universidad complutense de madrid - …biblioteca.ucm.es/tesis/qui/ucm-t28354.pdf · creo que he...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Departamento de Biologa y Bioqumica Molecular I

ESTRUCTURA Y MECANISMO DE ACCIN DEL REGULADOR SOS3: RESPUESTA AL ESTRS SALINO

EN LA RUTA SOS

MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR POR

Mara Jos Snchez Barrena

Bajo la direccin de los Doctores:

Armando Albert de la Cruz Martn Martnez Ripoll

Madrid, 2005 ISBN: 84-669-2845-6

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR I

ESTRUCTURA Y MECANISMO DE ACCIN DEL REGULADOR SOS3: RESPUESTA AL

ESTRS SALINO EN LA RUTA SOS

Esta memoria, presentada como Tesis Doctoral por Mara

Jos Snchez Barrena, para optar al Ttulo de Doctor por la

Universidad Complutense de Madrid, ha sido realizada en el

Grupo de Cristalografa Macromolecular y Biologa Estructural

del Instituto de Qumica-Fsica Rocasolano (CSIC), bajo la

direccin del Doctor Armando Albert de la Cruz y del Doctor

Martn Martnez Ripoll.

A mis padres. A mi familia. A todas las personas que siempre me han apoyado.

AGRADECIMIENTOS La realizacin del trabajo presentado en esta memoria ha sido posible gracias a la ayuda

desinteresada de muchas personas que durante estos ltimos cuatro aos han confiado en m.

En primer lugar me gustara dar las gracias a mis directores de tesis, el Dr. Armando Albert de la

Cruz y el Dr. Martn Martnez Ripoll, por todo lo que me han enseado y por lo mucho que he

disfrutado trabajando con ellos. Creo que he tenido una suerte inmensa al cruzarme en el camino

con personas tan trabajadoras, humildes y honestas, que no slo me han enseado ciencia, sino

que tambin se han preocupado de que estuviera como en casa desde el primer da,

considerando siempre mi opinin y aconsejndome en todo momento.

Esta tesis ha sido realizada gracias al apoyo del Ministerio de Educacin y Ciencia, que me ha

financiado durante cuatro aos mediante una beca del Plan de Formacin del Personal

Universitario (que a ver si pronto son contratos). Tambin quiero agradecer a mi tutor, el

Catedrtico D. Jos G. Gavilanes, todas las facilidades prestadas para la presentacin de esta

memoria en la Universidad Complutense de Madrid.

Durante la elaboracin de este proyecto, siempre he contado con el respaldo incondicional de

todos los miembros del Grupo de Cristalografa Macromolecular y Biologa Estructural y del

Departamento de Cristalografa del Instituto Rocasolano; cada uno a su manera, han sido

partcipes de mi formacin cientfica y de la elaboracin de esta memoria. As quiero dar las

gracias al Dr. Jos Miguel Mancheo, al Dr. Juan Hermoso, a la Dra. Julia Sanz y al Dr. Flix

Hernndez Cano. Tambin quiero recordar en estas lneas a la Dra. Mara del Carmen Apreda, al

Dr. Pepe Fayos, y a la Dra Lourdes Infantes, con los que tambin he compartido muchos buenos

momentos.

Quiero tambin dar las gracias a todos mis compaeros de laboratorio del GCMBE, por toda la

ayuda prestada y el tiempo y espacio robados durante la realizacin de esta memoria. A la Dra.

Beatriz Gonzlez, que ya ha vuelto, a Toms, todo un doctor y funcionario ya, a Raquel, que me

ense y ayud mucho cuando llegu al GCMBE, a Pablo, siempre tan pausado y comedido, a

Inma, que est siempre dispuesta a ayudar a quien lo necesite, a Rafa, el faseador de Gadolinio,

a Celia, la segunda extremea en aterrizar en el laboratorio, y a Laura, que aunque del

Departamento de Qumica-Fisica de Macromolculas Biolgica, tambin ha pasado largos ratos

entre nosotros. Adems quiero dar mil gracias a mis compaeras del laboratorio de Biologa

Molecular, a Martita, la chimba por excelencia, que ya es doctora, a Sandra, mi compaera del

club Obsesin y a Juana Mary, que tantos geles y cultivos prepara para todos. Ellas han sufrido

todas mis angustias con los dichosos rendimientos y me han ayudado y enseado infinidad de

cosas de Biologa Molecular y Bioqumica.

Este trabajo ha podido llegar a buen fin gracias tambin a la ayuda de muchas personas de otros

laboratorios como son la Dra. Begoa Monterroso y la Dra. Margarita Menndez, que vaya lata les

he dado con el CD, al Dr. Pepe Saiz, quien ha realizado los experimentos de ultracentrifugacin

analtica, a la Dra. Rosa Lebrn, por los experimentos de Maldi, a la Dra. Lola Sols, que tantos

productos nos ha dejado, por las horas de centrfuga y espectrofotmetro, a la Dra. Marta

Martnez, esta zaragozana que tantos consejos de Biologa Molecular me ha dado y a la futura

doctora Mara Jos Aguilar, que me ha puesto al da de la ltimas normas de la RAE. Tambin

quiero recordar al Dr. Pepe Ramos, a Vera y a Carlitos, del Departamento de Microbiologa de la

UCO, con los que pas unas semanas muy agradables aprendiendo a trabajar con levaduras y

estrs salino.

Aunque los he dejado para casi el final, quiero mostrar mi ms profundo agradecimiento a algunos

profesores de la UEX que, de una manera desinteresada, me animaron a venir al GCMBE, en

especial a la Dra. Mercedes Tirado, que me ense Qumica-Fsica de Macromolculas y que

siempre me ha guiado por el buen camino, sin pedir nada a cambio, al Dr. Fernando Garca

Barros, que un da me dijo haz lo que te gusta y no te conformes con lo que hay aqu y al Dr.

Paco Higes, que me ense lo bonita e interesante que es la Cristalografa y que

desafortunadamente ya no est entre nosotros. Tambin quiere recordar en estas lneas a tantos

compaeros de la UEX con los que he compartido momentos inolvidables.

Por ltimo quiero dar las gracias a mis padres, a mi hermana-amiga-compaera-de-piso Isa, a

toda mi familia, a todos mis amigos de Mrida, de Calamonte, de Madrid y de otros lugares, a los

que no nombro porque son muchsimos, y finalmente a Juan Ignacio, por ser el mejor compaero

que podra imaginar, por estar siempre a mi lado, pase lo que pase. Gracias a todos por vuestra

amistad, comprensin y por recordarme siempre qu es lo verdaderamente importante en la vida.

ABREVIATURAS CD Dicrosmo circular (Circular dichroism) CBL Protena parecida a la Calcineurina B (Calcineurin B-like) CIPK Quinasas que interaccionan con las CBLs (CBL-interacting protein

kinases) DTT Ditiotreitol EDTA cido etilendiamino tetra-actico (Ethylenediaminetetraacetic acid) ESRF Instalaciones europeas de radiacin sincrotrn (European synchrotron

radiation facilities) GST Glutation-S-transferasa IPTG Isopropil--D-tiogalactsido LB Luria Bertani MAD Dispersin anmala multiple (Multi-wavelength anomalous

diffraction) MIR Remplazo isomorfo multiple (Multiple isomorphous replacement) MIRAS Remplazo isomorfo multiple con dispersion anmala

(Multiple isomorphous replacement with anomalous scattering) MPD 2-Metil 2,4-pentanodiol MR Reemplazo molecular (Molecular replacement) m/v Relacin masa/volumen PDB Banco de datos de estructuras de protenas (Protein data bank) PEG 3350 Polietilenglicol 3350 Da PEG 4K Polietilenglicol 4 KDa PKS Quinasas del tipo a SOS2 (SOS2-like protein kinases) r.m.s.d. Desviacin cuadrtica media (Root mean square deviation) SAD Dispersin anmala simple (Single- wavelength anomalous

dispersin) SCaBP Sensores que unen Ca2+ del tipo a SOS3

(SOS3-like Ca2+ sensor/binding proteins)

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico (Polyacrylamide gel electrophoresis in sodium dodecyl sulfate)

SIR Reemplazo isomorfo simple (Single isomorphous replacement) SIRAS Reemplazo isomorfo simple con dispersion anmala

(Single isomorphous replacement with anomalous scattering)

SOS Altamente sensible a la sal (Salt overly sensitive) Tm Temperatura de desnaturalizacin (Melting temperature)

u.a. Unidades arbitrarias UV Ultravioleta v/v Relacin volumen/volumen

NNDDIICCEE

ndice

NDICE 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS 1

1.1.- ESTRS SALINO EN PLANTAS.. 4

1.2.- LA RUTA SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) DE Arabidopsis thaliana.................................................................................

7

1.3.- LAS FAMILIAS DE LOS SENSORES DE Ca2+ Y DE LAS PROTENAS QUINASAS EN Arabidopsis thaliana.......

11

1.4.- OBJETIVOS................................................................................................ 16

2. TCNICAS EXPERIMENTALES Y RESULTADOS............................................... 19

2.1. EXPRESIN Y PURIFICACIN.................................................................. 21

2.1.1. Introduccin..................................................................................... 21

2.1.2. Expresin y purificacin de SOS3................................................. 232.1.2.1. Expresin de SOS3........................................................................... 23

2.1.2.2. Purificacin de SOS3............................................................... 24

2.2. CRISTALIZACIN....................................................................................... 27

2.2.1.- Introduccin.................................................................................... 27

2.2.1.1. Principios bsicos de la cristalizacin........................................ 28

2.2.1.2. Preparacin del experimento de cristalizacin........................... 29

2.2.1.3. Proceso experimental de cristalizacin...................................... 30

2.2.1.4. Mtodos de Cristalizacin........................................................... 31

2.2.2. Cristalizacin de SOS3 y sus complejos...................................... 32

2.3. TCNICAS CRISTALOGRFICAS Y RESOLUCIN ESTRUCTURAL..........................................................................................

35

2.3.1. Conceptos generales...................................................................... 35

2.3.2. Resolucin estructural de SOS3.................................................... 45

2.3.2.1. Reemplazo molecular................................................................. 45

2.3.2.2. Faseado con yoduro................................................................... 48

2.3.2.3. Construccin y refinamiento de las estructuras

de los complejos SOS3 Ca2+ y SOS3 Mn2+ Ca2+...........................

63

2.3.3. Anlisis de la estructura de los complejos de SOS3................... 66

-I-

ndice

2.4. CARACTERIZACIN ESTRUCTURAL DE SOS3 EN SOLUCIN............ 68

2.4.1. Introduccin..................................................................................... 68

2.4.2. Comportamiento hidrodinmico de SOS3: anlisis mediante ultracentrifugacin analtica..........................................

68

2.4.2.1. Experimentos de equilibrio de sedimentacin............................ 69

2.4.2.2. Experimentos de velocidad de sedimentacin............................ 71

2.4.2.3. Prediccin de propiedades hidrodinmicas a partir de un modelo atmico....................................................

72

2.4.3. Anlisis estructural de SOS3 mediante espectroscopa de dicrosmo circular...........................................

73

2.4.3.1. Experimentos de dicrosmo circular en el UV-lejano y

el UV-cercano.............................................................................

73

2.4.3.2. Desnaturalizacin trmica registrada por CD.............................. 75

2.4.4. Anlisis de la estructura terciaria de SOS3 mediante espetroscopa de fluorescencia...................................

77

2.4.4.1. Experimentos de emisin de fluorescencia................................ 77

2.4.5. Cromatografa de interaccin hidrofbica.................................... 79

2.4.5.1. Experimentos de HIC con SOS3.................................................. 79

3. DISCUSIN 81

3.1. LOS SITIOS DE UNIN A METALES DE SOS3......................................... 85

3.2. LA ESTRUCTURA DIMRICA DE SOS3.................................................... 91

3.3. AUMENTO DEL CARCTER HIDROFBICO DE SOS3 POR LA UNIN AL Ca2+.............................................................................

93

3.4. COMPARACIN ESTRUCTURAL DE SOS3 Y CBL2................................ 94

3.5. MECANISMO DE ACTIVACIN DE SOS3................................................. 98

3.6. MECANISMO MOLECULAR DE SOS3 EN LA RUTA SALT OVERLY SENSITIVE.

102

4. CONCLUSIONES.................................................................................................... 105

5. BIBLIOGRAFA....................................................................................................... 109

-II-

ndice

-III-

6. ANEXO.............................................................................................................. 121

11.. IINNTTRROODDUUCCCCIINN YY OOBBJJEETTIIVVOOSS

Introduccin y objetivos

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

Las protenas desempean un papel crucial en prcticamente todos los procesos biolgicos y

pueden considerarse las verdaderas mquinas de la vida. As por ejemplo, las enzimas son los

catalizadores biolgicos que controlan todos los procesos qumicos en los sistemas vivos, las

protenas se encargan de almacenar y transportar otras molculas, las hormonas actan como

mensajeros entre diferentes partes del organismo, y los anticuerpos proveen a la clula de

inmunidad frente a infecciones. La diversidad de funciones biolgicas que desempean estas

complejas macromolculas est determinada y es dependiente de la estructura tridimensional. A

partir de la informacin gentica, slo es posible conocer la estructura primaria de las protenas, la

secuencia lineal de aminocidos que constituyen el esqueleto polipeptdico. Sin embargo, para

entender el lenguaje de las protenas y desentraar toda la informacin que contienen, es

necesario conocer la estructura tridimensional de las mismas y situarlas en el contexto celular

concreto (espacio y tiempo) en el que desempean su funcin.

Las protenas necesitan relacionarse con su entorno e interactuar con el mismo para llevar a cabo

su funcin. Mediante la interaccin con iones, otras molculas y macromolculas, las protenas

regulan una gran cantidad de procesos biolgicos. La importancia de estas interacciones en

biologa ha hecho que los procesos de reconocimiento en protenas sea un rea de considerable

inters. Estos procesos de reconocimiento tienen como objetivo la transmisin de las seales que

se generan en la clula como respuesta a los estmulos a los que est sometida. Las protenas

sufren cambios conformacionales y de estructura cuaternaria para interaccionar con sus dianas y

transmitir la seal. Todos estos cambios no son ms que un reflejo de la naturaleza dinmica de la

clula. El anlisis esttico de la estructura tridimensional de una protena refleja parcialmente su

funcionalidad, por lo que para comprender la complejidad y dinmica de los procesos celulares

hay que conocer tambin cmo interacciona con las molculas que la rodean y los cambios

estructurales que sufre para dicho fin. En estos procesos de reconocimiento y transmisin de

seales, las interacciones no covalentes juegan un papel principal, por lo que es necesario poder

caracterizar a nivel atmico la naturaleza de dichas interacciones, y as entender en mayor medida

las fuerzas que gobiernan todos estos procesos.

-3-


1.1.- ESTRS SALINO EN PLANTAS

Una caracterstica importante que distingue a las plantas de otros organismos multicelulares

complejos es que las plantas tienen un lugar de crecimiento y desarrollo fijo, por lo que han de

soportar una multitud de condiciones medioambientales adversas, tales como la sequa, el fro o la

salinidad del suelo, que pueden considerarse los ms graves de los estreses. El exceso de sales

en el suelo inhibe el crecimiento de las plantas y causa grandes prdidas en la produccin

agrcola en todo el planeta (Tester & Davenport, 2003; Hasegawa et al., 2000). Cerca del 20% de

las reas cultivadas y del 50% de las tierras de regado estn afectadas por problemas de

salinidad (Zhu, 2001).

Figura 1.1.1: Homeostasis del Na+ y del K+ de una clula en (a) un suelo normal y (b) estresado. En clulas no estresadas, la concentracin de K+, [K+], es muy superior a la del medio, para conseguirlo, el K+ es asimilado del medio externo y acumulado en el citoplasma y la vacuola; una parte de este K+ es devuelto al medio para un correcto equilibrio o como consecuencia de un reajuste osmtico. En un suelo estresado, la presencia de altas concentraciones de Na+ en el medio externo inhibe el flujo de K+ al interior de la clula y favorece la entrada y acumulacin de Na+ en el citoplasma. La clula pone en marcha mecanismos para la devolucin del Na+ al medio externo o para acumularlo en la vacuola (el grosor de las puntas de flecha indica magnitudes relativas)(Serrano & Rodrguez-Navarro, 2001).

La homeostasis inica es fundamental para la fisiologa de las clulas. Es necesario regular

adecuadamente los flujos de los iones a travs de la clula para mantener controlada una

concentracin baja de iones txicos y acumular los iones que son esenciales para la misma. Las

plantas emplean un transporte activo primario, mediado por H+-ATPasas, y un transporte

secundario, mediado por canales o cotransportadores, para mantener altas concentraciones de

in potasio (K+) y bajas concentraciones de in sodio (Na+) en el citosol. La homeostasis

intracelular de los iones Na+ y K+ es importante para la actividad de muchas enzimas que se

-4-


encuentran en el citosol, el mantenimiento del potencial de membrana y la regulacin del volumen

de la clula (Figura 1.1.1). Por tanto, el mantenimiento de los mecanismos que controlan la

homeostasis del Na+ y K+ es esencial en condiciones de estrs salino. Entender cmo las plantas

se enfrentan a altas concentraciones de Na+ es de gran importancia para el presente y el futuro de

la agricultura en un mundo con suelos cada vez ms salinizados. Adems, la regulacin del

transporte inico mediada por las seales de estrs salino provee un modelo para la comprensin

de la regulacin general de la homeostasis inica en las plantas.

La principal consecuencia del estrs salino por Na+ es que se genera un enorme potencial a

travs de la membrana plasmtica de las clulas de plantas, que favorece el transporte pasivo de

Na+ al citosol. El Na+ entra en la clula a travs del transportador de alta afinidad de K+ HKT1 (Rus

et al., 2001; Maser et al., 2002) y a travs de canales de cationes no selectivos (Amtmann &

Sanders, 1999) (Figura 1.1.2). Una cuestin intrigante es entender cmo es posible que a lo largo

de la evolucin, se hayan mantenido los transportadores de Na+, tales como HKT1, dado el efecto

txico que ocasiona el Na+ en la clula (Zhu, 2003). El estrs por Na+ impide la entrada de K+ a la

clula (Hasegawa et al., 2000). Cuando el Na+ entra en la clula y se acumulan altos niveles del

mismo, se hace txico para las enzimas que regulan el metabolismo, ocasionando un cese en el

crecimiento y desarrollo de la clula, y en ltima instancia la muerte (Hasegawa et al., 2000). Para

combatir la acumulacin de Na+ en el citosol es necesario compartimentarlo en la vacuola o bien

expulsarlo de la clula (Figura 1.1.1 y Figura 1.1.2). Esto requiere una regulacin de los

transportadores de Na+ del tonoplasto y de la membrana plasmtica.

El almacenamiento de Na+ en la vacuola contribuye no slo a la disminucin de la concentracin

de Na+ en el citosol, sino que tambin contribuye al ajuste osmtico para mantener la entrada de

agua desde soluciones salinas. Otros organelos, como los plstidos y mitocondrias, podran

tambin acumular Na+, contribuyendo de este modo a la compartimentacin subcelular total. En

Arabidopsis, la familia de los antiporteadores Na+/H+ NHX se encarga de dicha funcin (Blumwald,

2000) (Figura 1.1.2). AtNHX1 y AtNHX2 se encuentran localizados en la membrana vacuolar y sus

niveles de transcripcin estn regulados por la fitohormona ABA (Yokoi et al., 2002). Se ha

demostrado que la sobreexpresin de AtNHX1 en diversas plantas aumenta la tolerancia salina

(Apse & Blumwald, 2002).

El papel de la eliminacin de Na+ de la clula no es intuitivo en plantas, ya que el Na+ expulsado

de una presentara un problema para las clulas colindantes. As, el papel del flujo de Na+ hacia el

exterior de la clula debe considerarse en tejidos especficos y en el contexto de la planta,

considerada como un todo. En Arabidopsis, la expulsin de Na+ al exterior se lleva a cabo por el

antiporteador de Na+/H+ SOS1, que se localiza en la membrana plasmtica (Shi et al., 2000; Qiu et

-5-


al., 2002; Quintero et al., 2002; Shi et al., 2002). La actividad de SOS1 se ha detectado slo en

plantas estresadas (Qiu et al., 2002). SOS1 es un intercambiador de Na+/H+ electroneutral que es

especfico por Na+ y no puede transportar Li+ o K+ (Qiu et al., 2002, Qiu et al., 2003). La mayor

actividad de SOS1 se ha detectado en la raz y en las clulas que rodean el tejido vascular de la

planta (Shi et al., 2002). El patrn de expresin de SOS1, junto con los resultados obtenidos con

mutantes, sugieren que SOS1 posee distintas funciones. Primero, expulsar el Na+ al entorno de la

raz; segundo, y de manera indirecta, limitar la entrada de Na+ a la vacuola; y tercero, controlar el

transporte a larga distancia de Na+ entre la raz y las hojas de la planta. La activacin del

antiporteador de Na+/H+ SOS1 en condiciones de estrs salino est regulado por el complejo

formado entre las protenas SOS2 y SOS3 (Figura 1.1.2) (Qiu et al., 2002; Quintero et al., 2002). A

la ruta que controla la expulsin de Na+ de la clula se le ha denominado SOS, Salt Overly

Sensitive, de ah el nombre de las protenas implicadas.

Figura 1.1.2: Esquema de la maquinaria encargada de controlar la homeostasis del Na+ cuando la planta se encuentra en condiciones de estrs salino.

-6-


El estudio molecular de todos los sistemas involucrados en el control de la toxicidad del Na+ tiene

una gran importancia por la aplicacin biotecnolgica que subyace. La generacin de plantas

transgnicas en las que se introduzcan, por ejemplo, sistemas como el de la ruta SOS o los

antiporteadores NHX, va a permitir el crecimiento y desarrollo de estas plantas en terrenos

salinos, por lo que solucionar en gran medida los problemas actuales de la agricultura mundial,

motivados por la sobreexplotacin de los suelos y el cambio climtico.

1.2.- LA RUTA SALT OVERLY SENSITIVE (SOS) DE Arabidopsis thaliana

Mediante estudios genticos y bioqumicos se ha identificado la ruta Salt Overly Sensitive (SOS)

para la homeostasis del Na+ y la tolerancia salina en Arabidopsis (Zhu, 2000; Zhu, 2003). En esta

ruta, SOS3 es una protena que une el in calcio (Ca2+) y es capaz de sentir la seal del Ca2+ que

se genera en el citosol como respuesta al estrs salino. SOS3 presenta similitud secuencial con la

subunidad reguladora de la Calcineurina, una fosfatasa del tipo 2B, y los sensores neuronales de

calcio de origen animal (Liu & Zhu, 1998; Guo et al., 2001). Sin embargo, Arabidopsis no posee

ninguna protena fosfatasa del tipo 2B y el sensor de Ca2+ SOS3 activa a una protena quinasa,

SOS2, y no a una fosfatasa. SOS3 es una pequea protena miristoilada que no presenta

actividad enzimtica por s misma; la unin del Ca2+, la miristoilacin y los extremos N y C-terminal

son requeridas para la funcin de SOS3 en la tolerancia salina (Ishitani et al., 2000) (Figura 1.2.1).

Se ha propuesto que la miristoilacin es importante para el reclutamiento de SOS2 en la

membrana plasmtica, donde se encuentra el antiporteador SOS1 (Figura 1.1.2) (Ishitani et al.,

2000).

Figura 1.2.1: Esquema donde se compara el tamao de (a) SOS3 con el de (b) SOS2.

SOS2 es una protena quinasa del tipo Ser/Thr que tambin participa en la tolerancia salina de

Arabidopsis (Liu et al., 2000). El anlisis del doble mutante sos3/sos2 ha demostrado que SOS3 y

-7-


SOS2 actan en la misma ruta (Figura 1.1.2) (Halfter et al., 2000). SOS2 es una protena que

pertenece a la familia de las RD quinasas (Nolen et al., 2004) y que posee un dominio quinasa N-

terminal similar al encontrado en las protenas SNF1 (Suc nofermenting1) y AMPK (AMP-activated

kinase) (Hardie, 1999), y un dominio regulador C-terminal de plegamiento desconocido, que se

compone de un motivo denominado FISL, un dominio PPI (protein phosfatase interaction), para la

interaccin con fosfatasas del tipo 2C (tales como ABI1 y ABI2), y uno o varios motivos en el

extremo C-terminal con funcin desconocida (Figura 1.2.1(b)) (Gong et al., 2004). Se ha

demostrado que SOS3 interacciona fsicamente con SOS2 mediante ensayos de doble hbrido en

levadura e in vitro (Halfter et al., 2000). Adems, se sabe que en presencia de Ca2+, SOS3 activa

la capacidad de la quinasa SOS2 para fosforilar sustratos (Halfter et al., 2000). La unin de SOS3

a SOS2 est mediada por un motivo de veintin aminocidos del dominio regulador de SOS2,

denominado FISL, que autoinhibe la actividad quinasa mediante la interaccin intramolecular entre

los dominios quinasa y regulador (Guo et al., 2001) (Figura 1.2.2 y Figura 1.2.3). Mediante estudio

in vivo e in vitro, se ha propuesto un mecanismo para la activacin de SOS2 (Figura 1.2.3).

In vitro y en ausencia de SOS3, la quinasa puede ser activada bien mediante la mutacin

Thr168Asp (Figura 1.2.2 y Figura 1.2.3(a)) en el bucle de activacin, que mimetiza la fosforilacin

por otra quinasa, bien mediante la supresin del motivo autoinhibitorio FISL, o bien por la

combinacin de ambos, que produce un efecto sinrgico en la actividad quinasa de SOS2 (Guo et

al., 2001; Gong et al., 2002a). El cambio de dos residuos adicionales del bucle de activacin,

Ser156 y Tyr175 a Asp tambin activa la quinasa (Figura 1.2.2), sugiriendo que la fosforilacin

mltiple debe ser importante para la actividad de SOS2 (Gong et al., 2002b). El bucle de

activacin es un motivo estructural que regula la actividad de este tipo de quinasas y est

implicado en la interaccin con el cofactor, Mg2+ o Mn2+, el correcto posicionamiento del ATP y la

interaccin con el sustrato (Nolen et al., 2004). Por tanto, una distorsin de la conformacin del

bucle de activacin impide una correcta orientacin del ATP, de los residuos catalticos y de la

protena sustrato. La fosforilacin del bucle de activacin es el mecanismo ms comn para que

ste adquiera la conformacin adecuada y se lleve a cabo la reaccin.

In vivo, se ha propuesto que la quinasa puede ser activada mediante la unin del complejo SOS3

Ca2+ al motivo FISL, mediante fosforilacin del residuo Thr168 del bucle de activacin o mediante

una combinacin de ambos (Figura 1.2.2 y Figura 1.2.3(b)). Adems, se ha propuesto que la

fosforilacin/desfosforilacin de SOS2 por una quinasa/fosfatasa puede jugar un papel muy

importante en la regulacin de SOS2 in vivo. Aunque an no se conoce la quinasa/fosfatasa, se

ha propuesto que las fosfatasas del tipo 2C, como por ejemplo ABI2 que se unen a SOS2,

desfosforilen el bucle de activacin (Ohta et al., 2003).

-8-


Figura 1.2.2: Alineamiento secuencial (Pearson & Lipman, 1998) de protenas de la familia CIPK/PKS de A. thaliana. El alineamiento est referido a SOS2 y el orden en que aparecen las protenas obedece al mayor grado de identidad secuencial. En azul aparece el dominio quinasa, en amarillo el regulador y en gris el dominio de unin. En rojo se marca el dominio PPI y los residuos implicados en la interaccin y en verde, el motivo FISL y los residuos conservados. En amarillo se seala el bucle de activacin y los residuos que delimitan el mismo, en morado, los residuos de SOS2 que se fosforilan y los que se conservan en la familia de las PKS. En un recuadro azul se marcan los residuos que dan normbre a la familia de protenas quinasas del tipo RD.

-9-


Figura 1.2.3: Mecanismo de activacin de SOS2 (a) in vitro y (b) el propuesto in vivo. El extremo C-terminal del dominio regulador de funcin desconocida aparece en naranja. El bucle de activacin del dominio quinasa se muestra en azul claro. El dominio de interaccin con fosfatasas del tipo C, como por ejemplo la protena ABI2 (en ail), se muestra en verde y con la etiqueta PPI.

En condiciones de estrs, las protenas SOS2 y SOS3 son necesarias para la activacin del

antiporteador de Na+/H+ SOS1 (Figura 1.1.2). (Qiu et al., 2002). SOS1 est compuesta por un

dominio formado por doce hlices transmembrana, y un dominio C-terminal (de ms de

setecientos aminocidos) que reside en el citoplasma (Shi et al., 2000). Estudios realizados en

levadura han proporcionado evidencias adicionales de la interaccin de SOS2 y SOS3 y la

regulacin de SOS1. La coexpresin de SOS1, SOS2 y SOS3 aumenta dramticamente la

tolerancia salina en levadura en un mutante que carece de transportadores de Na+ endgenos

(Quintero et al., 2002). El complejo SOS2-SOS3 fosforila y activa al antiporteador SOS1

expresado en levadura, aumentando la exclusin del Na+ y aumentando la tolerancia salina

(Quintero et al., 2002). Estos resultados ponen de manifiesto la funcionalidad de estas tres

protenas en la homeostasis inica y la tolerancia a la sal en Arabidopsis. Adems, estudios

recientes han demostrado que la sobreexpresin de SOS1 o de un mutante de SOS2

-10-


constitutivamente activo mejora la tolerancia salina en Arabidopsis (Shi et al., 2003; Guo et al.,

2004), sugiriendo que la sobreexpresin conjunta de SOS1, SOS2 y SOS3 debe aumentar en

gran medida la tolerancia a la sal en plantas.

Finalmente, es interesante remarcar que se ha demostrado que existe coordinacin entre los

antiporteadores de Na+/H+ localizados en el tonoplasto y en la membrana plasmtica de

Arabidopsis. As, aunque NHX1 est regulado por la hormona ABA, otros antiporteadores del tipo

NHX presentan una actividad dependiente de la quinasa SOS2, pero no de SOS1 o SOS3 (Qiu et

al., 2004). Sin embargo, se desconoce qu proteina activa a SOS2 en esta nueva ruta y, adems,

la regulacin de NHX no implica cambios en la fosforilacin del transportador (Qiu et al., 2004).

Estos resultados muestran que la quinasa SOS2 juega un papel muy importante en el

mantenimiento de la homeostasis del Na+ y es un componente crtico en la maquinaria implicada

en la tolerancia salina en plantas.

1.3.- LAS FAMILIAS DE LOS SENSORES DE Ca2+ Y DE LAS PROTENAS QUINASAS EN Arabidopsis thaliana

Las plantas experimentan cambios de temperatura, luz y humedad, excesos y deficiencias de

minerales y ataques de organismos herbvoros y patgenos durante el ciclo de vida. Todos estos

estmulos provenientes del exterior provocan seales especficas que alteran su desarrollo y

crecimiento. Los segundos mensajeros son pequeas molculas que bien atraviesan la membrana

o bien se generan en la misma, para transformar una seal primaria que es recibida en la

membrana celular desde el medio externo.

El in calcio (Ca2+) acta como segundo mensajero en las rutas de sealizacin inducidas por

procesos fisiolgicos y medioambientales en las plantas (Trewavas & Malho, 1998; Sanders et al.,

2002; White & Broadley, 2003). De esta forma, los sucesos que ocurren en el exterior son

percibidos como oscilaciones en la concentracin citoslica del Ca2+, y en la especificidad de la

seal influyen tanto el cambio en la concentracin, como la cintica y compartimentacin de la

misma (Harmon et al. 2000; Scrase-Field & Knight, 2003). En la clula, los niveles de Ca2+ estn

fuertemente regulados, y pequeos cambios transitorios en la concentracin intracelular de Ca2+

proveen de informacin a la clula para la posterior regulacin de la actividad enzimtica y de la

expresin de genes como respuesta a un determinado estmulo. Por tanto, las seales

provenientes del exterior son transformadas a oscilaciones en la seal del Ca2+, que

posteriormente tienen que ser registradas por diferentes sensores y que mediante la unin de

dicho catin regulan distintas rutas de sealizacin (Snedden & Fromm, 1998; Zielinski, 1998). Por

tanto, adems de la especificidad de la seal del Ca2+, el tipo de sensor que responde a la seal

-11-


determina un segundo nivel de regulacin. Teniendo en cuenta que un mismo sensor puede

interaccionar con diversas dianas, el potencial de regulacin especfica de distintas rutas se

magnifica indudablemente.

Figura 1.3.1: Alineamiento secuencial de las CBLs de A. thaliana (Pearson & Lipman, 1998). Los smbolos *, : y . indican los residuos idnticos, conservados y semiconservados, respectivamente. Los recuadros azules muestran los sitios EF de unin a Ca2+. Con fondo amarillo se muestran los extremos N y C-terminal.

-12-


Existen dos tipos de sensores, aquellos que cuando unen Ca2+, cambian de conformacin y

modulan su propia funcin o actividad mediante interacciones intramoleculares (sensor

responders), o aquellos que no poseen actividad enzimtica y tras la unin del Ca2+ cambian de

conformacin para interaccionar con sus correspondientes dianas, por ejemplo, quinasas o

fosfatasas (sensor relays) (Sanders et al., 2002). En plantas, los sensores del tipo responders

mejor caracterizados son las protenas quinasas dependientes de Ca2+ (CDPK) (Harmon et al.,

2000) y entre los relays se encuentran las calmodulinas. SOS3 pertenece a este segundo tipo de

sensores, ya que no tiene actividad enzimtica y se ha demostrado que regula la actividad de la

quinasa SOS2 (Halfter et al., 2000).

Desde el aislamiento inicial y caracterizacin del sensor de Ca2+ SOS3 (Liu & Zhu, 1998) y de su

diana SOS2 (Liu et al., 2000), se han identificado otros nueve sensores y veinticuatro quinasas

que conforman dos nuevas familias de protenas en Arabidopsis (Kudla et al., 1999; Shi et al.,

1999; Kim et al., 2000; Albrecht et al., 2001; Luan et al., 2002; Kolukisaoglu et al., 2004, Gong et

al., 2004). La familia de los sensores de Ca2+ a la que pertenece SOS3 se ha denominado SCaBP

(SOS3-like Ca2+ sensor/binding proteins) (Guo et al., 2001) o CBL (Calcineurin B-like) (Kudla et al.,

1999). A la familia de SOS2 se le ha dado el nombre de PKS (SOS2-like protein kinases) (Halfter

et al., 2000) o CIPK (CBL-interacting protein kinases) (Shi et al., 1999). Estas dos familias de

protenas solo se han encontrado en plantas superiores, por lo que se ha sugerido que

desempean una funcin especfica en las mismas.

La familia de protenas CBL est bastante conservada en tamao. La mayora de los genes

predicen cadenas polipeptdicas de 23.5 a 26 KDa en Arabidopsis. La nica excepcin es CBL10,

que presenta una extensin en el extremo N-terminal, que aunque no corresponde a ningn

motivo o secuencia conocida, es de esperar que tenga relevancia funcional (Figura 1.3.1). La

identidad secuencial de las diferentes CBLs vara entre un 29 y un 92% (33-93% de similitud). Las

protenas ms parecidas son CBL1 y CBL9, y CBL2 y CBL3 que presentan una identidad

secuencial del 89 y 92%, respectivamente. Incluso las protenas ms divergentes, CBL5 y CBL10,

exhiben un 29% de identidad en la secuencia. Las diez protenas presentan tres manos EF para la

unin del Ca2+, aunque el grado de conservacin de las mismas con respecto al que presentan las

calmodulinas es muy variado. El espaciado entre las manos EF es igual, de manera que las

pequeas variaciones en tamao nicamente afectan a los extremos N y C-terminal. Estos

resultados tambin han sido observados en las CBLs de arroz, sugiriendo que las CBLs de

plantas deben de tener una estructura tridimensional conservada, mostrando por tanto un modo

de accin similar. Esto ltimo se refleja en que las CBLs interaccionan con las CIPKs a travs del

mismo motivo estructural de las ltimas, el motivo FISL o NAF (Halfter et al., 2000; Guo et al.,

2001; Albrecht et al., 2001).

-13-


La familia de protenas CIPK tambin presentan un elevado grado de conservacin en Arabidopsis

thaliana y en Oriza sativa (Kolukisaoglu et al., 2004). En Arabidopsis, estas protenas presentan

una identidad secuencial que est en el rango del 33-78%. El dominio quinasa N-terminal est

mucho ms conservado (51-90% de identidad y 63-96% de similitud secuencial) que el dominio

regulador C-terminal (24-58% de identidad y 36-69% de similitud secuencial) (Figura 1.2.2). Una

excepcin en el dominio regulador es el motivo FISL, que se encuentra altamente conservado en

toda la familia de protenas y que por tanto, define a estas quinasas como dianas de las CBLs en

la sealizacin por Ca2+. Debido al elevado grado de conservacin, es de esperar que las CIPKs

presenten la misma funcionalidad que SOS2 (Figura 1.2.2).

El elevado nmero de CBLs y CIPKs sugiere la existencia de una red compleja de posibles

interacciones, que asegura una descodificacin de la seal del Ca2+ diferenciada y que redunda

en una correcta respuesta de la clula a los estmulos percibidos. Entre los factores que regulan

esta red hay que destacar:

La diferente afinidad por el Ca2+ de las CBLs. En animales, es conocido que los sensores de Ca2+, como los sensores neuronales (NCS) difieren en la afinidad por dicho

catin (Burgoyne & Weiss, 2001). Esto implica que una familia de sensores puede actuar

en un rango grande de concentraciones de Ca2+ y cada miembro descodificar seales de

Ca2+ muy especficas. Sin embargo, este tipo de estudios no ha sido desarrollado con las

CBLs. Un nivel de regulacin adicional del Ca2+ consistira en la dependencia del catin

para la interaccin sensor-quinasa. Por ejemplo, SOS3 interacciona con SOS2 en

ausencia de Ca2+, pero ste es necesario para la activacin de la quinasa; sin embargo, la

pareja CBL1/CIPK1 solo interacciona en presencia de Ca2+.

La diferente especificidad de las CBLs por las CIPKs. Aunque es posible un nmero elevado de combinaciones CBL/CIPK, se ha demostrado que existen preferencias en la

interaccin de estas protenas. Pocas CBLs interaccionan con mltiples CIPKs, mientras

que la mayora de las CBLs nicamente interaccionan con unas pocas (alrededor de

cuatro) CIPKs; tambin ocurre que distintas CBLs interaccionan con una misma CIPK

(Batistic & Kudla, 2004; Kim et al., 2000; Guo et al., 2001). Ello induce a pensar que habr

sensores, como SOS3, que solo funcionarn ante un estmulo, pero habr otros, como

CBL1, que distribuyan las seales provenientes de distintos estmulos a distintas quinasas

(Figura 1.3.2). Sin embargo, estos estudios se han realizado mediante ensayos de doble

hbrido en levadura, y an queda por confirmar si estas parejas tambin interaccionan in

vivo y por estudiar las bases estructurales de las interacciones.

-14-


Figura 1.3.2: Rutas de sealizacin por estrs reguladas a travs la red de interacciones CBL/CIPK. Los diferentes colores de la flechas indican la especificidad de las respuestas a los distintos estreses. Las lneas discontinuas indican que la interaccin con la quinasa no se ha demostrado.

La localizacin temporal y espacial de las CBLs y las CIPKs en el contexto celular y de la planta. Algunas CBLs presentan sitios de miristoilacin, como SOS3, y se han localizado solo en la membrana plasmtica y otras, tanto en la membrana plasmtica como

en la vacuolar (Batistic & Kudla, 2004). Esta localizacin especfica de las CBLs va a

asegurar la necesaria separacin espacial de procesos de sealizacin que responden a

diferentes estmulos y que tienen que ser procesados al mismo tiempo. En contra de lo que

ocurre con las CBLs, las CIPKs no presentan en su secuencia seales que determinen su

localizacin (Kolukisaoglu et al., 2004). Por tanto, su localizacin depender de la protena

CBL con la que interaccionen. Acerca de la localizacin de las parejas de protenas en la

planta, los experimentos de expresin realizados con algunas CBLs y CIPKs muestran

patrones de expresin especficos segn el tejido y el estado de desarrollo de la planta, de

manera que se podrn esperar: (i) distintas funciones para un mismo complejo CIPK/CBL,

segn el rgano en donde se exprese, y (ii) una misma funcin para distintos complejos

que acten en el mismo tejido. Esto significa que la red de interacciones va a poder ser lo

suficientemente dinmica para responder a los cambios ambientales en cualquier estadio

de desarrollo de la planta (Batistic & Kudla, 2004).

-15-


La especificidad de las CIPKs por su sustrato. Hasta ahora solo es conocido el sustrato de SOS2, el antiporteador Na+/H+ SOS1.

Hasta la fecha, nicamente se ha podido establecer la funcin fisiolgica de unas pocas CBLs y

CIPKs. El complejo mejor caracterizado es el formado por SOS3 y SOS2, que como ya se ha

mencionado, regula la homeostasis del Na+ durante el estrs salino en las races (Liu & Zhu, 1998;

Halfter et al., 2000; Liu et al., 2000). Tambin es conocido que CBL1 est implicada en la

respuesta al fro, a la sequa, al estrs salino (en toda la planta, no como SOS3) y al estrs

osmtico (Figura 1.3.2) (Albrecht et al., 2003; Cheong et al., 2003). Para la regulacin del estrs

salino interaccionara con SOS2, y para la regulacin del estrs osmtico y la sequa con CIPK1.

Por otro lado, se ha visto que CBL1 y CBL9, sensores muy conservados, tienen funciones

opuestas en la regulacin de la sequa, activndose CBL1 ante la escasez de agua. Adems,

CBL9 tiene otra funcin dependiente de ABA de manera que regula la sntesis y sealizacin de la

misma mediante la interaccin con una quinasa que an se desconoce (CIPK?) (Figura 1.3.2).

CBL1 parece tambin interaccionar con esta quinasa desconocida, ya que su actividad genera la

expresin de genes inducidos por ABA, de una manera anloga a como ocurre cuando se activa

CBL9. Esto quiere decir que CBL1 y CBL9 tiene funciones solapantes y compiten por las mismas

quinasas en ciertas rutas.

1.4.- OBJETIVOS

El exceso de sal en los suelos inhibe el crecimiento de las plantas y causa grandes prdidas en la

produccin agrcola mundial. La ruta Salt Overly Sensitive (SOS) juega un papel determinante en

la tolerancia salina en plantas y el mantenimiento de concentraciones bajas de Na+ en el citosol,

de ah que el establecimiento de las bases estructurales de dicho proceso sea de gran importancia

para entender la funcin molecular del sistema y para poder en un futuro darle una aplicacin

biotecnolgica.

Como se ha descrito previamente, el sensor de Ca2+ SOS3 es una protena clave en la ruta SOS,

ya que se encarga de iniciar la respuesta para la tolerancia salina. SOS3 es capaz de sentir la

seal citoslica del Ca2+ provocada por el estrs salino, para posteriormente activar a la quinasa

SOS2. Por tanto, los objetivos fundamentales de este trabajo se centran en entender cmo SOS3 une el Ca2+ y regula la actividad de SOS2, para comprender en ltima instancia cmo funciona especficamente mediando la seal proveniente del estrs salino y no de otros tipos de estreses que pueden tambin provocar cambios en la concentracin citoslica de Ca2+.

-16-


-17-

Con estos objetivos se plantea abordar el estudio estructural de SOS3. Adems, la caracterizacin

estructural de SOS3 y su comparacin con la protena CBL2, la nica estructura conocida de las

CIPKs/CBLs, permite poner de manifiesto los determinantes estructurales asociados a la funcin

de cada una de ellas y sirve para caracterizar en mayor medida esta familia de protenas, de las

que hasta ahora, poco se conoce de su funcin molecular. Asimismo, y desde un punto de vista

metodolgico, se pretende sistematizar y comprobar la utilidad del anin yoduro como faseador de

estructuras cristalinas, empleando distintas estrategias de resolucin cristalogrfica.

Concretamente, los objetivos que se proponen en esta tesis pueden sintetizarse en:

Determinar la estructura tridimensional de SOS3:

Expresin y purificacin.

Cristalizacin.

Recogida y anlisis de datos de difraccin de rayos X.

Resolucin estructural.

Anlisis de la estructura.

Determinacin del modo de unin a Ca2+.

Comparacin estructural con sus homlogos estructurales.

Caracterizar la unin a Ca2+ y otros iones metlicos mediante tcnicas en solucin, tales

como:

Dicrosmo circular.

Desnaturalizaciones registradas por dicrosmo circular.

Emisin de fluorescencia de triptfano.

Cromatografa de interacciones hidrofbicas.

Estudiar del estado de asociacin:

Experimentos de equilibrio y velocidad de sedimentacin por ultracentrifugacin

analtica.

Proponer un mecanismo de respuesta al Ca2+ e interaccin con la quinasa SOS2.

22.. TTCCNNIICCAASS EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALLEESS YY RREESSUULLTTAADDOOSS

Tcnicas experimentales y resultados

2. TCNICAS EXPERIMENTALES Y RESULTADOS 2.1. EXPRESIN Y PURIFICACIN

2.1.1. Introduccin Los cristales de protena, como los de cualquier compuesto, estn caracterizados

microscpicamente por la agrupacin de una poblacin qumica y conformacionalmente nica, en

este caso de molculas de protena, segn un modelo de repeticin peridica. A priori no se

conoce cmo va a cristalizar la macromolcula, por lo que como regla general, las caractersticas

necesarias para abordar el estudio cristalogrfico de una protena son la cantidad, la pureza y la

homogeneidad conformacional de la misma. Esto explica por qu en el pasado las primeras

protenas que se estudiaron por tcnicas biofsicas y cristalogrficas fueron aquellas que eran ms

abundantes, estables y fciles de aislar.

El problema de la cantidad se ha resuelto con la aparicin de mtodos de ingeniera gentica que

hacen posible clonar y sobreexpresar genes en clulas bacterianas o eucariotas. La produccin

masiva de una protena concreta puede llegar a ser de un cuarto del total expresado, pero a altas

concentraciones intracelulares las protenas pueden formar agregados, cuerpos de inclusin o

desnaturalizarse. Por tanto, los niveles de produccin deben ser optimizados para obtener la

mayor proporcin de la protena deseada, funcionalmente activa y en su conformacin natural.

Adems, con el uso de ciertos vectores es posible expresar protenas de fusin con cola de

histidinas o GST, con lo que se facilita la posterior deteccin y purificacin de las protenas diana.

Para el estudio de complejos proteicos se ha elaborado una estrategia muy interesante basada en

la coexpresin de mltiples genes diana en E. coli, habindose diseado para ello vectores

especficos que son capaces de coexpresar varios genes. Con esta estrategia se consiguen

rendimientos ptimos de expresin de cada gen, se fomenta la actividad y solubilidad de las

protenas expresadas y se protege cada subunidad de posibles degradaciones.

La purificacin de una protena tiene como objetivo final obtener el material deseado con el

mximo rendimiento, utilizando el proceso ms corto, y a ser posible, ms econmico. Aunque

suele considerarse simplemente un mero trmite en cristalografa, en este proceso a veces es

posible extraer informacin acerca de propiedades de la macromolcula que pueden ser tiles

para estudios ulteriores. Para desarrollar un buen protocolo de purificacin es recomendable

conocer previamente qu cantidad (del orden de miligramos) y pureza (al menos del 95%) se

necesita, las propiedades fsicas de la macromolcula, informacin sobre el sistema de expresin

-21-


de la misma y el intervalo de condiciones compatibles con la estabilidad de la muestra.

Inicialmente se parte de un protocolo estndar, que ha de ser optimizado y posteriormente

escalado a las cantidades deseadas. La purificacin de muestras biolgicas crudas se puede

dividir en tres fases cromatogrficas diferentes: captura, purificacin intermedia y pulido (Figura

2.1.1).

La fase de captura consiste en concentrar la muestra y en eliminar el grueso de contaminantes. Para ello se usan columnas cromatogrficas con gran capacidad de carga

y buenas propiedades de flujo.

La fase de purificacin intermedia puede abarcar varios pasos y consiste en separar los contaminantes ms importantes, tales como otras protenas y cidos nucleicos, de la

muestra parcialmente pura. En este punto es importante usar columnas de mxima

resolucin, ya que los contaminantes que quedan tienen propiedades cromatogrficas

similares a las de la protena diana. Esto se lleva a cabo combinando tcnicas de distinta

selectividad que se usan en modo de alta resolucin (uso de gradientes de elucin,

tamao de bola ms pequeo, etc.). El flujo y la capacidad de carga tienen que controlarse

para que la resolucin sea mxima.

La fase de pulido sirve para alcanzar la pureza final de la muestra y para eliminar las trazas de contaminantes que incluso pueden ser variantes estructurales, tales como

agregados, de la misma protena. Con ninguna tcnica cromatogrfica se alcanzan

rendimientos del 100%, por lo que el rendimiento final depender del nmero de pasos

incluidos.

Figura 2.1.1: Secuencia de la estrategia de purificacin en tres fases.

-22-


Una vez purificada, para abordar el trabajo cristalogrfico es necesario concentrar la muestra y

conseguir que sta sea homognea. Para medir la homogeneidad (en cuanto a tamao) de una

solucin proteica se puede acudir a la tcnica de ultracentrifugacin analtica. Mediante un

experimento de equilibrio de sedimentacin, se puede extraer informacin de la dependencia de la

masa molecular de la protena con la concentracin. Una protena es homognea cuando

nicamente existe una especie molecular en solucin, y por tanto, no hay ningn equilibrio de

asociacin. La monodispersidad de una solucin proteica tambin es posible estudiarla mediante

cromatografa de penetrabilidad o dispersin dinmica de luz. En el caso de que la solucin

presente distintos agregados moleculares, habr que buscar los ligandos adecuados para

estabilizar alguna de las especies moleculares, o bien separar los unos de los otros si no existe un

equilibrio entre las diferentes especies.

2.1.2. Expresin y purificacin de SOS3 2.1.2.1. Expresin de SOS3 El gen SOS3 de Arabidopsis thaliana fue clonado en el plsmido de expresin pET14b (Novagen,

Madison, WI, USA) para obtener pET-His-SOS3. El plsmido se transform en clulas de

Escherichia coli pertenecientes a la lnea BL21(DE3) para la expresin de la protena con cola de

histidinas (Ishitani et al., 2000). Las cepas de E.coli con la construccin pET-His-SOS3 se

crecieron a 37 C durante toda la noche, para as disponer de un cultivo primario, en medio LB (10

g bacto-tryptona, 5 g extracto de levadura y 5 g de NaCl por litro de solucin) al que se le aadi

ampicilina hasta una concentracin final de 50 g/ml. Alcuotas de 5 ml de este cultivo se

subcultivaron en 500 ml de LB fresco con ampicilina y se dejaron crecer hasta una densidad ptica

(600 nm) DO600=0.6-0.8, situacin en la que las clulas se encontraban en fase exponencial de

crecimiento. La induccin de la expresin de la protena recombinante se inici con la adicin de

IPTG hasta una concentracin final en el medio de 0.3 mM. Despus de tres horas ms de

incubacin se recogieron las clulas inducidas mediante centrifugacin (10 min, 8300 g).

La comprobacin de que la induccin se haba llevado a cabo con xito se realiz mediante

electroforesis, cargando muestras de antes y de despus de inducir la expresin en un gel SDS-

PAGE.

-23-


2.1.2.2. Purificacin de SOS3 Cromatografa de afinidad a nquel

La protena recombinante SOS3 se expres con una cola de histidinas con el fin de purificarla

mediante una cromatografa de afinidad a nquel, ya que los anillos de imidazol de las histidinas

poseen una alta afinidad al catin Ni2+ que se encuentra covalentemente unido a la matriz de la

columna. Este tipo de cromatografas de selectividad tan elevada facilita la purificacin de las

protenas, pudindose conseguir altos grados de pureza. Con este propsito, se resuspendieron

las clulas en tampn 1 (20 mM fosfato de sodio pH 7.4, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazol, 0.05% (m/v)

NaN3) y se lisaron por sonicacin. Despus se centrifug la muestra a 4C (30 min, 34500 g) y se

recogi el sobrenadante resultante, que se filtr (dimetro de poro 0.45 m; Millipore Corporation,

Bedford, MA, USA) para posteriormente aplicarlo a una columna de nquel-sefarosa (volumen de 5

ml; Amersham Biosciences Limited, UK) que previamente estaba equilibrada en tampn 1. A

continuacin se lav la columna con cinco volmenes de tampn 1 para limpiarla de las protenas

que no se unan, seguido de un lavado con tampn 20 mM fosfato de sodio pH 7.4, 0.5 M NaCl,

30 mM imidazol, 0.05% (m/v) NaN3, para eluir las protenas que se unan dbil o

inespecficamente. Los pasos de la purificacin se verificaron mediante una electroforesis en un

gel SDS-PAGE (Figura 2.1.2(a)).

Figura 2.1.2: (a) Expresin y purificacin de SOS3 por cromatografa de afinidad a nquel. Las protenas se analizaron con un gel SDS-PAGE al 12%. Las lneas 1 y 2 muestran las fracciones precipitada y soluble despus de la lisis celular. La lnea 3 muestra la fraccin proteica que no se une a la columna de afinidad. La lnea 4, fraccin de protena eluida con tampn 30 mM imidazol. Lnea 5, fraccin eluda con 500 mM de imidazol. (b) Corte en columna de la protena con cola de histidinas. El anlisis se realiz con un gel SDS-PAGE al 15%. Lnea 1, protena cortada eluida tras la digestin. Lnea 2, protena no cortada eluda con tampn 500 mM imidazol. Las muestras se cargaron en condiciones reductoras. Los marcadores de peso molecular (M, en KDa; BioRad Laboratorios Inc., USA) aparecen indicados. Los geles se tieron con azul de Coomassie.

-24-


Digestin con trombina

Antes de eluir His-SOS3 de la columna de afinidad se hizo un corte de la cola de histidinas en

columna. El extremo que lleva las histidinas suele encontrarse bastante expuesto al solvente y

consiste en una sucesin de seis cargas positivas y a veces genera problemas en la cristalizacin

de la protena porque puede ocasionar desorden y repulsiones intermoleculares. Con este fin se

reequilibr la columna con tampn 1 y se aplic la proteasa trombina (Amersham Biosciences

Limited, UK) a la columna (7.5 unidades de trombina por mg de His-SOS3). La digestin se incub

a 20C durante una noche. La protena SOS3 cortada se eluy con tampn 1 y se comprob la

eficiencia del corte por electroforesis en gel SDS-PAGE (Figura 2.1.2(b)) y mediante

espectrometra de MALDI-TOF. En la Figura 2.1.3 se observa cmo la diferencia de masas entre

His-SOS3 (27876.2 Da) Da y SOS3 (25973.65 Da) era de 1902.55 Da, valor que coincida con la

masa de la cola de histidinas esperada 1882.1 Da, si se considera el error del aparato en la

medida de las masas.

Masa (m/z)10000 20000 30000 40000

% In

tens

idad

0

25

50

75

100

27715.22

27876.23

[M+H]+=27857

[M+2H]2+13943.14

Masa (m/z)10000 20000 30000

% In

tens

idad

0

25

50

75

100

8663.87

25973.65

[M+H]+=25975

[M+2H]2+

12987.04

[M+3H]3+

(a) (b) Figura 2.1.3: Espectro MALDI-TOF de His-SOS3 (a) y SOS3 (b).

Intercambio aninico

La pureza de SOS3 fue mejorada mediante una cromatografa de intercambio inico con una

columna Resource Q (volumen 6 ml; Amersham Biosciences Limited, UK). Primero se cambi el

tampn en el que se encontraba SOS3 con una columna PD-10 (Amersham Biosciences Limited,

UK) para dejarla en tampn 2 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.05 M NaCl, 0.05% NaN3). Una vez

preequilibrada la columna, cargada la muestra y lavada con cinco volmenes de tampn 2 se

aplic un gradiente de 0.05 M a 0.5 M de NaCl. La protena eluy a 0.1 M NaCl (Figura 2.1.4). El

-25-


segundo pico que se recogi (0.5 M NaCl) tambin corresponda a SOS3, pero deba de ser una

variante estructural menos estable, quiz mal plegada, que precipitaba al intentar concentrarla.

Volumen

Abs

orba

ncia

(280

nm

)

0,0

0,2

0,4

0,6

Con

duct

ivid

ad(m

S/c

m)

0

20

40

60

80

Figura 2.1.4: Cromatografa de intercambio aninico de SOS3. La lnea roja representa la conductividad de la solucin. La lnea verde representa la absorbancia registrada a 280 nm.

Finalmente, la muestra de SOS3 pura se dej en tampn 2 con la ayuda de una columna PD-10

(Amersham Biosciences Limited, UK) y se concentr a 20 mg/ml con un concentrador de protenas

Amicon YM-10 (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA). La concentracin final de SOS3 se

determin espectrofotomtricamente usando un coeficiente de absorcin molar de 10930 M-1cm-1

a 280 nm (http://us.expasy.org). La pureza final de la muestra fue examinada mediante

electroforesis en gel SDS-PAGE y por espectrometra de masas (Figura 2.1.3), donde se obtuvo

una masa, (M+H) = 25975 Da, que era coincidente con el valor esperado, 25974.7 Da.

Para corroborar la homogeneidad de la muestra se realiz un experimento de equilibrio de

sedimentacin en funcin de la concentracin de SOS3, haciendo uso de una ultracentrfuga

analtica Beckman Optima XL-A de seis canales (paso ptico de 12 mm) y un rotor AnTi50. Los

resultados mostraron que SOS3 se encuentra en equilibrio entre la forma monomrica y dimrica

(Apartado 2.4.2). La heterogeneidad que presentaba la muestra se contrast mediante la

realizacin de una cromatografa de penetrabilidad con una columna Superdex 200 (Amersham

Biosciences Limited, UK). Una vez equilibrada la columna con dos volmenes de tampn 2, se

cargaron 3 ml de muestra a 1.9210-4 M. Durante la cromatografa se recogieron dos picos. A

pesar de que stos salieron a unos tiempos tericos correspondientes a protenas de mayor masa

molecular, se asumi que el primero y mayoritario corresponda al dmero y el segundo, que era

aproximadamente un 5% del primero, al monmero. Las fracciones recogidas se examinaron

mediante electroforesis en gel SDS-PAGE para corroborar que los picos recogidos correspondan

a SOS3. Este tipo de cromatografa es muy sensible a factores como la forma de la

-26-
http://us.expasy.org/


macromolcula, por lo que el desajuste entre el tiempo de elucin y la masa molecular de la

protena podra deberse a que la forma del monmero y del dmero de SOS3 no es globular.

2.2. CRISTALIZACIN

2.2.1.- Introduccin La determinacin de la estructura tridimensional de cualquier molcula por difraccin de rayos X

depende, en primer lugar, del xito en la obtencin de monocristales adecuados para someterlos a

difraccin.

Un cristal se puede considerar como una red imaginaria de unidades elementales idnticas,

denominadas cada una de ellas celdilla unidad. La repeticin por translacin en las tres

direcciones del espacio de este elemento estructural genera el volumen del cristal. Si el cristal

est formado por celdillas unidad, la celdilla a su vez presenta en su interior una unidad mnima,

denominada unidad asimtrica. La aplicacin de ciertas operaciones de simetra a la unidad

asimtrica genera la celdilla unidad, que est definida por tres ejes (a,b,c) y tres ngulos

interaxiales (, , ) (Figura 2.2.1) que se usan como sistema de referencia para las coordenadas

atmicas.

Figura 2.2.1: Celdilla unidad (derecha). El apilamiento de celdillas forma el cristal (izquierda). Imagen cedida por los autores, Dr. Martn Martnez-Ripoll y Dr. Juan A. Hermoso y publicada en el libro Estructura

de Protenas (Gmez-Moreno et al., 2003).

Los cristales de protenas difieren mucho de los cristales convencionales de molculas pequeas

(como los compuestos orgnicos en general) o sales inorgnicas (como la sal comn). Las

caractersticas de los primeros estn condicionadas por la naturaleza propia de estas

macromolculas. As, debido al tamao de las protenas y a su esfera de solvatacin, el volumen

de la celdilla unidad suele ser bastante grande. Adems, como las macromolculas se

-27-


empaquetan con baja densidad, al ordenarse en el cristal dejan grandes canales constituidos por

molculas de agua desordenadas y el contenido en solvente suele ser elevado (50-70%)

(Mathews, 1968). Por todo ello, las interacciones entre molculas son muy pequeas, de manera

que los cristales son muy frgiles y, en ocasiones, suelen presentar un cierto grado de desorden.

2.2.1.1. Principios bsicos de la cristalizacin Para producir cristales de cualquier compuesto, las molculas en solucin, en presencia de

agentes precipitantes suaves, son conducidas a un estado de sobresaturacin, estado

termodinmicamente inestable, que posteriormente deriva en la aparicin de una fase cristalina,

de manera que las molculas son llevadas a un equilibrio entre las fases slida y lquida (Figura

2.2.2) (Ducruix & Gieg, 1992).

El proceso de cristalizacin se puede dividir en dos fases: la fase de nucleacin (formacin de los

primeros agregados ordenados) y la fase de crecimiento del cristal (en donde el conjunto de

interacciones atractivas entre las molculas son mximas, y las repulsivas mnimas).

Figura 2.2.2: Descripcin esquemtica de un diagrama bidimensional de solubilidad, en el que se ilustra el cambio de concentracin de protena con la concentracin de agente precipitante (Ducruix & Gieg, 1992).

Durante este proceso hay que superar una barrera energtica, como ocurre en cualquier reaccin

qumica (Figura 2.2.3). En el caso de las protenas, la superacin excesiva del punto de

saturacin, sobre todo si sucede rpidamente, conlleva con gran frecuencia la precipitacin de

protena en forma de agregados amorfos, no ordenados, que no son adecuados para los estudios

de difraccin. Por el contrario, si la sobresaturacin es leve se alcanza un estado metaestable que

no da lugar a ncleos cristalinos (a menos que se le aporte energa al sistema) pero que sera la

zona ideal para el crecimiento de cristales sin nucleacin de otros nuevos (Figura 2.2.2). Por tanto,

la formacin de cristales requiere alcanzar lentamente un grado limitado de sobresaturacin, para

que se formen pocos ncleos, de manera que la masa proteica se invierta en el crecimiento de los

cristales y as stos adquieran un buen tamao.

-28-


Figura 2.2.3: Diagrama de energa de la cristalizacin. Imagen extrada de la pgina web http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Crystals.

2.2.1.2. Preparacin del experimento de cristalizacin

Antes de comenzar a cristalizar la protena es conveniente controlar ciertos aspectos:

Est la protena pura?

Comprobar por electroforesis y espectrometra de masas.

Est bien plegada?

Comprobar la actividad de la protena, si es el caso, y hacer un espectro de dicrosmo circular

para ver si presenta estructura secundaria.

Hace tiempo que se purific?

Con el tiempo, las protenas se degradan y generan heterogeneidad.

Es monodispersa?

Corroborar mediante cromatografa de penetrabilidad, experimentos de equilibrio de

sedimentacin y ensayos de dispersin dinmica de luz.

Necesita estar la protena en condiciones reductoras?

Si tiene cistenas, usar -mercaptoetanol o DTT en la solucin proteica.

Es la protena estable a temperatura ambiente?

Se ha cristalizado alguna vez alguna protena similar?

Necesita la protena la adicin de algn compuesto para permanecer estable en

solucin?

En ocasiones las protenas unen ligandos que estabilizan ciertas regiones mviles de la protena,

que pueden favorecer las interacciones intramoleculares reduciendo la flexibilidad, cambiar las

propiedades de superficie de la protena e incluso causar cambios conformacionales. En estos

-29-


casos, antes de comenzar con la cristalizacin sera aconsejable adicionar dicho ligando o agente

estabilizante a la solucin proteica.

Se dispone de diferentes construcciones de la protena?

A veces, las protenas estn formadas por distintos dominios, o poseen extremos mviles que

confieren flexibilidad, caractersticas que no favorecen la cristalizacin. En estos casos, es

aconsejable hacer uso de las tcnicas de biologa molecular para producir los dominios por

separado o la protena sin los extremos mviles, eliminando as el carcter flexible de la

macromolcula.

Es posible trabajar con una protena homloga de otro organismo?

A veces, una simple mutacin puntual es suficiente para que una protena cristalice. Trabajar con

especies diferentes es la manera ms fcil de disponer de una coleccin de mutaciones puntuales

que no afecten a la funcionalidad, pero que confieran mayor estabilidad a la protena. Los

organismos termfilos son un buen ejemplo, ya que sus protenas tienen la caracterstica general

de ser muy estables.

2.2.1.3. Proceso experimental de cristalizacin La cristalizacin es un proceso que depende de muchos parmetros qumico-fsicos que an hoy

en da no se han llegado a racionalizar y controlar totalmente, con lo que se puede considerar que

este proceso es fundamentalmente emprico.

La estrategia que se sigue para alcanzar la sobresaturacin consiste en empezar con una

concentracin relativamente elevada de protena (alrededor de 10 mg/ml), y aumentar la

concentracin por eliminacin gradual de agua, introduciendo adems ciertas variables que

afecten a la solubilidad de la protena, como son:

Naturaleza y concentracin de diferentes agentes precipitantes, como por ejemplo

polmeros (los ms utilizados son los polietilenglicoles), sales, compuestos orgnicos

voltiles y no voltiles, etc.

pH.

Temperatura.

Naturaleza y concentracin de aditivos, como por ejemplo sales, ligandos comunes de

protenas, etc.

Esta bsqueda de las condiciones de cristalizacin se desarrolla en dos pasos, primero se realiza

una bsqueda de condiciones, seguida, en segundo lugar, de una optimizacin sistemtica de las

condiciones iniciales.

-30-


Bsqueda de condiciones iniciales: Debido a que el nmero de factores que controlar es excesivo, es imposible realizar una bsqueda sistemtica en la que se exploren todos los

factores posibles. Por este motivo se han diseado estrategias de muestreo, que utilizan

matrices que exploran el espacio de cristalizacin. La matriz ms utilizada actualmente fue

desarrollada por Jancarin y Kim (1991) y consiste en el rastreo de condiciones que han

dado en el pasado resultados favorables. Sin embargo tambin existen programas que

generan matrices que exploran al azar el espacio de cristalizacin, basndose nicamente

en incompatibilidades de reactivos.

Optimizacin: En primer lugar se hace un rastreo alrededor de las condiciones iniciales, variando la concentracin de precipitante, de protena, la temperatura o el mtodo de

cristalizacin. Una vez refinadas estas condiciones, se prueban ciertos aditivos, como

compuestos orgnicos, cationes, aniones, detergentes, etc. Adems, tambin se recurre

a las tcnicas de macro y microsembrado y al crecimiento de cristales en geles de

agarosa.

2.2.1.4. Mtodos de Cristalizacin Existen muchos mtodos de cristalizacin: la difusin de vapor, la dilisis, la contradifusin a

travs de interfase o el denominado microbatch.

La difusin de vapor es la tcnica ms ampliamente utilizada. Una pequea gota que contiene la

solucin de protena y la de cristalizacin, se equilibra contra un reservorio que contiene la

solucin de cristalizacin a una concentracin mayor que en la gota. El equilibrio se consigue por

difusin de las especies voltiles (agua o solvente orgnico), hasta que la presin de vapor en la

gota se iguala con la del reservorio. Aunque existen diversas modalidades de esta tcnica, la ms

utilizada es la de gota colgante (Figura 2.2.4(a)).

El mtodo de contradifusin se utiliza para la optimizacin de cristales a partir de condiciones de

cristalizacin conocidas. Como se muestra en la Figura 2.2.4(b), la solucin de protena, en

contacto con la solucin de cristalizacin a travs de una interfase lquido-lquido, se equilibra por

difusin de la segunda, que es ms densa, a travs de la primera. El experimento se realiza en un

capilar de pequeo dimetro (0.3 mm), con lo que se minimiza el transporte de masa por

conveccin, y solo se produce transporte por difusin, con lo que, en principio, existe un aporte de

protena al cristal ms regular, que debe redundar en un crecimiento cristalino ms ordenado y en

cristales con menores problemas mecnicos. Los cristales aparecen a lo largo del capilar debido

al gradiente de sobresaturacin que se genera, obtenindose al principio precipitados amorfos y, a

lo largo del capilar, cristales creciendo separados unos de otros (Gavira et al, 2002). Una ventaja

-31-


adicional de esta tcnica es que, en general, no es necesario manipular los cristales para recoger

datos de difraccin.

Solucin proteica

Solucin cristalizante

(a) (b)

Figura 2.2.4: Esquema de los montajes experimentales de cristalizacin mediante (a) la tcnica de difusin de vapor en gota colgante y (b) la de contradifusin en capilar (Gavira et al., 2002).

2.2.2. Cristalizacin de SOS3 y sus complejos

Las condiciones preliminares de cristalizacin se establecieron con el mtodo de difusin de vapor

en gota colgante a 293 K (mtodo y temperatura que se utilizaron en los experimentos que se

enumerarn, a no ser que se indique lo contrario) y usando las soluciones de cristalizacin

Crystal Screen I, Crystal Screen II, Crystal Screen Lite e Index (Hampton Research, CA,

USA), que estn basadas en la matriz de rastreo de condiciones ideada por Jancarin y Kim

(1991). As, se mezclaron 1 l de SOS3 pura con 1 l de solucin de cristalizacin y las gotas se

pusieron en equilibrio con 500 l de solucin de cristalizacin.

Se obtuvieron microcristales en forma de aguja con la condicin 40 del Crystal Screen Lite

(Hampton Research, CA, USA) (Tabla 2.2.1.a). Sin embargo, estos cristales, que aparecan en 3

4 das no evolucionaban y eran demasiado pequeos para someterlos a difraccin.

-32-


Muestra Precipitante Aditivo *Relacin

a SOS3 10% (v/v) isopropanol, 0.1 M tampn citrato pH 5.6, - 1:1

b SOS3-Mn 20% (m/v) PEG 4K, 30% (v/v) MPD, 0.1 M tampn citrato pH 4.9 - 2:1

c SOS3 20% (m/v) PEG 4K, 30% (v/v) MPD, 0.1 M tampn citrato pH 5.2sacarosa 30% (m/v) y etanol 30% (v/v) 2:1:0.75:0.75

d SOS3-Ca 24% (w/v) MPD, 18% (w/v)

PEG 4K, 0.1 M tampn citrato sdico pH 4.8

NaI 1 M 2:1:0.75

e SOS3-Mn-Ca 24% (w/v) MPD, 16% (w/v) PEG 4K, 0.1 M tampn citrato sdico

pH 4.8 NaI 1 M 2:1:0.75

* Relacin indica los microlitros de protena, precipitante y aditivos que se pusieron en la gota.

Tabla 2.2.1: Condiciones de cristalizacin de SOS3 con el mtodo de gota colgante.

Con el fin de controlar mejor el sistema de cristalizacin y optimizar los cristales se sustituy el

isopropanol por MPD, precipitante orgnico similar pero no voltil, y se adicion PEG 4K para

estudiar el efecto de la inclusin de un precipitante de cadena larga en las condiciones de

cristalizacin (Huang et al, 1999) (Tabla 2.2.1.b). Adems, a la solucin proteica (10 mg/ml) se le

adicion MnCl2 hasta una concentracin de 3.85 mM (relacin molar protena:Mn2+ 1:10), ya que

se haba visto previamente, por experimentos de desnaturalizacin trmica registrada por

dicrosmo circular, que el Mn2+ estabilizaba a SOS3 (Apartado 2.4.3.2). De esta manera, al cabo

de una semana, se obtuvieron agrupaciones de cristales en forma de aguja y de placa (Figura

2.2.5(a)). Sin embargo, estos cristales tampoco eran aptos para recoger datos de difraccin.

El uso de colecciones de pequeas molculas o aditivos, que se aaden a las condiciones de

cristalizacin, es una estrategia adecuada para la mejora de las condiciones de cristalizacin. As,

se prob la coleccin de aditivos de la casa comercial Hampton Research (CA, USA) alrededor de

las condiciones en que se obtuvieron las placas. Con la utilizacin de sacarosa como aditivo y

SOS3 (10.7 mg/ml) se consigui otro tipo de cristales en forma de barra (Tabla 2.2.1.c). La calidad

de estos cristales mejor al adicionar etanol a la gota (Figura 2.2.5(b)). Sin embargo, no se

consiguieron datos de difraccin a una resolucin mayor de 3.2 .

En ocasiones, debido a la fragilidad de los cristales de protena, su manipulacin, o la propia

tensin superficial de la gota, producen una destruccin interna del orden cristalino y por tanto de

la difraccin. En estos casos, el uso del mtodo de cristalizacin de contradifusin en capilar es

adecuado. Para ello, se mezclaron 4 l de SOS3 (15 mg/ml) con 1.2 l de sacarosa (30% (m/v) y

-33-


-34-

1.2 l de etanol (30% (v/v)). El volumen de solucin madre utilizado duplicaba al de la mezcla

proteica. Se dej el capilar en posicin horizontal y al cabo de dos semanas se obtuvieron

cristales que se estudiaron por difraccin sin sacarlos del capilar. Se alcanzaba una resolucin

similar a la obtenida con los cristales crecidos por difusin de vapor en gota colgante, por tanto, la

mala calidad de los mismos no se deba a su manipulacin, por lo que se asumi la existencia de

un gran desorden interno.

Figura 2.2.5: Imgenes de cristales de SOS3 en diferentes condiciones de cristalizacin, indicando el tamao de los mismos.

Finalmente se consiguieron cristales de SOS3 en complejo con Ca2+ (Figura 2.2.5(c)), y con Ca2+ y

Mn2+ (Figura 2.2.5(d)). Con la idea de partir de una muestra lo ms homognea qumica y

conformacionalmente, y para obtener mejores cristales, se someti la muestra a una incubacin

durante 1 h con una resina quelante (Hampton Research, CA, USA), que une preferentemente

iones metlicos divalentes (Dunn et al., 1980). A continuacin se aadi controladamente CaCl2

en una proporcin SOS3(10 mg/ml):CaCl2 1:10 y por otro lado CaCl2 y MnCl2 en una relacin

1:10:10. Con esta estrategia los cristales mejoraron, y ms an con la adicin de yoduro como

aditivo en las condiciones de cristalizacin (Tabla 2.2.1.d y e) y, como se ver posteriormente, la

calidad de los mismos fue suficiente para permitir la resolucin estructural.


2.3. TCNICAS CRISTALOGRFICAS Y RESOLUCIN ESTRUCTURAL

2.3.1. Conceptos generales

La biologa molecular tiene como fin ltimo entender los procesos biolgicos en trminos de la

fsica y la qumica de las macromolculas que participan en ellos. Una de las diferencias

esenciales entre la qumica de los sistemas vivos y los inertes es la gran complejidad estructural

de las macromolculas biolgicas. Por tanto, la qumica de la vida no se podr desvelar sin antes

conocer a resolucin atmica, o cercana a la atmica, la estructura de las macromolculas

biolgicas, especialmente las protenas (Branden & Tooze, 1991), que son las verdaderas

mquinas de la vida. As, entender la estructura de cada protena es entender en qu consiste la

vida (Max Perutz, Premio Nobel de Qumica).

La Cristalografa de rayos X es una de las tcnicas fsicas ms potentes para la obtencin de

informacin estructural de la materia ordenada. El estudio estructural realizado proporciona una

fotografa tridimensional, a escala atmica, del material cristalizado y, aplicado a las protenas,

proporciona informacin de la estructura tridimensional, plegamiento y tambin detalles de un gran

significado fsico-qumico, tales como distancias, ngulos de enlace, estado trmico vibracional de

los tomos o empaquetamiento cristalino, informacin clave para entender la funcin biolgica.

La tcnica alternativa para la determinacin estructural de molculas a alta resolucin es la

Resonancia Magntica Nuclear (RMN). Sin embargo, esta tcnica est limitada por el tamao

molecular. La Cristalografa de rayos X, por el contrario, no presenta dicha limitacin y se aplica al

estudio de la estructura tridimensional de protenas, virus, cidos nucleicos, complejos

nucleoproteicos y complejos protena-protena. Por otro lado, la microscopa electrnica se ha

convertido recientemente en una tcnica complementaria para grandes agregados moleculares,

aunque con un grado de resolucin mucho menor.

Concepto de difraccin

La difraccin de rayos X es el fenmeno fsico fundamental a travs del cual se manifiesta la

interaccin de los rayos X con la materia cristalina. Los rayos X, al incidir sobre un cristal,

interaccionan con los electrones de los tomos que componen el cristal, hacindolos vibrar

acopladamente con las variaciones peridicas de su campo elctrico. Los electrones oscilantes se

convierten, de esta manera, en focos de nueva radiacin X que se emite en cualquier direccin,

fenmeno que se denomina dispersin. Estos rayos X dispersados por los electrones interfieren

entre s, pudindose dar interferencias destructivas. Sin embargo, como los tomos en un cristal

-35-


estn ordenados de un modo regular y peridico, tambin ocurre que en determinadas

direcciones, las ondas interfieren constructivamente, reforzndose, dando lugar al fenmeno de

dispersin cooperativa o difraccin.

El modo en que la Cristalografa de rayos X llega al conocimiento de la estructura cristalina de

cualquier material puede comprenderse mejor si se compara con el smil que representa la

observacin de un objeto a travs de un microscopio ptico. En ste, la radiacin dispersada por

el objeto en estudio se recombina de nuevo, a travs de un sistema de lentes, para dar lugar a la

imagen aumentada del objeto dispersor. Sin embargo, no existe ninguna lente que sea capaz de

focalizar los rayos X dispersados por los tomos. Para ello, las tcnicas cristalogrficas hacen uso

de clculos matemticos denominados sntesis de Fourier, con los que se consigue focalizar

los rayos X.

Toma de datos de difraccin

En los experimentos de difraccin se hace incidir un haz monocromtico de rayos X (con una

longitud de onda alrededor de 1 ) sobre un monocristal de la muestra en estudio.

Figura 2.3.1: (a) Esquema de un experimento de difraccin con geometra Phi. (b) Esquema de un difractmetro con geometra Kappa.

El espectro de difraccin de rayos X contiene un patrn de intensidades correspondientes a los

haces difractados por el cristal y la recogida de datos de difraccin consiste en la medida de

dichas intensidades y su disposicin espacial respecto al sistema de referencia del laboratorio. El

diseo experimental implica la toma de imgenes sucesivas, en un detector plano situado en la

perpendicular del haz de rayos X, para distintas posiciones angulares del cristal, hasta obtener un

-36-


conjunto de datos completo. Esto se consigue mediante oscilaciones simples del cristal (geometra

Phi) o bien mediante una combinacin de giros ms complejos (geometra Kappa) (Figura 2.3.1).

La estrategia de recogida de los datos de difraccin y la eleccin de la fuente de radiacin

depender del tipo de datos de difraccin que sean necesarios para poder abordar la resolucin

estructural, pudindose realizar en un difractmetro con fuente convencional o en una estacin de

radiacin sincrotrn:

Las caractersticas tcnicas de un difractmetro con fuente convencional le confieren una

gran versatilidad y un bajo coste a la hora de disear y realizar una estrategia de recogida

de datos (Figura 2.3.2(a)).

Tanto en una fuente convencional, como de sincrotrn, es posible la implantacin de la

geometra Kappa, clave para poder orientar el cristal y disear estrategias para obtener

conjuntos de datos de difraccin completos y/o muy redundantes (Figura 2.3.1(b)).

Un sincrotrn es un acelerador de partculas en donde se genera radiacin de diferentes longitudes de onda, entre ellas rayos X (2.3.2(b)). La radiacin X que se produce es muy

brillante, es decir muy intensa y concentrada, caracterstica muy importante para el caso

de cristales de protena, donde el fenmeno de difraccin es dbil. Otra ventaja del

sincrotrn frente a las fuentes convencionales es que la radiacin producida es

sintonizable. Esto permite recoger datos a diferentes longitudes de onda que, como se

ver posteriormente, puede ser muy til a la hora de resolver las estructuras.

Figura 2.3.2: (a) Imagen un difractmetro con fuente convencional. (b) Imagen de una estacin de radiacin sincrotrn.

Los cristales de protena, debido a las caractersticas especiales que presentan, sufren un gran

deterioro al ser expuestos a la radiacin. As, la longitud de onda penetrante y la intensidad del

haz, unidas a prolongados tiempos de exposicin, provocan fenmenos de absorcin que hacen

que la muestra se caliente, generndose radicales libres en las molculas de protena y solvente,

que, con el tiempo, dan lugar a daos irreparables en el cristal que redundan en la prdida de

orden interno. Por este motivo es conveniente enfriar el cristal durante el proceso de difraccin

-37-


(Garman & Schneider, 1997), mediante un flujo laminar de nitrgeno fro (120-100 K) (Figura

2.3.1(a)). Para hacer uso de la criocristalografa es necesario previamente baar el cristal en una

solucin crioprotectora (glicerol, PEGs, etilenglicol, sacarosa, etc.) (McFerrin & Snell, 2002) para

que las molculas de agua no estructurales se reemplacen por las crioprotectoras, impidiendo as

la formacin de hielo y la consiguiente ruptura del cristal.

Resolucin estructural

Como se ha mencionado anteriormente, un espectro de difraccin de rayos X consiste en un

patrn de intensidades. La informacin estructural est concentrada en dicho patrn de difraccin

(Figura 2.3.3) y en forma de los denominados factores de estructura, asociados a cada intensidad,

cuya fase se pierde en el experimento de difraccin.

Figura 2.3.3: Proceso de resolucin estructural.

Haciendo uso de la teora de interferencias de ondas es fcil demostrar que la geometra del

espectro da cuenta de la celdilla unidad y la simetra de las intensidades informa de la simetra

cristalina. Adems, se puede establecer una relacin directa entre la estructura cristalina y el

experimento, mediante la transformada de Fourier (Figura 2.3.4).

Figura 2.3.4: Funcin de densidad electrnica. V es el volumen de la celdilla unidad y (hkl) es la fase asociada al mdulo del factor de estructura, F(hkl). Es interesante resaltar el hecho de que la densidad electrnica en un punto viene determinada por la informacin contenida en todos los factores de estructura, es decir, por la informacin de todo el espectro. Inversamente, el valor de un factor de estructura (mdulo y fase) viene determinado por las posiciones de todos los tomos que forman la estructura, (xyz).

-38-


Esta expresin (Figura 2.3.4) relaciona la densidad electrnica, (xyz), en cada punto (xyz) del

cristal, es decir la estructura, y el experimento de difraccin, donde F(hkl)es la raz cuadrada de

la intensidad de cada punto (hkl) del espectro de difraccin. Para poder resolver la ecuacin es

necesario disponer no solo de los mdulos, F(hkl), sino tambin de las fases, (hkl), asociadas

a los factores de estructura, pero cuya informacin se pierde durante el experimento. Esto

constituye el denominado problema de la fase y el trabajo del cristalgrafo consiste en averiguar

el valor de (hkl). Mediante diferentes metodologas que se expondrn a continuacin, es posible

obtener las fases, pudindose calcular el mapa de densidad electrnica y, por tanto, la estructura.

Figura 2.3.5: Relacin entre la estructura y un espectro de difraccin.

Metodologas para recuperar las fases

Conocida la amplitud (Fexp(hkl)) no es posible derivar, de manera directa, el valor de la fase

(exp(hkl)), nicamente conociendo la estructura molecular o la densidad electrnica es posible

saber los valores de las fases (c(hkl)). Por tanto, es necesario disponer previamente de algn

conocimiento parcial de la densidad electrnica o de la estructura para calcular unas fases

iniciales, c(hkl)

universidad complutense de madrid - …biblioteca.ucm.es/tesis/qui/ucm-t28354.pdf · creo que he...

Documents