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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los
Alimentos
“LACTOCOCCUS LACTIS” PRODUCTORES DE PEDIOCINA PA-1 Y ENTEROCOCOS AISLADOS DE
LECHE MATERNA COMO AGENTES BIOCONSERVANTES EN QUESOS
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Carlota Reviriego Herráez
Bajo la dirección de los doctores Juan Miguel Rodríguez Gómez y Leónides Fernández Álvarez
Madrid, 2009
• ISBN: 978-84-692-1096-3 © Carlota Reviriego Herráez, 2008
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN, BROMATOLOGÍA
Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
Lactococcus lactis PRODUCTORES DE PEDIOCINA PA-1 Y ENTEROCOCOS
AISLADOS DE LECHE MATERNA COMO AGENTES BIOCONSERVANTES
EN QUESOS
Memoria que para optar al grado de
Doctor, con mención honorífica
“Doctorado Europeus”, presenta la
Licenciada Carlota Reviriego Herráez
Madrid, marzo de 2008
JUAN MIGUEL RODRÍGUEZ GÓMEZ, PROFESOR TITULAR DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA Y LEÓNIDES FERNÁNDEZ ÁLVAREZ, PROFESORA TITULAR DE TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID,
CERTIFICAN:
Que la Tesis Doctoral titulada “Lactococcus lactis productores de pediocina PA-1 y
enterococos aislados de leche materna como agentes bioconservantes en quesos”, de la
que es autora la Licenciada Carlota Reviriego Herráez, ha sido realizada en el
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la
Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, bajo la dirección
conjunta de los que suscriben, y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de
Doctor con mención honorífica “Doctorado Europeus”.
Madrid, 27 de febrero de 2008
Los Directores de la Tesis Doctoral,
Juan Miguel Rodríguez Gómez Leónides Fernández Álvarez
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDF A C U L T A D D E V E T E R I N A R I A
DPTO. DE NUTRICIÓN, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
CIUDAD UNIVERSITARIA 28040 MADRID
A mis dos familias, la familia de la que vengo y la familia que he creado
“Si crees totalmente en ti mismo, no habrá nada que esté fuera de tus posibilidades”
Wayne W. Dyer
“Estar preparado es importante, saber esperar lo es aún más, pero aprovechar el momento adecuando es la clave de la vida”
Arthur Schnitzler
“Me he arrepentido de haber hablado, pero nunca de haber guardado silencio”
Publio Siro
Quisiera dar las gracias a todos los que durante el camino de realización de esta Tesis Doctoral he ido encontrando, a todos los que, con sus consejos y experiencias me han ayudado a llegar hasta el final de esta etapa.
A Lorenzo de la Hoz, director del Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, por acogerme en el Departamento y por la amabilidad mostrada a lo largo de estos años. Gracias Lorenzo por esas charlas matutinas y por escucharme, ¡que se que hablo mucho!
A mis directores de tesis, por abrirme las puertas al maravilloso mundo de la investigación. A Juan Miguel, por sus infinitos conocimientos dentro y fuera de la ciencia, por su preocupación diaria y su aliento en los momentos bajos. A Leo, por su tranquilidad y su calma, algo que a mí me falta, y por sus eternas jornadas de trabajo en búsqueda del camino a seguir. Por supuesto a ambos por su paciencia, por su trabajo y su dedicación hasta conseguir culminar este proyecto. Muchas gracias por todo.
A todas las personas que han pasado por el laboratorio y que han formado parte de mi grupo de investigación. A Rocío, por su amistad, por saber escuchar, por esos consejos y por no dejar de aconsejarme aun sabiendo que pocas veces los hago caso. Gracias por esas largas conversaciones telefónicas y por saber estar siempre cuando se te necesita. Eso sí que es una amiga. A Esther por su cariño y por sus contagiosas ganas de trabajar, por su ayuda desinteresada y como no, por resumir como nadie los capítulos de las series que me perdía por acostarme “como las gallinas”.
A todos los compañeros y profesores del Departamento que he conocido estos largos años y que han hecho posible que la convivencia fuera mucho más sencilla durante las largas jornadas de trabajo. Mención especial a Billy por su apoyo y por esos viajes por el BUS-VAO de los que guardo un recuerdo tan entrañable, a Meri por las profundas conversaciones sobre la familia y por descubrirme el instinto maternal y a Rakelita, por estar ahí aunque fuera en silencio.
A todas las personas que conocí durante mis estancias en Norwich y en Holanda. A Tracy Eaton y Jan Kok, por acogerme en sus grupos de trabajo y por preocuparse de que mi estancia fuera lo más agradable posible. A Cristina por esos viernes de pelis tumbadas en el sofa, por las tardes de compras y por comerse mis macarrones
“bomba”. A Satya por preocuparse como un “hermano” y enseñarme a apreciar las bondades de la cultura india. Y como no, a Naomi, Rute, Rasmus y Chris, por esos irrepetibles “Friday meetings” entre “toasties”, “triples” y “kaas suflés”.
A mis amig@s por aguantarme con paciencia, a los viejos, en especial a Noelia, por una sonrisa que da moral, y a Virginia, por crecer a mi lado. A los nuevos, a los Fredis, los Txemas, los Cornflakes, los Juanjos, Earlybird, Inés, a los de Teagasc, Evonne, Raffy, Jarek… a tod@s, por animarme a tirar p´alante. A los de la “facul”, Cristina y Sergio, por seguir mis pasos y no perderme la pista. A las de la Resi, Mar, Elena y Luisa, por seguir ahí a pesar del tiempo que ha pasado. A las “mamás de Julio 2006”, por su confianza y su apoyo todos estos meses y por compartir conmigo la experiencia de ser madre. Muchas gracias amig@s, caminando a vuestro lado todo resulta más fácil.
A mis dos familias, por estar ahí y por quererme. A Diego y a Fer por el entusiasmo de hermano pequeño, y sobre todo por ese afán proteccionista que os sale de dentro cuando os tocan a alguien querido. A mi madre, Mer, por su saber estar, su cariño y comprensión y por “no preguntar”. Me harían falta miles de hojas para agradecértelo todo, y ahora que la madre soy yo, mucho más. A mi padre, Jose, por haber andado previamente por mi camino y haber encontrado las piedras antes que yo. Por haberme dejado sus huellas marcadas para ayudarme a no tropezar y por esforzarse en comprender cuando, a pesar de todo, me empeño en pisar fuera de ellas. A Jorge por no darse nunca por vencido, por creer en mí y por quitarme la razón cuando no la tengo, que no es tarea fácil. Sin tu persistencia hace tiempo que habría “partido las peras” y lo sabes. Sin dudarlo un segundo, y aunque no siempre sea capaz de demostrarlo, Jimena y tú sois lo mejor que me ha pasado en la vida. Es evidente que no soy fácil como hija, ni como hermana, ni como pareja, ni probablemente como madre, así que gracias por quererme a pesar de las dificultades.
A “los Peter” y especialmente a Ana por su apoyo logístico, sin vuestra ayuda esto sí que no habría sido posible. Ana, teniendo una prima como tú, ¿para qué necesito más? Ya se sabe, quien tiene una prima tiene un tesoro, y más si es médico ;-)
Y esto es todo, aunque seguro que me olvido de alguien…
Resumen ___________________________________________________________________________________
RESUMEN/SUMMARY
Resumen ___________________________________________________________________________________
Resumen ___________________________________________________________________________________
RESUMEN
A) Producción heteróloga de pediocina PA-1 en cepas de Lactococcus lactis.
Empleo como cultivos bioprotectores para la elaboración de queso
En esta Tesis se han desarrollado diversos sistemas para la producción
heteróloga de pediocina PA-1 en cepas de Lactococcus lactis previamente
seleccionadas para la elaboración de quesos debido a sus buenas propiedades
tecnológicas. Inicialmente, el plásmido pFI2160, que contiene el gen híbrido L-pedA
(codifica la fusión entre el líder de la lactococina A y la propediocina PA-1) y los
genes lcnC y lcnD (codifican el sistema de secreción de la lactococina A) se introdujo
en L. lactis ESI 153 y L. lactis ESI 515 (Nis+). El nivel de producción de pediocina de
los respectivos transformantes (L. lactis CL1 y CL2) fue de aproximadamente 600 y
400 ng/ml, respectivamente, lo que representa un 30 y un 20% de la cantidad
producida por Pediococcus acidilactici 347, una cepa que produce dicha bacteriocina
de forma natural. La transformación de L. lactis ESI 515 con pFI2160 no afectó a su
capacidad para producir nisina. Los ensayos de actividad bacteriocinogénica revelaron
la estabilidad de pFI2160 en los dos hospedadores, tanto en condiciones selectivas
como no selectivas.
Posteriormente, se intentó mejorar la producción de pediocina en los mismos
hospedadores mediante la introducción de los plásmidos pMC117, pRK119 y
pCNC16, que contienen el operón completo de la pediocina bajo control del promotor
P32. En este caso, el nivel de producción de pediocina de todos los transformantes fue
mayor que el obtenido en el estudio anterior basado en el intercambio del líder y
sistema de transporte de la lactococina A. Con relación a las cepas recombinantes
derivadas de L. lactis ESI 153, la concentración de pediocina en los sobrenadantes de
L. lactis RK1 (pRK119) y CNC1 (pCNC16) fue notablemente superior (163-165 %)
que la obtenida en los de P. acidilactici 347. La transformación de L. lactis ESI 515
con cualquiera de estos tres plásmidos tampoco afectó a su capacidad para producir
nisina. La producción de pediocina por L. lactis RK2 (pRK119) y CNC2 (pCNC16)
fue similar (95-100%) a la de P. acidilactici 347. En consecuencia, se obtuvieron cepas
de L. lactis con la capacidad de coproducir pediocina PA-1 y nisina a niveles
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comparables a los de las respectivas cepas parentales. En este caso, los ensayos de
actividad bacteriocinogénica también revelaron la estabilidad de pMC117, pRK119 y
pCNC16 en los dos hospedadores en condiciones selectivas y no selectivas. En
contraste, la integración de los genes necesarios para la biosíntesis de pediocina en el
cromosoma de L. lactis MG1614 no condujo a la producción exocelular de esta
bacteriocina.
Finalmente, se construyó otro plásmido (pGA1) para intentar la producción de
pediocina PA-1 en los mismos hospedadores mediante un sistema de grado
alimentario. El plásmido pGA1 también porta el operón completo de la pediocina bajo
control del promotor P32 pero presenta la particularidad de carecer de genes que
confieren resistencia a antibióticos. Una vez obtenidos los transformantes de L. lactis
ESI 153 y L. lactis ESI 515 (L. lactis GA1 y GA2, respectivamente), se evaluó su
eficacia para inhibir el crecimiento de Listeria innocua SA1 durante la elaboración de
quesos. Los quesos se manufacturaron a partir de leche inoculada con un 1% de un
cultivo láctico (L. lactis ESI 153, ESI 515, GA1 ó GA2) con o sin la presencia de L.
innocua SA1 (~1 ×104 ufc/ml). Al final del período de maduración, los recuentos de L.
innocua fueron inferiores a 50 ufc/g en los quesos que contenían L. lactis GA1 e
inferiores a 25 ufc/g en aquellos con L. lactis GA2. En consecuencia, las cepas
desarrolladas pueden resultar útiles como cultivos bioprotectores para controlar el
crecimiento de Listeria en quesos.
B) Empleo de cepas de Enterococcus faecium aisladas de leche materna como
cultivos bioprotectores para la elaboración de quesos
La leche materna es el alimento ideal para los recién nacidos ya que satisface
todos sus requerimientos nutritivos y les protege frente a infecciones. En el momento
de iniciarse esta Tesis Doctoral, los pocos estudios existentes sobre la microbiología de
la leche humana se restringían básicamente al aislamiento e identificación de bacterias
potencialmente patógenas en bancos de leche y en casos de mastitis o infecciones
neonatales. En consecuencia, se desconocía la composición microbiológica de la leche
de mujeres sanas.
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Inicialmente se investigó si este fluido biológico contenía bacterias lácticas
(BAL) y, de hecho, se pudieron aislar de leche, areola mamaria, piel del pecho, vagina
y heces de ocho madres sanas y de la cavidad oral y heces de sus respectivos hijos. A
continuación, se seleccionaron al azar algunos aislados (178 de cada pareja madre-
hijo) y se sometieron a un análisis de sus perfiles genéticos mediante la técnica RAPD.
Posteriormente, se identificaron aquellos aislados que, independientemente de su
origen, compartían perfiles idénticos. De esta manera, se observó que ciertas cepas de
Lactobacillus gasseri y Enterococcus faecium se podían aislar simultáneamente de las
muestras de leche, areola mamaria, cavidad oral infantil y heces proporcionadas por
una misma pareja madre-hijo. En contraste, ninguna de las BAL aisladas de piel del
pecho o de vagina compartió perfiles de RAPD con aislados de otros orígenes. Estos
resultados revelaron que la leche materna es una fuente importante de BAL para el
intestino neonatal y que las BAL presentes en la leche pueden tener un origen
endógeno.
El siguiente objetivo fue la evaluación de la seguridad de las cepas de E.
faecium aisladas de leche humana. Para ello, se investigó la presencia de posibles
factores determinantes de virulencia mediante las técnicas de PCR y de hibridación
DNA-DNA. El potencial de las cepas para adquirir plásmidos mediante conjugación se
determinó mediante el análisis de genes implicados en los procesos conjugativos de los
enterococos. Paralelamente, se realizaron diversos ensayos fenotípicos de propiedades
relacionadas con la seguridad de las cepas. La presencia de genes que confieren
resistencia a la vancomicina se determinó mediante PCR. Los resultados obtenidos
revelaron que todas las cepas estaban libres de determinantes de virulencia. Ninguna
de las cepas mostró actividad gelatinasa, producción de hemolisinas o capacidad de
agregación. Ninguna portaba los genes vanA o vanB. Por lo tanto, la leche de mujeres
sanas parece ser una fuente de cepas apatógenas de E. faecium para el intestino del
lactante.
Finalmente, se procedió a evaluar si las cepas de E. faecium aisladas de leche
materna poseían actividad anti-Listeria y/o diversas propiedades bioquímicas de
interés tecnológico para la industria láctea, incluyendo capacidad acidificante y
actividades proteolítica, aminopeptidásica, lipásica y esterásica. In vitro, todas las
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cepas inhibieron el crecimiento de Listeria monocytogenes y Listeria innocua, siendo
E. faecium LJx4 la que manifestó la actividad anti-Listeria más potente. En cuanto a
las propiedades tecnológicas, su actividad acidificante fue baja y no mostraron
actividad proteolítica detectable, a excepción de dos cepas (LJx4 y Lc4) en las que la
actividad fue pequeña. En contraste, todas las cepas mostraron actividad peptidásica y
esterásica. Finalmente, se evaluó la eficacia de E. faecium LJx4 para inhibir el
crecimiento de Listeria innocua SA1 durante la elaboración de quesos. Los quesos se
manufacturaron a partir de leche inoculada con la cepa LJx4, con o sin la presencia de
L. innocua SA1 (~1 ×104 ufc/ml). Al final del período de maduración, los recuentos de
L. innocua fueron de aproximadamente 5×102 y 2×106 ufc/g en presencia o ausencia de
E. faecium LJx4, respectivamente. En consecuencia, los enterococos analizados
también podrían resultar útiles como cultivos adjuntos y/o bioprotectores en la
elaboración de quesos aunque deberían aplicarse conjuntamente con un cultivo
iniciador.
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SUMMARY
A) Heterologous production of pediocin PA-1 in Lactococcus lactis strains. Use as
bioprotective cultures for cheese making
Heterologous production of pediocin PA-1 in Lactococcus lactis strains, which
had been previously selected because of their technological properties for cheese
making, was investigated. Plasmid pFI2160, which contains a hybrid gene (L-pedA)
encoding the fusion between the lactococcin A leader and propediocin PA-1, and also
the genes lcnC and lcnD, that encode the lactococcin A secretion apparatus, was
introduced into L. lactis ESI 153 and L. lactis ESI 515 (Nis+). The pediocin production
level of their respective transformants, L. lactis CL1 and CL2, was approximately 600
and 400 ng ml-1, respectively, which represents a 30% and a 20% of the quantity
produced by the natural pediocin PA-1 producer Pediococcus acidilactici 347.
Transformation of L. lactis ESI 515 with pFI2160 did not affect its ability to produce
nisin. Pediocin bioassays showed the stability of pFI2160 in both heterologous hosts
under selective and non-selective conditions.
Later, plasmids pMC117, pRK119 and pCNC16, which contain the complete
pediocin operon under the control of the strong P32 promoter, were introduced into the
same hosts in order to enhance pediocin PA-1 production. The pediocin production
levels of all the transformants were higher than those obtained in the previous study
through a strategy based on exchange of the leader and transporter system of the
bacteriocin lactococcin A. In relation to L. lactis ESI 153 derivatives, pediocin
production by strains RK1 (pRK119) and CNC1 (pCNC16) was notably higher (163-
165 %) than that produced by P. acidilactici 347. Transformation of L. lactis ESI 515
with the plasmids cited above did not affect its ability to produce nisin. The level of
pediocin production by L. lactis RK2 and CNC2 was similar (95-100%) to that of P.
acidilactici 347. Therefore, we obtained L. lactis strains technologically suited for
cheese making with the ability to coproduce pediocin PA-1 and nisin A at levels
comparable to the respective wild parental strains. Pediocin bioassays revealed the
stability of plasmids pMC117, pRK119 and pCNC16 in both heterologous hosts after
ten subcultures under selective and non-selective conditions. In contrast, chromosomal
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integration of the genes required for pediocin production in L. lactis MG1614 did not
lead to pediocin production.
Finally, plasmid pGA1 was constructed in order to achieve food-grade
heterologous production of pediocin PA-1 in the lactococcal hosts. This plasmid
contains the complete pediocin operon under the control of the strong P32 promoter
and is devoid of any antibiotic marker. Then, the antimicrobial activity of the pediocin-
producing transformants on the survival of Listeria innocua SA1 during cheese
ripening was also investigated. Cheeses were manufactured from milk inoculated with
1% of the lactic culture and with or without approximately 1 ×104 CFU/ml of the
Listeria strain. L. lactis ESI 153, L. lactis ESI 515, and their transformants (L. lactis
GA1 and GA2, respectively) were used as starter cultures. At the end of the ripening
period, counts of L. innocua in cheeses made with the bacteriocin-producing
lactococcal strains were below 50 CFU/g in the L. lactis GA1 cheeses and below 25
CFU/g in the L. lactis GA2 ones. As a consequence, the food-grade recombinant
strains can be useful as bioprotective cultures to control the growth of Listeria in
cheeses.
B) Use of Enterococcus faecium strains isolated from breast milk as bioprotective
cultures for cheese making
During some months, breast milk is the best food for the rapidly-growing infant
since it fulfils all the nutritional requirements. Additionally, several studies have
shown that breastfeeding protects the newborn against infectious diseases. When this
PhD Thesis started, the few microbiological studies focused on human milk had been
restricted to the identification of potential pathogenic bacteria in stored milk and in
clinical cases of maternal or infant infection. Therefore, the microbiological
composition of breast milk in healthy women was completely unknown.
Initially, we investigated if human breast milk contains potentially probiotic
lactic acid bacteria (LAB). LAB were isolated from milk, mammary areola, breast
skin, vaginal swabs and feces of eight healthy mothers, and oral swabs and feces of
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their respective breast-fed infants. Some isolates (178 from each mother-newborn pair)
were randomly selected and submitted to randomly amplified polymorphic DNA
(RAPD)-PCR analysis, and those that displayed identical RAPD patterns were
identified by 16S rDNA sequencing. Within each mother-newborn pair, some rod-
shaped LAB isolated from mammary areola, breast milk, infant oral swabs and feces
displayed identical RAPD profiles. All of them were identified as Lactobacillus
gasseri. Similarly, among coccoid LAB from these different sources, some shared an
identical RAPD pattern and were identified as Enterococcus faecium. In contrast, none
of the LAB isolated from breast skin shared RAPD profiles with LAB of the other
sources. These results revealed that breastfeeding can be a significant source of LAB
to the infant gut and that LAB present in milk may have an endogenous origin (the
maternal gut) instead of being a mere result of contamination from the surrounding
breast skin.
Since some of the breast milk isolates belonged to the species E. faecium, the
objective of this work was to evaluate their safety. The enterococcal strains were
screened by PCR and Southern hybridization for the presence of virulence
determinants. The potential of the strains to acquire plasmids by conjugation was
investigated by screening for genes involved in conjugation processes. Parallel,
phenotypic assays were performed. Presence of genes conferring resistance to
vancomycin was assessed by PCR. PCR amplifications and Southern hybridizations
revealed that all the strains were clear of the majority of potential virulence
determinants. None of the strains showed gelatinase activity, hemolysin production or
aggregation phenotype and none of them carried vanA or vanB genes. These findings
suggest that milk of healthy mothers may be a source of avirulent E. faecium isolates
to the newborns.
Finally, we analyzed if the E. faecium strains isolated from breast milk had
anti-Listeria activity and/or a variety of biochemical properties of technological
interest to dairy industries, including acidifying ability and proteolytic,
aminopeptidase, lipase and esterase activities. In vitro, all the enterococcal strains
inhibited the growth of all the Listeria monocytogenes and Listeria innocua strains
tested, being E. faecium LJx4 the one that showed the highest anti-Listeria activity. In
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relation to the technological properties, their acidifying capacity was low and they did
not show detectable proteolytic activity, with the exception of two strains (LJx4 y Lc4)
which displayed a low activity. In contrast, all the strains showed peptidase and
esterase activities. Finally, the effect of E. faecium LJx4 on the survival of Listeria
innocua SA1 during cheese ripening was also investigated. Cheeses were
manufactured from milk inoculated with the enterococcal strain and with or without
approximately 1 ×104 CFU/ml of the Listeria strain. At the end of the ripening period,
counts of L. innocua were approximately 5×102 and 2×106 CFU/g in cheeses made
with and without E. faecium LJx4, respectively. As a consequence, the enterococcal
strains could be useful as adjunct and/or bioprotective in cheese making although they
should be used together with a starter culture.
Índice ___________________________________________________________________________________
i
Página
CAPÍTULO I. Exposición general del tema a investigar 1
CAPÍTULO II. Introducción general 7
II.1. Las bacterias lácticas 9
II.1.1. Metabolitos de las bacterias lácticas 14
II.1.2. Bacteriocinas de las bacterias lácticas 15
II.2. Pediocina PA-1 21
II.2.1. Características moleculares 22
II.2.2. Organización genética 27
II.2.3. Biosíntesis y regulación 30
II.2.4. Espectro antimicrobiano 33
II.2.5. Modo de acción 36
II.2.6. Inmunidad de las células productoras 40 II.2.7. Aplicación de la pediocina PA-1 en los alimentos 43
II.2.7.1 Adición de pediocina PA-1 o de un fermentado 45
II.2.7.2. El empleo de pediocina PA-1 en sistemas de barreras
52
II.2.7.3. Adición de un cultivo productor de pediocina PA-1
58
II.2.8. Expresión heteróloga de la pediocina PA-1 61
II.2.8.1. Hospedadores heterólogos 62
II.2.8.2. Expresión heteróloga de bacteriocinas en Escherichia coli
65
II.2.8.3. Expresión heteróloga de bacteriocinas en bacterias lácticas
67
II.2.8.3.1. Expresión de genes nativos 67
II.2.8.3.2. Intercambio de líderes y/o sistemas de secreción
69
II.2.8.3.3. Aplicaciones y perspectivas futuras de la producción heteróloga de bacteriocinas en bacterias lácticas
71
II.3. Enterococos 74
II.3.1. Perspectiva histórica 74
II.3.2. Aislamiento e identificación de enterococos 77
II.3.3. Los enterococos en hospedadores sanos 81
Índice ____________________________________________________________________________
ii
Página
II.3.4. Los enterococos como probióticos 82
II.3.5. Los enterococos como patógenos oportunistas 85
II.3.6. Factores de virulencia de los enterococos 86
II.3.6.1. Citolisina 88
II.3.6.2. Gelatinasa 91
II.3.6.3. Sustancia de agregación y feromonas 92
II.3.6.4. Proteína de superficie de enterococos 94
II.3.6.5. Adhesina de unión al colágeno 96
II.3.6.6. Adhesinas efaAfs y efaAfm 97
II.3.6.7. Carbohidratos de la pared celular y polisacáridos capsulares
97
II.3.6.8. Superóxido extracelular 98
II.3.7. Resistencia a antibióticos y mecanismos de transferencia
98
II.3.8. Aplicaciones de los enterococos en los quesos 102
II.3.8.1. Características tecnológicas de los enterococos 105
II.3.8.1.1. Actividad acidificante 105
II.3.8.1.2. Actividad proteolítica 106
II.3.8.1.3. Actividad lipolítica 108
II.3.8.1.4. Metabolismo del citrato 109
II.3.8.1.5. Producción de bacteriocinas 110
II.3.8.2. Los enterococos como cultivos adjuntos en la maduración
113
II.3.8.3. Los enterococos en bioprotección 114
II.4. El queso 115
II.4.1. Tecnología del queso 116
II.4.2. Cambios bioquímicos durante la maduración 121
II.4.3. Microbiología del queso 126
CAPÍTULO III. La leche humana es una fuente de bacterias lácticas para el intestino infantil
133
CAPÍTULO IV. Mejora de la producción de pediocina PA-1 en cepas salvajes de Lactococcus lactis de origen lácteo
141
CAPÍTULO V. Desarrollo de un sistema de grado alimentario para la producción de pediocina PA-1 en cepas de Lactococcus lactis. Aplicación para inhibir el crecimiento de Listeria en quesos experimentales
147
Índice ___________________________________________________________________________________
iii
Página
CAPÍTULO VI. La leche humana es una fuente de bacterias lácticas para el intestino infantil
155
CAPÍTULO VII. Análisis de los determinantes de virulencia en cepas de Enterococcus faecium aisladas de leche humana
163
CAPÍTULO VIII. Actividad anti-Listeria y propiedades bioquímicas de interés para la industria láctea en cepas de Enterococcus faecium aisladas de leche materna
173
CAPÍTULO IX. Discusión general 203
IX.1. Producción heteróloga de pediocina PA-1 en L. lactis de interés industrial
205
IX.1.1. Empleo de cepas de interés industrial como hospedador heterólogo
207
IX.1.2 Expresión heteróloga de pediocina PA-1 empleando el sistema secretor de la lactococina A
208
IX.1.3 Mejora de la producción heteróloga de pediocina PA-1 empleando promotores fuertes
209
IX.1.4. Integración cromosómica del gen que codifica la pediocina PA-1 en L. lactis
211
IX.1.5. Construcción de un vector de grado alimentario 213
IX.2. La microbiota de la leche humana 215
IX.2.1. Origen y función de las bacterias lácticas aisladas de leche materna
218
IX.2.2. El caso particular de los enterococcos 223
IX.2.3. Los enterococos de la leche humana como agentes bioterapéuticos y/o bioconservantes
227
CAPÍTULO X. CONCLUSIONES 231
CAPÍTULO XI. BIBLIOGRAFÍA 237
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
1
I. EXPOSICIÓN GENERAL DEL TEMA A INVESTIGAR
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
2
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
3
Las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas de origen alimentario
poseen un gran interés como agentes bioconservantes por tres razones fundamentales:
(a) Muchas cepas que las producen pertenecen a especies reconocidas
generalmente como seguras (GRAS) y/o con presunción cualificada de seguridad
(QPS).
(b) Debido a su naturaleza peptídica son degradadas e inactivadas en el tracto
digestivo, por lo que no afectan a la microbiota intestinal ni originan problemas de tipo
alérgico en los consumidores.
(c) Actúan sinérgicamente con otros sistemas de conservación pudiendo
contribuir a un menor empleo de ciertos aditivos químicos y/o a la suavización de
algunos tratamientos tecnológicos.
El interés por sistemas de conservación más “naturales” se ha acentuado en los
últimos años como consecuencia del creciente conocimiento que tienen los
consumidores sobre las relaciones entre la alimentación y la salud. Por este motivo, la
combinación de bacteriocinas con otros sistemas de control microbiológico constituye
un procedimiento atractivo para mejorar la calidad microbiológica de los alimentos. La
adopción de un sistema de barreras es especialmente interesante para evitar el
crecimiento en los alimentos de microorganismos que, como Listeria monocytogenes,
son difíciles de controlar mediante algunos sistemas de conservación clásicos (p. e., la
acidificación o la refrigeración). L. monocytogenes es el agente causal de la listeriosis,
la toxiinfección alimentaria con mayor tasa de morbilidad y mortalidad en los países
desarrollados.
Este microorganismo representa un peligro relevante para la industria láctea ya
que se han producido diversos brotes de listeriosis asociados al consumo de quesos
contaminados. L. monocytogenes es un agente etiológico de mastitis asintomáticas o
subclínicas en vacas, ovejas y cabras; este hecho, junto con su ubicuidad ambiental y
las manipulaciones inadecuadas, explica porqué la contaminación de la leche con este
microorganismo es relativamente frecuente. Los quesos elaborados con leche cruda,
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
4
insuficientemente tratada y/o recontaminada son los que plantean un mayor riesgo de
transmisión de este patógeno.
En dos Tesis Doctorales previas (Martínez, 1999; Fernández, 2004), se
obtuvieron cepas de Lactococcus lactis produjeran pediocina PA-1, una bacteriocina
de la clase II con una potente actividad anti-Listeria. Salvo algunas excepciones, la
pediocina PA-1 es producida por cepas de Pediococcus acidilactici, un organismo
normalmente asociado a productos vegetales y cárnicos pero cuyas propiedades
metabólicas y tecnológicas son inadecuadas para su inclusión en productos lácteos. Por
lo tanto, la producción de esta bacteriocina por microorganismos de origen lácteo,
como Lactococcus lactis, es un logro relevante.
En las citadas Tesis, la producción de pediocina (y, en su caso, la coproducción
de pediocina PA-1 y nisina A) en L. lactis se consiguió aprovechando el elevado grado
de homología existente tanto entre los líderes como entre los transportadores de
diversas bacteriocinas de la clase II. No obstante, se emplearon como hospedadoras
cepas laboratoriales que carecen de ciertas propiedades tecnológicas que resultan
esenciales para su aplicación en productos lácteos. Además, todos los vectores
empleados contenían genes que confieren resistencia a ciertos antibióticos como
marcadores fenotípicos para facilitar el proceso de selección de las colonias
recombinantes. Por este motivo, la primera parte de la Tesis Doctoral tenía como
objetivos: (1) la producción de esta bacteriocina a partir de cepas salvajes de L. lactis
seleccionadas por sus características tecnológicas; (2) la comparación del sistema
desarrollado previamente (empleo del líder/sistema de secreción de la lactococina A)
con una estrategia alternativa basada en el empleo del operón completo de la pediocina
PA-1 bajo control de un promotor fuerte (P32); y (3) el desarrollo de un sistema de
grado alimentario mediante la integración cromosómica de los genes necesarios para la
biosíntesis de la pediocina o la construcción de un plásmido que portara esa misma
información pero que estuviera desprovisto de genes de resistencia a antibióticos.
Finalmente, se evaluaría la capacidad de algunas de las cepas generadas para inhibir el
crecimiento de Listeria durante la elaboración de quesos. Conviene recordar que el
empleo de una bacteriocina para inhibir el crecimiento de microorganismos
indeseables puede conllevar la selección de una población resistente al agente
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
5
antimicrobiano y que la resistencia puede ser extensible a otras bacteriocinas de una
misma clase. En este sentido, la coproducción de nisina y pediocina PA-1 resulta una
combinación atractiva para evitar la aparición de resistencias ya que son dos
bacteriocinas de clases distintas, con espectros y modos de acción diferentes y,
además, ejercen un efecto sinérgico. Por ese motivo, una de las cepas salvajes
seleccionadas como hospedadora tenía la capacidad de producir nisina.
Obviamente, las cepas de L. lactis productoras de pediocina son cepas
recombinantes y pueden enfrentarse al rechazo de los consumidores. Por ese motivo,
en esta Tesis también se contempló el empleo de bacterias no modificadas
genéticamente pero que tuvieran un origen peculiar con fines bioprotectores. En el
momento en el que se iniciaba esta Tesis Doctoral se pensaba que las bacterias sólo
podían atravesar el epitelio intestinal intacto a través de las células M, unas células
epiteliales especializadas que se localizan principalmente en las placas de Peyer. Sin
embargo, Vazquez-Torres y col. (1999) y Rescigno y col. (2001) demostraron que las
células CD18+ (básicamente, células dendríticas y macrófagos) existentes en la lámina
propia pueden penetrar el epitelio intestinal intacto y captar bacterias comensales
directamente de la luz intestinal. Más concretamente, las células dendríticas son
capaces de abrir las zonas de oclusión entre enterocitos adyacentes, proyectar dendritas
al exterior del epitelio y captar células viables, preservando la integridad de la barrera
intestinal mediante la expresión de las proteínas que integran las zonas de oclusión.
Una vez captadas por las células CD18+, las bacterias pueden propagarse fácilmente a
mucosas distantes de la del aparato digestivo, ya que es bien conocida la circulación de
células del sistema inmunitario dentro del sistema linfoide asociado a mucosas (Roitt,
1994).
Algunas bacterias podrían utilizar este mecanismo para migrar desde la mucosa
intestinal y colonizar mucosas distantes, como la de los tractos respiratorio y
genitourinario, la de las glándulas salivares y lacrimales, y la que recubre los
conductos de las glándulas mamarias en las mujeres embarazadas y/o lactantes (Roitt,
1994). En este sentido, se sabe que durante el período de lactancia, existe una
colonización selectiva del epitelio de la glándula mamaria por parte de células
inmunitarias procedentes del intestino materno (la llamada circulación entero-
Exposición general del tema a investigar _____________________________________________________________________
6
mamaria) (Bertotto y col., 1991). En consecuencia, si ciertas bacterias intestinales
pudieran migrar asociadas a células del sistema inmunitario, la leche materna sería una
fuente importante de bacterias para la colonización del intestino del recién nacido. El
estudio de la posible transmisión vertical (madre-hijo) de bacterias lácticas es
particularmente interesante ya que estas bacterias se aíslan con facilidad en el intestino
humano y se suelen incluir entre las que poseen un mayor potencial para ejercer
efectos beneficiosos en un hospedador. Dado que la leche materna es un alimento
ingerido por neonatos, el aislamiento en este fluido biológico de bacterias lácticas
resultaría particularmente atractivo ya que, por su propia naturaleza, cumplirían
algunos de los requisitos generalmente recomendados para bacterias empleadas como
probióticos humanos, tales como una ingestión prolongada sin efectos adversos en una
población particularmente susceptible a las enfermedades infecciosas y una total
adaptación tanto a mucosas humanas como a ambientes lácteos. En este sentido, los
objetivos de la segunda parte de la Tesis Doctoral fueron los siguientes: (1) conocer si
la leche materna obtenida de mujeres sanas es una fuente de bacterias lácticas; (2) en
caso del aislamiento de enterococos, se procedería a analizar su seguridad, incluyendo
la presencia o ausencia de determinantes de virulencia, genes de resistencia a
vancomicina, capacidad de participar en procesos conjugativos y perfil de resistencia a
antibióticos; y (3) analizar la capacidad tecnológica de algunas de las cepas de
enterococos que se consideren seguras y evaluar su eficacia para inhibir el crecimiento
de Listeria durante la elaboración de quesos.
Introducción
7
II. INTRODUCCIÓN
Introducción
8
Introducción
9
II.1. LAS BACTERIAS LÁCTICAS
Las bacterias lácticas probablemente son el grupo bacteriano más ligado al
hombre. Están presentes de forma natural en el ambiente y en una gran cantidad de
alimentos, tanto de origen animal como vegetal, y, además, se encuentran
habitualmente asociadas a las mucosas de los vertebrados. Recientemente su papel
clásico como microorganismos involucrados en la producción de una amplia variedad
de alimentos e ingredientes alimentarios se ha ampliado e incluye el de mantener la
salud de los consumidores. A pesar de que las bacterias lácticas se consideraron como
un grupo diferenciado a principios del siglo XX, es difícil definirlo porque engloba a
microorganismos Gram-positivos muy heterogéneos, tanto desde el punto de vista
morfológico como del filogenético (Figura II.1). Pueden tener forma bacilar o cocoide,
aparecer aisladas o formando cadenas, no forman esporas, carecen de citocromos y de
una verdadera catalasa, son tolerantes al ácido y poseen carácter anaeróbico más o
menos estricto (Axelsson, 2004; Stiles y Holzapfel, 1997).
Figura II.1. Relación filogenética entre los principales géneros de bacterias lácticas y bacterias Gram-positivas relacionadas. Adaptado de Stiles y Holzapfel (1997).
Bajo contenido en G+C
Alto contenido en G+C
Introducción
10
El rasgo común que caracteriza a estas bacterias es una propiedad metabólica: la
producción de ácido láctico como único o principal producto final de la fermentación
de una gran variedad de sustratos (Axelsson, 2004). Este rasgo metabólico está
asociado a bacterias que pertenecen a distintas ramas del árbol filogenético del
dominio Bacteria. En la actualidad, las principales bacterias lácticas relacionadas con
los alimentos y que poseen interés industrial pertenecen a los géneros Enterococcus,
Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus
y Streptococcus (Leroy y De Vuyst, 2004; Stiles y Holzapfel, 1997).
Las bacterias lácticas se encuentran en ambientes muy variados, pero
generalmente están asociadas con sustratos ricos en nutrientes. Esto ha determinado
que en su evolución hayan perdido muchas capacidades biosintéticas, así como la
capacidad de esporulación, innecesarias en sustratos como los alimentos o el tracto
gastrointestinal (Makarova y Koonin, 2007; Pfeiler y Klaenhammer, 2007). En
relación con los alimentos, forman parte de la microbiota natural de las superficies de
vegetales, aparecen con frecuencia en leche y derivados, en productos cárnicos y en
otros alimentos. En estos sustratos la acidificación y otros cambios que acompañan el
crecimiento de las bacterias lácticas, como por ejemplo la producción de compuestos
antimicrobianos, exopolisacáridos y diversas enzimas, contribuyen al aroma, textura,
conservación y valor nutritivo de una gran variedad de productos fermentados
(Kleerebezem y Hugenholtz, 2003; Wood, 1997). En general, las bacterias lácticas
toleran bien concentraciones relativamente altas de ácidos y valores de pH más bajos
que el resto de las bacterias por lo que suelen llegar a predominar en los hábitats que
colonizan. Gracias a las bacterias lácticas la vida útil y la calidad microbiológica y
organoléptica de los productos finales aumentan notablemente con respecto a la
materia prima original. Sin embargo, el interés industrial de estas bacterias no se limita
a la obtención de alimentos fermentados, sino que también abarca la producción de
diversos compuestos químicos y biológicos como etanol, ácido láctico, bacteriocinas,
biopolímeros o enzimas (Leroy y De Vuyst, 2004).
Un aspecto muy positivo de las bacterias lácticas es que prácticamente todas las
cepas que forman parte de la microbiota de los alimentos fermentados poseen un
amplio historial de consumo seguro (Caplice y Fitzgerald, 1999; Wood y Holzapfel,
Introducción
11
1995). El hecho de que las bacterias lácticas y los productos de su metabolismo hayan
sido consumidos por el hombre durante tantos siglos sin ocasionar problemas, salvo en
muy contadas excepciones, ha determinado se consideren como bacterias reconocidas
generalmente como seguras (GRAS, acrónimo de Generally Recognized As Safe). Para
hacernos una idea de su inocuidad baste considerar que un europeo ingiere unos 22 kg
de leche fermentada al año, lo que equivaldría a un consumo global, tan sólo en
Europa, de 8,5 × 1020 bacterias lácticas (o 3.400 toneladas) cada año, sin que se les
haya asociada con ningún problema sanitario grave (Chamba y Jamet, 2007).
Precisamente la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria ha propuesto para obtener
la calificación de presunción cualificada de seguridad (QPS, Qualified Presumption of
Safety) a un gran número de especies pertenecientes al grupo de las bacterias lácticas.
Es decir, se asume el supuesto de su seguridad en base a las evidencias disponibles.
Este calificativo, otorgado a un género o a un grupo de especies relacionadas, se hace
en base a cuatro pilares: establecimiento de la identidad, cuerpo de conocimiento,
posible patogenicidad y empleo final. Permite que cualquier microorganismo cuya
identidad se pueda determinar inequívocamente, y se garantize su pertenencia a un
grupo QPS, se aplique en la producción de alimentos sin necesidad de estudios
adicionales para asegurar su seguridad. De todas las bacterias lácticas empleadas
habitualmente para la elaboración de productos fermentados, sólo dos géneros tienen
una posición ambigua en lo que respecta a la seguridad de su uso en alimentación
humana. Se trata del género Enterococcus, ya que en él que se encuentran algunas
cepas patógenas y no es fácil distinguirlas de las que carecen de rasgos virulentos,
siendo necesario estudiar cada caso individualmente, y los estafilococos coagulasa
negativos (EFSA, 2007a).
Los productos fermentados suponen alrededor de un tercio de los alimentos que
consumimos habitualmente. La importancia económica de las fermentaciones a gran
escala en la industria alimentaria ha desterrado la práctica tradicional de confiar en las
fermentaciones espontáneas o de utilizar como inóculo una pequeña porción de una
fermentación previa (back-slopping). Estos métodos han quedado relegados en la
actualidad a la obtención de productos fermentados en países en vías de desarrollo o
para la elaboración de productos fermentados artesanos, así como en ciertos casos en
los que no se conoce con precisión la sucesión de los microorganismos implicados, en
Introducción
12
países desarrollados (Harris, 1998). En los países occidentales la práctica habitual para
la producción a gran escala de alimentos fermentados es el empleo de cultivos
iniciadores. En este caso lo que se añade es un microorganismo, o una mezcla,
seleccionado previamente por sus características fisiológicas y metabólicas. Así, se
logra un estrecho control del proceso de la fermentación y de las características del
producto final, evitándose las grandes pérdidas económicas derivadas de
fermentaciones fallidas o anómalas. Un grave inconveniente asociado a esta práctica es
que con frecuencia los productos fermentados industriales carecen de las propiedades
organolépticas que caracterizan a los productos artesanos elaborados sin empleo de
cultivos iniciadores y que son tan apreciadas por los consumidores (Caplice y
Fitzgerald, 1999).
En los últimos años en la elaboración industrial de alimentos fermentados se está
extendiendo el empleo de cultivos iniciadores funcionales (De Vuyst, 2000). Estos
cultivos poseen, al menos, una propiedad funcional que contribuye a incrementar la
seguridad del alimento y/o ofrece ventajas organolépticas, tecnológicas o nutricionales.
Aplicando estas cepas como cultivos iniciadores o adjuntos en los procesos
fermentativos se puede conseguir el desarrollo in situ de la propiedad deseada,
mientras que el alimento mantiene su condición de natural y saludable (Ross et al.,
2000). Permiten sustituir de manera total o parcial el uso de algunos aditivos químicos
por compuestos naturales producidos por las cepas de bacterias lácticas incorporadas,
además de ofrecer alimentos atractivos acordes con la demanda del consumidor actual
(Thomas et al., 2000). Cabe destacar que la aplicación de bacterias lácticas en los
alimentos goza de gran aceptación, ya que son consideradas como “naturales” e
incluso “beneficiosas para la salud”, al contrario que los aditivos químicos. En este
sentido, las bacterias lácticas son candidatos idóneos para formar parte de cultivos
bioprotectores, entendiendo por bioconservación “la extensión de la vida útil y el
incremento de la seguridad sanitaria de los alimentos mediante la microflora natural
o sus metabolitos” (Aymerich y Hugas, 1998). No obstante, no puede descartarse
totalmente la utilización de aditivos químicos, ya que continúan siendo necesarios en
la conservación de alimentos, además de mejorar algunas de sus características
organolépticas.
Introducción
13
La creciente demanda de alimentos menos procesados y con menos aditivos
parece estar en contradicción con el deseo de alimentos cada vez más seguros. Para
contrarrestar este problema, las industrias buscan alternativas adecuadas y, en el caso
de los alimentos fermentados, uno de los puntos clave lo constituyen los cultivos
iniciadores (Leroy y De Vuyst, 2004). Hasta el momento, la disponibilidad de nuevas
cepas ha sido muy limitada; sin embargo, los crecientes avances de la bioinformática y
las diversas “ómicas” (genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica) de los
microorganismos de interés industrial aumentan las perspectivas de mejora de los
cultivos iniciadores (Klaenhammer et al., 2005; Seizen et al., 2004). A esto se suma el
que, desde hace ya algún tiempo, la biología molecular permite la expresión de ciertas
propiedades deseables y la supresión de otras no deseables en cepas que forman parte
de cultivos iniciadores (Delcour et al., 1999; Law, 2001; Mogensen, 1993).
Otro aspecto de interés en relación con las bacterias lácticas es que algunas
especies, sobre todo las pertenecientes a los géneros Enterococcus, Lactobacillus y
Streptococcus, forman parte de la microbiota natural de la mucosa intestinal de los
mamíferos (Vaughan et al., 2002). Estas bacterias intestinales contribuyen a la salud y
el bienestar de los individuos mediante diversos efectos, como por ejemplo
manteniendo el equilibrio de la microbiota intestinal, la exclusión competitiva de
patógenos y la estimulación y/o modulación del sistema inmunitario. Los
consumidores, que prestan cada vez más atención a los temas relacionados con la
alimentación y la salud, no son ajenos a esta relación. Prueba de ello es el rápido
crecimiento del mercado de alimentos con propiedades beneficiosas para la salud,
siendo el de mayor éxito comercial el sector de los productos lácteos conteniendo
como probióticos cepas seleccionadas de Lactobacillus y Bifidobacterium (Saxelin et
al., 2005). Los probióticos se definen como “microorganismos vivos que, cuando se
administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del
hospedador” (FAO/WHO, 2002). El uso de probióticos se ha asociado con un gran
número de efectos beneficiosos como la mejora de la intolerancia a la lactosa, la
modulación del sistema inmunitario, la reducción de la hipercolesterolemia y la
hipertensión, y la protección frente a enfermedades infecciosas, inflamatorias,
alérgicas y tumorales. Sin embargo, no se debe asumir, bajo ningún concepto, que
todas las bacterias lácticas y bifidobacterias posean propiedades beneficiosas. De igual
Introducción
14
manera, cuando se adscribe un efecto beneficioso a una cepa, tampoco se puede
extrapolar esa propiedad a las restantes cepas de la misma especie. Incluso la
adscripción de un efecto beneficioso a una cepa depende de las condiciones de su
empleo y, muy particularmente, de la dosis. La excesiva generalización sobre los
beneficios de los probióticos suele tener efectos contraproducentes ya que crea
escepticismo en la comunidad científica, en la médica y en los consumidores.
Las tendencias de mercado y el marco legislativo actual, junto a sus peculiares e
interesantes propiedades, dotan de gran atractivo a la aplicación industrial de las
bacterias lácticas. Dado que el empleo de microorganismos modificados genéticamente
despierta en los consumidores rechazo es de gran interés aislar cepas de fuentes
naturales y seleccionarlas por sus propiedades funcionales. Sin embargo, es importante
señalar que este rechazo al empleo de microorganismos modificados genéticamente se
deba, probablemente, a la carencia de información adecuada sobre su proceso de
obtención y los beneficios que pueden reportar. No hay que olvidar que el espectacular
avance de la biología molecular ofrece una amplia gama de posibilidades para la
construcción de cultivos iniciadores de grado alimentario según las necesidades (de
Vos, 2001; Klaenhammer y Kullen, 1999; Law, 2001).
II.1.1. Metabolitos de las bacterias lácticas
Las bacterias lácticas producen numerosos compuestos, como ácido láctico,
diacetilo, acetaldehído, etanol, dióxido de carbono, peróxido de hidrógeno o
bacteriocinas, como resultado de su metabolismo. El nivel final y la proporción de
estos metabolitos dependen de la especie, la composición química del sustrato y las
condiciones que imperan durante la fermentación. Estos compuestos contribuyen a la
textura y al desarrollo de las propiedades aromáticas y sápidas características de un
determinado alimento fermentado. Por ejemplo, el ácido láctico es responsable de la
coagulación de la leche para la elaboración del queso y el diacetilo y el acetaldehído
determinar el olor y sabor típicos de la mantequilla. Otros metabolitos de estas
bacterias ejercen una acción antibacteriana, como los ácidos orgánicos, el etanol, el
dióxido de carbono, la reuterina, la reutericiclina, el peróxido de hidrógeno y las
bacteriocinas (Hugas et al., 1995; Rodríguez et al., 1998). Estas sustancias
Introducción
15
antimicrobianas son una alternativa muy interesante para sustituir, al menos
parcialmente, a agentes químicos como los nitritos, los sulfitos o los ácidos propiónico,
sórbico y benzoico (Smith, 1993).
De entre todas estas sustancias antimicrobianas cabe destacar a las bacteriocinas,
cuyo interés para la industria alimentaria se debe a que inhiben a bacterias alterantes y
patógenas resistentes a algunos métodos de conservación tradicionales (como, por
ejemplo, la refrigeración o la acidificación). Además, son compuestos muy atractivos
desde el punto de vista tecnológico, dado que son efectivas a concentraciones muy
bajas y no modifican las características organolépticas del producto. Las bacteriocinas
de las bacterias lácticas han sido intensamente investigadas, por lo que se conoce
relativamente bien su composición química y su modo de acción (Ross et al., 1999;
Patton y van der Donk, 2005; Fimland et al., 2005). Dado que las bacterias lácticas han
sido utilizadas durante siglos en la elaboración de alimentos para consumo humano,
sus bacteriocinas se presentan como unos agentes bioconservadores particularmente
atractivos.
II.1.2. Bacteriocinas de las bacterias lácticas
Tradicionalmente las bacteriocinas se han definido como péptidos
biológicamente activos con propiedades antimicrobianas frente a bacterias
estrechamente relacionadas con la especie productora (Tagg et al., 1976). Esta
definición estaba influida por los estudios sobre las colicinas de Escherichia coli, las
primeras bacteriocinas descritas (Gratia, 1925) y que eran las más conocidas en aquel
momento. En la actualidad este concepto se ha modificado, ya que se ha comprobado
que en algunos casos también pueden tener acción bactericida frente a cepas
distanciadas filogenéticamente de la especie bacteriocinogénica (Sablon et al., 2000).
Definiciones posteriores del término bacteriocina, como la de Koninsky (1982),
las describen como agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica cuya síntesis no es
letal para la célula productora. Klaenhammer (1988) las considera como un grupo
heterogéneo de compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica que varían en su
espectro de actividad, modo de acción, peso molecular, determinantes genéticos y
Introducción
16
características bioquímicas. Como rasgo común a todas las bacteriocinas cabe citar que
son péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal que pueden sufrir modificaciones
postraduccionales.
Existen numerosas bacteriocinas producidas por bacterias lácticas y cada una de
ellas exhibe un espectro de inhibición particular. Algunas inhiben únicamente el
crecimiento de cepas relacionadas taxonómicamente con la cepa productora, como las
lactococinas A, B y M, activas solamente frente a Lactococcus (Ross et al., 1999).
Otras bacteriocinas, en cambio, inhiben a un amplio rango de bacterias, si bien es
cierto que la acción inhibitoria de las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-
positivas suele restringirse a otras bacterias Gram-positivas. Con respecto a las
bacterias Gram-negativas, los mohos y las levaduras, las bacteriocinas de las bacterias
lácticas tienen difícil el acceso a su lugar de acción, la membrana plasmática. Existen
algunas excepciones a este comportamiento general. Así, la nisina A es activa frente a
diversas bacterias Gram-negativas de importancia médica, como Campylobacter,
Haemophilus, Helicobacter o Neisseria (Mota-Meira et al., 2000). Además, la
congelación, el calentamiento suave, la exposición al ácido láctico y/o EDTA o la
presión hidrostática facilita la actuación de las bacteriocinas sobre otras bacterias
Gram-negativas (Kalchayanand et al., 1992; Stevens et al., 1992; Kalchayanand et al.,
1998; Arqués et al., 2005).
Hacer una clasificación de las bacteriocinas de las bacterias lácticas es una tarea
ardua dada la gran variedad existente, pero necesaria para facilitar su estudio.
Tradicionalmente se han clasificado en tres grandes grupos, a partir del criterio
establecido por Klaenhammer (1993) y atendiendo a algunas características comunes,
según se muestra en la Tabla II.1 (Klaenhammer, 1993; Cleveland et al., 2001; Nes y
Holo, 2000). La mayor parte de las bacteriocinas que se conocen hasta el momento
están incluidas en las clases I y II. El resto de las bacteriocinas son, en algunas
ocasiones difíciles de clasificar, puesto que sus características se podrían ajustar a más
de un grupo. La propuesta más reciente hecha por Cotter et al. (2006) considera,
además de las clases I y II ya mencionadas, otras dos clases, la III que incluiría las
bacteriocinas de gran tamaño y la IV para los péptidos cíclicos. Según este autor, la
clase III se dividiría a su vez en dos grupos según su modo de acción: las
Introducción
17
bacteriolíticas (IIIa) del tipo de la zoocina A y las que poseen un modo de acción no
lítico, como la helveticina J (Cotter et al., 2006).
En la clase I (lantibióticos) se incluyen bacteriocinas termoestables formadas por
uno o dos péptidos de pequeño tamaño molecular (<5 kDa) modificados
postraduccionalmente. Contienen aminoácidos poco frecuentes como la
deshidroalanina (DHA) y la deshidrobutirina (DHB), originados por la deshidratación
postraduccional de la serina y la treonina, respectivamente. La condensación de estos
residuos DHA y DHB con el grupo sulfhidrilo de las cisteínas de la molécula origina,
respectivamente, lantionina y β-metil-lantionina.
Los lantibióticos se dividen en dos subgrupos atendiendo a su estructura y modo
de acción. Los lantibióticos de tipo A se caracterizan por ser péptidos flexibles y
cargados positivamente que actúan a nivel de membrana (Wiedemann et al., 2001 y
2004; Patton y van der Donk, 2005). A este tipo pertenece la nisina, la más estudiada
de todas las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas. Inicialmente su
actividad se atribuyó a la formación de poros como consecuencia de su unión
inespecífica a la membrana celular, mediante interacción electrostática. Sin embargo,
el hecho de que estas bacteriocinas sean activas a concentraciones muy bajas (en el
rango nanomolar) hizo sospechar la existencia de algún receptor específico para su
unión a la membrana. En el caso de la nisina, el lípido II parece tener dicha función
(Wiedemann et al., 2001). De hecho, los poros se forman de manera muy específica
tras la unión de ocho moléculas de nisina a cuatro moléculas de lípido II y son mucho
más estables que los formados en vesículas artificiales en ausencia del lípido II
(Hasper et al., 2004). Al bloquearse la disponibilidad del lípido II queda inhibida la
síntesis de la pared celular en la bacteria sensible, ya que es uno de los precursores
esenciales. Por otra parte, los lantibióticos de tipo A tienen efectos adicionales como,
por ejemplo, inducir autolisis o inhibir la germinación de esporos bacterianos, ambos
descritos para la nisina. Todos estos efectos explican, por una parte, que su
Introducción
18
Tabla II.1. Clasificación general de las bacteriocinas de las bacterias lácticas Clase Características Subclase Ejemplos Bacteria productora Referencias
I
Lantibióticos: contienen lantionina y β-metil-lantionina
Tipo A: Lineales moléculas alargadas, flexibles <5 kDa
Nisina A
Lactococcus lactis
Gross y Morell (1971)
Tipo C: Multicomponentes
Lacticina 3147 Plantaricina W
Lactococcus lactis Lactobacillus plantarum
McAuliffe et al. (1998) Holo et al. (2001)
II Péptidos no modificados, termoestables, <10kDa
Subclase IIa: bacteriocinas de la familia de la pediocina (actividad frente a Listeria)
Pediocina PA-1 Mesentericina Y105
Pediococcus acidilactici, Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides
Gonzalez y Kunka (1987) Ennahar et al. (1996) Hècharc et al. (1992)
Subclase IIb: dos componentes
Plantaricina S Lactococinas Ga1 y Gb
Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
Jiménez-Díaz et al. (1995) Niessen-Meyer et al. (1992)
Subclase IIc: otras bacteriocinas de la subclase II
Lactococina A Enterocina P
Lactococcus lactis Enterococcus faecium
Holo et al. (1991) Cintas et al. (1997)
III Proteínas termolábiles, >30 kDa
Helveticina J Enterocina MMT05
Lactobacillus helveticus Enterococcus faecalis
Joerger et al. (1990) Ghairi et al. (2004)
IV Bacteriocinas con componente glucídico o lipídico
Leuconocina S Lactocina 27
Leuconostoc paramesenteroides Lactobacillus helveticus
Lewus et al. (1992) Upreti y Hinsdill (1975)
V Bacteriocinas cíclicas Enterocina AS-48 Gassericina A
Enterococcus faecalis Lactobacillus gasseri
Gálvez et al. (1986) Kawai et al. (2004)
Introducción
19
actividad antimicrobiana sea tan potente y, por otra, que la sensibilidad dependa de la especie
o cepa bacteriana (Héchard y Sahl, 2002; Patton y van der Donk, 2005).
Los lantibióticos de tipo B tienen una estructura secundaria más rígida. Son péptidos
globulares que actúan inhibiendo algunas de las reacciones enzimáticas de la célula diana
(Sahl y Bierbaum, 1998). Sin embargo, todavía no se ha descrito la producción de
lantibióticos de tipo B en las bacterias lácticas. También se han descrito lantibióticos de
bacterias lácticas constituidos por dos péptidos que actúan sinérgicamente, como la lactacina
3147 o la plantaricina W (Ryan et al., 1996; Holo et al., 2001), y que podrían constituir una
nueva subclase de bacteriocinas, los lantibióticos de tipo C (Holo et al., 2001; Cotter et al.,
2006).
La clase II engloba pequeños péptidos (<10 kDa) termoestables y no modificados
postraduccionalmente, que tienen un alto contenido en aminoácidos poco voluminosos (como
la glicina) lo cual les confiere un elevado grado de libertad conformacional. Además, tienen
un fuerte carácter catiónico, con un pI elevado (entre 8 y 11), como la mayoría de las
bacteriocinas de bacterias lácticas (Jack et al., 1995). Esta clase se subdivide a su vez en tres
subclases.
La clase IIa, también denominada “familia de la pediocina” porque la pediocina PA-1
fue el primer miembro que se descubrió, constituye el grupo más numeroso de las
bacteriocinas de la clase II, con más de 30 integrantes hasta el momento. Este tipo de
bacteriocinas se ha encontrado en muchos géneros bacterianos, no sólo pertenecientes al
grupo de las bacterias lácticas (Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Carnobacterium y
Leuconostoc) sino también en Bifidobacterium, Bacillus y Listeria (Eijsnik et al., 2002). Esta
familia se caracteriza por su intensa actividad frente a microorganismos del género Listeria,
así como por tener una alta homología en sus secuencias, sobre todo en el extremo N-terminal
(Aymerich et al., 1996; Nes y Holo, 2000; Ennahar et al., 2000). Todas ellas, a excepción de
la acidocina A, presentan dos residuos de cisteína conservados y unidos mediante un puente
disulfuro dando lugar a un anillo formado por seis residuos de aminoácidos en el extremo N-
terminal (Cleveland et al., 2001). Actúan formando poros en la membrana plasmática gracias
a que casi todas poseen una región C-terminal que puede adoptar una estructura anfilílica,
situándose la parte hidrofílica en lo que sería el interior de un canal y la parte hidrofóbica
Introducción
20
hacia el exterior en contacto con la bicapa de fosfolípidos de la membrana (Diep y Nes,
2002). Su estructura y modo de acción se aborda con más detalle en el siguiente apartado.
La clase IIb contiene bacteriocinas cuya actividad depende de la acción complementaria
de dos péptidos. En algunos casos, como en el de la lactococina G, para que la bacteriocina
sea activa es necesaria la presencia de ambos péptidos. En otros, uno de los dos péptidos es
activo pero su actividad se incrementa notablemente en presencia del otro; éste es el caso de
la lacticina F (Allison et al., 1994) o la plantaricina S (Jiménez-Díaz et al., 1995).
La clase IIc abarca aquellas bacteriocinas de la clase II cuya peculiaridad impide
clasificarlas en ninguno de los tipos anteriores. Así encontramos en este grupo a la
carnobacteriocina A (Worobo et al., 1994), la enterocina B (Casaus et al., 1997), la enterocina
Q (Cintas et al., 2000), la lactococina A (Holo et al., 1991), la lactococina 972 (Martínez et
al., 1996) y la plantaricina A (Hauge et al., 1998).
Las bacteriocinas de la clase III son termolábiles, tienen gran tamaño molecular (>30
kDa) y carecen de aminoácidos modificados en su estructura, como la helveticina J o la
enterocina MMT05 (Joerger y Klaenhammer, 1986; Ghrairi et al., 2004). Se desconoce el
modo de acción exacto de este grupo, aunque difiere del de las dos clases anteriores, ya que
no interfieren con la actividad de la membrana. Estas bacteriocinas han sido poco estudiadas y
son las que despiertan menos interés en la industria en la actualidad.
Algunos autores han propuesto otras dos clases, la IV y la V. La clase IV comprende
bacteriocinas de las que apenas se conoce nada sobre su estructura o función, excepto que
requieren lípidos o carbohidratos para ser activas. En esta clase se incluirían, entre otras, la
leuconocina S (Lemus et al., 2002) y la lactocina 27 (Upreti y Hinsdill, 1975). La clase V está
formada por bacteriocinas de estructura circular, pero que no están modificadas
postraduccionalmente, como la enterocina AS-48 (Maqueda et al., 2004), o la gassericina A
(Kawai et al., 2004).
Como se ha comentado anteriormente, a medida que aumenta el número de
bacteriocinas caracterizadas, se comprueba que algunas no se adaptan de forma adecuada a
ninguno de los grupos anteriores o que podrían incluirse en más de uno. Es posible, por tanto,
Introducción
21
que sea necesario replantearse los criterios para la clasificación de estos péptidos
antimicrobianos (Cotter et al., 2006).
II.2. PEDIOCINA PA-1
La pediocina PA-1 probablemente sea, después de la nisina, la bacteriocina más
estudiada en relación con la industria alimentaria por el control que ejerce sobre patógenos
como Listeria monocytogenes (Jack et al., 1995). Por otra parte, no sería de extrañar que en
un futuro no muy lejano esta bacteriocina adquiriese importancia en el ámbito médico para
controlar las infecciones intestinales causadas por bacterias patógenas multirresistentes. En un
estudio reciente se ha descrito la capacidad que tiene la pediocina PA-1 para modular la
microbiota intestinal y reducir la colonización de ratones infectados con enterococos
resistentes a la vancomicina (Millette et al., 2008a).
Las primeras referencias a la pediocina PA-1 se remontan a los años 80, cuando dos
grupos de investigadores describieron, por separado, la producción de una bacteriocina en dos
pediococos de origen cárnico, Pediococcus acidilactici PAC1.0 y P. acidilactici H. Su
caracterización confirmó que se trataba de la misma molécula, que se denomina
habitualmente como pediocina PA-1 (González y Kunka, 1983; Bhunia et al., 1988).
Posteriormente se ha descubierto que las bacteriocinas producidas por diversas cepas de P.
acidilactici, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus plantarum
también son idénticas a la pediocina PA-1 (Bennik et al., 1997; Christensen y Hutkins, 1992;
Daba et al., 1994; Ennahar et al., 1996; Hoover et al., 1988; Luchansky et al., 1992; Mathys et
al., 2007; Ray y Hoover, 1993; Rodríguez et al., 1997; Schved et al., 1993). Hasta el momento
es la única bacteriocina de su subclase que es producida por diferentes especies del mismo
género e incluso por diferentes géneros de bacterias lácticas (Miller et al., 2005).
Curiosamente, cabe señalar que Bacillus coagulans I4 produce una bacteriocina denominada
coagulina que tan sólo se diferencia de la pediocina PA-1 en un aminoácido (Le Marrec et al.,
2000).
El hecho de que se hayan aislado bacterias lácticas productoras de pediocina PA-1 a
partir de alimentos muy diversos (productos cárnicos, lácteos y vegetales) e incluso del
Introducción
22
intestino humano (Millette et al., 2008b), y en lugares muy distantes geográficamente, como
Canadá, EE.UU., España, India, Israel o Noruega, da una idea del grado de conservación y
difusión de esta propiedad (Rodríguez et al., 2002a).
II.2.1. Características moleculares
La pediocina PA-1 es un péptido de 44 aminoácidos que no se modifican
postraduccionalmente (Henderson et al., 1992; Marugg et al., 1992; Motlagh et al., 1992a;
Nieto Lozano et al., 1992) (Figura II.2). Tiene carga neta positiva a pH 6,0 (entre +8 y +3,
según los autores) y pI básico (entre 8,6 y 10, también según los autores) (Chen et al., 1997ª;
1997b; Jack et al., 1995; Henderson et al., 1992; Nieto Lozano et al., 1992). La secuencia
primaria conocida parece suficiente para inducir un efecto tóxico en las células sensibles, ya
que la pediocina PA-1 obtenida por síntesis química posee una actividad específica
comparable a la de la forma natural (Fimland et al., 1996).
El alineamiento de las secuencias de las bacteriocinas de la clase IIa (Figura II.3) revela
un elevado grado de homología entre ellas, especialmente en el extremo N-terminal (Drider et
al., 2006; Fimland et al., 2005; Nes y Holo, 2000). La comparación de sus estructuras
primarias sugiere la existencia de, al menos, dos módulos funcionales: uno en la región N-
terminal, con una secuencia aminoacídica relativamente bien conservada y de carácter
hidrofílico, y otro en la porción C-terminal, cuya secuencia está mucho menos conservada y
tiene carácter hidrofóbico y anfifílico (Fimland et al., 1998).
En la región N-terminal, que comprende los primeros 16 residuos de aminoácidos, se
encuentra la secuencia consenso YGNGV/L, denominada “caja de la pediocina”. Este
extremo conservado, que se caracteriza por tener una estructura de lámina β y un marcado
carácter catiónico (Figura II.2), es el responsable de la unión de la bacteriocina a la superficie
de las células sensibles. Las diferencias en esta región podrían explicar la distinta actividad
que muestran las bacteriocinas de esta subclase. En este extremo de la secuencia también
están muy conservados dos residuos de cisteína (Cys9, Cys14), que forman un puente
disulfuro, y un residuo de triptófano (Trp18). Los residuos de triptófano tienden a disponerse
en las interfases membrana-agua, como se ha puesto de manifiesto en otras proteínas de
Introducción
23
membrana. Por ello, es muy probable que estos tres aminoácidos contribuyan a estabilizar la
estructura terciaria de la pediocina PA-1 (Fimland et al., 2005).
Figura II. 2. Secuencia primaria y estructuras secundaria y terciaria de la pediocina PA-1. En la estructura secundaria, las líneas entre los residuos Cys9-Cys14 y Cys22-Cys44 representan los dos puentes disulfuro, las flechas indican las estructuras β y la cinta plegada simboliza la hélice α. En la estructura terciaria, las esferas amarillas representan los grupos implicados en los dos puentes disulfuro, la cinta verde la estructura de lámina β y la cinta roja la estructura de hélice α. Imágenes tomadas de Watson et al. (2001) y de Kaur et al. (2004).
El residuo conservado de ácido aspártico (o asparagina en otras bacteriocinas de la clase
IIa) en la posición 17 actúa como una bisagra, separando esta región N-terminal del extremo
C-terminal y permitiendo el necesario movimiento de uno con respecto al otro (Fimland et al.,
2005; Johnsen et al., 2005). En el extremo C-terminal se localiza el dominio más hidrofóbico,
siendo esta parte la que penetra en la parte hidrofóbica de la membrana celular de esas
bacterias sensibles y la que determina la especificidad de estas bacteriocinas de la clase IIa
(Fimland et al., 1996; Fimland et al., 2005; Johnsen et al., 2005). De hecho, la construcción de
bacteriocinas híbridas, combinando los dos dominios de varios miembros de la familia de la
pediocina, ha permitido comprobar que la especificidad de los péptidos obtenidos se
correspondía con la de la bacteriocina de la que procedía el extremo C-terminal (Fimland et
al., 1996; Johnsen et al., 2005).
Pediocina PA-1KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC hélice α
Introducción
24
Figura II.3. Alineamiento de las secuencias de las bacteriocinas maduras de la clase IIa, según el programa Clustalw2, con el editor Jalview 2.2.1. La intensidad del color azul muestra el porcentaje de identidad de los residuos en las distintas secuencias. Los residuos enmarcados en cajas negras están implicados en la estabilización de la estructura del péptido. La leucocina A es idéntica a la leucocina B, la piscicocina VIa es idéntica a la piscicolina 126, la sakacina A es idéntica a la curvacina A, la carnobacteriocina BM1 es idéntica a la piscicocina VIb, la pediocina PA-1 es idéntica a la pediocina AcH y a la pediocina SJ-1. La secuencia de la piscicocina CS526 se ha omitido por poseer varias indeterminaciones.
Introducción
25
Un rasgo muy importante de la pediocina PA-1, que comparte con otras de su subclase
(enterocina A, divercina V41, divergicina M35, plantaricinas 423 y 19 y sakacina G), es que
contiene dos cisteínas adicionales en el extremo C-terminal (Cys24 y Cys44; Figura II.4). El
análisis de espectrometría de masas de la pediocina PA-1 ha revelado una masa molecular
experimental de 4.623 Da, lo que confirma que sus cuatro residuos de cisteína están oxidados
y unidos, dos a dos, mediante puentes disulfuro (Fimland et al., 1996). Estos dos enlaces
disulfuro presentes en ambos extremos de la pediocina PA-1 se forman espontáneamente,
tanto en la pediocina PA-1 natural como en la obtenida por síntesis química, y son cruciales
para su actividad biológica (Ennahar et al., 2000; Fimland et al., 1996; Richard et al., 2006).
Figura II.4. Orientación en la membrana de las bacteriocinas de la clase IIa. El puente disulfuro y el residuo de triptófano del extremo C-terminal no están presentes en todas las bacteriocinas de esta subclase. Adaptado de Johnsen et al. (2005).
El primer modelo sobre la estructura secundaria y terciaria de la pediocina PA-1 se debe
a Chen et al. (1997a). Estos autores describieron cómo podría ser la estructura tridimensional
de los 19 residuos de aminoácidos presentes en el extremo N-terminal. Sin embargo, el
elevado grado de libertad conformacional que presentaba el extremo C-terminal no permitió
describir en aquel momento su estructura. Este primer modelo predecía una estructura de
lámina β formada por tres cadenas antiparalelas en el extremo N-terminal. Cuatro de los
residuos del motivo YGNGV se encuentran precisamente en el giro β entre la primera y
MEMBRANA
interior hidrofóbico
exterior hidrofílico
extremo N-terminal extremo
C-terminal
lámina β (dominio catiónico)
horquilla (dominio hidrofóbico)
(-S–S-)
-S-S-
Asp/Asn (bisagra)
Trp (Trp)
Introducción
26
segunda cadena (Gly4-Asn5-Gly6-Val7), mientras que en la vuelta entre la segunda y tercera
cadena se localizan dos residuos cargados positivamente (Lys11 e His12). Esta estructura de
lámina β está estabilizada por el puente disulfuro conservado Cys9-Cys14. Es de destacar que
esta disposición originaría una zona hidrofóbica determinada por los residuos Val7, Cys9,
Cys14, Val16 y Trp18. Los trabajos realizados con otras bacteriocinas de la clase IIa
(leucocina A y sakazina P) utilizando técnicas de resonancia magnética nuclear (NMR) han
confirmado que este modelo es aplicable todas ellas (Fimland et al., 2005).
El residuo Asp17 marca la separación entre esta lámina β y una hélice α que está
localizada en el centro de la molécula y tiene carácter anfifílico (Figura II.5). Esta hélice está
formada por 14 aminoácidos, desde Trp18 hasta Met31, orientándose los residuos
hidrofóbicos a un lado de la misma (Kaur et al., 2004). La cola con los restantes 13 residuos
que conforman esa región C-terminal no tiene una estructura secundaria definida, pero se
pliega sobre la hélice α creando una estructura similar a una horquilla, que puede penetrar en
la membrana celular de la célula diana (Figura II.4) (Ennahar et al., 2000; Johnsen et al.,
2005). De esta forma, entre los residuos Cys24 y Cys44, localizados en la mitad de la hélice α
y en el extremo de la molécula, respectivamente, se puede formar un segundo puente
disulfuro que estabiliza esta gran horquilla y es, además, responsable de la termoestabilidad
de la bacteriocina (Kaur et al., 2004). La importancia de este segundo puente disulfuro se
había puesto de manifiesto en ensayos realizados con la sakacina P. Esta bacteriocina sólo
contiene un puente disulfuro (Cys9-Cys14) de forma natural. La construcción de una variante
sintética de la sakacina P con un segundo puente disulfuro en el otro extremo de la molécula
(Cys24-Cys44) reveló que tenía una actividad y una estabilidad notablemente superiores a las
de la bacteriocina original (Uteng et al., 2003). A pesar de que entre las secuencias
aminoacídicas del extremo C-terminal de las bacteriocinas de la clase IIa existen diferencias
notables, la estructura de hélice α con un lado hidrofóbico descrita para la pediocina PA-1
parece estar muy conservada (Figura II.5).
Por otra parte, la metionina presente en la posición 31 también es importante para la
actividad de la pediocina PA-1, puesto que la oxidación de su átomo de azufre desestabiliza la
bacteriocina al formarse agregados que carecen de actividad (Johnsen et al., 2000).
Introducción
27
Figura II.5. Estructura de hélice α con carácter anfipático formada por 14 residuos del extremo C-terminal de la pediocina PA-1. Fuente: Kaur et al. (2004).
Estudios de espectroscopía de dicroismo circular y espectroscopía de infrarrojos por
transformada de Fourier han puesto de manifiesto que la pediocina PA-1 tiene una disposición
muy desordenada en solución acuosa a pesar de contar con dos puentes disulfuro (Watson et
al., 2001). Sin embargo, a diferencia de otras bacteriocinas relacionadas, posee en ese
ambiente una pequeña proporción de estructura β (20% de lámina β y 15% de giro β). Esta
disposición permitiría que los aminoácidos catiónicos conservados del extremo N-terminal,
que son necesarios para la interacción electrostática inicial con las bacterias sensibles,
quedasen orientados hacia el exterior de la molécula. La presencia de una interfase
hidrocarbono-agua, con una estructura similar a una membrana biológica, disminuye el
desorden de la molécula al inducir que el 32% de los aminoácidos formen una hélice α, al
tiempo que se mantienen las estructuras β antes mencionadas.
II.2.2. Organización genética
Las cepas que producen pediocina PA-1 de forma natural descritas hasta el momento
poseen los determinantes genéticos para la biosíntesis de esta bacteriocina localizados en
plásmidos cuyo tamaño oscila entre 8,9 y 11 kb (Bhunia et al., 1994; Ennahar et al., 1996;
González y Kunka, 1987; Hoover et al., 1988; Jager y Harlander, 1992; Motlagh et al., 1992a;
Ray et al., 1989; Rodríguez et al., 1997; Miller et al., 2005). En estos plásmidos, los
determinantes genéticos necesarios para la producción de la pediocina PA-1 ocupan un
fragmento de aproximadamente 3,5 kb (Figura II.6) que contiene 4 marcos abiertos de lectura
(genes pedA, pedB, pedC y pedD) con idéntica secuencia y organización en todas las cepas
Introducción
28
productoras de esta bacteriocina (Marugg et al., 1992; Mathys et al., 2007; Miller et al.,
2005).
Figura II.6. Representación esquemática del operón de la pediocina PA-1
Los cuatro genes están dispuestos dentro de un mismo operón (operón ped o pap),
bajo el control de un promotor situado delante del gen pedA. Las secuencias -35 (TTGACA) y
-10 (TAGAAT) del promotor se ajustan a las secuencias consenso de los promotores
constitutivos de las bacterias Gram-positivas (Marug et al., 1992). La transcripción del operón
de la pediocina origina dos tipos de mRNA. El primero y más abundante (1,2 kb) cubre los
genes pedABC, mientras que el segundo (3,5 kb) abarca los cuatro genes del operón
(pedABCD). Este hecho está en concondarcia con la existencia de dos terminadores
transcripcionales rho-independientes detrás de los genes pedC y pedD (Motlagh et al., 1994;
Venema et al., 1995).
El operón coa, que codifica la producción de coagulina en B. coagulans, tiene la
misma organización y una elevadísima homología de secuencia que el operón ped, presente
en al menos 5 cepas de Pediococcus y Lactobacillus productoras de pediocina PA-1. Sin
embargo, no existe homología entre los promotores ni entre las secuencias que flanquean a
ambos operones en los plásmidos presentes en los tres géneros bacterianos, lo cual indica que
la dispersión de los genes productores de pediocina PA-1 se ha producido hace no mucho
tiempo, probablemente por conjugación (Le Marrec et al., 2000; Miller et al., 2005).
El gen pedA es el gen estructural y codifica un péptido de 62 aminoácidos, la
prepediocina PA-1. El gen de inmunidad, pedB, se encuentra inmediatamente a continuación
ped
ped ped ped
186 pb 336 pb 522 pb 2172 pb
P TR R R R
T
P: promotor R: Lugar de unión al ribosoma T: terminador transcripcional
Introducción
29
y codifica una proteína de 112 aminoácidos (ped-im) que está involucrada en la protección de
la cepa productora frente a su propia bacteriocina. Y, por último, los genes pedC y pedD están
implicados en el procesado y secreción de la bacteriocina al exterior de la célula
(Bukhtiyarova et al., 1994; Marugg et al., 1992).
La proteína PedD (724 aminoácidos) pertenece al grupo de transportadores exclusivos
del tipo ABC (del inglés, ATP-Binding Cassette) y, por lo tanto, interviene en el transporte de
la bacteriocina a través de membrana citoplasmática de las células productoras. Su secuencia
tiene un elevado grado de homología con las de muchos otros transportadores de tipo ABC
(Fath y Kolter, 1993). La proteína PedC (174 aminoácidos), que pertenece al grupo de
proteínas accesorias requeridas en los procesos de traslación asociados a transportadores de
tipo ABC, es esencial para la secreción de la pediocina PA-1, aunque se desconoce su función
exacta. Ambas proteínas, PedD y PedC, son similares a las implicadas en el transporte de la
lactococina A en Lactococcus lactis y de la hemolisina A en Escherichia coli (Bukhtiyarova
et al., 1994; Gilson et al., 1990; Håvarstein et al., 1995; Marugg et al., 1992; Stoddard et al.,
1992; Venema et al., 1995). Aunque la utilización de transportadores del tipo ABC es muy
común entre las bacteriocinas de la clase IIa, un número reducido de bacteriocinas emplean la
ruta general de secreción (sec), como la enterocina P (Cintas et al., 1997), la enterocina 31
(Tomita et al., 1996) o la bacteriocina T8 (De Kwaadsteniet et al., 2006).
En otros miembros de la clase IIa, los genes encargados de la síntesis, el procesado y la
secreción de las bacteriocinas tienen una organización semejante, aunque generalmente algo
más compleja. Estos genes están agrupados en uno, dos o tres operones, que generalmente
también se localizan en plásmidos, excepto algunos casos (enterocina A, divercina V41,
sakacina P y carnobacteriocinas B2 y BM1) en los que se encuentran en el cromosoma
bacteriano. La disposición más compleja descrita hasta el momento la tienen las bacteriocinas
con regulación transcripcional, en las que los genes se agrupan en tres operones: el primero
contiene el gen estructural y el de inmunidad, el segundo los genes de transporte y secreción y
el tercero aquellos que intervienen en la autorregulación mediante el fenómeno de percepción
de quórum (Ennahar et al., 2000). Para las bacteriocinas que emplean la ruta general de
secreción ni siquiera se conoce el número exacto de genes implicados en su producción
(Drider et al., 2006).
Introducción
30
II.2.3. Biosíntesis y regulación
Todas las bacteriocinas de la clase IIa se sintetizan en forma de precursor o
prebacteriocina, en la que la bacteriocina está unida a una secuencia líder N-terminal o
péptido señal (de 15 a 30 aminoácidos según la bacteriocina), que es imprescindible para la
secreción de la bacteriocina al medio exocelular (Figura II.7). Este líder contiene una
secuencia consenso consistente en dos residuos de glicina en su extremo C-terminal, por lo
que habitualmente se denominan líderes “doble glicina”. Se considera que estos dos residuos
conservados de glicina actúan como una señal de reconocimiento para su procesado y
transporte a través de la membrana (Håvarstein et al., 1994; 1995). La secuencia líder de la
pediocina PA-1 consta de 14 aminoácidos y muestra una intensa homología con la de otras
bacteriocinas. En ciertas posiciones (-4, -7, -12 y -15) siempre se encuentra un aminoácido
hidrofóbico mientras que en las posiciones -5, -6 y -11 siempre se disponen residuos
hidrofílicos (Figura II.7). Esta similitud entre los líderes doble glicina hace suponer que exista
cierta similitud en las proteínas encargadas de su transporte, lo cual permitiría la expresión
heteróloga de una bacteriocina de la clase IIa empleando el sistema de transporte de otra
bacteriocina relacionada que pudiera ser más eficiente (Ennahar et al., 2000).
Tradicionalmente se ha considerado que una de las dos principales funciones de esta
secuencia líder es evitar que la bacteriocina sea biológicamente activa cuando se encuentra en
el interior de la célula productora (evitando la interacción de la bacteriocina con la
membrana). Así lo confirmaban los resultados obtenidos durante la caracterización del operón
de la pediocina PA-1 por Venema et al. (1995). Sorprendentemente, pocos años más tarde se
describió que, a diferencia de lo que se observaba en otras bacteriocinas relacionadas, la
prepediocina PA-1 tenía casi la misma actividad biológica que la bacteriocina madura (Ray et
al., 1999). Estos investigadores postularon que, en ese caso, la célula productora debía
disponer de otros mecanismos para defenderse de la acción letal de la prebacteriocina. Entre
ellos citan como posibles: un mecanismo rápido y eficiente de translocación de la
prebacteriocina al exterior celular, mantener los residuos de cisteína en estado reducido y/o
una rápida destrucción por parte de las proteasas intracelulares de las moléculas de
prebacteriocina que no se secreten inmediatamente (Ray et al., 1999).
Introducción
31
Figura II.7. Alineamiento de las secuencias líder de algunas bacteriocinas de la clase IIa, según el programa ClustalW2 con el editor Jalview 2.2.1. La intensidad del color azul muestra el porcentaje de identidad de los residuos en las distintas secuencias.
La segunda función asignada a esta secuencia líder es la de proporcionar la señal de
reconocimiento al sistema de transporte de la bacteriocina. Como se ha indicado
anteriormente, el transporte y procesado de las bacteriocinas que poseen un líder doble glicina
se realiza mediante transportadores dedicados del tipo ABC y sus proteínas accesorias. Puesto
que en la misma célula se pueden encontrar simultáneamente varios transportadores ABC, la
presencia de una secuencia de reconocimiento específica es fundamental para asegurar que el
transporte eficaz de la bacteriocina por su transportador específico (Drider et al., 2006).
Los transportadores ABC son una superfamilia de proteínas dedicadas a la secreción
de diversas sustancias que tienen en común la presencia de un gran dominio de 200
aminoácidos en el extremo C-terminal, que se caracteriza por ser muy hidrofílico y estar muy
conservado, donde se une el ATP. Además, los transportadores ABC encargados del
Introducción
32
transporte y secreción de bacteriocinas que poseen un líder doble glicina forman una pequeña
subfamilia con un alto grado de homología en sus extremos, siendo ambos fundamentales
para su actividad. En el extremo N-terminal se encuentra un dominio citosólico (de unos 150
aminoácidos) con actividad proteolítica encargado de separar el líder de la bacteriocina por el
lugar adyacente al motivo Gly-Gly y liberar la bacteriocina madura. En este extremo N-
terminal se han identificado dos motivos conservados: el motivo “cisteína”
(QX4D/ECX2AX3MX4Y/FGX4I/L) y el motivo “histidina” (HY/FY/VVX10I/LXDP) donde se
encuentran dos aminoácidos implicados en la actividad tiol proteinasa (Hårvarstein et al.,
1995). La intervención de este dominio N-terminal de PedD en la eliminación del líder de la
pediocina PA-1 por proteolisis intracelular fue demostrada por Venema et al. (1995). La
región que existe entre ambos extremos de estos transportadores ABC tiene una secuencia
aminoacídica menos conservada y forma el dominio transmembrana (Håvarstein et al., 1995).
La topología de membrana de PedD parece similar a la de LcnC, que posee cuatro segmentos
transmembránicos en vez de los seis típicos en otros transportadores ABC (Franke et al.,
1996).
Por último, para la secrección y el transporte de la pediocina PA-1 a través de la
membrana se requiere la proteína accesoria PedC. Por analogía con la proteína accesoria
HlyD, que se extiende entre las dos membranas de E. coli formando un canal para la secreción
de la hemolisina A (Schülein et al., 1992), Venema et al. (1995) especularon que PedC estaría
involucrada en la formación de canales entre la membrana plasmática y la pared celular de las
células productoras de pediocina PA-1. Franke (1998) ha postulado un papel similar para
LcnD, la proteína accesoria de la lactococina A.
El trabajo de Håvarstein et al. (1995) con el péptido α de la lactococina G demostró
que la secreción de ésta y otras bacteriocinas, entre las que se incluye la pediocina PA-1, es un
proceso bifásico. En primer lugar, el dominio proteolítico de PedD se une a la prepediocina,
desencadenando la hidrólisis del ATP que induce cambios conformacionales en el
transportador. La hidrólisis de la secuencia líder en el lado citosólico de la membrana se
compaña del transporte de la bacteriocina a través del complejo formado por el dominio
transmembránico de PedD y PedC en la membrana citoplasmática.
Introducción
33
II.2.4. Espectro antimicrobiano
La producción de bacteriocinas es una característica muy extendida y conservada entre
las bacterias. Esto indica que es un rasgo ventajoso para la bacteria productora, ya que le
permite adquirir una posición dominante en un determinado nicho ecológico al eliminar a
otras bacterias competidoras (Deegan et al., 2006). A diferencia de las bacteriocinas de la
clase I, que tienen un espectro de acción bastante amplio, en la clase II suele ser más limitado.
Una de las posibles razones quizá sea la necesidad de un receptor en la bacteria sensible. Sin
embargo, la pediocina PA-1 puede considerarse una excepción porque es activa frente a un
número nada despreciable de bacterias Gram-positivas relacionadas (Tabla II.2), como
algunas especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Carnobacterium o Enterococcus.
Además, también tiene actividad frente a otras bacterias Gram-positivas más lejanas
filogenéticamente, entre las que se encuentran algunas causantes de toxiinfecciones
alimentarias y/o alterantes de los alimentos, como Bacillus, Brochotrix, Clostridium, Listeria
y Staphylococcus (Ennahar et al., 2000). Es preciso aclarar que la sensibilidad depende de la
especie e incluso de la cepa. Merece la pena destacar que las mismas concentraciones de esta
bacteriocina no tienen ningún efecto en diversas especies que frecuentemente forman parte de
cultivos iniciadores, como las del género Lactococcus (Eijsink et al., 1998; Guyonnet et al.,
2000). Sin embargo, hasta el momento, uno de los rasgos que más se destacan de la pediocina
PA-1, así como de otras bacteriocinas de la clase IIa, es su intensa actividad frente a L.
monocytogenes (Muriana, 1996). En la Tabla II.2 se indica el espectro antimicrobiano de la
pediocina PA-1 según han indicado diversos autores.
Con respecto a las bacterias Gram-negativas, sus cubiertas celulares impiden el acceso
de las bacteriocinas a la membrana plasmática. Sin embargo, es suficiente alterar la
permeabilidad de sus membranas externas para permitir la acción antibacteriana de las
bacteriocinas. Uno de los ejemplos más clásicos es el empleo del quelante EDTA, que une
iones magnesio del lipopolisacárido y altera la membrana externa de las bacterias Gram-
negativas, permitiendo el paso de las bacteriocinas (Stevens et al., 1991). Este modo de acción
también explica que las bacterias Gram-negativas sean sensibles a las bacteriocinas después
de haber sido sometidas a algunos nuevos métodos de conservación que debilitan o forman
poros en sus cubiertas celulares, como las altas presiones hidrostáticas (Kalchayanand et al.,
1998).
Introducción
34
Tabla II.2. Espectro antimicrobiano de la pediocina PA-1ª Bacterias Gram-positivas
Células vegetativas Bacillus cereus Lactobacillus leichmanni Bacillus subtilis Lactobacillus plantarum Brochotrix thermosphacta Lactobacillus sakei Carnobacterium divergens Lactobacillus sanfranciscensis Carnobacterium piscicola Lactobacillus viridescens Clostridium botulinum Lactococcus raffinolactis Clostridium butyricum Lactococcus lactisc Clostridium divergens Leuconostoc mesenteroides Clostridium laramiae Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris Clostridium perfringens Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum Enterococcus durans Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Enterococcus faecalis Listeria innocua Enterococcus faecium Listeria ivanovii Enterococcus hirae Listeria monocytogenes Lactobacillus bifermentum Mycobacterium smegmatis Lactobacillus casei Pediococcus acidilacticid Lactobacillus coryniformis Pediococcus pentosaceus Lactobacillus curvatus Propionibacterium acidipropionici Lactobacillus helveticus Staphylococcus aureus
Esporos Bacillus subtilis Bacillus stearothermophilus Clostridium botulinum tipo E Clostridium laramiae
Bacterias Gram-negativasb Aeromonas hydrophila Escherichia coli Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Salmonella typhimurium Salmonella anatum Yersinia enterocolitica
aEl listado no es completamente exhaustivo y ciertas cepas pertenecientes a las especies citadas pueden ser resistentes bTras ser sometidas a tratamientos subletales cHay algunas cepas sensibles, aunque la mayoría son resistentes dCepas no productoras de pediocina PA-1
Es muy difícil comparar la actividad de unas bacteriocinas con otras porque, aunque se
han realizado muchos ensayos, las condiciones empleadas son difícilmente comparables. Por
otra parte, a pesar de la homología entre las secuencias de las bacteriocinas de la familia de la
pediocina, existe variabilidad tanto en la especificidad de las bacterias sensibles como en la
intensidad de su actividad (Eijsink et al., 1998; Fimland et al., 1996; Richard et al., 2006).
Introducción
35
Este hecho se ha relacionado con las diferencias que existen en las secuencias de estas
bacteriocinas (Johnsen et al., 2005). Al comparar la actividad antimicrobiana de cuatro
bacteriocinas puras de la clase IIa (pediocina PA-1, enterocina A, sakacina P y curvacina A)
frente a un amplio espectro de microorganismos indicadores se puso de manifiesto que las dos
primeras eran las que inhibían a un mayor número de cepas y las que tenían valores de
concentraciones inhibitorias mínimas más bajos (Eijsink et al., 1998).
Posteriormente, Guyonnet et al. (2000) confirmaron estos resultados al comparar la
actividad de seis bacteriocinas purificadas pertenecientes a la clase IIa. De nuevo, la pediocina
PA-1 y la enterocina A, junto con la divercina V41, fueron las más activas frente a Listeria
ivanovii. La característica común de estas tres bacteriocinas es la posesión de dos puentes
disulfuro, mientras que las bacteriocinas con menor actividad tienen tan sólo uno. Más
recientemente, Richard et al. (2006) estudiaron la acción inhibidora de ocho miembros de la
clase IIa empleando la misma técnica analítica y 23 bacterias Gram-positivas como
microorganismos indicadores. En seis de las ocho bacteriocinas ensayadas (pediocina PA-1,
enterocina P, curvacina A, sakacina A, mesentericina Y105 y bavaricina A) se confirmó que
su espectro de actividad era relativamente amplio. Probablemente el resultado más destacable
de este vasto estudio sea, precisamente, la comprobación de que existe una fuerte correlación
entre la intensidad de la actividad inhibidora y la presencia de un puente disulfuro en el
extremo C-terminal de la molécula de la bacteriocina. Con la única excepción del pI, ningún
otro parámetro físico-químico ni la estructura primaria de las bacteriocinas (número de
aminoácidos en la bacteriocina madura, masa molecular, número de residuos cargados
positiva o negativamente y carácter alifático o hidrofóbico) influía en la actividad inhibidora
de la bacteriocina. Este segundo puente disulfuro es muy importante para la estabilización de
la estructura secundaria del extremo C-terminal, así como para reconocer el receptor y
determinar la especificidad de acción (Fimland et al., 1996; Kaur et al., 2004).
Para muchas aplicaciones, por ejemplo controlar la microbiota alterante en un
producto cocido y envasado, generalmente es más conveniente que las bacteriocinas tengan
actividad frente a un amplio espectro de bacterias. En cambio, en algunos casos concretos
puede interesar lo contrario, como por ejemplo en productos lácteos fermentados, en cuyo
caso es interesante que la bacteriocina no disminuya la actividad del cultivo iniciador. En
Introducción
36
estos casos, el empleo de pediocina PA-1 resulta muy interesante porque no tiene actividad
frente a la mayor parte de las cepas de Lactococcus.
II.2.5. Modo de acción
El modo de acción de la pediocina PA-1 en las bacterias sensibles es bactericida y se
debe a la permeabilización de la membrana como consecuencia de la formación de poros.
Pero no todas las bacteriocinas tienen el mismo modo de acción. Así, por ejemplo, la nisina
no se limita a formar poros, sino que su mecanismo de acción incluye también la inhibición de
la biosíntesis de la pared celular gracias a su capacidad de unir el lípido II y la inducción de
autolisis, entre otros. Esta multiplicidad de acción de la nisina, y otras bacteriocinas
relacionadas, hace que sea muy efectiva incluso a concentraciones ínfimas (nM) (Hèchard y
Sahl, 2002; Patton y van der Donk, 2005).
Las bacteriocinas de la clase IIa, en cambio, actúan fundamentalmente mediante la
formación de complejos de poración por los que se pierden algunos componentes
intracelulares: iones, aminoácidos y otros compuestos de bajo peso molecular (Deegan et al.,
2006). Como consecuencia se disipa la fuerza protón-motriz, reduciéndose o perdiéndose
totalmente el potencial eléctrico transmembrana (∆Ψ) y el gradiente de protones (∆pH), como
se ha comprobado para la pediocina PA-1 y otras bacteriocinas relacionadas (Bhunia et al.,
1991; Chen y Montville, 1995; Chikindas et al., 1993; Jack et al., 1995). Todos aquellos
procesos celulares que requieren energía, como por ejemplo la síntesis de ATP y algunos
sistemas de transporte, resultan profundamente afectados. Sin embargo, y a diferencia de los
lantibióticos, la pediocina PA-1 no provoca la salida de ATP hacia el exterior celular, aunque
sí un rápido agotamiento de las reservas intracelulares al intentar la célula sensible recuperar
la fuerza protón-motriz (Chen y Montville, 1995).
La permeabilización de la membrana mediada por las bacteriocinas se lleva a cabo en
tres etapas: unión a la membrana, inserción y agregación de monómeros para formar
complejos de poración. Los primeros estudios sobre el modo de acción de la pediocina PA-1
sugirieron que para su actividad in vivo era necesaria la presencia de un receptor específico en
la membrana de la bacteria sensible (Chikindas et al., 1993; Venema et al., 1995). Estudios
posteriores demostraron que la unión inicial de la pediocina PA-1 a la membrana era
Introducción
37
inespecífica y sin intervención del motivo consenso YGNGV/L, presente en todas las
bacteriocinas de la familia de la pediocina (Chen et al., 1997a). Dicha unión inicial estaría
mediada por interacciones electrostáticas entre los residuos de aminoácidos cargados
positivamente en la bacteriocina y los fosfolípidos presentes en la membrana de dicho
microorganismo, siendo esencial para esa unión el carácter aniónico de los lípidos (Chen et
al., 1997a; 1997b). La observación de que la pediocina PA-1 no sólo es capaz de
permeabilizar vesículas de lípidos obtenidos de L. monocytogenes, sino también vesículas de
fosfolípidos puros, parecía reforzar la idea de que no era necesario un receptor proteico. Por
otra parte, la presencia de ácido lipoteicoico, que se caracteriza por tener una fuerte carga
negativa, en la pared celular de las bacterias Gram-positivas y su ausencia en la de las Gram-
negativas podría explicar por qué esta bacteriocina únicamente es activa per se frente a cepas
Gram-positivas. Sin embargo, Fimland et al. (1998) mostraron claramente que un fragmento
sintético de 15 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal de la pediocina PA-1 inhibía
su actividad y la de otras bacteriocinas relacionadas. Estos investigadores sugirieron que este
fragmento competía con las bacteriocinas por un receptor en las células sensibles.
Los estudios realizados con mutantes de Listeria monocytogenes y Enterococcus
faecalis resistentes a las bacteriocinas de la clase IIa han proporcionado mucha información
sobre el modo de actuación de estas bacteriocinas a nivel molecular. Los primeros resultados
obtenidos indicaron que el gen rpoN estaba implicado en la sensibilidad de estas bacterias, ya
que los mutantes en este gen en ambas especies tenían un fenotipo resistente a bacteriocinas
de la clase IIa. El gen rpoN codifica la subunidad σ54 de la RNA polimerasa, un factor sigma
alternativo que controla la transcripción de un grupo de genes, que tienen un promotor distinto
del habitual. Es decir, los resultados obtenidos indicaban que el gen rpoN controlaba la
expresión de la molécula a la que se unían las bacteriocinas de la clase IIa (Robichou et al.,
1997; Dalet et al., 2000). La resistencia a las bacteriocinas de la clase IIa también se
conseguía en L. monocytogenes y E. faecalis mediante mutaciones en el operón mpt, que
codifica una permeasa específica de manosa (EIItMan) del sistema de fosfotransferasa de
azúcares dependiente de fosfoenolpirúvico (PTS) (Gravesen et al., 2002). La expresión del
operón mpt no depende del factor sigma más habitual (σ70) sino de σ54, en concordancia con
los resultados obtenidos anteriormente. La permeasa EIItMan de L. monocytogenes está
formada por tres subunidades: IIAB, que se encuentra en el lado citoplasmático y está
implicada en la fosforilación del azúcar que se va a transportar, y IIC y IID, que se encuentran
Introducción
38
inmersas en la membrana y son las encargadas del transporte del azúcar de un lado a otro de
la membrana. Curiosamente, el nivel de expresión del operón mpt está estrechamente
relacionado con la sensibilidad a la bacteriocina (Dalet et al., 2001; Hèchard et al., 2001).
Aunque los primeros resultados se obtuvieron con la mesentericina Y105 y la leucocina A, al
estudiar en profundidad los mecanismos de resistencia de Listeria se ha indicado que este
rasgo podría hacerse extensivo a otras bacteriocinas de la clase IIa (Dalet et al., 2001;
Gravesen et al., 2002; Ramnath et al., 2000). De hecho, la resistencia de Listeria a las
bacteriocinas de la clase IIa supone un coste energético ya que lleva aparejado una menor
actividad de las enzimas encargadas del transporte de la glucosa y suelen mostrar una menor
velocidad de crecimiento (Dykes y Hastings, 1998; Naghmouchi et al., 2007; Vadyvaloo et
al., 2002). En la Figura II.8 se muestra cómo se podría producir la interacción de una
bacteriocina de la clase IIa con la permeasa de la manosa.
Figura II.8. Representación esquemática de la interacción de una bacteriocina de la clase IIa con el receptor, la permeasa específica de manosa (EIIt
Man) que consta de tres subunidades IIAB (en el lado citosólico de la membrana) y IIC y IID (inmersas en la bicapa lipídica). La bacteriocina se une a la subunidad IIC y dispara la permeabilización de la bacteria, provocando finalmente la muerte celular. La bacteriocina está representada como una línea ondulada. Adaptado de Diep et al. (2007).
La expresión de distintas combinaciones de los tres genes del operón mpt de L.
monocytogenes en una cepa de Lactococcus lactis resistente a varias bacteriocinas de la clase
IIa permitió comprobar que basta con la expresión del gen mptC (que codifica la subunidad
IIC de la permeasa EIItMan) para inducir sensibilidad a ese tipo de bacteriocinas (en concreto,
la leucocina A, la enterocina A y la pediocina PA-1). El efecto observado no se podía atribuir
a una alteración de la membrana ocasionada por la presencia de las proteínas inducidas
(Ramnath et al., 2004). Otros investigadores, en cambio, si han encontrado modificaciones en
la composición lipídica de la membrana celular en variantes de L. monocytogenes y en la
Introducción
39
fluidez de la membrana de cepas de L. innocua resistentes a bacteriocinas de clase IIa
(Naghmouchi et al., 2007).
Con respecto a los complejos de poración, el modelo más aceptado sugiere que las
estructuras de hélice α de las bacteriocinas se dispondrían atravesando la membrana de las
bacterias sensibles como si fueran las duelas de un barril (Figura II.9). El lado hidrofóbico de
las hélices α interaccionaría con las cadenas de los ácidos grasos de los fosfolípidos de la
membrana y el lado hidrofílico formaría parte del canal del poro. Sin embargo, no se descarta
que las moléculas de bacteriocina pudieran disponerse sobre la superficie de la membrana,
como una alfombra, interfiriendo con su organización bicapa (Moll et al., 1999). No existen
datos concluyentes sobre la arquitectura ni la estequiometría exactas ni si se producen
interacciones entre las moléculas de bacteriocina que se encuentran en la membrana.
Figura II.9. Representación esquemática de la interacción de las bacteriocinas de la clase IIa con la membrana plasmática de las células sensibles hasta formar un poro hidrofílico. A. Reconocimiento del receptor. B. Interacción electrostática con la membrana citoplasmática. C. Interacción hidrofóbica. D. Reorientación e inserción de la bacteriocina en la bicapa lipídica. E. Agregación y formación del poro que permite la salida de componentes intracelulares. Las partes sombreadas de la bacteriocina se corresponden con las zonas hidrofóbicas, mientras que las claras lo hacen con las hidrofilicas. Adaptado de Ennahar et al. (2000).
A
B
C D
E
Introducción
40
La pediocina PA-1 actúa sinérgicamente con otras bacteriocinas de la clase I (nisina,
lacticina 481), de la subclase IIb (lactacina F) y de la clase III (lactacina B) (Hanlin et al.,
1993; Mulet-Powell et al., 1998; Naghmouchi et al., 2007). Curiosamente, la lacticina 481,
que muestra un marcado carácter sinérgico cuando se combina con la pediocina PA-1,
interacciona antagónicamente con el resto de las bacteriocinas citadas. Por otra parte, no se
han observado efectos sinérgicos entre la pediocina PA-1 y otras bacteriocinas de la clase IIa,
como la enterocina A, la curvacina A y la sakacina P, lo cual es lógico ya que todas las
bacteriocinas de esta subclase tienen una gran similitud en cuanto a su estructura y modo de
acción (Eijsink et al., 1998).
También se ha constatado acción sinérgica de tres bacteriocinas de la familia de la
pediocina (curvacina A, pediocina PA-1, sakacina P) con la pleurocidina, un péptido
antimicrobiano de síntesis ribosomal pero de origen piscícola (Cole et al., 1997). La
pleurocidina es capaz de permeabilizar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas,
permitiendo así el acceso de las bacteriocinas a la membrana interna. Es decir, ésta podría ser
una alternativa para aumentar el espectro de bacterias sensibles a las bacteriocinas. Estos
péptidos antimicrobianos de origen eucariota se diferencian de las bacteriocinas por tener un
espectro de acción más amplio, que incluye tanto a microorganismos Gram-positivos como
Gram-negativos. Sin embargo, dicha acción requiere emplear concentraciones mucho
mayores, aproximadamente de un orden de magnitud. Estos péptidos no tendrían interés en la
práctica porque, además, su producción tiene un elevado coste ya que la fuente natural de
producción no es rentable y la síntesis química automatizada sería muy costosa.
II.2.6. Inmunidad de las células productoras
Uno de los aspectos más desconocidos de las bacteriocinas es la protección de las
células productoras frente a sus propias bacteriocinas. En general, la expresión de las
bacteriocinas de la clase IIa se acompaña de la de una proteína de inmunidad, codificada en
un gen contiguo. La protección que proporciona esta proteína de inmunidad a la célula
productora de la bacteriocina suele ser bastante específica, ya que sólo es extensible a otras
bacteriocinas muy relacionadas con la que produce la propia bacteria. Esta especificidad se ha
atribuido a la escasa homología que existe entre las proteínas de inmunidad de las
bacteriocinas de la clase IIa y que contrasta con la elevada homología que se observa entre las
Introducción
41
secuencias de las bacteriocinas correspondientes (Aymerich et al., 1996; Drider et al., 2006;
Eijsink et al., 1998). Hasta el momento, y dentro del grupo de las bacteriocinas de la clase IIa,
se ha identificado la secuencia de unas supuestas 20 proteínas de inmunidad, que se pueden
agrupar claramente en función de su homología (Drider et al., 2006). Tienen entre 88 y 115
aminoácidos, de los cuales entre el 25 y el 30% son residuos cargados, lo que confiere a la
molécula un fuerte carácter hidrofílico. Por ello se consideran proteínas citosólicas,
habiéndose confirmado que su interacción con la membrana, cuando se produce, es
relativamente débil (Johnsen et al., 2004).
En las bacterias productoras de pediocina PP-1, que se diferencia de la pediocina PA-1
en tan solo un aminoácido, se ha purificado y cristalizado la proteína de inmunidad PedB para
determinar su estructura tridimensional y compararla con la de las proteínas de inmunidad de
la carnobacteriocina B2 (ImB2) y de la enterocina A (EntA-im) (Kim et al., 2007).
Curiosamente, y a pesar de la escasa homología de las secuencias, las tres son proteínas
globulares y comparten la misma estructura tridimensional: un dominio compacto formado
por un manojo de cuatro hélices α antiparalelas unidas entre sí mediante unos pequeños bucles
de 4 a 7 aminoácidos. Esta estructura está estabilizada por las interacciones hidrofóbicas que
se establecen entre las hélices α, que forman un núcleo de carácter hidrofóbico en el centro de
la proteína, quedando los residuos hidrofílicos y cargados en el exterior (Kim et al., 2007).
Esta disposición concuerda con que la proteína de inmunidad tenga una localización
citosólica. La predicción de la estructura de otras proteínas de inmunidad apunta fuertemente
a que esta estructura de cuatro hélices α está muy conservada en las bacteriocinas de la clase
IIa. Las principales diferencias se encuentran en el extremo C-terminal, donde se encuentran
precisamente varios aminoácidos polares y cargados, sin una estructura claramente definida
en algunos casos, que podrían estar implicados en el reconocimiento específico de la
bacteriocina correspondiente (Kim et al., 2007). Estudios realizados con proteínas de
inmunidad híbridas ya habían señalado que ese extremo de la molécula reconoce el extremo
C-terminal de la bacteriocina y es el responsable de la especificidad de la inmunidad (Johnsen
et al., 2004 y 2005). Sin embargo, no parece haber una interacción directa entre la proteína de
inmunidad y su bacteriocina. La bacteriocina está embebida en la membrana, mientras que la
proteína de inmunidad sólo puede interaccionar con los lípidos polares de la superficie de la
membrana, una disposición que dificulta la interacción entre la proteína de inmunidad y la
bacteriocina (Johnsen et al., 2004; Fimland et al., 2005; Kim et al., 2007).
Introducción
42
Aunque no se conoce con detalle el modo de acción de las proteínas de inmunidad de
las bacteriocinas de la clase IIa, si se sabe que para ejercer la protección han de producirse
intracelularmente. La adición extracelular de la bacteriocina y de la proteína de inmunidad a
células sensibles no ejerce ninguna protección (Kim et al., 2007). La ausencia de interacción
directa entre la bacteriocina y la proteína de inmunidad ha sugerido la existencia de un
mediador que impida la actividad de la bacteriocina. Este mediador podría ser la propia
membrana o un componente presente en ella. Se ha postulado que la proteína de inmunidad
podría interaccionar con el poro formado por la bacteriocina, impidiendo la salida de
componentes intracelulares. Otra posibilidad es que la proteína de inmunidad interaccione con
el receptor de la bacteriocina, alterando su conformación o escondiendo el sitio de unión.
Recientemente se ha comprobado que EntiP, SaiA y LciA, las proteínas de inmunidad de
varias bacteriocinas de la clase II (enterocina P, sakacina A y lactococina A, respectivamente)
forman complejos con los componentes IIC y IID de EIItMan, pero sólo cuando la bacteriocina
correspondiente también forma parte del complejo (Diep et al., 2007). La propuesta que se
deriva de estas observaciones es que, en las bacteriocinas de clase II, la proteína de inmunidad
interacciona directamente con el complejo receptor-bacteriocina y bloquea los pasos
posteriores que dan lugar a la permeabilización de la membrana y, por último, a la muerte
celular (Diep et al., 2007) (Figura II.10). Sin embargo, es difícil explicar la especificidad de la
inmunidad si todas las bacteriocinas de la clase IIa interaccionan con el mismo receptor
(Drider et al., 2006).
Figura II.10. Modelo de inmunidad propuesto para bacteriocinas de la clase II. A. En las células inmunes, y en ausencia de bacteriocina, la proteína de inmunidad (I) no tiene una asociación especial con EIIt
Man. B. Cuando hay bacteriocina en el medio extracelular, la proteína de inmunidad se aproxima y une fuertemente a las proteínas IIC y IID de EIIt
Man (receptor de la bacteriocina) C. El complejo bacteriocina-proteínas IIC y IID-proteína de inmunidad impide la muerte celular. Fuente: Diep et al. (2007).
A B C MEDIO
EXTRACELULAR
CITOPLASMA
Introducción
43
Por otra parte, se ha descrito la existencia de varios genes de inmunidad, sin relación
aparente con la producción de una determinada bacteriocina, que podrían contribuir a reforzar
la autoprotección de las células productoras (Drider et al., 2006). Otros factores como, por
ejemplo, la presencia de proteasas con capacidad para degradar la bacteriocina también
podrían contribuir a la autoinmunidad de las células productoras.
II.2.7. Aplicación de la pediocina PA-1 en los alimentos
La aplicación de bacteriocinas en los alimentos debe considerarse en el contexto de las
características de la sociedad actual y de lo que ésta demanda a la industria alimentaria. El
consumidor exige disponer de alimentos seguros, nutritivos y de la mayor calidad
organoléptica posible, siendo eso uno de los objetivos prioritarios de la industria alimentaria.
Para ello, y entre otras disposiciones, pone en práctica numerosas medidas para prevenir o
reducir la presencia de microorganismos indeseables, como establecen los planes de APPCC.
Sin embargo, y a pesar de ello, en algunas ocasiones se producen brotes de toxiinfecciones de
origen alimentario. Por lo tanto, para la industria alimentaria sería deseable disponer de
mejores alternativas para controlar el desarrollo de microorganismos patógenos, sobre todo
teniendo en cuenta que progresivamente la distribución de los productos alimenticios se ha
ido prolongando en el espacio y en el tiempo. La industria alimentaria también ha de reducir
las elevadas pérdidas económicas que se producen como consecuencia de la alteración
indeseable de los productos elaborados y, en la medida de lo posible, los costes de procesado.
Todo ello implica, en cierta medida, no sólo extremar las precauciones siguiendo unas buenas
prácticas de fabricación, sino también emplear métodos de conservación eficaces que
aseguren la más alta calidad microbiológica de los alimentos.
Por otra parte, la industria alimentaria también debe atender otras demandas de los
consumidores, que quieren alimentos procesados que no requieran mucho tiempo para su
preparación, pero que sean seguros, tengan una buena calidad nutritiva y organoléptica, una
vida útil larga y, al mismo tiempo, aspecto de “frescos”. Dicho de otra forma, los
consumidores desean que sus productos hayan sufrido un procesado mínimo y no contengan
conservantes “artificiales”. Es decir, hay un claro contraste entre algunas demandas de los
consumidores y lo que ha de poner en práctica la industria alimentaria para asegurar la calidad
higiénico-sanitaria de los productos que elabora. La bioconservación, mediada por las
Introducción
44
bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas, puede ser una posible alternativa para
satisfacer a ambas partes. Y, de hecho, es una práctica que se lleva realizando intencionada o
inadvertidamente durante siglos (Stiles, 1996). Tampoco se debería olvidar que muchos de los
países en vías de desarrollo no tienen acceso generalizado o fácil a ciertos métodos clásicos de
conservación de los alimentos, como la aplicación de frío o los tratamientos térmicos. Sería de
gran interés para ellos disponer de otros métodos de conservación con menor requerimiento
energético. También en este caso la bioconservación, y en concreto las bacteriocinas
producidas por las bacterias lácticas, sería un método adecuado para mejorar la calidad de los
alimentos.
Las bacteriocinas de las bacterias lácticas tienen muchas propiedades que las hacen
interesantes para su empleo en la industria alimentaria. Por una parte, no tienen efectos
indeseables para nuestra salud, porque carecen de toxicidad, no son activas frente a células
eucariotas y son degradadas por las proteasas digestivas por lo que no tienen efecto frente a
las microbiota intestinal, como se ha comprobado recientemente con la nisina (Bernbom et al.,
2006). Por otra, tienen un espectro de inhibición relativamente amplio, que incluye no sólo a
bacterias patógenas sino también a otras alterantes, su modo de acción es bactericida
(actuando generalmente en la membrana plasmática) y, por ello, no tienen resistencia cruzada
con los antibióticos y, finalmente, son tolerantes a un amplio rango de condiciones de acidez y
calor (Gálvez et al., 2007).
El principal interés que tiene la aplicación de pediocina PA-1 en los alimentos deriva
de su intensa actividad frente a L. monocytogenes. Aunque este microorganismo no es la
primera causa de toxiinfección alimentaria (en Europa la incidencia anual oscila entre 2 y 10
casos por millón), hay que destacar que si lo es en cuanto a tasa de hospitalización (alrededor
del 90%) y de mortalidad (entre el 20 y el 30%) en sus brotes, especialmente entre ancianos,
niños, embarazadas y otros adultos inmunodeprimidos. La Comisión Científica sobre Riesgos
Biológicos (BIOHAZ) de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ha indicado
recientemente que el número de casos de listeriosis en Europa ha aumentado desde el año
2000 (con 1.583 casos y un 8% de mortalidad en 2006). El grupo más vulnerable es el de los
adultos de más de 60 años. La mayoría de los casos descritos están asociados al consumo de
platos preparados, especialmente con productos cárnicos, y queso en los que L.
monocytogenes se había multiplicado a lo largo de la vida útil del producto. Esta comisión
Introducción
45
advierte que la industria alimentaria no sólo debe observar el cumplimiento del criterio
microbiológico (ausencia en 25 g de producto o ≤100 ufc/g, dependiendo del alimento, en el
momento del consumo), sino que debe hacer énfasis en reducir al mínimo la contaminación
inicial de los productos y la multiplicación de L. monocytogenes durante la vida útil de los
mismos (EFSA, 2007b).
L. monocytogenes se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, incluyendo
las materias primas alimentarias, y destaca por su extraordinaria resistencia a condiciones
ambientales desfavorables. Puede crecer en un amplio rango de pH (entre 4,1 y 9,6) y de
temperatura (entre 1 y 45ºC), en aerobiosis y anaerobiosis, en presencia de alta concentración
de sal y a baja aw (hasta 0,9) y, además, tiene capacidad para formar biofilms (Gandhi y
Chikindas, 2007). Todas estas características hacen que L. monocytogenes sea un grave
problema en la seguridad alimentaria a nivel mundial. Tanto es así que la legislación
alimentaria en algunos países, como por ejemplo EE UU, ha establecido para los alimentos
más críticos (como los platos preparados) el nivel de tolerancia cero, aunque hay propuestas
para aumentarlo a 100 ufc/g en aquellos productos en los que no se pueda multiplicar (Gandhi
y Chikindas, 2007).
II.2.7.1 Adición de pediocina PA-1 o de un fermentado que la contenga
En general, las bacteriocinas en la industria alimentaria se pueden emplear
añadiéndolas en forma más o menos purificada, como un fermentado o mediante la inclusión
del cultivo productor de la bacteriocina (Stiles, 1996). En el caso de añadir la bacteriocina
purificada, a efectos legislativos, se necesita la correspondiente autorización para su uso como
conservante. Hasta el momento la única bacteriocina cuyo uso está autorizado en más de 50
países es la nisina producida por Lactococcus lactis. Su empleo en alimentos está aprobado
por la OMS desde 1969, en la Unión Europea se incluyó como conservante alimentario
(E234) en 1983 y la FDA de EE UU la aprobó en 1988 (EFSA, 2006). Un estudio reciente
realizado con ratas colonizadas con microflora intestinal humana ha demostrado que la
ingestión de nisina no altera de forma indeseable el perfil de la microbiota intestinal. Además,
la nisina administrada por vía oral se degradaba o inactivaba durante su tránsito por el
intestino (Bernbom et al., 2006).
Introducción
46
Los productos alimenticios en los que se puede utilizar nisina en la UE son postres a
base de semolina y tapioca (3 mg/kg), queso fundido y queso curado o madurado (12,5
mg/kg) y, por último, queso Mascarpone y clotted cream (10 mg/kg), según se recoge en el
RD 142/2002. En otros países, la nisina se emplea, sobre todo, para la conservación de quesos
procesados y conservas vegetales, aunque también se ha descrito su aplicación en productos
cárnicos, huevo líquido, hielo para la conservación del pescado fresco, alimentos infantiles,
productos de panadería, mayonesa, cerveza y vino (Delves-Broughton, 2005). Los preparados
que la contienen reciben distintas denominaciones comerciales como, por ejemplo, Nisaplin™
y Novasin® (Danisco), Crisin® (Chr. Hansen) o NisinPro (ChiHonBio).
El coste económico de la obtención de bacteriocina purificada y, sobre todo, la
dificultad de conseguir la autorización legal para su empleo en esa forma hace que esta opción
no sea muy atractiva para el resto de las bacteriocinas. La segunda opción consiste en añadir
un fermentado que contenga la bacteriocina. Así, por ejemplo, la empresa canadiense Quest
fue la primera en comercializar el ALTA 2341, un fermentado que contenía pediocina PA-1.
Actualmente los productos ALTA™ (ALTA 1701, 2351 y 2345), comercializados por Kerry
Bio-Sciences (Irlanda), consisten en fermentados de un cultivo iniciador de un P. acidilactici
productor de pediocina, y están recomendados especialmente para productos cárnicos y
lácteos. Estos preparados tienen como ventaja, desde el punto de vista legal, que se pueden
emplear como ingredientes, puesto que alguno de los componentes del fermentado puede
aportar alguna funcionalidad al alimento. Además, en estos fermentados la actividad de la
bacteriocina cuenta con la ayuda adicional de otros metabolitos, que también tienen actividad
antibacteriana y son producidos por las bacterias lácticas durante la fermentación como, por
ejemplo, los ácidos orgánicos (Gálvez et al., 2007). El fermentado ALTA 1701, por ejemplo,
contiene ácido propiónico procedente de una fermentación propiónica adicional.
El primer ensayo realizado para comprobar la utilidad de la pediocina PA-1 en un
sustrato alimenticio fue realizado por Pucci et al. (1988) en un producto lácteo. En ese
momento era una idea atractiva, teniendo en cuenta que poco tiempo antes se habían
desarrollado varios brotes de listeriosis asociados al consumo de distintos tipos de queso.
Estos investigadores comprobaron que la adición de un fermentado conteniendo pediocina
PA-1 permitía controlar de una manera eficaz el desarrollo de L. monocytogenes en alimentos
ácidos mantenidos en refrigeración. La pediocina PA-1 tenía un efecto bactericida rápido (<24
Introducción
47
h) y mantenía un bajo recuento de Listeria durante la primera semana de almacenamiento a
4ºC, aunque a partir del séptimo día la población de Listeria aumentaba (Pucci et al., 1988).
Esta rapidez de actuación de la pediocina PA-1 frente a Listeria fue corroborada por diversos
investigadores en varios sustratos lácteos y cárnicos (carne de ternera, salchichas, queso
“Cottage”, helado y leche en polvo reconstituida) (Degnan et al., 1993; Motlagh et al.,
1992b). En algunos casos, al minuto y medio de añadir la bacteriocina ya era evidente que la
población de L. monocytogenes se reducía en 2 ciclos logarítmicos (Degnan et al., 1993).
Además, se puso de manifiesto que la acción de la bacteriocina dependía de su concentración
y, sobre todo, de la cepa diana, ya que la misma cantidad de pediocina PA-1 (1350 unidades
arbitrarias/ml) reducía la población de L. monocytogenes ScottA, L. monocytogenes Ohio2 y
L. ivanovii ATCC 19119 en 1, 3 y 7 ciclos logarítmicos, respectivamente (Motlagh et al.,
1992b).
Poco tiempo después, se probó la eficacia de la pediocina PA-1 frente a
microorganismos alterantes (Clostridium laramiae, Lactobacillus spp. y Leuconostoc) en
sustratos cárnicos (Kalchayanand, 1990). En ese estudio, la combinación de pediocina PA-1
con el envasado al vacío y la refrigeración logró reducir durante 12 semanas el número de
bacterias alterantes en carne de ternera (Kalchayanand, 1990). Casi al mismo tiempo, se
evaluó la utilidad de la pediocina PA-1 frente a L. monocytogenes en una muestra de carne de
ternera irradiada y refrigerada (5ºC). La acción de la bacteriocina redujo la población de
Listeria entre 1 y 2 ciclos logarítmicos, manteniéndose en esos niveles durante 28 días
(Nielsen et al., 1990).
En los estudios realizados hasta el momento, la pediocina PA-1 es muy efectiva
inmediatamente después de su adición, como ya se ha mencionado, pero pierde su actividad
antimicrobiana con el tiempo. Esta pérdida se ha atribuido en los productos cárnicos, al menos
en parte, a su degradación por las proteasas de la carne o a la adsorción a las proteínas o a la
grasa (Murray y Richard, 1997). Para aumentar el potencial de su aplicación en este tipo de
productos, se ha propuesto su encapsulación en liposomas o su adición junto con un
emulgente como, por ejemplo, el Tween 80 como modo de protección de la bacteriocina
(Degnan et al., 1993). Por otra parte, en productos cárnicos que reciben algún tratamiento
térmico, la utilización de bacteriocina tiene la ventaja de que es resistente a la acción del calor
(Goff et al., 1996). Es decir, una buena parte de su actividad se retiene después de este
Introducción
48
tratamiento tecnológico y protegería al producto de una posible contaminación posterior o de
abusos en la temperatura de almacenamiento.
La efectividad de la pediocina PA-1 semipurificada o del fermentado ALTA 2341 se
ha probado en diversos sustratos alimenticios. La mayor parte de los estudios se han hecho en
productos cárnicos y el principal objetivo consistía en controlar el crecimiento de L.
monocytogenes (Tabla II.3). Las aplicaciones de pediocina PA-1 en otros productos (huevo,
productos lácteos y productos vegetales) son mucho más escasas (Gálvez et al., 2007;
Muriana, 1996). Por otra parte, la comparación en el mismo sustrato (carne de cerdo) de la
actividad antimicrobiana de varias bacteriocinas reveló que la pediocina PA-1 suele ser más
activa que la nisina A, pero menos que otras como, por ejemplo, la piscicolina (Jack et al.,
1996; Murray y Richard, 1997).
La pediocina PA-1 añadida al agua que se emplea para higienizar hortalizas crudas
cortadas (repollo, coliflor y brotes de judías mung) es una alternativa al tratamiento con
hipoclorito. El hipoclorito no inactiva completamente muchos patógenos y, además, sus restos
pueden ser origen de compuestos químicos clorados secundarios con actividad carcinogénica.
En este tipo de sustratos alimenticios, la pediocina fue más efectiva que la nisina,
consiguiendo reducciones de entre 2 y 4 ciclos logarítmicos, aunque no eliminó
completamente a L. monocytogenes (Bari et al., 2005). La incorporación de pediocina durante
la fermentación del kimchi, un producto coreano elaborado a base de col china, impide el
crecimiento de Listeria durante al menos 16 días (Choi y Beuchat, 1994).
La pediocina PA-1 también se ha utilizado unida a células muertas productoras de esta
bacteriocina (P. acidilactici H o Lactobacillus plantarum WHE92) en carne de pollo cruda
sometida a irradiación y en un embutido crudo loncheado, respectivamente. Esta es una forma
sencilla de concentrar y purificar parcialmente la bacteriocina, ya que con sólo ajustar la
acidez del medio de cultivo en el que se encuentra la bacteria productora a pH 6,0, la
bacteriocina libre del medio se adsorbe a la superficie de las células productoras. En ambos
casos, se comprobó que la pediocina así incorporada en la muestra era activa, manteniendo a
la población de L. monocytogenes en niveles muy bajos, pero sin llegar a su completa
destrucción (Goff et al., 1996).
Introducción
49
Tabla II.3. Aplicación de pediocina PA-1 en la conservación de diversos alimentos Sustrato Forma en la que se
añade Microorganismo diana
Efecto Referencia
Sustrato lácteo (queso cottage, nata y crema de queso)
Sobrenadante concentrado de P. acidilactici PAC 1.0 (10-100 UAa/g o ml)
L. monocytogenes (2-3 log ufc/ml)
<2 log ufc/ml, 7d, 4ºC Pucci y col. (1988)
Sustratos lácteos (a base de leche en polvo desnatada o mantequilla) y sustratos cárnicos (pastas elaborada con músculo de ternera o sebo de vacuno)
Pediocina AcH (30000 UA/ml)
L monocytogenes (dos cepas, 6,1 log ufc/ml)
Reducción de 2 log ufc/ml
Rapidez de la acción de la bacteriocina (1,5 min)
Degnan y col. (1993)
Queso blanco ALTA 2431 (0,6 – 2,5%)
L monocytogenes (6 log ufc/ml)
Reduce el crecimiento, pero no elimina completamente el patógeno; rapidez de la acción
Glass y col. (1995)
Huevo líquido Reducción de 1 log ufc/ml durante calentamiento a 65ºC
Muriana (1996)
Piezas cárnicas esterilizadas por irradiación
Sobrenadante de un cultivo de P. acidilactici (LACTACEL 110) (500-5000 UA /ml)
L. monocytogenes Scott A
Reducción de 1-2 log ufc/g, 21 d, 5ºC Nielssen y col. (1990)
Carne de pechuga de pavo (25% en agua) Pediocina (5000 AU/ml)
L. monocytogenes (4,5 log ufc/g)
Rápida reducción de 0,9 log ufc/g Schlyter y col. (1993)
Pechuga de pollo cocinada ALTA 2341 (0,25-1% w/w aplicado por inyección)
Bacterias aerobias totales
Reducción de 2-3 log ufc/g, 5 semanas, 2ºC Rozum y Maurer (1997)
Carne de cerdo Sobrenadante concentrado (× 10) de P. acidilactici (500-5000 UA/ml)
L monocytogenes y Clostridium perfirngens
Reducción de 1-3 log ufc/g, 3d a 15ºC ó 2,5-3,5 log ufc/g, 21 d, 4ºC (L monocytogenes). Escaso efecto sobre Cl. perfringens
Nieto-Lozano y col. (2006)
Introducción
50
Tabla II.3 (cont.). Aplicación de pediocina PA-1 en la conservación de diversos alimentos Sustrato Forma en la que se
añade Microorganismo diana
Efecto Referencia
Carne de cerdo L innocua Lin11 Reduce el recuento, 2d, 5ºC Murray y Richard (1997)
Salchichas tipo frankfurt
ALTA 2341 (3000-6000 UA/salchicha)
L. monocytogenes (mezcla de 5 cepas) (3 log ufc/g)
Reducción de 1,5-2 log ufc/g; se mantiene 14 d, 10ºC o 49 d, 4ºC
Chen y col. (2004b)
Pasta de jamón de york ALTA 2341 (2048 UA/g)
L. monocytogenes 4A (103 ufc/g)
Inhibición 7 d, 10ºC; a 14 d hay crecimiento limitado. Más efectivo que nisina, pero menos que piscicolina
Jack y col. (1996)
Carne L. monocytogenes y Listeria ivanovii
Reducción de 3 log ufc/g (L. monocytogenes) y 7 log ufc/g (L. ivanovii), 28 días, 4ºC; 1 log ufc/g, 28 d, 10ºC
Motlagh y col. (1992b)
Carne de cangrejo azul esterilizada ALTA 2341 (2000-20000 AU/ml)
L. monocytogenes (mezcla de tres cepas) (5,5 log ufc/g)
Reducción de 2-3 log ufc/ml, 6 h, 4ºC. Se mantiene inhibición 6 días, 4ºC
Degnan y col. (1994)
Hortalizas crudas cortadas Sobrenadante concentrado de cultivo (100 AU/ml)
L. monocytogenes (mezcla de cepas) (4-5 log ufc/g)
Reducción de 2-4 log ufc/g tras 1 min lavado por inmersión
Bari y col. (2005)
aUA: unidades arbitrarias
Introducción
51
Una propuesta muy atractiva para la aplicación de la pediocina PA-1 en la industria
alimentaria es a través de la tecnología del envasado bioactivo. En los últimos años se ha
desarrollado la idea de que la función del envase puede ir más allá de la de ser una mera
barrera inerte frente a las condiciones ambientales. El fundamento del envasado activo es la
inclusión en los envases de ciertos compuestos que contribuyan a alargar la vida útil, mejorar
la seguridad o las características organolépticas de los alimentos. Estas funciones de los
envases activos se consiguen gracias a su capacidad para secuestrar oxígeno, absorber
humedad, generar dióxido de carbono o etanol o por mostrar propiedades antimicrobianas. De
todas ellas, esta última es la que más interés ha despertado, sobre todo en la industria cárnica,
e incluye la posibilidad de utilizar como compuestos antimicrobianos a las bacteriocinas. Es
decir, en vez de añadir la bacteriocina directamente al alimento, ésta se incluye en el material
de envasado que va a estar en contacto directo con él. La bacteriocina difundiría gradualmente
desde el envase hacia el alimento. Una ventaja importante es que al encontrarse incluida en el
material del envase, estaría protegida de la acción de algunos constituyentes del alimento
(como, por ejemplo, las proteasas de la carne) o de la adsorción a la proteína o la grasa
(Gálvez et al., 2007).
Existen bastantes estudios sobre la incorporación en materiales de envasado de nisina,
directamente en la matriz del polímero o como una cubierta superficial. Sin embargo, la
información disponible sobre otras bacteriocinas es escasa, aunque igualmente prometedora
(Gálvez et al., 2007). El único trabajo realizado sobre el empleo pediocina PA-1 en tripas de
celulosa o bolsas de plástico recubiertas con la bacteriocina demostró una notable efectividad
para inhibir completamente el crecimiento superficial de L. monocytogenes en varios tipos de
productos cárnicos a lo largo de 12 semanas a 4’C (Ming et al., 1997). La utilidad, en este
caso, sería impedir la proliferación de la contaminación superficial que se produce como
consecuencia del contacto del producto ya tratado térmicamente con la superficie de los
equipos de procesado. Existe al menos una posible aplicación comercial de la inclusión de
pediocina en materiales para el envasado de alimentos, como se describe en la patente
americana 5573797 de Viskasa Co., una empresa dedicada a la comercialización de tripas
para productos cárnicos (Aymerich et al., 2008).
Por último, la pediocina PA-1 y otras bacteriocinas no sólo tienen interés para mejorar
la seguridad de los alimentos, sino que también pueden ser de gran ayuda para mejorar la
Introducción
52
calidad de los productos fermentados y/o acortar su tiempo de maduración. El objetivo
entonces, aunque depende de cada aplicación, puede ser controlar la flora secundaria, que en
ciertas ocasiones es responsable de alteraciones organolépticas en los productos, o promover
la lisis del cultivo iniciador para liberar sus enzimas intracelulares, implicadas en la formación
de compuestos aromáticos y sápidos (Ávila et al., 2005; Ávila et al., 2006; Martínez-Cuesta et
al., 2001; Peláez y Requena, 2005).
II.2.7.2. El empleo de pediocina PA-1 en sistemas de barreras
Debe destacarse que a pesar de que la casi totalidad de los estudios realizados in vitro
confirman que la pediocina PA-1 exhibe una potente actividad frente a bacterias sensibles, su
aplicación en diferentes tipos de alimentos sólo permite una modesta reducción de 1 a 3 ciclos
logarítmicos en las poblaciones de los microorganismos diana, tal y como se muestra en la
Tabla II.3 (Muriana, 1996; Schillinger et al., 1996; Szabo y Cahill, 1999). Esta limitada
actividad antimicrobiana de la pediocina PA-1 en los alimentos puede deberse a varios
factores, entre los que se encuentran aquellos que afectan a la cepa productora (como un
ambiente inadecuado para su adaptación, una pérdida espontánea de su habilidad para
producir la bacteriocina, la infección por fagos o el antagonismo con otros microorganismos)
y los que influyen en el mecanismo de acción de la bacteriocina (por ejemplo, la aparición de
resistencias en las bacterias sensibles, su unión a componentes o ingredientes del alimento, su
baja solubilidad o estabilidad en el sustrato alimentario y la presencia de la microbiota propia
del producto) (Muriana, 1996; Schillinger et al., 1996).
Un aspecto que se ha de vigilar especialmente es la aparición de bacterias resistentes,
un hecho bastante común cuando se emplean bacteriocinas de la clase IIa. En el caso de la
pediocina PA-1 se ha descrito que la frecuencia de aparación de bacterias resistentes llega ser
de 10-4 a 10-6 (Dykes y Hastings, 1998; Ennahar et al., 2000). Esto quiere decir que esta
bacteriocina, y se puede ampliar a todas las bacteriocinas en general, no se debería utilizar
como única medida frente el crecimiento de bacterias indeseables en los alimentos, ya que su
protección podría ser insuficiente. Tradicionalmente se ha indicado que una alternativa sería
utilizar dos bacteriocinas, pertenecientes a distintas clases, porque la probabilidad de
aparición de bacterias resistentes a ambas bacteriocinas es mucho menor. Sin embargo,
estudios recientes indican lo contrario, que el desarrollo de resistencia a una bacteriocina
Introducción
53
puede hacerse extensivo no sólo a otras de su misma clase, sino también a las de otras clases,
al menos in vitro (Gravesen et al., 2004; Naghmouchi et al., 2007). El empleo conjunto de dos
bacteriocinas de la clase IIa nunca se ha considerado de gran interés debido al desarrollo de
resistencias cruzadas, al tener las células sensibles la misma molécula receptora (Rasch y
Knøchel, 1998).
Combinar el empleo de bacteriocinas con otros métodos de conservación (control de
pH, temperatura, sal, altas presiones hidrostáticas, pulsos eléctricos o condiciones de
almacenamiento) si se considera como una opción muy prometedora (Deegan et al., 2006;
Muriana, 1996; Stiles, 1996). Esta estrategia, conocida como “sistema de barreras múltiples”
o “teoría de los obstáculos”, podría compatibilizar la obtención de alimentos más seguros con
una reducción considerable de las cantidades de aditivos químicos y/o de la intensidad de los
tratamientos tecnológicos (Leistner, 1992). De este modo, podríamos disponer de alimentos
que conservan mejor sus propiedades nutritivas y organolépticas, al tiempo que tienen una
excelente calidad higiénica que les permite tener una larga vida útil. Las diversas
combinaciones de tratamientos que se han ensayado a lo largo de los años han sido revisadas
por Gálvez et al. (2007). En la Tabla II.4 se han resumido aquellas en las que la pediocina PA-
1 se ha empleado como una barrera más en la estrategia de conservación de un producto.
Cabe destacar que se ha comprobado, mediante experimentos realizados in vitro, que
cuando L. monocytogenes se somete a estrés osmótico (6,5% NaCl, w/v) se hace insensible a
la acción de la pediocina PA-1. Igualmente la pediocina PA-1 era mucho menos activa sobre
bacterias sometidas previamente a estrés térmico con temperaturas de refrigeración (5ºC)
(Jydegaard et al., 2000). Se desconoce si estos efectos son debidos a cambios en la
conformación de la bacteriocina, a la dificultad de la interacción electrostática entre la
bacteriocina y la membrana bacteriana o a cambios en la cubierta celular de las bacterias.
Sería interesante comprobar si esos resultados son extrapolables en la práctica a los alimentos,
dado que es muy común en la industria alimentaria aplicar refrigeración y adicionar sal en
muchos productos. Es posible que la limitada acción antibacteriana que generalmente se
observa durante la aplicación de bacteriocina en productos alimenticios concretos se deba, al
menos en parte, a que casi siempre se hace en combinación con el empleo de refrigeración.
Introducción
54
Tabla 4. Aplicación de la pediocina PA-1 en sistemas de barreras o tratamientos combinados Método de conservación adicional
Origen de la pediocina Sustrato Referencia
Ácidos orgánicos: Diacetato sódico (3%, p/v) Lactato sódico (6%, p/v)
ALTA 2341 (3% p/p) Salchichas tipo frankfurt
Uhart et al. (2004)
Ácido cítrico (10 mM) Lactato sódico (2%) Sorbato potásico (0,02%) Ácido fítico (0,02%)
Pediocina purificada de P. acidilactici LET 01
Hortalizas cortadas frescas
Bari et al. (2005)
Lactato sódico + MAP ALTA 2341 (0,5-3% w/w)
Pollo cocinado Barakat y Harris (1999)
Diacetato sódico (0,3 - 0,5% p/p)
Pediocina (5000 UA/ml) Carne de pavo Schlyter et al. (1993)
Ácido acético ALTA 2341 (2,5%) Queso Glass et al. (1995) Otras bacteriocinas: nisina, lacticina 481, lacticina F
Sobrenadante de cultivo con pediocina PA-1
Medio de cultivo Mulet-Powell et al. (1998)
Envasado en atmósferas modificadas:
100 % CO2 y vacío ALTA 2341 (0,1 – 1% p/p)
Salmón ahumado Szabo y Cahill (1999)
Tratamientos térmicos:
Kalchayanand et al. (1992)
71, 81 ó 96ºC durante 30, 60 ó 120 segundos
ALTA 2341 (3000-6000 UA/salchicha)
Salchichas tipo frankfurt
Chen et al. (2004a)
Otros tratamientos: Irradiación (1-2 kGy) ALTA 2341
(3000-6000 UA/salchicha)
Salchichas tipo frankfurt
Chen et al. (2004b)
Pulsos eléctricos (12,5 kV/cm2, 25 µF, 4ºC)
Pediocina PA-1 (5000 UA/ml)
Peptona Kalchayanand et al. (1994)
Alta presión hidrostática (30000-50000 lb/in2, 1 min, 22ºC)
Pediocina PA-1 (5000 UA/ml)
Peptona Kalchayanand et al. (1994)
Alta presión hidrostática (138-345 MPa, 5-15 min, 25-50ºC)
Pediocin PA-1 (3000 UA/ml)
Peptona Kalchayanand et al. (1998)
Alta presión hidrostática (400 MPa, 10 min, 17ºC)
Pediocina concentrada de P. acidilactici
Modelo cárnico preparado con jamón cocido enlatado
Garriga et al. (2002)
UA: unidades arbitrarias
Introducción
55
Ya en la primera aplicación de la pediocina PA-1 a sustratos alimentarios se indicó
que el ácido láctico, que se encontraba de forma natural en los productos lácteos que se
estaban ensayando, tenía un efecto sinérgico con la bacteriocina (Pucci et al., 1988). Los
ácidos orgánicos y sus sales, sobre todo cuando el pH del alimento es ácido, son muy
efectivos potenciando la actividad de las bacteriocinas. En un medio ácido aumenta la
solubilidad de las bacteriocinas, y por tanto su capacidad para difundir, y se podría facilitar su
translocación a través de la pared celular al aumentar la carga neta de la molécula (Gálvez et
al., 2007). La acción sinérgica de la pediocina PA-1 y diversos ácidos orgánicos se ha puesto
de manifiesto en varios alimentos, como por ejemplo productos cárnicos, queso y hortalizas
(Tabla II.4) (Barakat y Harris 1999; Bari et al.2005; Glass et al.1995; Schlyter et al.1993;
Uhart et al.2004).
En este contexto de barreras múltiples, también se han empleado conjuntamente varias
bacteriocinas, con la idea de reducir la cantidad de cada una de las bacteriocinas y, al mismo
tiempo, impedir la aparición de bacterias resistentes (aunque esto último sea dudoso, como ya
se ha mencionado anteriormente). De las distintas combinaciones ensayadas cabe destacar que
la pediocina PA-1 suele tener un efecto sinérgico con bacteriocinas de otras clases (nisina,
lactacina 481, lactacina F y lactacina B), por lo que sería factible emplear como
bioconservante una mezcla de distintas bacteriocinas (Hanlin et al., 1993; Mulet-Powell et al.,
1998). El mismo efecto se ha comprobado no sólo in vitro, sino también en un sustrato
alimenticio, carne, con una mezcla de una bacteriocina de la clase IIa (enterocina CRL35) y
otras pertenecientes a otras clases: nisina y lactococina 707. El empleo conjunto de estas tres
bacteriocinas impidió la aparición de células resistentes en L. monocytogenes y L. innocua
(Vignolo et al., 2000).
Aunque sólo se han descrito las combinaciones recogidas en la literatura científica
para la pediocina PA-1 y algunos compuestos con actividad antibacteriana, existen otras
muchas posibilidades. Otros compuestos efectivos al ser empleados conjuntamente con varias
bacteriocinas en distintos sistemas son el nitrito (que permite reducir la cantidad necesaria
para impedir la producción de toxina botulínica en sistemas cárnicos), varios quelantes como
el citrato, fosfatos, el maltol o el etil maltol (que amplian la acción de las bacteriocinas a las
bacterias Gram-negativas), el etanol, la monolaurina, varios ésteres de ácidos grasos con
sacarosa, la reuterina, diversos aceites esenciales que contienen compuestos fenólicos
Introducción
56
(carvacol, eugenol, timol, ácido cinámico o geraniol, entre otros), la lisozima, el sistema
lactoperoxidasa o la lactoferrina (Gálvez et al., 2007).
Los alimentos conservados mediante la aplicación de tratamientos térmicos también se
podrían beneficiar de la actividad de las bacteriocinas desde el punto de vista de los sistemas
de barreras múltiples. Las bacterias que han sido sometidas a un tratamiento térmico son más
sensibles a la acción de las bacteriocinas, como se ha demostrado para la pediocina PA-1 y la
nisina (Kalchayanand et al., 1992). Y, al contrario, la acción de algunas bacteriocinas reduce
la resistencia térmica de las bacterias (Boziaris et al.1998). Es decir, el empleo conjunto de
bacteriocina y un tratamiento térmico permitiría reducir la intensidad de este último, lo que se
traduciría en una mínima modificación de las propiedades sensoriales del alimento al tiempo
que se logra una calidad microbiológica adecuada. Las bacteriocinas también podrían ofrecer
una protección adicional frente a la proliferación de las endosporas que sobreviven al
tratamiento térmico (Galvez et al., 2007). En el caso concreto de productos cárnicos cocidos,
como las salchichas de tipo frankfurt, la combinación de pediocina y una pasterización del
producto envasado es un tratamiento muy efectivo para controlar una posible contaminación
del producto terminado con L. monocytogenes, incluso durante un posible abuso de la
temperatura de almacenamiento (Chen et al., 2004a). Estos mismos autores comprobaron en
el mismo producto que también se producía un efecto sinérgico, e incluso más potente que el
recién descrito, entre la pediocina PA-1 y la irradiación (hasta 2,3 kGy) en relación con la
inhibición de L. monocytogenes (Chen et al., 2004b). En ambos casos se comprobó que los
tratamientos aplicados carecían de repercusiones negativas en las características
organolépticas de las salchichas.
El envasado en atmósferas modificadas es otra posible barrera a aplicar en
combinación con las bacteriocinas, por su alta complementaridad. El CO2 empleado en este
método de conservación es muy efectivo frente a las bacterias Gram-negativas, mohos y
levaduras, que son poco sensibles a la acción de las bacteriocinas. La acción conjunta de la
pediocina PA-1 contenida en el extracto ALTA 2341 y el envasado en una atmósfera de CO2
puro o al vacío permite controlar el crecimiento de L. monocytogenes en salmón ahumado
(Szabo y Cahill, 1999).
Introducción
57
Sin lugar a dudas, los métodos de conservación no térmicos tienen ahora un gran
interés para la industria alimentaria puesto que no dan lugar a los cambios indeseables en las
propiedades funcionales, nutritivas y organolépticas de las materias primas alimentarias que
suelen estar asociados con los tratamientos térmicos clásicos. De entre estos métodos
alternativos, la aplicación de altas presiones hidrostáticas y los pulsos eléctricos de alta
intensidad son los más estudiados y, de hecho, ya se aplican a nivel industrial para el
tratamiento de diversos alimentos. Entre otros efectos, ambos tratamientos desestabilizan la
membrana e interfieren con el metabolismo celular de las bacterias que se encuentran en los
alimentos a tratar. Sin embargo, para lograr en los alimentos una estabilidad microbiológica
que les permita tener una vida útil razonablemente prolongada suelen requerirse tratamientos
tan intensos que son económicamente inviables o provocan modificaciones indeseables, como
por ejemplo, en la textura.
El empleo de las bacteriocinas como una barrera adicional con este tipo de métodos de
conservación no térmicos puede ser muy interesante, puesto que permitiría disminuir la
intensidad de dichos tratamientos y/o contrarrestar el efecto protector del alimento. Además,
como uno de sus puntos clave de actuación es la membrana celular, cuya integridad dañan, se
potencia la eficacia bactericida de las bacteriocinas, que llegan a destruir incluso bacterias
Gram-negativas como, por ejemplo, E. coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella
typhymurium y Serratia liquefaciens (Kalchayanand et al., 1994). Por otra parte, estos
investigadores han comprobado que el efecto sinérgico de la combinación de pediocina PA-1
y nisina se potencia en gran medida cuando se emplean con altas presiones, siendo efectivo in
vitro incluso frente las esporas de Clostridium que han germinado por las altas presiones
(Kalchayanand et al., 1998; 2004). El análisis con microscopía de barrido electrónico de las
bacterias sometidas a la acción conjunta de una mezcla de pediocina PA-1 y nisina y/o a alta
presión (345 Mpa, 5 minutos, 25ºC) reveló que en L. monocytogenes se produce el colapso de
la pared celular y de la membrana que conduce, finalmente, a la lisis celular en cualquiera de
las distintas combinaciones de tratamiento. En cambio, en Salmonella typhimurium y en E.
coli O157:H7 sólo se producían graves alteraciones de la cubierta celular cuando las bacterias
eran sometidas a altas presiones, con o sin la presencia conjunta de nisina y pediocina PA-1
(Kalchayanand et al., 2004).
Introducción
58
II.2.7.3. Adición de un cultivo productor de pediocina PA-1
A pesar de los resultados satisfactorios que se obtienen al añadir la bacteriocina más o
menos purificada a los alimentos, tanto desde el punto de vista legal como desde el
económico, una opción más interesante es la adición de un cultivo productor de la
bacteriocina, bien como cultivo iniciador o como adyuvante. Así tendríamos un producto
dotado de su propio sistema de conservación, como si fuera una fábrica “viva”, y sin
necesidad de aprobación legal. De hecho, ésta es la aplicación que ha aglutinado una gran
parte de la investigación realizada en los últimos años (Drider et al., 2006). Por supuesto, se
ha de escoger el cultivo adecuado para cada aplicación, teniendo en cuenta las peculiaridades
de cada producto y, además, controlar que su metabolismo no modifique indeseablemente las
características del producto final. En la Tabla II.5 se enumeran algunas aplicaciones de los
cultivos productores de pediocina PA-1 en la industria alimentaria.
Entre los posibles problemas que puede plantear la aplicación de un cultivo
bacteriocinogénico se encuentran la pérdida espontánea de dicha capacidad o la baja
producción en el alimento, la susceptibilidad a la infección por fagos y el antagonismo con
otras bacterias presentes de forma natural en ese sustrato (Gálvez et al., 2006).
Dado que la mayor parte de las cepas productoras de pediocina PA-1 han sido aisladas
de carne o productos cárnicos, esta estrategia no debería entrañar grandes dificultades en esos
sustratos, ya que es de esperar que sea fácil disponer de cepas adaptadas a ese sustrato. Y,
como se ha comprobado en diversas ocasiones, la presencia de bacterias productoras de
bacteriocinas es algo bastante habitual en los productos cárnicos. Así lo han demostrado, por
ejemplo, Budde et al. (2003) en un estudio en el que aislaron bacterias productoras de
bacteriocinas de casi la mitad de unos 50 productos cárnicos envasados al vacío. No cabe
duda de que la capacidad de producir una bacteriocina puede ser de gran utilidad para lograr
la implantación en el producto de su bacteria productora.
En los productos cárnicos fermentados una opción relativamente sencilla sería emplear
un cultivo iniciador que posea la capacidad de producir bacteriocina. La fermentación y el
descenso del pH (pH < 4,9), y el secado en el caso de los productos curados, controla en cierta
forma el crecimiento de L. monocytogenes. La pediocina PA-1 producida in situ por el cultivo
Introducción
59
Tabla II.5. Utilización de cultivos productores de pediocina PA-1 en alimentos
iniciador a lo largo de la fermentación contribuiría adicionalmente a obtener un producto
seguro, especialmente en aquellos casos en los que no se llegasen a alcanzar esas condiciones
(Baccus-Taylor et al., 1993; Berry et al., 1990; Foegeding et al., 1992). Sin embargo, muchas
de las bacterias que producen bacteriocinas de la clase IIa no son adecuadas para llevar a cabo
las fermentaciones tradicionales porque no tienen la capacidad de producir ácido láctico con
rapidez (Drider et al., 2006).
Los cultivos productores de bacteriocina también se pueden emplear en productos
cárnicos no fermentados como cultivos adyuvantes, para inhibir el crecimiento de
microorganismos patógenos y alterantes a lo largo de su vida útil. Mientras que la adición de
bacteriocina tiene un efecto muy rápido, como hemos visto anteriormente, el empleo de un
cultivo productor de bacteriocina probablemente proporcione protección a largo plazo y,
además, en situaciones de mayor riesgo. En varios ensayos se ha comprobado que P.
acidilactici JBL1095, una cepa productora de pediocina PA-1, ni se multiplica ni produce
pediocina cuando se emplea como cultivo coadyuvante en productos cárnicos cocidos
Bacteria Alimento Referencia
Pediococcus acidilactici JD1-23 Embutido Berry et al. (1990)
Pediococcus acidilactici PAC1.0
(como cultivo iniciador)
Embutido curado Foegeding et al. (1992)
Pediococcus acidilactici
(como cultivo coadyuvante)
Salchichas Berry et al. (1991)
Pediococcus acidilactici JBL1095 Salchichas
(carne de ternera, exudado)
Yousef et al. (1991)
Pediococcus acidilactici JBL1095 Salchichas
(ternera, envasadas al vacío)
Degnan et al. (1992)
Pediococcus acidilactici JBL1095 Salchichas
(de carne de pavo)
Luchansky et al. (1992)
Pediococcus acidilactici Salchichas
(de carne de pollo)
Baccus-Taylor et al. (1993)
Pediococcus acidilactici Leche Raccach y Geshell (1993)
Lactobacillus plantarum WHE92
(cultivo adjunto)
Queso Munster Ennahar et al. (1998)
Introducción
60
envasados al vacío y almacenados a 4ºC. Sin embargo, a 25ºC, como ejemplo de un
almacenamiento incorrecto, esa bacteria se multiplica y proporciona una buena protección
frente a la contaminación con L. monocytogenes (Degnan et al., 1992; Luchansky et al., 1992;
Yousef et al., 1991). Otros investigadores, en cambio, mostraron que la inoculación
simultánea de P. acidilactici JD1-23, productor de pediocina PA-1, con Listeria en salchichas
tipo Frankfurt prevenía el crecimiento del patógeno durante al menos 60 días durante el
almacenamiento al vacío y a 4ºC (Berry et al., 1991).
Con respecto a las aplicaciones en la industria láctea, hay que tener en cuenta que los
pediococos no pueden fermentar la lactosa y tienen dificultad para adaptarse a productos
lácteos. A pesar de ello, si se emplea un inóculo elevado de de P. acidilactici (109 ufc/ml de
leche) se puede controlar el crecimiento de L. monocytogenes en ese tipo de sustratos
(Raccach y Geshell, 1993). La construcción de pediococos con capacidad de fermentar la
lactosa sería una posible solución y, de hecho aunque por otros motivos, ya se ha logrado
introduciendo por electroporación un plásmido procedente de un lactococo. Sin embargo,
existe otra opción que no requiere ningún tipo de manipulación y es emplear la cepa
Lactobacillus plantarum WHE92, aislada previamente de queso Munster y que produce de
forma natural pediocina PA-1 (Ennahar et al., 1996). Esta cepa de lactobacilo cuenta, además,
con la ventaja adicional de producir pediocina PA-1 incluso cuando el pH del medio es de 6,0,
un valor bastante frecuente en la industria láctea, cosa que no se observa con los pediococos
productores de esta bacteriocina. Su presencia desde el comienzo del periodo de maduración
en la superficie de un queso inoculado con L. monocytogenes impidió su crecimiento, sin
interferir en la maduración (Ennahar et al., 1996). Sin embargo, es necesario tener en cuenta
que cuando se emplea esta estrategia es muy frecuente el desarrollo de mutantes resistentes a
la pediocina que, al no tener bacterias competidoras, se pueden mantener en el producto
durante un tiempo muy prolongado. El empleo de cepas productoras de varias bacteriocinas,
de nuevo, puede ser muy ventajoso para limitar la posible aparición de bacterias resistentes a
las bacteriocinas, a pesar de que en principio no se considere un problema especialmente
preocupante para la industria alimentaria (Deegan et al., 2006).
Actualmente existen en el mercado varias bacterias que se comercializan precisamente
como cultivos bioprotectores y que persiguen mejorar la calidad microbiológica de diversos
alimentos, especialmente productos cárnicos. Entre ellos se pueden citar Bactoferm F-Lc de
Introducción
61
Christian Hansen (Dinamarca), que contiene P. acidilactici y Lactobacillus curvatus
productores de pediocina y sakacina A, respectivamente, o Fargo 25 de Kerry Biosciences
(EE UU), un cultivo liofilizado de P. acidilactici en medio lácteo.
Por último, hay que resaltar que, al igual que con las bacteriocinas, el empleo de los
cultivos de pediococos productores de pediocina PA-1 casi siempre se ha enfocado desde el
punto de vista de la seguridad microbiológica, pero no se debe olvidar el posible papel que
pueden jugar para controlar el crecimiento de bacterias alterantes o incluso mejorar sus
propiedades sensoriales. Como ejemplo de esto último, Danisco comercializa un cultivo
liofilizado de P. acidilactici (Choozit™ Lyo. Flav 43), recomendado como cultivo adjunto en
la elaboración de queso Cheddar y otros tipos semiduros, para acelerar y potenciar los rasgos
aromáticos gracias a la producción de bacteriocinas (Deegan y col, 2006).
II.2.8. Expresión heteróloga de la pediocina PA-1
El empleo de sistemas de expresión heteróloga obedecer a diversos objetivos. Desde el
punto de vista de la investigación básica, permite estudiar más fácilmente la función y/o el
modo de acción de ciertas proteínas y péptidos. Por otro, desde el industrial, facilita el control
transcripcional y/o traduccional sobre la expresión del gen recombinante o hace posible
conseguir un nivel de producción mayor que el obtenido a partir de las fuentes nativas
(Makrides, 1996).
Aunque las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas son muy interesantes
para la bioconservación de los alimentos, su eficacia y/o la de las cepas productoras puede
verse seriamente comprometida por diversos factores. Entre ellos se incluye el que su espectro
de acción en algunas ocasiones puede ser bastante reducido, la incapacidad de obtener buenos
protocolos de purificación que permitan unos rendimientos aceptables, la aceptabilidad de la
cepa productora como microorganismo QPS, la adaptabilidad de la cepa bacteriocinogénica a
diferentes sustratos alimentarios o la posibilidad de aparición de bacterias resistentes
(Rodríguez et al., 2002b). En este contexto, la producción heteróloga de bacteriocinas puede
ser una alternativa atractiva para evitar algunas de las situaciones adversas anteriormente
citadas. Además, esta estrategia también se puede utilizar para construir cepas
Introducción
62
multibacteriocinogénicas o conferir propiedades antimicrobianas a cepas de interés
tecnológico, como las que forman parte de cultivos iniciadores.
II.2.8.1. Hospedadores heterólogos
El diseño de un sistema de expresión eficiente para producir proteínas o péptidos
recombinantes depende de muchos factores, entre los cuales se pueden citar: las
características del hospedador heterólogo, los elementos genéticos utilizados (como por
ejemplo, las señales de transcripción y de traducción, los genes o los vectores), la localización
y el nivel de expresión del producto final, la existencia de modificaciones postraduccionales
y/o la legislación vigente, en el caso de proteínas comerciales (Makrides, 1996). De todos
estos factores, la elección de un hospedador heterólogo apropiado puede resultar crítico para
la expresión del gen de interés.
Desde los inicios de la microbiología molecular, E. coli ha sido el huésped procariota
más empleado para la clonación y expresión de genes heterólogos, lo cual es completamente
lógico si se tiene en cuenta que se trata del microorganismo mejor caracterizado
genéticamente. Se conocen bien muchos de sus procesos biológicos, existe un número casi
ilimitado de herramientas genéticas disponibles para su manipulación y la expresión es rápida.
Sin embargo, resulta utópico pensar que una única especie sea adecuada para cualquier
aplicación y, de hecho, no todos los genes se pueden expresar correctamente en E. coli.
Existen varias razones que explican esta falta de universalidad de E. coli como
productor heterólogo. En primer lugar, el empleo de codones de E. coli difiere del de las
bacterias lácticas. Baste recordar que el contenido de G+C en los genes de E. coli es de
aproximadamente un 50%, mientras que en los de las bacterias lácticas es el 35%. Y,
precisamente, el empleo de codones se ha identificado como el factor más importante, aunque
no el único, a la hora de obtener una expresión génica satisfactoria en procariotas (Gustafsson
et al., 2004). En segundo lugar, la proteína recombinante puede ser tóxica para E. coli. Por
otra parte, pueden existir problemas con la estructura del gen recombinante y/o con la
estabilidad o la eficiencia en la traducción del mRNA correspondiente. Tampoco conviene
olvidar que E. coli es una bacteria Gram-negativa y, como tal, la organización de su
membrana celular y anexos difiere significativamente de la que podemos encontrar en
Introducción
63
microorganismos Gram-positivos como las bacterias lácticas. Por lo tanto, la producción de
una proteína heteróloga en E. coli puede enfrentarse a la falta de mecanismos de secreción
que permitan el transporte del producto al medio de cultivo. Algunas proteínas de gran
tamaño y las de membrana no se expresan o lo hacen en forma insoluble, como cuerpos de
inclusión. Estos cuerpos de inclusión también se forman cuando la expresión de la proteína
recombinante supera la capacidad de transporte de la célula y tienen el inconveniente de que
es necesario incluir etapas adicionales para recuperar su actividad biológica. Además, los
péptidos o proteínas heterólogas pueden degradarse por la acción de las enzimas proteolíticas
de E. coli. Otra desventaja de la producción de proteínas recombinantes en E. coli es la
acumulación de lipopolisacárido, que se debe eliminar antes de su empleo (Makrides, 1996).
Finalmente, es importante considerar que E. coli no sólo no está considerado como
microorganismo GRAS/QPS sino que, por el contrario, se debe considerar como patógeno o
potencialmente patógeno. En consecuencia, cuando se desean producir proteínas heterólogas
con fines alimentarios deben emplearse hospedadores alternativos.
Los inconvenientes citados anteriormente se pueden superar eligiendo otras bacterias
alternativas aunque, en última instancia, la utilidad de unas y otras depende de la
disponibilidad de herramientas para su manipulación genética. Actualmente las bacterias
lácticas ya constituyen, en muchos casos, la primera elección para la expresión de genes
heterólogos y, dada la gran cantidad de investigadores que han trabajado y están trabajando en
la expresión génica en este tipo de organismos, esta situación ha mejorado sustancialmente.
Muchas bacterias lácticas se consideran seguras o “de grado alimentario” y éste es uno los
principales motivos, junto con su importancia industrial, por el que resultan tan atractivas
como biorreactores para la producción heteróloga de proteínas o péptidos de interés para el
sector alimentario (Billman-Jacobe, 1996). El carácter de grado alimentario incluye incluso a
algunos de los sistemas de selección disponibles. Esto quiere decir que las bacteriocinas, u
otras proteínas, expresadas heterólogamente en las bacterias lácticas se pueden emplear
directamente en forma de extractos celulares crudos o con tan sólo una sencilla purificación.
Por otra parte, la manipulación genética de las bacterias lácticas que se utilizan en la
mayoría de los laboratorios, y en especial de L. lactis, es relativamente sencilla. Además,
poseen otras características adecuadas para la expresión y secreción de proteínas
recombinantes, como son una limitada actividad proteolítica, el reducido número de proteínas
Introducción
64
que secretan y la secuenciación completa del genoma de varias especies. Tampoco producen
cuerpos de inclusión ni esporas. Además, se multiplican fácilmente llegando a alcanzar
densidades celulares elevadas (aproximadamente tienen un tiempo de duplicación de 1 hora
en las fermentaciones) sin necesidad de aireación, utilizando simplemente agitación (Kunji et
al., 2005).
Algunas bacterias lácticas, como L. lactis, son muy versátiles y su potencial ha
aumentado notablemente en los últimos años como resultado de los recientes avances en la
estabilización de genes heterólogos y en el control de su expresión, así como con la
secuenciación completa de su genoma (Le Loir et al., 2005). De hecho, ya se ha descrito la
producción heteróloga a escala industrial de una proteína (la lisostafina, con actividad
antibacteriana) en L. lactis, comprobándose que el escalado, la producción y el posterior
procesado del producto eran simples y permitían obtener una proteína muy purificada y con
actividad biológica (Mierau et al., 2005).
Las levaduras, como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, también se han
empleado desde 1980 en numerosas ocasiones para la producción heteróloga de proteínas,
tanto en el ámbito académico como en el biofarmaceútico o industrial. Al igual que las
bacterias, se multiplican con mucha facilidad y las técnicas necesarias para su manipulación
genética no son mucho más complejas que las empleadas en procariotas. Pero, a diferencia de
las bacterias, tienen la ventaja de que en caso necesario pueden llevar a cabo algunas
modificaciones postraduccionales como glicosilaciones, formación de puentes disulfuro o
procesado proteolítico, propias de los sistemas eucariotas. La primera levadura seleccionada
para desarrollar sistemas de producción heteróloga fue S. cerevisiae que, junto con E. coli, es
uno de los microorganismos mejor caracterizado, tanto genética como fisiológicamente.
Además, el hecho de que sea considerado como un microorganismo seguro para su uso en
humanos favoreció la elección de este hospedador para la producción heteróloga de proteínas
de interés. Sin embargo, el bajo rendimiento de producto, la escasa estabilidad de los
plásmidos, la dificultad del escalado industrial, la excesiva glicosilación de los productos y su
escasa capacidad secretora han fomentado la búsqueda de otras alternativas.
Entre las levaduras “no convencionales” empleadas para la producción heteróloga de
proteínas puede citarse a Pichia pastoris, Hansenula polymorfa, Kluyveromyces lactis,
Introducción
65
Schwanniomyces occidentalis y Yarrowia lipolytica. De entre ellas cabe a destacar a P.
pastoris porque une a los rasgos antes mencionados para S. cerevisiae su escasa capacidad
fermentativa, haciendo posible su multiplicación hasta alcanzar densidades de cultivo
extraordinariamente elevadas. Por ello es más apreciada que S. cerevisiae como huésped,
habiéndose empleado desde 1984 para la producción heteróloga de más de 300 proteínas.
II.2.8.2. Expresión heteróloga de bacteriocinas en Escherichia coli
El primer hospedador utilizado para la producción heteróloga de varias bacteriocinas,
incluyendo la pediocina PA-1, fue E. coli (Marugg et al., 1992; Bukhtiyarova et al., 1994). En
estos primeros trabajos, el operón de la pediocina PA-1 se subclonó y expresó con éxito en E.
coli, permitiendo su análisis funcional. En ambos casos, la expresión heteróloga se basó en el
empleo de los sistemas de transporte y secreción de las propias bacteriocinas. En otras
ocasiones se han empleado los sistemas de transporte y secreción de proteínas propios de E.
coli, por ejemplo el sistema dedicado ABC de la colicina V para la producción heteróloga de
la divergicina A (van Belkum et al., 1997). Posteriormente, Coderre y Somkuti (1999)
consiguieron expresar la pediocina PA-1 en E. coli utilizando el operón completo de la
bacteriocina pero, en este caso, bajo el control del promotor STP2201, un promotor de
Streptococcus thermophilus.
Dependiendo del tipo de bacteriocina y/o el sistema de expresión utilizado en E. coli
se han observado algunas de las limitaciones señaladas en el apartado anterior. Por ejemplo,
es habitual que el nivel de producción sea bajo, como se ha descrito para la mesentericina
Y105 (Biet et al., 1998) o la pediocina PA-1 (Miller et al., 1998; Venema et al., 1995). Otro
de los problemas descritos es la toxicidad de la bacteriocina recombinante por acumulación
del péptido activo en el espacio periplásmico del hospedador (Biet et al., 1998). Además,
cuando se trata de péptidos relativamente grandes, la actividad proteolítica del hospedador
puede dar lugar a pequeños péptidos no activos o de muy baja actividad, como se ha
observado con la brococina C, una bacteriocina de la clase IIb formada por dos péptidos de 59
y 43 residuos de aminoácidos (Garneau et al., 2003). Una posible solución es la formación de
quimeras con proteínas de secreción de E. coli, que contengan un péptido señal que sea
reconocido por el sistema sec de esta bacteria. Esta estrategia se ha utilizado para la expresión
heteróloga de carnobacteriocina B2 y pediocina PA-1, mediante la fusión con la proteína de
Introducción
66
unión a maltosa (MBP, del inglés Maltose Binding Protein), cuyo péptido señal es reconocido
por el sistema sec de E. coli (Quadri et al., 1997; Miller et al., 1998). En este último estudio,
por ejemplo, la secreción de la pediocina PA-1 empleando la secuencia señal de la MBP
permitió obtener una cantidad adecuada de diversas bacteriocinas mutantes en E. coli, muy
útiles para estudiar la relación entre estructura y función de esta bacteriocina (Miller et al.,
1998).
Recientemente se han ensayado nuevas estrategias para mejorar la expresión
heteróloga de bacteriocinas en E. coli. Por una parte, y para superar el principal obstáculo que
suele presentarse cuando las proteínas proceden de bacterias poco relacionadas, Richard et al.
(2004) construyeron un gen sintético que codificaba la divercina V41 recombinante teniendo
en cuenta los codones que empleaba preferentemente la cepa de E. coli utilizada como
hospedador. Además, el sistema de expresión empleado permitía obtener la bacteriocina
fusionada a la tiorredoxina en el citoplasma, de tal forma que no sólo era más soluble, sino
también menos susceptible a la degradación proteolítica. La tiorredoxina contribuye, al mismo
tiempo, a mantener un bajo potencial redox intracelular en el hospedador, permitiendo así la
formación del puente disulfuro necesario para la actividad de la bacteriocina. Además, este
sistema de expresión permite también una fácil purificación, recuperándose la bacteriocina
madura con un simple paso de hidrólisis química Este mismo sistema mediante el cual la
bacteriocina se expresa como una proteína de fusión junto a la tiorredoxina se ha empleado
para la piscicolina 126 y la pediocina PA-1, también con muy buen rendimiento en E. coli
(Gibbs et al., 2004).
Una opción aún más avanzada es la propuesta por Ingham et al. (2005) para
bacteriocinas cuya secuencia sea conocida y que no requieran modificaciones
postraducionales, como las pertenecientes a la clase II. Este sistema de expresión desarrollado
para E. coli está basado en la clonación del gen sintético para la bacteriocina de interés en el
mismo marco de lectura que el péptido señal de una pectato liasa (PelB) y junto a un gen
híbrido compuesto de una inteína y un dominio de unión a quitina. Al tratarse de un gen
sintético, se pueden emplear los codones optimizados para E. coli. El péptido señal de PelB
facilita la secreción, el dominio de unión a la quitina simplifica la purificación de la
bacteriocina, empleando una resina de quitina, y la inteína lleva a cabo la autohidrólisis para
obtener la bacteriocina nativa, sin necesidad de realizar una hidrólisis enzimática o química
Introducción
67
(con bromuro de cianógeno). Este sistema de expresión ha sido utilizado para la producción
heteróloga en E. coli de piscicolina 126, divercina V41, enterocina P y pediocina PA-1
(Ingham et al., 2005). Otra alternativa similar, ensayada para la pediocina PA-1 pero que se
podría hacer extensiva a otras bacteriocinas de la clase IIa, es la expresión de la bacteriocina
con la dihidrofolato reductasa de ratón y una cola de histidina para facilitar su posterior
purificación (Moon et al., 2005).
II.2.8.3. Expresión heteróloga de bacteriocinas en bacterias lácticas
El empleo de bacterias relacionadas filogenéticamente como hospedadores para la
producción heteróloga de bacteriocinas puede aminorar algunos problemas frecuentes que
surgen cuando el hospedador es un microorganismo poco relacionado, como ya se ha
mencionado. Entre estos problemas cabe citar el que el hospedador no reconozca los
promotores, un distinto alfabeto de codones o la necesidad de factores adicionales como las
proteínas de inmunidad y el sistema de secreción (Ingham et al., 2005). Actualmente, las
bacterias lácticas, y especialmente L. lactis, constituyen la primera elección para la expresión
heteróloga de bacteriocinas, incluso a escala industrial. Hasta la fecha, los trabajos que han
utilizado diferentes especies de bacterias lácticas como hospedadores para la producción
heteróloga de bacteriocinas se basan en la expresión de sus genes nativos o en el intercambio
de líderes y/o sistemas de secreción de otras bacteriocinas (Rodríguez et al., 2002b). Sin duda
alguna, y por su interesante actividad antimicrobiana, la producción heteróloga de pediocina
PA-1 fue uno de los principales objetivos que se plantearon varios investigadores que
trabajaban en el campo de las bacteriocinas.
II.2.8.3.1. Expresión de genes nativos
Teóricamente, el procedimiento más sencillo para la expresión y la secreción de una
bacteriocina en un hospedador heterólogo es utilizar todos los genes necesarios para su
biosíntesis. De hecho, ésta fue la estrategia seguida en los primeros trabajos relacionados con
la expresión heteróloga de bacteriocinas en bacterias lácticas. Venema et al. (1995) clonaron
el operón completo de la pediocina PA-1 (operón ped), incluyendo su propio promotor, en
Pediocococcus pentosaceus PPE1.2. La expresión heteróloga de la pediocina en este
hospedador, una cepa sensible a la pediocina de forma natural, hizo posible el análisis
Introducción
68
funcional del operón ped. La sustitución del promotor de la pediocina por el promotor
lactocócico P32 permitió aumentar la producción de pediocina PA-1, que fue hasta cuatro
veces superior a la obtenida en el productor natural (P. acidilactici PAC1.0) (Chikindas et al.,
1995). En este mismo trabajo, además, se logró expresar pediocina PA-1 en L. lactis, aunque
con niveles más bajos (no llegaba ni al 1% del observado en el productor natural). No
obstante, el nivel de producción dependía del número de copias del plásmido. Cabe destacar
que cuando se sustituyó el promotor P32 por el promotor original del operón ped, no se
detectó pediocina en los sobrenadantes de las cepas recombinantes de L. lactis. Estos mismos
autores construyeron otro plásmido que contenía los cuatro genes necesarios para la
biosíntesis de la lactococina A. La transformación de P. acidilactici PAC1.0 con este último
plásmido resultó en la coproducción de pediocina PA-1 y lactococina A.
Aunque el trabajo de Chikindas et al. (1995) demostró que se puede producir pediocina
PA-1 en L. lactis, las cepas empleadas como hospedadoras carecían de algunas propiedades
necesarias para su aplicación en la industria láctea. Para explorar el potencial de un cultivo
comercial productor de pediocina PA-1, Buyong et al. (1998) seleccionaron como hospedador
heterólogo a L. lactis MM210, una cepa empleada industrialmente en la elaboración de queso
Cheddar. La actividad anti-Listeria del lactococo recombinante se comprobó durante la
elaboración de quesos Cheddar coinoculados con el lactococo y con una mezcla de tres cepas
de L. monocytogenes. En los quesos experimentales, los recuentos del patógeno disminuyeron
en un ciclo logarítmico tras la primera semana de maduración y, posteriormente, se redujeron
en un ciclo adicional a los tres meses, siendo los recuentos finales de 10 ufc g-1. La presencia
del plásmido con el operón ped no afectó al crecimiento ni a las propiedades tecnológicas del
lactococo. En los quesos control, inoculados con la misma concentración de un lactococo
isogénico no productor de pediocina, los recuentos de L. monocytogenes aumentaron en 4
ciclos logarítmicos tras las dos primeras semanas de maduración y, seguidamente,
disminuyeron gradualmente hasta aproximadamente 103 ufc g-1 a los 6 meses.
Otras bacterias lácticas de interés industrial, por su capacidad para fermentar la lactosa,
en las que se ha conseguido la expresión heteróloga de la pediocina PA-1 son Enterococcus
faecalis y Streptococcus thermophillus (Coderre y Somkuti, 1999). En este caso el operón ped
estaba bajo el control del promotor STP2201, de S. thermophilus. El nivel de producción de
pediocina PA-1 era variable y dependía del hospedador, perdiéndose gradualmente en algunos
Introducción
69
casos con los subcultivos seriados de las cepas transformadas. Esta estabilidad dependiente de
cepa había sido observada en otros plásmidos de la misma familia (Soleiman y Somkuti,
1993).
II.2.8.3.2. Intercambio de líderes y/o sistemas de secreción
La secreción y el procesado de la mayoría de las bacteriocinas producidas por bacterias
lácticas requieren un sistema dedicado integrado por un transportador de tipo ABC y una
proteína accesoria. La explotación de las grandes homologías en la secuencia aminoacídica
existentes tanto entre los líderes como entre los transportadores de la mayor parte de las
bacteriocinas de la clase II, e incluso con algunos lantibióticos, constituye una estrategia
atractiva para la producción heteróloga de bacteriocinas (Rodríguez et al., 2002b).
Uno de los primeros trabajos que emplearon esta estrategia para desarrollar un sistema
de expresión capaz de producir pediocina PA-1 en L. lactis fue el de Horn et al. (1998). Este
sistema estaba constituido por un vector de expresión, que portaba el promotor de la
lactococina A y un gen híbrido en el que la secuencia que codifica el líder la lactococina A
estaba fusionada a la secuencia que codifica la pediocina PA-1 madura, y por el hospedador
heterólogo L. lactis IL1403, que posee en su cromosoma dos genes (lcnC´ y lcnD´) análogos a
los que codifican las proteínas del sistema de transporte dedicado de la lactococina A. La
transformación de L. lactis IL1403 con pFI2126 dio lugar a una cepa recombinante (L. lactis
FI9043) que secretó pediocina PA-1 activa, aunque en una cantidad muy inferior a la del
productor natural P. acidilactici 347. No obstante, los niveles de producción de pediocina
fueron superiores a los observados en la misma cepa de L. lactis con el promotor y el sistema
de transporte dedicado de la pediocina PA-1 (Chikindas et al., 1995), como se describió
anteriormente.
Estos mismos investigadores intentaron aumentar la producción de pediocina PA-1 en
L. lactis IL1403 situando los genes encargados del transporte de la lactococina A (genes
lcnCD) junto al gen híbrido “líder de la lactococina A/pediocina PA-1 madura”. Esta
disposición de los genes necesarios para la biosíntesis de la bacteriocina mejoró los niveles de
producción hasta unos valores muy próximos a los observados en el pediococo original. En
este mismo trabajo, y empleando una cepa de L. lactis productora de nisina A, se consiguió la
Introducción
70
coproducción de nisina y pediocina; aunque se mantuvo la misma producción de nisina que en
la cepa original, la cantidad de pediocina PA-1 fue inferior a la detectada en la cepa
recombinante que únicamente producía pediocina. Es de destacar que éste fue el primer
trabajo en el que se planteó la posibilidad de coproducir las dos únicas bacteriocinas
aceptadas como bioconservantes de los alimentos (Horn et al., 1999).
La enterocina A también se puede producir, e incluso coproducir con la pediocina PA-
1, utilizando el sistema de transporte de la lactococina A codificado en el cromosoma de L.
lactis. El nivel de producción de ambas bacteriocinas representó tan sólo un 4-8% de la
producida por las cepas naturales, E. faecium T136 y P. acidilactici 347, a pesar de que la
expresión de sus genes estaba bajo el control de un promotor fuerte. Este bajo rendimiento
puede deberse al bajo número de copias de los genes cromosómicos lcnC´D´ y/o a que el
producto de estos genes no sea completamente idéntico a las proteínas de transporte de la
lactococina A. En cualquier caso, como ambas bacteriocinas pertenecen a la clase IIa y su
estructura, modo de acción y espectro antimicrobiano son muy similares, carecen de acción
sinérgica y su coproducción no es un objetivo relevante a nivel práctico (Martínez et al.,
2000).
Basándose en los resultados obtenidos en trabajos anteriores, Horn et al. (2004) han
desarrollado un sistema de expresión que permite la producción de pediocina PA-1 y colicina
V en cepas de L. lactis bajo el control del promotor inducible de la nisina (PnisA). En este
sistema, el gen híbrido “líder de la lactococina/pediocina PA-1 madura” se encuentra en un
plásmido, mientras los genes lcnCD necesarios para el transporte y la secreción están en un
plásmido distinto. La cepa de L. lactis utilizada como hospedador heterólogo lleva en su
cromosoma dos genes (nisKR) cuya expresión es necesaria para que se inicie la transcripción
de los genes regulados por PnisA. Este sistema permite la expresión heteróloga en L. lactis de
pediocina PA-1. Pero, además, si el hospedador heterólogo es una cepa de L. lactis productora
de nisina, se coproducen ambas bacteriocinas, pediocina PA-1 y nisina. En ningún caso la
cantidad de pediocina producida superaba el 20-30% de lo observado en P. acidilactici 347,
aunque la cantidad de nisina si era igual que en la cepa original. Este mismo sistema se
empleó para la colicina V, alcanzándose unos niveles de producción del 25-35% con respecto
a los observados en la cepa de E. coli ATCC 14763. De todos estos resultados, cabe destacar
que, por primera vez, se ha obtenido una bacteria láctica que produce una bacteriocina de un
Introducción
71
microorganismo Gram-negativo (colicina V) simultáneamente con otra de bacterias Gram-
positivas (nisina).
Una estrategia similar a la descrita por Horn et al. (1999) se ha aplicado recientemente
para producir pediocina PA-1 en Lc. mesenteroides (Morriset y Frére, 2002), empleando el
líder y los genes encargados del transporte de la mesentericina Y105 (mesCDE). Nuevamente,
los niveles de producción de la pediocina fueron muy similares a los del pediococo parental.
Otro hospedador en el que se ha ensayado la producción heteróloga de bacteriocinas es
Lactobacillus sakei Lb790 (Axelsson et al., 1998). En este caso se utilizaban los genes
involucrados en la activación transcripcional del promotor así como los necesarios para la
secreción y el procesado de la sakacina A (genes orf4sapKRTE) en un plásmido. Un segundo
plásmido portaba el gen estructural y el de inmunidad de la sakacina P, la pediocina PA-1 o la
piscicolina 61, bajo el control de sus propios promotores o del promotor de la sakacina A. La
producción de sakacina, pediocina o piscicolina fue muy similar o, incluso, superior a la
obtenida en las respectivas cepas parentales sobre todo cuando se empleaba el promotor de la
sakacina A.
II.2.8.3.3. Aplicaciones y perspectivas futuras de la producción heteróloga de bacteriocinas
en bacterias lácticas
Hasta el momento, la utilización de bacterias lácticas es una de las pocas alternativas
válidas para la que aplicación de estas bacteriocinas recombinantes sea aceptada por la
industria alimentaria. Sin embargo, no hay que descartar el empleo de otros hospedadores
heterólogos en un futuro próximo, siempre y cuando se demuestre que no poseen
determinantes genéticos que puedan ser perjudiciales para la salud del consumidor.
En estos últimos años se han desarrollado algunos vectores de expresión para la
producción de proteínas recombinantes en bacterias lácticas. Sin embargo, un aspecto muy
importante relación a la aplicación en la industria alimentaria es que los sistemas de expresión
heteróloga puedan recurrir a vectores de “grado alimentario”, es decir, vectores que no
requieran compuestos dañinos y carezcan de antibióticos como marcadores de selección. En
caso contrario, existiría la posibilidad de transferencia a la microbiota intestinal, poniendo en
Introducción
72
peligro la terapia antibiótica en humanos. Se ha propuesto que los sistemas de grado
alimentario deberían estar constituidos por vectores de expresión que contengan únicamente
DNA procedente del hospedador heterólogo GRAS, o al menos, de otro hospedador que
también sea considerado como seguro. Con ello se conseguiría algo similar a un sistema de
“autoclonación” lo cual facilitaría la autorización para su uso (de Vos, 1999).
Entre los posibles marcadores de selección para sistemas de grado alimentario se
encuentran los que confieren un nuevo fenotipo y los que complementan una función dañada.
En la primera clase están aquellos basados en la utilización de azúcares poco habituales, como
por ejemplo la melibiosa o la rafinosa, y los marcadores que confieren resistencia o
inmunidad a determinadas sustancias consideradas seguras, como la nisina o la lactacina F. En
cuanto al segundo tipo, se puede emplear cualquier función vital que se pueda inactivar para
obtener un mutante auxotrófico y complementar posteriormente con genes codificados en un
plásmido (ejemplo, auxotrofías para lactosa, timidina o pirimidina) (de Vos, 1999). Existe una
tercera opción que consiste en emplear dos plásmidos, codificando uno de ellos la resistencia
a un antibiótico. Inicialmente se necesitan los dos plásmidos, pero en las células
transformadas al eliminar la presión selectiva desaparece el vector que no lleva la resistencia a
antibiótico. Es decir, el microorganismo final obtenido es de grado alimentario (Cotter et al.,
2003).
Otro aspecto de gran interés es el desarrollo de sistemas de expresión controlada que
permiten la expresión del gen independientemente del crecimiento del hospedador (Kuipers et
al., 1997). De todos los sistemas de expresión controlados descritos hasta la fecha, el más
fiable y utilizado es el que responde a mínimas dosis de nisina, conocido como sistema NICE
(del inglés, NIsin-Controlled-Expression) (Kuipers et al., 1998). Los elementos
imprescindibles en cualquier sistema NICE son una cepa que contenga los genes nisRK
encargados de la regulación del operón de la nisina, la nisina que actúa como molécula
inductora y el gen de interés que debe estar controlado por el promotor de la nisina. Una vez
que se poseen todos estos elementos, la inducción controlada es un proceso sencillo. La
presencia de nisina extracelular (0,l-5 ng/ml) se traduce en una autofosforilación de la
proteína NisK que transfiere su grupo fosfato a la proteína NisR para iniciar la transcripción
de los genes bajo el control del promotor de la nisina, que llegan a inducirse hasta 1000 veces
por encima de su nivel basal de expresión.
Introducción
73
Otra ventaja que ofrecen los sistemas NICE para la producción heteróloga de proteínas
es su flexibilidad, puesto que la relación dosis-respuesta entre la concentración del inductor y
la producción de la proteína de interés es lineal. Además, son muy versátiles, puesto que se
han utilizado con éxito para la expresión de una gran variedad de proteínas de interés no sólo
para la industria alimentaria, sino también para el ámbito médico y biotecnológico, y en un
gran número de bacterias lácticas como recoge la revisión de Mierau y Kleerebezem (2005).
La mayoría de los sistemas de expresión heteróloga se basan, por lo general, en
vectores que portan determinados marcadores de selección. Estos vectores que pueden ser
bastante inestables, ya que requieren de una presión selectiva constante. Este inconveniente se
podría solucionar mediante la utilización de los llamados sistemas de integración
cromosómica. Su aplicación práctica es dudosa, puesto que el número de copias por bacteria
sería muy reducido. De momento, este sistema se ha empleado para integrar el operón
completo de la nisina en Bacillus subtilis para estudiar con detalle los mecanismos de
modificación postraducional de este lantibiótico (Yuksel y Hansen, 2007). Por otro lado, casi
todas las bacterias lácticas utilizadas como hospedadores heterólogos pertenecen al grupo de
las denominadas “cepas de laboratorio”. Estas cepas de laboratorio pueden servir de
referencia en los primeros ensayos, pero una vez que ya han sido evaluados, sería importante
sustituirlas por otras aceptables para uso industrial. A este respecto, algunos autores ya han
mostrado la posibilidad de utilizar cepas de bacterias lácticas de valor comercial para la
expresión heteróloga de bacteriocinas (Buyong et al., 1998).
Por tanto, de todo lo expuesto en este apartado se deduce que la aplicación práctica de
las bacteriocinas expresadas heterólogamente pasa por la utilización de vectores de grado
alimentario y de cepas consideradas como seguras o de interés en la industria alimentaria. No
conviene olvidar que el uso de organismos modificados genéticamente capaces de producir
bacteriocinas se podría enfrentar a importantes barreras legales, además de la oposición de las
industrias y consumidores, por lo que la construcción de bacterias lácticas que contengan
exclusivamente material genético de grado alimentario sería el primer paso para intentar
comprender la ventaja que supone la utilización de este tipo de microorganismos (Rodríguez
et al., 2002b). No obstante, sería necesario optimizar los sistemas de expresión antes de
cualquier tipo de aplicación práctica. Es obvio que la mayoría de los sistemas desarrollados
Introducción
74
hasta este momento para la producción heteróloga de bacteriocinas ofrecen ciertas
limitaciones, como por ejemplo, los niveles de producción que alcanzan o la versatilidad que
ofrecen para su aplicación en diferentes hospedadores.
Otro escollo muy importante para la aplicación industrial de las bacteriocinas es la
viabilidad económica de su producción a gran escala. Para ello se están haciendo esfuerzos en
varios sentidos. Por un lado, es necesario buscar cepas que sean capaces de producir
bacteriocinas en medios de bajo coste. La caracterización de P. acidilactici C20, una cepa
productora de pediocina PA-1, reveló que poseía una galactosidasa β inducible por lactosa, lo
que le confería la capacidad de fermentar lactosa. Este rasgo metabólico permite aprovechar
un subproducto de la industria láctea, el suero de quesería, como medio para producir
pediocina con un buen rendimiento y a un bajo coste (Halami y Chandrashekar, 2005).
También es necesario desarrollar métodos simples para la purificación a gran escala de
bacteriocinas.
II.3. ENTEROCOCOS
II.3.1. Perspectiva histórica
El género Enterococcus pertenece al Filum Firmicutes, Clase Bacilli, Orden
Lactobacillales y Familia Enterococcaceae; esta última incluye, además, los géneros
Melissococcus, Tetragenococcus y Vagococcus (Garrity y Holt, 2001). Sin embargo, la
taxonomía de las especies que integran este género ha sufrido numerosos cambios durante el
siglo pasado, tal y como se describe a continuación.
La primera descripción de un miembro de este género fue realizada por Thiercelin
(1899) con relación a un diplococo Gram-positivo aislado de una muestra intestinal humana.
Poco después, Thiercelin y Jouhaud (1903) acuñaron el término “enterococo” (entérocoque)
para referirse a este tipo de bacterias. Andrewes y Horder (1906) propusieron la
denominación de Streptococcus faecalis para una bacteria aislada de un paciente con
endocarditis ya que, a pesar de este origen, consideraron que se trataba de un microorganismo
característico del intestino humano. Durante la siguiente década varios autores incluyeron
Introducción
75
nuevos aislados dentro de la especie S. faecalis. Orla-Jensen (1919) describió cepas de dos
nuevas especies (S. glycerinaceus y S. faecium) que fueron prácticamente ignoradas durante
muchos años. De hecho, hasta finales de los años 30, todos los aislados fecales que
compartían unas mínimas características comunes con la bacteria descrita por Andrewes y
Morder siguieron considerándose como S. faecalis (Murray, 1990).
Sherman (1937) advirtió que el término “enterococo” se había empleado para
designar, no sólo a los aislados que pertenecían estrictamente a la especie S. faecalis, sino a
cualquier estreptococo de origen fecal. En consecuencia, propuso un nuevo esquema de
clasificación en la que los estreptococos se estructuraban en cuatro grupos: piogénicos,
viridans, lácticos y enterococos. Este último término quedaba reservado para aquellos
estreptococos capaces de crecer entre 10 y 45 ºC, en presencia de un 6,5% de cloruro sódico
y/o a pH 9,6. Además, tenían que hidrolizar la esculina en presencia de bilis y sobrevivir a
60ºC durante 30 min. Esta clasificación guardaba cierta correlación con la clasificación
serológica propuesta a principios de los años 30 por Lancefield, basada en la presencia de un
antígeno en la pared celular. Así, los enterococos reaccionaban con los antisueros del grupo
D, los estreptococos lácticos con los del grupo N, los piógenos con los de los grupos A, B, C,
E, F o G y los viridans no se podían agrupar siguiendo este criterio. Sherman incluyó cuatro
especies dentro de los enterococos (S. faecalis, S. zymogenes, S. liquefaciens y S. durans) pero
añadió que, dado las grandes similitudes existentes entre las tres primeras, quizás sería más
apropiada la siguiente terminología: S. faecalis (no hemolítica, no proteolítica), S. faecalis
var. zymogenes (hemolítica, proteolítica), S. faecalis var. liquefaciens (no hemolítica,
proteolítica), S. faecalis var. hemolyticus (hemolítica, no proteolítica) y S. durans. Décadas
después, se observó que la hemólisis es una propiedad totalmente inadecuada para distinguir
entre especies ya que está mediada por un plásmido y puede ser transferida a cepas no
hemolíticas (Ike et al., 1987).
Sherman consideró que las especies S. glycerinaceus y S. faecium, propuestas por
Orla-Jensen, eran indistinguibles de S. faecalis. No obstante, a lo largo de las décadas de los
40 y los 50, varios estudios mostraron que los aislados que se habían identificado
originalmente como S. faecium realmente poseían ciertas propiedades bioquímicas que los
diferenciaban de S. faecalis y, así, esta especie se incorporó a la nomenclatura oficial a
mediados de los años 60 (Barnes, 1956; Hartman et al., 1966).
Introducción
76
Paralelamente, entre los años 30 y los 80 se fueron aislando numerosos enterococos a
partir de las más diversas fuentes (alimentos, animales, vegetales, muestras humanas),
incluyendo algunos que, con relación a S. faecalis, manifestaban propiedades “atípicas” como
motilidad, pigmentación y/o reactividad no sólo con el antisuero del grupo D sino con otros,
como el del grupo Q. Los nuevos aislados se fueron clasificando y reclasificando en forma de
distintas especies, subespecies y variedades, la mayoría de las veces sin un criterio muy
definido, lo que provocó un período de gran confusión taxonómica (Murray, 1990).
A partir de los años 80, la progresiva generalización de las técnicas genéticas como
herramienta esencial en el campo taxonómico, ha contribuido decisivamente a clarificar la
situación. Así, la aplicación de las técnicas de hibridación DNA-DNA y de secuenciación del
16S rRNA reveló que S. faecalis y S. faecium, por una parte, y los streptocococos del grupo
N, por otra, eran lo suficientemente distintos del resto de estreptococos como para ser
transferidos a dos nuevos géneros: el género Enterococcus y el Lactococcus, respectivamente
(Schleifer y Kilpper-Bälz, 1984). Desde entonces, se han añadido al género Enterococcus
otras especies de tal manera que en la actualidad está integrado por 28 especies: E. asini, E.
avium, E. canis, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, E. faecalis,
E. faecium, E. flavescens, E. gallinarum, E. gilvus, E. haemoperoxidus, E. hirae, E.
malodoratus, E. moraviensis, E. mundtii, E. pallens, E. phoeniculicola, E. pseudoavium, E.
raffinosus, E. ratti, E. saccharolyticus, E. saccharominimus, E. solitarius, E. sulfureus y E.
villorum (Foulquie Moreno et al., 2006). El análisis comparativo de los genes 16S rRNA de
las diferentes especies ha permitido la distinción de ocho grupos: grupo E. faecium, grupo E.
avium, grupo E. gallinarum, grupo E. dispar, grupo E. saccharolyticus, grupo E. cecorum,
grupo E. faecalis y grupo Tetragenococcus. Entre las diferentes especies del género
Enterococcus, E. faecalis y E. faecium siguen siendo las más representativas, jugando papeles
muy importantes en numerosos alimentos y en hospedadores humanos y animales, ya sea
como probióticos, como comensales o, en ocasiones, como patógenos oportunistas.
En un futuro próximo, se podrían producir algunas reclasificaciones ya que, por
ejemplo, no se observan suficientes diferencias entre E. casseliflavus y E. flavescens para que
sean clasificadas separadamente (Descheemaeker et al., 1997; Devriese y Pot, 1995) y,
además, existe cierta controversia sobre otras dos especies, E. avillorum y E. porcinus (De
Graef et al., 2003).
Introducción
77
II.3.2. Aislamiento e identificación de enterococos
El hecho de que los enterococos se encuentren entre los microorganismos a considerar
en numerosas muestras alimentarias, clínicas y ambientales ha propiciado que su aislamiento,
enumeración e identificación sea una tarea habitual en muchos laboratorios. En lo que
respecta a su aislamiento, se han propuesto más de cien medios de cultivo que,
frecuentemente, incluyen substratos cromogénicos diferenciales o sustancias inhibidoras del
crecimiento de otros grupos bacterianos (Reuter, 1992). Entre los más empleados destacan el
Slanetz Bartley (Slanetz y Bartley, 1957) y el agar Kanamicina Esculina Azida (KAA)
(Mossel et al., 1978), ya sea en su formulación original o con diversas modificaciones. No
obstante, no existe ningún medio ideal o universal para el aislamiento y enumeración de
enterococos ya que todos ellos tienen ciertos inconvenientes en términos de selectividad y/o
capacidad de recuperación, tal y como concluyeron Garg y Mital (1991) y Domig et al.
(2003a) en sus excelentes revisiones sobre este tema.
Una vez aislados, los presuntos enterococos deben ser caracterizados e identificados.
La diferenciación e identificación bacteriana es un área en pleno desarrollo que se basa en una
combinación de métodos “clásicos” y “avanzados”. En muchos casos, las diferencias
fenotípicas (morfología, pruebas bioquímicas) no son suficientes para establecer relaciones
filogenéticas y puede conducir a una clasificación errónea de los enterococos (Domig et al.,
2003b). Por este motivo, es necesario emplear técnicas de identificación basadas en la
composición única de los ácidos nucleicos de las distintas bacterias. De hecho, la “taxonomía
polifásica” combina la información fenotípica y genotípica y forma la base de la Sistemática
Bacteriana actual.
Por lo que respecta a las características fenotípicas, existen ciertas características que
parecen comunes para todas las especies de enterococos (Devriese y Pot, 1995). Los
miembros del género Enterococcus son cocos ovoides, Gram-positivos, con un bajo contenido
de G+C (<50 mol%) en su DNA y que se disponen solos, en parejas o formando cadenas
cortas. Estas características morfológicas se pueden visualizar con una alta reproducibilidad
cuando crecen en agar BHI a 37ºC. En general, son organismos anaerobios aerotolerantes ya
que, aunque carecen de catalasa, poseen superóxido dismutasas y peroxidasas que degradan el
Introducción
78
oxígeno y el peróxido de hidrógeno generados en condiciones de aerobiosis en las que, de
hecho, muestran un crecimiento excelente cuando el resto de condiciones son favorables. El
metabolismo de carbohidratos de los enterococos es típicamente homofermentativo (ruta de
Embden-Meyerhof-Parnas) y conduce a la producción de ácido L-láctico como producto final
predominante. Por otra parte, todas las especies poseen un peptidoglicano del tipo lisina-D-
asparagina, a excepción de E. faecalis en el que es del tipo lisina-alanina2-3 (Schleifer y
Kilpper-Bälz, 1987).
En el caso de los enterococos “típicos” (E. durans, E. faecalis, E. faecium, E.
gallinarum, E. hirae y E. mundtii), su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre 32 y
37ºC aunque la mayor parte de las especies pueden crecer a temperaturas de entre 10 y 45 ºC.
Además, también pueden crecer en presencia de un 6,5% de cloruro sódico, de un 40% de
bilis y/o a pH 9,6. No obstante, muchas de las especies descritas recientemente muestran
algunas propiedades que difieren de las que tradicionalmente se habían considerado
características de los enterococos. Por ejemplo, E. dispar, E. sulfureus, E. malodoratus y E.
moraviensis no crecen a 45ºC (Collins et al., 1984; Martínez-Murcia et al., 1991; Svec et al.,
2001) mientras que E. cecorum y E. columbae no lo hacen a 10ºC (Devriese et al., 1993).
Además, E. avium, E. saccharominimus, E. cecorum y E. columbae no crecen, o lo hacen
pobremente, en presencia de un 6,5% de cloruro sódico (Devriese et al., 1993; Vancanneyt et
al., 2002). Todas las especies reaccionan con el antisuero del grupo D de Lancefield con la
excepción de E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. pseudoavium, E. saccharolyticus y E.
sulfureus (Hardie y Whiley, 1997). A este respecto conviene señalar que, en las últimas
décadas, aproximadamente un tercio de los leuconoctocs aislados de materiales clínicos se
clasificaron erróneamente como enterococos debido a que reaccionaban con el antisuero del
grupo D (Facklam y Elliott, 1995). Finalmente, existen dos especies pigmentadas, E.
casseliflavus y E. mundtii, y dos móviles, E. casseliflavus y E. gallinarum (Schleifer y
Kilpper-Bälz, 1987). En estas últimas, la motilidad puede variar dependiendo de la
composición del medio de cultivo (Toth y Van Horn, 1999). La Tabla II.6 muestra las
principales características fisiológicas de diversas especies de enterococos.
Actualmente, existe un amplio abanico de métodos para identificar y/o tipar
enterococos, cada uno de ellos con un poder discriminatorio definido. El biotipado es uno de
los sistemas más empleados para la diferenciación bacteriana y se ha basado tradicionalmente
Introducción
79
n.d., no determinado; (+), débilmente positivo; V, variable; +/-, resultados contradictories en la literature. E.
solitarius parece pertenecer realmente al género Tetragenococcus (Devriese y Pot, 1993).
Tabla II.6. Características fisiológicas de las distintas especies de enterococos
Crecimiento a: Crecimiento en presencia de: Especie 10ºC 45ºC pH 9.6 NaCl (6,5%) Bilis (40%) Azida sódica (0,04%)
Hidrólisis esculina
Antígeno Grupo D
E. asini (+) (+) n.d. - + n.d. + + E. avium V + + V V/+ n.d. + + E. casseliflavus + + + V/+ + + + + E. cecorum - + (+) - (+) - + - E. columbae - n.d. n.d. - (+) - + - E. dispar + - n.d. +/- + - + - E. durans + + + + + + + (+) E. faecalis + + + + + + + + E. faecium + + + + + + + V E. flavescens V/- V/+ n.d. + + + + + E. gallinarum + + + + + + + + E. haemoperoxidus + - n.d. + + + + + E. hirae + + + + + + + V E. malodoratus + - + + + n.d. + + E. moraviensis + - n.d. + + + + + E. mundtii + + + + + + + + E. porcinus + + n.d. + n.d. n.d. + + E. pseudoavium + + + +/- V/+ n.d. + - E. raffinosus (+) + + + V/+ n.d. + n.d. E. ratti + + n.d. + n.d. n.d. + (+) E. saccharolyticus + + n.d. (+) + n.d. + - E. solitarius + + n.d. + + n.d. + + E. sulfureus + - n.d. + + n.d. + - E. villorum n.d. n.d. n.d. + + + + n.d.
Introducción
80
en la determinación del perfil de fermentación de carbohidratos y del de actividades
enzimáticas. Para ello, se suelen emplear kits que no sólo permiten su obtención de una
forma rápida, cómoda y semicuantificable, sino también su comparación con los
perfiles existentes en bases de datos. Sin embargo, los kits disponibles en la actualidad
sólo permiten la identificación presuntiva de un número muy limitado de especies del
género Enterococcus e, incluso en tales casos, los resultados deben ser considerados
como meramente orientativos, siendo necesarias pruebas fenotípicas y genotípicas
adicionales. Para ello, diversos autores han propuesto claves para la identificación
fenotípica de las especies de Enterococcus (Devriese et al., 1996; Facklam y Collins,
1989; Facklam y Sahm, 1995; Manero y Blanch, 1999; Reed et al., 1999) pero todavía
no existe un acuerdo sobre cuales son las pruebas estrictamente necesarias para su
clasificación inequívoca.
Alternativamente, existen otras técnicas de biotipado que permiten una
identificación más precisa. Entre ellas destacan la comparación de los perfiles de
proteínas totales obtenidos mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con
dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y la electroforesis de isoenzimas (MLEE). Ambas
técnicas son reproducibles y tienen un alto poder discriminatorio pero, en lo
concerniente a los enterococos, la MLEE parece más adecuada cuando se trata de
establecer relaciones entre un elevado número de aislados (Tomayko y Murray, 1995).
El resto de pruebas de tipado basadas en propiedades fenotípicas, como los ensayos de
susceptibilidad a ciertos antimicrobianos, el serotipado o el análisis de ácidos grasos de
cadena larga, tienen un uso mucho más restringido. Finalmente, y como se ha
comentado anteriormente, la disponibilidad de técnicas de biología molecular ha
contribuido decisivamente a que la identificación de enterococos sea cada vez más
rápida y exacta. Entre los métodos genotípicos que se han empleado para tal fin
destacan los análisis de restricción (REA) del DNA cromosómico, la comparación de
perfiles plasmídicos, la electroforesis de campo pulsado (PFGE), el ribotipado, el
tipado de secuencias multilocus (MLST), las técnicas de hibridación y toda la gama de
sistemas basados en la PCR. La aplicación de todas estas técnicas a la identificación y
tipado de enterococos ha sido revisada en detalle por Domig et al. (2003b).
Introducción
81
II.3.3. Los enterococos en hospedadores sanos
En los últimos años, se ha puesto en evidencia que la hipótesis tradicional sobre
la colonización del intestino neonatal, que consideraba que tanto el feto in utero como
la leche materna eran estériles, era errónea. De hecho, se han podido detectar bacterias
propias del aparato digestivo de la madre en muestras de corioamnion, líquido
amniótico y/o sangre de cordón umbilical de niños sanos en los que las membranas
placentarias estaban intactas (Bearfield et al., 2002; Dasanayake et al., 2005; Hitti et
al., 1997; Jiménez et al., 2005). Entre estas bacterias destacan estreptococos,
estafilococos y enterococos. La capacidad de translocación intestinal de ciertos
enterococos sin causar efectos perjudiciales para el hospedador ha sido puesta de
manifiesto tanto in vitro como in vivo (Berg, 1995; Berg y Garlington, 1979;
Fernández et al., 2004; Jiménez et al., 2005; Rodríguez et al., 2001). Es más, la
translocación de bacterias lácticas en la cavidad oral de mujeres embarazadas con una
placenta completamente normal deriva en la presencia de estas bacterias en el líquido
amniótico, un proceso que tiene una clara influencia beneficiosa en el proceso de
gestación ya que se ha asociado a una menor tasa de prematuridad (Dasanayake et al.,
2005).
Todo ello sugiere que estas bacterias pueden acceder desde el aparato digestivo
a la circulación sistémica y, posteriormente, aparecer en fluidos como el líquido
amniótico o la leche materna. En este sentido, la administración por vía oral de una
cepa de E. faecium marcada genéticamente a ratonas preñadas permitió observar la
transferencia de la cepa marcada tanto al intestino fetal (bajo nivel de transferencia)
como a la glándula mamaria de las madres (alto nivel de transferencia) (Fernández et
al., 2004). Precisamente, en estos últimos años también se ha puesto de manifiesto que
la leche materna es una fuente constante de bacterias comensales para el intestino del
lactante, encontrándose en concentraciones relativamente elevadas (>104 ufc/ml) y
siendo particularmente rica en estreptococos, estafilococos y bacterias lácticas, entre
las que destacan los enterococos (Beasley y Saris, 2004; Heikkilä y Saris, 2003; Martín
et al., 2003; Ng et al., 2004). Recientemente, se ha confirmado que la concentración de
lactobacilos y enterococos es significativamente más elevada en la microbiota de
lactantes que en la de niños alimentados con fórmulas (Ahrné et al., 2005; Rinne et al.,
Introducción
82
2005). La aplicación de técnicas moleculares basadas en los genes que codifican el 16S
rRNA ha confirmado que la leche materna es una buena fuente de enterococos (Martín,
2005).
.
En las primeras semanas de vida, bacterias anaerobias facultativas
(estreptococos, enterococos, estafilococos, lactobacilos, enterobacterias) colonizan el
TGI del neonato. Parece significativo que se trate precisamente de los grupos
bacterianos más representativos de la microbiota de la leche materna (Martín, 2005).
Estas bacterias crearían un ambiente reductor favorable para la colonización de
bacterias anaerobias (bifidobacterias, bacteroides y clostridios). Cuando se inicia la
fase de destete, se van introduciendo progresivamente alimentos sólidos y,
paralelamente, se va reduciendo la ingesta de leche materna hasta su completa
sustitución. Estas circunstancias producen grandes cambios en la composición de la
microbiota intestinal infantil, de tal manera que, en poco tiempo, desaparecen las
diferencias entre la microbiota de los lactantes y la de los alimentados con fórmulas
(Mackie et al., 1999; Stark y Lee, 1982). En general, se estima que los grupos
microbianos dominantes en la microbiota intestinal de los niños de dos años son
similares a los de los adultos (Favier et al., 2002). En cualquier caso, la microbiota
intestinal parece ser específica de cada individuo y las poblaciones dominantes suelen
permanecer estables a lo largo del tiempo.
Finalmente, los enterococos son característicos de otras mucosas humanas,
como la mucosa vaginal en la que, junto con los lactobacilos, contribuyen a evitar
infecciones. Todo ello sugiere que los enterococos son habitantes normales de las
mucosas de hospedadores sanos, en las que desempeñarían funciones biológicas que
están aún por esclarecer. Tal es así que, de hecho, la ausencia de estas bacterias en el
intestino y la vagina de humanos sanos debería considerarse como una verdadera
anomalía.
II.3.4. Los enterococos como probióticos
Posiblemente, el término “probiótico” fue empleado por primera vez por
Vergio (1954) cuando comparaba los efectos adversos (“antibiotika”) que los
Introducción
83
antibióticos ejercían sobre la microbiota intestinal con las acciones beneficiosas
(“probiotika”) ejercidas por otros factores que no pudo determinar. Una década más
tarde, Lilly y Stillwell se referían a los probióticos como sustancias que producían
ciertos protozoos que promovían el crecimiento de otros microorganismos (Lilly y
Stillwell, 1965). Fuller (1989) los redefinió como “suplementos alimenticios
integrados por microorganismos vivos que afectan beneficiosamente al hospedador
que los consume mediante la mejora de su equilibrio microbiano intestinal”. Más
recientemente, la FAO y la OMS los han definido como “organismos vivos que
ingeridos a dosis definidas ejercen efectos beneficiosos para la salud” (FAO/WHO,
2002). Esta última definición es más amplia y tiene en cuenta los resultados de
recientes investigaciones que demuestran la existencia de efectos probióticos que no se
restringen al ámbito intestinal.
Las bacterias lácticas y las bifidobacterias ocupan el lugar más destacado entre
los microorganismos empleados con fines probióticos pero también se utilizan con este
fin otras bacterias, como Escherichia coli y Bacillus cereus, y levaduras,
principalmente Saccharomyces cerevisiae. Dentro de las bacterias lácticas, los dos
géneros más empleados hasta la fecha con este fin son Lactobacillus (el más destacado
en este sentido) y el que nos ocupa: Enterococcus (Holzapfel et al., 1998). Diversas
cepas de E. faecium y E. faecalis se han empleado y se siguen empleando como
probióticos humanos en diferentes presentaciones. Además, algunos estudios han
puesto en evidencia la presencia de enterococos en alimentos y suplementos
probióticos cuya presencia no se hacía constar en el etiquetado (Temmerman et al.,
2003). Por otra parte, estas bacterias también se han aplicado como probióticos en
animales; por ejemplo, desde el año 2004 la Unión Europea ha autorizado como
aditivos en piensos animales 10 preparaciones que, globalmente, contienen 9 cepas de
E. faecium (Comisión Europea, 2004).
Entre las cepas de enterococos empleadas como probióticos, E. faecium SF68
(F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basilea, Suiza) es una de las más estudiadas. Diversos
estudios clínicos han demostrado su eficacia en la prevención de diarreas asociadas a
antibioterapia (Wunderlich et al., 1989) y en el tratamiento de diarreas infantiles
(Bellomo et al., 1980). Más recientemente, esta cepa se ha aplicado en dos hospitales
Introducción
84
belgas para tratar a adultos con diarrea aguda, observándose una reducción
significativa en la duración del proceso (Buydens y Debeuckelaere, 1996). Resulta
significativo que la empresa MD Foods (Aarhus, Dinamarca) ha vendido desde hace
muchos años diversos productos lácteos que contienen concentraciones elevadas de E.
faecium SF68 (>108 ufc/ml) (gama GAIO) sin que se haya descrito ningún efecto
adverso hasta la fecha. Un estudio reciente evaluó la relación entre el consumo de un
producto GAIO y el tratamiento con vancomicina y la conclusión fue que la cepa E.
faecium SF68 presente en el producto fue incapaz de adquirir resistencia a la
vancomicina durante el periodo de estudio (Lund et al., 2000).
E. faecium PR88 (E. faecium Fargo 688; Quest International, Naarden,
Holanda) es otra de las cepas evaluadas en ensayos clínicos humanos. Su consumo se
ha asociado a una mejora de los síntomas del síndrome de colon irritable (Allen et al.,
1996). Esta cepa se ha empleado para la producción de un queso Cheddar probiótico y
su aplicación no sólo no afecta negativamente a las propiedades organolépticas del
queso sino que incluso mejora su aroma y sabor (Gardener et al., 1999). Por otra parte,
la cepa E. faecium CRL 183 ha mostrado su potencial probiótico in vitro,
especialmente en lo referente a actividad hipocolesterolémica (Rossi et al., 1999).
Finalmente, existe un producto en el mercado (Ecoflor, Walthers Health Care, Den
Haag, Holanda) que contiene una cepa de E. faecium que, según el productor, posee
numerosas actividades beneficiosas para el hospedador aunque no existen evidencias
científicas al respecto.
El empleo de enterococos como probióticos es un tema controvertido debido a
su papel como patógenos oportunistas y a la posible transferencia de genes que
codifican resistencias a antibióticos (ver secciones siguientes). No obstante, existen
evidencias científicas del potencial probiótico y de la seguridad de diversas cepas. De
hecho, los enterococos forman parte de la microbiota natural de la leche materna y de
la existente en el intestino de lactantes sanos, una población particularmente sensible a
las infecciones. Además, estas bacterias son predominantes en numerosos alimentos
fermentados consumidos por la población general, desde niños hasta ancianos, sin que
se hayan asociado a problemas sanitarios. De momento, las compañías más
representativas del sector no comercializan productos que contengan cepas de
Introducción
85
enterococos para evitar cualquier polémica interesada pero es posible que esta
situación se reconsidere a medio y largo plazo, cuando existan las herramientas y las
condiciones necesarias para una evaluación objetiva de su seguridad.
II.3.5. Los enterococos como patógenos oportunistas
Tradicionalmente, los enterococos se habían considerado como bacterias
comensales que habitaban el tracto intestinal de personas y animales, en buena sintonía
con sus hospedadores y con otros miembros de la microbiota intestinal, y realmente es
lo que sucede en la mayoría de los casos. Sin embargo, en las últimas décadas se ha
observado una creciente implicación de los enterococos en casos de infecciones
humanas. De hecho, estas bacterias se encuentran actualmente entre los agentes que
con mayor frecuencia causan infecciones nosocomiales y, en tales circunstancias,
pueden provocar bacteriemias, endocarditis e infecciones del tracto urinario, del
sistema nervioso central, intraabdominales y/o pélvicas (Endtz et al., 1999; Franz et
al., 2003). No obstante, no se debe generalizar esta consideración a todos los
enterococos ya que la incidencia de factores de virulencia y de resistencia a
antibióticos depende de cada cepa (Eaton y Gasson, 2001; Franz et al., 2002;
Temmerman et al., 2003). Vancanneyt et al. (2002) compararon los genotipos de
numerosas cepas de E. faecium aisladas de muestras humanas, animales y alimentarias,
y encontraron que los aislados humanos involucrados en infecciones clínicas podrían
englobarse en un mismo subgrupo, distinto de todos los demás. Pillai et al. (2002)
también han sugerido la existencia de subpoblaciones virulentas entre las cepas de E.
faecalis. En consecuencia, la seguridad de cualquier cepa de Enterococcus spp. de
interés clínico o industrial debe ser evaluada de forma individual y meticulosa.
Hasta hace poco tiempo, se pensaba que las infecciones enterocócicas se
adquirían endógenamente, es decir, a partir de la propia flora del paciente; sin
embargo, en los últimos años los análisis de casos clínicos han demostrado que
prácticamente todas las cepas involucradas tenían un origen exógeno (Keyser, 2003).
En este sentido, actualmente se sabe que las infecciones por enterococos suelen seguir
un proceso que consta de dos etapas (Keyser, 2003); inicialmente, se produce una
colonización asintomática de los pacientes con cepas que poseen factores de virulencia
Introducción
86
y resistencia a antibióticos y que son endémicas en un hospital o unidad hospitalaria;
seguidamente, esta población exógena crece, a menudo favorecida por la eliminación
de competidores debida a la antibioterapia, y puede conducir a una enfermedad
adicional en pacientes de riesgo. Conviene destacar que, incluso en pacientes
inmunodeprimidos, los enterococos por sí solos son a menudo incapaces de causar
enfermedad y requieren para ello la presencia simultánea de una flora patógena
compleja (Keyser, 2003).
Generalmente, los enterococos existentes en ámbitos hospitalarios poseen uno o
más factores de virulencia y son resistentes a diversos antibióticos lo que, unido a su
robustez intrínseca, les permite sobrevivir y distribuirse rápidamente tanto en el
ambiente como en los pacientes. Sin embargo, únicamente en circunstancias muy
particulares, los enterococos son capaces de invadir los tejidos de un hospedador y
desarrollar un proceso patológico (Keyser, 2003). En este sentido, los principales
factores de riesgo asociados a infecciones enterococócicas son la existencia de
enfermedades subyacentes graves, los estados de inmunosupresión, las estancias
prolongadas en hospitales (especialmente en unidades de cuidados intensivos), la
aplicación de catéteres vasculares o urinarios y/o los tratamientos antibióticos
prolongados. Frecuentemente, todas esas circunstancias suelen concurrir en los casos
de infecciones por enterococos por lo que, en general, se consideran microorganismos
de baja patogenicidad e irrelevantes para personas de cualquier edad con un estado de
salud normal. Pero la posible patogenicidad de los enterococos no sólo depende de
factores relacionados con el hospedador sino también de la cepa implicada. En este
sentido, la adquisición de nuevas propiedades puede permitir que una cepa colonice
nuevos nichos y sea potencialmente virulenta. Este hecho se puso de manifiesto con la
identificación del islote de patogenicidad (PAI) de E. faecalis (Shankar et al., 2002),
cuya existencia refleja claramente las diferencias genéticas existentes entre cepas
potencialmente patógenas y cepas comensales.
II.3.6. Factores de virulencia de los enterococos
Un factor de virulencia es una molécula efectora que aumenta la capacidad de
un microorganismo para causar enfermedad más allá de la capacidad intrínseca de su
Introducción
87
especie (Murray, 1992). Todavía no se conocen bien los factores de virulencia de los
enterococos aunque tanto la reciente identificación de islotes de patogenicidad como la
secuenciación del genoma de cepas clínicas de E. faecalis y E. faecium pueden
contribuir a una mejor comprensión en los próximos años (Shankar et al., 2002;
Tendolkar et al., 2003). La Tabla II.7 recoge los factores de virulencia de los
enterococos propuestos hasta la fecha y en las siguientes secciones se procederá a su
descripción.
Tabla II.7. Principales determinantes genéticos de virulencia descritos en enterococos
Gen(es) Papel de la(s) proteína(s) expresada(s)
agg Proteína de agregación involucrada en la adherencia a células
eucariotas, agregación celular y conjugación
gelE Toxina; metaloendopeptidasa extracelular, hidroliza gelatina,
colágeno, hemoglobina y otros compuestos bioactivos
cylM Modificación postraduccional de la citolisina (hemolisina-
bacteriocina que lisa un amplio espectro de células de eucariotas y
de bacterias Gram-positivas)
cylB Transporte de la citolisina
cylA Activación de la citolisina
espfs; espfm Proteína asociada a la pared celular involucrada en la evasión al
sistema inmune por parte de E. faecalis y E. faecium,
respectivamente; puede estar asociada con los genes cyl en islotes
de patogenicidad
efaAfs; efaAfm Adhesinas de pared celular, que se expresan en E. faecalis y E.
faecium, respectivamente
cpd, cob, ccf, cad Feromonas sexuales, quimiotáxicos para leucocitos humanos;
facilitan los procesos de conjugación
Fuente: Eaton y Gasson (2001)
Introducción
88
II.3.6.1. Citolisina
Inicialmente, Sherwood et al. (1949) describieron que algunos estreptococos β-
hemolíticos del grupo D inhibían el crecimiento de otras bacterias. Posteriormente,
este mismo fenómeno fue observado por otros autores, tal y como se recoge en
diversas revisiones sobre el tema (Haas y Gilmore, 1999; Jett et al., 1994). Brock y
Davies (1963) y Granato y Jackson (1969) proporcionaron evidencias irrefutables de
que la actividad β-hemolítica y la actividad bacteriocinogénica eran debidas a una
misma molécula. Más tarde, Gilmore et al. (Gilmore et al., 1990) propusieron que la
hemolisina/bacteriocina de E. faecalis se denominara citolisina (Cyl; del inglés,
Cytolysin) para evitar posibles confusiones. El análisis de la citolisina de E. faecalis
reveló que se trataba de un lantibiótico que poseía una característica diferencial con
respecto a otros lantibióticos ya que no sólo era capaz de lisar bacterias sino también
eritrocitos y otras células eucariotas (Gilmore et al., 1994). La presencia de citolisina
parece estar relacionada con una mayor virulencia de las cepas que la producen (Chow
et al., 1993; Dupont et al., 1998; Jett et al., 1992) aunque los resultados no son
concluyentes y habrá que esperar a que futuros estudios esclarezcan su implicación en
las infecciones enterocócicas.
Los determinantes genéticos para la biosíntesis de la citolisina pueden estar
codificados en plásmidos de gran tamaño dependientes de feromonas o en el
cromosoma, dentro de un islote de patogenicidad. La biosíntesis de este lantibiótico es
un proceso complejo que implica a los productos de la expresión de ocho genes: cylR1,
cylR2, cylLL, cylLS, cylM, cylB, cylA y cylI (Coburn et al., 1999; Gilmore et al., 1990;
Haas et al., 2002; Ike et al., 1990; Shankar et al., 1999). Estos genes se encuentran
organizados en dos transcriptos divergentes, cada uno de ellos con su propio promotor:
(1) el transcripto estructural (cylLLLSMBAI) y (2) el regulador (cylR1R2) (Figura II.11).
La expresión de los genes estructurales (cylLL y cylLS) origina los precursores de las
dos subunidades de la citolisina propiamente dicha (CylLL y CylLS, de 68 y 63
aminoácidos, respectivamente) que sufren una modificación post-traduccional por
acción de CylM, un polipéptido de 993 aminoácidos (fruto de la expresión del gen
cylM) que introduce modificaciones características de los lantibióticos como la
Introducción
89
presencia de los aminoácidos lantionina y β-metil-lantionina (3). Posteriormente, las
subunidades resultantes (CylLL* y CylLS*) son reconocidas y secretadas por CylB, una
proteína de tipo ABC resultante de la expresión de cylB (Gilmore et al., 1990; Gilmore
et al., 1994). Durante el proceso de transporte se elimina el péptido líder existente en el
extremo N-terminal de CylLL* (24 aminoácidos) y de CylLS* (36 aminoácidos),
generándose las subunidades CylLL’ y CylLS’, respectivamente. Tras la secreción de
las subunidades modificadas y procesadas, la proteína CylA (codificada en el gen
cylA) se encarga de la eliminación de los seis aminoácidos N-terminales de CylLL’ y
de CylLS’, dando lugar a las subunidades activas de la citolisina (CylLL’’ y CylLS’’)
(Booth et al., 1996; Shankar et al., 1999). CylA es una serín proteasa similar a la
subtilisina que se expresa en forma de preproenzima y que no necesita la participación
de CylB para su transporte ya que presumiblemente se secreta a través de la ruta de
secreción general (Sec). Por su parte, el producto del gen cylI confiere autoprotección
para la propia célula productora de citolisina (Coburn et al., 1999).
El operón de la citolisina (cylLLLSMBAI) está reprimido por las actividades de
las proteínas CylR1 y CylR2, codificadas en el operón regulador (cylR1R2) (Haas et
al., 2002). CylR1 es una proteína de 94 aminoácidos, sin homología con otras
proteínas conocidas y con tres dominios transmembrana. El gen cylR2 codifica una
proteína de 66 aminoácidos (CylR2) con un lugar de unión al DNA. La existencia de
dos repeticiones (IR1 e IR2) en la región intergénica que separa los genes cylR1 y
cylLL parece ser determinante en la regulación de la síntesis de la citolisina. Dado que
la repetición IR1 se solapa con el lugar de inicio de la transcripción del operón
cylR1R2 y con una zona de la región -35 del promotor del operón cylLLLSMBAI, la
unión entre IR1 y CylR2 bloquea el acceso de la RNA polimerasa al citado promotor
reprimiendo la transcripción del operón estructural. A su vez, el receptor
transmembrana CylR1 interaccionaría intracelularmente con CylR2 estabilizando el
complejo represor. Dicha represión queda anulada mediante un proceso de percepción
de quórum en el que CylLS’’ juega el papel de molécula autoinductora (Shankar et al.,
2004). La posición de CylR1 en la membrana le permite interaccionar con el péptido
inductor CylLS”, unión que desestabiliza el complejo CylR1-CylR2 y que, finalmente,
libera a CylR2 de su lugar de unión, posibiltando la transcripción de los genes
Introducción
90
estructurales de la citolisina. La Figura II.11 muestra una representación esquemática
de la biosíntesis de la citolisina de E. faecalis.
Figura II.11. Representación esquemática del proceso de biosíntesis de citolisina. Los
detalles se explican en el texto. Adaptado de Shepard y Gilmore (2002).
LS*
LS
L
LL LS
R2 R1
M B A I
R2
LL*
LS’
LL’
M
B
B
A
A
LS’
’LL’
’
Lisis célular
ILS
’
’
Introducción
91
II.3.6.2. Gelatinasa
La gelatinasa (GelE) es una metaloendopeptidasa extracelular producida por E.
faecalis con capacidad para degradar diversos sustratos, como la gelatina, fragmentos
insolubles de colágeno, la cadena β de la insulina, la hemoglobina o la endotelina-1. La
GelE influye en la longitud de las cadenas en las que se suelen disponer las células
enterocócicas mediante la activación de una autolisina y también participa en la
degradación de la fibrina polimerizada lo que sugiere que podría facilitar la difusión de
los enterococos en un hospedador (Waters et al., 2003). Además, su secreción afecta
notablemente al nivel de feromonas activas ya que, por ejemplo, la feromona sexual
cCF10 es prácticamente indetectable en el sobrenadante de las cepas de E. faecalis que
expresan gelE. Este hecho favorece la diseminación de E. faecalis cuando la densidad
celular es elevada (Waters et al., 2003). Recientemente, se ha asociado la pérdida de
funcionalidad de gelE con la incapacidad de de E. faecalis para translocar a través de
células T84 derivadas de carcinoma de colon (Zeng et al., 2005).
El gen gelE está localizado en un operón en el que también se localiza el gen
sprE, que codifica una serín proteasa (SprE) (Figura II.12). Delante de ellos se
encuentra el sistema regulador Fsr (del inglés, E. faecalis Regulator), constituido por
los genes fsrA, fsrB y fsrC, que codifican un regulador de respuesta, un péptido
inductor y una proteína sensora, respectivamente (Figura II.12). La expresión del gen
fsrA se encuentra bajo el control del promotor homónimo (constitutivo y débil), la de
fsrBC bajo el del promotor fsrB y, finalmente, la de gelE y sprE mediante el promotor
gelE. La expresión de los genes regulados por los dos últimos promotores depende de
un proceso de percepción de quórum (Qin et al., 2000; 2001). La molécula que actúa
como autoinductora del sistema es un péptido de estructura cíclica denominado
feromona activadora de la biosíntesis de la gelatinasa (GBAP; del inglés Gelatinase
Biosynthesis-Activated Pheromone) (Nakayama et al., 2001). La acumulación
extracelular de GBAP es detectada por FsrC, una histidín quinasa que, a su vez, activa
al regulador de respuesta y al factor de transcripción FsrA, que induce la transcripción
y la subsiguiente producción de GelE y SprE (Hancock y Perego, 2004).
Introducción
92
Diversos estudios con modelos animales han sugerido la posible participación
del sistema Fsr (incluyendo GelE y SprE) en la patogenia de la infección enterocócica
(Mylonakis et al., 2002; Qin et al., 2000; Sifri et al., 2002). Además, el sistema
regulador Fsr puede desempeñar un papel en la formación de biofilms (Hancock y
Perego, 2004). No obstante, a pesar de la elevada prevalencia del locus fsr en aislados
clínicos de E. faecalis (Pillai et al., 2002), su presencia no es una característica
exclusiva de las cepas potencialmente patógenas, por lo que no parece una propiedad
que per se pueda conducir a una infección (Roberts et al., 2004).
Figura II.12. Organización de los genes gelE y sprE y del sistema regulador Fsr.
Fuente: Nallapareddy et al. (2000a).
II.3.6.3. Sustancia de agregación y feromonas
La sustancia de agregación (AS; del inglés Aggregation Substance) es una
proteina de superficie propia de ciertas cepas de E. faecalis, cuya expresión es inducida
por feromonas sexuales (Tabla II.8). Esta proteina promueve la formación de
agregados durante la conjugación bacteriana (Clewell, 1993). Se trata de un
componente importante del sistema de intercambio genético dependiente de feromonas
y, en este sentido, permite un contacto eficiente entre las células donantes y las
receptoras, facilitando la transferencia de plásmidos (Clewell, 1993). En ensayos in
vitro se ha observado que la AS actúa como mediador en la adhesión de E. faecalis a
células del túbulo renal (Kreft et al., 1992) y, además, aumenta la internalización o
translocación de los enterococos a través de enterocitos humanos (Wells et al., 2000).
In vivo, la AS puede contribuir a la patogénesis de la infección enterocócica mediante
diversos mecanismos como la adhesión a las células del hospedador y a las proteínas
fsrA fsrB fsrC gelE sprE
Introducción
93
de la matriz extracelular, el aumento de la hidrofobicidad de la superficie celular y los
procesos de evasión del sistema inmunitario derivados de su interacción con
macrófagos y neutrófilos polimorfonucleares (Mundy et al., 2000).
Tabla II.8. Secuencia aminoacídica de las principales feromonas sexuales descritas en
E. faecalis.
Fuente: Maqueda et al. (1997)
La AS (Figura II.13) contiene dos motivos RGD (Arg-Gly-Asp) que son
comunes entre las proteínas que se unen a las integrinas, una familia de receptores
presentes en células eucariotas como leucocitos, trombocitos, células endoteliales y
células epiteliales (Sartingen et al., 2000; Süβmuth et al., 2002). La presencia de estos
motivos explica el papel de la AS en la unión de los enterococos a las células
eucariotas y a las proteínas de la matriz extracelular. Precisamente, la adherencia de los
enterococos a las proteínas de la matriz extracelular (fibronectina, trombospondina,
vitronectina y colágeno de tipo I) puede ser un factor importante en la patogénesis de
las infecciones enterocócicas ya que estas proteínas son más abundantes en epitelios o
endotelios dañados y se ha observado que la incidencia y severidad de las endocarditis
Péptido Secuencia
cCF10 H-Leu-Val-Thr-Leu-Val-Phe-Val-OH
cPD1 H-Phe-Leu-Val-Met-Phe-Leu-Ser-Gly-OH
cAD1 H-Leu-Phe-Ser-Leu-Val-Leu-Ala-Gly-OH
cAM373 H-Ala-Ile-Phe-Ile-Leu-Ala-Ser-OH
cOB1 H-Val-Ala-Val-Leu-Val-Leu-Gly-Ala-OH
iCF10 H-Ala-Ile-Thr-Leu-Ile-Phe-Ile-OH
iPD1 H-Ala-Leu-Ile-Leu-Thr-Leu-Val-Ser-OH
iAD1 H-Leu-Phe-Val-Val-Thr-Leu-Val-Gly-OH
iAM373 H-Ser-Ile-Phe-Thr-Leu-Val-Ala-OH
iOB1 H-Val-Ala-Val-Leu-Val-Leu-Gly-Ala-OH
Introducción
94
producidas por enterococos es mucho mayor cuando existe un daño endotelial previo
(Franz et al., 2003).
Por su parte, las feromonas de los enterococos son péptidos de pequeño tamaño
codificados en plásmidos (Franz et al., 2003) (Tabla II.8). La presencia de plásmidos
regulados por feromonas ha sido descrita tanto en E. faecalis como E. faecium y en
ambas especies se encuentran relacionados con determinantes de virulencia. Hasta el
momento, se han descrito cuatro plásmidos feromona-dependientes que codifican la
AS en E. faecalis mientras que en E. faecium los plásmidos regulados por feromonas
se relacionan con genes que codifican resistencia a la vancomicina (Castro et al.,
2004). El hecho de que algunos genes indeseables estén codificados en plásmidos que
responden a feromonas que generalmente sólo se encuentran en E. faecalis podría
explicar la mayor incidencia de factores de virulencia en cepas de esta especie y su
marcado predominio (80-90%) entre los enterococos involucrados en infecciones
humanas (Kayser, 2003). Adicionalmente, las feromonas secretadas por las células
productoras provocan una respuesta inflamatoria en el hospedador, inducen la
secreción de peróxido de hidrógeno y son quimiotácticas para leucocitos humanos por
lo que también podrían considerarse por sí mismas como posibles factores de
virulencia (Eaton y Gasson, 2001).
Figura II.13. Sustancia de agregación (AS) de E. faecalis. PS: péptido señal; PC:
dominio de unión a la pared celular; AM: dominio de anclaje a la membrana;
RGD(S/V): secuencia de reconocimiento para las integrinas Fuente: Castro et al. (2004).
PS PC AM
RGD S
RGDV
Zona de unión a bacterias
Zona de unión a células eucariotas
Introducción
95
II.3.6.4. Proteína de superficie de enterococos
La proteína de superficie extracelular de los enterococos (Esp) es una adhesina
que se describió inicialmente en E. faecalis MMH594, una cepa muy virulenta y
resistente a la gentamicina (Shankar et al., 1999). Esta proteina se encuentra codificada
en el gen esp que contiene 5622 nucleótidos y cuya expresión resulta en un producto
de 1873 aminoácidos. Su extremo N-terminal no muestra similitudes con proteínas
conocidas y, posiblemente, es la región que interacciona con las células del hospedador
(Shankar et al., 1999). Esp posee una estructura muy característica incluyendo un
número variable de bloques repetitivos bien conservados (Figura II.14). Así, su región
central supone aproximadamente el 50% de la proteína y está constituida por tres
unidades repetitivas (A, B y C). El número de repeticiones oscila entre una y tres en el
caso de la unidad A y entre tres y nueve en el de la unidad C. Globalmente, Esp
muestra una estructura similar a la de la proteína C-alfa de los estreptococos del grupo
B (Wastfelt et al., 1997) y a la de la proteína Bap de Staphylococcus aureus, asociada a
la formación de biofilms (Cucarella et al., 2001).
La presencia de Esp parece estar asociada a la propagación de los enterococos
en pacientes con transplantes hepáticos (Waar et al., 2002) y a su persistencia en el
tracto urinario de animales de experimentación (Shankar et al., 2001). Por otra parte, la
expresión de Esp aumenta la hidrofobicidad celular y favorece la adhesión de las
células productoras a superficies bióticas o abióticas y la creación de biofilms
(Tendolkar et al., 2003; Toledo-Arana et al., 2001) aunque existen otros factores que
contribuyen a su formación. Los biofilms desempeñan un papel importante en el
origen de muchas infecciones crónicas, como las endocarditis bacterianas, y pueden
suponer un importante problema en pacientes con válvulas cardíacas o catéteres
(Parsek y Singh, 2003).
La proteína Esp no es exclusiva de E. faecalis ya que se ha descrito una
variante de esta proteína, Espfm, en aislados clínicos de E. faecium (Eaton y Gasson,
2002). Sin embargo, entre los aislados de origen alimentario, la incidencia de Esp es
muy distinta dependiendo de la especie. Así, es muy elevada en los de E. faecalis y
Introducción
96
extremadamente rara en los de E. faecium, sin que se haya podido obtener una
explicación hasta la fecha (Eaton y Gasson, 2001; Franz et al., 2001).
Figura II.14. Proteína Esp de E. faecalis. S: péptido señal; N y C: dominios N- y
C-terminal, respectivamente; R: dominio con secuencias repetidas A-C. Fuente:
Castro et al. (2004).
II.3.6.5. Adhesina de unión al colágeno
La adhesina de unión al colágeno (Ace, del inglés “Adhesin of Collagen from
E. faecalis”) es una proteína con una gran similitud estructural y funcional con la
proteína de unión al colágeno de Staphylococcus aureus (Cna) y forma parte de los
componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas adhesivas de la
matriz (MSCRAMMs, del inglés “Microbial Surface Components Recognising
Adhesive Matrix Molecules”) (Nallapareddy et al., 2000a; Rich et al., 1999). Esta
adhesina es capaz de interactuar con proteínas de la matriz extracelular como el
colágeno (tipos I y IV) y la laminina, favorenciendo la unión de los enterococos a las
células del hospedador (Nallapareddy et al., 2000b). El gen que codifica la adhesina
Ace es ubicuo entre los aislados de E. faecalis, independientemente de que tengan un
carácter comensal o patógeno (Duh et al., 2001), y parece expresarse durante el
proceso infeccioso. De hecho, la mayoría de los sueros de pacientes con endocarditis
enterocócica reaccionan con anticuerpos anti-Ace (Nallapareddy et al., 2000a). No
obstante, todavía no se han identificado los factores del hospedador que pueden regular
la expresión del gen ace in vivo.
S N R C
A1 A2 A3 B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C7a B
Introducción
97
Recientemente, se ha identificado un homólogo del gen ace en E. faecium,
recibiendo el nombre de acm (Nallapareddy et al., 2003). El mismo estudió reveló que
todos los aislados de E. faecium analizados poseían el citado gen pero que algunos
carecían del fenotipo de unión al colágeno debido a diferentes delecciones y
mutaciones dentro del gen o de su promotor putativo.
II.3.6.6. Adhesinas EfaAfs y EfaAfm
Otras moléculas consideradas como posibles factores de virulencia son los
antígenos EfaAfs y EfaAfm producidos por E. faecalis y E. faecium, respectivamente. El
antígeno EfaAfs muestra una gran homología con ciertas adhesinas estreptocócicas,
como PsaA, SsaB, FimA o ScaA. Se cree que EfaAfs interviene en la adhesión de E.
faecalis a las células del endocardio mientras que aún se desconoce la función de
EfaAfm (Franz et al., 2003; Singh et al., 1998).
II.3.6.7. Carbohidratos de la pared celular y polisacáridos capsulares
Los componentes de las cápsulas bacterianas suelen jugar un papel importante
en la patogenia de las enfermedades infecciosas ya que debido a su complejidad y a su
capacidad para conferir resistencia a la fagocitosis pueden intervenir en los procesos de
evasión del sistema inmunitario del hospedador. Recientemente, se ha identificado el
operón (cpsABCDEFGHIJK) responsable de la biosíntesis del polisacárido capsular
más común entre los aislados clínicos de E. faecalis (Hancock y Gilmore, 2002). La
inactivación insercional de los genes cps origina mutantes con mayor sensibilidad a la
fagocitosis in vitro y menor capacidad para persistir en los ganglios linfáticos de
ratones (Hancock y Gilmore, 2002). Además, también se han purificado y
caracterizado otros polisacáridos capsulares presentes en la superficie de E. faecalis y
E. faecium, que poseen actividad opsonizante en ensayos in vitro e in vivo (Huebner et
al., 1999; 2000; Hufnagel et al., 2004). No obstante, se desconoce realmente la
implicación de las cápsulas de los enterococos en su posible patogenicidad ya que se
ha observado que las personas sanas poseen anticuerpos frente a polisacáridos
capsulares de distintos serotipos de E. faecalis (Hufnagel et al., 2005).
Introducción
98
II.3.6.8. Superóxido extracelular
Los enterococos tienen la peculiaridad de producir cantidades sustanciales de
superóxido, una característica particularmente asociada con aislados sanguíneos de E.
faecalis. Actualmente se conoce la ruta bioquímica que conduce a la producción de
superóxido en E. faecalis y se ha demostrado su producción in vivo en el colon de ratas
(Huycke et al., 2001). El superóxido producido por E. faecalis parece ejercer un fuerte
estrés oxidativo en el epitelio intestinal y, además, podría estar implicado en los
procesos de translocación a través de dicho epitelio y/o en la inestabilidad
cromosómica asociada a pólipos intestinales y cáncer colorectal (Huycke y Moore,
2002; Huycke et al., 2002).
II.3.7. Resistencia a antibióticos y mecanismos de transferencia
Los enterococos son intrínsecamente resistentes a muchos de los agentes
antimicrobianos empleados para tratar infecciones humanas aunque es más
preocupante su capacidad para adquirir y transferir resistencias (Mundy et al., 2000).
Estas bacterias están provistas de elegantes mecanismos de intercambio genético, a
través de los cuales han adquirido un alto nivel de resistencia a β-lactámicos,
aminoglucósidos y glucopéptidos (Rice, 2000; Walsh, 2000). Como se ha comentado
previamente, la adquisición de resistencias frente a gran parte de los antibióticos que se
están utilizando, unida a la fortaleza intrínseca de estos microorganismos, les concede
una ventaja selectiva para su persistencia en los ambientes hospitalarios (Shepard y
Gilmore, 2002). La Tabla II.9 muestra las principales resistencias a antibióticos
mostradas por los enterococos hasta la fecha.
Desde hace mucho tiempo, se conoce la resistencia (nivel bajo) de los
enterococos a los antibióticos β-lactámicos (Krogstad y Pargwette, 1980), así como el
hecho de que generalmente E. faecium es menos sensible que E. faecalis a este tipo de
agentes. Además, los enterococos pueden mostrar un nivel alto de resistencia a estos
antibióticos cuando la proteína de unión a penicilina (PBP5) está alterada y presenta
baja afinidad hacia las penicilinas (Ligozzi et al., 1996). En general, la producción de
Introducción
99
β-lactamasa por parte de estas bacterias es rara (Murray, 1992) aunque existen
evidencias genéticas que sugieren una posible adquisición de los determinantes
genéticos de dicha enzima a partir de S. aureus (Smith y Murray, 1992). Más
recientemente, se ha descrito un nuevo mecanismo de resistencia a β-lactámicos en E.
faecium en el que se evita la reacción de DD-transpeptidación que ocurre durante la
etapa final de la síntesis del peptidoglicano (Mainardi et al., 2000).
Por lo que respecta a la resistencia intrínseca a los aminoglucósidos, la de nivel
bajo se ha atribuido a la incapacidad de estos agentes para atravesar la membrana
celular de los enterococos mientras que la de nivel alto (muy común entre estas
bacterias) se debe a la producción de diversas enzimas modificadoras de
aminoglucósidos, entre las que destacan fosfotransferasas, acetiltransferasas y
nucleotidiltransferasas (Chow, 2000). En el caso particular de la estreptomicina, la
resistencia ocurre debido a un cambio en la estructura de la subunidad 30S del
ribosoma (Eliopoulos et al., 1984).
Las resistencias a niveles elevados de glucopéptidos (vancomicina,
teicoplanina y avoparcina) resultan de particular interés ya que la vancomicina es uno
de los últimos recursos para el tratamiento de infecciones originadas por bacterias
multirresistentes (Franz et al., 2003). Se producen a través de la adquisición de
elementos genéticos transponibles (fenotipos VanA, VanB, VanD, VanE y VanG) o
mediante un determinante cromosómico no transferible (fenotipo VanC) (Leclercq y
Courvalin, 1997). Entre estos cinco fenotipos, VanA y VanB son los más extendidos.
El VanA es particularmente prevalente en E. faecium y confiere resistencia cruzada a
vancomicina, teicoplanina y avoparcina. VanB confiere resistencia a niveles variables
de vancomicina pero no frente a la teicoplanina. El gen vanC se localiza en
enterococos con motilidad (E. gallinarum, E. casseliflavus y E. flavescens), a los que
confiere resistencia a bajos niveles de vancomicina. Finalmente los fenotipos VanD,
VanE y VanG parecen de menor relevancia clínica y sólo se han detectado en algunas
cepas de E. faecium y E. faecalis (Dutka-Malen et al., 1995; Kayser, 2003; Klare et al.,
2003; McKessar et al., 2000). Aunque se ha descrito la transferencia de genes de
resistencia a vancomicina a una cepa probiótica de E. faecium (Lund y Edlund, 2001),
Introducción
100
otras cepas se han mostrado totalmente incapaces para participar en procesos de
conjugación (Eaton y Gasson, 2001). En este sentido, Franz et al. (2003) consideran
que, en muchos estudios, las tasas de transferencia de genes a cepas de E. faecium son
muy exageradas ya que las condiciones en las que se realizan los experimentos no son
representativas de las que pueden existir en ambientes naturales. No obstante, se trata
de un tema del que habrá que estar muy pendiente en los próximos años, como
demuestra el reciente aislamiento de cepas de S. aureus resistentes a vancomicina
mediante mecanismos transferibles similares a los existentes en los enterococos
(Weigel et al., 2003).
En Europa, los principales reservorios de enterococos resistentes a vancomicina
(VRE, del Inglés "Vancomycin Resistant Enterococci") parecen ser los animales de
abasto. El empleo durante algunas décadas de dosis subterapeúticas de avoparcina
como promotor del crecimiento ha contribuido a su aparición y expansión ya que la
resistencia frente a este agente confiere resistencia cruzada a la vancomicina (Wegener
et al., 1997). En este sentido, Jensen et al. (1999) aislaron cepas de E. faecium
resistentes a vancomicina a partir de cerdos y de pacientes hospitalizados en
Dinamarca y observaron que aislados de ambas fuentes mostraban perfiles de campo
pulsado similares. No obstante, en Europa las infecciones con VRE son raras. Por el
contrario, en EE.UU. donde no se empleó la avoparcina en alimentación animal, es
difícil detectar VRE en animales, alimentos derivados o en humanos sanos (Hayes et
al., 2003). Sin embargo, en dicho país, el empleo de vancomicina en terapéutica
humana ha favorecido la diseminación de VRE en los ambientes hospitalarios,
constituyendo una de las principales causas de infección en pacientes
inmunodeprimidos o con enfermedades subyacentes (Kayser, 2003; Lund et al., 2002).
Introducción
101
Tabla II.9. Principales resistencias adquiridas a antibióticos en enterococos Antibiótico Genes de resistencia Espectro de resistencia Penicilinas pbp5
blaZ penicilinas y cefalosporinas penicilinas
Aminoglicósidos aph(2’’)-Ib aph(2’’)-Ic aph(2’’)-Id aph(3’)-IIIa aac(6’)-Ie + aph(2’’)-Ia aac(6’)-Ii ant(4’)-Ia ant(6)-Ia ant(3’’)-Ia ant(9)-Ib mutaciones en genes 30S rRNA
G, T, K, N, D G, T, K, D G, T, K, N, D K Todos excepto STR T, K, N, SIS T, A, K, D STR STR STR STR
Glicopéptidos Operón vanA Operón vanB vanB+pbp5 Operón vanC1 Operón vanC2/3 Operón vanD Operón vanE Operón vanG Mutación gen ddl
V, TPL, AVO (nivel alto) V, (AVO) V, AMP V (bajo) V (bajo) V (moderado), TPL (moderado-bajo) V (moderado) V (moderado) Asociado a cepas vanB+
Macrólidos ermB mef(A) msrC
AZT, CLR, L y CLI (alto); StrB E, AZT y CLR (bajo) lincosamidas y StrB macrólidos, lincosamidas y StrB
Lincosamidas lnu(B) L, CLI Estreptograminas lsa
vat(E) vat(D) vat(A) erm(B) vgb(A)
Lincosamidas, StrA, StrA/B StrA StrA, Q/D, VIR StrA, Q/D, VIR StrB, Q/D StrB, Q/D, VIR
Cloranfenicol catpIP501 catpSC7 catpC194 catpC221
Cm Cm Cm Cm
Tetraciclinas tet(K) tet(L) tet(M) tet(O), tet(S) tet(U)
TET TET TET, MIN TET, MIN TET, MIN
Quinolonas gyrA, parC quinolonas Oxazolidinonas G2576T linezolida Everninomicinas emtA EVE, AVI
Abreviaturas: A, amikacina; AMP, ampicilina; AVI, avilamicina; AVO, avoparcina; AZT, azitromicina;
CLI, clindamicina; CLR, claritromicina; Cm, cloranfenicol; D, dibekacina; E, eritromicina; EVE,
evernimicina; G, gentamicina; K, kanamicina; L, lincomicina; MIN, minociclina; N, netilmicina; Q/D,
quinupristina/dalfopristina; SIS, sisomicina; STR, estreptomicina; StrA, estreptograminas tipo A; StrB,
estreptograminas tipo B; T, tobramicina; TET, tetraciclinas; TPL, teicoplanina; V, vancomicina; VIR,
virginiamicina. Fuente: Klare et al. (2003).
Introducción
102
II.3.8. Aplicaciones de los enterococos en los quesos
Los enterococos se encuentran en numerosos alimentos fermentados
tradicionales, entre ellos en una gran variedad de quesos elaborados en países
mediterráneos a partir de leche cruda o pasterizada, en los que representan una parte
importante de la microbiota (Centeno et al., 1996; Coppola et al., 1988; Fernández del
Pozo et al., 1988; García et al., 2002; Litopoulou-Tzanetaki, 1990; Menéndez et al.,
1998; Núñez y Martínez Moreno, 1976; Ordóñez et al., 1978; Pérez-Elortondo et al.,
1999; Poullet et al., 1993; Tzanetakis y Litopoulou-Tzanetaki, 1992). Su contribución
al desarrollo de las características sensoriales ha sido puesta de manifiesto en distintas
variedades de queso y, de hecho, se han empleado como integrantes de cultivos
iniciadores (Centeno et al., 1999; Coppola et al., 1988, 48, Litopoulou-Tzanetaki et al.,
1993; 69, Sarantinopoulos et al., 2002a). Sin embargo, otros trabajos indican que
niveles altos de enterococos en queso pueden deteriorar las propiedades organolépticas
del producto (López-Díaz et al., 1995; Thompson y Marth, 1986). El interés en la
aplicación de los enterococos en leche y productos lácteos se ha renovado por la
producción, en algunas cepas, de enterocinas activas frente a bacterias patógenas o
alterantes, así como por sus propiedades probióticas. Su utilización, fundamentalmente
como cultivos adjuntos, se ha orientado hacia su contribución a la mejora de las
propiedades organolépticas y de la calidad microbiológica del queso.
El hábitat natural de los enterococos es el tracto gastrointestinal del hombre y
los animales (Franz et al., 1999). Se encuentran además en agua, suelo, vegetales,
insectos, etc. Su ubicuidad, supervivencia y persistencia en distintos ambientes están
favorecidas por su elevada resistencia a condiciones adversas (pH, temperatura,
salinidad, etc.), que les permite mantenerse o multiplicarse en diversos sustratos. Por
ello, sobreviven a las condiciones habituales de producción de alimentos y pueden
contaminar el producto durante su procesado.
La presencia de enterococos en productos lácteos se consideró durante mucho
tiempo como una consecuencia directa de la falta de higiene durante la producción y
procesado de la leche. Los enterococos contaminarían la leche, bien por contacto
directo con material fecal de origen animal o humano, o bien indirectamente a través
Introducción
103
del agua, de la superficie del animal o de equipos e instalaciones contaminadas
(Gelsomino et al., 2001; 2002). Sin embargo, deben ser considerados como parte de la
microbiota natural de la leche y de una amplia variedad de productos lácteos, a los que
también se pueden incorporar durante su elaboración (Giraffa, 2003). El hecho de que
los enterococos formen parte de la microbiota natural de la glándula mamaria humana
durante el periodo de lactancia (Heikkilä y Saris, 2003; Martín et al., 2003; Ng et al.,
2004) abre nuevas perspectivas sobre el posible origen de los enterococos que se
encuentran en la leche y productos lácteos.
Los niveles de enterococos en el queso varían en función de la contaminación
de la leche, la supervivencia en el ambiente de la quesería y las condiciones
particulares de elaboración y maduración de cada variedad (Foulquié Moreno et al.,
2006). La presencia y multiplicación de los enterococos en el queso resulta favorecida
por su elevada adaptabilidad a diversos sustratos y a condiciones ambientales adversas,
incluida la pasteurización, que les permite soportar las condiciones habituales de la
fabricación y convertirse en parte importante de la microbiota fermentadora del
producto. Se ha descrito la presencia de enterococos en numerosas variedades de queso
de leche cruda o pasterizada (Tabla II.10) en niveles de 104-106 ufc/g en la cuajada
hasta 105-107 ufc/g en queso maduro, donde pueden convertirse en el grupo
microbiano predominante (Centeno et al., 1996, Coppola et al., 1988; Fontecha et al.,
1990; Núñez y Martínez Moreno, 1976; Ordóñez et al., 1978). El 17% de un total de
4379 aislados de 35 productos lácteos, en su mayoría quesos elaborados con leche
cruda, fueron identificados como Enterococcus por Cogan et al. (1997). La especie
aislada con mayor frecuencia es E. faecalis (Andrighetto et al., 2001; Arizcun et al.,
1997; Centeno et al., 1996, 26, Suzzi et al., 2000), seguida de E. faecium y E. durans,
más abundantes en algunos quesos como Feta y Kefalotyri (Litopoulou-Tzanetaki,
1990; Tzanetakis y Litopoulou-Tzanetaki, 1992). E. casseliflavus también ha sido
descrito como predominante en leche y queso (Gelsomino et al., 2001; 2002).
El papel de los enterococos en la maduración del queso es controvertido. Si
bien en los quesos industriales frescos o tiernos, elaborados con leche pasterizada y
cultivos iniciadores, la existencia de elevadas concentraciones de enterococos suele
conducir a la alteración de sus propiedades organolépticas (Franz et al., 1999; Giraffa
Introducción
104
y Carminati, 1997), numerosos estudios han demostrado que estas bacterias pueden
ejercer una influencia muy positiva en muchos de los quesos tradicionales. Así, se ha
demostrado el potencial de los enterococos para su empleo como cultivos iniciadores o
adjuntos en quesos Cheddar (Dahlberg y Kosikowski, 1948; Jensen et al., 1975), Feta
(Litopoulou-Tzanetaki et al., 1993; Sarantinopoulos et al., 2002a), Cebreiro (Centeno
et al., 1999) y Mozzarella (Parente et al., 1989; Villani y Coppola, 1994), entre otros.
En la mayoría de estos estudios, el empleo de enterococos se asoció a un aumento de la
proteolisis, el contenido en ácidos grasos volátiles libres, diacetilo y acetoína, entre
otros compuestos, así como a una mejora de las propiedades organolépticas de los
quesos.
Tabla II.10. Principales estudios sobre enterococos realizados en quesos españoles
Tipo de queso Especie Referencia
Armada Cabra Tornadijo et al. (1995)
Arzúa Vaca Centeno et al. (1995)
Casar de Cáceres Oveja Poullet et al. (1993)
Cebreiro Vaca Centeno et al. (1996; 1999); Menéndez et al.
(1998)
Idiazábal Oveja Arizcun et al. (1997)
La Serena Oveja Fernández del Pozo et al. (1988)
Majorero Cabra Fontecha et al. (1990)
Manchego Oveja Núñez y Martínez Moreno (1976); Ramos et al.
(1981)
Roncal Oveja Arizcun et al. (1997)
San Simón Vaca García et al. (2002)
Queso de Tenerife Cabra Zárate et al. (1997)
Tetilla Vaca Menéndez et al. (2001)
El número de cepas diferentes en los cultivos iniciadores disponibles
comercialmente es limitado, por lo que existe un interés considerable en el aislamiento
Introducción
105
de cepas nuevas a partir de orígenes naturales como leche cruda, quesos artesanales o
plantas (Cogan et al., 1997; Wouters et al., 2002). Por otra parte, existe una demanda
creciente por los consumidores de productos de calidad, con características
organolépticas mejoradas. Los enterococos son parte importante de la microbiota
secundaria de muchas variedades de queso, con potencial para desarrollar propiedades
organolépticas atractivas y/o con capacidad para inhibir el crecimiento de bacterias
patógenas y alterantes, por lo que se ha sugerido que su papel en la maduración del
queso debería ser reevaluado (Cogan et al., 1997; Giraffa et al., 1997).
II.3.8.1. Características tecnológicas de los enterococos
De entre todas las propiedades bioquímicas de los enterococos, se revisarán a
continuación las que se consideran de mayor relevancia en relación con su aptitud
tecnológica para la elaboración de productos lácteos fermentados.
II.3.8.1.1. Actividad acidificante
La capacidad de producir ácido en las primeras fases de elaboración del queso
es probablemente la propiedad más importante de los cultivos iniciadores. El descenso
de pH contribuye a la expulsión del suero y reduce el contenido en humedad, factores
que previenen el desarrollo de la microbiota alterante (Cogan et al., 1997). En general,
los enterococos se caracterizan por una actividad acidificante baja cuando crecen en
leche. Ni siquiera las cepas aisladas de queso poseen la capacidad de bajar rápidamente
el pH de la leche para alcanzar valores tecnológicamente adecuados. Así, por ejemplo,
Andrighetto et al. (2001) registraron valores de pH en leche inferiores a 5,2, tras una
incubación de 16 h a 37ºC, únicamente con el 20% de las 124 cepas aisladas de quesos
italianos analizadas. Otros trabajos con enterococos de origen lácteo confirman estos
resultados, con solo un pequeño porcentaje de cepas capaces de alcanzar en leche
valores de pH inferiores a 5,0-5,2 tras 16-24 h a 37ºC (Abeijón et al., 2006; Durlu-
Ozkaya et al., 2001; Sarantinopoulos et al., 2001a). Los aislados de E. faecalis
presentan un mayor potencial acidificante en comparación con E. faecium y E. durans
(Suzzi et al., 2000).
Introducción
106
Esta deficiente capacidad acidificante en leche de los enterococos determina
que no se puedan considerar como cultivos iniciadores adecuados en la fabricación del
queso (Huggins y Sandine, 1984), sino tan sólo como cultivos adjuntos al iniciador.
II.3.8.1.2. Actividad proteolítica
La hidrólisis de las caseínas juega un papel esencial en el desarrollo de la
textura del queso. Además, contribuye decisivamente al aroma y sabor de este
producto, a través de los péptidos y de los aminoácidos liberados, que pueden así ser
degradados posteriormente, dando lugar a la formación de cientos de compuestos
aromáticos (Parente y Cogan, 2004). Los agentes fundamentales de esta proteolisis son
las enzimas proteolíticas endógenas de la leche, el coagulante utilizado en la
fabricación, así como las proteinasas de pared y las peptidasas intracelulares de las
bacterias lácticas que se liberan tras su lisis.
En general, la actividad proteinásica y peptidásica de los enterococos se
considera baja, siendo entre ellos superior en la especie E. faecalis (Andrighetto et al.,
2001; Arizcun et al., 1997; Consentino et al., 2004; Macedo y Malcata, 1997; Suzzi et
al., 2000; Tsakalidou et al., 1994; Villani y Coppola, 1994). Los enterococos aislados
de alimentos tienen, dentro de su escasa actividad, mayor capacidad proteolítica que
los aislados de muestras veterinarias o humanas (Sarantinopoulos et al., 2001a). No
obstante, esta característica depende notablemente de la cepa analizada y de las
condiciones del ensayo. Se han encontrado diferencias considerables en la actividad
proteolítica incluso entre los enterococos procedentes de una misma variedad de queso
(Cogan et al., 1997).
Los estudios realizados con enterococos han puesto de manifiesto que no
poseen una actividad proteolítica extracelular destacable, excepto algunos aislados
pertenecientes a la especie E. faecalis var. liquefaciens (Dovat et el., 1970; García de
Fernando et al., 1991). Sin embargo un desarrollo excesivo de cepas de esta especie da
lugar a defectos en el queso, fundamentalmente un sabor amargo y una textura blanda,
como consecuencia de una intensa actividad proteolítica (Cantoni et al., 2000).
Introducción
107
En algunas cepas de E. faecium de origen lácteo se ha observado una destacable
actividad peptidásica, a pesar de que su actividad proteolítica era escasa (Andrighetto
et al., 2001; Ayad et al., 2004). Esta actividad peptidásica se considera interesante para
la elaboración de productos lácteos (Ayad et al., 2004), dado que el catabolismo de los
aminoácidos tiene un papel fundamental en la formación del aroma.
El aumento de la concentración de aminoácidos, por otra parte, puede tener
implicaciones negativas en la seguridad de los consumidores. Esto se debe a que su
descarboxilación conduce a la formación de aminas biógenas, fundamentalmente
tiramina e histamina, en el queso. Estas aminas biógenas se relacionan con problemas
toxicológicos en individuos susceptibles cuando se encuentran en concentraciones
elevadas en los alimentos (Ten Brink et al., 1990). Muchas bacterias lácticas poseen
aminoácido descarboxilasas y producen aminas biógenas a partir de los aminoácidos
libres en quesos cuando tiene lugar una proteolisis muy elevada (Leuschner et al.,
1998). Sin embargo, el contenido en aminas biógenas de los quesos es muy variable y
depende de la variedad, del periodo de maduración, del proceso de elaboración y de la
microbiota presente.
La capacidad para producir tiramina está ampliamente distribuida entre los
enterococos (Bover-Cid y Holzapfel, 1999; Consentino et al., 2004; Delgado y Mayo,
2002; Le Jeune et al., 1995) pero no es exclusiva de los aislados de origen lácteo. Esta
propiedad metabólica está también presente en cepas de origen humano y veterinario
(Sarantinopoulos et al., 2001a). Los enterococos tienen escasa o nula capacidad para
descarboxilar otros aminoácidos distintos a la tirosina. Así, por ejemplo, la facultad de
los enterococos para generar histamina parece ser bastante inferior a la de algunas
bacterias Gram-negativas (Tham, 1988). Por lo tanto, se han considerado poco
relevantes en cuanto a una posible intoxicación histaminérgica como consecuencia de
consumo de queso (Tham et al., 1990). La formación de tiramina requiere unas
condiciones ambientales adecuadas, como las que se encuentran en muchos alimentos
fermentados o alterados (Bover-Cid y Holzapfel, 1999). Por el contrario, las
condiciones existentes en las mucosas humanas distan mucho de ser adecuadas para su
formación. Por este motivo, es lógico pensar que los problemas toxicológicos
asociados a las aminas biógenas derivan del consumo de alimentos en los que se han
Introducción
108
formado y acumulado y no de la ingestión de cepas potencialmente formadoras de
estos compuestos.
II.3.8.1.3. Actividad lipolítica
La hidrólisis de la grasa láctea se debe, de forma análoga a la proteolisis, a la
acción de la lipasa de la leche, las enzimas lipolíticas de la microbiota y, según la
variedad de queso, las esterasas pregástricas añadidas. Las esterasas y lipasas de los
enterococos participan, por tanto, en el desarrollo del aroma y sabor de los quesos
mediante la liberación de ácidos grasos que, especialmente en el caso de los de cadena
corta, pueden ser convertidos en otros compuestos con gran intensidad aromática y
sápida, como metilcetonas, lactonas y tioésteres. Por otra parte, hay que tener en
cuenta que los ácidos grasos libres son susceptibles a la oxidación, originando así otros
compuestos que modifican notablemente el aroma del queso, como los aldehídos
insaturados. La lipolisis es limitada (<1.5%) en quesos de tipo Suizo y semiduros y
elevada (5-25%) en Parmigiano Reggiano, Pecorino y otros quesos italianos, quesos
madurados con mohos o quesos de cabra (Beuvier y Buchin, 2004). Aunque los
fenómenos de lipólisis no están directamente involucrados en la reología del queso, los
glicéridos parciales resultantes son sustancias tensioactivas que influyen en la
organización molecular y, por tanto, ejercen un efecto adicional sobre la textura.
A pesar de que las bacterias lácticas, en general, se han considerado
tradicionalmente poco lipolíticas, algunos autores (Macedo y Malcata, 1997;
Tsakalidou et al., 1994) han constatado que los aislados de Enterococcus poseen una
mayor actividad lipolítica que otras bacterias lácticas. Por otra parte, las actividades
esterásica y lipásica de los enterococos dependen de la cepa, de las condiciones de
crecimiento y de las condiciones del ensayo (Carrasco de Mendoza et al., 1992).
Dentro del género Enterococcus, se observa mayor actividad lipolítica y
esterolítica en E. faecalis que en E. faecium o E. durans (Sarantinopoulos et al.,
2001a). Los enterococos hidrolizan tributirina, exhibiendo E. faecalis mayor actividad,
mientras que los aislados de E. faecium son más activos frente a los sustratos sintéticos
que emplean habitualmente para ensayar la actividad esterásica (Sarantinopoulos et al.,
Introducción
109
2001a). Algunos autores han puesto en evidencia que los enterococcos aislados de
ciertas variedades de queso, como Semicotto Caprino o Fiore Sardo, no muestran
actividad lipolítica cuando se emplea tributirina como sustrato (Consentino et al.,
2004; Suzzi et al., 2000). Es conveniente señalar que, hasta la fecha, se desconoce con
exactitud hasta qué punto se pueden extrapolar los resultados sobre la actividad
lipolítica obtenidos empleando sustratos artificiales (tributirina o esteres de ácidos
grasos con compuestos cromogénicos) a lo que ocurre en la realidad, en un sustrato
mucho más complejo como la grasa de la leche, compuesta de una gran variedad de
triacilglicéridos.
Por otra parte, algunos estudios han revelado que no existe una única enzima
responsable de la actividad lipolítica, sino que las bacterias disponen de un sistema
esterásico bastante complejo. La detección de actividad esterásica en algunos aislados
de E. faecalis, E. faecium y E. durans, tras la separación de las proteínas intracelulares
mediante electroforesis en condiciones no desnaturalizantes, ha puesto en evidencia la
existencia de hasta cinco bandas con distinta especificidad (Abeijón et al., 2006;
Sarantinopoulos et al., 2001a).
II.3.8.1.4. Metabolismo del citrato
La utilización de citrato por las bacterias lácticas es otra característica
tecnológica de interés, ya que da lugar a compuestos del aroma y sabor, como
diacetilo, acetaldehido, acetoína o 2,3-butanodiol (Hughenholtz, 1993), y dióxido de
carbono que contribuye a la textura de algunos productos lácteos fermentados (Kimoto
et al., 1999). Esta capacidad siempre está ligada a la presencia de plásmidos que
contienen el gen que codifica el transportador del citrato presente en el medio hacia el
interior de la célula (Bandell et al., 1998). El metabolismo del citrato ha sido estudiado
con gran detalle en Lactococcus, Leuconostoc y Lactobacillus (Hughenholtz, 1993;
Palles et al., 1998), pero el conocimiento es bastante más limitado en el género
Enterococcus (Coventry et al., 1978; Parente y Hill, 1992; Sarantinopoulos et al.,
2001b). Sin embargo, en algunas cepas de E. faecalis y E. faecium se ha comprobado
la producción de acetaldehído, etanol, diacetilo y acetoína cuando crecen en leche, lo
Introducción
110
que avala su posible participación en la formación del aroma y sabor del queso
(Andrighetto et al., 2001; Sarantinopoulos et al., 2001a).
La mayoría de las bacterias lácticas son capaces de metabolizar citrato, aunque
se ha comprobado que existe cierta diversidad en relación con esta capacidad para
utilizar el citrato. Tradicionalmente se ha considerado que los enterococos requieren la
presencia de otra fuente alternativa de energía, como glucosa o lactosa, para
metabolizar el citrato (Freitas et al., 1999; Sarantinopoulos et al., 2003). Sin embargo,
en algunos casos se ha comprobado que aunque el citrato puede metabolizarse en
presencia de lactosa, no ocurre lo mismo si en el medio existe glucosa o fructosa
(Sarantinopoulos et al., 2001b). Esto se debe a que la glucosa (o, en su caso, la
fructosa) ejerce represión por catabolito en el metabolismo del citrato; es decir, el
citrato presente en el medio sólo comienza a metabolizarse una vez agotada la glucosa
(o la fructosa) del medio. Otros azúcares como la galactosa y la sacarosa, en cambio,
no tienen el mismo efecto (Rea y Cogan, 2003a; 2003b). Aunque se han caracterizado
numerosos aislados de E. faecalis (Sarantinopoulos et al., 2001a) y E. faecium
(Abeijón et al., 2006) capaces de metabolizar citrato, esta propiedad está más
ampliamente difundida en E. durans (Consentino et al., 2004).
Recientemente se han aportado pruebas concluyentes sobre la importancia del
metabolismo del citrato que llevan a cabo los enterococos durante la elaboración de
queso. Los niveles de diacetilo y acetoína en el queso Cebreiro elaborado con E.
faecalis eran superiores a los del queso elaborado sin la participación de enterococos
(Centeno et al., 1999). El catabolismo del citrato presente en la leche podría, en
consecuencia, explicar el papel de los enterococos en el desarrollo de las características
organolépticas propias de los quesos mediterráneos (Foulquié Moreno et al., 2006).
Esto ha motivado la inclusión de estos microorganismos en los cultivos iniciadores de
algunas variedades (Litopoulou-Tzanetaki et al., 1993; Parente et al., 1989).
II.3.8.1.5. Producción de bacteriocinas
Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos activos frente a otras bacterias
generalmente próximas filogenéticamente a la cepa productora. Debido a su naturaleza
Introducción
111
peptídica las bacteriocinas pueden ser degradadas por enzimas digestivas, resultando
inocuas para el hombre y su microbiota intestinal. Además, sus propiedades
fisicoquímicas confieren a estos compuestos resistencia a los tratamientos térmicos y
gracias a su pequeño tamaño pueden difundir con relativa facilidad en los alimentos.
Las bacteriocinas de las bacterias lácticas presentan un gran interés para su uso en
quesería como bioconservantes. La nisina, producida por algunas cepas de lactococos,
es la más estudiada y se emplea actualmente como conservante en más de 40 países
(Rodríguez, 1996).
La producción de bacteriocinas es una propiedad muy extendida entre los
enterococos (Giraffa, 1995), siendo muchas de ellas activas frente a Listeria
monocytogenes. Este hecho podría deberse, al menos parcialmente, no sólo a la
estrecha relación filogenética existente entre Enterococcus y Listeria (Stackebrandt y
Teuber, 1988), sino también a que se encuentran con frecuencia en los mismos nichos
ecológicos (Rodríguez et al., 1997). Desde que en 1955 se describió la primera
sustancia tipo bacteriocina en los entonces denominados estreptococos del grupo D
(Kjems, 1955), se han publicado numerosos estudios reclamando la detección,
caracterización y/o identificación de enterocinas, un tema que ha sido revisado
recientemente por Foulquié Moreno et al. (2006). La primera enterocina que se
purificó a homogeneidad fue la enterocina AS-48 producida por un enterococo de
origen humano (E. faecalis S-48) (Gálvez et al., 1989). La mayor parte de las
bacteriocinas de enterococos pertenecen a las subclases IIa (familia de la pediocina) y
IIc (bacteriocinas con características singulares que no pueden incluirse en ninguno de
los otros grupos descritos). Pero también se ha descrito la producción de una
bacteriocina de la clase I (lantibióticos) con actividad hemolítica, y de bacteriocinas de
la clase III (bacteriocinas de gran tamaño molecular), como la enterolisina A (2003a).
La producción de enterocinas se ha detectado en cepas aisladas de muy diversas
fuentes incluyendo no sólo alimentos (queso, carne, pescado y vegetales), sino también
animales y el hombre. Es frecuente que una misma enterocina se identifique en
enterococos de distintos orígenes y especies, como se recoge en el trabajo publicado
por Foulquié Moreno et al. (2003a). Así, se han aislado enterococos productores de
enterocina AS-48 de leche cruda (Rodríguez et al., 2000), comprobándose que es una
Introducción
112
bacteriocina muy frecuente en enterococos y que la producen tanto E. faecalis como E.
faecium (Joosten et al., 1997). Son numerosos los autores que han aislado cepas de E.
faecium bacteriocinogénicas de productos lácteos (Ennahar et al., 2001; Farias et al.,
1996; Giraffa et al., 1995a; Parente y Hill, 1992; Vlaemynck et al., 1994).
Dado que la capacidad de producir bacteriocinas es una propiedad relevante,
tanto desde el punto de vista higiénico-sanitario como desde el tecnológico, la
aplicación de cepas productoras de enterocinas en forma de cultivos y/o de las propias
enterocinas ha despertado gran interés. Este interés se ha traducido en diversos
estudios que, en general, han demostrado la eficacia de este enfoque para mejorar la
calidad microbiológica de los quesos (Tabla II.11). No obstante, todavía no se conoce
bien la funcionalidad de tales cepas (y/o de sus bacteriocinas) tras un escalado
industrial, aspecto que se deberá evaluar en los próximos años (Foulquié Moreno et al.,
2006).
Tabla II.11. Estudios de aplicación de enterocinas como agentes bioconservantes en
quesos
Cepa Enterocina Aplicación Referencia E. faecalis B114 Desconocida Camembert Sulzer y Busse (1991) E. faecium 7C5 Enterocina 7C5 Taleggio Giraffa y Carminati (1997)E. faecalis INIA 4 Enterocina 4 Manchego Joosten et al. (1995) E. faecalis INIA 4 Enterocina 4 Manchego Núñez et al. (1997) E. faecium CCM 4231
Enterocina CCM 4231
Saint-Paulin Lauková et al. (2001)
E. faecalis TAB 28 Enterocina AS-48 Hispánico Rodríguez et al. (2001) E. faecium FAIR-E 198
Enterocinas A y/o P
Feta Sarantinopoulos et al. (2002b)
E. faecium RZS C5 Enterocina RZS C5
Cheddar Foulquié Moreno et al. (2003b)
E. faecium DPC 1146
Enterocina DPC 1146
Cheddar Foulquié Moreno et al. (2003b)
E. faecium TAB 52 Enterocina I Queso de leche cruda
Arqués et al. (2005); Rodríguez et al. (2005)
Introducción
113
II.3.8.2. Los enterococos como cultivos adjuntos en la maduración
En numerosos trabajos se ha propuesto la inclusión de enterococos en los
cultivos iniciadores empleados para la elaboración de numerosas variedades de quesos,
como Cheddar (Dahlberg y Kosikowski, 1948; Jensen et al., 1975), Feta (Litopoulou-
Tzanetaki et al., 1993; Sarantinopoulos et al., 2002a), Cebreiro (Centeno et al., 1996;
Centeno et al., 1999) y Mozzarella (Coppola et al., 1988; Perente et al., 1989; Villani y
Coppola, 1994). En todos los casos se ha empleado E. faecalis, excepto en Feta, donde
se han ensayado E. faecium y E. durans, las especies mayoritarias en ese tipo de queso
(Litopoulou-Tzanetaki et al., 1993; Sarantinopoulos et al., 2002a).
El empleo de E. faecalis como adjunto al cultivo iniciador comercial para la
fabricación de queso Cheddar mejoró en varios estudios la calidad del sabor, además
de reducir el periodo de maduración, comprobándose un aumento de la proteolisis y de
los niveles de compuestos volátiles (Dahlberg y Kosikowski, 1948; Jensen et al.,
1975). Esto mismo se observó también cuando se utilizó una cepa probiótica de E.
faecium en la elaboración de este tipo de queso (Gardiner et al., 1999). Más
recientemente, cepas de E. durans y E. faecium se han empleado en la elaboración de
Feta comprobándose una mayor proteolisis y lipolisis (Litopoulou-Tzanetaki et al.,
1993; Sarantinopoulos et al., 2002a). En queso Cebreiro se confirmó, además, una
mayor concentración de diacetilo y acetoína al emplear enterococos en su fabricación
(Centeno et al., 1999). Todos estos ejemplos confirman la ventaja de incluir
enterococos como adjuntos al cultivo iniciador para la fabricación de diversas
variedades de queso.
El efecto lítico de las bacteriocinas abre las puertas a una interesante aplicación
que consiste en la aceleración de la maduración del queso, al potenciar la liberación de
enzimas intracelulares del cultivo iniciador que contribuyan a la proteolisis y la
lipolisis secundarias. Como consecuencia, aumentaría la concentración de aminoácidos
y ácidos grasos libres y, en última instancia, incrementaría el sabor y aroma del queso.
De hecho, la presencia de la enterocina AS-48, producida por E. faecalis INIA 4,
durante la elaboración de queso Hispánico potenció la proteolisis, aumentó la
concentración de diversos compuestos volátiles y condujo a un desarrollo más rápido
Introducción
114
del aroma y sabor. Además, un panel de catadores otorgó al queso elaborado mejor
puntuación de calidad e intensidad de sabor (Garde et al., 1997; Oumer et al., 2001).
II.3.8.3. Los enterococos en bioprotección
Otro aspecto relevante del empleo de enterococos en la elaboración de queso
sería su papel como bioconservantes o bioprotectores. Es evidente el interés que existe
en la industria alimentaria por el control de la vida útil y la seguridad de los alimentos
mediante la aplicación de métodos naturales y/o menos drásticos que permitan obtener
productos de la máxima calidad, no sólo desde el punto de vista higiénico sino también
desde el nutritivo y organoléptico. En la elaboración de distintos tipos de quesos se ha
investigado la utilidad de emplear diversas enterocinas, bien mediante la producción in
situ por un cultivo iniciador o adjunto o bien añadidas como aditivo. Este es un aspecto
relevante considerando que la leche cruda es buen sustrato para la producción de
enterocinas, por lo que las cepas bacteriocinogénicas contarían con una ventaja
adaptativa para competir con la microbiota nativa (Rodríguez et al., 1997). Varios
autores han confirmado la producción de enterocinas durante la elaboración de queso,
así como su estabilidad durante la maduración del mismo (2003b; Giraffa y Carminati,
1997; Giraffa et al., 1995b; Núñez et al., 1997). En dos cepas de E. faecium (RZS C5 y
DPC 1146), empleadas como cultivos adjuntos para la elaboración de queso Cheddar,
no sólo se detectó la producción de enterocina desde el principio de la fermentación,
sino que dicha bacteriocina persistió en el producto durante todo el periodo de
maduración (2003b). La producción de enterocinas se ha comprobado también en otras
variedades de queso como, por ejemplo, Manchego y Taleggio (Giraffa et al., 1995b;
Núñez et al., 1997; Rodríguez et al., 2001). Es de destacar que el empleo de E. faecium
y E. faecalis puede controlar el crecimiento de L. monocytogenes en estas dos
variedades de queso. En el caso del queso Taleggio, E. faecium 7C5 evitó por
completo el crecimiento en superficie del patógeno (Giraffa y Carminati, 1997) y en
queso Manchego elaborado con E. faecalis INIA 4 se consiguieron reducciones de L.
monocytogenes de 3 unidades logarítmicas a las 8 h y de 6 unidades logarítmicas a los
7 d de la elaboración (Núñez et al., 1997). Sin embargo, en queso Feta elaborado con
E. faecium FAIR-E 198 como adjunto no se detectó bacteriocina activa
(Sarantinopoulos et al., 2002b).
Introducción
115
La adición directa de un preparado de bacteriocina parece que puede ser incluso
más efectiva que el empleo de cultivo iniciador. Esto es lo que se ha comprobado
durante la elaboración de un queso de cabra, donde se consiguió reducir la población
de L. monocytogenes hasta 9 unidades logarítmicas al final de la maduración mediante
el empleo de enterocina CRL35 (Farias et al., 1999). También la enterocina CCM 4231
inhibió al patógeno durante la elaboración de queso Saint-Paulin (Lauková et al.,
2001).
Las limitaciones que puede tener del uso de bacteriocinas son, por una parte, su
espectro inhibitorio reducido, su naturaleza proteica, que les hace susceptibles de
interaccionar con enzimas proteolíticas o con otras proteínas, y su carácter
generalmente hidrofóbico, que permite que puedan interaccionar con la grasa de los
productos lácteos. Todo esto hace que disminuya su eficacia. Otra limitación de las
bacteriocinas es la aparición de resistencias en los microorganismos diana. Entre las
soluciones planteadas para paliar estas limitaciones y potenciar el efecto
antimicrobiano se encuentra la aplicación de diversos tratamientos combinados. Este
tipo de tratamientos tienen una gran eficacia para mejorar la calidad higiénica del
queso, como se ha demostrado en varias ocasiones. Por ejemplo, en queso Hispánico
elaborado con E. faecium TAB 52 (productor de enterocina I) o con E. faecalis TAB
28 (productor de enterocina AS-48) como adjuntos al cultivo iniciador, la aplicación
de tratamientos de altas presiones inactivó totalmente a L. monocytogenes (Arqués et
al., 2005) y E. coli O157:H7 (Rodríguez et al., 2005).
II.4. EL QUESO
El queso se puede definir sencillamente como el producto fresco o madurado
obtenido mediante la coagulación de la leche de ciertos mamíferos y la posterior
separación del suero. Es difícil situar con exactitud el origen de este producto ya que es
muy anterior a la tradición escrita, pero es muy probable que los primeros quesos
surgieran como consecuencia de la acidificación causada por el crecimiento natural de
las bacterias lácticas durante el almacenamiento de la leche. Además, las dos
fracciones resultantes, la cuajada y el suero, se podían aprovechar como alimento. El
Introducción
116
empleo de estómagos animales para transportar y almacenar la leche permitió obtener
una cuajada formada gracias a la acción conjunta de las enzimas presentes en las
paredes del estómago y de la acidificación de las bacterias contaminantes. En estas
cuajadas la sinéresis era mucho mejor que en las obtenidas únicamente por
acidificación y permitía obtener un producto con menor contenido de humedad y, por
lo tanto, más estable. La transformación de la leche en queso es, por ello, una forma de
bioconservación: la proteína de la leche y su grasa se concentran unas diez veces, al
eliminarse el agua en forma de suero, y la lactosa se transforma en ácido láctico por las
bacterias lácticas.
Desde sus orígenes el queso y su tecnología de elaboración han sufrido una
profunda evolución hasta llegar a la inmensa variedad de productos que se producen en
grandes industrias con un elevado grado de tecnificación. Sin embargo, en muchos
países, como por ejemplo los mediterráneos, la industria quesera es relativamente
heterogénea, coexistiendo empresas pequeñas y medianas de carácter local y artesanal,
junto a grandes industrias muy tecnificadas. El volumen productivo en España es
bastante más bajo que el de otros países europeos y, como ocurre en Francia, este
sector se caracteriza por la diversidad de sus productos: existen más de 100 variedades
de quesos tradicionales, de los cuales 18 tienen el reconocimiento de Denominación de
Origen Protegida e Indicación Geográfica Protegida.
II.4.1. Tecnología del queso
En esencia, el queso se elabora a partir de una materia prima sencilla (leche de
un número limitado de especies) mediante un protocolo de fabricación constituido por
unos principios generales aplicables a la mayoría de las variedades existentes. Sin
embargo, es un producto dinámico y durante su elaboración y maduración tienen lugar
diversos cambios bioquímicos, responsables de las peculiaridades del producto final.
La elaboración del queso se puede dividir en líneas generales en cinco fases: control de
las propiedades de la materia prima, coagulación de la leche, desuerado de la cuajada,
moldeado y maduración, a excepción de los quesos frescos, que se consumen sin la
última (Figura II.15). A continuación se hace una breve descripción de estas fases, a
Introducción
117
partir de la información recogida en dos textos clásicos en la materia (Eck, 1990; Fox,
1987).
Figura II.15. Diagrama de flujo del proceso de elaboración de un queso tipo.
Recepción de la leche cruda
Almacenamiento en refrigeración (4-8ºC), 10-20 h
Enfriamiento (35ºC)
Pasteurización (72ºC, 15 s)
Coagulación (30 min)
Cultivo iniciador CaCl2 Cuajo
Corte de la cuajada
Agitación (calentamiento)
Desuerado
Moldeado y prensado
Salado por inmersión en salmuera (20% NaCl p/v, 7-9ºC, 24 h)
Maduración en cavas (~12ºC, 90-70%, 4-24 meses)
Envasado y etiquetado
Almacenamiento (~4-8ºC)
Introducción
118
La elaboración del queso comienza con la selección de la leche, que ha de tener
la más alta calidad química y microbiológica, evitando la procedente de vacas con
mastitis y con residuos de antibióticos. Generalmente la recepción de la leche se
acompaña de una primera limpieza (centrifugación o filtración) para eliminar material
extraño que pudiera estar presente. Cuando se realiza una centrifugación se eliminan,
además, las esporas de Clostridium tyrobutirucum. Estas esporas resisten el
tratamiento térmico al que se somete la leche y su germinación durante la maduración
del queso está asociada a defectos en el flavor, por la producción de ácido butírico, y a
la hinchazón tardía por el CO2 generado.
Hasta su empleo, la leche cruda se almacena en refrigeración, pero debe
evitarse un almacenamiento prolongado ya que favorece el crecimiento indeseable de
microorganismos psicrotrofos, generalmente asociados con defectos en el aroma y la
textura de los quesos. También es necesario hacer una normalización para ajustar la
relación materia grasa:proteína y, en ciertas variedades, una homogenización para
obtener una distribución uniforme de los glóbulos grasos.
Aunque para algunas variedades de queso todavía se utiliza leche cruda, para la
gran mayoría la leche generalmente se pasteuriza (72ºC, 15 segundos) antes de su
empleo. Este tratamiento térmico es obligatorio para aquellos quesos que se vayan a
consumir con menos de dos meses de maduración. Este tratamiento destruye la
microbiota natural de la leche cruda pero, sobretodo, asegura la eliminación de los
microorganismos patógenos que pudiera haber y facilita la obtención de quesos con
una calidad uniforme. Sin embargo, los conocedores de una determinada variedad de
queso siempre aseguran que este tratamiento térmico de la leche tiene un efecto
indeseable en la calidad organoléptica del producto final.
Una vez pasterizada y enfriada la leche (30-35ºC), se pasa a la cuba de cuajar,
donde se añade el cultivo iniciador, el cloruro cálcio para compensar las pérdidas de
calcio iónico soluble sufridas durante el tratamiento térmico y el cuajo. Ésta será la
primera etapa clave que determinará las características del producto terminado. En ella
se producen profundas modificaciones físico-químicas en las micelas de caseína como
consecuencia del ácido láctico generado por el cultivo iniciador y la actividad de las
Introducción
119
enzimas proteolíticas presentes en el cuajo, que conducen a la formación de un gel
denominado “cuajada”.
La producción de ácido láctico, con su descenso de pH asociado, provoca la
desmineralización de las caseínas (desplazamiento progresivo del calcio y del fosfato
inorgánico hacia la fase acuosa) que provoca la desorganización de su estructura
cuaternaria. Cuando el pH se acerca al punto isoeléctrico (pH 4,6), se neutralizan las
cargas y disminuye notablemente la hidratación de las caseínas, lo cual tiene como
consecuencia la formación de un coágulo débil. La producción de ácido a una
velocidad adecuada y en momento preciso afecta diversos aspectos clave de la
elaboración del queso como son, entre otros, la actividad del cuajo durante la
coagulación, la cantidad de cuajo residual que queda en la cuajada, la fuerza y la
sinéresis de la cuajada y el crecimiento de otras bacterias en el queso. Evidentemente,
el ácido láctico originado depende del tipo y cantidad de cultivo iniciador, así como de
la temperatura empleada. Es importante recordar que el cultivo iniciador continúa
produciendo ácido láctico significativamente durante la maduración de algunos quesos.
En la mayoría de los quesos, la cuajada no se forma como consecuencia del
ácido producido por las bacterias lácticas, sino que se debe a la hidrólisis enzimática
del enlace Phe105-Met106 de la κ-caseína. Se libera, así, el caseinomacropéptido
(residuos 106-169 de la κ-caseína) que, por su componente glucídico, contribuye en
gran medida a la estabilidad de las micelas de caseína. Al separarse el
caseinomacropéptido, entre las micelas se pueden establecer los enlaces que darán
lugar a la formación del gel. Antiguamente el cuajo se obtenía del estómago de
rumiantes lactantes. Este cuajo contiene una mezcla de quimosina y pepsina, siendo la
primera la responsable de la hidrólisis específica del enlace indicado de la κ-caseína.
Debido a su elevado coste económico, existen en el mercado numerosas alternativas
como otros cuajos de origen animal o los coagulantes microbianos. Sin embargo, en
estos momentos la mejor opción la constituyen los cuajos recombinantes, ya
comercializados, que se obtienen por expresión del gen de la quimosina de ternero en
Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger o E. coli. Ciertas variedades de queso, como la
Torta del Casar de Cáceres, se caracterizan por emplear un cuajo vegetal.
Introducción
120
La coagulación tarda entre 15 y 60 minutos, dependiendo de la temperatura y la
cantidad de enzima adicionada, obteniéndose un coágulo bastante estable si se deja en
reposo. Pero, cuando se rompe o corta, se produce rápidamente la sinéresis o expulsión
de parte del suero contenido en el gel. La rotura mecánica del coágulo se realiza
generalmente con cuchillos o liras, y el tamaño del grano de la cuajada dependerá de la
variedad de queso que se esté elaborando. Así, por ejemplo, para obtener un queso más
húmedo los granos de la cuajada deben ser más grandes. La cuajada se mantiene en
contacto con el suero durante un periodo de tiempo variable, en el cual para algunas
variedades de queso se puede producir incluso un calentamiento con agitación para
favorecer la sinéresis. A continuación es necesario separar el lactosuero expulsado de
los granos de cuajada, lo cual se hace por decantación y filtración, antes de colocarlos
en el molde del queso. El desuerado, como se denomina a la sinéresis más la
evacuación del lactosuero, no se limita a obtener un coágulo con una determinada
cantidad de agua, sino que también regula la cantidad de lactosa que queda en la
cuajada.
Una vez introducida en los moldes, la cuajada se somete a un prensado más o
menos intenso en función del tipo de queso. Si es un queso blando, con alto contenido
en humedad, el prensado será suave; mientras que si queremos obtener un queso con
vida útil larga, duro y con poca humedad se utilizará mayor presión. Cuando las piezas
han adquirido cierta firmeza, se sacan de los moldes y se salan, generalmente por
inmersión en una salmuera, aunque también se puede hacer por incorporación de la sal
en la superficie o en la masa. El salado contribuye a la conservación, al inhibir en parte
el crecimiento de bacterias indeseables, y a potenciar el sabor del queso, así como a
reducir el contenido de humedad.
La etapa final del proceso de elaboración de un queso es la maduración, que
tiene lugar durante el almacenamiento en condiciones controladas de temperatura (5-
12ºC) y humedad relativa (65-95%) por un tiempo variable dependiendo de la
variedad, pero que puede llegar a superar los 18 meses en algunos casos. En esta etapa
se produce un complejísimo conjunto de cambios bioquímicos en los que intervienen
el cuajo, las enzimas propias de la leche y las bacterias del cultivo iniciador o
adjuvantes y sus enzimas.
Introducción
121
II.4.2. Cambios bioquímicos durante la maduración
Los principales cambios bioquímicos que tienen lugar durante la maduración
del queso son la glucolisis, la proteolísis y la lipolísis. Como consecuencia de la
hidrólisis de los principales constituyentes de la leche. se modifica la textura y se
liberan compuestos aromáticos. Los productos de la hidrólisis son, a su vez,
metabolizados por los microorganismos presentes en el queso y/o participan en
reacciones químicas, aumentando notablemente, tanto en número como en diversidad,
las moléculas aromáticas y sápidas generadas (Figura II.16). Además, hay una gran
diversidad de cambios catabólicos secundarios como desaminaciones,
descarboxilaciones, β-oxidaciones e incluso reacciones químicas como
esterificaciones.
La mayor parte de la lactosa presente originalmente en la leche se elimina
durante el desuerado, bien como tal o después de haber sido transformada en ácido
láctico. Se estima que en los granos de cuajada sólo queda, como mucho, un 2% de la
lactosa inicial. Esta lactosa residual se metaboliza rápidamente a ácido L(+)-láctico en
las primeras horas de la maduración. Además, no es deseable un mayor porcentaje de
lactosa residual porque podría ser metabolizada por otras bacterias lácticas distintas al
cultivo iniciador y provocar alteraciones en el queso como, por ejemplo, gas. Por otra
parte, las bacterias lácticas que se encuentran como microbiota secundaria también
pueden favorecer la aparición del isómero D(−) del ácido láctico, por fermentación de
la lactosa o por racemización del isómero L(+) a D(−), especialmente si la maduración
no es a temperatura muy baja. Este isómero D(−) del ácido láctico es menos soluble y
puede precipitar con el calcio, dando lugar a indeseables cristales de lactato cálcico en
la superficie de los quesos. En las variedades de queso en las que intervienen mohos
superficiales en la maduración, como Geotrichum o Penicillium, el ácido láctico
generado se transforma rápidamente a CO2 y H2O, contribuyendo al típico incremento
del pH (Fox et al., 1990).
La concentración de citrato en la leche es relativamente baja (~8 mM) y, aunque
no sirve como fuente de energía para la mayoría de las bacterias presentes en el queso,
Introducción
122
Figura II.16. Transformaciones bioquímicas básicas durante la maduración del queso.
algunas sí pueden metabolizarlo si existen otros sustratos fermentables. Como
consecuencia del metabolismo del citrato se forma CO2, responsable de la formación
de los “ojos” típicos de ciertas variedades de queso como los de tipo suizo (Edam,
Gouda), y diacetilo, un compuesto aromático muy potente y característico de quesos
frescos tipo Cottage. En otras variedades de queso, estas mismas reacciones son
indeseables, bien por modificar el flavor típico o por la aparición indeseada de ojos
(Fox et al., 1990).
El sistema proteolítico descrito en el queso es muy complejo y está formado por
el cuajo, la plasmina de la leche y las proteasas y peptidasas bacterianas. La acción
Peptidasas del cultivo iniciador
Lactosa Citrato
Ácido láctico Diacetilo
Ácido acético Ácido propiónico Etanol
Leuconostoc Propionibacterium Bact. lácticas (no cultivo iniciador)
Bacterias lácticas del cultivo iniciador Otras bacterias lácticas
LípidoÁcidos grasos
CO2
Tioésteres Cetoácidos Ésteres de ácidos grasos Alcoholes Aldehidos Tioles Aminas SH2
NH4
Fenilésteres
Lipasas y esterasas de cuajo, leche y bacterias
CaseínaPéptidos ↑PM
Cuajo
Péptidos amargos
Péptidos ↓PM
Oligopéptidos Dipéptidos
Aminoácidos
Proteasa del cultivo iniciador
Oligopéptidos Dipéptidos
Aminoácidos
Peptidasas del cultivo iniciador y de otras
bacterias lácticas
Bacterias lácticas del cultivo iniciador Otras bacterias lácticas Propionibacterium Levaduras Reacciones químicas
Introducción
123
complementaria de todas estas enzimas proteolíticas genera una mezcla de
aminoácidos y péptidos de pequeño tamaño que contribuyen de una manera directa y
clara tanto al sabor como a la textura percibida en la boca. Además, la proteolisis
proporciona un conjunto muy importante de sustratos que se metabolizarán o
transformarán químicamente en compuestos aromáticos y sápidos (Figura II.16). De
todas las enzimas proteolíticas mencionadas, las de las bacterias lácticas son las que
tienen mayor peso en el perfil aromático y sápido típico de cada variedad de queso
(Law, 2001).
En la leche se encuentran de forma natural varias enzimas con actividad
proteolítica, aunque en relación con el queso sólo merece la pena destacar una serín-
proteasa alcalina, idéntica a la plasmina sanguínea, que es bastante estable al calor y
contribuye a hidrolizar, sobre todo, la caseína β. La parte residual del cuajo que queda
atrapada en la cuajada, continúa actuando sobre las proteínas lácteas (especialmente la
caseína αs1) a lo largo de la maduración y, además, de forma bastante inespecífica.
Como consecuencia de su acción se generan péptidos de tamaño relativamente grande
(>1400). Estos péptidos no contribuyen al sabor propio del queso, en general, por su
gran tamaño, excepto si tienen carácter amargo. Sin embargo, esta hidrólisis es
fundamental para iniciar el ablandamiento de la textura inicial del queso (Law, 1987).
El sistema proteolítico de las bacterias lácticas asociadas con el ambiente lácteo
ha sido caracterizado con bastante profundidad, tanto desde el punto de vista
bioquímico como en sus aspectos genéticos, desde hace algo más de una década
(Pritchard y Coolbear, 1993). Las bacterias lácticas, y en concreto lactococos y
lactobacilos, son auxótrofas para varios aminoácidos (entre seis y catorce por cepa).
Por ello, para llegar a tener un buen crecimiento en leche son totalmente dependientes
de un sistema proteolítico eficiente que pueda liberar esos aminoácidos esenciales de
los péptidos derivados de la caseína (Christensen et al., 1999). De hecho, considerando
el conjunto de enzimas descritas en las bacterias lácticas se podrían liberar todos los
aminoácidos presentes en los péptidos generados por la acción del cuajo (Law, 2001).
A este complejo sistema proteolítico de las bacterias lácticas pertenecen las proteasas
ligadas a la pared celular, que pueden actuar tanto sobre la caseína como sobre los
primeros grandes péptidos derivados de ella. Algunas variantes de estas proteasas
Introducción
124
generan péptidos amargos, mientras que otras generan péptidos con un buen impacto
en el sabor del queso. Sobre estos péptidos puede actuar un amplio conjunto de
peptidasas: di-, tri-, endo-, amino- y carboxi-peptidasas, con muy distintos tipos de
especificidad, que también forman parte del sistema proteolítico. Es decir, estas
peptidasas pueden degradar los péptidos amargos que generan el cuajo y las proteasas
asociadas a la pared celular de las bacterias lácticas. Como los péptidos amargos se
caracterizan por ser ricos en el aminoácido prolina, las endopeptidasas específicas por
este residuo de aminoácido adquieren especial relevancia pra reducir el amargor del
queso (Lemieux y Simard, 1992). Como ejemplo de la complejidad que puede alcanzar
este sistema, puede mencionarse que en Lactobacillus helveticus CNRZ32 se han
llegado a caracterizar, tras muchos años de dedicación, 12 enzimas proteolíticas
distintas. Sorprendentemente, el análisis realizado en el primer borrador de la
secuencia de su genoma ha revelado que, en realidad, el número de genes que
codifican enzimas proteolíticos es de 28, sin incluir todos los múltiples sistemas de
transporte de oligo-, di- y tripéptidos y aminoácidos (Cogan et al., 2007).
Algunos de los aminoácidos liberados influyen directamente en el sabor del
queso, como por ejemplo la prolina (dulce) y el ácido glutámico (potenciador del
sabor). En cambio, otros van a servir de intermediarios para la formación de otros
compuestos aromáticos y sápidos, como es el caso de la cisteína, la metionina, la
isoleucina, la valina y la fenilalanina, tras su descarboxilación, desaminación,
transaminación, deshidratación o hidrólisis. Aunque en general no se dispone de
información detallada sobre estas transformaciones, cabe destacar que la metionina da
origen a diversos compuestos volátiles azufrados, como el metanotiol y sus ésteres,
que se encuentran en la mayoría de los quesos, contribuyendo a su sabor y olor típicos.
Las desaminasas y las transaminasas de las bacterias lácticas también pueden
transformar aminoácidos insípidos en cetoácidos y precursores de ésteres que
intensifican el aroma de ciertas variedades de queso (Law, 2001; Williams et al.,
2001).
Ciertos aminoácidos libres pueden ser sustrato de las descarboxilasas de las
bacterias lácticas y originar aminas biógenas, con importancia debido a su actividad
biológica. La histamina (derivada de la histidina) y la tiramina (tirosina) se encuentran
Introducción
125
entre las aminas más tóxicas para la salud de los consumidores, con efectos
indeseables en el sistema nervioso central y el vascular, mientras que la putrescina (de
la ornitina) y la cadaverina (de la lisina) modifican las propiedades organolépticas de
los alimentos. La amina primaria que se encuentra con mayor frecuencia en el queso es
la tiramina. Este producto también está implicado con cierta frecuencia, aunque menos
que el pescado, en intoxicaciones histaminérgicas. Otras aminas biógenas que se llegan
a encontrar ocasionalmente en el queso son la triptamina (triptófano), la putrescina y la
cadaverina, que potencian los efectos tóxicos de otras aminas al inhibir la actividad de
las enzimas con actividad destoxificante (Stratton et al., 1991).
La lipolisis es el tercero de los procesos fundamentales que tienen lugar durante
la maduración del queso. Aunque menos estudiada, tiene un papel vital determinando
el perfil aromático y sápido de algunas variedades de queso. Sin embargo, en general,
parece más difícil definir su contribución específica a la textura e intensidad del aroma
y sabor. Entre las enzimas implicadas en la lipolisis se encuentra la lipasa nativa de la
leche, aunque sólo es relevante en los quesos elaborados con leche cruda, ya que se
inactiva con la pasterización. Por otra parte, también contribuyen las lipasas y esterasas
de origen microbiano. Tradicionalmente se ha considerado que las bacterias lácticas
son poco lipolíticas y que su actividad lipásica es irrelevante en comparación con la
esterásica (Holland et al., 2005). A pesar de que esta actividad lipolítica sea muy
suave, tiene una contribución importante al desarrollo del aroma y sabor en el queso.
Los ácidos grasos libres contribuyen, por una parte, directamente al aroma de los
quesos maduros, en especial los de cadena corta. En este sentido, destaca el ácido
butírico, que a bajas concentraciones tiene ya un intenso olor a queso. Por otra parte,
los ácidos grasos libres sirven de precursores de otros compuestos volátiles
(metilcetonas, alcanos, lactonas, ésteres, etc.), igualmente importantes. Por ejemplo,
muchos ésteres de ácidos grasos son esenciales para el sabor y aroma característico de
algunos quesos, como los ésteres del ácido caproico en el queso de cabra y los
tioésteres en el Camembert o los derivados del ácido linoleico liberado de los
triacilglicéridos de la leche por la lipasa, responsables del característico aroma de los
quesos con mohos blancos en superficie (Law, 2001). Conviene señalar que algunos de
los compuestos derivados de los ácidos grasos tienen un umbral de percepción muy
Introducción
126
bajo, por lo que bastaría con una ligera actividad esterásica o lipásica para que
repercutiese en el flavor del queso (Choisy et al., 1990). Por otro parte, además, si su
concentración fuese demasiado elevada o se desequilibrase el balance de los ácidos
grasos podría resultar en detrimento del aroma y sabor de algunas variedades de
quesos.
Dado que el proceso de maduración del queso, dependiendo de la variedad,
puede prolongarse mucho, se han desarrollado diversas estrategias para conseguir el
desarrollo de unas propiedades organolépticas adecuadas en un tiempo más corto. En
estos momentos las opciones más interesantes son emplear temperaturas más elevadas
durante la maduración, la adición de enzimas exógenos (proteasas, lipasas o mezclas
de ambas) o el empleo de cultivos iniciadores atenuados para poder añadir mayor
cantidad de bacterias sin modificar la velocidad de acidificación, de cultivos auxiliares
y, en teoría, de cultivos iniciadores modificados genéticamente (Law, 2001).
II.4.3. Microbiología del queso
Es evidente que las características de la leche y los parámetros tecnológicos
empleados durante la elaboración del queso van a tener una fuerte influencia en las
características del producto final. Sin embargo, la microbiota del queso juega un papel
clave en el desarrollo de las características clave de cada variedad (Fox y Wallace,
1997). Los microorganismos presentes habitualmente en el queso se pueden dividir en
dos grandes grupos. En el primer grupo se encuentran las bacterias lácticas del cultivo
iniciador, que están implicadas, sobre todo, en la producción de ácido durante la
fabricación del queso, aunque, por supuesto, también intervengan en la maduración.
En el grupo de los microorganismos secundarios están aquellos que no son
responsables de la producción de ácido, pero que tienen un papel muy importante
durante la maduración. En este segundo grupo se encuentran las bacterias lácticas que
no pertenecen al cultivo iniciador (las denominadas en inglés, NSLAB o non-starter
lactic acid bacteria), bacterias pertenecientes a otros grupos, levaduras y/o mohos.
Todos estos microorganismos secundarios suelen ser característicos de cada variedad
de queso o, como mucho, de variedades muy relacionadas (Beresford et al., 2001).
Introducción
127
La principal función del cultivo iniciador es la producción de ácido durante la
primera etapa de la elaboración del queso. Para esta función se consideran adecuadas
aquellas bacterias que producen una cantidad suficiente de ácido para reducir el pH de
la leche a un valor inferior a 5,3 al cabo de 6 horas de incubación a 30-37ºC (Cogan et
al., 1997). Esta acidificación de la leche pueden realizarla las bacterias lácticas que se
encuentran de forma natural en la leche cruda, como se hacía antiguamente. Sin
embargo, actualmente este modo de proceder sólo se mantiene en algunos quesos
artesanales, ya que el comportamiento de la microbiota natural es con frecuencia
impredecible e inadecuado para el proceder industrial. Por ello, generalmente se
emplean cultivos iniciadores que contienen bacterias bien caracterizadas que dominan
la fermentación y aseguran una adecuada velocidad de acidificación, así como una
calidad uniforme. Desde que se descubrió que las bacterias lácticas eran las
responsables de la acidificación de la leche durante la elaboración del queso, no ha
cesado la investigación y la búsqueda de cepas lo más adaptadas posible a cada
aplicación. La industria de los cultivos iniciadores ha ido desarrollándose hasta llegar a
convertirse en una de las más avanzadas y sofisticadas industrias actuales.
El tipo de cultivo iniciador dependerá de los parámetros de fabricación de la
variedad de queso que se desee elaborar. Las principales especies bacterianas que se
suelen encontran en los cultivos iniciadores se encuentran en la Tabla II.12, junto con
sus principales características bioquímicas. Estos cultivos iniciadores pueden tener una
composición definida, es decir un número conocido de cepas bacterianas, o indefinida
en el caso de los cultivos mixtos en los que se desconoce el número y el tipo exacto de
microorganismos presentes. Por otra parte, en función de la temperatura de
crecimiento se distinguen cultivos iniciadores mesófilos y termófilos. Los primeros,
con una temperatura óptima de crecimiento alrededor de 30°C, contienen
fundamentalmente cepas de Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis ssp. lactis,
entre las que se pueden incluir algunas cepas que metabolicen citrato para la
producción de aroma, como por ejemplo L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis,
Leuconostoc lactis y L. mesenteroides ssp. cremoris. Los cultivos iniciadores
termófilos, adecuados para la elaboración de quesos de pasta cocida, están formados
por bacterias cuya temperatura óptima de crecimiento está alrededor de 40-45°C, como
Streptococcus thermophilus y lactobacilos termófilos como Lactobacillus delbrueckii
Introducción
128
ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. delbrueckii spp. lactis o
Lactobacillus helveticus. Los enterococos, a pesar de no estar presentes,
aparentemente, en los cultivos iniciadores, se aislan con gran frecuencia y en gran
número de muchas variedades de quesos. Algunas cepas de enterococos tienen una
buena capacidad acidificante y un papel muy positivo en el desarrollo del aroma,
especialmente en los quesos mediterráneos (Cogan et al., 1997; Beresford et al., 2001).
En cualquier caso, las bacterias del cultivo iniciador se multiplican en las
primeras etapas de elaboración del queso hasta alcanzar 108-109 ufc/g en la mayoría de
las variedades de queso, pero durante la maduración disminuyen como consecuencia
de la acción de sus propias enzimas autolíticas (Thomas y Batt, 1969). En el primer
mes, sólo queda aproximadamente el 1% de las bacterias viables presentes
inicialmente. Es decir, las células intactas del cultivo iniciador fermentan la lactosa,
eliminan el oxígeno y, probablemente, inicien reacciones para generar compuestos
aromáticos; a continuación, las enzimas intracelulares (peptidasas y esterasas, sobre
todo) de las células autolisadas aceleran la hidrólisis de péptidos y lípidos generando
más precursores de compuestos aromáticos (Crow et al., 1995).
La microbiota secundaria tiene el comportamiento opuesto. La población inicial
de bacterias lácticas que no pertenecen al cultivo iniciador es muy pequeña y
generalmente es inferior a 103 ufc/g. Sin embargo, llegan a alcanzar entre 107 y 109
ufc/g entre los 3 y 9 meses de maduración, manteniéndose durante toda la maduración
(Peterson y Marshall, 1990). Las bacterias de esta microbiota secundaria pertenecen
generalmente a los géneros Lactobacillus, Enterococcus y, ocasionalmente,
Pediococcus y Leuconostoc (Cogan et al., 2007). Aunque forman una parte
significativa de los microorganismos presentes en el queso durante la maduración no
contribuyen a la acidificación en la elaboración del queso ni siquiera crecen bien en la
leche. Las especies que se encuentran con mayor frecuencia en los quesos son
lactobacilos homofermentativos facultativos de las especies Lb. casei/ Lb. paracasei,
Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. curvatus, P. acidilactici y P. pentosaceus,
dependiendo de la variedad de queso. Dentro de una variedad es frecuente, incluso,
encontrar varias especies simultáneamente, con cambios notables a lo largo del tiempo;
Introducción
129
Tabla II.12. Principales características de las bacterias lácticas que se encuentran en los cultivos iniciadores Crecimiento a: Fermentación deb:
Morfología
Ácido láctico
producido en leche
(%)a
Isómero del ácido láctico
Metabolismo del citrato
Producción de NH3 de la arginina 10ºC 40ºC 45ºC Glu Gal Lac
Streptococcus thermophilus Cocos 0,6 L - - - + + + - + Lactobacillus helveticus Bacilos 2 DL - - - + + + + + Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Bacilos 1,8 D - - - + + + - + Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis Bacilos 1,8 D - -/+c - + + + +/-c + Lactococcus lactis ssp. lactis Cocos 0,8 L - - + - - + + + Lactococcus lactis ssp. cremoris Cocos 0,8 L +/- + + + - + + + Leuconostoc lactis Cocos <0,5 D + - + - - + + + Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Cocos 0,2 D + - + - - + + + aValores aproximados; los valores pueden variar dependiendo de las cepas. bGlu, glucosa; Gal, galactosa; Lac, lactosa. c-/+, la mayoría de las cepas son negativas; +/-, la mayoría de las cepas son positivas. Adaptado de Bresdord et al. (2001).
Introducción
130
en casi todos los casos analizados Lb. paracasei es la especie que suele predominar en
las últimas etapas de la maduración (Beresford et al., 2001).
Existe cierta controversia acerca del origen de estas bacterias lácticas que no
pertenecen al cultivo iniciador. Cuando se emplea leche cruda en la elaboración del
queso, está claro que ése será su origen. En cambio, cuando se emplea leche
pasterizada para elaborar queso, éste también contiene bacterias lácticas distintas a las
añadidas como cultivo iniciador. Es decir, se desconocen si se originan de una
contaminación posterior al tratamiento térmico o si hay una pequeña proporción que
sobreviven y se multiplican en el queso (Jordan y Cogan, 1993). Tampoco se sabe con
exactitud qué fuente de energía emplean para su crecimiento, ya que la lactosa se ha
agotado cuando esta microbiota secundaria comienza a multiplicarse. Otras posibles
alternativas son el citrato y las glicoproteínas de la membrana del glóbulo graso
(Beresford et al., 2001).
Sin embargo, si parece haber acuerdo unánime sobre el importante papel que
juegan estas bacterias lácticas que no pertenecen al cultivo iniciador en el desarrollo
del flavor del queso, especialmente contribuyendo a la proteolisis e intensificando el
sabor (Cogan et al., 2007). Tanto es así que ya es habitual, en algunos casos, emplear
lactobacilos como cultivos auxiliares en la elaboración del queso, con la idea de
controlar la aparición de otras bacterias lácticas secundarias “salvajes”. De esta forma,
y sin modificar el proceso de elaboración, se podría evitar la aparición de defectos y la
inconsistencia de la calidad del producto final (Broadbent et al., 2003).
El ecosistema microbiano del queso se completa con otros grupos como, por
ejemplo, las propionibacterias, los micrococos, los estafilococos, Brevibacterium
linens y otras corinebacterias, así como con mohos y levaduras, asociados a variedades
concretas de quesos (Beresford et al., 2001). La complejidad de este ecosistema y las
interacciones que se establecen entre los distintos grupos en las especiales condiciones
del queso hacen muy difícil que se tenga un control preciso de su maduración.
Desde el punto de vista higiénico, el queso madurado (por un periodo superior a
los 60 días) se considera microbiológicamente seguro gracias a sus peculiares
Introducción
131
características: pH ácido, baja aw, presencia de sal, ausencia de O2, refrigeración y
presencia de microorganismos fermentadores que compiten por el mismo nicho
ecológico. La pasteurización de la leche que se emplea para la elaboración del queso es
una forma muy eficaz de control de los microorganismos patógenos que pudiera haber
en la materia prima. Cuando se emplea leche cruda para elaborar queso, en cambio, es
necesario que transcurra un periodo de tiempo lo suficientemente prolongado durante
la maduración (>60 días) para asegurar la destrucción de los microorganismos
patógenos.
Durante la elaboración del queso existen varias situaciones que pueden plantear
un riesgo particular de brote de intoxicación alimentaria. Por un lado, la inactivación
total o parcial de las bacterias lácticas durante la fermentación tendría como
consecuencia que los niveles de acidificación serían bajos y, por tanto, el pH alto.
Estos fallos en la acidificación permitirían la supervivencia y multiplicación de los
microorganismos patógenos y alterantes. Por otra parte, unas malas prácticas
higiénicas de fabricación durante la manipulación posterior a la pasteurización, aunque
sea correcta, pueden facilitar las contaminaciones cruzadas o el contacto con patógenos
del ambiente o del equipo de procesado.
De los posibles patógenos asociados con el queso, los que representan una mayor
preocupación para los fabricantes de queso son L. monocytogenes, Salmonella
enteritidis y E. coli O157:H7. La información disponible sugiere que L.
monocytogenes es la más problemática. Se trata de un microorganismo Gram-positivo
psicrotrofo que tiene una gran facilidad para crecer y/o sobrevivir en ambientes
desfavorables: la adición de sal (hasta 30% de NaCl) o nitritos, la refrigeración o una
baja aw, son ineficaces de impedir el desarrollo de este microorganismo. El riesgo de
este patógeno no debería tomarse a la ligera, ya que la mortalidad asociada en muy alta
(la probabilidad de que la infección desemboque en muerte es del 33%). Así ocurrió
durante la década de los 80 en EE UU: la aparición de graves brotes de listeriosis
transmitida a través de alimentos contaminados causó gran alarma social. Además, la
mayor parte de estos brotes se debieron al consumo de leches y quesos frescos
contaminados.
Introducción
132
A pesar de que los niveles necesarios de L. monocytogenes para causar la
listeriosis rara vez se encuentran inicialmente en los alimentos (Notermans et al.,
1998), como es capaz de reproducirse a temperaturas de refrigeración, incluso
conservando los alimentos de manera adecuada, un número inicial relativamente bajo
de este microorganismo, puede llegar a alcanzar los niveles que causan la enfermedad
en un corto espacio de tiempo. A este respecto, y dada la elevada posibilidad de
encontrar microorganismos del género Listeria en leche y productos lácteos como
algunos quesos, sería muy interesante disponer de medios para controlar este
microorganismo in situ desde las primeras etapas del proceso de elaboración.
International Dairy Journal 15 (2005) 45–49
ARTICLE IN PRESS
*Correspondin
3743.
E-mail addres
0958-6946/$ - see
doi:10.1016/j.ida
Production of pediocin PA-1, and coproduction of nisin A andpediocin PA-1, by wild Lactococcus lactis strains of dairy origin
C. Reviriegoa, A. Fern!andeza, N. Hornb, E. Rodr!ıguezc, M.L. Mar!ına,L. Fern!andeza, J.M. Rodr!ıgueza,*
aDepartamento de Nutrici !on y Bromatolog!ıa III, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, SpainbFood Safety Science Division, BBSRC Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UA, UK
cDepartamento Tecnolog!ıa de Alimentos, INIA, Ctra. La Coruna Km 7, Madrid 28040, Spain
Received 15 November 2003; accepted 7 May 2004
Abstract
Heterologous production of pediocin PA-1 in nisin and non-nisin-producing Lactococcus lactis strains, which had been previously
selected because of their technological properties for cheese making, was investigated. Plasmid pFI2160, which contains a hybrid
gene (L-pedA) encoding the fusion between the lactococcin A leader and propediocin PA-1, and also the genes lcnC and lcnD, that
encode the lactococcin A secretion apparatus, was introduced into L. lactis ESI 153 and L. lactis ESI 515 (Nis+). The pediocin
production level of their respective transformants, L. lactis CL1 and L. lactis CL2 (Nis+), was approximately 600 and 400 ngmL�1,
respectively, which represents a 30% and a 20% of the quantity produced by the natural pediocin PA-1 producer Pediococcus
acidilactici 347. Transformation of L. lactis ESI 515 with pFI2160 did not affect its ability to produce nisin. Pediocin bioassays
showed the stability of pFI2160 in both heterologous hosts under selective and non-selective conditions.
r 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Lactococcus lactis; Pediocin PA-1; Nisin; Heterologous production
1. Introduction
Lactic acid bacteria (LAB) usually play a key role infood fermentations, where they contribute not only tothe development of the desired sensorial properties inthe final products, but also to their microbiologicalsafety (Stiles, 1996). As a consequence, a high number ofLAB strains have found wide commercial applicationsas starter or bioprotective cultures. The bioprotectiveeffect is based on the production of different antimicro-bial compounds and, among them, bacteriocins havereceived considerable research attention during the lastyears (Cleveland, Montville, Nes, & Chikindas, 2001).Pediocin PA-1 is a class II bacteriocin with a broad
inhibitory spectrum and particularly effective againstListeria monocytogenes (Muriana, 1996). Most pediocin
g author. Tel.: +34-91-394-3747; fax: +34-91-394-
s: [email protected] (J.M. Rodr!ıguez).
front matter r 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.
iryj.2004.05.003
PA-1-producing bacteria so far isolated are pediococci,organisms usually associated with vegetables and meatproducts but not suitable for production of dairyproducts both from a metabolic and a technologicalpoints of view. Therefore, the production of thisbacteriocin by strains of dairy origin is a desirableobjective and, as a consequence, strategies based on itsheterologous production by Lactococcus lactis havebeen attempted (Chikindas, Venema, Ledeboer, Vene-ma, & Kok, 1995; Van Belkum, Worobo, & Stiles, 1997;Horn et al., 1998, 1999; Buyong, Kok, & Luchansky,1998; Rodr!ıguez, Mart!ınez, Horn, & Dodd, 2003).The significant amino acid homologies shared by
leader peptides, and also by dedicated transporters, ofmost class II bacteriocins (Van Belkum et al., 1997,H(avarstein, Holo, & Nes, 1994; H(avarstein, Diep, &Nes, 1995) represent an attractive and alternativeapproach to produce pediocin PA-1 in heterologoushosts. Horn et al. (1999) reported production ofpediocin PA-1 in the non-starter L. lactis strains
ARTICLE IN PRESSC. Reviriego et al. / International Dairy Journal 15 (2005) 45–4946
IL1403, MG1614 and FI5876, by introducing a plasmidcontaining the following foreign genes: a hybrid gene(L-pedA) containing an in-frame fusion of sequencesencoding the lactococcin A leader and propediocin PA-1under the control of the lactococcin A promoter, andthe genes lcnC and lcnD, that encode the lactococcin Asecretion apparatus (Stoddard, Petzel, Van Belkum,Kok, & McKay, 1992). Since L. lactis FI5876 is anisin-producing strain, its transformants were able tocoproduce nisin A and pediocin PA-1.In this context, the objective of this study was to
determine if this strategy can be also valid to getsignificant production of pediocin PA-1 in nisin andnon-nisin-producing L. lactis strains that were pre-viously selected because of their technological propertiesfor cheese making (Cogan et al., 1997). Subsequently,the ability of the recombinant strains to inhibit thegrowth of L. monocytogenes, Staphylococcus aureus andEscherichia coli O157:H7 in cheese was evaluated(Rodr!ıguez et al., 2004).
2. Materials and methods
2.1. Microorganisms and culture conditions
The lactococcal host strains, L. lactis ESI 153 and L.
lactis ESI 515 (Nis+), were originally isolated from artisanalraw milk cheeses (Cogan et al., 1997). They were selectedbecause of their technological and/or antimicrobial proper-ties, and have already been used as starter cultures in cheesemanufacture (G!omez, Rodr!ıguez, Gaya, Nunez, & Medina,1999; Rodr!ıguez, Gaya, Nunez, & Medina, 1998). L. lactis
FI9267 was used as the source of pFI2160 (Horn et al.,1999). Lactococcal strains were routinely grown in MRS(Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, UK) or M17 medium(Oxoid) supplemented with 0.5% (wt/vol) glucose (GM17medium) at 32�C without agitation. Pediococcus acidilactici
347, a wild pediocin PA-1-producing strain (Rodr!ıguez et al.,1997), was grown in MRS medium at 32�C withoutagitation. Agar plates were made by addition of 1.5% (wt/vol) agar to broth media. When appropriate, chloramphe-nicol (Cm; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) was added(5mgmL�1) to the lactococcal cultures as selective agent.The lactococcal strains were stored at �80�C in GM17broth containing 15% glycerol (vol/vol) and their authen-ticity was assessed by RAPD profiling (Section 2.3) andplasmid profiling (data not shown).
2.2. Bacteriocin assays
Pediocin PA-1 and nisin antimicrobial activities incultures were assayed by a plate diffusion bioassayperformed as previously described (Dodd, Horn, Zhang,& Gasson, 1992) with L. lactis MG1614 (pediocin-resistant, nisin-sensitive; Gasson, 1983), Enterococcus
faecium P21 (pediocin-sensitive, nisin-sensitive; Herranzet al., 2001) and E. faecalis TAB28 (pediocin-sensitive,nisin-resistant; Joosten, Rodr!ıguez, & N !unez, 1997) asindicator organisms. L. lactis BB24 (Rodr!ıguez et al.,1995) was used as a positive control for nisin produc-tion. Pediocin PA-1 production was quantified using aseries of pediocin PA-1 standards, ranging from 0 to5 mgmL�1. Pure pediocin PA-1 was kindly provided byDr. J.M. Mart!ınez (Universidad Complutense de Ma-drid, Spain) and GM17 broth was the diluent used toprepare the standards. The pediocin PA-1 concentrationin these standards was determined by a competitiveindirect enzyme-linked immunosorbent assay (CI-ELI-SA) using the polyclonal antibodies and the conditionsdescribed by Mart!ınez et al. (1999). The zones ofinhibition were measured and plotted against thelogarithm of their concentration to give a standardcurve from which test supernatant concentrations wereestimated. The assays were performed in triplicate withfour independent sets of cultures. Then, the standarddeviation (SD) values were calculated.
2.3. Transformation of the L. lactis strains
Plasmid pFI2160 is a derivative of pTG262 (alactococcal-E. coli shuttle vector that confers resistanceto Cm) and contains the hybrid gene L-pedA (an in-frame fusion between sequences encoding lactococcin Aleader and pediocin PA-1 propeptide), and lcnCD genes(encoding the secretory machinery of lactococcin A)(Horn et al., 1998). Previously, it has been shown thatpFI2160 is able to direct pediocin PA-1 production in L.
lactis at a high level (Horn et al., 1999). L. lactis ESI 153and ESI 515 were transformed with pFI2160 followingthe procedure described by Wells, Wilson, and Le Page(1993). Plasmid DNA isolation was carried using theQiagen plasmid mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Totest the stability of pFI2160 either in the presence or inthe absence of Cm, MRS subcultures of L. lactis ESI 153and ESI 515 were made every 12 h for 5 days, and thesupernatants were assayed for pediocin PA-1 productionusing the diffusion bioassay. RAPDs assays usingprimers ArgDei (50-ACCYTRGAAGGYGGY-GATGTB-30) and OPL5 (50-ACGCAGGCAC-30)(Veyrat, Miralles, & Perez-Mart!ınez, 1999) were per-formed to confirm isogenicity between L. lactis ESI 153and CL1, and between ESI 515 and CL2. Such primersare designed to provide a high variability of RAPDprofiles among LAB isolates.
3. Results and discussion
Transformation of L. lactis ESI 153 and ESI 515 withpFI2160 generated the L. lactis strains CL1 and CL2,respectively. The transformation efficiency of both
ARTICLE IN PRESSC. Reviriego et al. / International Dairy Journal 15 (2005) 45–49 47
lactococcal host strains, measured as the number ofrecipient strains required to obtain one transformant,was low, ranging from 3� 10�6 to 1� 10�7. Inhibitionof the pediocin-sensitive indicator organisms E. faecalis
TAB28 and E. faecium P21 by culture supernatants ofstrains CL1 and CL2 was detected in plate diffusionbioassays (Figs. 1 and 2). The pediocin production levelof L. lactis CL1 and CL2 was approximately 600 (729)and 400 (718) ngmL�1, respectively, which represents a30% and a 20% of the quantity produced by the natural
Fig. 1. Agar diffusion bioassay for detection of bacteriocin activity
against E. faecium P21. Samples: 1, L. lactis ESI 153; 2, GM17 broth;
3-7, L. lactis ESI 153 transformants (5, CL1); 8, L. lactis MG1614
(Bac�); 9, L. lactis BB24 (Nis+); 10, P. acidilactici 347 (Ped+).
Fig. 2. Agar diffusion bioassay for detection of bacteriocin activity
against Enterococcus faecalis TAB28. Samples: 1, P. acidilactici 347; 2,
L. lactis BB24; 3, GM17 broth; 4, L. lactis MG1614; 5, L. lactis ESI
515; 6, L. lactis CL2.
producer P. acidilactici 347. Transformation of L. lactis
ESI 515 with pFI2160 did not affect its ability toproduce nisin (Fig. 3). Pediocin bioassays showedstability of pFI2160 in CL1 and CL2 after 10subcultures, either under selective (Cm) or non-selective(no antibiotic added) conditions. RAPDs assays usingprimers ArgDei and OPL5 confirmed isogenicity be-tween L. lactis ESI 153 and CL1, and between ESI 515and CL2 (Fig. 4).Production of pediocin PA-1 by strains of dairy origin
has been previously attempted. Chikindas et al. (1995)achieved production and secretion of pediocin PA-1 in
Fig. 3. Agar diffusion bioassay for detection of nisin activity against
L. lactis MG1614. Samples: 1, P. acidilactici 347; 2, L. lactis MG1614;
3, L. lactis ESI 515; 4, L. lactis BB24; 5, L. lactis ESI 153; 6, L. lactis
CL1; 7, L. lactis CL2; 8. GM17 broth.
Fig. 4. RAPDs profiles obtained after amplification of genomic DNA
using primers ArgDei (A) and OPL5 (B). Samples: 1, Standard (100 bp
ladder, Gibco); 2, L. lactis ESI 153; 3, L. lactis CL1; 4, L. lactis ESI
515; 5, L. lactis CL2; 6, P. acidilactici 347.
ARTICLE IN PRESSC. Reviriego et al. / International Dairy Journal 15 (2005) 45–4948
L. lactis IL1403 and L. lactis LL108 (a L. lactis MG1363derivative carrying several copies of repA in itschromosome) transformed with pMC117, a plasmidcontaining the ped operon under the control of thelactococcal promoter P32. However, such lactococcalhosts lack several properties required for application inthe dairy industry since they are proteinase negative,lactose negative and incapable of adequate growth andacid production in milk. Therefore, to exploit thecommercial potential of a pediocin-producing dairystarter culture, L. lactis MM210, a strain used inCheddar cheese manufacture, was selected as a hostfor the ped operon-encoding plasmid (Buyong et al.,1998). The antilisterial ability of the recombinant L.
lactis starter culture was tested in Cheddar cheesescoinoculated with the lactococcal strain and a mixtureof three L. monocytogenes strains (Buyong et al., 1998).In the experimental cheese, the initial counts of thepathogen in the inoculated milk (103 cfumL�1) de-creased by 1 log cycle within 1 week of ripening and thendecreased by an additional log cycle within 3 months(final counts: 10 cfu g�1). The presence of the plasmidencoding pediocin production in the lactococcal starterculture did not affect its technological properties. Incontrol cheeses made with an isogenic, non-pediocinproducing L. lactis strain, Listeria counts increased byapproximately 4 log cycles after 2 weeks of ripening andthen gradually decreased to about 103 cfu g�1 after 6months.Pediocin PA-1 and lactoccoccin A are both class II
bacteriocins and, hence, likely candidates for expressionand secretion in L. lactis via heterologous translocators.Horn et al. (1998,1999) reported the heterologousproduction of pediocin PA-1 in L. lactis following suchstrategy. However, and similarly to Chikindas et al.(1995), the strains that they used as hosts are notsuitable for cheese making. Therefore, in this work weapplied the same strategy for heterologous productionof pediocin PA-1 in L. lactis ESI 153 and ESI 515, twostrains selected for their dairy technological properties(Cogan et al., 1997).Since transformation of L. lactis ESI 515 did not
affect its ability to produce nisin (Fig. 3), the new strainCL2 was able to coproduce nisin and pediocin PA-1.Previously, Horn et al. (1999) achieved coproduction ofthese bacteriocins in the non-starter strain L. lactis
FI5876; however, the pediocin level was only 11% ofthat accounted by P. acidilactici 347. Therefore, the levelof coproduced pediocin PA-1 has been improved in thiswork. The particular antimicrobial properties of pedio-cin PA-1 and nisin, and the beneficial effects of theircoproduction are features that can be exploited by thefood industry. The synergistic effects of these twobacteriocins against a variety of pathogens have beenpreviosuly described (Hanlin, Kalchayanand, Ray, &Ray, 1993; Mulet-Powell, Lacoste-Armynot, Vinas, &
De Buochberg, 1998). In addition, the fact that they arecompletely unrelated bacteriocins can prevent theemergence of cross-resistances among initially sensitivebacteria (Rekhif, Atrih, & Lefebvre, 1994). Work is inprogress to develop food-grade pediocin-producing L.
lactis ESI 153 and ESI 515 derivatives by chromosomalintegration of the genes involved in pediocin PA-1biosynthesis, by using food-grade vectors, and/or byremoval of the gene conferring Cm resistance frompFI2160.
4. Conclusions
Transformation of L. lactis ESI 153 and L. lactis ESI515 with pFI2160 generated strains CL1 and CL2,respectively. Both showed pediocin PA-1 production,approximately 600 and 400 ngmL�1, respectively.Transformation of the naturally nisin-producing strainL. lactis ESI 515 with pFI2160 did not affect its abilityto produce nisin. Pediocin bioassays showed the stabilityof pFI2160 in both heterologous hosts under non-selective conditions. Therefore, the new strains are goodcandidates to study how their ability to producesignificant amounts of pediocin PA-1 may affect thegrowth of selected pathogens during cheese making (seeRodr!ıguez et al., 2004). If the results obtained werepromising, it would open new perspectives sincedifferent approaches to obtain food-grade L. lactis
strains with the same ability are currently in progress.
Acknowledgements
This work was partially supported by GrantAGL2002-04609-C02-02 from the Ministerio de Cienciay Tecnolog!ıa, Madrid, Spain.
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�CorrespondE-mail addr
International Dairy Journal 17 (2007) 574–577
www.elsevier.com/locate/idairyj
Enhanced production of pediocin PA-1 in wild nisin- andnon-nisin-producing Lactococcus lactis strains of dairy origin
C. Reviriegoa, L. Fernandeza, O.P. Kuipersb, J. Kokb, J.M. Rodrıgueza,�
aDepartamento de Nutricion, Bromatologıa y Tecnologıa de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid,
28040 Madrid, SpainbDepartment of Genetics, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Groningen, 9751 NN Haren, The Netherlands
Received 6 October 2005; accepted 1 May 2006
Abstract
In this work, heterologous production of pediocin PA-1 in Lactococcus lactis ESI 153 and ESI 515 (Nis+), two strains selected because
of their technological properties for cheesemaking, was achieved after transformation with plasmids pMC117, pRK119 and pCNC1,
which contain the complete pediocin operon under the control of the strong P32 promoter. The pediocin production of the L. lactis ESI
153 derivatives containing pRK119 or pCNC1 was higher (approximately 165%) than that achieved by the natural pediocin PA-1
producer Pediococcus acidilactici 347. In the case of the L. lactis ESI 515 derivatives, those containing pRK119 or pCNC1 showed a
pediocin production level similar (95–100%) to that of P. acidilactici 347.
r 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Lactococcus lactis; Pediocin PA-1; Nisin; Heterologous production
1. Introduction
The bacteriocin pediocin PA-1 is interesting as a foodbiopreservative because of its strong activity againstListeria monocytogenes (Muriana, 1996), a major biologicalhazard in the dairy industry. Therefore, production ofpediocin PA-1 in strains of dairy origin is an attractiveobjective. Heterologous production of this bacteriocin bystrains of Lactococcus lactis has been achieved using twostrategies: introduction of the whole pediocin PA-1 operon(pedABCD) (Buyong, Kok, & Luchansky, 1998; Chikindas,Venema, Ledeboer, Venema, & Kok, 1995), or theexploitation of the amino acid homologies shared amongleader peptides, and also among transporters of most classII bacteriocins (Horn et al., 1998; Horn et al., 1999; Horn,Fernandez, Dodd, Gasson, & Rodrıguez, 2004; Reviriegoet al., 2005). However, the results of the studies cited abovecannot be compared because of the different hosts,plasmids, promoters, substrates and antimicrobial assaysemployed.
e front matter r 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.
airyj.2006.05.013
ing author. Fax: +34 91 3943743.
ess: [email protected] (J.M. Rodrıguez).
In a previous study (Reviriego et al., 2005), pediocin-producing derivatives of the starter strains L. lactis ESI 153and ESI 515 (CL1 and CL2, respectively) were constructedby introduction of pFI2160. This pTG262-derivative vectorincludes a fragment (Lped-lcnCD) that contains a hybridgene encoding the lactococcin A leader fused to the maturepart of pediocin PA-1, and the genes lcnC and lcnD thatspecify the lactococcin A secretion apparatus (Horn et al.,1999). The objective of this work was to elucidate ifpediocin production could be enhanced in such hosts aftertransformation with plasmids harbouring the ped operonunder the control of a stronger promoter. In addition, weinvestigated if chromosomal integration of the ped genescould be an alternative for pediocin PA-1 production inlactococcal hosts.
2. Materials and methods
2.1. Microorganisms and culture conditions
The lactococcal strains used in this study are listed inTable 1. L. lactis ESI 153 and ESI 515 (a nisin-producingstrain; Nis+) were originally isolated from artisan raw milk
ARTICLE IN PRESS
Table 1
Lactococcal strains used in this study
Strain Host Plasmid Reference or source
MG1614 Gasson (1983)
LL108 (repA+) MG1363 Leenhouts et al. (1998)
LL108O LL108 pORI280-GalA’(EryR, pORI280 derivative, contains a BamHI site between the
initial and the final sequence of the galA gene of L. lactis)
W.A. Pool and A.R.
Neves
LL108W LL108 pWRC03 (EryR, pORI280-GalA’ derivative, contains the hybrid L-pedA gene
preceded by the lactococcin A promoter, lcnC and lcnD)
This study
IL1403MC IL1403 pMC117 (EryR, pMG36e derivative, contains the pediocin operon preceded by
the P32 promoter)
Chikindas, Venema,
Ledeboer, Venema, and
Kok (1995)
MG1363RK MG1363 pRK119 (CmR, pMG36c derivative, contains the pediocin operon preceded by
the P32 promoter)
R. Kemperman
MG1614CNC MG1614 pCNC16 (CmR, pTG262 derivative, contains the pediocin operon preceded by
the P32 promoter)
This study
CR MG1614 Plasmid free; the pWRC03 fragment containing L-pedA, lcnC and lcnD has
been integrated in the chromosome
This study
ESI 153 Cogan et al. (1997)
CL1 ESI 153 pFI2160 (CmR, pTG262 derivative, contains the hybrid L-pedA gene preceded
by the lactococcin A promoter, lcnC and lcnD)
Reviriego et al. (2005)
MC1 ESI 153 pMC117 This study
RK1 ESI 153 PRK119 This study
CNC1 ESI 153 pCNC16 This study
ESI 515 (Nis+) Cogan et al. (1997)
CL2 ESI 515 pFI2160 Reviriego et al. (2005)
MC2 ESI 515 pMC117 This study
RK2 ESI 515 PRK119 This study
CNC2 ESI 515 pCNC16 This study
C. Reviriego et al. / International Dairy Journal 17 (2007) 574–577 575
cheeses (Cogan et al., 1997), and have been successfullyused as adjuncts and/or starter cultures in cheese manu-facture (Rodrıguez, Gaya, Nunez, & Medina, 1998).Lactococcal strains were grown in M17 (Oxoid, Basing-stoke, UK) supplemented with 0.5% (w/v) glucose (GM17medium) or MRS (Oxoid) while Pediococcus acidilactici
347 (Rodrıguez et al., 1997) was grown in MRS. Cultureswere incubated at 32 1C without agitation. When appro-priate, chloramphenicol (Cm; Sigma, St Louis, USA) orerythromycin (Ery; Sigma) was added (5 mgmL�1) to thecultures.
2.2. Construction of lactococcal strains
Three plasmids harbouring the complete ped operonpreceded by the P32 promoter (Table 1) were used toelucidate if pediocin production could be enhanced in ESI153 and ESI 515: (1) pMC117, a pMG36e derivative(Chikindas et al., 1995); (2) pRK119, a pMG36c derivativekindly provided by R. Kemperman (University of Gronin-gen, The Netherlands); and (3) pCNC16, a pTG262derivative that was constructed as follows. A DNAfragment (3659-bp) containing the pediocin PA-1 operonunder the control of the P32 promoter was obtained byPCR from pRK119 using primers operonF (50-CGAA-GATCTGATATGATAAGATTAATAGTT-30) and oper-onR (50-CGAAGATCTCTATTCTTGATTATGAATTAAC-30), which include BglII sites (underlined), and thePlatinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Paisley, UK).
PCR conditions have been described previously (Reviriegoet al., 2005). After digestion with BglII (New EnglandBiolabs, Ipswich, USA), the fragment was cloned in theBamHI site of pTG262 generating pCNC16.Transformation of the lactococcal hosts with pCNC16,
pMC117 and pRK119 as described by Wells, Wilson, and LePage (1993) generated strains MC1, RK1 and CNC1,respectively, in the case of L. lactis ESI 153, and strainsMC2, RK2 and CNC2, respectively, in that of ESI 515.Pediocin PA-1 and nisin antimicrobial activities were assayedby a diffusion bioassay with Enterococcus faecalis TAB28(pediocin-sensitive; Joosten, Rodrıguez, & Nunez, 1997) andL. lactis MG1614 (nisin-sensitive; Gasson, 1983) as indicatororganisms. The supernatants were obtained from cultureswith a bacterial concentration of 1� 109 cfumL�1. L. lactis
BB24 (Nis+; Rodrıguez et al., 1995) and P. acidilactici 347(Ped+) were used as positive controls.Pediocin PA-1 activity in the culture supernatants was
quantified by a microtiter plate assay system (Holo,Nilssen, & Nes, 1991) with E. faecalis TAB28 as indicator.The assays were performed in quadruplicate and thestandard deviations (SD) values were calculated.
2.3. Chromosomal integration of the genes required for
pediocin PA-1 biosynthesis in L. lactis MG1614
The fragment Lped-lcnCD was amplified from pFI2160(Horn et al., 1999) with primers FBglIIlcnC (50-CGA-AGATCTGAGGCAGTAAGTAATATTATTTTC-30) and
ARTICLE IN PRESS
Table 2
Pediocin PA-1 production by the strains used in this study
Strain Pediocin PA-1 activity
(BU7SD)
%
P. acidilactici 347 1500729 100
L. lactis ESI 153 Nda —
L. lactis CL1 106712 7
L. lactis MC1 225715 15
L. lactis RK1 2447743 163
L. lactis CNC1 2478739 165
L. lactis ESI 515 Nd —
L. lactis CL2 3377 2
L. lactis MC2 751722 50
L. lactis RK2 1503734 100
L. lactis CNC2 1427740 95
L. lactis CR Nd —
aNd, not detected.
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RBglIIhybr (50-CGAAGATCTGCATAATGCTAGCATT-TATGAT-30) (annealing at 50 1C), which include BglIIsites (underlined). The resulting 4099-bp fragment was cutwith BglII and cloned in the BamHI site of the non-replicative vector pORI280-GalA0 (Table 1) to generatepWRC03. This plasmid was introduced into L. lactis
LL108 for maintenance purposes since this strain carriesseveral copies of repA in its chromosome (Leenhouts,Bolhuis, Venema, & Kok, 1998); then, pWRC03 wasintroduced into L. lactis MG1614, a strain in which theplasmid can not replicate, enabling the integration of thegenes required for pediocin PA-1 production into itschromosome. Integration of the fragment Lped-lcnCD
(4093bp) in the chromosome of L. lactis MG1614 wasassessed by PCR amplification using the primers FlcnC(50-GAGGCAGTAAGTAATATTATTTTC-30) and Rhybr(50-GCATAATGCTAGCATTTATGAT-30) (annealing at50 1C).
3. Results and discussion
Pediocin production was detected in the culture super-natants of strains CL1, MC1, RK1, CNC1, CL2 MC2,RK2 and CNC2 (Fig. 1a). The smallest inhibition zonescorresponded to CL1 and CL2 supernatants while thoseobtained by pRK119- or pCNC16-containing strains (RK1and RK2 or CNC2 and CNC1, respectively) displayed thelargest halos (Fig. 1a). These results were in agreement withthose obtained with the microtitre plate assay (Table 2).Pediocin production by CL1 and CL2 (Table 1) hadalready been achieved through the leader/transporterexchange strategy (Reviriego et al., 2005). However, thepediocin activity observed in those cultures was notablylower than that displayed by the strains carrying the ped
operon constructed in this study (Fig. 1a; Table 2). Thismay be a consequence of a higher biosynthetic capacity ofstrains containing the complete pediocin operon and/or the
Fig. 1. Agar diffusion bioassay for detection of pediocin PA-1 activity agai
MG1614 (B). Samples: 1 and 2, L. lactis ESI 153; 3, L. lactis CL1; 4, L. lactis M
L. lactis RK2; 3, L. lactis CNC2; 11, P. acidilactici 347; 12, L. lactis BB24; 13
effect of the strong P32 promoter since in pFI2160 thegenes required for pediocin biosynthesis are under thecontrol of the lactococcin A promoter. The highestpediocin production was achieved by strains RK1 andCNC1, which displayed 163% and 165%, respectively, ofthe activity displayed by P. acidilactici 347 (Table 2). Thepediocin activity showed by L. lactis MC1 (pMC117), wasmore than ten times lower than that detected in RK1(pRK119) supernatants (Table 2). Curiously, the maindifference between pMC117 and pRK119 is the antibioticresistance marker (Ery and Cm, respectively).The presence in L. lactis ESI 515 of either pMC117,
pRK119 or pCNC16 did not alter its nisin-producingphenotype (Fig. 1b), a finding that has been previouslyreported when this strain has been used as a host forpediocin PA-1 production (Horn et al., 1999, 2004;Reviriego et al., 2005). Pediocin production by strainMC2 (pMC117; 751 BU) was three times higher than inL. lactis MC1 (pMC117; 225 BU). In contrast, pediocin
nst Enterococcus faecalis TAB28 (A) and nisin activity against L. lactis
C1; 5, L. lactis RK1; 6, L. lactis CNC1; 7, L. lactis CL2; 8, L. lactis MC2; 9,
, L. lactis MG1614.
ARTICLE IN PRESSC. Reviriego et al. / International Dairy Journal 17 (2007) 574–577 577
activity in the supernatants of the ESI 515-derivatives(Nis+) carrying pRK119 (1503BU) or pCNC16 (1427BU)was lower than that found in the corresponding ESI 153-derivatives (Nis�) (2447 and 2478BU, respectively) (Fig. 1;Table 2). A reduced pediocin production in nisin/pediocinco-producing lactococci strains, in comparison with non-nisin producing L. lactis strains, has been previouslyreported (Horn et al., 1999, 2004; Reviriego et al., 2005).Nevertheless, the level of pediocin production by L. lactis
RK2 and CNC2 was approximately that observed in thewild strain P. acidilactici 347 (Fig. 1; Table 2). To ourknowledge, this represents the first report of L. lactis
strains technologically suited for cheese making with theability to co-produce pediocin PA-1 and nisin at levelscomparable to the respective parental strains (Table 2).
Finally, a DNA fragment carrying the genes required forproduction of pediocin PA-1 was successfully integrated inthe chromosome of L. lactis MG1614. However, produc-tion of pediocin PA-1 could not be detected in thesupernatants of the integrant, probably because of thesharp reduction in the copy number of the ped genes (1 percell). Work is in progress to obtain pediocin-producingL. lactis ESI 153 and ESI 515 derivatives suited for dairyapplications by the development of food-grade vectors.
4. Conclusions
L. lactis ESI 153 and ESI 515 derivatives carrying P32-ped operon-containing plasmids produced more pediocinPA-1 than L. lactis CL1 and CL2, in which a strategy basedon leader/transporter exchange was used. The enhancedproduction of pediocin PA-1 in L. lactis RK1 and CNC1,and the high coproduction of pediocin PA-1 and nisin inL. lactis RK2 and CNC2, makes these new strains veryattractive for the control of L. monocytogenes and otherpathogens in dairy products.
Acknowledgments
We are grateful to M. Medina (INIA, Madrid), W.A.Pool and A.R. Neves (University of Groningen, TheNetherlands), and R. Kemperman (University of Gronin-gen, The Netherlands) for providing us with strains ESI153, ESI 515, LL108O and MG1363RK. Plasmid pTG262was provided by N. Horn (Institute of Food Research,Norwich, UK) and used under a materials transferagreement. This work was partially support by grantAGL2002-04609-C02-02 from the Ministerio de Educaciony Ciencia (Madrid, Spain).
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HUMAN MILK IS A SOURCE OF LACTIC ACID BACTERIA FOR
THE INFANT GUT
ROCıO MARTıN, MSC, SUSANA LANGA, MSC, CARLOTA REVIRIEGO, MSC, ESTHER JIMENEZ, MSC, MARıA L. MARıN, PHD, JORDI XAUS, PHD,LEONIDES FERNANDEZ, PHD, AND JUAN M. RODRıGUEZ, PHD
Objectives To investigate whether human breast milk contains potentially probiotic lactic acid bacteria, and therefore,
whether it can be considered a synbiotic food.
Study design Lactic acid bacteria were isolated from milk, mammary areola, and breast skin of eight healthy mothers and
oral swabs and feces of their respective breast-fed infants. Some isolates (178 from each mother and newborn pair) were
randomly selected and submitted to randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) polymerase chain reaction analysis, and
those that displayed identical RAPD patterns were identified by 16S rDNA sequencing.
Results Within each mother and newborn pair, some rod-shaped lactic acid bacteria isolated from mammary areola, breast
milk, and infant oral swabs and feces displayed identical RAPD profiles. All of them, independently from the mother and child
pair, were identified as Lactobacillus gasseri. Similarly, among coccoid lactic acid bacteria from these different sources, some
shared an identical RAPD pattern and were identified as Enterococcus faecium. In contrast, none of the lactic acid bacteria
isolated from breast skin shared RAPD profiles with lactic acid bacteria of the other sources.
Conclusions Breast-feeding can be a significant source of lactic acid bacteria to the infant gut. Lactic acid bacteria present
in milk may have an endogenous origin and may not be the result of contamination from the surrounding breast skin. (J Pediatr
2003;143:754-8)
Breast-feeding protects the newborn against infectious diseases.1-3 This effect isprobably a result of the combined action of breast milk components, such asmaternal immunoglobulins, immunocompetent cells, or a variety of antimicrobial
compounds.4 Breast milk also contains prebiotic substances, the so-called bifidogenic factors,which may selectively stimulate the growth of a limited number of beneficial bacteria in thegut.5-7 Although modern infant formulas are made to mimic human breast milk, theyremain different from the natural biological fluid.8 As a consequence, differences in the gutmicroflora between breast-fed and formula-fed infants have been repeatedly observed.9-14
Studies on the microbiology of breast milk have been restricted to potentialpathogenic bacteria, mainly related to clinical cases of mastitis. There is a surprising lack ofstudies on the isolation and analysis of commensal or potential probiotic bacteria frommilkof healthy women. Neonates are particularly susceptible to infectious diseases.15 If bacteriawith the ability to confer health benefits to human hosts were isolated from breast milk,they would be considered attractive probiotic organisms. These bacteria would fulfill someof the main criteria generally recommended for human probiotics,16,17 such as humanorigin; a history of safe, prolonged intake by infants; and adaptation to dairy substrates.
In the current study, we investigated the presence of lactic acid bacteria in breast milkof healthy women, which may affect the qualitative and quantitative composition of theneonate gut microflora. Lactic acid bacteria can be isolated from the neonatal gut.10-18 Toelucidate the origin of such bacteria, we also isolated lactic acid bacteria from mammaryareola and breast skin. In addition, lactic acid bacteria were isolated from infant feces and
From the Departament of Nutricion yBromatologıa III, Universidad Complu-tense de Madrid, Madrid, and theDepartament de Immunology, PulevaBiotech, Granada, Spain.Supported in part by a grant from theMinisterio de Ciencia y Tecnologia,Spain, and by a grant from PulevaBiotech, Granada, Spain.Submitted for publication Apr 28, 2003;revision received July 31, 2003; acceptedSept 9, 2003.Reprint requests: Juan M. Rodrıguez,PhD, Departamento de Nutricion yBromatologıa III, Universidad Complu-tense de Madrid, 28040 Madrid, Spain.E-mail: [email protected]ª 2003Mosby, Inc. All rightsreserved.0022-3476/2003/$30.00 + 0
10.1016/j.jpeds.2003.09.028
KAA Kanamycin aesculin azidePCR Polymerase chain reaction
RAPD Randomly amplified polymorphic DNAVRBA Violet red bile agar
754
oral swabs to evaluate whether breast-feeding may play a rolein bacterial colonization of the infant digestive tract.
METHODSWritten informed consent was obtained from the
women and the parents of the children who provided thebiological samples used in this study. The protocol was ap-proved by the Ethical Committee of University Complutenseof Madrid, Spain.
The volunteer mothers belonged to the staff of ouruniversity and were recruited among mothers who attendedone of the two collaborating hospitals during their pregnancyand labor. They were enrolled in this study according with thefollowing criteria: (1) healthy women without current or pastunderlying conditions; (2) normal, full-term pregnancy; and(3) absence of infant or maternal perinatal problems (includingmastitis). The eight healthy pregnant women and their full-term breast-fed infants (seven vaginally delivered and one bornby cesarian section) provided a wide variety of asepticallycollected samples, including breast milk; swabs obtained frommammary areola, breast skin, and vagina of the mother; andinfant feces and oral swabs. All the samples were collected byduplicate on the fourth day postpartum. To assure the qualityof sample collection from mothers and infants, a team wasformed in each hospital, which included a senior obstetricianand gynecologist, a senior pediatrician, and a senior microbi-ologist. The samples were collected in sterile tubes and storedon ice until delivery to the laboratory. The samples wereprocessed 15 to 20 minutes after collection. Once diluted insterile peptone water (when required), the samples werecultured in triplicate on de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS,Oxoid, Basingstoke, UK) and kanamycin aesculin azide(KAA; Oxoid) agar plates for isolation of lactic acid bacteria,and also in violet red bile agar (VRBA; Difco, Detroit, Mich)and Nutrient agar (Oxoid) plates for isolation of otherbacterial groups, including Gram-negative bacteria. Theplates were anaerobically incubated at 378C for as long as 48hours. Approximately 300 isolates from each mother and childpair were examined by phase-contrast microscopy to de-termine cell morphology and Gram-staining reaction, andwere tested for oxidase and catalase activities. Subsequently,78 rod-shaped and 100 coccoid-shaped isolates (per eachmother and child pair) were randomly selected for furtherstudies, as follows: 44 from breast milk (22 rods, 22 cocci), 50from mammary areola swabs (25 rods, 25 cocci), 24 frombreast skin swabs (four rods, 20 cocci), 38 from infant feces (19rods, 19 cocci), and 14 from infant oral swabs (eight rods, 14cocci). The rod-shaped bacteria were isolated among thecolonies that grew on MRS plates, whereas the coccoidisolates were obtained from those growing on KAA plates.
The 178 isolates from each mother and child pair weredivided into two independent groups on the basis of theirmorphology (100 cocci and 78 rods) and submitted torandomly amplified polymorphic DNA (RAPD) polymerasechain reaction (PCR) analysis. Genomic DNA was isolatedfrom 10 mL overnight MRS cultures by using the DNeasy
Human Milk is a Source of Lactic Acid Bacteria for the Infant Gut
tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) following the protocolrecommended by the supplier for isolation of genomic DNAfrom Gram-positive bacteria. The DNA was used in sub-sequent PCR amplifications performed in Techne DNAThermal Cyclers (Techne, Cambridge, UK). In the case of therod-shaped isolates, PCR amplifications were performedas described by Veyrat et al19 by using either primer OPL5(59-ACGCAGGCAC-39), ISSRev (59-GGATCCAAGA-CAACGTTTCAAA-39), or ArgDei (59-ACCYTRGAA-GGYGGYGATGTB-39). In the case of the coccoid-shapedisolates, PCR reactions were performed following the pro-cedure described by Knijff et al20 using the primer pair A1
(59-GGGAAAACGACAATTGC-39) and A2 (59-GTA-CAATGCGGCCGTTA-39). A total of 5 lL of the PCRmixtures was analyzed on a 1.2% (wt/vol) agarose (Sigma, StLouis, Mo) gel with ethidium bromide staining. A 100-bpladder (Invitrogen, Paisley, UK) was used as a molecularweight standard. Gels were run for approximately 1 hour at100 V, and the DNA was visualized and analyzed in a geldocumentation system (Gel Doc 2000, Bio-Rad) by using theDiversity Database software package (Bio-Rad, Hercules,Calif).
Identification of the rod-shaped isolates that displayedidentical RAPDs profiles with the three primers tested wasperformed by 16S rDNA sequencing at three independentlaboratories: Department of Product Functionality, NIZOFood Research, Ede, The Netherlands; BCCM/LMGBacteria Collection, University of Gent, Gent, Belgium; andDepartment of Food Safety, BBSRC Institute of FoodResearch, Norwich, United Kingdom. Identification of thecoccoid-shaped isolates that shared the same RAPD patternand that grew well on KAA agar plates was based on PCRspecies-specific detection of enterococcal ddl genes, which en-code D-alanine:D-alanine ligases, following the protocol de-scribed by Dutka-Malen et al.21 For this purpose, four primerswere used: E1 (59-ATCAAGTACAGTTAGTCTT-39,
Figure. RAPD-PCR profiles obtained (A) with primer OPL5 fromL gasseri isolated from breast milk (lanes 1 and 2), mammary areola(lanes 3 and 4), infant feces (lane 5), and infant oral swabs (lane 6);and (B) with the primer pair E1-E2 from E faecium isolated frombreast milk (lanes 1 and 2), mammary areola (lanes 3 and 4), infantfeces (lane 5), and infant oral swabs (lane 6). L represents thestandard 100-bp ladder (Invitrogen, Paisley, UK).
755
Table I. L gasseri isolates that shared identical RAPD profiles
No. identical isolates (% of MRS isolates tested)*
Mother and infant pair A B C D E F G H
Maternal samplesBreast milk 5 (23) 7 (32) 8 (36) 6 (27) 4 (19) 5 (23) 9 (40) 4 (19)Mammary areola 13 (52) 16 (64) 16 (64) 14 (56) 14 (56) 12 (48) 17 (68) 11 (44)Breast skin 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)Vaginal swab 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Infant samplesFeces 6 (32) 7 (37) 8 (42) 5 (27) 5 (27) 7 (37) 9 (47) 5 (27)Oral swab 2 (25) 6 (75) 5 (62) 3 (37) 2 (25) 2 (25) 6 (75) 1 (12)
*Identical isolate means that, within each mother and infant pair, all the isolates included in the table shared identical RAPD profiles, independently fromtheir origin.
E2 (59-ACGATTCAAAGCTAACTG-39), F1 (59-GCA-AGGCTTCTTAGAGA-39), and F2 (59-CATCGT-GTAAGCTAACTTC-39). The first pair (E1 and E2)specifically detects Enterococcus faecium strains, whereas thesecond (F1 and F2) is specific for Enterococcus faecalis.
21 PCRresults were confirmed by 16S rDNA sequencing.
RESULTSBreast milk samples were collected from eight healthy
women and inoculated on MRS, KAA, VRBA, and Nutrientagar plates. By using the first three media, lactic acid bacteriawere isolated from all the samples, and the counts ranged from2 3 104 to 1 3 105 cfu mL�1, depending on the woman. Nogrowth was obtained on VRBA agar plates, and no Gram-negative bacteria could be detected on Nutrient agar. Lacticacid bacteria were also isolated frommaternal mammary areola(4 3 103 to 1 3 104 cfu per swab), breast skin (<20 cfu perswab), and vagina (1 3 103 to 5 3 103 cfu per swab), andfrom infant feces (6 3 107 to 4 3 108 cfu g-1) and oral swabs(1 3 103 to 3 3 103 cfu per swab). Approximately 300lactic acid bacteria from different biological samplesprovided by each mother and newborn pair by using MRS(pH 5.5) and KAA agar plates were initially isolated. Theisolates were examined by phase-contrast microscopy todetermine cell morphology and Gram-staining reaction, andwere tested for oxidase and catalase activities. All the isolateswere Gram-positive, catalase-negative, and oxidase-negativerods or cocci. Then, 78 rod-shaped and 100 coccoid-shapedisolates (from each mother and newborn pair) were randomlyselected.
The RAPD-PCR analyses created a vast amount ofdata; therefore, only the most significant results are com-mented on. Within each mother and child pair, the 78 rod-shaped and 100 coccoid-shaped isolates showed a large varietyof RAPD-PCR patterns. However, some rod-shaped lacticacid bacteria isolated from breast milk, mammary areola,infant feces, and infant oral swabs had identical RAPD profileswith the three primers tested (Table I, Figure, A ). For
756 Martın et al
example, in the case of the mother and newborn pair B (asa representative example of all the pairs), seven breast milkisolates, 16 mammary areola isolates, seven infant fecesisolates, and six infant oral swabs isolates displayed identicalRAPD patterns (Table I). All these isolates were identified asLactobacillus gasseri. Among the rod-shaped lactic acid bacteriaisolated from breast milk that did not share identical RAPDprofiles, one additional isolate was identified as Lactobacillusfermentum. The 16S rDNA sequencing results obtained by thedifferent labs were completely coincident.
Similar results were obtained with the coccoid-shapedlactic acid bacteria. In the case of pair B, two isolates frombreast milk, three from mammary areola, two from infantfeces, and three from infant oral swabs showed identicalRAPD profiles with the primer pair tested (Table II,Figure, B). These isolates were identified by species-specificPCR as E faecium; this result was further confirmed by 16SrDNA sequencing. Among the cocci that did not have thesame RAPD profiles, three additional breast milk isolates wererandomly selected and identified as E faecium. None of thebreast skin and vaginal isolates displayed a RAPD patternidentical to any of those obtained with isolates from the othersources (data not shown).
DISCUSSIONWe investigated the presence of lactic acid bacteria in
human breast milk. From the approximately 300 isolates thatwere initially isolated from the different sources provided byeach mother and newborn pair, 178 lactic acid bacteria werefurther selected, divided in two groups (78 rod-shaped and100 coccoid-shaped isolates), and used for RAPD analyses.The primers used for RAPD analyses were selected becausethey are designed to provide a high variability of patterns inlactobacilli (primers OPL5, ArgDei, and ISSRev)19 andenterococci (primer pair A1 and A2).
20 However, within thedifferent mother and newborn pairs, some rod-shaped isolatesdisplayed the same RAPD profiles with the three independentprimers, despite the fact that they had been isolated from
The Journal of Pediatrics � December 2003
Table II. E faecium isolates that shared identical RAPD profiles
No. identical isolates (% of KAA isolates tested)*
Mother and infant pair A B C D E F G H
Maternal samplesBreast milk 2 (9) 2 (9) 4 (18) 3 (14) 2 (9) 4 (18) 5 (23) 2 (9)Mammary areola 3 (12) 3 (12) 6 (24) 4 (16) 4 (16) 4 (16) 7 (28) 2 (8)Breast skin 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)Vaginal swab 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Infant samplesFeces 2 (11) 2 (11) 5 (26) 3 (16) 3 (16) 4 (21) 5 (26) 2 (11)Oral swab 2 (14) 3 (21) 2 (14) 1 (7) 0 (0) 2 (14) 5 (36) 1 (7)
*Identical isolate means that, within each mother and infant pair, all the isolates included in the table shared identical RAPD profiles, independent fromtheir origin.
different maternal and infant sources (excluding maternalbreast skin and vagina; Figure, A); similarly, some coccoidisolates showed an identical RAPD pattern using the primerpair A1 and A2 (Figure, B). All these 36 rod-shaped and14 coccoid-shaped isolates were identified as L gasseri andE faecium, respectively.
Among the lactic acid bacteria isolated from breast milktwo species clearly predominated: L gasseri and E faecium.These species are considered among the probiotic bacteria16,17
and contain strains that are used in commercial probioticproducts. Although enterococci are traditionally associatedwith food fermentations, and strains with histories of safe useare being commercially used, their use as probiotics requirescareful safety evaluation, because both expressed and silentvirulence genes have been identified among enterococcalstrains.22 The E faecium isolated from breast milk in this studywere tested for the virulence determinants proposed by Eatonand Gasson,22 and none of them could be detected (un-published data). Therefore, the breast milk of healthy womancan be considered a source of safe and potentially probioticlactic acid bacteria that may play an important role in theprevention of neonatal infectious diseases. It is not surprisingthat all the lactobacilli that shared the same RAPD profilewere identified as L gasseri, independently from their origin,because this particular species can be regarded as a generalmucosa-associated bacterium in human beings.23 The pres-ence of a few predominant bacterial species, such as L gasseriand E faecium, in breast milk may be one of the reasons whythe gut microbiota of breast-fed infants is composed ofa relatively narrow spectrum of Gram-positive bacterialspecies, and a more diverse microbiota develops only afterdietary supplementation commences.10 As previously observedby different authors,6,9,10,12,13 the composition of the gutmicroflora is profoundly influenced by the diet of the infant,and the introduction of solid food and the withdrawal of breastmilk coincide with major microbiota changes.10
None of the few lactic acid bacteria isolated from breastskin shared RAPD profiles with lactic acid bacteria isolatedfrom breast milk or mammary areola (data not shown), whichsuggests that most breast milk lactic acid bacteria have an
Human Milk is a Source of Lactic Acid Bacteria for the Infant Gut
endogenous origin and that cross-contamination with skinbacteria has, if any, a secondary role as a lactic acid bacteriasource for the infant gut. Lactic acid bacteria present incolostrum and breast milk probably form a biofilm on themammary areola, inside the mammary duct system, or both.The mammary gland prepares for lactation through a series ofdevelopmental steps during adolescence and pregnancy. Theprincipal feature of mammary growth in pregnancy is a greatincrease in ducts and alveoli. Late in pregnancy, the lobules ofthe alveolar system are maximally developed, and smallamounts of colostrum may be released for several weeksbefore delivery. In addition, the nipple and areola markedlyenlarge, and the sebaceous glands become more prominent.8
These changes provide good conditions for biofilm formation.The increased lymph and blood supply of the mammary glandand the oxytocin release that causes contraction of the myo-epithelial cells that invest the mammary alveoli may also facil-itate the presence of lactic acid bacteria in breast milk.8
None of the vaginal isolates tested shared RAPDprofiles with lactic acid bacteria isolated from other sourcesof the same mother and infant pair; in addition, no remarkabledifferences were found between the results obtained fromsamples of the vaginally delivered infants and those obtainedfrom the cesarean-born one (pair D; Tables I and II). Bothobservations give rise to questions on the role of vaginal florain the early bacterial colonization of the newborn intestinaltract, and this subject should be addressed in future studies.
In conclusion, the results of this work indicate thatbreast milk contains lactic acid bacteria, is a natural source oflactic acid bacteria for the newborn through breast-feeding,and may be considered a synbiotic food. Pulsed-field gelelectrophoresis profiling of the strains displaying identicalRAPD patterns is in progress, and the preliminary resultsreinforce our findings. Work is in progress to elucidate thecomposition, origin, and significance of the neonatal gutmicrobiota and its relationships with the bacteria isolated frombreast milk by using more powerful molecular techniques suchas those based on 16S rRNA genes. In addition, we are alsostudying the probiotic potential of some of the lactic acidbacteria isolated from breast milk.
757
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The Journal of Pediatrics � December 2003
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
173
VIII. ACTIVIDAD ANTI-Listeria Y PROPIEDADES
BIOQUÍMICAS DE INTERÉS PARA LA INDUSTRIA LÁCTEA
EN CEPAS DE Enterococcus faecium AISLADAS DE LECHE
MATERNA
Manuscrito en preparación
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
174
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
175
Actividad anti-Listeria y propiedades bioquímicas de interés para la
industria láctea en cepas de Enterococcus faecium aisladas de leche
materna
Anti-Listeria activity and biochemical properties of interest to dairy
industries in Enterococcus faecium strains isolated from human milk
C. Reviriego, R. Arroyo, J.M. Rodríguez, L. Fernández*
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad
de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain
*Autora para correspondencia.
Fax 34-91-3943743; Correo electrónico: [email protected]
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
176
Resumen
En este trabajo se ha evaluado la actividad anti-Listeria y diversas propiedades
bioquímicas de interés tecnológico en siete cepas de E. faecium aisladas de leche
materna poseían In vitro, todas las cepas inhibieron el crecimiento de diversas cepas de
Listeria monocytogenes y Listeria innocua, siendo E. faecium LJx4 la que manifestó la
actividad anti-Listeria más potente. En cuanto a las propiedades tecnológicas, su
actividad acidificante fue baja y no mostraron actividad proteolítica detectable, a
excepción de dos cepas (LJx4 y Lc4) en las que la actividad fue pequeña. En contraste,
todas las cepas mostraron actividad peptidásica y esterásica. Finalmente, se evaluó la
eficacia de E. faecium LJx4 para inhibir el crecimiento de Listeria innocua SA1
durante la elaboración de quesos. Los quesos se manufacturaron a partir de leche
inoculada con la cepa LJx4, con o sin la presencia de L. innocua SA1 (~4 log ufc/ml).
Al final del período de maduración, los recuentos de L. innocua fueron de,
aproximadamente, 5×102 ufc/g en presencia de E. faecium LJx4 y de 2×106 ufc/g en su
ausencia. Los enterococos analizados podrían resultar útiles como cultivos adjuntos
y/o bioprotectores en la elaboración de quesos.
Abstract
In this work, the anti-Listeria activity and a variety of biochemical properties of
seven E. faecium strains isolated from breast milk were analyzed. In vitro, all the
enterococcal strains inhibited the growth of all the Listeria monocytogenes and Listeria
innocua strains tested, being E. faecium LJx4 the one that showed the highest anti-
Listeria activity. In relation to the technological properties, their acidifying capacity
was low and they did not show detectable proteolytic activity, with the exception of
two strains (LJx4 y Lc4) which displayed a low activity. In contrast, all the strains
showed peptidase and esterase activities. Finally, the effect of E. faecium LJx4 on the
survival of Listeria innocua SA1 during cheese ripening was also investigated.
Cheeses were manufactured from milk inoculated with the enterococcal strain and with
or without the Listeria strain (4 log CFU/ml). At the end of the ripening period, counts
of L. innocua were approximately 5×102 CFU/g in cheeses made with E. faecium
LJx4, and 2×106 CFU/g in those in which the enterococcal strain was not present. The
enterococcal strains could be useful as adjunct and/or bioprotective in cheese making.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
177
1. INTRODUCCIÓN
Los enterococos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza,
asociados a los alimentos, en el ambiente y como constituyentes de la microbiota
intestinal humana. Su elevada tolerancia al calor, su capacidad para adaptarse a
distintos sustratos y su resistencia a condiciones ambientales adversas les permiten
colonizar una gran variedad de nichos ecológicos (Giraffa, 2002). En estos momentos
el género Enterococcus es el más controvertido dentro de las bacterias lácticas. Por
una parte, los enterococos juegan un papel fundamental en la obtención de muchos
productos fermentados, como quesos, embutidos o aceitunas, y algunas cepas se
emplean como probióticos. Por otra, algunas cepas de enterococos están dotadas de
factores de virulencia propios de patógenos oportunistas y son responsables de
infecciones nosocomiales en individuos inmunodeprimidos (Franz et al., 2003;
Foulquié Moreno et al., 2006; Giraffa, 2002; Ogier y Serror, 2007). Los enterococos
son intrínsecamente resistentes a muchos de los agentes antimicrobianos empleados
para tratar infecciones humanas aunque es más preocupante su capacidad para
adquirir y transferir resistencias (Mundy et al., 2000). Las resistencias a niveles
elevados de glucopéptidos (vancomicina, teicoplanina y avoparcina) resultan de
particular interés ya que la vancomicina es uno de los últimos recursos para el
tratamiento de infecciones originadas por bacterias multirresistentes (Franz et al.,
2003).
Los enterococos son fundamentales para la maduración y el desarrollo del
flavor en la mayoría de los quesos del sur de Europa, independientemente de que
hayan sido elaborados con leche cruda o pasterizada o con leche de cualquiera de las
especies empleadas habitualmente (Foulquié Moreno et al., 2006). Las especies que
se aíslan con mayor frecuencia de productos lácteos son Enterococcus faecalis, E.
faecium y E. durans. El número de enterococos presentes en el queso es, además,
relativamente elevado desde las primeras etapas de elaboración (104-106 UFC/g en la
cuajada) hasta el final de la maduración (105-107 UFC/g) (Franz et al., 1999; Ogier y
Serror, 2007). Los enterococos pueden contribuir a la proteolisis, a la generación de
ácidos grasos y a la producción de diacetilo y acetoína (Centeno et al., 1999;
Sarantinopoulos et al., 2001). Un beneficio adicional que pueden aportar los
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
178
enterococos durante la elaboración del queso es la producción de bacteriocinas
activas frente a patógenos de origen alimentario (Franz et al., 2007).
Otro aspecto interesante de los enterococos es su potencial como probióticos,
en cepas cuya seguridad haya sido confirmada. Después de los lactobacilos, los
enterococos son las bacterias que se emplean con mayor frecuencia como probióticos
en el hombre, e incluso en los animales (Holzapfel et al., 1998). Existen en el
mercado preparados comerciales que contienen diversas cepas de E. faecium cuya
efectividad como probióticos se ha demostrado en ensayos clínicos (Foulquié Moreno
et al., 2006).
La caracterización de la microbiota presente en la leche de mujeres sanas ha
revelado que está compuesta de un espectro relativamente pequeño de bacterias, entre
las que se encuentran diversas especies de enterococos (Martín et al., 2003). En un
trabajo anterior, se investigó la presencia de diversos rasgos genéticos y fenotípicos
de importancia clínica en siete cepas aisladas de E. faecium procedentes de varias
mujeres sanas. En ninguna de las cepas se detectó ningún factor de virulencia,
indicando su seguridad para los lactantes (Reviriego et al., 2005). Dada la
competitividad de los enterococos, el objetivo de este trabajo fue determinar la
actividad anti-Listeria y algunas propiedades bioquímicas de relevancia tecnológica
en estas cepas de E. faecium para evaluar su posible inclusión como cultivos
iniciadores, bioprotectores o adjuntos en la elaboración de productos lácteos
fermentados.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Bacterias y condiciones de cultivo
En este trabajo se ha empleado una colección de siete cepas de Enterococcus
faecium aisladas de tres muestras de leche materna (Reviriego et al., 2005). Como
referencia se han empleado diversas cepas de origen lácteo. E. faecalis TAB 28, E.
faecalis TAB 52, Lactococcus lactis ESI 153 y L. lactis ESI 515 fueron aisladas
originalmente de quesos artesanos elaborados con leche cruda (Cogan et al., 1997) y
se han empleado en repetidas ocasiones como cultivos iniciadores y/o adjuntos para
la elaboración de queso (Rodríguez et al., 1998). E. durans AZ6 es una cepa aislada
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
179
de queso elaborado con leche cruda de cabra por su notable actividad esterásica y,
junto con L. lactis 18-16, L. lactis E8 y Lactobacillus helveticus CNRZ32, procede de
la colección que mantenemos en nuestro laboratorio. Los enterococos y el lactobacilo
se mantuvieron en caldo MRS (Oxoid) y los lactococos en caldo GM17 (M17
complementado con 0,5% de glucosa), a los que se añadió glicerol (15% v/v), a -
80ºC. Estos cultivos se revitalizaron (1% v/v) en el medio correspondiente antes de
ser utilizados. Todos ellos se incubaron a 32ºC, excepto L. helveticus CNRZ32 que se
incubó a 42ºC.
2.2. Actividad anti-Listeria
La capacidad anti-Listeria de las cepas de E. faecium aisladas de leche
materna se evaluó mediante la técnica de Magnusson y Schnürer (2001) empleando
las siguientes bacterias indicadoras de nuestra colección: Listeria monocytogenes
ScottA, Ohio, CA y SLR1, y Listeria innocua RdC y TFD1. Para ello, se emplearon
placas de agar MRS en las que se habían sembrado las cepas de E. faecium en forma
de estrías de aproximadamente 2 cm de largo; tras una incubación a 37ºC durante 24
h, se añadió una capa (10 ml) de agar BHI (0,7%) con 105 UFC del correspondiente
indicador. A continuación, las placas se incubaron a 32ºC durante 48 h. Finalmente,
se examinaron las placas para detectar zonas de inhibición (>2 mm) alrededor de las
estrías de las cepas de E. faecium. Todos los ensayos de inhibición se realizaron por
triplicado.
Paralelamente, se investigó si la posible actividad inhibidora era debida a la
producción de bacteriocinas. Inicialmente, las cepas de E. faecium se crecieron en
caldo MRS a 37ºC hasta el inicio de la fase estacionaria (A620~1). Los cultivos se
centrifugaron a 12.000 g durante 10 min a 4ºC, y los sobrenadantes se neutralizaron a
6,2 con NaOH 1 M, se hirvieron durante 5 min y se filtraron a través de filtros de 0,22
µm de diámetro de poro (Millipore, Bedford, USA). La actividad bacteriocinogénica
de los sobrenadantes libres de células se determinó mediante un ensayo de difusión en
agar. Alícuotas (50 µl) de los sobrenadantes se depositaron en pocillos (7 mm
diámetro) realizados en placas de agar BHI previamente inoculadas (105 UFC/ml) con
las cepas indicadoras citadas previamente. Las placas se mantuvieron a 4ºC durante 2
h y, posteriormente, se incubaron a 32ºC durante 24 h.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
180
2.3. Actividad acidificante
La actividad acidificante de las distintas bacterias se evaluó midiendo el
cambio del pH y la acidez titulable (expresada como g 100 mL-1) en leche desnatada.
Las bacterias se cultivaron en caldo MRS o GM17 a 32ºC y este cultivo se empleó
para inocular al 1% (v/v) leche desnatada en polvo reconstituida (al 10%, p/v)
(Oxoid) y sometida a un tratamiento térmico suave (121ºC, 5 min). El pH se midió
con un pH-metro a las 6, 12 y 24 h de incubación a 32ºC. La acidez se determinó por
titulación con 0,11 M NaOH en presencia de fenoftaleína y se expresó como la
cantidad de ácido láctico producido (g 100 mL-1). Ambos parámetros, pH y acidez
titulable, se estimaron empleando dos duplicados por cada cepa.
2.4. Actividad proteolítica
La actividad proteolítica se determinó con el ensayo espectrofotométrico
basado en el empleo de OPA (o-phthaldialdehido) descrito por Church y col. (1983).
Este ensayo detecta los grupos amino α liberados por la hidrólisis de la caseína, tras
reaccionar con OPA y mercaptoetanol β para formar un complejo que absorbe
fuertemente a una densidad óptica de 340 nm (DO340). Las bacterias se cultivaron en
caldo MRS o GM17 a 32ºC y, a continuación, para reducir al mínimo la cantidad de
grupos amino libres en el inóculo, se lavaron y resuspendieron en un volumen igual al
original de tampón fosfato sódico 0,32 mM, pH 7,2. Las células lavadas se inocularon
(1%) en leche desnatada en polvo (Nestlé) reconstituida e incubada a 32ºC durante 24
h. Como control, se incubó una muestra sin inocular. Los valores de la actividad
proteolítica se expresaron con la diferencia en DO340 entre los cultivos de las bacterias
y la leche sin inocular.
2.5. Preparación de extractos intracelulares
Las bacterias se incubaron en caldo MRS hasta el final de la fase exponencial
de crecimiento. Las células se recuperaron por centrifugación (10000 ×g) durante 10
min a 4ºC y se lavaron dos veces con solución salina fría (0,85% NaCl, p/v).
Finalmente, se resuspendieron en tampón fosfato 50 mM, pH 7, de tal forma que se
concentraron 100 veces con respecto al volumen original del cultivo. La suspensión
de bacterias se mezcló con 0,5 ml de perlas de vidrio, enfriándose la mezcla en hielo.
A continuación se sometieron a cuatro ciclos de agitación a 5 m s-1 y de 15 s de
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
181
duración en un FastPrep FP120 (Qbiogen), enfriándose en hielo entre los ciclos. Las
perlas de vidrio y los restos celulares se eliminaron por centrifugación (13.000 rpm,
15 min, 4ºC). Los sobrenadantes recuperados se emplearon como extractos
intracelulares. El contenido de proteína en los extractos intracelulares se determinó
con el método de Bradford (BioRad), empleando seroalbúmina bovina (Sigma) como
estándar.
2.6. Actividad peptidásica
La actividad aminopeptidásica de las bacterias se ensayó utilizando los
sustratos L-alanina p-nitroanilida (Ala-pNA), L-leucina p-nitroanilida (Leu-pNA), L-
lisina p-nitroanilida (Lys-pNA), L-prolina p-nitroanilida (Pro-pNA) y ácido L-
glutámico p-nitroanilida (Glu-pNA) y la actividad dipeptidásica con glicil- L-prolina
p-nitroanilida (Gly-Pro-pNA) (Sigma). El ensayo se hizo en placas multipocillos,
estando la mezcla de reacción formada por 200 µl de tampón fosfato sódico 50 mM,
pH 7, 25 µl de extracto intracelular (diluido en caso necesario) y 25 µl de la solución
de sustrato 20 mM recién preparada en metanol. Para determinar la cantidad de p-
nitroanilina liberada se midió el incremento en la absorbancia a 410 nm al cabo de
una h de incubación a 37ºC. La actividad peptidásica específica se expresó como los
nmoles de pNA liberados por miligramo de proteína en el extracto intracelular y por h
de incubación.
2.7. Actividad esterásica y lipásica
Para la determinación de las actividades esteárica y lipásica se emplearon seis
derivados α-naftil (α-NA) de los ácidos acético (C2), propiónico (C3), butírico (C4),
caproico (C6), palmítico (C16) y esteárico (C18) (Sigma). El método empleado se
desarrolló a partir del descrito por Abeijón y col. (2006), adaptándolo para realizarlo
en placas multipocillos. La mezcla de reacción contenía 28 µl de tampón fosfato
sódico 50 mM, pH 7, 10 µl de extracto intracelular (diluido, como mínimo, diez veces
en el mismo tampón) y 2 µl de la solución de sustrato 10 mM recién preparada en
metanol. Después de incubar la mezcla a 37ºC durante una h, se añadieron 60 µl de
Fast Garnet GBC (Sigma) con una concentración de 0,5 mg mL-1 en SDS al 10%
(p/v) y 100 µl de SDS al 10%. A continuación se procedió a la lectura de la
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
182
absorbancia a 560 nm. Los resultados se expresaron como los µmoles de naftol α
liberados por miligramo de proteína en el extracto intracelular y por h de incubación.
2.8. Perfil de actividad esterásica
Los extractos intracelulares (aproximadamente 150 mg de proteína) se
separaron mediante electroforesis en geles de acrilamida-agarosa utilizando
condiciones no desnaturalizantes y tampón HEPES 50 mM pH 7,2 con 5 mM MgCl2,
según describen Benoist y Schwencke (1990) en una unidad de electroforesis Mini
Protean 2 (BioRad). La electroforesis se llevó a cabo a voltaje constante (60 V)
durante 2 h. Al finalizar, los geles se equilibraron durante 20 min con tampón HEPES
100 mM pH 7,5 con NaCl 100 mM y MgCl2 5 mM. A continuación se añadieron a
cada gel 50 ml del mismo tampón conteniendo como sustrato el derivado α-NA del
ácido acético, propiónico o butírico (20 mM en dimetilsulfóxido, concentración final)
correspondiente y 1% de Fast Garnet GBC. Las bandas con actividad esterásica se
visualizaron en el gel como zonas de color negro.
2.9. Elaboración de quesos experimentales y análisis microbiológicos
Los quesos se elaboraron a partir de leche pasterizada de la forma descrita por
Rodríguez et al. (2005) y Reviriego et al. (2007) en dos ensayos independientes. En
cada ensayo, la leche (32ºC; CaCl2: 0,01%) se distribuyó en 5 cubas (1,5 l por cuba).
Dos de las cubas se inocularon con un 1% de un cultivo en leche (~9 log UFC/ml) de
E. faecium LJx4. Otras dos cubas se coinocularon con la cepa enterocócica (de la
forma descrita anteriormente) y con L. innocua SA1 (concentración final: 4 log
UFC/ml). La cuba restante se inoculó únicamente con L. innocua SA1. La renina
(Naturen Powder, Chr. Hansen, Hørsholm, Dinamarca) se añadió a la leche 20 min
después de que se inoculara con los cultivos bacterianos. Las cuajadas se cortaron 40
min después de la adición de reinina y, seguidamente, se calentaron a 38ºC durante 20
min. Tras drenar el suero, las cuajadas se distribuyeron en moldes cilíndricos de
plástico. A partir de cada cuba se obtuvo un único queso (~190 g). Los quesos se
prensaron durante 4 h a temperatura ambiente, se salaron en una salmuera (15%)
durante 45 min y se mantuvieron a 20ºC durante 16 h. Entonces, cada queso se cortó
en 5 piezas, que se envasaron al vacío individualmente en bolsas de plástico Cryovac,
y se dejaron madurar a 12ºC durante 4 semanas.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
183
Antes del prensado, se tomaron dos muestras (2 g) de cuajada de cada cuba.
Posteriormente, se tomaron muestras de los quesos en los días 1 (antes del envasado
al vacío), 7, 14, 21 y 28. Los recuentos de L. innocua se determinaron por duplicado
en placas de agar PALCAM agar plates (Biomerieux, Marcy L’Etoile, Francia), que
se incubaron a 32ºC durante 48 h.
2.10. Análisis estadístico
En este trabajo se ha utilizado el análisis de la varianza (ANOVA) con el test
de Duncan de comparaciones múltiples post hoc. Todos los experimentos se
repitieron al menos dos veces.
3. RESULTADOS
3.1. Actividad anti-Listeria
Las 7 cepas de E. faecium mostraron actividad antimicrobiana (zona de
inhibición >2 mm alrededor de la estría) frente a todas las listerias empleadas como
bacterias indicadoras. Sin embargo, no se pudo detectar actividad bacteriocinogénica
en las condiciones en las que se realizaron los ensayos.
3.2. Actividad acidificante: acidez titulable y evolución del pH
La actividad acidificante de las siete cepas de E. faecium aisladas de leche
humana se evaluó durante su crecimiento en leche desnatada, registrando la evolución
del pH y determinando el ácido láctico producido (Tabla 1). El pH inicial de la leche
fue 6,57. Al cabo de 6 h de crecimiento a 32ºC, todas estas cepas de E. faecium habían
disminuido el pH de los cultivos en leche a valores que oscilaban entre 6,06 (Lc27 and
LJx27) y 6,11 (Lc4). Otras especies de enterococos (E. faecalis y E. durans) de origen
alimentario, aisladas de quesos artesanos, que se incluyeron en este estudio tuvieron el
mismo comportamiento (P < 0.01) que los E. faecium de origen humano en relación
con la disminución del pH durante este periodo de tiempo. El valor más bajo de pH
(pH 5,43) que se obtuvo al cabo de 6 h se correspondió con L. lactis ESI 153, la
bacteria con mayor capacidad acidificante. Al cabo de 24 h a 32ºC, el pH de ninguno
de los cultivos en leche de E. faecium, ni el de E. faecalis TAB52, había descendido
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
184
por debajo de 5,0. En cambio, E. faecalis TAB28 y L. lactis ESI 153 habían alcanzado
este valor en menos de 12 h.
Los valores correspondientes a la producción de ácido cuando esas bacterias
crecieron en leche desnatada también se muestran en la Tabla 1. La cantidad de ácido
láctico producido por las cepas de E. faecium aisladas de leche materna después de 6
h osciló entre 0,06 y 0,08 g 100 mL-1. Tampoco se observó ninguna diferencia (P <
0.01) en la cantidad de ácido láctico producido por estos aislados ni siquiera al cabo
de 12 (0,09-0,14 g 100 mL-1) ó 24 h (0,18-0,21 g 100 mL-1) a 32ºC. Por lo tanto,
deben considerarse con escasa capacidad acidificante, ya que la cantidad de ácido
producida fue muy inferior a la necesaria para la coagulación de la leche. Por otra
parte, todos los enterococos de origen alimentario, a excepción de E faecalis TAB52,
y todos los lactococos mostraron una buena capacidad acidificante (>0,3 g de ácido
láctico 100 mL-1) transcurridas 24 h, provocando la coagulación de la leche. E.
faecalis TAB28 y L lactis ESI 153 coagularon la leche desnatada reconstituida en
menos de 12 h.
3.3. Actividad proteolítica
La actividad proteolítica de las bacterias se determinó en leche desnatada
reconstituida (Tabla 2). En el ensayo del OPA se detectan los grupos amino α, que
aparecen como consecuencia de la proteolisis de las proteínas de la leche, por lo que
da una medida directa de la actividad proteolítica. Ninguna de las cepas de E. faecium
tuvo una actividad proteolítica detectable, excepto las cepas Lc4 y LJx4, que liberaron
una pequeña cantidad de grupos amino (DO340 0,018 ± 0,002 y 0,009 ± 0,001,
respectivamente). La actividad proteolítica más intensa fue la mostrada por las cepas
E. faecalis TAB28 y L. lactis ESI153 (DO340 0,287 ± 0,011 y 0,141 ± 0,008,
respectivamente). En el resto de las bacterias ensayadas, no se detectó actividad
proteolítica (Tabla 2); de hecho, la cantidad de grupos amino α presentes en las
muestras de leche en las que habían crecido esas bacterias era inferior que en el
control, indicando que seguramente las bacterias habían empleado para su crecimiento
una buena parte del nitrógeno soluble presente en la leche.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
185
3.4. Actividad peptidásica
La actividad peptidásica de las distintas bacterias sobre varios sustratos se
muestra en la Tabla 3. Las cepas de E. faecium procedentes de leche materna
mostraron actividad aminopeptidásica frente a Glu-, Ala-, Leu- y Lys-pNA, pero no
frente a Pro-pNA. El nivel de actividad observada con los sustratos Ala-, Leu- y Lys-
pNA fue similar (entre 4 y 16 nmol mg-1 proteína h-1) y aproximadamente unas diez
veces inferior al obtenido al emplear Glu-pNA (entre 50 y 113 nmol mg-1 proteína h-
1). Ninguna de las siete cepas de enterococos de leche materna mostró actividad
dipeptidásica con Gly-Pro-pNA como sustrato y lo mismo sucedió con las tres cepas
de enterococos de origen alimentario, E. faecalis TAB52 y TAB28 y E. durans AZ6.
De las cepas de enterococos de leche materna, E. faecium Lc4 fue la que tuvo una
mayor actividad aminopeptidásica con todos los sustratos ensayados.
La actividad aminopeptidásica de E. faecalis TAB52 y TAB28 fue muy
parecida a la de los enterococos de leche materna, excepto que fueron incapaces de
hidrolizar Glu-pNA. En cambio, E. durans AZ6 hidrolizó todos los sustratos
ensayados, incluso Pro-pNA, y su actividad aminopeptidásica fue bastante más
elevada que la del resto de los enterococos.
A diferencia de los enterococos, L. lactis ESI153, ESI515, 18-16 y E8 y Lb.
helveticus CNRZ32 mostraron una intensa actividad dipeptidásica frente a Glu-Pro-
pNA. Además, la actividad aminopeptidásica de estas bacterias, aunque variable de
unas cepas a otras, fue muy superior a la de las cepas de E. faecium y E. faecalis,
excepto con el sustrato Glu-pNA.
3.5. Actividad esterásica y lipásica
La actividad esteárica de las bacterias se determinó en los extractos
intracelulares empleando los derivados α-NA de los ácidos grasos C2, C3, C4 y C6
como sustratos (Fig. 1). Se detectó actividad esterásica en los extractos intracelulares
de todas las bacterias ensayadas, obteniéndose los valores más altos en los
enterococos.
Como ya se había observado con la actividad aminopeptidásica, el
comportamiento de los E. faecium aislados de leche materna fue bastante similar. En
todos ellos el valor más alto de actividad esterásica siempre se obtuvo con los
derivados del ácido propiónico (entre 85,24 y 114,22 µmoles de α-NA mg-1 proteína
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
186
h-1) y el ácido butírico (entre 65,61 y 99,64 mg-1 proteína h-1). La actividad esterásica
con los derivados del ácido acético (entre 17,91 y 28,73 µmoles de α-NA mg-1
proteína h-1) y caprílico (entre 16,70 y 23,28 µmoles de α-NA mg-1 proteína h-1) fue
bastante menor.
La actividad esterásica de E. faecalis TAB52 y TAB28 fue superior a la de los
enterococos de leche materna, especialmente con el α-NA-propionato (entre 132,97 y
193,00 µmoles de α-NA mg-1 proteína h-1). La diferencia de actividad entre el
derivado del ácido propiónico y el del butírico fue, también, mucho más marcada en
estas dos cepas.
A diferencia de lo observado con la actividad peptidásica, Lb. helveticus
CNRZ32 apenas tuvo capacidad para hidrolizar ninguno de los cuatro sustratos
ensayados. Los lactococos, por su parte, tuvieron un comportamiento variable, pero
en general se caracterizaron por su escasa actividad esterásica. Quizá deba resaltarse
que en L. lactis 18-16 y E8 la actividad más intensa se correspondía con el derivado
del ácido caprílico, siendo ésta, por otra parte, muy similar a la observada en los
enterococos.
Finalmente, en ningún caso se observó actividad lipolítica apreciable
empleando como sustratos los derivados α-NA de los ácidos grasos palmítico ni
esteárico.
3.6. Perfiles de esterasas
La detección de actividad esterásica después de la separación electroforética de
los extractos intracelulares reveló que el sistema esterásico de las bacterias lácticas es
bastante complejo, con una gran diversidad entre los distintos géneros e incluso dentro
de la misma especie (Fig. 2). Todos los enterococos aislados de leche materna
mostraron una única banda (Rf de 0,34) con actividad frente a los tres sustratos
ensayados, los derivados de los ácidos acético, propiónico y butírico. En E. faecalis
TAB28 y TAB52, así como en E. durans AZ6 el perfil fue más complejo, detectándose
entre dos y tres bandas adicionales con los sustratos α-NA-propionato y -butirato con
Rf de 0,27 y 0,22. El perfil de los lactococos y de Lb. helveticus CNRZ32 fue
completamente distinto y característico de cada cepa, mostrando cada una entre una y
tres bandas con actividad. Es de destacar que a igual concentración de proteína, la
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
187
intensidad de las bandas (actividad esterásica en los geles) casi siempre fue
notablemente superior en los enterococos aislados de leche materna.
3.7. Efecto de E. faecium LJx4 frente a L. innocua en quesos experimentales
La actividad anti-Listeria de E. faecium LJx4 se evaluó en quesos inoculados
con L. innocua SA1. En los quesos que contenían el enterococo, los valores de pH
oscilaron entre 4,94 y 4,99 en el día 1 y entre 4,66 y 4,67 al final del periodo de
maduración (Tabla 4). Por otra parte, el pH de los quesos que únicamente se
inocularon con L. innocua SA1 varió de aproximadamente 6,18 (día 1) a 4,95 (día 28)
(Tabla 4). En los quesos control, los recuentos de L. innocua SA1 fueron de 7,40 log
UFC/g en el día 1 y disminuyeron durante la maduración hasta alcanzar 6,35 log
UFC/g en el día 28 (Tabla 5). La presencia de E. faecium LJx4 provocó una
reducción significativamente mayor (P<0.01) en los recuentos finales de L. innocua,
que fueron 3,64 unidades logarítmicas menores que los observados en los quesos
control tras 28 días de maduración (Tabla 5).
4. DISCUSIÓN
Los productos fermentados gozan de gran popularidad porque se perciben
como naturales, sanos, nutritivos y sensorialmente atractivos. Estas características tan
deseables son consecuencia del crecimiento y metabolismo de los microorganismos
que intervienen en la fermentación (Cogan et al., 2007; Law, 2001). La práctica
habitual en la industria alimentaria, que persigue obtener productos con características
consistentes y un control adecuado de la fermentación, ha reducido notablemente el
número de cepas que se emplean. En consecuencia, las propiedades organolépticas de
los productos procedentes de fermentaciones industriales a menudo se consideran
demasiado uniformes y poco atractivas. Existe, por tanto, una necesidad de buscar
nuevas cepas de bacterias que se puedan utilizar para aumentar la biodiversidad,
diversificar el flavor y recuperar las características propias de los productos
tradicionales (Cogan et al., 2007; Peláez y Requena, 2005). Por otro lado, también hay
un gran interés en desarrollar productos que aporten un beneficio adicional a la salud
de los consumidores (Saxelin et al., 2005).
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
188
La leche de mujeres sanas se podría considerar, teniendo en cuenta lo anterior,
una fuente potencial de nuevas bacterias, dado que por su origen estas bacterias serían
seguras. La caracterización microbiológica de la leche de mujeres sanas ha puesto de
manifiesto que E. faecium es una de las especies predominantes, aislándose en 9 de 10
muestras analizadas (Martín et al., 2003). En un estudio posterior, se ha demostrado
que siete E. faecium aislados en dicho trabajo carecían de rasgos genéticos y
fenotípicos de relevancia clínica (Reviriego et al., 2005). Por otra parte, un gran
número de enterococos, pertenecientes a diferentes especies del género Enterococcus,
poseen características tecnológicas interesantes, entre las que caben citar la producción
de bacteriocinas y propiedades probióticas (Foulquié Moreno et al., 2006; Franz et al.,
1999). En este trabajo, se han estudiado distintas propiedades tecnológicas en los siete
E. faecium procedentes de leche materna para determinar su posible aptitud
tecnológica para la elaboración de productos lácteos fermentados. Curiosamente, los
resultados obtenidos muestran que todos los E. faecium aislados de leche materna
tuvieron un comportamiento muy similar en relación con casi todas las propiedades
tecnológicas ensayadas y, en algunos casos como por ejemplo la actividad esterásica,
claramente distinto de las otras bacterias lácticas empleadas en la industria alimentaria.
La propiedad tecnológica más relevante de los cultivos iniciadores en la
industria láctea es la capacidad de producir ácido rápidamente, para favorecer una
sinéresis correcta e impedir el crecimiento de microorganismos indeseables. Un cultivo
con una adecuada velocidad de acidificación para la industria es capaz de bajar el pH
de la leche a 5,3 al cabo de 6 horas a 30ºC (Cogan et al., 1997). Ni los enterococos
aislados de leche materna ni el resto de las bacterias lácticas analizadas tuvieron buena
capacidad acidificante (Tabla 1). Este comportamiento es muy habitual en las bacterias
lácticas que no están asociadas a los cultivos iniciadores clásicos de la industria láctea,
como ocurre con muchos lactococos y enterococos aislados de quesos artesanos
(Alonso-Calleja et al., 2002; Ayad et al., 2000; Cogan et al., 1997; de la Plaza et al.,
2006).
La actividad proteolítica es muy deseable para que las bacterias tengan un
crecimiento rápido en leche y juega un papel clave en el desarrollo de la textura de los
quesos. Además, algunos péptidos contribuyen al típico flavor del producto, mientras
que otros pueden aportar un carácter amargo (Sousa et al., 2001). De los E. faecium
aislados de leche materna sólo dos cepas (Lc4 y LJx4) mostraron una débil actividad
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
189
proteolítica. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en muchos otros estudios
en los que se ha puesto de manifiesto que, en general, la actividad proteolítica de los
enterococos en leche es escasa, aunque varía mucho de una cepa a otra (Cogan et al.,
1997; Foulquié Moreno et al., 2006; Psoni et al., 2006). Los aislados de E. faecium
siempre tienen menor actitividad proteolítica cuando se compara con E. faecalis
(Andrighetto et al., 2001; Sarantinopoulos et al., 2001).
La lentitud acidificación y la escasa actividad proteolítica de los aislados de E.
faecium de leche materna indican que sólo serían útiles como cultivos auxiliares a un
cultivo iniciador industrial. Por otra parte, en los últimos años el interés se ha centrado
en la búsqueda y selección de cultivos que contribuyan a incrementar el sabor y aroma
de los quesos. Precisamente los enterococos son los principales implicados en la
maduración y en el desarrollo del flavor en muchos quesos, sobre todos los del
Mediterráneo (Bouton et al., 1998; Centento et al., 1996; Coppola et al., 1998;
Litopoulou-Tzanetaki, 1990; Macedo et al., 1995; Nikolaou et al., 2002; Ordóñez et
al., 1978; Prodromou et al., 2001; Psoni et al., 2003; Suzzi et al., 2000; Tzanetakis y
Litopoulou-Tzanetaki, 1992).
Todos los enterococos aislados de leche materna mostraron actividad
peptidásica frente a Ala-, Leu-, Lys- y Glu-pNA, poniendo en evidencia la presencia
de, al menos, una aminopeptidasa general. Esta actividad fue poco intensa en
comparación con otras bacterias, como por ejemplo E. durans AZ6, varios lactococos
y, especialmente, L. helveticus CNRZ32. Este lactobacilo se emplea comercialmente
como cultivo adyuvante para reducir el amargor en queso y su sistema proteolítico está
muy bien caracterizado. Destacó por su intensa actividad aminopeptidásica frente a
todos los sustratos, excepto Glu-pNA (Christensen et al., 1999). Precisamente con este
sustrato los enterococos de leche materna mostraron una actividad destacable. Existen
varias rutas por las que se puede metabolizar el ácido glutámico en las bacterias
lácticas, habiéndose demostrado que potencia la producción de ácidos carboxílicos.
Estos ácidos carboxílicos como, por ejemplo, el ácido isovalérico son compuestos
aromáticos muy potentes que contribuyen en gran medida al flavor del queso
(Kieronczyk et al., 2003; Urbach, 1997).
Cabe destacar que ningún enterococo, a excepción de E. durans AZ6, hidrolizó
el sustrato Pro-pNA ni el dipéptido Glu-Pro-pNA. Las aminopeptidasas generales no
hidrolizan los enlaces peptídicos en los que está implicado el aminoácido prolina,
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
190
requiriéndose para ello peptidasas específicas. Los péptidos que contienen prolina se
caracterizan por ser amargos y tras su hidrólisis mejora sustancialmente el sabor del
queso (Park et al., 1995). Los pocos trabajos disponibles sobre la actividad peptidásica
de otros enterococos aislados de productos lácteos confirman esta escasa actividad
peptidásica (Arizcun et al., 1997; Psoni et al., 2006; Tsakalidou et al., 1994).
La hidrólisis de la grasa es otro de los fenómenos bioquímicos importantes
durante la maduración del queso, aunque ha sido bastante menos estudiado que la
proteolisis o la utilización de la lactosa. Los ácidos grasos liberados durante la lipolisis
afectan directamente al flavor del queso y, además, pueden ser transformados en
compuestos aromáticos mucho más potentes como metil cetonas, lactonas, ésteres,
alcoholes secundarios y aldehidos. La importancia de las esterasas de bacterias lácticas
no se debe sólo a que contribuyen a la liberación de ácidos grasos de cadena corta, sino
que también pueden en medios acuosos catalizar la síntesis de ésteres, aunque se
desconoce si tienen la misma actividad en el queso (Fenster et al., 2003; Holland et al.,
2005).
Todos los enterococos tuvieron una notable actividad esterásica con los
sustratos ensayados, derivados de los ácidos grasos C2 a C6, en general muy superior a
la de los lactococos y L. helveticus CNRZ32. Esta superior actividad esterásica de los
enterococos sobre otras bacterias lácticas concuerda con observaciones anteriores
(Katz et al., 2007; Oliszewski et al., 2007; Tsakalidou et al., 1994). Los sustratos
preferidos, con bastante diferencia sobre el resto, fueron los derivados de los ácidos
propiónico y butírico, como han mostrado con anterioridad otros autores (Abeijón et
al., 2006; Oliszewski et al., 2007).
La actividad esterásica se puede atribuir en los enterococos aislados de leche
materna a una única proteína. En el resto de los enterococos y en los lactococos hay
más de una banda proteica con actividad esterásica, que se diferencian no sólo en la
movilidad electroforética, sino también en la preferencia de sustratos. El polimorfismo
electroforético de las esterasas es habitual en las bacterias lácticas (Abeijón et al.,
2006; Ouzari et al., 2006; Sarantinopoulos et al., 2001). También es frecuente en otras
especies bacterianas, siendo el análisis de los perfiles de esterasas útil incluso como
herramienta taxonómica y como marcador para estudios epidemiológicos (Goullet y
Picard, 1995; Ouzari et al., 2006).
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
191
En resumen, las cepas de enterococos aisladas de leche materna evaluadas en
este estudio tienen poca capacidad acidificante y escasa actividad proteolítica. Sin
embargo, presentan intensa actividad esterásica y una notable actividad
aminopeptidasa que les permite liberar ácido glutámico. Por todo ello, podrían ser
útiles como cultivos auxiliares durante la elaboración de queso. Sería deseable en el
futuro analizar con detalle los compuestos aromáticos formados a partir de los
sustratos liberados por la acción de las peptidasas y esterasas de estos enterococos y su
influencia en las propiedades organolépticas del queso. También sería interesante
analizar el metabolismo del citrato, otra fuente muy imporante de aromas como
diacetilo, acetaldehído, acetoína y 2,3-butanodiol (Hugenholtz, 1993).
La aplicación de E. faecium LJx4 para inhibir el crecimiento de L. innocua en
quesos experimentales condujo en una notable reducción de la concentración de L.
innocua al final de la maduración. Probablemente el inóculo de L. innocua fuera
demasiado elevado para el enterococo pudiera eliminarla completamente. En cualquier
caso, los resultados obtenidos muestran la necesidad de la aplicación de un cultivo
iniciador junto con E. faecium LJx4. Serán necesarios más estudios para evaluar el
potencial de la cepa como cultivo adjunto o bioprotector.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Dra. M. Medina (INIA, Madrid) la cesión de las cepas de L. lactis
ESI 153 y ESI 515 y E. faecalis TAB 28 y TAB 52.
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Capítulo VIII _____________________________________________________________________
197
Tabla 1. Actividad acidificante de las cepas de E. faecium procedentes de leche materna, y de otras bacterias lácticas relevantes en la industria láctea, en leche descremada (10% p/v) a las 6, 12 y 24h a 30ºC. 6 h 12 h 24 h Acidez titulable Acidez titulable Acidez titulable Cepa pH (ácido láctico, g/100 mL) pH (ácido láctico, g/100 mL) pH (ácido láctico, g/100 mL) Enterococcus faecium: Lc4 6,11 0,06 ± 0,01a 5,84 0,09 ± 0,01a 5,57 0,19±0,01a Lc27 6,06 0,07 ± 0,00a 5,77 0,11 ± 0,00a 5,54 0,18±0,00a Ljx4 6,08 0,08 ± 0,00ac 5,60 0,14 ± 0,01a 5,63 0,18±0,01a Ljx27 6,06 0,07 ± 0,01ac 5,87 0,10 ± 0,01a 5,49 0,20±0,00a Ljx33 5,99 0,08 ± 0,00ac 5,86 0,12 ± 0,02a 5,50 0,19±0,01a LM1a 6,10 0,07 ± 0,00a 5,86 0,10 ± 0,00a 5,65 0,18±0,01a LM22 6,06 0,07 ± 0,01a 5,86 0,11 ± 0,01a 5,57 0,21±0,03a Enterococcus faecalis: TAB 52 6,19 0,05 ± 0,00a 5,92 0,12 ± 0,00a 5,67 0,17±0,00a TAB 28 5,74 0,08 ± 0,01ac 4,92* 0,44 ± 0,03b 4,51* 0,69±0,02b Enterococcus durans: AZ6 6,03 0,07 ± 0,01a 5,48 0,22 ± 0,03c 5,07* 0,31±0,01c Lactococcus lactis: ESI 153 5,43 0,18 ± 0,03b 4,31* 0,68 ± 0,07d 4,10* 0,71±0,01b ESI 515 6,19 0,05 ± 0,01a 5,65 0,14 ± 0,03a 4,35* 0,54±0,03d Lactococcus lactis ssp. lactis var. Diacetylactis: 18-16 5,96 0,10 ± 0,01c 5,36 0,30 ± 0,01e 4,93* 0,39±0,01e Nota: Los valores presentados son las medias ± DS de cultivos duplicados para cada bacteria. Los valores en la misma columna y con distinta letra difieren significativamente (Duncan, P < 0,01) *, la muestra estaba coagulada.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
198
Tabla 2. Actividad proteolítica de las cepas de E. faecium procedentes de leche materna, y de otras bacterias lácticas relevantes en la industria láctea, en leche descremada (10% p/v) a las 24 h a 30ºC.
N
Nota: Los valores presentados son las medias ± DS de cultivos duplicados para cada bacteria. Los valores con distinta letra difieren significativamente (Duncan, P < 0,01). ND: no detectado.
Cepa OPA (DO340)
Enterococcus faecium:
Lc4 0,018 ± 0,002a
Lc27 ND
LJx4 0,009 ± 0,001a
LJx27 ND
LJx33 ND
LM1a ND
LM22 ND
Enterococcus faecalis:
TAB 52 ND
TAB 28 0,287 ± 0,011b
Enterococcus durans:
AZ6 ND
Lactococcus lactis:
ESI 153 0,141 ± 0,008c
ESI 515 ND
Lactococcus lactis ssp. lactis var. diacetylactis:
18-16 ND
Capítulo VIII _____________________________________________________________________
199
Tabla 3. Actividad peptidásica específica de las cepas de E. faecium procedentes de leche materna y de otras bacterias lácticas relevantes en la industria láctea. Actividad aminopeptidásica (nmol pNA mg-1 proteína h-1) Cepa Ala-pNA Leu-pNA Lys-pNA Pro-pNA Glu-pNA Gly-Pro-pNA Enterococcus faecium Lc4 16,16 ± 3,32a 15,36 ± 2,16a 15,61 ± 0,84a ND 113,29 ± 10,23a ND Lc27 8,45 ± 1,84a 8,96 ± 2,08a 4,07 ± 1,87a ND 62,32 ± 7,08bc ND Ljx4 5,39 ± 0,25a 10,56 ± 1,50a 5,50 ± 1,14a ND 70,67 ± 11,74bc ND Ljx27 9,53 ± 3,99a 13,99 ± 0,98a 8,58 ± 1,40a ND 76,42 ± 12,53b ND Ljx33 7,01 ± 1,36a 8,29 ± 2,19a 4,73 ± 2,19a ND 51,38 ± 6,06c ND LM1a 9,37 ± 1,68a 8,94 ± 0,99a 6,50 ± 0,98a ND 68,97 ± 8,99bc ND LM22 7,06 ± 2,76a 7,37 ± 1,21a 7,65 ± 1,71a ND 59,01 ± 2,69bc ND Enterococcus faecalis TAB 52 15,19 ± 0,76a 9,68 ± 0,42a 2,67 ± 0,11a ND ND ND TAB 28 9,03 ± 7,83a 8,32 ± 0,29a 1,55 ± 1,19a ND ND ND Enterococcus durans AZ6 447,27 ± 28,50b 98,46 ± 16,16b 417,44 ± 37,43b 12,45 ± 4,64ac 194,48 ± 30,05d ND Lactococcus lactis ESI 153 41,02 ± 6,95c 80,06 ± 6,51b 563,04 ± 37,61c 8,97 ± 1,38b 1,06 ± 0,20e 2244,10 ± 21,07a ESI 515 225,64 ± 35,62d 232,87 ± 55,10c 1401,39 ± 44,18d 9,34 ± 0,84ab 249,28 ± 5,60f 3829,86 ± 117,46b L. lactis var. diacetylactis 18-16 128,67 ±16,87e 429,93 ± 65,67d 1880,47 ± 207,45e 14,43 ± 4,25c 1,72 ± 0,65e 4316,86 ± 27,64c E8 166,78 ± 4,49f 380,30 ± 19,55e 2470,48 ± 221,11f 21,15 ± 2,86d 24,54 ± 2,06g 3872,66 ± 21,89b Lactobacillus helveticus CNRZ32 12895,80 ± 880,674 9431,53 ± 1024,74 14416,40 ± 1038,14 227,88 ± 11,55 13,11 ± 0,11 12263,60 ± 1173,65 Nota: Los valores presentados son las medias ± DS de los triplicados para cada bacteria. Los valores en la misma columna y con distinta letra difieren significativamente (Duncan, P < 0,05). En el análisis estadístico no se incluyeron los datos de Lactobacillus helveticus CNRZ32.
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
200
Tabla 4. Valores de pH en los quesos experimentales.
Periodo de maduración (días) Cultivo Cuajada 1 7 14 21 28 L. innocua SA1 6,91± 0,07 6,18± 0,04 5,35± 0,04 5,12± 0,10 4,87± 0,03 4,95± 0,04 E. faecium LJx4 6,52± 0,03 4,99± 0,04 4,76± 0,02 4,64± 0,03 4,65± 0,04 4,66± 0,02 E. faecium LJx4/L.innocua SA1 6,39± 0,02 4,94± 0,06 4,75± 0,03 4,62± 0,05 4,61± 0,06 4,67± 0,07 Tabla 5. Recuentos (log10 UFC/g) de L. innocua en los quesos experimentales inoculados con Listeria innocua SA1. Periodo de maduración (días) Cultivo Cuajada 1 7 14 21 28 L. innocua SA1 4,02±0,09 7,40±0,15 7,21± 0,11 7,11± 0,17 7,02± 0,04 6,35±0,07 E. faecium LJx4+ L, innocua 4,05±0,07 4,15± 0,12 3,74± 0,07 3,67± 0,12 3,43± 0,17 2,71± 0,10
Capítulo VIII _____________________________________________________________________
201
Figura 1. Actividad esterásica específica de las cepas de E. faecium procedentes de leche materna, y de otras bacterias lácticas relevantes en la industria láctea, empleando como sustratos los derivados α-NA de los ácidos grasos C2, C3, C4 y C6.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Lc4 Lc27 LJx4 LJx27 LJx33 LM1a LM22 TAB28 TAB52 AZ6 515 18-16 E8 CNRZ32
Acetato
Propionato
Butirato
Caprilato
E. faecium E. faecalis E. durans L. lactis Lb. helveticus
Actividad esterásica (µmol α–
naftol mg-1 prot h-1)
Caproato
Capítulo VIII ___________________________________________________________________________________
202
Figura 2. Perfiles esterásicos de las cepas de E. faecium procedentes de leche materna y de otras bacterias lácticas relevantes en la industria láctea. Las proteínas de los extractos intracelulares de las bacterias se separaron en geles de poliacrilamida-agarosa en condiciones no desnaturalizantes. La actividad esterásica se reveló incubando los geles con α-naftil acetato y Fast Garnet GBC. Panel A: Línea 1, Enterococcus faecium Lc4; línea 2, E. faecium Lc27; línea 3, E. faecium Ljx4; línea 4, E. faecium Ljx27; línea 5, E. faecium Ljx33; línea 6, E. faecium LM1a; línea 7, E. faecium LM22; y línea 8, E. durans AZ6. Panel B: Línea 1, Enterococcus faecium Lc4; línea 2, E. faecalis TAB28; línea 3, E. faecalis TAB52; línea 4, E. durans AZ6; línea 5, Lactococcus lactis ESI153; línea 6, L. lactis ESI515; línea 7, L. lactis 18-16; línea 8, L. lactis E8; y línea 9, Lactobacillus helveticus CNRZ32.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
B
Capítulo VIII _____________________________________________________________________
203
Discusión general ___________________________________________________________________________________
203
IX. DISCUSIÓN GENERAL
Discusión general ___________________________________________________________________________________
204
Discusión general ___________________________________________________________________________________
205
IX.1. PRODUCCIÓN HETERÓLOGA DE PEDIOCINA PA-1 EN L. lactis DE
INTERÉS INDUSTRIAL
Las bacterias lácticas tienen un papel clave en la fermentación de diversas
materias primas alimentarias porque desarrollan en los productos fermentados
características sensoriales que son muy apreciadas por el consumidor y, al mismo
tiempo, contribuyen a su seguridad desde el punto de vista microbiológico. El empleo
empírico de las bacterias lácticas para la conservación de los alimentos
(bioconservación) es una práctica muy antigua en la historia de la humanidad (Stiles,
1996). De los diversos compuestos antimicrobianos que producen las bacterias
lácticas, sin ninguna duda, las bacteriocinas poseen un gran número de propiedades
idóneas para que se empleen como bioconservantes. La aplicación de las bacteriocinas
aporta muchos beneficios como, por ejemplo, alargar la vida útil, disminuir el riesgo
de transmisión de patógenos a través de los alimentos, proporcionar una protección
adicional si se rompe la cadena de frío y permitir el empleo de una menor cantidad de
conservantes químicos o reducir la severidad de otros tratamientos de conservación
(Gálvez et al., 2007). De esta forma, contribuyen, en definitiva, a conservar las
propiedades nutritivas y organolépticas de los alimentos.
Uno de los patógenos que más preocupan en la industria láctea, por su carácter
psicrotrofo y su resistencia al ácido, es L. monocytogenes. Este patógeno puede estar
presente en productos elaborados con leche cruda e incluso en los elaborados con leche
pasterizada, si se produce una contaminación posterior al tratamiento térmico. Los
brotes de listeriosis no tienen una incidencia muy elevada (entre 2 y 10 casos por
millón de habitantes en la Unión Europea), pero tienen la tasa de mortalidad más alta
de todos los patógenos de transmisión alimentaria. Muchos brotes de listeriosis han
estado relacionados con el consumo de leche o queso contaminados (Jemmi y Stephan,
2006). Una de las estrategias más prometedoras para el control de L. monocytogenes
en la industria láctea es el empleo de bacteriocinas y, en concreto, la pediocina PA-1,
ya que consigue reducir la población del patógeno entre 1 y 4 ciclos logarítmicos
(Muriana, 1996). Aunque estos niveles de inhibición son inaceptables como método de
conservación único, si resultan muy útiles como uno de los factores en un sistema de
barreras múltiples. Por otra parte, en productos fermentados la pediocina PA-1 tiene
Discusión general ___________________________________________________________________________________
206
muy poca interferencia con los cultivos iniciadores a diferencia de otra bacteriocinas
como, por ejemplo, la nisina (Eijsink et al., 1998; Guyonnet et al., 2000).
Los microorganismos productores de pediocina PA-1 pertenecen al género
Pediococcus, a excepción de Lb. plantarum WHE92 (Ennahar et al., 1996). Esos
pediococos proceden de productos vegetales y cárnicos y no son útiles en la industria
láctea porque no fermentan bien la lactosa ni poseen buena actividad proteolítica
(Caldwell et al., 1996). Por ello, experimentalmente se ha buscado en numerosas
ocasiones el modo de dotar a diversas cepas de lactococos con la capacidad de
producir pediocina PA-1 (Buyong et al., 1998; Chikindas et al., 1995; Horn et al.,
1998, 1999; Rodríguez et al., 2003; van Belkum et al., 1997). Una de las estrategias
con la que se obtuvo más éxito permitió que una cepa de L. lactis produjera una
cantidad de pediocina PA1 similar a la de P. acidilactici 347, el productor natural
(Horn et al., 1999). Esta estrategia se basaba en utilizar el líder, el promotor y el
aparato secretor de la lactococina A para producir y secretar la pediocina PA-1. Las
cepas de L. lactis empleadas por estos investigadores eran de uso habitual en
investigación, bien caracterizadas y desprovistas de plásmidos, pero con una dudosa
aptitud tecnológica. Es de destacar, por otra parte, que en ese mismo trabajo se
obtuvieron dos cepas de L. lactis capaces de expresar y secretar simultáneamente
nisina y pediocina PA1. Es decir, se ampliaba la utilidad de L. lactis como
bioconservante al coproducir esas dos bacteriocinas: además de su actividad frente a
Listeria, esas cepas también serían efectivas frente a los clostridios y sus esporas,
gracias a la producción de nisina (Horn et al., 1999).
A pesar de los avances logrados en la producción heteróloga de pediocina PA-1
en L. lactis, la utilización de cepas llamadas “de laboratorio” para su consecución hace
que los resultados no tengan aplicación industrial inmediata. En este contexto, uno de
los objetivos de esta Tesis Doctoral fue producir niveles adecuados de pediocina PA-1
en cepas de L. lactis de interés para la industria láctea.
Discusión general ___________________________________________________________________________________
207
IX.1.1. Empleo de cepas de interés industrial como hospedador heterólogo
En la industria láctea, y especialmente durante la elaboración de queso, es
necesario que el cultivo iniciador produzca ácido rápidamente, contribuya a la
proteolisis, tenga resistencia a los bacteriófagos y desarrolle el flavor adecuado en el
producto (Law, 2001). Sin embargo, en los laboratorios de investigación suelen
emplearse cepas “de laboratorio” para las que se dispone de una gran variedad de
herramientas de trabajo y están perfectamente caracterizadas. Éste es el caso de las dos
cepas de L. lactis más habituales en investigación, IL1403 y MG1363 descritas
inicialmente por Chopin et al. (1984) y Gasson (1983), de las que incluso se ha hecho
público su genoma completo (Bolotin et al., 2001; Makarova et al., 2006). Es probable
que las industrias de cultivos iniciadores hayan secuenciado algunas de sus cepas, pero
difícilmente harán públicas dichas secuencias (Johansen, 2003).
Estas cepas “de laboratorio” proceden originalmente de cepas comerciales, pero
las manipulaciones realizadas para facilitar el trabajo de investigación hacen que sus
propiedades tecnológicas disten mucho de ser adecuadas para la industria. En primer
lugar, carecen de plásmidos, donde precisamente se suelen encontrar muchos genes
importantes para la industria. Éste es el caso de los relacionados con el metabolismo de
la lactosa y la producción de proteinasa, necesarios para la acidificación y la
coagulación de la leche, y de muchos genes de resistencia a bacteriófagos. Además, en
la cepa MG1363 se ha eliminado un profago. La presencia de un profago confiere
cierta inmunidad frente a la infección por otros fagos y facilita la autolisis, una
característica muy favorable para el desarrollo del flavor del queso (Johansen, 2003).
Por otra parte, las estrategias de manipulación genética están optimizadas para
las cepas utilizadas en los laboratorios, por lo que cuando se trabaja con cepas salvajes
es necesario adaptar las técnicas y los protocolos, como ha sucedido en la realización
del trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral. En este tipo de cepas, la eficiencia de la
transformación suele ser muy reducida, bien por dificultad para obtener células
electrocompetentes o por la presencia de otros plásmidos en el interior de la cepa, lo
cual dificulta la aceptación de un nuevo vector (Gravesen et al., 1997; Sørensen et al.,
2000). Además, existen mecanismos de resistencia en Lactococcus que reconocen y
Discusión general ___________________________________________________________________________________
208
degradan el DNA extraño, independientemente de que sea un plásmido o un fago, por
lo que las posibilidades de introducir y mantener un plásmido en el interior de la célula
son escasas (Forde y Fitzgerald, 1999). Finalmente, un escollo adicional para trabajar
con cepas de interés industrial es el gran desconocimiento de sus necesidades nutritivas
individuales.
Las cepas elegidas para desarrollar este trabajo han sido L. lactis subsp. lactis
ESI 153 y ESI 515, siendo esta última productora de nisina de forma natural (Nis+).
Ambas cepas fueron aisladas de quesos artesanos y se caracterizan por tener buena
capacidad tecnológica para la elaboración de quesos (Cogan et al., 1997). Además, se
han utilizado como cultivos adjuntos en la elaboración de quesos en varios trabajos
(Rodríguez et al., 1998; Gómez et al., 1999).
IX.1.2 Expresión heteróloga de pediocina PA-1 empleando el sistema secretor de
la lactococina A
La estrategia inicial empleada para producir heterólogamente pediocina PA-1
en L. lactis ESI 153 y ESI 515 (Nis+) fue la misma que utilizaron Horn et al. (1999)
con cepas de laboratorio: aprovechar la homología de líderes y del sistema de
secreción de la lactococina A, una bacteriocina lactocócica de la clase IIa. De hecho, se
empleó el mismo plásmido para comprobar su utilidad en cepas salvajes. La cantidad
de pediocina PA-1 producida por los respectivos transformantes, L. lactis CL1 (Ped+) y
L. lactis CL2 (Nis+, Ped+), fue aproximadamente el 30 y 20% de la cantidad que
produce normalmente P. acidilactici 347. Es decir, se obtuvieron mejores resultados
que en el trabajo realizado por Horn et al. (1999), ya que la cantidad de pediocina PA-
1 producida en L. lactis FI5876 (Nis+, Ped+) fue sólo el 11% de lo observado en P.
acidilactici 347. También se confirmó en L. lactis ESI 515 (Nis+) que la producción de
pediocina PA-1 no afectaba en absoluto su capacidad de sintetizar y segregar nisina.
Además, la capacidad de producir pediocina PA-1 en L. lactis CL1 (Ped+) y L. lactis
CL2 (Nis+, Ped+) fue muy estable, incluso en ausencia de presión selectiva, indicando
que esa nueva propiedad aparentemente no altera el metabolismo normal de la bacteria.
Otros autores, en cambio, habían constatado la inestabilidad de la producción de
pediocina PA-1 en ausencia del agente selectivo (antibiótico) en transformantes de L.
Discusión general ___________________________________________________________________________________
209
lactis, a pesar de que curiosamente sí se mantenía la resistencia al antibiótico del
plásmido en el que se encontraba el operón de la pediocina (Coderre y Somkuti, 1999).
Las peculiares propiedades de la nisina y la pediocina PA-1 y la posibilidad de
coproducirlas en cepas de interés industrial abren nuevas posibilidades en la industria
láctea. Por un lado, estas bacteriocinas tienen un efecto sinérgico, ya que su
mecanismo de acción es distinto, ampliándose mucho el espectro de acción
antimicrobiano (Hanlin et al., 1993; Mulet-Powell et al., 1998). Por otra parte, la
aparición de resistencias cruzadas en las bacterias sensibles es más difícil (Rekhif et
al., 1994). De hecho, la efectividad como cultivos auxiliares de los transformantes L.
lactis CL1 (Ped+) y L. lactis CL2 (Nis+, Ped+) para controlar L. monocytogenes,
Staphylococcus aureus y E. coli O157:H7 se ha comprobado durante la elaboración de
quesos experimentales. Empleando un nivel de contaminación inicial muy superior al
que se podría esperar de forma natural en la leche, se consiguieron reducciones de
2,97, 0,98 y 1,69 unidades logarítmicas, respectivamente, para cada uno de los
patógenos (Rodríguez et al., 2005).
IX.1.3 Mejora de la producción heteróloga de pediocina PA-1 empleando
promotores fuertes
Uno de los aspectos claves que determinan la eficiencia y el control de la
expresión génica es la fuerza y la inducibilidad del promotor del gen durante la
iniciación de la trasncripción. El promotor que dirigía la expresión de la pediocina PA-
1 en L. lactis CL1 (Ped+) y L. lactis CL2 (Nis+, Ped+) era el promotor de la lactococina,
de carácter constitutivo y débil. Se planteó, por tanto, la posibilidad de emplear un
promotor constitutivo más fuerte, como P32, muy utilizado en la manipulación
genética de los lactococos (Van de Guchte et al., 1989). Este promotor se combinó con
diversos plásmidos (pMC117, pRK119, pCNC16) utilizados anteriormente para la
producción heteróloga de pediocina PA-1 en estudios con cepas de laboratorio, para
evaluar la estrategia más adecuada en las cepas L. lactis ESI 153 y ESI 515 Nis+)
(Chikindas et al., 1995; Kemperman, comunicación personal).
Los plásmidos pMC117, pRK119 y pCNC16 contienen el operón ped completo
bajo el control del promotor lactocócico P32, diferenciándose en el marcador de
selección (resistencia a eritromicina en pMC117 y a cloranfenicol en pRK119 y
Discusión general ___________________________________________________________________________________
210
pCNC16) y en el número de copias del plásmido por célula (entre 5 y 6 veces más
copias por célula en pCNC16 que en pMC117 y pRK119) (Chikindas et al., 1995;
Kemperman et al., comunicación personal). La producción de pediocina PA-1 en todos
los transformantes de L. lactis ESI 153 y ESI 515 obtenidos con estos plásmidos, en
los que el operón estaba bajo el control del promotor P32, fue superior a la observada
anteriormente con el promotor de la lactococina A en L. lactis CL1 (Ped+) y L. lactis
CL2 (Nis+, Ped+). Estos resultados pueden ser la respuesta a una mayor capacidad
biosintética de las cepas, al contener el operon ped completo. Otra razón puede ser la
mayor fuerza del promotor P32 empleado, un factor clave en el control de la expresión
génica.
Por otra parte, en los transformantes de L. lactis ESI 153 y ESI 515 (Nis+)
conteniendo el plásmido pMC117, L. lactis MC1 (Ped+) y MC2 (Nis+, Ped+),
respectivamente, la producción de pediocina PA-1 fue un 15 y un 50% de la
producción de P. acidilactici 347. Es decir, en estas cepas fue superior a la obtenida
anteriormente en cepas de laboratorio (Chikindas et al. (1995). Ese mismo vector se
había utilizado en un lactococo que formaba parte de un cultivo iniciador para la
industria quesera. La producción de pediocina PA-1 en el queso por el transformante
L. lactis MM217 era muy inferior a la observada anteriormente en las cepas de
laboratorio. Sin embargo, la inhibición de L. monocytogenes fue evidente (Buyong et
al., 1998; Chikindas et al., 1995).
Curiosamente, el cambio del marcador de selección del plásmido, resistencia a
cloranfenicol en vez de resistencia a eritromicina, permitió un notable aumento de la
producción de pediocina PA-1. En cambio, el número de copias por célula del operon
ped no tuvo influencia. En los derivados de L. lactis ESI 153 que contenían los
plásmidos pRK119 y pCNC16 (resistencia al cloranfernicol), denominados L. lactis
RK1 (Ped+) y CNC1 (Ped+), respectivamente, la producción de pediocina PA-1 supero
notablemente (163 y 165%) el nivel producido por P. acidilactici 347. Los derivados
del productor natural de nisina L. lactis ESI 515 (Nis+) que contenían esos mismos
plásmidos, denominados L. lactis RK2 (Nis+, Ped+) y CNC2 (Nis+, Ped+), produjeron el
mismo nivel de pediocina que P. acidilactici 347, al tiempo que mantenían su nivel
natural de producción de nisina. Por lo tanto, estos nuevos transformantes se
Discusión general ___________________________________________________________________________________
211
consideran muy atractivos para controlar no sólo a L. monocytogenes, sino también a
otros muchos patógenos en la industria alimentaria, puesto que tienen la peculiaridad
de coproducir pediocina PA-1 y nisina a niveles comparables a los de las cepas
parentales.
En ocasiones los promotores constitutivos tienen algunos problemas, bien por
tratarse de promotores débiles, como PlcnA, o bien por ser fuertes, ya que la elevada
producción de proteína puede conducir a su agregación, acumulación y/o degradación
intracelular (Makrides, 1996). Para evitar estos problemas, se han desarrollado nuevos
sistemas de expresión basados en promotores inducibles, que permiten controlar la
expresión génica mediante un inductor, un represor o factores ambientales, como el
pH, la temperatura o la concentración de ciertos iones (Nouaille et al., 2003). De los
diversos sistemas de expresión génica desarrollados para las bacterias lácticas, el de
mayor interés está basado en el promotor inducible de la nisina (PnisA) (de Vos y
Gasson, 1989; Kuipers et al., 1995, 1997). El interés de este sistema se debe al peculiar
sistema de autorregulación de la biosíntesis de la nisina y al hecho de que es un
bioconservante de grado alimentario autorizado con fines alimentarios en numerosos
países. El nivel basal de expresión de los genes bajo el control de PnisA en cepas que
contienen las proteínas NisR y NisK pero que no producen nisina, es despreciable. Sin
embargo, la adición de nisina al medio de cultivo durante la fase logarítmica de
crecimiento de esas mismas cepas activa la transcripción de los genes controlados por
nisA, siendo el nivel de expresión proporcional a la cantidad de nisina añadida. Este
sistema se ha aplicado con éxito para la producción de pediocina PA-1 y de otras
bacteriocinas (Horn et al., 2004).
IX.1.4. Integración cromosómica del gen que codifica la pediocina PA-1 en L. lactis
A pesar de los niveles de pediocina PA-1 tan satisfactorios obtenidos en las
cepas L. lactis RK1 (Ped+), RK2 (Nis+, Ped+), CNC1 (Ped+) y CNC2 (Nis+, Ped+), la
presencia de marcadores de selección no deseados en los plásmidos que portan hace
inviable su utilización en la industria alimentaria. A este respecto, otro de los objetivos
planteados durante el transcurso de esta Tesis Doctoral fue la obtención de cepas de L.
Discusión general ___________________________________________________________________________________
212
lactis capaces de producir pediocina PA-1 o coproducir pediocina y nisina A en las que
no hubiese genes de resistencia a antibióticos como marcadores de selección con el
objetivo de que se puedan considerar de grado alimentario.
Una de las posibles alternativas es reconstruir las cepas de manera adecuada,
mediante la integración cromosómica del operón ped. Esto permitiría prescindir del
empleo de antibióticos como marcadores de selección y estabilizar las características
codificadas en los genes integrados. Los sistemas de integración cromosómica se basan
en plásmidos no replicativos o de replicación condicionada (de Vos y Simons, 1994).
Una posibilidad es emplear un vector que no disponga del gen que codifica la proteína
RepA, necesaria para su replicación, y que contenga una región de homología con el
cromosoma de la célula hospedadora. Al introducir el vector en un hospedador
adecuado, los genes se integran mediante recombinación por homología con
entrecruzamiento sencillo o integración Campbell (de Vos, 1999). Si el plásmido
integrativo contiene dos regiones de homología con el cromosoma de la célula
hospedadora, que estén cercanas entre sí como, por ejemplo, el fragmento inicial y
final de la secuencia de un determinado gen, la recombinación conlleva la sustitución
total del gen. Esta recombinación puede ocurrir simultáneamente produciéndose un
entrecruzamiento doble o consecutivamente, ocurriendo en primer lugar un
entrecruzamiento sencillo y, a continuación, la deleción de la secuencia
correspondiente al vector. Esta modificación genética se considera segura y las cepas
resultantes, por lo tanto, aptas para llegar al consumidor.
A la dificultad que presenta habitualmente este tipo de recombinación en las
cepas de laboratorio, se suman las propias de trabajar con cepas industriales. El gen en
el que se llevará a cabo la recombinación no debe modificar la capacidad tecnológica
de la cepa industrial. Además, la construcción del vector integrativo debe ser
individual para cada cepa, puesto que la secuencia del gen seleccionado puede diferir
de una cepa a otra. Por este motivo, se abordó el problema empezando la integración
cromosómica para la producción heteróloga de pediocina PA-1 en una cepa de
laboratorio, L. lactis MG1614. El plásmido para la integración se preparó clonando los
genes necesarios para la biosíntesis de la pediocina PA-1 (utilizando el sistema de
intercambio de líderes, genes lcnA/pedA, lcnC y lcnD) entre dos fragmentos del gen
Discusión general ___________________________________________________________________________________
213
galA. Con este plásmido se construyó la cepa L. lactis CR, en la que se confirmó la
presencia de los genes de interés, pero no se pudo detectar producción de pediocina.
Sin embargo, sí se detectó producción de pediocina PA-1 en otra cepa de L. lactis en la
que se introdujo el plásmido y que porta varias copias del gen repA en su cromosoma
que permiten su replicación. La integración de una única copia de los genes de interés
en el cromosoma de L. lactis MG1614 puede explicar la ausencia de producción de
pediocina en L. lactis CR. Por lo tanto, esta alternativa no se considera adecuada para
la construcción de cultivos bioprotectores para la industria alimentaria y se descartó la
posibilidad de construir nuevos vectores adecuados a L. lactis ESI 153 y ESI 515
(Nis+).
IX.1.5. Construcción de un vector de grado alimentario
Aunque no existe una definición precisa de qué se considera como un organismo
modificado genéticamente de grado alimentario, se ha indicado que únicamente puede
contener DNA de su misma especie o, teniendo en cuenta una definición un poco más
amplia, de otros microorganismos que cumplan con el estatus GRAS (Johansen, 1999).
Gracias a esta definición, se ha admitido como GRAS una cepa de Lactococcus
modificada genéticamente, que se está utilizando en el mercado norteamericano
(Kondo y Johansen, 2002).
Para la construcción de un vector de grado alimentario se partió del plásmido
pCNC16, puesto que ya se había comprobado que permitía obtener lactococos
coproductores de pediocina PA-1 y nisina, y en cantidades muy adecuadas. En este
plásmido era necesario eliminar todo DNA no perteneciente a cepas con carácter
GRAS. Para ello, en primer lugar, se localizaron con exactitud los genes estrictamente
necesarios para la replicación (el y para la producción de la bacteriocina (el promotor y
el operón ped). Estas dos regiones se amplificaron y unieron para dar lugar al nuevo
vector pGA1. Este plásmido sólo contiene los genes necesarios para la producción de
pediocina PA-1, que proceden de Pediococcus, y el resto de la secuencia (Ori+, gen
repA y promotor P32) pertenece a Lactococcus, por lo que puede considerarse de
grado alimentario de acuerdo con la definición de Sørensen et al. (2000).
Discusión general ___________________________________________________________________________________
214
Los transformantes obtenidos a partir de L. lactis ESI 153 y ESI 515, mediante la
transformación con el plásmido pGA1, denominados L. lactis GA1 (Ped+) y GA2
(Nis+, Ped+), respectivamente, produjeron entre 10 y 3 veces menos pediocina PA-1
que los derivados que tenían el plásmido original pCNC16 (L. lactis RK1 y RK2). Este
resultado era de esperar, dada la eliminación de ciertas secuencias presentes en el
plásmido. Como se había observado anteriormente con otros plásmidos, la presencia
de este vector de grado alimentario no modificó la producción de nisina en la cepa L.
lactis GA2. En consecuencia, este sistema de coproducción de ambas bacteriocinas
representa un logro muy atractivo para la industria alimentaria.
Finalmente, era obligado comprobar la utilidad en la práctica de estas cepas de
grado alimentario. Para ello se elaboraron quesos experimentales con los derivados
construidos y leche contaminada con 104 ufc/mL de Listeria innocua. Aunque el
agente causal de la listeriosis y, por tanto, el microorganismo a controlar en la industria
láctea es L. monocytogenes, su elevada patogenicidad y el elevado volumen de
residuos que se generan durante la elaboración de queso, imposibilitaban su empleo
para las fabricaciones en las instalaciones disponibles. Por otra parte, el efecto
inhibitorio de la pediocina PA-1 frente a L. innocua es similar al ejercido por esta
bacteriocina frente a distintas cepas de L. monocytogenes como Ohio y Scott A.
Al final de la maduración, y a pesar de la menor producción de pediocina PA-1
observada in vitro, los recuentos del patógeno en los quesos se encontraron por debajo
de 50 ufc/g en el caso de L. lactis GA1 (Ped+) y de 25 ufc/g en L. lactis GA2 (Ped+,
Nis+). Estos niveles corresponden, respectivamente, a reducciones de 2,35 y 2,65
ciclos logarítmicos de la población inicial de Listeria. Esta reducción resulta muy
interesante para controlar la presencia de microorganismos del género Listeria,
teniendo en cuenta que, como se comentó anteriormente, estos niveles del patógeno
son superiores a los que se suelen encontrar en la práctica. Por lo tanto, cabe esperar
una mejora en la inhibición cuando la población de dicho microorganismo sea más
reducida. A pesar de que se recomienda la ausencia de Listeria en 25 g de queso, se
considera aceptable aquel producto que contiene menos de 100 ufc/g (Recomendación
2005/175/CE). Tras la maduración de los quesos elaborados en este estudio, los
recuentos de Listeria se encontraron entre 25 y 50 ufc/g, por lo que se considerarían
Discusión general ___________________________________________________________________________________
215
aptos para el consumo. Por otra parte, se confirma la actividad sinérgica de las
bacteriocinas producidas por L. lactis GA2, nisina y pediocina PA-1, observada en
ocasiones anteriores y por otros autores (Hanlin et al., 1993; Mulet-Powell et al., 1998;
Horn et al., 2004).
En consecuencia, la capacidad inhibidora frente a Listeria que exhiben in situ las
cepas L. lactis GA1 y GA2 y la presencia exclusiva de DNA procedente de bacterias
seguras podrían abrir camino a su utilización como cultivos iniciadores o adyuvantes
en la industria láctea. La conversión de resultados de investigación en innovaciones
útiles para la industria es bastante más compleja de lo que se puede apreciar a primera
vista (Pedersen et al., 2005). Sin embargo, aunque la modificación genética provoca
bastante rechazo por parte de los consumidores, cabría esperar que esta situación
cambie en el futuro. Sobre todo en casos como el aquí referido, dado que las cepas
construidas mejoran las condiciones higiénicas y la seguridad del producto final, al
tiempo que reducen la necesidad de aditivos químicos o la intensidad de tratamientos
tecnológicos complementarios.
IX.2. LA MICROBIOTA DE LA LECHE HUMANA
En general, la leche materna constituye el mejor alimento para los bebés
durante los primeros meses de su vida ya que satisface todos sus requerimientos
nutritivos durante esta etapa de rápido crecimiento. Por ello, se recomienda que el
destete no se inicie hasta los 6 meses y que, llegada esta edad, se haga de forma
gradual, de tal manera que se mantenga un aporte de leche humana durante un tiempo
no inferior a los dos años (WHO, 2001). Desafortunadamente, durante algunas décadas
la lactancia estuvo considerada por diversos sectores como una práctica anticuada e
incompatible con un estilo de vida “moderno”, creando una inercia que todavía no se
ha superado completamente. En este sentido, los condicionantes socio-laborales
representan, con diferencia, la primera causa de destete precoz o forzado. No obstante,
en los últimos años se ha producido una cierta inflexión al constatarse que, a pesar de
los grandes avances en el campo de la nutrición infantil, todavía existen diferencias
cuantitativa y cualitativamente importantes entre la leche humana y las fórmulas
Discusión general ___________________________________________________________________________________
216
infantiles. En este sentido, la lactancia materna constituye un derecho fundamental
para el niño (WHO/UNICEF, 1989).
Entre las ventajas “no nutricionales” que confiere la leche materna al recién
nacido destaca su elevada capacidad de protección frente a enfermedades infecciosas
(López-Alarcón et al., 1997; Morrow y Rangel, 2004; Wright et al., 1998). Resulta
ilustrativo el hecho de que en neonatos prematuros, particularmente sensibles a este
tipo de enfermedades, la alimentación exclusiva con leche materna conlleva una menor
incidencia de enterocolitis necrotizante (Lucas y Cole, 1990) y septicemia (El-
Mohandes et al., 1997; Ronnestad et al., 2005), una tolerancia más rápida a la nutrición
enteral y una menor dependencia de la nutrición parenteral (Schanler, 2000).
Este efecto protector puede ser debido a la acción combinada de algunos
componentes de la leche, como inmunoglobulinas, células inmunocompetentes, ácidos
grasos antimicrobianos, oligosacáridos fucosilados, lisozima, lactoferrina y péptidos
antimicrobianos (Newburg, 2005; Saavedra, 2002). Recientemente, se ha demostrado
que estos componentes pueden inactivar patógenos de forma individual, aditiva y/o
sinérgica (Isaacs, 2005). Además, la leche materna también contiene sustancias
prebióticas que estimulan de forma selectiva el crecimiento de bacterias deseables en
el intestino infantil (Dai y Walker, 1999; Drasar y Roberts, 1990).
Desde un punto de vista microbiológico, los estudios sobre leche materna son
muy escasos y, en cualquier caso, se han restringido casi exclusivamente a la detección
e identificación de bacterias potencialmente patógenas en leche almacenada en bancos
o en casos de mastitis (Bingen et al., 1992; El-Mohandes et al., 1993; Wright y Fenny,
1998; Le Thomas et al., 2001; Ng et al., 2004); en contraste, apenas existen estudios
sobre la microbiología de la leche humana obtenida de mujeres sanas, lo cual no es de
extrañar si se tiene en cuenta que este fluido se había considerado estéril hasta hace
pocos años a pesar de la inexistencia de trabajos científicos que avalaran tal esterilidad.
Por este motivo, el conocimiento sobre los microorganismos comensales presentes en
la leche humana es todavía muy limitado. No obstante, los escasos estudios existentes
hasta la fecha señalan que, entre las bacterias que se aíslan con mayor frecuencia,
destacan diversas especies de los géneros Staphylococcus, Enterococcus,
Discusión general ___________________________________________________________________________________
217
Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus y Leuconostoc (Gavin y Ostovar, 1977;
Heikkilä y Saris, 2003; Ng et al., 2004; West et al., 1979). En esta Tesis, el empleo de
medios de cultivo adecuados para el aislamiento de bacterias lácticas confirmó que la
leche materna es una excelente fuente de estas bacterias y, particularmente, de
lactobacilos y enterococos. El hecho de que bacterias pertenecientes a los citados
géneros se puedan aislar fácilmente de leche obtenida a partir de mujeres residentes en
países muy distantes entre sí sugiere que su presencia no es un fenómeno aislado sino
que, al contrario, se trata de una característica propia de la leche. Por lo tanto, sería
más justo considerar que tales bacterias no son el resultado de una mera contaminación
sino que realmente constituyen la microbiota natural de este fluido biológico.
La leche humana es uno de los factores clave en la iniciación y el desarrollo de
la microbiota intestinal del neonato ya que este fluido garantiza un aporte continuo de
bacterias durante todo el periodo de lactancia. De hecho, posiblemente se trate de la
principal fuente de bacterias para el recién nacido ya que se estima que un lactante que
ingiera aproximadamente 800 ml de leche al día recibe entre 1 × 105 y 1 × 107
bacterias comensales y/o potencialmente beneficiosas (Heikkilä y Saris, 2003), dato
que también se ha confirmado durante la realización de esta Tesis. Por lo tanto, y como
se ha comentado anteriormente, no es de extrañar que la microbiota intestinal del
lactante refleje la existente en la leche materna (Heikkilä y Saris, 2003). Por ejemplo,
la concentración de lactobacilos y enterococos es significativamente más elevada en la
microbiota intestinal de lactantes que en la de niños alimentados con fórmulas (Ahrné
et al., 2005; Rinne et al., 2005).
Recientemente, la construcción de librerías génicas a partir de muestras de
leche de mujeres sanas permitió la detección de secuencias correpondientes a un
máximo de 12 especies bacterianas (Martín, 2005). El predominio de un pequeño
número de especies en este fluido podría explicar porqué la microbiota intestinal de
lactantes sanos está compuesta por un reducido espectro de especies y cepas (Ahrné et
al., 2005). La presencia de un espectro bacteriano muy reducido también podría
explicar porqué el desarrollo de una microbiota mucho más diversa coincide
precisamente con el inicio del destete (Favier et al., 2002; Hall et al., 1990). La
Discusión general ___________________________________________________________________________________
218
microbiota intestinal infantil está profundamente influenciada por la dieta y, en este
sentido, la introducción de alimentos sólidos, junto con la retirada progresiva de la
leche, provoca cambios drásticos en su composición (Favier et al., 2002; Mackie et al.,
1999). Es probable que este hecho sea el principal responsable de las diferencias
observadas entre la microbiota intestinal de los niños que reciben lactancia materna y
la de aquellos alimentados con fórmulas infantiles (Benno et al., 1984; Favier et al.,
2002; Harmsen et al., 2000; Mackie et al., 1999; Yoshioka et al., 1983). Precisamente,
la composición microbiológica constituye actualmente una de las mayores diferencias
entre la leche humana y las fórmulas infantiles.
IX.II.1. Origen y función de las bacterias lácticas aisladas de leche materna
Como se ha comentado en la sección anterior, en los últimos años se han
aislado diversas especies de bacterias a partir de la leche humana, incluyendo E.
faecium y E. faecalis (Heikkilä y Saris, 2003). Sin embargo, el origen de las bacterias
presentes en este fluido biológico es objeto de controversia.
La idea de que la colonización del intestino del neonato empieza durante el
parto debido a la contaminación de la cavidad oral del recién nacido con bacterias
procedentes de las mucosas vaginal e intestinal de la madre ha sido ampliamente
aceptada a pesar de no existir evidencias científicas (Favier et al., 2002; Isolauri et al.,
2001; Tannock, 1995). Posteriormente, las bacterias pasarían de la boca del niño al
pecho de la madre y de ahí a la leche. Tal hipótesis es contraria a los hallazgos de esta
Tesis. De hecho, resultados obtenidos por otros miembros de nuestro grupo de
investigación mediante la utilización de métodos de microbiología molecular (PCR-
DGGE y/o librerías de clones), indican que no existen diferencias destacables entre la
composición cualitativa y cuantitativa de la microbiota intestinal de niños nacidos por
cesárea y la de los nacidos por parto (Martín, 2005). Por otra parte, Heikkilä y Saris
(2003) aislaron cepas de Lb. rhamnosus con un perfil genético indistinguible de la cepa
comercial GG y también cepas de L. lactis productoras de nisina a partir de leche de
mujeres finlandesas. Lb. rhamnosus GG es una cepa consumida frecuentemente en
Finlandia a través de productos lácteos que son muy populares en aquel país nórdico
mientras que las cepas de L. lactis productoras de nisina se aislan habitualmente a
Discusión general ___________________________________________________________________________________
219
partir de alimentos fermentados. En consecuencia, es poco probable que estos aislados
estuvieran presentes en la leche materna como resultado de una mera contaminación
vaginal.
En cualquier caso, el papel prácticamente irrelevante de la microbiota vaginal
en la colonización intestinal del neonato ha sido puesto de manifiesto durante los
últimos años gracias al empleo de técnicas moleculares (Ahrné et al., 2005; Fanaro et
al., 2003; Matsumiya et al., 2002; Tannock et al., 1990). Por otra parte, diversos
estudios han demostrado que las bacterias que colonizan inicialmente el intestino
neonatal se transmiten de forma vertical entre la madre y el niño, incluso en aquellos
nacidos por cesárea, y todos los indicios sugieren que la leche puede resultar un
elemento clave en esta transmisión (Ahrné et al., 2005; Favier et al., 2002; Matsumiya
et al., 2002; Qutaishat et al., 2003; Schultz et al., 2004; Tannock et al., 1990). Por lo
que respecto al posible papel de la piel como fuente de bacterias lácticas para el
intestino del recién nacido, en esta Tesis Doctoral se ha comprobado la gran dificultad
o, en muchos casos, imposibilidad de aislar bacterias lácticas a partir de la piel que
rodea al pecho materno.
En esta Tesis se ha observado que los enterococos forman parte de la
microbiota asociadas a la leche humana fresca, lo que coincide con los resultados de
otros estudios (Eidelman y Szilagyi, 1979; Heikkilä y Saris, 2003; Ng et al., 2004;
West et al., 1979). De hecho, en los últimos años se han podido detectar estas y otras
bacterias propias de las mucosas del aparato digestivo de la madre (estreptococos,
estafilococos, enterococos, lactobacilos, propionibacterias…) en muestras de
corioamnion, líquido amniótico y/o sangre de cordón umbilical de niños sanos en los
que las membranas placentarias estaban intactas (Bearfield et al., 2002; Dasanayake et
al., 2005; Hitti et al., 1997; Jiménez et al., 2005). Curiosamente, las bacterias
predominantes en las muestras perinatales citadas coinciden con las que se han
encuentran en la leche humana, lo que sugiere que podrían acceder desde el aparato
digestivo a la circulación sistémica y, posteriormente, aparecer en fluidos como el
líquido amniótico o la leche materna. En otras palabras, al menos una parte sustancial
de las bacterias comensales existentes en leche materna podrían proceder de la
microbiota intestinal de la madre y accederían al epitelio de la glándula mamaria a
Discusión general ___________________________________________________________________________________
220
través de la ruta enteromamaria, una conexión bien documentada que se establece
durante los últimos meses de gestación y la lactancia.
Aunque el mecanismo por el que los enterococos y otras bacterias Gram-
positivas podrían atravesar el epitelio intestinal no se ha dilucidado todavía, algunos
trabajos recientes ofrecen posibilidades muy interesantes, que implican interacciones
no destructivas entre las bacterias, las células del epitelio intestinal y ciertas células del
sistema inmunitario, como las células dendríticas o los macrófagos (Langa, 2006;
Qutaishat et al., 2003; Rescigno et al., 2001; Vazquez-Torres et al., 1999). En
cualquier caso, las bacterias del intestino materno deberían reunir al menos tres
propiedades para alcanzar primero el epitelio de la glándula mamaria y, después, el
intestino del niño: (1) capacidad de translocación a través del epitelio intestinal, (2)
capacidad para interactuar con los componentes del sistema inmunitario en la lámina
propia del intestino y en la circulación sistémica sin ser destruidas, y (3) capacidad
para sobrevivir durante el tránsito por el aparato digestivo del lactante.
La capacidad de translocación de ciertos lactobacilos y enterococos sin causar
efectos perjudiciales para el hospedador ha sido puesta de manifiesto tanto in vitro
como in vivo (Berg, 1995; Berg y Garlington, 1979; Jiménez et al., 2005; Rodríguez et
al., 2001; Langa, 2006). Es más, la translocación de las bacterias lácticas en la cavidad
oral de mujeres embarazadas con una placenta completamente normal deriva en la
presencia de estas bacterias en el líquido amniótico, un proceso que tiene una clara
influencia beneficiosa en el proceso de gestación ya que se ha asociado a una menor
tasa de prematuridad (Dasanayake et al., 2005). Recientemente, Hufnagel et al. (2005)
observaron que el suero de humanos sanos contiene de forma natural anticuerpos
específicos frente a las cápsulas de los enterococos, lo que demuestra la presencia
regular de estas bacterias en la sangre sin que ello conlleve ninguna situación
patológica para el anfitrión.
Por otra parte, se sabe que en el intestino se establecen interacciones
específicas entre células del sistema inmunitario y ciertas bacterias lácticas, las cuales
pueden propiciar la translocación de cepas que se encuentran en la leche humana
(Christensen et al., 2002). En este mismo sentido, Langa (2006) detectó la activación
Discusión general ___________________________________________________________________________________
221
de células dendríticas pertenecientes a dos líneas celulares (D1 de origen murino y
KG1 de origen humano) en presencia de algunas cepas pertenecientes a los géneros
Lactobacillus, Lactococcus y Enterococcus mediante el análisis de marcadores de
activación. Por ejemplo, las células D1 mostraron una notable activación en presencia
de E. faecium M1a y Lb. salivarius CECT 5713 ya que se observó un aumento
significativo en la expresión de los marcadores MHC-II y B7.2 (CD86) en
aproximadamente el 60% de las células D1 expuestas a las citadas cepas. Estos
resultados concuerdan con los de otros trabajos previos en los que también se había
demostrado que las bacterias lácticas tienen un papel claramente estimulatorio en
células dendríticas inmaduras de ratón (Drakes et al., 2004).
Tradicionalmente se pensaba que las bacterias sólo podían atravesar el epitelio
intestinal intacto a través de las células M, unas células epiteliales especializadas que
se localizan en las placas de Peyer, pero Rescigno et al. (2001) demostraron que las
células dendríticas (CD18+) existentes en la lámina propia pueden penetrar el epitelio
intestinal intacto y captar bacterias directamente de la luz intestinal. Más
concretamente, las células dendríticas son capaces de abrir las zonas de oclusión entre
enterocitos adyacentes, proyectar dendritas al exterior del epitelio y captar células
viables, preservando la integridad de la barrera intestinal mediante la expresión de las
proteínas que integran las zonas de oclusión. Una vez en el interior de las células del
sistema inmunitario, las bacterias pueden migrar desde la mucosa intestinal y colonizar
mucosas distantes, como la de los tractos respiratorio y genitourinario, la de las
glándulas salivares y lacrimales, y, lo que es más relevante para este trabajo, la de la
glándula mamaria de las mujeres embarazadas y/o lactantes (Roitt, 1994).
Precisamente, durante el período de lactancia, se produce un acúmulo selectivo de
células del sistema inmunitario en la glándula mamaria mediante un proceso regulado
por las hormonas lactogénicas (Bertotto et al., 1991).
Con respecto a la supervivencia de las bacterias lácticas en la corriente
sanguínea/linfática, es interesante señalar que 57 de las 166 cepas de enterococos y
125 de las 485 cepas de lactobacilos depositadas en la prestigiosa colección PROSAFE
(derivada del proyecto de la UE titulado “Biosafety evaluation of lactic acid bacteria
used for human consumption”) fueron aisladas originalmente de muestras de sangre
Discusión general ___________________________________________________________________________________
222
humana obtenida, en la mayoría de los casos, de individuos sanos (Vankerckhoven et
al., 2004). Entre esas 182 cepas se encuentran dos especies de enterococos y 16 de
lactobacilos, incluyendo todas las especies a las que pertenecen las cepas identificadas
en las muestras de leche analizadas en el transcurso de esta Tesis. Resulta
particularmente ilustrativo que de las 57 cepas de enterococos aisladas de sangre, 53
(93%) pertenezcan a la especie E. faecium, precisamente la especie que se ha
encontrado de forma mayoritaria en la leche de las mujeres que participaron en nuestro
estudio.
Finalmente, un estudio reciente de nuestro grupo de investigación ha
demostrado la elevada supervivencia de diversas cepas de lactobacilos de leche
humana cuando se exponen a las condiciones existentes durante el tránsito por el tracto
gastrointestinal (Martín et al., 2005). De hecho, un reciente estudio ha corroborado que
la administración oral de Lb. gasseri CECT 5714 a personas adultas va seguida de su
presencia en el intestino (Olivares et al., 2006). Lo mismo se ha observado con una de
las cepas de Enterococcus faecium aisladas de leche materna en esta Tesis cuando se
administró a ratonas gestantes (Fernández et al., 2004). Este hecho no es de extrañar ya
que precisamente la resistencia a la exposición a condiciones acídicas y/o a la
presencia de sales biliares son características comunes entre los enterococos.
Este hecho implicaría que la capacidad de algunas bacterias lácticas intestinales
para extenderse a otros tejidos u órganos de hospedadores humanos sanos habría sido
tradicionalmente infravalorada. Aunque los problemas clínicos relacionados con
lactobacilos son muy escasos, se han descrito algunos casos de endocarditis,
septicemia o abscesos hepáticos causados por estas bacterias, habitualmente en
pacientes con graves enfermedades previas (Alvarez-Olmos y Oberhelman, 2001;
Rautio et al., 1999). Obviamente tales casos no son representativos de lo que puede
suceder en un hospedador sano pero ilustran el hecho de que ciertos lactobacilos tienen
mecanismos para extenderse desde el intestino a localizaciones extraintestinales. En un
hospedador sano, estas bacterias no provocan sintomatología, por lo que no se
investiga su presencia extraintestinal y pasan desapercibidas. Conviene recalcar que el
consumo de lactobacilos (y otras bacterias lácticas) es extraordinariamente seguro ya
que cada año se consumen en el mundo billones de dosis de productos que los
Discusión general ___________________________________________________________________________________
223
contienen (Hamilton-Miller et al., 1999; Reid, 2002) y el escasísimo número de casos
clínicos en los que están implicados se puede considerar prácticamente irrelevante
desde un punto de vista epidemiológico.
IX.2.2. El caso particular de los enterococcos
Por lo que respecta a los enterococos, algunas cepas pueden actuar como
patógenos oportunistas y causar infecciones nosocomiales en niños que sufren
enfermedades graves que requieren, habitualmente, convalecencias prolongadas
(Moellering, 2000). Hasta hace poco tiempo, se pensaba que las infecciones
enterocócicas se adquirían endógenamente, es decir, a partir de la propia flora del
paciente; sin embargo, en los últimos años los análisis de casos clínicos han
demostrado que prácticamente todas las cepas involucradas tenían un origen exógeno
(Kayser, 2003). En este sentido, actualmente se sabe que las infecciones por
enterococos suelen seguir un proceso que consta de dos etapas (Kayser, 2003);
inicialmente, se produce una colonización asintomática de los pacientes con cepas que
poseen factores de virulencia y resistencia a antibióticos y que son endémicas en un
hospital o unidad hospitalaria; seguidamente, esta población exógena crece, a menudo
favorecida por la eliminación de competidores debida a la antibioterapia, y puede
conducir a una enfermedad adicional en pacientes de riesgo (normalmente con
enfermedades graves y/o crónicas que requieren una larga hospitalización). Conviene
destacar que, incluso en pacientes inmunodeprimidos, los enterococos por sí solos son
a menudo incapaces de causar una enfermedad y requieren para ello la presencia de
una microbiota patógena compleja (Kayser, 2003). En cualquier caso, no se debe
generalizar esta consideración a todos los enterococos ya que la incidencia de factores
de virulencia y de resistencia a antibióticos depende de cada cepa (Eaton y Gasson,
2001; Franz et al., 2001; Temmerman et al., 2003). Vancanneyt et al. (2002)
compararon los genotipos de numerosas cepas de E. faecium aisladas de muestras
humanas, animales y alimentarias, y encontraron que todos los aislados humanos
involucrados en infecciones clínicas podrían englobarse en un mismo subgrupo,
distinto de todos los demás; los resultados de ese trabajo sugieren que seguramente
existe una base genética común a todas las cepas potencialmente peligrosas. Pillai et
al. (2002) también han sugerido la existencia de subpoblaciones virulentas entre las
Discusión general ___________________________________________________________________________________
224
cepas de E. faecalis. En consecuencia, la seguridad de cualquier cepa de Enterococcus
spp. de interés clínico o industrial debe ser evaluada de forma individual y meticulosa.
Por este motivo, se analizó la presencia de los genes que codifican factores de
virulencia conocidos o presuntivos (efaAfs+, efaAfm
+, espfs+, espfm
+, cpd+, cob+, ccf+,
cad+, gelE+, agg+, vanA, vanB y cylMBA+) y de diversos fenotipos relacionados con la
seguridad (gelatinasa, hemólisis, agregación, capacidad de conjugación, actividad
proteolítica, antibiograma, degradación de mucinas, producción de aminas biógenas)
en las cepas de E. faecium aisladas de leche materna en esta Tesis. Los resultados
obtenidos por PCR e hibridación de Southern revelaron que ninguna de las cepas
analizadas contenía determinantes genéticos de factores de virulencia, a excepción del
gen efaAfm que estaba presente en todas. Estos resultados coinciden plenamente con los
de las pruebas fenotípicas ya que ninguna de las cepas mostró actividad gelatinasa,
producción de hemolisina o capacidad de agregación celular. Tampoco se pudo
conseguir la transferencia conjugativa de pAD1 desde E. faecalis FI9582 a E. faecium
LC27, a pesar de los repetidos intentos.
La presencia en todas las cepas del gen efaAfm, que codifica la supuesta
adhesina, no es un hecho preocupante ya que hasta la fecha no se le ha podido atribuir
ningún papel en la virulencia de E. faecium, en contraste con efaAfs de E. faecalis
(Singh et al., 1998). La presencia de efaAfm no tiene valor como indicador de riesgo en
ausencia de otros factores de virulencia. De hecho, se halla presente en el 100% de los
E. faecium que forman parte de cultivos iniciadores analizados por Eaton y Gasson
(2001) y, al menos varias de esas cepas, tienen un largo historial de uso seguro en
alimentos humanos. Además, el gen espfm, que codifica otra adhesina enterocócica,
tampoco se pudo detectar en ninguna cepa. La ausencia de los genes cylA, cylB y cylM
explica la ausencia de actividad hemolítica en las cepas analizadas ya que su expresión
es imprescindible para la biosíntesis de la citolisina (Gilmore et al., 1994). De forma
similar, la ausencia del gen gelE está directamente relacionada con la ausencia de
actividad gelatinasa.
Algunos enterococos poseen mecanismos de transferencia génica muy eficaces
y se sabe que los genes que codifican ciertos factores de virulencia y la resistencia a
Discusión general ___________________________________________________________________________________
225
algunos antibióticos están asociados con plásmidos altamente transferibles. Sin
embargo, en este estudio no fue posible detectar los genes relacionados con feromonas
sexuales (cpd, cob, ccf y cad) ni el gen de agregación agg en las cepas analizadas;
estos resultados justifican la falta de agregación celular y la repetida incapacidad de E.
faecium LC27 para adquirir el plásmido pAD1 mediante conjugación. En
consecuencia, el potencial de nuestras cepas para adquirir y/o transferir genes es
extremadamente bajo, en caso de que exista. El hecho de que algunos genes
indeseables estén codificados en plásmidos que responden a feromonas y que
generalmente sólo se encuentran en E. faecalis podría explicar la mayor incidencia de
factores de virulencia en cepas de esta especie y su marcado predominio (80-90%)
entre los enterococos involucrados en infecciones humanas (Kayser, 2003). Aunque se
ha descrito la transferencia de genes de resistencia a vancomicina a una cepa probiótica
de E. faecium (Lund y Edlund, 2001), otras cepas se han mostrado totalmente
incapaces para participar en procesos de conjugación (Eaton y Gasson, 2001). En este
sentido, Franz et al. (2003) consideran que, en muchos estudios, las tasas de
transferencia de genes a cepas de E. faecium son muy exageradas ya que las
condiciones en las que se realizan los experimentos no son representativas de las que
pueden existir en ambientes naturales.
Ninguna de las cepas analizadas produjo histamina, putrescina o cadaverina.
Por el contrario, todas las cepas produjeron niveles detectables de tiramina, a
excepción de E. faecium LM1a y LM22. Las aminas biógenas se producen en ciertos
alimentos, como consecuencia de la actividad descarboxilasa de algunos
microorganismos, y cuando se encuentran en concentraciones elevadas pueden
ocasionar problemas toxicológicos en los consumidores (ten Brink et al., 1990). La
histamina y la tiramina tienen propiedades vasoactivas y psicoactivas, mientras que las
diaminas putrescina y cadaverina, además de potenciar la toxicidad de las anteriores,
son potenciales precursores de nitrosaminas carcinogénicas si simultáneamente existen
agentes nitrosables en los alimentos (Bover-Cid y Holzapfel, 1999). En este estudio, se
investigó el potencial de las cepas para producir estos compuestos orgánicos en
previsión de que algún día se utilicen en alimentos comerciales. No se pudo detectar
histamina, putrescina o cadaverina a partir de ninguna de las cepas, mientras que la
mayoría formaron tiramina. Las únicas excepciones fueron E. faecium LM1a y LM22,
Discusión general ___________________________________________________________________________________
226
dos aislados procedentes de la misma muestra de leche y que muy posiblemente
conformen una misma cepa ya que comparten perfiles genéticos. A diferencia de lo
que sucede con otras aminas biógenas, la capacidad para producir tiramina está
ampliamente distribuida entre los enterococos (Le Jeune et al., 1995; Bover-Cid y
Holzapfel, 1999; Bover-Cid et al., 2001; Gardini et al., 2001). No obstante, la
formación de tiramina parece requerir unas condiciones ambientales que sólo se
encuentran en alimentos fermentados o alterados (Bover-Cid y Holzapfel, 1999) y, en
consecuencia, la presencia de estas cepas en la leche humana o en el intestino del
lactante no debe ser considerada como un riesgo para la salud infantil.
Todas las cepas analizadas fueron sensibles a la ampicilina, a la clindamicina,
al cloranfenicol, a la tetraciclina y, lo que es más significativo, a la vancomicina. Por el
contrario, se mostraron resistentes a la eritromicina, a la ciprofloxacina y a la
kanamicina. No se detectaron los genes vanA o vanB en ninguna de las cepas
analizadas. La resistencia a los antibióticos es una propiedad muy importante cuando
se evalúa la seguridad de cepas de enterococos. En este contexto, resultan
particularmente preocupantes la resistencia frente a glucopéptidos como la
vancomicina ya que, en primer lugar, pueden ser transferidas a otras cepas, incluso de
otras especies y géneros, y, en segundo lugar, porque estos antibióticos constituyen
frecuentemente la única opción para tratar infecciones nosocomiales en hospedadores
inmunodeprimidos. Diversos estudios sobre la incidencia de resistencia a antibióticos
entre enterococos que no están implicados en infecciones humanas han revelado que la
mayoría de las cepas analizadas, especialmente las de E. faecium, suelen ser sensibles
a los antibióticos clínicamente importantes, incluyendo la vancomicina (Klein et al.,
1998; Franz et al., 2001; Temmerman et al., 2003). Recientemente, Temmerman et al.
(2003) han demostrado la escasa validez de los métodos basados en difusión a partir de
discos para determinar la resistencia real a la vancomicina. A pesar de ello, estos
métodos se siguen empleando ampliamente y originan un gran número de falsos
resistentes. Por ello, los citados autores sugirieron el empleo de métodos de dilución,
como los habitualmente utilizados para establecer concentraciones mínimas en
combinación con la detección de los genes vanAB por PCR.
Discusión general ___________________________________________________________________________________
227
La sensibilidad de las cepas a antibióticos tan importantes como la ampicilina,
la clindamicina, el cloranfenicol, la tetraciclina y la vancomicina, junto con la ausencia
de los genes vanAB y la incapacidad manifiesta para adquirir información genética
mediante procesos de conjugación, hace que, desde este aspecto, las cepas analizadas
se puedan considerar seguras. La resistencia de todas las cepas frente a la kanamicina
era un resultado esperado ya que el género Enterococcus es intrínsecamente resistente
a dicho antibiótico (Franz et al., 1999).Quizás, la prueba más convincente de la
seguridad de las cepas de E. faecium sea el hecho de que los niños de cuyas madres se
obtuvieron las muestras de leche se alimentaron con leche materna que contenía
elevadas concentraciones de enterococos (>103 ufc/ml) durante al menos sus primeros
5 meses de vida y su estado de salud ha sido óptimo hasta la fecha.
Finalmente, conviene reflexionar sobre el hecho de que entre los principales
agentes bacterianos causantes de infecciones neonatales nosocomiales se encuentren
enterococos, estafilocosos, estreptococos, propionibacterias o E. coli, que son
precisamente las bacterias predominantes de forma natural en sangre del cordón
umbilical, líquido amniótico y meconio de niños sanos (Jiménez et al., 2005) y que son
también muy abundantes en la leche humana (Heikkilä y Saris, 2003; Ng et al., 2004).
El hecho de que estos microorganismos causen una enfermedad infecciosa únicamente
a niños con otras patologías predisponentes sugiere que el estado del hospedador es un
factor clave para que una bacteria comensal pueda convertirse en un patógeno
oportunista.
IX.2.3. Los enterococos de la leche humana como agentes bioterapéuticos y/o
bioconservantes
En los últimos años, los problemas asociados a la difusión de bacterias
resistentes a antibióticos de relevancia clínica ha conducido a un renovado interés por
la bacterioterapia, una práctica que hace uso de bacterias comensales o probióticas para
prevenir o tratar la colonización del hospedador por parte de patógenas (Huovinen,
2001; Reid et al., 2001; Strauss, 2000). Esta estrategia se basa en el principio de
exclusión competitiva, por el que ciertas bacterias no patógenas se imponen sobre las
patógenas cuando compiten por el mismo nicho ecológico (Mackie et al., 1999). En
Discusión general ___________________________________________________________________________________
228
este sentido, es lógico suponer que algunas de las bacterias comensales presentes en la
leche materna contribuyen a la prevención de infecciones infantiles; de hecho, su
presencia podría ser una de las razones que explicarían porqué la actividad
antimicrobiana exhibida por la leche humana recién recolectada se pierde, parcial o
totalmente, tras su pasteurización (Ford et al., 1977).
La leche materna es el único alimento ingerido por muchos neonatos, un
segmento de la población muy sensible a las enfermedades infecciosas (Morris y
Potter, 1997), especialmente cuando deben permanecer ingresados en unidades de
neonatología durante un tiempo prolongado. En consecuencia, el aislamiento de
bacterias con propieda beneficiosas para la salud de los niños a partir de leche humana
resulta particularmente atractivo para los sectores biomédico y alimentario ya que, por
su propia naturaleza, cumplen algunos de los requisitos generalmente recomendados
para bacterias empleadas como probióticos humanos, tales como origen humano,
ingestión infantil prolongada sin efectos adversos y adaptación tanto a mucosas como a
substratos lácteos (Klaenhammer y Kullen, 1999). Además, tal hallazgo abre nuevas
perspectivas sobre el papel biológico de la lactancia materna. De hecho, Martín et al.
(2005) observaron recientemente que al menos algunos de los lactobacilos aislados de
leche materna poseen un potencial probiótico similar o superior al de ciertas cepas de
gran difusión comercial como Lb. rhamnosus GG, Lb. casei imunitass o Lb. johnsonii
La-1. Conviene tener en cuenta que entre las bacterias aisladas normalmente de la
leche materna existen algunas especies, como Lb. gasseri, Lb. rhamnosus, Lb.
salivarius, Lb. fermentum o E. faecium, que se incluyen habitualmente entre las
potencialmente probióticas (Holzapfel et al., 1998). En este sentido, 21 de las 166
cepas de enterococos y 163 de las 485 cepas de lactobacilos depositadas en la
colección PROSAFE citada anteriormente se emplean en productos prebióticos y
fueron donadas por las empresas que las comercializan (Vankerckhoven et al., 2004).
Nuevamente llama la atención que, entre las 21 cepas de enterococos utilizadas como
probióticos, 17 (81%) pertenecen a la especie E. faecium. En consecuencia, la leche de
mujeres sanas puede constituir una fuente de bacterias lácticas probióticas o
bioterapéuticas con un papel importante en la protección de los niños y las madres
frente a enfermedades infecciosas (Gavin y Ostovar, 1977). Como se ha comentado
repetidamente, la leche materna es posiblemente la principal fuente de bacterias
Discusión general ___________________________________________________________________________________
229
comensales para el intestino del lactante y se considera que las bacterias intestinales
son uno de los estímulos más importantes para el desarrollo del tejido linfoide
asociado a la mucosa intestinal, pudiendo promover procesos antiinfecciosos y
antialergénicos (Kalliomäki et al., 2001).
El potencial probiótico de las bacterias presentes en la leche materna debería
ser un motivo de reflexión para los Bancos de Leche. El desconocimiento de la
existencia de una microbiota específica en la leche materna ha propiciado que estas
entidades desechen aquellas leches que contienen un recuento total de entre 103 y 105
ufc/ml, a pesar de que dichas concentraciones se encuentran de forma natural en la
leche de prácticamente cualquier mujer sana (Heikkilä y Saris, 2003). Además, la mera
presencia, a cualquier nivel, de enterococos o estafilococos también se considera un
elemento de inaceptabilidad. En esta Tesis, se ha observado que tales bacterias son
habitantes naturales de la leche materna por lo que, siguiendo ese criterio,
prácticamente ninguna mujer sana debería amamantar a su bebé; afortunadamente, a
las mujeres que amamantan directamente a sus hijos no se les practica cultivos de
leche materna. En este sentido, no es de extrañar que hasta un 86% de las muestras de
leche extraidas de mujeres chinas sanas habría sido rechazada según los criterios de
muchos Bancos de Leche (Ng et al., 2004) a pesar de que, en ese mismo estudio, el
empleo de esa leche “presuntamente contaminada” derivó en efectos beneficiosos para
la salud de los niños que la consumieron, especialmente en comparación con la de
aquellos que recibieron fórmulas infantiles. En conclusión, la leche de madres sanas
puede considerarse como una fuente de enterococos seguros para sus recién nacidos.
La elevada concentración de enterococos tanto en la leche materna como en el
intestino infantil sugiere que estos microorganismos deben desempeñar un papel
biológico importante en los primeros meses de vida del niño, tema que será objeto de
estudio por parte de nuestro grupo de investigación en un futuro próximo.
Por lo que respecta al posible papel de los enterococos de la leche materna
como candidatos a formar parte de cultivos bioprotectores para la industria alimentaria,
hay que recordar que las bacterias lácticas, en general, y los enterococos, en particular,
desempeñan papeles muy importantes en los procesos fermentativos, entre los que se
incluyen un aumento de la vida útil, la seguridad microbiológica y la calidad
Discusión general ___________________________________________________________________________________
230
organoléptica de los productos finales en comparación con las de las materias primas
de partida (Wood, 1997). Otro aspecto positivo es que prácticamente todas las cepas
que forman parte de la microbiota natural de alimentos fermentados poseen un largo
historial de consumo seguro (Caplice y Fitzgerald, 1999; Wood y Holzapfel, 1995).
Las bacterias lácticas, incluyendo a enterococos, y los productos de su metabolismo
han sido consumidos desde tiempos inmemoriales a través de alimentos fermentados.
En este sentido, Aymerich y Hugas (1998) consideran que si por bioconservación se
entiende la extensión de la vida útil e incremento de la seguridad sanitaria de los
alimentos mediante la microflora natural o sus metabolitos, entonces las bacterias
lácticas son los candidatos ideales para su selección como cultivos bioprotectores. Así,
no es de extrañar que se haya llegado a definir bioconservación como el empleo de
bacterias lácticas, sus productos metabólicos o ambos para mejorar o asegurar la
seguridad y calidad de los alimentos (Montville y Winkowski, 1997).
Los enterococos constituyen una parte importante de la microbiota autóctona de
las mucosas humanas (Favier et al., 2002; Manero y Blanch, 1999). Dentro de las
especies de enterococos, E. faecium es la más numerosa en el tracto gastrointestinal
humano, seguida de E. faecalis (Klein, 2003). Tradicionalmente, estas dos especies se
han empleado como indicadores de contaminación fecal debido, por una parte, a su
amplia distribución en el intestino de animales y personas, y, por otra, a su resistencia
a los ambientes extraentéricos. Sin embargo, esta interpretación tan parcial ha
evolucionado y actualmente se considera que los enterococos forman parte de la
microbiota normal de las mucosas y los alimentos, sin que su presencia sea
necesariamente atribuible a una falta de higiene (Franz et al., 1999; Klein, 2003). De
hecho, existen diversas cepas de enterococos que integran cultivos iniciadores o
adjuntos, o que forman parte de productos probióticos (Franz et al., 2003). En esta
Tesis, se ha observado que las cepas de enterococos aisladas de leche materna son
seguras, poseen actividad anti-Listeria y podrían tener aplicaciones como cultivos
adjuntos o bioprotectores en las industrias queseras.
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
231
X. CONCLUSIONES
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
232
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
233
PRIMERA. En esta Tesis se han desarrollado diversos sistemas para la producción
heteróloga de pediocina PA-1 en cepas salvajes de Lactococcus lactis con buenas
propiedades tecnológicas para la elaboración de quesos. La introducción del plásmido
pFI2160, que contiene el gen híbrido L-pedA (que codifica la fusión entre el líder de la
lactococina A y la propediocin PA-1) y los genes lcnC y lcnD (que codifican el
sistema de secreción de la lactococina A) en L. lactis ESI 153 y L. lactis ESI 515
(Nis+) condujo a una producción estable de pediocina equivalente a un 30 y un 20%,
respectivamente, de la cantidad producida por Pediococcus acidilactici 347, una cepa
que produce dicha bacteriocina de forma natural.
FIRST. In this PhD Thesis, heterologous production of pediocin PA-1 in Lactococcus
lactis strains, which had been previously selected because of their technological
properties for cheese making, was investigated. The introduction of plasmid pFI2160,
which contains the hybrid gene L-pedA (encoding the fusion between the lactococcin
A leader and propediocin PA-1) and also the genes lcnC and lcnD (encoding the
lactococcin A secretion apparatus), into L. lactis ESI 153 and L. lactis ESI 515 (Nis+)
led to a stable pediocin production. The production level was equivalent to 30 and
20%, respectively, of the quantity produced by the natural pediocin PA-1 producer
Pediococcus acidilactici 347.
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
234
SEGUNDA. La producción de pediocina PA-1 aumentó considerablemente tras la
introducción de los plásmidos pRK119 y pCNC16, que contienen el operón completo
de la pediocina bajo control del promotor P32, en los mismos hospedadores. Con
relación con las cepas derivadas de L. lactis ESI 153, la concentración de pediocina en
los sobrenadantes de L. lactis RK1 y CNC1 fue mayor (165 %) que la obtenida en los
de P. acidilactici 347. En el caso de las derivadas de L. lactis ESI 515, la producción
de pediocina mostrada por L. lactis RK2 y CNC2 fue similar a la de P. acidilactici
347. La transformación de L. lactis ESI 515 con cualquiera de estos plásmidos no
afectó a su capacidad para producir nisina. En consecuencia, se obtuvieron cepas de L.
lactis con la capacidad de coproducir pediocina PA-1 y nisina a niveles comparables a
los de las respectivas cepas parentales.
SECOND. Pediocin production increased after the introduction of plasmids pRK119
and pCNC16, which contain the complete pediocin operon under the control of the
strong P32 promoter, into the same hosts. In relation to L. lactis ESI 153 derivatives,
pediocin production by strains RK1 (pRK119) and CNC1 (pCNC16) was notably
higher (163-165 %) than that produced by P. acidilactici 347. In the case of the L.
lactis ESI 515-derived strains, the level of pediocin production by L. lactis RK2 and
CNC2 was similar to that of P. acidilactici 347. Transformation of L. lactis ESI 515
with any of the plasmids cited above did not affect its ability to produce nisin.
Therefore, we obtained L. lactis strains technologically suited for cheese making with
the ability to coproduce pediocin PA-1 and nisin A at levels comparable to the
respective wild parental strains.
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
235
TERCERA. En esta Tesis se construyó un vector de grado alimentario (pGA1), que
porta el operón completo de la pediocina bajo control del promotor P32 y carece de
genes que confieran resistencia a antibióticos. Una vez obtenidos los transformantes de
L. lactis ESI 153 y L. lactis ESI 515 (L. lactis GA1 y GA2, respectivamente), se
evaluó su eficacia para inhibir el crecimiento de Listeria innocua SA1 durante la
elaboración de quesos. Al final del período de maduración, los recuentos de L. innocua
fueron inferiores a 50 ufc/g en los quesos que contenían L. lactis GA1 e inferiores a 25
ufc/g en aquellos con L. lactis GA2. En consecuencia, las cepas desarrolladas podrían
resultar útiles como cultivos bioprotectores para controlar el crecimiento de Listeria en
quesos.
THIRD. Plasmid pGA1 was constructed in order to achieve food-grade heterologous
production of pediocin PA-1 in the lactococcal hosts. This plasmid contains the
complete pediocin operon under the control of the strong P32 promoter and is devoid
of any antibiotic gene marker. Once L. lactis ESI 153 and L. lactis ESI 515
transformants were obtained (L. lactis GA1 and GA2, respectively), their ability to
inhibit Listeria innocua SA1 growth during cheese ripening was also investigated. At
the end of the ripening period, counts of L. innocua in cheeses made with the
bacteriocin-producing lactococcal strains were below 50 CFU/g in the L. lactis GA1
cheeses and below 25 CFU/g in the L. lactis GA2 ones. As a consequence, the food-
grade recombinant strains can be useful as bioprotective cultures to control the growth
of Listeria in cheeses.
Conclusiones ___________________________________________________________________________________
236
CUARTA. La leche materna es una excelente fuente de bacterias lácticas para el
intestino infantil. En esta Tesis, las especies que se aislaron con mayor frecuencia
fueron Lactobacillus gasseri y Enterococcus faecium. Los resultados obtenidos
revelaron que las siete cepas de E. faecium analizadas estaban libres de determinantes
de virulencia. Ninguna de las cepas mostró actividad gelatinasa, producción de
hemolisinas o capacidad de agregación. Ninguna portaba genes van. Por lo tanto, la
leche de mujeres sanas parece ser una fuente de cepas apatógenas de E. faecium para el
intestino del lactante.
FOURTH. Breast milk is an excellent source of lactic acid bacteria to the neonatal
gut. In this PhD Thesis, the species more frequently isolated were Lactobacillus
gasseri and Enterococcus faecium. PCR amplifications and Southern hybridizations
revealed that all the E. faecium strains tested were clear of potential virulence
determinants. None of the strains showed gelatinase activity, hemolysin production or
aggregation phenotype and none of them carried van genes. These findings suggest
that milk of healthy mothers may be a source of avirulent E. faecium isolates to the
newborns.
***************************
QUINTA. El análisis de la actividad anti-Listeria y de diversas propiedades
bioquímicas de interés tecnológico para la industria láctea reveló que las cepas de E.
faecium aisladas de leche materna pueden resultar útiles como cultivos adjuntos y/o
bioprotectores para la elaboración de quesos.
FIFTH. Analyses of anti-Listeria activity and biochemical properties of technological
interest to dairy industries revealed that the E. faecium strains isolated from breast milk
may be useful as adjunct and/or bioprotective cultures in cheese making.
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