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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
“COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD LEISHMANICIDA DE LOS
TRANSFEROSOMAS DE ENROFLOXACINA FRENTE A LA
ENROFLOXACINA EN SOLUCIÓN USANDO PROMASTIGOTES DE
Leishmania mexicana COMO MODELO BIOLÓGICO”
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de Química Farmacéutica
Autor: Gina Alexandra Loachamin Toapanta
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
DMQ, junio, 2018
ii
DEDICATORIA
A mis padres Delia y Manuel por creer en mí y siempre darme fuerzas para seguir
adelante.
A mis hermanos Mario y Marco por su cariño y apoyo incondicional.
A mi pequeño Matías por la alegría y el amor que me das cada día.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser mi fortaleza y sustento durante las diferentes etapas de mi vida.
A mis padres por el cariño y apoyo brindado en toda mi etapa estudiantil.
A mi tutor Javier Santamaría por sus consejos, apoyo y fuerzas brindadas para la
culminación de esta investigación.
A mi cotutora Ana Poveda por su ayuda y conocimientos brindados.
Al doctor Pablo Bonilla por permitirme utilizar las instalaciones y equipos del
laboratorio de nanomateriales.
Al Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis-CIZ por permitirme realizar
parte de este proyecto en sus instalaciones.
Al doctor Jorge Heredia por abrirnos las puertas para el uso de las instalaciones del
Centro de Investigación Biomédica (CENBIO).
A la doctora Marbel Torres por donar la cepa de Leishmania mexicana, utilizada en
esta investigación.
A Lissette Esteves por impartir su conocimiento y ayuda en la determinación de la
actividad leishmanicida de los transferosomas.
A Luis Cacuango por su apoyo en el análisis de los transferosomas en el AFM.
A mis amigos Diego, Pablo y Diana por su confianza, cariño y amistad brindada.
Finalmente, a la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias
Químicas a quienes les debo mi formación académica.
iv
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo Gina Alexandra Loachamin Toapanta en calidad de autor del trabajo de
investigación: Comparación de la actividad leishmanicida de los transferosomas de
enrofloxacina frente a la enrofloxacina en solución usando promastigotes de
Leishmania mexicana como modelo biológico, autorizo a la Universidad Central del
Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que pertenecen o parte de los que contiene
esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8, 19 y demás pertenecientes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a
lo dispuesto en el Art.144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
v
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Javier Rodrigo Santamaría Aguirre en calidad de tutor del trabajo de investigación
titulado: Comparación de la actividad leishmanicida de los transferosomas de
enrofloxacina frente a la enrofloxacina en solución usando promastigotes de
Leishmania mexicana como modelo biológico, elaborado por el estudiante Gina
Alexandra Loachamin Toapanta de la Carrera de Química Farmacéutica, Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo
reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo
epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por
parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los dos días del mes de mayo de 2018
vi
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Inés Echeverría y Pablo Bonilla, luego de revisar el trabajo
de investigación titulado: Comparación de la actividad leishmanicida de los
transferosomas de enrofloxacina frente a la enrofloxacina en solución usando
promastigotes de Leishmania mexicana como modelo biológico, previo a la obtención
del título de Químico Farmacéutico presentado por la señorita Gina Alexandra
Loachamin Toapanta, APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
vii
LUGAR DE LA INVESTIGACIÓN
El presente proyecto de Investigación se realizó en el laboratorio de Nanomateriales del
Instituto de Investigación y Posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y en el
Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis de la Universidad Central del
Ecuador, en el laboratorio de Replicación del DNA e Inestabilidad del Genoma
(DR&GI) el cual se encuentra a cargo de la Doctora Ana María Poveda Gabaldón.
Este trabajo fue financiado con fondos del proyecto #21 de la Dirección General de
Investigación y Posgrado, Universidad Central del Ecuador y con fondos de la
Academie de Recherche et d ́Enseignement Supérieur (ARES) de Bélgica.
viii
Índice de Contenidos
Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo I .......................................................................................................................... 3
El Problema ...................................................................................................................... 3
Planteamiento del problema.......................................................................................... 3
Formulación del problema. ........................................................................................... 4
Preguntas directrices. .................................................................................................... 4
Objetivos ....................................................................................................................... 4
Objetivo general. ....................................................................................................... 4
Objetivos específicos. ............................................................................................... 4
Justificación e importancia ........................................................................................... 5
Capítulo II ......................................................................................................................... 7
Marco teórico.................................................................................................................... 7
Antecedentes de la investigación .................................................................................. 7
Fundamento teórico. ..................................................................................................... 8
Leishmania ................................................................................................................ 8
Ciclo de vida de Leishmania spp. ............................................................................. 9
Leishmaniasis .......................................................................................................... 10
Manifestaciones clínicas ...................................................................................... 10
ix
Actividad leishmanicida de fluoroquinolonas como posible tratamiento alternativo
................................................................................................................................. 11
Enrofloxacina .......................................................................................................... 12
Propiedades físicas y químicas ............................................................................ 13
Espectro antibacteriano ....................................................................................... 16
Propiedades farmacocinéticas ............................................................................. 16
Liposomas ............................................................................................................... 17
Transferosomas.................................................................................................... 18
Composición de los transferosomas .................................................................... 18
Caracterización de los transferosomas ................................................................ 20
Marco legal. ................................................................................................................ 24
Norma ISO/TC 229 Nanotecnologies ..................................................................... 24
Norma ISO/TR 12885 ............................................................................................. 24
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA INEN-ISO/TR 12885 .............................. 25
Hipótesis ..................................................................................................................... 26
Conceptualización de variables .................................................................................. 26
Formulación ................................................................................................................ 26
Variables independientes ........................................................................................ 26
Variables dependientes ............................................................................................ 27
Actividad leishmanicida ............................................................................................. 27
Variables independientes. ....................................................................................... 27
x
Variables dependientes. ........................................................................................... 27
Capítulo III ..................................................................................................................... 28
Metodología .................................................................................................................... 28
Diseño de la investigación .......................................................................................... 28
Materiales y métodos .................................................................................................. 28
Formulación ............................................................................................................ 31
Obtención de los transferosomas ............................................................................ 31
Método de hidratación de la película delgada ..................................................... 31
Caracterización de los transferosomas .................................................................... 32
Distribución del tamaño de la vesícula y potencial zeta...................................... 32
Eficiencia de atrapamiento .................................................................................. 32
Perfil de liberación .............................................................................................. 33
Estabilidad de los transferosomas ....................................................................... 33
Caracterización de actividad leishmanicida de los transferosomas de enrofloxacina
(determinación de MIC, NIC, IC50). ...................................................................... 34
Diseño experimental ................................................................................................... 38
Formulación ............................................................................................................ 38
Screening ............................................................................................................. 38
Optimización ....................................................................................................... 39
Actividad leishmanicida .......................................................................................... 41
Matriz de operacionalización de variables.................................................................. 41
xi
Formulación ............................................................................................................ 41
Screening ............................................................................................................. 41
Optimización ....................................................................................................... 42
Actividad leishmanicida .......................................................................................... 43
Técnicas e instrumentos de recolección de datos ....................................................... 43
Técnicas de procesamiento y análisis de datos ........................................................... 44
Capítulo IV ..................................................................................................................... 45
Análisis y discusión de resultados .................................................................................. 45
Formulación ................................................................................................................ 45
Screening ................................................................................................................. 45
Optimización ........................................................................................................... 48
Actividad leishmanicida ............................................................................................. 60
Capítulo V ...................................................................................................................... 67
Conclusiones y recomendaciones ................................................................................... 67
Bibliografía ..................................................................................................................... 69
xii
Índice de Anexos
Anexo A. Árbol de problemas ........................................................................................ 74
Anexo B. Diagrama de flujo de la elaboración de los transferosomas ........................... 75
Anexo C. Instrumento de recolección de datos .............................................................. 77
Anexo D. Resultados pruebas preliminares.................................................................... 80
Anexo E. Espectros de los componentes de los transferosomas .................................... 81
Anexo F. Curva de calibración de enrofloxacina en metanol ........................................ 83
Anexo G. Datos obtenidos en el perfil de liberación de la formulación final de
transferosomas ................................................................................................................ 84
Anexo H. Fotografías del proceso de obtención de los transferosomas ......................... 85
Anexo I. Fotografía del disolutor durante el ensayo de liberación de la droga .............. 87
xiii
Índice de figuras
Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp. ..................................................................... 9
Figura 2. Estructura química de la enrofloxacina.. ......................................................... 13
Figura 3. Formas de enrofloxacina en función del pH.. ................................................. 14
Figura 4. Distribución de la fracción de las cuatro especies: el catión ácido (C), especie
neutra no ionizada (N), el zwitterion (Z), ion básico (A) de enrofloxacina en función del
pH. .................................................................................................................................. 15
Figura 5. Perfil experimental de solubilidad / pH de la enrofloxacina. .......................... 15
Figura 6. Coeficientes de partición de la enrofloxacina en función del pH… ............... 16
Figura 7. Estructura de un transferosoma.. ..................................................................... 18
Figura 8. Estructura de la lecitina. .................................................................................. 19
Figura 9. Estructura del sodio desoxicolato ................................................................... 20
Figura 10. Principio de dispersión dinámica de la luz.. .................................................. 21
Figura 11. Modelo de la doble capa para representar el potencial zeta .......................... 22
Figura 12. Diseño de distribución de muestras en la placa de fluorescencia. ................ 36
Figura 13. Gráfica de relación entre la fluorescencia y el logaritmo de la concentración
para determinar el MIC, IC50 y NIC. ............................................................................. 37
Figura 14. Diagramas de Pareto de efectos estandarizados para tamaño (A), índice de
polidispersión (B) y potencial zeta (C). .......................................................................... 47
Figura 15. Diagrama de interacción entre la relación fosfolípido-surfactante y pH del
buffer para el potencial zeta. .......................................................................................... 48
Figura 16. Diagramas de Pareto de efectos estandarizados para tamaño (A), índice de
polidispersión (B) y potencial zeta (C). .......................................................................... 51
Figura 17. Perfil de liberación de transferosomas de enrofloxacina. ............................. 55
Figura 18. Comparación de la variación de tamaño (A), índice de polidispersión (B) y
potencial zeta (C) a través del tiempo de los diferentes lotes almacenados a 4°C y
temperatura ambiente ..................................................................................................... 58
Figura 19. Visualización de la suspensión transferosomal optimizada en el AFM........ 60
Figura 20. Comparación de los valores de MIC e IC50 de las muestras ensayadas. ..... 62
Figura 21. Gráficas de log C vs Fluorescencia de las muestras ensayadas. ................... 65
Figura 22. Gráficas de log C vs Fluorescencia de todas las muestras analizadas. ......... 66
xiv
Índice de tablas
Tabla 1. Generaciones de quinolonas ............................................................................. 12
Tabla 2. Componentes de los transferosomas ................................................................ 19
Tabla 3. Variables de formulación y proceso de los transferosomas. ............................ 31
Tabla 4. Cantidad de droga, suspensión de parásitos y medio Schneider utilizado para
preparar las dispersiones para el ensayo. ........................................................................ 35
Tabla 5. Factores y niveles para el diseño experimental. ............................................... 38
Tabla 6. Tratamientos generados en el software Minitab para la etapa de screening .... 38
Tabla 7. Factores y niveles para optimización ............................................................... 40
Tabla 8. Tratamientos de la etapa de optimización ........................................................ 40
Tabla 9. Variables de la actividad leishmanicida ........................................................... 41
Tabla 10. Matriz de operacionalización de variables screening ..................................... 41
Tabla 11. Matriz de operacionalización de variables optimización ............................... 42
Tabla 12. Matriz de operacionalización de variables actividad leishmanicida .............. 43
Tabla 13. Resultados del diseño experimental de 24 corridas........................................ 45
Tabla 14. Resultados obtenidos con respecto al tamaño de los transferosomas a los
diferentes porcentajes y tiempos de sonicación. ............................................................. 49
Tabla 15. Variables de optimización. ............................................................................. 49
Tabla 16. Resultados obtenidos en la etapa de optimización. ........................................ 50
Tabla 17. Condiciones seleccionadas para la elaboración de la suspensión
transferosomal final. ....................................................................................................... 52
Tabla 18. Resultados obtenidos en la determinación de eficiencia de atrapamiento. .... 52
Tabla 19. Cantidad de droga liberada durante el perfil de liberación. ........................... 54
Tabla 20. Cinética de liberación de la enrofloxacina de los transferosomas .................. 55
Tabla 21. Resultados de estabilidad física para lote de 5 mL. ....................................... 56
Tabla 22. Resultados de estabilidad física para lotes de 10 mL. .................................... 57
Tabla 23. Características de los transferosomas usados en los ensayos de actividad
leishmanicida. ................................................................................................................. 61
Tabla 24. Valores de MIC, NIC, IC50, R2 de las muestras ensayadas. .......................... 61
Tabla 25. Resultados obtenidos del ANOVA. ................................................................ 63
Tabla 26. Resultados del análisis del método de Tukey. ................................................ 64
xv
Lista de abreviaturas
DLS……. Dynamic Light Scatering
pa……… Principio activo
MIC……. Concentración mínima inhibitoria, por sus siglas del inglés:
Minimal Inhibitory concentration
NIC……. Concentración no inhibitoria, por sus siglas del inglés:
Non Inhibitory Concentration
IC50…… Concentración inhibitoria 50, por sus siglas del inglés:
Inhibitory Concentration 50
SBF……. Suero Bovino Fetal
PBS……. Buffer fosfato salino (Phosphate Buffered Saline)
xvi
Comparación de la actividad leishmanicida de los transferosomas de
enrofloxacina frente a la enrofloxacina en solución usando promastigotes de
Leishmania mexicana como modelo biológico
Autor: Gina Alexandra Loachamin Toapanta
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
Resumen
La leishmaniasis es una importante causa de morbilidad y mortalidad a nivel mundial.
El tratamiento de primera línea para leishmaniasis es antimoniato de meglumina el cual
en las últimas décadas ha generado inconvenientes como reacciones adversas y falta de
eficacia, por lo cual se han buscado alternativas; una de ellas es el uso de
fluoroquinolonas. Se seleccionó para esta investigación a la enrofloxacina, que en
estudios realizados en el mismo laboratorio demostró actividad frente a promastigotes
de Leishmania mexicana. Este fármaco se encuentra ionizado en un amplio rango de
pH, lo que podría disminuir su absorción a través de las membranas biológicas, una
limitante que podría ser solucionada utilizando un sistema liposomal como lo son los
transferosomas cargados con enrofloxacina. Los transferosomas fueron elaborados por
método de hidratación de la película delgada, se realizó una etapa de screening para
determinar las variables de formulación y de proceso con efecto en las variables
respuesta; con esta información se optimizó la formulación. Los transferosomas se
caracterizaron en términos de tamaño, índice de polidispersión, potencial zeta,
porcentaje de atrapamiento, liberación de principio activo y estabilidad física. La
técnica que se utilizó para determinar la actividad leishmanicida fue desarrollada por
Tufiño & Poveda y optimizada por Lissette Esteves en el Instituto de Investigación en
Salud Pública y Zoonosis de la Universidad Central del Ecuador, esta técnica relaciona
la fluorescencia con la cantidad de parásitos, aplicando la función modificada de
Gompertz para determinar la concentración mínima inhibitoria, concentración no
inhibitoria y la concentración inhibitoria 50 de las muestras ensayadas. Los
transferosomas de enrofloxacina presentaron mayor actividad leishmanicida que la
enrofloxacina en solución; a su vez, la enrofloxacina, tanto en solución como en
transferosomas, fue más efectiva que el tratamiento de primera línea.
PALABRAS CLAVE: TRANSFEROSOMAS, ENROFLOXACINA, Leishmania
mexicana, PROMASTIGOTES.
xvii
Comparison of Leishmanicide activity of enrofloxacin transferosomes versus
enrofloxacin in solution using Leishmania mexicana promastigotes as a biological
model
Author: Gina Alexandra Loachamin Toapanta
Tutor: Santamaría Aguirre Javier Rodrigo
Abstract
Leishmaniasis is an important cause of morbidity and mortality worldwide. The first
line treatment for leishmaniasis is meglumine antimonate which in the last decades has
generated inconveniences such as adverse reactions and lack of efficacy, whereby
alternatives have been sought, one of them is the use of fluoroquinolones. Enrofloxacin
was selected for this research, which in studies carried out in the same laboratory
showed activity against promastigotes of Leishmania mexicana. This drug is ionized in
a wide range of pH, which could decrease its absorption through the biological
membranes, a limitation that could be overcomed using a liposomal system such as the
transferosomes loaded with enrofloxacin. The transferosomes were elaborated by thin
film hydration method, a screening stage was carried out to determine the formulation
and process variables with effect on the response variables; with this information the
formulation was optimized. The transferosomes were characterized in terms of size,
polydispersity index, zeta potential, entrapment percentage, release of active substance
and physical stability. The technique that was used to determine the leishmanicidal
activity was developed by Tufiño & Poveda and optimized by Lissette Esteves in the
Public Health and Zoonoses Research Institute of the Central University of Ecuador,
this technique relates the fluorescence with the amount of parasites, applying the
modified function of Gompertz to determine the minimum inhibitory concentration,
non-inhibitory concentration and the inhibitory concentration of the samples tested. The
transferosomes of enrofloxacin showed greater leishmanicidal activity than
enrofloxacin in solution; in turn, enrofloxacin, both in solution and in transferosomes,
was more effective than first-line treatment.
KEYWORDS: TRANSFEROSOMES, ENROFLOXACIN, Leishmania mexicana,
PROMASTIGOTES.
1
Introducción
La leishmaniasis ha incrementado su incidencia en el Ecuador en los últimos 10 años
encontrándose en 23 de las 24 provincias del país (Dirección Nacional de Vigilancia
Epidemiológica, 2016). Los tratamientos convencionales de esta enfermedad presentan
inconvenientes como falta de efectividad, resistencia y efectos adversos, siendo
necesario buscar nuevas alternativas para combatirla. Entre estas alternativas
encontramos a las fluoroquinolonas, antibióticos de amplio espectro, de relativa baja
toxicidad para el huésped humano en comparación con los antimoniales pentavalentes.
Las fluoroquinolonas interfieren en la síntesis del ADN, conduciendo a muerte
celular bacteriana mediante la fragmentación cromosómica, estas penetran la pared
celular a través de porinas, inhibiendo directamente la replicación bacteriana al
interactuar con dos enzimas: ADN girasa y topoisomerasa IV (Leyva, 2008).
Estudios realizados en el Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis han
demostrado que las fluoroquinolonas: moxifloxacina y enrofloxacina tienen un efecto
inhibitorio en el crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana (Tufiño &
Poveda, 2017), siendo enrofloxacina la que presenta mayor actividad (Esteves L.
comunicación personal).
La enrofloxacina se ioniza en un amplio rango de pH, generando variaciones en su
actividad frente a los patógenos celulares, inconveniente que podría ser solucionado
mediante la incorporación de esta droga en liposomas.
Es por lo que en este estudio se planteó incorporar a la enrofloxacina en
transferosomas, un tipo especial de liposoma, para comparar su efectividad
leishmanicida con la enrofloxacina en solución frente a promastigotes de Leishmania
mexicana.
En el primer capítulo se presenta el problema, el cual contiene los siguientes
elementos: el planteamiento y formulación del problema, las preguntas directrices,
objetivos tanto generales como específicos, justificación e importancia de la
investigación.
En el segundo capítulo se aborda el marco teórico, donde se menciona los
antecedentes bibliográficos del tema, el fundamento teórico, fundamentación legal de la
investigación, además de las hipótesis y la conceptualización de las variables.
El tercer capítulo trata de la metodología, que consta del diseño de la investigación,
los materiales y métodos a utilizarse, el diseño experimental, la operacionalización de
las variables, el instrumento de recolección de datos, las técnicas de procesamiento y
análisis de datos.
2
En el capítulo 4 se presenta el análisis y discusión de resultados, en el cual se
analizan cada uno de los datos obtenidos en la parte experimental con su respectiva
justificación e interpretación.
En el capítulo 5 se encuentran las conclusiones y recomendaciones del trabajo, en el
cual se muestran si las hipótesis planteadas se cumplen o se rechazan, además de
proporcionar un resumen de los principales resultados y su aporte.
3
Capítulo I
El Problema
Planteamiento del problema.
La leishmaniasis es causada por un protozoo parásito del género Leishmania, que
presenta más de 20 especies diferentes y se transmite a los humanos por la picadura de
flebótomos hembra infectados. La enfermedad se presenta en tres formas principales:
leishmaniasis visceral, leishmaniasis cutánea y leishmaniasis mucocutánea (OMS,
Organización Mundial de la Salud, 2017).
En el Ecuador se han reportado casos de leishmaniasis cutánea y mucocutanea,
siendo la primera la más frecuente ya que ha incrementado su incidencia en los últimos
10 años encontrándose en 23 de las 24 provincias del país (Dirección Nacional de
Vigilancia Epidemiológica, 2016).
Los tratamientos convencionales de leishmaniasis presentan inconvenientes como
falta de efectividad, resistencia y efectos adversos, siendo necesario buscar nuevas
alternativas con las que se pueda combatir a esta enfermedad. Una opción que aquí se
plantea son las fluoroquinolonas, antibióticos de amplio espectro, de relativa baja
toxicidad para el huésped humano en comparación con los antimoniales pentavalentes,
frente a las cuales diferentes cepas de Leishmania presentan susceptibilidad, como es el
caso de Leishmania panamensis que es sensible a ciprofloxacina y enoxacina (Cortazar
T. M., 2007).
Investigaciones en el Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis han
evidenciado la sensibilidad de Leishmania mexicana frente a soluciones de
moxifloxacina y enrofloxacina (Tufiño & Poveda, 2017), lo que las convierte en
candidatos potenciales para estudios más profundos.
Estudios recientes realizados en este mismo instituto, han demostrado la efectividad
leishmanicida de la enrofloxacina sobre otras fluoroquinolonas ensayadas, frente a
Leishmania mexicana (Esteves. E comunicación personal), por lo cual se la seleccionó
para este estudio.
La enrofloxacina en solución se encuentra ionizada en un amplio rango de pH,
generando una compleja composición de especies (Titos, 2010), lo anterior podría
determinar una absorción incompleta, errática o poco reproducible a través de
membranas biológicas, limitación que podría superarse mediante el uso de sistemas
4
liposomales. Los cuales, en comparación con el fármaco no encapsulado, permiten
mejores resultados en términos de efectividad y seguridad del principio activo,
disminuyendo la dosis y la toxicidad, que es el objetivo de este trabajo (Date, 2007).
Los transferosomas, sistemas liposomales elásticos, fueron seleccionados en este
estudio. Estos poseen un núcleo acuoso rodeado por una bicapa lipídica compleja
ultradeformable, propiedad que les permite atravesar eficazmente diversas barreras de
transporte, actuando como portadores de fármaco (Sharma, 2012).
En este trabajo se planteó determinar, si la actividad leishmanicida de la
enrofloxacina incorporada dentro de transferosomas es mayor que la de la
enrofloxacina en solución, considerando que esta molécula se encuentra ionizada en un
amplio rango de pH, lo que podría suponer una limitada y poco reproducible absorción
a través de las membranas biológicas, limitación que puede minimizarse con sistemas
liposomales elásticos.
Formulación del problema.
¿Los transferosomas de enrofloxacina tienen mayor actividad leishmanicida que la
enrofloxacina en solución, frente a promastigotes de Leishmania mexicana?
Preguntas directrices.
¿Qué método se utilizará para la obtención de transferosomas?
¿Cómo se va a determinar que los transferosomas utilizados son los adecuados?
¿Cómo se va a comparar la actividad leishmanicida de los transferosomas de
enrofloxacina frente a enrofloxacina en solución?
Objetivos
Objetivo general.
Comparar la actividad leishmanicida de los transferosomas de enrofloxacina frente a la
enrofloxacina en solución usando promastigotes de Leishmania mexicana como modelo
biológico.
Objetivos específicos.
- Desarrollar transferosomas de enrofloxacina por el método de hidratación de la
película delgada.
- Caracterizar los transferosomas de enrofloxacina en términos de tamaño, índice de
polidispersión, potencial zeta, porcentaje de atrapamiento, liberación de principio
activo y estabilidad física.
- Comparar MIC, NIC e IC50 de transferosomas de enrofloxacina, enrofloxacina en
solución, transferosomas sin carga y antimoniato de meglumina en promastigotes de
5
Leishmania mexicana.
Justificación e importancia
La leishmaniasis ha sido declarada en América como un “problema de salud
pública” debido a su incidencia, morbilidad, amplia distribución geográfica, variedad
de especies del parásito y formas clínicas, además de falta de esquemas terapéuticos y
de medidas de prevención adecuados (OMS, Leishmaniasis en las Américas, 2013). En
Ecuador la manifestación cutánea es la que se encuentra ampliamente distribuida,
causando graves lesiones ulcerosas en la piel del paciente, este tipo de leishmaniasis a
su vez puede dividirse en: leishmaniasis recidiva cutis donde se presenta nódulos dentro
o alrededor de la cicatriz luego de un largo periodo de tiempo y leishmaniasis cutánea
difusa que se manifiesta mediante la presencia de nódulos no ulcerativos en todo el
cuerpo que se asemejan a las lesiones de la piel causadas en la lepra (Vela, 2014).
De acuerdo a los datos de la Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica,
publicados en la gaceta No. 53, hasta el miércoles 6 de enero del 2016, se reportaron
1401 casos de leishmaniasis cutánea siendo la provincia de Pichincha la que presenta
mayor número de casos en el país con 332, seguida de la provincia Santo Domingo de
los Tsáchilas con 214 casos (Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica, 2016).
Este número elevado de casos puede deberse a que, en los últimos años, la
urbanización no planificada y los problemas medioambientales, entre ellos el cambio
climático, están influyendo considerablemente en la transmisión de esta enfermedad, la
misma que es sensible a las condiciones climáticas, y los cambios en las
precipitaciones, la temperatura y humedad (Conterón, 2015).
Además, pequeñas fluctuaciones en la temperatura pueden tener un acusado efecto
en el ciclo de desarrollo de los promastigotes de Leishmania en los flebótomos, y
permitir que el parásito se transmita en zonas donde la enfermedad no era previamente
endémica lo que podría explicar su presencia en la mayoría de las provincias del
Ecuador (Conterón, 2015).
En el país el cambio climático ha producido un incremento de 0,8 grados centígrados
en la temperatura promedio anual en el periodo comprendido entre 1960-2006, con una
reducción de la cubierta de los glaciares de un 27,8 % en los últimos 30 años, (Diario
La Hora, 2017). Siendo esto un factor potencial para la proliferación de los vectores
que trasmiten esta enfermedad; un estudio realizado acerca del cambio climático, salud
y enfermedades tropicales en Quito determinó que las zonas del oeste del Distrito
Metropolitano son las de mayor riesgo climático al 2050 en relación a las enfermedades
vectoriales, por lo que presumiblemente aumentaría el número de casos de
leishmaniasis cutánea a futuro (Secretaría del Ambiente, 2015).
6
El tratamiento de primera línea de la leishmaniasis usa antimoniales pentavalentes,
luego está la pentamidina, miltefosina, anfotericina B y paromomicina. Estos
tratamientos se han desarrollado hace muchos años y tienen serias limitaciones como
alta toxicidad y reacciones adversas severas, que para los antimoniales pentavalentes
incluyen cardiotoxicidad, pancreatitis y nefrotoxicidad. La pentamidina también es
toxica y presenta baja eficacia. Miltefosina tiene la ventaja de la administración oral,
pero tiene un efecto teratogénico y baja eficacia. La anfotericina B puede generar
miocarditis y nefrotoxicidad. Su formulación liposomal es menos tóxica, pero el
incremento de costo asociado la hace inaccesible. Finalmente, la paromomicina se
asocia con una alta toxicidad. Además, estos medicamentos son efectivos solo contra
algunas especies de Leishmania (Poveda, 2016).
Por todo esto es necesario estudiar nuevas alternativas para el desarrollo de
tratamientos tópicos para leishmaniasis cutánea como por ejemplo el desarrollo de
medios de administración transdérmica de fármacos como son los transferosomas que
se proponen en esta investigación. Estas son vesículas blandas y maleables adaptadas
para mejorar la entrega de agentes activos, que debido a su ultradeformabilidad
alcanzan las capas internas de la piel por debajo del estrato córneo.
7
Capítulo II
Marco teórico
Antecedentes de la investigación
Las fluoroquinolonas (agentes antimicrobianos que actúan sobre ADN girasa y / o
topoisomerasas), han demostrado ser potenciales agentes quimioterapéuticos para el
tratamiento antitumoral y de parásitos patógenos como es el caso de Leishmania spp.,
cuyas topoisomerasas han mostrado ser un buen objetivo para el efecto curativo de
fármacos leishmanicidas (Vouldoukis, 2006) .
Estudios realizados por Romero I. y colaboradores demuestran que las
fluoroquinolonas de segunda generación (enoxacina y ciprofloxacina) ejercen una
acción selectiva contra amastigotes intracelulares de Leishmania panamensis (Romero
I. , 2005). En 2006 Vouldoukis y colaboradores demostraron la efectividad
leishmanicida de la marbofloxacina, una fluoroquinolona de tercera generación frente a
promastigotes y amastigotes de Leishmania infantum en macrófagos caninos
(Vouldoukis, 2006). Otro estudio demostró que las quinolonas de primera generación
(no fluoradas) ácido nalidíxico y la cinoxacina son inhibidores ineficaces tanto de los
macrófagos como de la topoisomerasa II (TOPII) de Leishmania, mostrando una
selectividad antiparasitaria despreciable, por el contrario, una gama de derivados de
segunda generación ciprofloxacina y enoxacina, mostraron selectividades significativas
para la topoisomerasa II del parásito, ya que se ha demostrado que las fluoroquinolonas
se dirigen específicamente a TOPs bacterianos de tipo 2 (TOPII '' girasa '' y TOP IV),
induciendo la formación de complejos escindibles, fragmentación de ADN y muerte
celular (Cortazar T. , 2007).
Ensayos realizados in vivo también han demostrado la efectividad de las
fluoroquinolonas como es el caso de la enrofloxacina usada en el tratamiento de
leishmaniasis canina, la cual produjo mejoría clínica de las lesiones ocasionadas por
Leishmania infantum (Bianciardi, 2004). En humanos, la ciprofloxacina intralesional
fue tan eficaz como el antimoniato de meglumina intralesional para el tratamiento de la
leishmaniasis cutánea (Rehman, 2011).
En el año 2017, Karen Tufiño determinó la actividad leishmanicida de las
fluoroquinolonas: ciprofloxacina, enrofloxacina, moxifloxacina en promastigotes de
Leishmania mexicana y Leishmania amazonensis, encontrando que la moxifloxacina y
la enrofloxacina tienen actividad leishmanicida frente a promastigotes de Leishmania
mexicana presentando una concentración inhibitoria 50 de 141,95 µg/mL y 835,96
µg/mL respectivamente (Tufiño & Poveda, 2017). Estudios recientes realizados para
determinar la actividad leishmanicida de las fluoroquinolonas enrofloxacina,
levofloxacina, ciprofloxacina, moxifloxacina y meglumina antimoniato frente a
8
promastigotes de Leishmania mexicana han demostrado que estas drogas inhiben el
crecimiento de promastigotes, obteniéndose un valor de MIC para la enrofloxacina de
7216 µM y 470235 µM para meglumina antimoniato, concluyendo que la enrofloxacina
es la droga más efectiva ya que se necesita una menor concentración de la misma en
comparación con el fármaco de primera línea (Esteves. L comunicación personal).
La enrofloxacina ha demostrado no concentrarse eficazmente en los patógenos
celulares (Sezer, 2007), dificultad que podría deberse al pH al que se encuentre pues
puede existir en cuatro formas posibles: como un catión ácido, una especie neutra no
ionizada, un zwitterión intermedio y un ion básico (Lizondo, 1997), por lo que la
encapsulación de esta quinolona en liposomas o transferosomas mejoraría su eficacia
(Sezer, 2007).
Dentro de los sistemas de entrega de fármacos, los liposomas han sido objeto de
estudio en el tratamiento de la leishmaniasis debido al hecho de que el parásito coloniza
los macrófagos que son responsables del aclaramiento de los liposomas in vivo, estas
vesículas además reducen la toxicidad de los fármacos leishmanicidas (Date, 2007).
Estudios realizados en leishmaniasis con estas vesículas, han demostrado que los
antimoniales encapsulados en liposomas son 700 veces más activos que los fármacos
no encapsulados, lo que confirma el potencial de los sistemas liposómicos (Date, 2007).
Los agentes antimoniales liposómicos además producen desintegración dramática de
Leishmania en células de Kupfer de hámster, efecto posiblemente producido por fusión
fagolisosómica (Alving.C, 1984).En leishmaniasis cutánea producida por Leishmania
tropica los antimoniales encapsulados en liposomas presentan eficacia contra esta
enfermedad (New.R, 1980). Los transferosomas, un tipo especial de liposoma que se
caracteriza por su membrana ultradeformable han mostrado conservar la actividad
leishmanicida de la miltefosina (Hernández, 2014).
En los estudios mencionados anteriormente se ha evidenciado la actividad
leishmanicida de las fluoroquinolonas, como es el caso de la enrofloxacina frente a
Leishmania mexicana; sin embargo, al ser esta una molécula que se ioniza en un amplio
rango de pH, su absorción a través de las membranas biológicas podría no ser
reproducible, lo que constituye una limitante en su uso terapéutico. Esta limitante
podría ser solucionada mediante un sistema liposomal, como los transferosomas, que
han demostrado conservar la actividad leishmanicida de las drogas y tener buena
permeabilidad transdérmica, convirtiendolos en potenciales sistemas para el tratamiento
de leishmaniasis cutánea, enfermedad de creciente incidencia en el Ecuador.
Fundamento teórico.
Leishmania
Es un protozoario del orden Kinetoplastea, este género tiene más de 20 especies y
9
dos subgéneros Leishmania y Viannia que tienen diferente localización de desarrollo en
el intestino del huésped transmisor (Romero R. , 2007).
El género Leishmania tiene dos formas de desarrollo el promastigote y el
amastigote. El amastigote mide de 2,5 a 3,5 micras invade las células del huésped
vertebrado, es ovalado o esférico, inmóvil y posee un gran núcleo localizado en un
extremo, aunque en ocasiones también se encuentra en la parte central; el promastigote
que se localiza y desarrolla en el intestino del huésped invertebrado, es alargado y mide
entre 18 y 20 micras, tiene su núcleo en un extremo y en el contrario se localiza el
blefaroplasto de donde nace un flagelo corto, antero nuclear (Romero R. , 2007).
Ciclo de vida de Leishmania spp.
Los promastigotes metacíclicos, extracelulares, una vez en la probóscide del
mosquito hembra, son introducidos en la piel de un huésped vertebrado durante la
ingesta de sangre. Los parásitos son fagocitados en piel por macrófagos y células de
Langerhans activando el complemento. Aunque muchos promastigotes son destruidos
por los polimorfonucleares, algunos se transforman en amastigotes en las células del
sistema fagocítico mononuclear; en los fagolisosomas pierden el flagelo y se
transforman en amastigotes, multiplicándose por división binaria. La replicación ocurre
en cantidades que oscilan desde decenas hasta cientos. Las células infectadas se rompen
finalmente y los amastigotes se diseminan hacia diferentes tejidos. Cuando mosquitos
libres de infección se alimentan de individuos infectados, ingieren las células con
amastigotes los cuales sufren cambios bioquímicos y morfológicos en el intestino
medio del insecto, se multiplican y finalmente migran a la probóscide como
promastigotes metacíclicos, altamente infectantes, todo este proceso puede observarse
esquemáticamente en la figura 1 (Berrueta, 2017).
Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp. (Berrueta, 2017)
10
Leishmaniasis
Es una parasitosis producida por protozoos del género Leishmania, de localización
intracelular, caracterizada por lesiones cutáneas, mucosas o viscerales y transmitidas
por la picadura de insectos dípteros de la familia Phlebotomidae, géneros Phlebotomus
y Lutzomyia. Existen reservorios domésticos y silvestres, por lo que puede considerarla
una zoonosis (Conterón, 2015).
Manifestaciones clínicas
Leishmaniasis visceral
Esta manifestación clínica es causada en América por las especies Leishmania
donovani chagasi y Leishmania donovani y en el viejo mundo por Leishmania
donovani infantum.
Los signos y síntomas que caracterizan a esta enfermedad son fiebre, palidez,
anorexia, pérdida de peso, tos, vómito, diarrea, epistaxis; esplenomegalia masiva
acompañada de hepatomegalia, linfadenopatías a veces generalizadas, sangrado
gingival, equimosis y petequias en extremidades, agrandamiento del bazo que puede
aparecer con consistencia blanda en casos agudos. En etapas posteriores del
padecimiento se han descrito taquicardia, ictericia, distensión abdominal, ascitis o
edema pedal, sangrados y equimosis más importantes, alteraciones en piel y anexos,
como hiperpigmentación, lesiones verrucosas no ulceradas y alopecia (Berrueta, 2017).
Leishmaniasis mucocutánea
La forma mucocutánea se asocia con mayor frecuencia a L. braziliensis y L.
panamensis, aunque otras especies pueden estar involucradas como L. infantum.
El sitio inicial y más frecuentemente afectado es la mucosa del tabique nasal, que en
casos graves puede perforarse, el proceso puede extenderse al paladar, faringe y la
úvula, cuando afecta a la nariz se puede presentar obstrucción, sangrado, secreción
nasal y la aparición de costras y heridas. El compromiso de la laringe y la faringe puede
ocasionar dolor, ronquera, disfonía y disfagia (OMS, Organización Mundial de la
Salud, 2017).
Leishmaniasis cutánea
Se consideran dos cuadros clínicos cutáneos: leishmaniasis cutánea localizada
causada por múltiples especies de los subgéneros Leishmania y Viannia: L. mexicana,
L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, y L. peruviana, y leishmaniasis cutánea
diseminada causada por L. mexicana y L. amazonensis (Berrueta, 2017).
Leishmaniasis cutánea localizada
Generalmente se encuentra circunscrita al sitio de inoculación gracias a una
respuesta inmune celular protectora, el período de incubación en esta forma clínica
varía de una a doce semanas, aunque puede ser más prolongado, la lesión inicial es una
11
pápula que evoluciona a un nódulo eritematoso, pruriginoso e indoloro, acompañada
hasta en un 30% de los casos de adenopatía regional, con un diámetro de 1 -10 cm y
que se ulcera en un lapso de 1 - 3 meses. La úlcera característica es redondeada, de
borde elevado y bien definido, indurado, cubierta por una costra amarillenta; cuando
ésta se desprende revela un fondo de tejido de granulación limpio, en ocasiones no hay
ulceración y se aprecian en su lugar lesiones vegetantes o verrucosas (Berrueta, 2017).
Leishmaniasis cutánea diseminada
Se caracteriza por una pobre respuesta inmune celular, que permite la diseminación
no controlada en piel, se presentan lesiones nodulares con gran número de parásitos,
diseminadas prácticamente en todo el tegumento, con excepción del cuero cabelludo,
regiones inguinal y axilar, genitales externos, plantas y palma, la enfermedad es de
curso crónico y presenta resistencias a los tratamientos (Berrueta, 2017).
Actividad leishmanicida de fluoroquinolonas como posible tratamiento
alternativo
Las fluoroquinolonas son análogos sintéticos del ácido nalidíxico, poseen un átomo
de flúor unido al anillo de quinolona en la posición C-6, que mejora la actividad contra
bacterias gramnegativas y grampositivas, y sus propiedades farmacocinéticas como
absorción oral y distribución tisular (Leyva, 2008).
Estas interfieren en la síntesis del ADN, conduciendo a muerte celular bacteriana
mediante la fragmentación cromosómica, penetran la pared celular a través de porinas,
inhibiendo directamente la replicación bacteriana al interactuar con dos enzimas: ADN
girasa (proteína tetramérica compuesta por dos pares de subunidades A y B, codificadas
por los genes GyrA y GyrB), que es el blanco en bacterias gramnegativas y,
topoisomerasa IV (proteína tetramérica compuesta por dos pares de subunidades A y B,
codificados por los genes ParC y ParE) blanco en bacterias grampositivas (Álvarez,
2015), la ADN girasa introduce superenrollamientos negativos en el ADN y libera la
tensión torsional acumulada por los procesos de replicación y transcripción; mientras
que la topoisomerasa IV presenta una potente actividad decatenante (Leyva, 2008).
Existen 4 generaciones de quinolonas, que se han clasificado de acuerdo a su época
de aparición y espectro de actividad, sus representantes se pueden observar en la tabla
1.
12
Tabla 1. Generaciones de quinolonas
Fluoroquinolonas
1ra. Generación 2da. Generación 3ra. Generación 4ta. Generación
ácido nalidíxico
ácido oxolínico
ácido piromídico
ácido pipemídico
rosoxacina
cinoxacina
flumequina
ciprofloxacina
enoxacina
fleroxacina
lomefloxacina
nadifloxacina
norfloxacina
ofloxacina
pefloxacina
rufloxacina
levofloxacina
esparfloxacina
tosufloxacina
temafloxacina
grepafloxacina
enrofloxacina
balofloxacina
clinafloxacina
gatifloxacina
gemifloxacina
moxifloxacina
pazufloxacina
arenfloxacina
sitafloxacina
rovafloxacina
trovafloxacina
(Alvarez, 2015)
Estudios acerca de la actividad marcada de las fluoroquinolonas en Leishmania se
han venido realizado desde décadas atrás, entre estos podemos mencionar el realizado
por Raether y colabores donde demostraron la efectividad de las fluoroquinolonas
(norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina, pefloxacina y enoxacina) en amastigotes de
Leishmania donovani, donde se produjo una reducción significativa de los amastigotes
en el tejido hepático de hamsters sirios (Raether.W, 1989), en otro estudio pefloxacina,
fluoroquinolona de segunda generación, disminuyó significativamente el tamaño de las
lesiones primarias en ratones infectados con Leishmania major (Zucca.M, 1996),
ciprofloxacina y enoxacina fluoroquinolonas de segunda generación, también han
presentado una extraordinaria selectividad parasitaria frente a Leishmania panamensis,
en un estudio acerca de la actividad catalítica de la topoisomerasa II del ADN nuclear
(TOPII) de promastigotes de Leishmania panamensis, se determinó que las actividades
leishmanicidas de ciertas fluoroquinolonas pueden estar mediadas en parte por
inhibición de la TOP II (Cortazar T. , 2007). También se ha evaluado la actividad
leishmanicida de moxifloxacina (fluoroquinolona de cuarta generación), linezolina y
caspofungina frente a promastigotes de Leishmania major utilizando el método de
microdilución, obteniéndose como resultado que la moxifloxacina era eficaz en
concentraciones más bajas que los otros agentes estudiados (Limoncu, 2013), actividad
leishmanicida que también se vio reflejada cuando se determinó la concentración
mínima inhibitoria de las fluoroquinolonas por fluorescencia sobre promastigotes de
Leishmania spp demostrando que la enrofloxacina y la moxifloxacina presentan
actividad leishmanicida en promastigotes de Leishmania mexicana (Tufiño & Poveda,
2017).
Enrofloxacina
La enrofloxacina es una fluoroquinolona aprobada exclusivamente para uso en
13
medicina veterinaria; no se han reportado datos sobre los efectos de esta droga en
humanos (Otero.J, 2001); (European Medicines Agency, 2018).
Se derivada del ácido nalidixico y como todas las quinolonas posee un núcleo básico
denominado dihidroquinolina o anillo 4 quinolónico (Otero.J, 2001) (Figura 2).
Figura 2. Estructura química de la enrofloxacina. Autora: Loachamin G.
En posición 6 presenta un átomo de flúor que mejora la unión a la ADN-girasa
bacteriana y hace que su penetración celular sea hasta 70 veces superior a las
quinolonas que no poseen este flúor, aumentando su eficacia frente a gramnegativos y
ampliando su espectro de actividad contra grampositivos (Titos, 2010).
El anillo 4-metilopiperazin-1-il, en posición 7, le confiere mayor potencia, al
contrario de las quinolonas que tienen en esta posición moléculas lineales. Por otra
parte, la presencia de un grupo etilo en la posición 4, aumenta la absorción digestiva y
la disponibilidad, además de hacer que en el plasma se alcance el doble de
concentración de enrofloxacina que de ciprofloxacina, quinolona con estructura
parecida pero sin este grupo etilo (Titos, 2010).
Propiedades físicas y químicas
La enrofloxacina tiene un bajo peso molecular de 359,39 g/mol favoreciéndose su
penetración a nivel de los tejidos. Sus constantes de ionización son 5,94 ±0,09 para el
grupo del ácido carboxílico en posición 3 y 8,70 ± 0,44 para el grupo básico
piperazínico en posición 7 (Titos, 2010).
En función del pH la enrofloxacina puede existir en cuatro posibles formas (Figura
3).
N
O
F COOH
N
N
H5C2
14
N
F
O O
OH
N
NCH3
N
F
O O
O-
N
NCH3
N
F
O O
OH
N
N
H
+CH3
N
F
O O
O-
N
N
H
+CH3
KNA
KZA
KCZ
KCN
pH ÁCIDO
Forma Catiónica
pH BÁSICO
Forma Aniónica
pH NEUTRO
Forma no ionizada
pH NEUTRO
Forma Zwitterion
Figura 3. Formas de enrofloxacina en función del pH. Autora: Loachamin G.
En la figura 4 se puede observar como varían las fracciones de las cuatro posibles
formas en función del pH, en solución las especies catiónicas y aniónicas se acercan a
la concentración total de enrofloxacina a pH bajos y altos respectivamente y las
especies neutras alcanzan un máximo en el pH isoeléctrico, la forma neutra es
principalmente el zwitterion, ya que la constante de disociación del ácido carboxílico es
mayor que para la amina. Las especies neutras no cargadas están en una proporción
extremadamente baja (Lizondo, 1997).
15
Figura 4. Distribución de la fracción de las cuatro especies: el catión ácido (C),
especie neutra no ionizada (N), el zwitterion (Z), ion básico (A) de enrofloxacina en
función del pH. (Titos, 2010).
La solubilidad acuosa de la enrofloxacina, en parte explicada por su compleja
ionización, se puede observar en la figura 5.
Figura 5. Perfil experimental de solubilidad / pH de la enrofloxacina. (Lizondo,
1997).
La máxima solubilidad acuosa se alcanza a pH 5,02, en donde predominarían la
forma catiónica y la de zwitterion. La enrofloxacina presenta una solubilidad acuosa
baja en la proximidad del punto isoeléctrico, donde predomina la forma zwitterion, pero
16
una elevada solubilidad lipídica, lo cual facilita su difusión dentro de tejidos biológicos,
incluyendo células bacterianas (Lizondo, 1997).
El coeficiente de partición octanol/agua para la enrofloxacina se puede apreciar en la
figura 6, esta curva tiene una forma parabólica con el máximo al pH correspondiente al
predominio de las especies zwitteriónicas.
Figura 6. Coeficientes de partición de la enrofloxacina en función del pH (Titos,
2010).
Además, la cantidad de enrofloxacina transferida desde la fase acuosa a la orgánica
es máxima a pH 7, tanto por debajo como por encima de este pH, los coeficientes de
partición disminuyen, indicando que la polaridad de este antibiótico es alta.
Espectro antibacteriano
La enrofloxacina tiene una buena actividad frente a bacterias grampositivas y
gramnegativas, incluyendo algunos anaerobios patógenos y Mycoplasma spp. Además
es mycoplasmicida a bajas concentraciones y eficaz contra organismos que son
resistentes a los betalactámicos, aminoglucósidos, tetraciclinas, antagonistas del ácido
fólico y macrólidos (Otero. J, 2001).
Propiedades farmacocinéticas
Absorción y biodisponibilidad
La enrofloxacina es fácil y rápidamente absorbida luego de la administración
parenteral en terneros, cerdos, perros, gatos, pollos y pavos, alcanzándose
concentraciones máximas dentro de las 0,5 a 2 horas, además los niveles de la droga
luego de su administración oral a pollos y cerdos son equivalentes a aquellos
encontrados luego de la aplicación parenteral a las mismas dosis, lo cual sugiere buena
absorción digestiva (Otero.J, 2001).
La absorción de la enrofloxacina en bovinos es dependiente de la vía de
17
administración, siendo pobre (aproximadamente del 10 %) cuando se administra por vía
oral y extensa cuando se administra de forma subcutánea, con una biodisponibilidad
mayor al 90 % (Titos, 2010).
En cabras luego de la administración intravenosa la enrofloxacina presentó un
tiempo de vida media de 0.25 h y casi completa absorción (Muammer Elmas, 2001).
Los tiempos de aparición del pico de concentración plasmática (Tmax) de
enrofloxacina administrado en forma oral a caballos, pavos, pollos y terneros son de
0,5; 0,9; 1,4; 2,5 y 5,4 horas respectivamente (Vancutsem.P, 1990). En perros el pico de
concentración máximo de enrofloxacina por vía oral se sitúa entre 1 y 3,6 h con valores
de biodisponibilidad del 100 % (Garcia.H, 1996).
Distribución
En ganado bovino, ganado porcino, perros, gatos, pollos y pavos la enrofloxacina se
dispersa en todos los órganos y tejidos, siguiendo una pauta de distribución muy similar
en todas las especies estudiadas con elevadas concentraciones, además en bovinos se ha
demostrado que este fármaco se distribuye rápidamente y ampliamente en todo el
organismo, con una excelente disponibilidad sistémica y una tasa de eliminación
relativamente baja (Titos, 2010).
En ovinos, la enrofloxacina administrada en forma intramuscular es ampliamente
distribuida en el organismo, con una biodisponibilidad mayor al 85 %, y un alto
volumen de distribución (Otero.J, 2001).
Metabolismo y excreción
La enrofloxacina se metaboliza parcialmente a ciprofloxacina, la cual es responsable
de una considerable parte de la actividad antimicrobiana, mediante N-desalquilacion. El
metabolismo en el ganado se lleva a cabo en el hígado y posiblemente en otros sitios
como la ubre, o los macrófagos. El efecto del primer paso hepático es bajo,
aproximadamente del 7%, las concentraciones plasmáticas del metabolito con respecto
al fármaco madre (AUC concentración -tiempo) son de 35-55% en ovejas, 29% en
vacas y 25% en terneros (Titos, 2010).
Liposomas
Son vesículas microscópicas que consisten en una o más esferas concéntricas de
bicapas lipídicas separadas por compartimentos acuosos o de buffer, estas estructuras
esféricas pueden tener diámetros comprendidos entre 80 nm y 100 µm y son capaces de
encapsular fármacos tanto polares como no polares (Date, 2007).
Las formulaciones liposomales se pueden clasificar en dos categorías: Vesículas
rígidas entre las que encontramos a los liposomas y niosomas (liposomas basados en
tensioactivo no iónico) y vesículas elásticas como transferosomas y etosomas (vesículas
ultradeformables con alto contenido de alcohol) (Rajan, 2011).
Las vesículas rígidas generalmente no son adecuadas para el suministro
18
transdérmico, ya que quedan atrapadas en las capas superiores del estrato córneo,
proporcionando un suministro esencialmente epidérmico a diferencia de las vesículas
elásticas que minimizan la permeabilidad transdérmica defectuosa de un sin número de
fármacos de alto y bajo peso molecular (Glujoy, 2014).
Transferosomas
Son un tipo especial de liposomas, que están compuestos por fosfatidilcolina y un
activador de borde (figura 7). Estas vesículas blandas y maleables están adaptadas para
mejorar la entrega de agentes activos ya que tienen alta eficiencia de atrapamiento. En
el caso de fármacos lipofílicos la eficiencia alcanza cerca del 90%. Además, estos
sistemas protegen al fármaco encapsulado de la degradación metabólica (Rajan, 2011).
La formulación en transferosomas permite administrar el fármaco reproduciblemente en
o a través de la piel, con alta eficiencia, siendo varios órdenes de magnitudes más
elásticas que los liposomas estándar y por tanto adecuadas para la penetración de la
piel, (Sharma, 2012) a través de las regiones lamelares lipídicas del estrato córneo
como resultado de la hidratación o fuerza osmótica (Pandey, 2016).
Molécula de lípido
Molécula de surfactante
Principio activo
Figura 7. Estructura de un transferosoma. Autora: Loachamin G.
Composición de los transferosomas
Los transferosomas son un agregado lipídico mixto, autoadaptable y optimizado;
están compuestos por fosfolípidos como la fosfatidilcolina, que se auto ensambla en la
bicapa lipídica en solución acuosa y se cierra para formar la vesícula, un activador de
borde que consiste normalmente en un tensioactivo de cadena sencilla que aumenta la
flexibilidad y permeabilidad de la membrana, esta flexibilidad puede alterarse
mezclando agentes tensioactivos adecuados en las relaciones apropiadas. Tanto el
fosfolípido como el activador de borde son solubilizados en etanol, metanol o en la
mezcla de estos dos solventes. Otro componente es el tampón de fosfato salino (pH 6,5-
7) que se utiliza como medio hidratante (Solanki, 2016). La tabla 2 resume los
principales componentes de los transferosomas.
19
Tabla 2. Componentes de los transferosomas
Componente Función
Fosfolípido Lecitina de soya Componente formador de la
vesícula
Surfactante Sodio desoxicolato Proveedor de la flexibilidad
Solvente cloroformo-metanol 1:1 (v/v) Solubilización de fosfolípidos
y surfactante
Tampón Tampón de fosfato salino (pH 7) Medio hidratante
Realizado por Loachamin G
Lecitina de soya
Llamada también fosfatidilcolina o polienilfosfatidilcolina, puede extraerse de los
granos de soya mediante extracción mecánica o química y el uso del hexano. Tiene baja
solubilidad en agua, pero es un excelente emulsionante al hidratarse, de ahí que esta sea
su característica química más importante, en solución acuosa sus fosfolípidos pueden
formar liposomas, bicapas lipídicas, micelas o estructuras lamelares, según la
hidratación y la temperatura (Cala, 2017).
La lecitina es una mezcla compleja de fosfolípidos y triglicéridos. Los fosfolípidos
más comunes en esta mezcla son la fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, aunque
presenta otros fosfolípidos de inositol, serina y ácido fosfatídico que también son
importantes (Cala, 2017).
CH3O
CH2 O C (CH2)14
CH
CH2
O
CH3
C (CH2)14 CH3
O P O CH2
O-
CH2 N+
CH3
CH3
O
O
Ácidos grasos
no polares
Polar
Colina
Ácidograso
Figura 8. Estructura de la lecitina. Autora: Loachamin G
Sodio desoxicolato
El sodio desoxicolato es una sal biliar y un detergente iónico que posee un peso
molecular de 414,55 g/mol. Las sales biliares funcionan junto con
lípidos/grasas/colesterol y forman micelas mixtas en el intestino. Estas micelas ayudan
20
en la digestión y absorción de las grasas a través de la pared intestinal
(Mukhopadhyay.S, 2004) .
Este surfactante aniónico en la formulación de transferosomas actúa como "activador
de borde", confiriéndole ultradeformabilidad, lo que les permite pasar a través de los
canales en el estrato córneo (Rajan, 2011).
Figura 9. Estructura del sodio desoxicolato (Estados Unidos Patente nº
PCT/US2011/048806, 2011).
Técnica de hidratación de película fina para la obtención de los transferosomas
Consta de tres pasos, primeramente se prepara una mezcla de fosfolípidos,
tensioactivo y principio activo por disolución en disolvente orgánico volátil como
cloroformo o metanol (Solanki, 2016).
Después, el disolvente orgánico se evapora por encima de la temperatura de
transición lipídica (temperatura ambiente para vesículas puras de fosfatidilcolina, o
50ºC para dipalmitoil fosfatidilcolina) usando un evaporador rotatorio para formar una
película fina (Solanki, 2016).
Las trazas finales de disolvente se eliminan al vacío durante toda la noche, la
película delgada preparada se hidrata con tampón por rotación a 60 rpm durante 1 hora
a la temperatura correspondiente y se deja reposar las vesículas resultantes durante 2
horas a temperatura ambiente. Para preparar vesículas pequeñas, las vesículas
resultantes se sonican a temperatura ambiente usando un sonicador de baño o una
sonda. Finalmente, el tamaño de las vesículas se homogenizan mediante extrusión
(Solanki, 2016).
Caracterización de los transferosomas
Distribución del tamaño de la vesícula
El tamaño de la vesícula y la distribución de tamaños se determinan por dispersión
dinámica de luz (DLS), esta técnica se fundamenta en la medición de fluctuaciones
temporales que usualmente se analizan mediante la función de autocorrelación de
intensidad (Singh, 2016).
21
Cuando la luz monocromática de la fuente de radiación golpea las pequeñas
partículas, que están presentes en la solución, la luz experimenta dispersión de Rayleigh
(dispersión en todas las direcciones) (Singh, 2016) (Fig. 10).
Figura 10. Principio de dispersión dinámica de la luz. (Singh, 2016).
Esta fluctuación de la luz se debe a que las pequeñas partículas en dispersión se ven
sujetas al movimiento browniano, por lo tanto, la distancia entre los dispersores en la
solución cambia constantemente con respecto al tiempo (Singh, 2016).
Esta luz difusa experimenta entonces interferencias constructivas o destructivas por
las partículas circundantes. Dentro de esta fluctuación de intensidad, la información
está contenida en la escala de tiempo de movimiento de los dispersores con el fin de
obtener la dispersión de los "retrasos" que es uno de los factores importantes. En los
retrasos de tiempo corto, se observa una alta correlación porque las partículas en
movimiento no tienen oportunidad de moverse en gran medida desde el estado inicial
en el que se encuentran (Singh, 2016).
A medida que el factor de "retrasos de tiempo" se hace más largo, la correlación se
reduce exponencialmente, en el lapso de un largo período, no existe correlación entre la
intensidad dispersa de los estados inicial y final, igualmente se ve afectada por la
viscosidad del disolvente y la temperatura. El decaimiento experimental está
relacionado con el movimiento de las partículas, específicamente con el coeficiente de
difusión (Singh, 2016).
La decadencia exponencial es alta para vesículas que tienen un tamaño mayor y
viceversa, la principal razón de esto es un movimiento browniano más lento asociado
con partículas más grandes (Singh, 2016).
Potencial zeta
Es una medida de la magnitud de la repulsión/atracción electrostática o de carga
entre partículas, su medición proporciona información detallada sobre las causas de la
dispersión, agregación o floculación, y se puede aplicar para mejorar la formulación de
dispersiones, emulsiones y suspensiones (Malvern Panalytical, 2018).
22
Desde un punto de vista físico, el potencial zeta es el potencial eléctrico en la doble
capa interfacial; es decir que es el punto donde se unen la capa difusa y la de Stern
(Figura 11).
Figura 11. Modelo de la doble capa para representar el potencial zeta (Batalla,
2014).
La importancia del potencial zeta radica en que su valor puede estar relacionado con
la estabilidad de las dispersiones coloidales, indicando el grado de repulsión entre
partículas adyacentes, cargadas en una dispersión. Para las moléculas y partículas que
son lo suficientemente pequeñas, un alto potencial zeta les confiere estabilidad, es
decir, la solución o dispersión se resistirá a la agregación. Cuando el potencial es bajo,
se tiene atracción entre las partículas, se supera a la repulsión y se forman flóculos. Por
lo tanto, los coloides de alto potencial zeta se estabilizan eléctricamente, mientras que,
los coloides con bajos potenciales zeta tienden a coagular o flocular (Batalla, 2014).
Para considerar a un sistema estable el potencial zeta debe mantenerse por encima de
±25 mV. En términos generales, cuanto mayor sea el valor absoluto del potencial zeta,
más estable será el sistema (nanoComposix, 2018). Este potencial se puede medir
utilizando dispersión de luz para evidenciar el movimiento de partículas debido a un
campo eléctrico aplicado (Bodycomb, 2010).
Eficiencia de atrapamiento
Representa el porcentaje del fármaco que es encapsulado en las vesículas, su cálculo
se realiza por medio de la siguiente ecuación:
%𝐸𝐸 =𝐹𝑇 − 𝐹𝐿
𝐹𝑇× 100
Donde % EE es el porcentaje de fármaco atrapado, FL es la cantidad de fármaco
libre y FT es la cantidad de fármaco total.
23
Estudio de estabilidad
La estabilidad de los sistemas vesiculares puede verse afectada por problemas
fisicoquímicos originados por oxidación o hidrólisis de los fosfolípidos, distribución de
carga incorrecta y aglomeración debido a la maduración de Ostwald lo que ocasiona
una fuga de fármaco, agregación de vesículas y cambio en el tamaño de las mismas
(Singh, 2016). Al ser necesario que estos sistemas sean estables durante el período de
almacenamiento, y permanezcan en los tamaños apropiados e intactos antes de alcanzar
su lugar de acción, se debe determinar cuáles son las mejores condiciones de
almacenamiento para las mismas, mediante estudios de estabilidad tanto física como
química. La estabilidad física se realiza mediante el control de los tamaños, índice de
polidispersión y potencial zeta de las vesículas después de ser almacenadas a diferentes
temperaturas como a 4ºC y 37ºC y por diferentes intervalos de tiempo por ejemplo 30,
45 y 60 días después de su preparación (Sahil, 2011).Este ensayo permite determinar si
existe inestabilidad física por aglomeración.
Microscopia de fuerza atómica (AFM)
La microscopía de fuerza atómica es una poderosa herramienta que permite que una
variedad de superficies sean fotografiadas y caracterizadas a nivel atómico siendo muy
utilizado en el estudio de nanopartículas, el microscopio de fuerza atómica incluye una
punta montada en un voladizo micromecanizado, a medida que la punta explora una
superficie a investigar, las fuerzas interatómicas entre la punta y la superficie inducen el
desplazamiento de la punta, un rayo láser se transmite y se refleja desde el voladizo
para medir su orientación, el haz de láser reflejado se detecta con un bisel sensible a la
posición, la salida del bisel se dirige a una computadora para el procesamiento de los
datos para proporcionar una imagen topográfica de la superficie con resolución atómica
(Estados Unidos Patente nº 5,144,833, 1992).
Caracterización de actividad antimicrobiana de drogas (Determinación del MIC,
NIC, IC 50)
Las concentraciones de la drogas a la que se inhibe el crecimiento del parásito, a la
que se inhibe el crecimiento de la mitad de la población y a la concentración a la que no
existe inhibición alguna, MIC, IC50, NIC respectivamente, se determinan por un
método modificado para su uso en Leishmania spp, basado en un protocolo empleado
en el parásito Plasmodium falciparum por Reiling & Rohrbach en el 2015, el cual
utiliza fluorescencia y hace uso de una placa de microtitulación, el análisis de los datos
obtenidos de cada pocillo de la placa se realiza mediante la función modificada de
Gompertz que relaciona el logaritmo de la concentración del antimicrobiano y la
fluorescencia, dando como resultado estos tres parámetros (Tufiño & Poveda, 2017).
24
Marco legal.
Como nanopartículas:
Norma ISO/TC 229 Nanotecnologies
Alcance:
Normalización en el campo de las nanotecnologías que incluye uno o ambos de los
siguientes aspectos:
1. La comprensión y el control de la materia y de los procesos a escala nanométrica,
por lo general, aunque no exclusivamente, por debajo de 100 nanómetros de una o más
dimensiones, donde la aparición de fenómenos dependientes del tamaño por lo general
permite nuevas aplicaciones.
2. La utilización de las propiedades de los materiales a nanoescala que difieren de
las propiedades de los átomos individuales, moléculas y la materia a granel, para crear
materiales mejorados, los dispositivos o sistemas que explotan estas nuevas
propiedades.
Las tareas específicas incluyen la elaboración de normas para: la terminología y la
nomenclatura, la metrología y la instrumentación, incluidas las especificaciones para
los materiales de referencia, metodologías de prueba, modelado y simulaciones, y la
salud basadas en la ciencia, la seguridad y prácticas ambientales.
Norma ISO/TR 12885
Describe las prácticas de salud y seguridad en lugares de trabajo relacionados con
las nanotecnologías.
Se centra en la fabricación y uso de nanomateriales artificiales en el trabajo. No se
refiere a cuestiones o prácticas asociados a los nanomateriales generados por procesos
naturales, procesos en caliente y otras operaciones estándar que generan
involuntariamente nanomateriales, o exposición de los consumidores potenciales o usos
de salud y seguridad, aunque parte de la información en la norma ISO / TR 12885:
2008 podría ser correspondiente a dichas áreas.
El uso de la información contenida en la norma ISO/TR 12885: 2008 podría ayudar
a las empresas, investigadores, trabajadores y otras personas para evitar consecuencias
adversas para la salud y seguridad durante la producción, manipulación, uso y
eliminación de nanomateriales manufacturados.
25
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA INEN-ISO/TR 12885
NANOTECNOLOGÍAS. PRÁCTICAS DE SEGURIDAD Y SALUD EN
LUGARES DE TRABAJO RELACIONADOS CON LAS NANOTECNOLOGÍAS
(ISO/TR 12885:2008, IDT)
Esta Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN-ISO/TR 12885 es una traducción
idéntica del Reporte Técnico Internacional ISO/TR 12885:2008, Nanotechnologies.
Health and safety practices in occupational settings relevant to nanotechnologies”, la
fuente de la traducción es la norma adoptada por AENOR. El comité nacional
responsable de esta Norma Técnica Ecuatoriana y de su adopción es el Comité Interno
del INEN.
Esta norma detalla la descripción y fabricación de nanotecnologías, además de
prácticas de seguridad y salud en lugares de trabajo relacionados con las mismas y
metodologías de control.
Como nuevo medicamento
Constitución de la República del Ecuador
TÍTULO VI: REGIMEN DEL BUEN VIVIR
Art. 363: el estado será responsable de garantizar la disponibilidad y acceso a
medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover
la producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las
necesidades epidemiológicas de la población.
Ley orgánica de salud:
Capítulo II. De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y responsabilidades
Art. 6.- Es responsabilidad del Ministerio de Salud Pública:
Numeral 18: regular y realizar el control sanitario de la producción, importación,
distribución, almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de
alimentos procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano así
como los sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a
través del Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta
Pérez y otras dependencias del Ministerio de Salud Pública.
Numeral 32: participar, en coordinación con el organismo nacional competente, en
la investigación y el desarrollo de la ciencia y tecnología en salud, salvaguardando la
vigencia de los derechos humanos, bajo principios bioéticos.
26
Numeral 34: Cumplir y hacer cumplir esta Ley, los reglamentos y otras
disposiciones legales y técnicas relacionadas con la salud, así como los instrumentos
internacionales de los cuales el Ecuador es signatario.
CAPÍTULO VI
Libro Tercero VIGILANCIA Y CONTROL SANITARIO
Art. 131: El cumplimiento de las normas de buenas prácticas de manufactura,
almacenamiento, distribución, dispensación y farmacia, será controlado y certificado
por la autoridad sanitaria nacional.
CAPÍTULO III DE LOS MEDICAMENTOS
Art. 154.- El Estado garantizará el acceso y disponibilidad de medicamentos de
calidad y su uso racional, priorizando los intereses de la salud pública sobre los
económicos y comerciales.
Art. 157. La autoridad sanitaria nacional garantizará la calidad de los medicamentos
en general y desarrollará programas de fármaco vigilancia y estudios de utilización de
medicamentos, entre otros, para precautelar la seguridad de su uso y consumo.
Hipótesis
Hi: Los transferosomas de enrofloxacina tienen mayor actividad leishmanicida que
la enrofloxacina en solución, frente a promastigotes de Leishmania mexicana.
Ho: Los transferosomas de enrofloxacina no tienen mayor actividad leishmanicida
que la enrofloxacina en solución, frente a promastigotes de Leishmania mexicana.
Conceptualización de variables
Formulación
Variables independientes
Relación fosfolípido: surfactante: proporción de lecitina de soya y sodio
desoxicolato que se utilizara en la formulación.
Cantidad de principio activo: miligramos de enrofloxacina que se utilizara en la
formulación total.
pH del buffer: medida de acidez o alcalinidad de una disolución que se utilizara
como medio hidratante
Amplitud de sonicación: energía de sonicación aplicada durante el ensayo expresada
en porcentaje.
27
Tiempo de sonicación: medida de duración de la sonicación de las muestras.
Variables dependientes
Tamaño de partícula: medida del diámetro de las vesículas en nanómetros.
Potencial zeta: medida indirecta de la carga neta sobre la superficie de la
nanopartícula.
Porcentaje de atrapamiento: cantidad de fármaco encapsulado dentro de los
transferosomas.
Cantidad de fármaco liberado: total de enrofloxacina que será liberada de los
transferosomas a través del tiempo.
Estabilidad física: estudio de la conservación de los transferosomas a través del
tiempo.
Actividad leishmanicida
Variables independientes.
Transferosomas de enrofloxacina: nano vesículas cargadas con enrofloxacina
(problema).
Transferosomas sin carga: nano vesículas sin principio activo (control negativo).
Solución de enrofloxacina: mezcla homogénea de enrofloxacina en agua destilada.
Solución de antimoniato de meglumina: medicamento de primera línea para el
tratamiento de la leishmaniasis (control positivo).
Variables dependientes.
MIC: Mínima Concentración de droga a la cual se inhibe el crecimiento.
NIC: Máxima concentración de droga a la cual no existe inhibición del crecimiento.
IC50: Concentración a la cual se inhibe el crecimiento de la mitad de la población.
28
Capítulo III
Metodología
Diseño de la investigación
La presente investigación corresponde al paradigma cuantitativo que recoge
información empírica (de cosas o aspectos que se pueden contar, pesar o medir), es
objetivo y que por su naturaleza siempre arroja números como resultado (Delgado,
2016). Porque se caracterizará a los transferosomas en términos de tamaño, índice de
polidispersión, potencial zeta, porcentaje de atrapamiento, liberación de principio
activo y estabilidad física, además se determinará la actividad leishmanicida de los
mismos.
Esta investigación se encuentra dentro del nivel correlacional el mismo que tiene
como finalidad conocer la relación o grado de asociación que existe entre dos o más
conceptos, categorías o variables en una muestra o contexto en particular (Sampieri,
2006), porque se determinara la relación existente entre el porcentaje de fosfolípido,
surfactante y principio activo con el tamaño, potencial zeta, porcentaje de atrapamiento,
cantidad liberada de principio activo de los transferosomas; con ellos se realizara la
comparación de su actividad leishmanicida con la enrofloxacina en solución frente a
promastigotes de Leishmania mexicana, para lo que se determinara el MIC,NIC y IC50
de los transferosomas.
Por último, la investigación será de tipo experimental que es la que está integrada
por un conjunto de actividades metódicas y técnicas que se realizan para recabar la
información y datos necesarios sobre el tema a investigar y el problema a resolver
(Ruiz, 2009), porque se desarrollaran los transferosomas y se comparará su actividad
leishmanicida con la enrofloxacina en solución mediante curvas de crecimiento de
promastigotes de Leishmania mexicana expuestos a: transferosomas de enrofloxacina,
enrofloxacina en solución, antimoniato de meglumina y transferosomas sin carga.
Materiales y métodos
Formulación
Reactivos
Lecitina de soya grado alimenticio
Sodio desoxicolato pureza ≥ 97 %
29
Enrofloxacina
Cloroformo Loba Chemie 99.96% de pureza
Metanol Scharlau 99,99% de pureza
Buffer de fosfato (pH 7-7,5)
Solución de hidróxido de Sodio 0,2 M
Solución de fosfato de potasio, monobásico 0,2 M
Agua tipo 1
Materiales
Tubos de ensayo
Pipeta volumétrica de 5 mL
Pipeta aforada de 10mL
Balón de fondo redondo de 1L
Vaso de precipitación de 25 mL
Vaso de precipitación de 50 mL
Balón aforado de 25 mL
Balón aforado de 100 mL
Jeringas de 5 mL
Pipeta pasteur
Filtros de jeringa REPHILE de 13 mm, 0,45 um PVDF
Filtros de jeringa REPHILE de 13 mm, 0,22 um PVDF
Equipos
Balanza analítica Metter Toledo modelo RV10C5099
Mezclador de vórtice analógico Fisherbrand ™
Centrífuga Hettich EBA 20
Rotavapor IKA modelo RV10C5099
Procesador ultrasónico modelo Gex 130
Potenciómetro Inlab modelo 06130021
Centrífuga Hettich Mikro 20
Refractómetro digital de bolsillo “PAL-RI”
30
Analizador de nanopartículas Horiba Scientific SZ 100
Disolutor Copley Scientific NS4-COPD
Espectrofotómetro Bio Varian
Actividad leishmanicida
Muestras
Cultivo de promastigotes de Leishmania mexicana (cepa originaria de Venezuela
donada por la Dra. Marbel Torres. ESPE)
Transferosomas de enrofloxacina
Transferosomas sin carga
Solución de antimoniato de meglumina
Solución de enrofloxacina
Materiales
Microplaca de 96 pocillos
Micropipeta multicanal
Puntas desechables
Pipetas desechables
Tubos eppendorf
Equipos
Microscopio óptico Leica DM 750
Microscopio DFC 3000 G
Incubadora Biobase
Centrífuga Thermo Scientific Sorvall ST 8R
Lector de placas de fluorescencia Synergy H1 Biotek
Reactivos
Medio líquido Schneider con suero fetal bovino al 10%
PBS (57mM Na2HPO4, 3mM NaH2PO4, 43.8mM NaCl)
Buffer de lisis (Tris pH 7.5 20 mM, EDTA 5 mM, Sarcosine 0.008%, Triton x-100
0.08%).
31
Solución intercalante fluorescente (SYBR Gold)
Formulación
Pruebas preliminares
Después de la revisión bibliográfica se identificó la composición general de los
transferosomas y durante cuatro semanas se procedió a desarrollar una metodología
para la obtención de los mismos; para ello se modificó tanto el surfactante, fosfolípido
y el pH del buffer. Adicionalmente en el proceso de obtención de los transferosomas se
ensayó con y sin utilización de un mezclador de vórtice, se varió el tipo de equipo de
sonicación, frecuencia de sonicación, tiempo de sonicación y filtración, a fin de
observar los efectos de estas variables en el tamaño y potencial zeta de estas
nanopartículas y así estandarizar el método de preparación, los resultados obtenidos se
detallan en el anexo D. A partir de estos resultados se seleccionaron las variables de
formulación y de proceso que se muestran a continuación en la siguiente tabla.
Tabla 3. Variables de formulación y proceso de los transferosomas.
Variables Niveles
Form
ula
ción
Relación fosfolípido: surfactante (lecitina de soya: sodio
desoxicolato)
85:15 – 90:10
Cantidad de principio activo (enrofloxacina) 25 – 50 mg
pH del buffer 7,0 – 7,5
Pro
ceso
Tiempo de sonicación 2 - 5 min
Amplitud de sonicación 33 y 66 %
Realizado por Loachamin. G
Obtención de los transferosomas
Método de hidratación de la película delgada
Se preparó 2 mL de una solución cloroformo-metanol relación 1:1, se dispersó la
lecitina de soya con agitación en el mezclador de vórtice analógico Fisherbrand ™ por
5 minutos a la velocidad de 10; seguidamente se centrifugó la muestra a 4200 rpm
32
durante 5 minutos en la centrifuga Hettich EBA 20; transcurrido este tiempo se
procedió a retirar el sobrenadante y a colocarlo en un tubo.
Se agregó el surfactante (sodio desoxicolato) y el principio activo en la solución y se
los dispersó en el mezclador de vórtice por 15 segundos a la velocidad de 10, se
trasvasó la suspensión a un balón de fondo redondo de 1 L para la evaporación del
solvente en el rotavapor IKA modelo RV10C5099, a 50 °C ,100 rpm y 337 mbar por
diez minutos, obtenido el film se dejó reposar por un día para la evaporación total del
solvente.
Al día siguiente se hidrató el film con 25 mililitros de buffer de fosfato salino por 1
hora a 60 rpm y 25°C; se dejó reposar la dispersión por dos horas, seguidamente se
tomó 5 mL de la muestra y se colocó en un tubo plástico para ser sonicado en el
procesador ultrasónico modelo Gex 130 con la sonda de 3 mm a la amplitud
correspondiente durante el tiempo previsto utilizando la función de pulsos de 30
segundos.
Se extruyó la dispersión a través de filtros de jeringa, primeramente, por el filtro de
13 mm de PVDF de 0,45 µm y luego por el de 0,22 µm, la dispersión resultante se
colocó en tubos de ensayo con tapa rosca para las pruebas de caracterización.
Nota: Si las pruebas de caracterización no se van a realizar inmediatamente
almacenar la suspensión transferosomal a 4°C máximo durante 24 h.
Caracterización de los transferosomas
Distribución del tamaño de la vesícula y potencial zeta
El tamaño de las vesículas se determinó mediante dispersión dinámica de luz
utilizando el analizador de nanopartículas Horiba Scientific SZ 100 para lo cual se
realizó una dilución de 0,5 mL de suspensión transferosómica en 5 mL de buffer de
fosfato pH 7,0. Para la lectura del valor del potencial zeta se realizó una dilución de 0,5
mL de suspensión transferosomal en 5 mL de agua purificada tipo I. Cada valor
informado fue el promedio de tres mediciones.
Eficiencia de atrapamiento
Mediante revisión bibliográfica se determinó que la enrofloxacina disuelta en
metanol presenta una longitud de absorción máxima a 280 nm, la misma que fue
verificada al realizar un barrido espectral desde 200 nm a 800 nm (ver anexo E).
Seguidamente se procedió a comprobar que esta la longitud de onda elegida no se
viera afectada tanto por el solvente de dilución como por los demás componentes de la
formulación realizando un barrido espectral del metanol, lecitina de soya y sodio
desoxicolato.
33
Posteriormente se realizó la curva de calibración a partir de una solución de
enrofloxacina en metanol de una concentración de 0,2 mg/mL, la cual se utilizó para
preparar 25 mL de una solución madre de 20 ppm, con la que se obtuvieron los
estándares de 8 ppm, 7 ppm, 6ppm, 5ppm, 4ppm, 3ppm, 2ppm, 1ppm.
Se tomó 1,4 mL de suspensión transferosomal, se agregó 100 µL de solución de
glucosa al 20 % y se centrifugó a 13000 rpm y 4ºC durante 15 minutos con pausas de
10 minutos hasta completar 45 minutos de centrifugación; se retiró 300 µL del
sobrenadante y se diluyó con 5 mL de metanol, de la solución resultante se tomó 500 µl
y se diluyó con 5 mL de metanol. La concentración de enrofloxacina en el
sobrenadante, que representa la cantidad de enrofloxacina fuera de las vesículas
liposomales, se determinó por espectrofotometría UV-Vis a 280 nm usando como
blanco transferosomas sin principio activo. El ensayo se realizó por duplicado.
La cantidad de droga encapsulada fue calculada usando la ecuación:
% 𝐸𝐸 =𝐹𝑇 − 𝐹𝐿
𝐹𝑇× 100
Donde % EE es el porcentaje de fármaco atrapado, FL es la cantidad de fármaco
libre y FT es la cantidad de fármaco total.
Perfil de liberación
La liberación in vitro de la enrofloxacina de los transferosomas fue realizada por el
método de la bolsa de diálisis. Se colocó 1,5 mL de solución transferosomal en una
bolsa de celulosa Cellu Set tipo WCOT. Esta fue colocada en un vaso del disolutor que
contenía 100 mL de buffer fosfato salino (pH 7.4), cuyo baño térmico se encontraba a
37º C con una agitación constante de 50 rpm. Alícuotas de 5 mL fueron retiradas a los
5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 180, 210, 240, 270, 300 minutos y 17,
22, 24 horas de la solución receptora y reemplazadas con buffer fresca que se
encontraba a 37 º C. Las alícuotas fueron colocadas en balones de 10 mL y aforadas
con metanol. El ensayo se realizó por duplicado utilizando una suspensión
transferosomal sin principio activo como blanco para las mediciones y una solución de
enrofloxacina equivalente a la cantidad de fármaco libre en la suspensión
transferosomal para la corrección de la absorbancia.
La cantidad de enrofloxacina liberada fue medida a 280 nm usando un
espectrofotómetro UV-VIS.
Estabilidad de los transferosomas
Muestras de suspensión transferosomal fueron almacenadas a 4ºC y temperatura
ambiente, alícuotas de 0,5 mL fueron removidas cada semana durante un mes para el
control de tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta a través del tiempo.
34
Actividad leishmanicida
Cultivo de promastigotes de Leishmania mexicana
Se preparó 15 mL de cultivo de 1x106 parásitos/mL, 5 mL de un cultivo de 2x106
parásitos/mL y 5 mL de un cultivo de 4 x106 parásitos/mL, para lo cual se colocó medio
Schneider con suero fetal bovino al 10% en un tubo con tapa rosca de 50 mL de fondo
cónico. Con la ayuda de una micropipeta, se añadió el volumen de cultivo de
promastigotes crecido y contado necesario para obtener las concentraciones de
parásitos descritas anteriormente y se incubó a 25°C por 48 horas.
Conteo de concentraciones celulares en cámara de Neubauer
Con la ayuda de la micropipeta se cargó la cámara de Neubahuer con la dilución
1:10 de los promastigotes de Leishmania mexicana en PBS glucosado más
formaldehido (37%), una vez que se consiguió el enfoque en el microscopio, se realizó
el conteo de los cuadrados de la esquina superior izquierda e inferior derecha.
Para determinar la concentración de parásitos se utilizó la siguiente formula.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟á𝑠𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑚𝐿⁄ =𝑋1 + 𝑋2
2× 10000 × 10
Caracterización de actividad leishmanicida de los transferosomas de
enrofloxacina (determinación de MIC, NIC, IC50).
La técnica utilizada para este ensayo fue desarrollada por Tufiño & Poveda en el
Instituto de Investigación en Salud Pública y Zoonosis de la Universidad Central del
Ecuador, en el laboratorio de Replicación del DNA e Inestabilidad del Genoma
(DR&GI) y optimizada por Lissette Esteves como parte de su trabajo de tesis
(comunicación personal).
Para este ensayo se utilizaron cultivos de 1x106 parásitos/mL, 2x106 parásitos/mL y
4 x106 parásitos/mL, además de medio Schneider suplementado con suero bovino fetal
al 10%, PBS y Buffer de lisis.
Las suspensiones de droga con parásitos y droga con medio Schneider se prepararon
previamente a la realización del ensayo, como se detalla a continuación en la tabla 4.
35
Tabla 4. Cantidad de droga, suspensión de parásitos y medio Schneider utilizado
para preparar las dispersiones para el ensayo.
Droga
Suspensión de
parásitos
Medio
Schneider +
SBF al 10%
Concent.
(µM)
Vol.
(µL)
Concent.
(parásitos/
mL)
Vol.
(µL)
Vol.
(µL)
Dro
ga +
pará
sito
s
Enrofloxacina 40000 350 2x106 350 ------
Transferosomas
con enrofloxacina
2782,49 350 2x106 350 ------
Transferosomas
sin carga
2412,25 350 2x106 350 ------
Antimoniato de
meglumina
819716,92 525 4x106 175 ------
Dro
ga +
med
io S
chn
eid
er Enrofloxacina 40000 150 ------ ------ 150
Transferosomas
con enrofloxacina
2782,49 150 ------ ------ 150
Transferosomas
sin carga
2412,25 150 ------ ------ 150
Antimoniato de
meglumina
819716,92 225 ------ ------ 75
Realizado por Loachamin. G
Se utilizó una microplaca de 96 pocillos, cuyo esquema se presenta en la figura 12.
36
Figura 12. Diseño de distribución de muestras en la placa de fluorescencia. Autora:
Loachamin G.
Con la ayuda de la pipeta multicanal se colocó 100 µL de parásitos 1x106 en la
columna 1 (C: Control de parásitos).
Retirando la cuarta y la octava punta de la pipeta multicanal se colocó 100 µL de
parásitos 1x 106 desde la columna 11 hasta la 3.
Se colocó nuevas puntas en la pipeta multicanal y se añadió 100 µL de medio
Schneider suplementado con suero fetal bovino al 10% en la columna 12 (B: Blanco del
medio).
Con las mismas puntas se colocaron 100 µL de medio de Schneider suplementado
con suero fetal bovino al 10% desde el pocillo 4D al 11D y desde el pocillo 4H al 11H.
Utilizando una micropipeta adecuada, se colocó 100 µL de medio de Schneider
suplementado con suero fetal bovino al 10% en los pocillos 3D y 3H.
En los pocillos 2A hasta 2C se colocó 200 µL de una suspensión de droga con
parásitos, seguidamente se añadió 200 µL de la droga con medio Schneider en el
pocillo D. A continuación, se colocó 200 µL de una suspensión de otra droga con
parásitos en los pocillos 2E hasta 2G y 200 µL de una solución de esta droga con medio
Schneider en el pocillo 2H. Con la ayuda de la pipeta multicanal a partir de los pocillos
de la columna 2 se retiró 100 µL con previa homogenización (15 veces) y se los
trasvasó a la columna 3. Del mismo modo y con homogenización previa se trasvasó 100
µL de la columna 3 a la columna 4 y se continuó con las diluciones seriadas hasta la
columna 11, desechando los 100 µL restantes de esta última columna. Se tapó la
37
microplaca y selló los bordes con papel parafilm, dejándose incubar a 25°C durante 24
horas. Al día siguiente con la ayuda de la pipeta multicanal se añadió 200 µL de PBS en
la columna 12 con homogenización (cinco veces), y luego en la columna 1. Se realizó
un cambio de puntas y se añadió 200 µL de PBS en los pocillos de la columna 11 hasta
la columna 2 homogenizándose 5 veces después de cada adición. Se tapó la microplaca,
se la posicionó en la centrifuga de tal manera que los número y letras de los extremos
de la placa quedasen hacia fuera del rotor y se centrifugó a 4000 rpm durante 10
minutos a 25 °C. Transcurrido el tiempo de centrifugación con la ayuda de la pipeta
multicanal se retiró de los pocillos de la columna 12, 250 µL de sobrenadante (2 veces
125 µL). NOTA: El pellet se deposita en el lado izquierdo del pocillo, es muy
importante que la punta de la pipeta ingrese muy cerca del borde derecho del pocillo.
Seguidamente se procedió a retirar 250 µL de sobrenadante de la columna 1, luego de
la columna 11, 10, 9 y así sucesivamente hasta la columna 2. Se resuspendió el pellet
formado en los pocillos añadiendo 200 µL de PBS con homogenización de 5 veces,
primeramente en la columna 12, luego en la columna 1 y desde la columna 11 hasta la
2. Se tapó la microplaca y se centrifugó a 4000 rpm durante 10 minutos a 25 °C.
Trascurrido el tiempo de centrifugación, se retiró 200 µl del sobrenadante de la
columna 12, luego de la columna 1 y finalmente desde la columna 11 hasta la 2.
Se añadió 100 µL de Buffer de lisis con Sybr gold a una concentración de 0,1X en la
columna 12 y se homogenizó 5 veces, luego en la columna 1 y finalmente desde la
columna 11 hasta la 2.
Finalmente se colocó la placa en el lector de fluorescencia Synergy H1 Biotek y se
realizó la lectura de esta.
Se determinó el MIC, NIC y el IC50 mediante gráficas utilizando la función
modificada de Gompertz, que es una función matemática que relaciona el logaritmo de
la concentración y la fluorescencia como se puede observar en la figura 13 (Tufiño &
Poveda, 2017).
Figura 13. Gráfica de relación entre la fluorescencia y el logaritmo de la
concentración para determinar el MIC, IC50 y NIC (Tufiño & Poveda, 2017) .
38
Diseño experimental
Formulación
Screening
Para la etapa de screening se empleó el diseño de Plackett-Burman con cinco
factores los cuales fueron: A: Relación fosfolípido: surfactante, B: Cantidad de
principio activo, C: pH del buffer, D: amplitud de sonicación, E: tiempo de sonicación,
cada uno con dos niveles y 2 réplicas de cada tratamiento.
Tabla 5. Factores y niveles para el diseño experimental.
Factores A B C D E
Niveles Bajo (-1) 85:15 25 7,0 33 2
Alto (+1) 90:10 50 7,5 66 5
Realizado por Loachamin. G
Tabla 6. Tratamientos generados en el software Minitab para la etapa de screening
Corrida Relación
F:S
Cantidad
de pa
pH Buffer Amplitud de
sonicación
Tiempo de
sonicación
1 -1 1 1 1 -1
2 -1 -1 -1 1 1
3 1 -1 1 1 -1
4 1 -1 -1 -1 1
5 1 1 1 -1 1
6 1 -1 1 -1 -1
7 -1 -1 -1 1 1
8 1 1 -1 1 1
39
9 -1 -1 1 1 1
10 -1 -1 -1 -1 -1
11 -1 1 -1 -1 -1
12 -1 1 1 -1 1
13 1 1 -1 1 -1
14 -1 -1 1 1 1
15 -1 1 -1 -1 -1
16 1 -1 1 -1 -1
17 1 1 -1 1 -1
18 -1 1 1 1 -1
19 1 -1 1 1 -1
20 1 -1 -1 -1 1
21 -1 -1 -1 -1 -1
22 1 1 1 -1 1
23 1 1 -1 1 1
24 -1 1 1 -1 1
Realizado por Loachamin. G
F: S Fosfolípido surfactante; pa: principio activo
Optimización
En función de los resultados del screening, para la etapa de optimización se realizó
un diseño factorial de dos factores, dos niveles manteniéndose constante la relación
fosfolípido-surfactante, la cantidad de principio activo y el tiempo de sonicación. Se
realizó dos réplicas de cada tratamiento.
40
Tabla 7. Factores y niveles para optimización
Factores pH del buffer Amplitud de sonicación (%)
Niveles Bajo (-1) 7 33
Alto (+1) 7,5 66
Realizado por Loachamin. G
Tabla 8. Tratamientos de la etapa de optimización
Corrida pH del
buffer
Amplitud de
sonicación
1 -1 -1
2 -1 -1
3 -1 -1
4 -1 +1
5 -1 +1
6 -1 +1
7 +1 -1
8 +1 -1
9 +1 -1
10 +1 +1
11 +1 +1
12 +1 +1
Realizado por Loachamin. G
A la mejor formulación obtenida, se le determinó el porcentaje de atrapamiento y se
realizó el perfil de liberación, antes de la realización de las pruebas in vitro en los
promastigotes de Leishmania mexicana.
41
Actividad leishmanicida
Para determinar la actividad leishmanicida, se ensayó con cada una de las muestras
para obtener la media del MIC, NIC, IC 50.
Tabla 9. Variables de la actividad leishmanicida
TE TSC SE SMA
MIC
IC50
NIC
Realizado por Loachamin. G
TE: Transferosomas de enrofloxacina; TSC: Transferosomas sin carga, SE: Solución de
enrofloxacina; SMA: Solución de antimoniato de meglumina
Matriz de operacionalización de variables
Formulación
Screening
Tabla 10. Matriz de operacionalización de variables screening
Variable Dimensiones Indicadores
Relación de fosfolípido:
surfactante
85:15
90:10
-Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Cantidad de principio
activo
50 mg
25 mg
-Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
42
pH del buffer 7,0
7,5
Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Amplitud de sonicación 33%
66%
Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Tiempo de sonicación 2 minutos
5 minutos
-Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Realizado por: Loachamin. G
Optimización
Tabla 11. Matriz de operacionalización de variables optimización
Variable Dimensiones Indicadores
pH del buffer 7,0
7,5
- Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Amplitud de sonicación 33%
66%
-Diámetro de partícula (nm)
-Índice de polidispersión
-Potencial zeta (mV)
Realizado por: Loachamin. G
Nota: De la mejor formulación se realizó la eficiencia de atrapamiento y perfil de
liberación.
43
Actividad leishmanicida
Tabla 12. Matriz de operacionalización de variables actividad leishmanicida
Variable Dimensiones Indicadores
Transferosomas de
enrofloxacina
NA -MIC (µM)
-NIC (µM)
-IC50 (µM)
Transferosomas sin carga NA
-MIC (µM)
-NIC (µM)
-IC50 (µM)
Solución de enrofloxacina NA
-MIC (µM)
-NIC (µM)
-IC50 (µM)
Solución de antimoniato
de meglumina
NA -MIC (µM)
-NIC (µM)
-IC50 (µM)
Realizado por: Loachamin. G
Técnicas e instrumentos de recolección de datos
La técnica que se empleó en este proyecto fue la observación, la que nos permitió
detectar y asimilar la información recolectada en el laboratorio y el registro de los
respectivos resultados.
Como instrumento de recolección de datos para la etapa de formulación se utilizó
una guía de observación donde se registró el tamaño de partícula, índice de
polidispersión, potencial zeta, porcentaje de eficiencia de atrapamiento y cantidad de
fármaco liberado.
Del mismo modo para la determinación de actividad leishmanicida se utilizó una
guía de observación la cual nos permitió registrar el MIC, NIC, IC50 de los
transferosomas de enrofloxacina, transferosomas sin carga, solución de enrofloxacina y
44
solución de antimoniato de meglumina.
Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Formulación
Se realizó un análisis estadístico de varianza (ANOVA), para afirmar que efectos de
cada una de las variables, contribuyen a explicar el comportamiento de las respuestas:
tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta. Para lo cual se utilizó el programa
Minitab 17.0, obteniéndose diagramas de Pareto de efectos estandarizados, que nos
permitieron determinar cuáles son las variables significativas en la formulación.
Además, se obtuvo diagramas de interacción, para observar cómo influye la correlación
entre las variables estudiadas en la variable respuesta.
Actividad leishmanicida
Se obtuvo una media de la concentración mínima inhibitoria, la concentración no
inhibitoria y la concentración inhibitoria 50, de tres réplicas de cada uno de los
tratamientos, con la ayuda del programa GraphPad Prism 6, el cual utiliza la función
modificada de Gompertz, que es una función matemática que relaciona el logaritmo de
la concentración y la fluorescencia (Tufiño & Poveda, 2017).
Para determinar si las medias de los valores del MIC de los transferosomas y la
solución de enrofloxacina eran diferentes, se realizó un análisis de varianza, seguido de
la comparación de medias de tratamientos mediante el método de Tukey.
45
Capítulo IV
Análisis y discusión de resultados
Formulación
Screening
Para esta etapa se aplicó el diseño de Plackett-Burman con 5 factores dando un total
de 24 corridas, donde se determinó el tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta
de los tratamientos como se puede observar en la siguiente tabla.
Tabla 13. Resultados del diseño experimental de 24 corridas.
Corrida F:S pa pH AS TS Tamaño (nm) IP PZ (mV)
1 -1 1 1 1 -1 88,4 0,599 -35,1
2 -1 -1 -1 1 1 98,1 0,486 -43,4
3 1 -1 1 1 -1 666,9 5,599 -42,4
4 1 -1 -1 -1 1 97,4 0,242 -41,2
5 1 1 1 -1 1 128,5 0,694 -41,4
6 1 -1 1 -1 -1 115,8 0,544 -37
7 -1 -1 -1 1 1 90,5 0,531 -34
8 1 1 -1 1 1 115,6 0,498 -38,9
9 -1 -1 1 1 1 87,3 0,607 -40,2
10 -1 -1 -1 -1 -1 -- -- --
11 -1 1 -1 -1 -1 -- -- ..
12 -1 1 1 -1 1 100,9 0,499 -39,7
13 1 1 -1 1 -1 122,4 0,526 -47,1
14 -1 -1 1 1 1 119,2 0,464 -48,3
15 -1 1 -1 -1 -1 -- -- --
16 1 -1 1 -1 -1 98,4 0,496 -32,5
17 1 1 -1 1 -1 122,2 0,556 -38,5
18 -1 1 1 1 -1 109,4 0,465 -46,6
46
19 1 -1 1 1 -1 125,9 0,433 -36
20 1 -1 -1 -1 1 112,2 0,444 -43,8
21 -1 -1 -1 -1 -1 -- -- --
22 1 1 1 -1 1 109,8 0,547 -39,7
23 1 1 -1 1 1 88,2 0,394 -30,4
24 -1 1 1 -1 1 102,2 0,646 -32,5
Realizado por Loachamin. G
F: S relación Fosfolípido surfactante, pa: cantidad de principio activo, AS: Amplitud de
sonicación, TS: Tiempo de sonicación, IP: Índice de polidispersión, PZ: Potencial zeta
Los tratamientos 10 y 11 con sus respectivas replicas saturaron los filtros de 0,45 nm
recogiéndose una mínima cantidad de suspensión transferosomal, por lo que el diseño
original de 24 corridas se redujo a 20 corridas.
La corrida 3 presentó un tamaño e índice de polidispersión alto, detalle que llamó la
atención por lo que se comparó este resultado con su réplica la corrida 19, que presentó
un tamaño de partícula de 125,9 nm y un índice de polidispersión de 0,433
demostrándonos que ese valor elevado de tamaño e índice de polidispersión pudo
deberse a un error en la sonicación de la muestra.
Al descartar los resultados obtenidos en la corrida 3 por un posible error durante la
preparación, se consideraron las demás corridas para determinar la variación de tamaño.
Identificándose que los tamaños de los transferosomas variaron entre 88,2 nm y 128,5
nm, siendo valores que se encontraban dentro del rango esperado (tamaño < 200 nm).
Los valores de índice de polidispersión que van de 0 a 0.5 se consideran
monodispersos y homogéneos, pero los superiores a 0,5 indican no homogeneidad y
polidispersión (Kumar, 2015). En el caso de la corrida 4, el índice de polidispersión de
0,242 indicó una dispersión vesicular homogénea, hecho que no se repitió en su réplica
la corrida 20, la cual presento una polidispersión de 0,444. Los índices de
polidispersión de la corrida 4, 8 y sus réplicas la corrida 20 y 23 respectivamente
mostraron dispersión vesicular homogénea, a diferencia de las demás corridas que
tuvieron distribución vesicular heterogénea, lo que podría generar una inestabilidad en
los transferosomas ya que al existir variación de tamaño de las vesículas están podrían
fusionarse (Singh, 2016).
Con respecto al potencial zeta en las diferentes corridas éste varió entre -30,4 mV
hasta -48,3 mV demostrando la estabilidad de los transferosomas, ya que nanopartículas
con un potencial zeta fuera del rango ±30 mV presentan estabilidad en suspensión,
debido a que la carga superficial evita la agregación de las partículas (Batalla, 2014).
Los resultados de esta etapa fueron procesados mediante la opción de análisis de
47
diseño factorial que ofrece el programa Minitab, obteniéndose diagramas de Pareto que
muestra los valores absolutos de los efectos estandarizados desde el efecto más grande
hasta el efecto más pequeño. El diagrama además muestra una línea de referencia para
indicar cuáles efectos son estadísticamente significativos. Esta línea depende del nivel
de significancia denotado por alfa, para nuestro caso =0,05. Para la interpretación de
los resultados del diagrama, las barras que cruzan la línea de referencia son
estadísticamente significativas.
(A)
(B)
(C)
Figura 14. Diagramas de Pareto de efectos estandarizados para tamaño (A), índice
de polidispersión (B) y potencial zeta (C). Autora: Loachamin G.
Los diagramas de Pareto de efectos estandarizados mostraron que los factores
ensayados, no son estadísticamente significativos para tamaño e índice de
Factor Nombre A Relación F: S B Cantidad de pa C pH buffer D amplitud de sonicación E tiempo de sonicación
48
polidispersión (Figura 14A y 14B) y que la interacción de los factores relación de
fosfolípido-surfactante y pH del buffer fue estadísticamente significativa para el
potencial zeta (Figura 14C).
Ya que la relación fosfolípido surfactante y pH del buffer fue estadísticamente
significativa, se procedió a realizar un diagrama de la interacción entre estos efectos
con respecto al potencial zeta. Observándose que el nivel bajo de relación fosfolípido-
surfactante necesita un pH de 7,5 para obtener valores de potencial zeta más negativos;
por el contrario, el nivel alto de relación fosfolípido-surfactante necesita de un pH de 7
para obtener valores más negativos como se puede observar en la figura 15.
Figura 15. Diagrama de interacción entre la relación fosfolípido-surfactante y pH
del buffer para el potencial zeta. Autora: Loachamin G.
Concluyendo que cada nivel de relación fosfolípido-surfactante, necesita un pH de
buffer específico, para dar mayor estabilidad en el transferosoma.
Optimización
Para identificar cuáles serían los factores que se mantendrían constantes y cuales se
modificarían se realizó un análisis de los datos de tamaños de los transferosomas
obtenidos en la etapa de screening con respecto al porcentaje y tiempo de sonicación,
como se puede observar en la tabla 14.
49
Tabla 14. Resultados obtenidos con respecto al tamaño de los transferosomas a los
diferentes porcentajes y tiempos de sonicación.
Amplitud de
sonicación
Tiempo de
sonicación (min)
Resultado
33 %
2 No pasa a través de los filtros, tamaño > a 450nm
5 Tamaño entre 100-200 nm
66 %
2 Tamaño entre 100-200 nm
5 Tamaño < 100 nm
Realizado por Loachamin. G
De los resultados de la tabla anterior se determinó que un tiempo bajo y una
amplitud de sonicación baja no ayudan en la reducción de tamaño de partícula,
ocasionando la saturación rápida de los filtros de 0,45 µm, lo cual implica que el
tamaño de las partículas resultantes es mayor al poro de este filtro. Por el contrario, a
mayor tiempo y amplitud de sonicación el tamaño disminuye siendo inferior a los 100
nm, efecto que no era deseado ya que pruebas preliminares (ver anexo D) sugerían que
transferosomas de tamaño inferior a 100 nm eran más propensos a sufrir aglomeración
y aumentar su tamaño al pasar los días. Estableciéndose además que para obtener
transferosomas con tamaño entre 100 y 200 nm se debe utilizar el 33% de amplitud por
5 minutos o el 66% de amplitud por 2 minutos.
En los ensayos en el laboratorio se realizaron dos observaciones importantes, la
primera, que cuando se trabajaba con una relación de fosfolípido surfactante de 90:10,
el film se formaba homogéneamente y la segunda, que a mayor cantidad de fármaco
añadido a la formulación mayor era la precipitación del mismo en el fondo del tubo al
dejarlo en reposo. Estas observaciones, además del análisis de la tabla 14 como de la
figura 15, se tomaron en cuenta para seleccionar los factores que se mantendrían
constantes y los que se modificarían en esta etapa (tabla 15).
Tabla 15. Variables de optimización.
Amplitud de
sonicación
(%)
Tiempo de
sonicación
(min)
Cantidad
de pa (mg)
Relación
fosfolípido:
surfactante
pH
33 5 25 90:10 7
7,5
66 2 25 90:10 7
7,5
Realizado por Loachamin. G
50
Con las variables de optimización de la tabla 15, se generó un diseño de cuatro
tratamientos con tres réplicas cada uno, dando un total de 12 corridas. Evaluándose las
variables respuesta: tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta. Los resultados
fueron los siguientes:
Tabla 16. Resultados obtenidos en la etapa de optimización.
pH del buffer Amplitud de
sonicación (%)
Tamaño
(nm)
IP PZ
(mV)
7,0 33 111,4 0,633 -43,6
7,0 33 110,1 0,702 -38,9
7,0 33 109,0 0,556 -34,0
7,0 66 107,8 0,600 -34,8
7,0 66 389,7 3,119 -33,7
7,0 66 119,7 0,592 -36,7
7,5 33 115,5 0,485 -35,3
7,5 33 117,6 0,561 -41,4
7,5 33 127,6 0,508 -31,6
7,5 66 113,4 0,632 -35,9
7,5 66 121,7 0,616 -39,6
7,5 66 137,9 0,681 -41,5
Realizado por Loachamin. G
En el ensayo donde se trabajó a pH 7 y amplitud de sonicación de 66 % una de las
tres replicas presentó un tamaño inusual de 389,7 nm con polidispersión de 3,119; dado
que los valores de las otras dos replicas fueron inferiores a 200 nm se atribuyó este
resultado inusual a un problema durante la filtración de la suspensión transferosomal.
Al realizar el análisis factorial de los resultados obtenidos en la tabla 16 se
determinó que tanto el pH del buffer, como la amplitud de sonicación no tienen efecto
significativo en el tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta (Figura 16).
51
(A)
(B)
(C)
Figura 16. Diagramas de Pareto de efectos estandarizados para tamaño (A), índice
de polidispersión (B) y potencial zeta (C). Autora: Loachamin G
Todos los análisis realizados en la etapa de formulación permitieron determinar las
condiciones con las cuales se trabajaría para obtener la suspensión transferosomal final
detallada en tabla 17. Eligiéndose el 33% de amplitud de sonicación ya que estudios
realizados demuestran que una amplitud alta de sonicación conduce a la oxidación de
los fosfolípidos, causando la precipitación de los lípidos, además de la reducción de la
eficiencia de atrapamiento (Shaji, 2014). El pH 7 se eligió de acuerdo con la interacción
que se observó en la figura 15, entre la relación fosfolípido surfactante y pH del buffer
en la respuesta del potencial zeta, determinándose que para la relación fosfolípido
Factor Nombre A pH del buffer B amplitud de sonicación
52
surfactante de 90:10 el pH más recomendado a utilizar y que nos dará valores de
potencial zeta más negativo es el pH 7. La cantidad de principio activo de 25 mg se
seleccionó al observar que en las suspensiones transferosomales con mayor cantidad se
producía una mayor precipitación de este en el fondo del tubo al dejarlo en reposo.
Además, los tratamientos realizados bajo estas condiciones (tabla 16) fueron los que
presentaron mejor reproducibilidad en cuanto al tamaño de los transferosomas.
Tabla 17. Condiciones seleccionadas para la elaboración de la suspensión
transferosomal final.
Relación F:S Cantidad de pa
(mg)
pH
Buffer
Amplitud de
sonicación (%)
Tiempo de
sonicación (min)
90:10 25 7 33 5
Realizado por Loachamin. G
Eficiencia de atrapamiento
Este ensayo se realizó para determinar la cantidad de principio activo que se
encuentra encapsulado dentro de los transferosomas elaborados según las condiciones
detalladas en la tabla 17; los resultados se muestran a continuación.
Tabla 18. Resultados obtenidos en la determinación de eficiencia de atrapamiento.
Muestra Absorbancia
Concentración
(mg/L)
Fármaco libre
(mg)
Atrapamiento
(%)
M1 0,2939 2,7 13,1175 47,53
M2 0,3070 2,8 13,6033 45,58
�̅� 46,56
Realizado por Loachamin. G
Los transferosomas presentaron una eficiencia de atrapamiento del 46,56 %,
porcentaje que podría deberse al hecho que la cantidad total de enrofloxacina agregada
en la formulación no se solubiliza totalmente, formándose una dispersión donde existe
principio activo no disuelto que queda fuera sin ser encapsulado. Cabe resaltar que la
eficiencia de atrapamiento es dependiente de varios factores como la amplitud de
sonicación, tiempo de sonicación, relación fosfolípido surfactante, tipo de surfactante,
método de preparación de los transferosomas, técnica utilizada para la separación del
53
principio activo de las vesículas, etc.; esto fue reportado en una investigación acerca del
efecto del método de preparación y el proceso de purificación de liposomas de
enrofloxacina obtenidos por el método de extrusión, en el porcentaje de atrapamiento;
encontrándose que la purificación por filtración en gel, diálisis y columna de
centrifugación presentaron porcentajes de encapsulación del 2, <1 y 10±2%
respectivamente (Pons, 1995).
Con respecto al tipo de surfactante, en nuestro caso se utilizó sodio desoxicolato,
surfactante aniónico que ha mostrado dar buenos porcentajes de atrapamiento en
transferosomas de anfotericina B, obteniéndose un porcentaje de atrapamiento de
68,5±3%, también se ha observado que este surfactante produce reducción en la
eficiencia de atrapamiento de la dexametasona, hecho que permite notar que también el
tipo de fármaco que se utilice interfiere en la eficiencia de atrapamiento (Singodia,
2010).
La naturaleza zwitteriónica anfótera de las fluoroquinolonas, como es el caso de la
enrofloxacina, hace que estas moléculas estén ionizadas en todo el rango de pH,
propiedad que puede influir en su distribución y afinidad por los entornos lipídicos,
particularmente las bicapas como las de los transferosomas. Por ello, la cantidad
incorporada podría no depender únicamente del volumen acuoso interno de las
vesículas, sino también de la bicapa (Montero, 1996).
Estudios realizados en liposomas cargados con fluoroquinolonas han demostrado
también que el grado de incorporación es una función del pH (Montero, 1996).
Transferosomas de ciprofloxacina que utilizaron sodio desoxicolato como activador
de borde presentaron una eficiencia de atrapamiento de 45,16 ± 7,45 valor muy similar
al obtenido en nuestro estudio con enrofloxacina (Al-mahallawi, 2014).
Perfil de liberación
El perfil de liberación permite determinara si la enrofloxacina incorporada dentro de los
transferosomas puede liberase cuando llegue a su lugar de acción. Esta liberación se
determinó por el método de la bolsa de diálisis, el cual se realizó por 24 horas (Anexo
G). En la tabla 19 se muestran los valores obtenidos del perfil de liberación hasta los
120 minutos.
54
Tabla 19. Cantidad de droga liberada durante el perfil de liberación.
Cantidad de droga liberada (%)
Tiempo (min) M1 M2 �̅�
5 14,83 14,13 14,48
10 15,74 20,62 18,18
15 20,12 20,12 20,12
30 41,65 31,51 36,58
45 52,88 51,19 52,03
60 61,00 62,58 61,79
75 68,81 68,40 68,60
90 68,31 72,41 70,36
105 71,47 72,03 71,75
120 63,57 63,88 63,73
Realizado por Loachamin. G
Como se puede observar en la tabla a los 5 minutos se liberó un 14,48 % del fármaco
encapsulado llegando a un total de 71,75% a los 105 minutos.
Después de este tiempo se observa un descenso de la cantidad de droga liberada, que
puede deberse a la degradación del principio activo ya que se sabe que las
fluoroquinolonas son relativamente estables a diferentes temperaturas, pero muy
sensibles a la luz (Pons, 1995). Se descartó que exista una alteración a nivel de los
transferosomas que produzcan este efecto, ya que la solución de enrofloxacina presentó
también descenso de la cantidad de droga liberada después de transcurrido los 120
minutos.
En la siguiente grafica podemos observar el perfil de liberación de enrofloxacina a
partir de los transferosomas.
55
Figura 17. Perfil de liberación de transferosomas de enrofloxacina. Autora:
Loachamin G
Cinética de liberación
Con los datos obtenidos en la tabla 19, se procedió a determinar el modelo cinético
al que se ajustan los transferosomas.
Tabla 20. Cinética de liberación de la enrofloxacina de los transferosomas
Tiempo (min) % lnC 1/C
5 14,48 2,6728 0,0691
10 18,18 2,9003 0,0550
15 20,12 3,0017 0,0497
30 36,58 3,5995 0,0273
45 52,03 3,9518 0,0192
60 61,79 4,1237 0,0162
75 68,60 4,2283 0,0146
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
0 20 40 60 80 100 120 140
Can
tid
ad d
e d
roga
lib
erad
a (%
)
Tiempo(min)
Cantidad de droga liberada vs Tiempo
56
90 70,36 4,2537 0,0142
105 71,75 4,2732 0,0139
120 63,73 4,1546 0,0157
R2 0,8332 0,7804 0,6975
Realizado por Loachamin. G
Como se puede observar en la tabla anterior la liberación de la enrofloxacina de los
transferosomas se ajusta mejor al modelo cinético de orden cero, donde la velocidad de
liberación es independiente de la concentración, concordando con el resultado obtenido
en un estudio realizado en liposomas multilamelares de enrofloxacina (Sezer, 2007).
Estabilidad física de los transferosomas
Se realizó la estabilidad de las suspensiones transferosomales de diferentes lotes
durante 1 mes a dos condiciones: temperatura ambiente y 4 °C, los resultados se
muestran en la tabla 21 para un lote de 5 mL y la tabla 22 para un lote escalado a 10 mL
con el mismo equipamiento.
Tabla 21. Resultados de estabilidad física para lote de 5 mL.
Elaboración 12/01/2018
Temperatura Ambiente (TA) 4°C
Semanas
Tamaño
(nm) IP
PZ
(mV)
Tamaño
(nm) IP
PZ
(mV)
0 113,4 0,683 -44,5 116,4 0,558 -43,9
1 116,2 0,546 -41,9 107,8 0,551 -39,9
2 117,9 0,546 -40,7 114,3 0,483 -43,9
3 101,0 0,479 -49,7 114,2 0,531 -63,8
4 111,2 0,543 -57,1 115,8 0,393 -69,6
Realizado por Loachamin. G
57
Tabla 22. Resultados de estabilidad física para lotes de 10 mL.
Elaboración 01/02/2018 16/01/2018
Temperatura Ambiente (TA) 4°C
Semanas
Tamaño
(nm) IP
PZ
(mV) Tamaño (nm) IP
PZ
(mV)
0 102,7 0,471 -43,1 111,5 0,444 -41,6
1 105,6 0,512 -44,8 120,1 0,461 -44,4
2 101,5 0,385 -42,8 121,7 0,422 -47,9
3 98,7 0,452 -39,3 118,3 0,512 -42,9
4 102,3 0,441 -41,8 121,4 0,510 -33,5
Realizado por Loachamin. G
La comparación del tamaño, índice de polidispersión y potencial zeta de los
diferentes lotes a temperatura ambiente y a 4 grados centígrados se puede observar a
continuación.
58
(A)
(B)
(C)
Figura 18. Comparación de la variación de tamaño (A), índice de polidispersión
(B) y potencial zeta (C) a través del tiempo de los diferentes lotes almacenados a
4°C y temperatura ambiente. Autora: Loachamin G
Al evaluar los tamaños de los transferosomas de enrofloxacina se observó que
ninguno de los lotes almacenados a temperatura ambiente y 4°C presentó cambios
significativos durante el periodo de almacenamiento (Figura 18A).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 1 2 3 4
Ind
ice
de
po
lidis
per
sió
n
Tiempo (semanas)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4
Tam
año
(n
m)
Tiempo (Semanas)
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
0 1 2 3 4
Po
ten
cial
zet
a (m
V)
Tiempo (semanas)
59
El índice de polidispersión tampoco mostró una variación que fuera significativa en
ninguno de los lotes y en las diferentes temperaturas de almacenamiento,
manteniéndose entre 0,6 y 0,4 durante las 4 semanas de estudio (Figura 18B).
Las leves diferencias observadas en el tamaño e índice de polidispersión de los
transferosomas almacenados tanto a temperatura ambiente como a 4°C durante las 4
semanas pueden deberse a variaciones aleatorias en la medición y no sugieren ningún
tipo de inestabilidad física en ninguno de los lotes.
En el lote 12/01/2018 (figura 18C) el potencial zeta de las muestras almacenadas a
temperatura ambiente y 4°C a partir de la tercera semana mostraron un ligero aumento,
hecho que se podría atribuir a una posible alteración química de la formulación, ya que
el tamaño de los transferosomas no varió significativamente, descartándose el
fenómeno de aglomeración, este hecho no se replica en la estabilidad del lote
01/02/2018 TA y el lote 16/01/2018 4°C en la tercera y cuarta semana.
Es importante mencionar también que las formulaciones que se mantuvieron a
temperatura ambiente eran susceptibles a contaminarse con hongos hecho que no se
observó en las muestras que se almacenaron a 4°C. Las muestras contaminadas fueron
descartadas y no se usaron para las mediciones de estabilidad.
Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Las características morfológicas de los transferosomas optimizados fueron
analizadas utilizando microscopio de fuerza atómica, para lo que se colocó gotas de la
suspensión transferosomal en un cubreobjetos y se dejó secar a temperatura ambiente,
después del secado se realizó la lectura de la muestra en modo de escaneo de no
contacto.
60
Figura 19. Visualización de la suspensión transferosomal optimizada en el AFM
La microfotografía que se observa en la figura 19 demuestra que los transferosomas
están bien identificados y presentan una forma esférica casi perfecta.
Además, se muestra la dispersión vesicular heterogénea existente en esta suspensión
transferosomal, ya que se observa variación en el tamaño de las vesículas, siendo de 98
nm para la vesícula que se encuentra entre la flecha roja y verde y de 138 nm para la
vesícula que se encuentra entre la fecha azul y la celeste. Este resultado confirma que la
polidispersión de 0,821 determinada en el DLS fue correcta
Actividad leishmanicida
Para este ensayo se usaron suspensiones transferosomales recién elaboradas a partir
de las condiciones descritas en la tabla 17, las cuales se extruyeron a través de filtros de
jeringa de 13 y 33 mm de diámetro generando transferosomas con las siguientes
características.
61
Tabla 23. Características de los transferosomas usados en los ensayos de actividad
leishmanicida.
Formulación optimizada
Diámetro del filtro (mm) 13 33
Tamaño (nm) 123,1 46,7
Índice de polidispersión 0,393 0,195
Potencial zeta (mV) -45 -39,5
Realizado por Loachamin. G
Se determinó la actividad leishmanicida de las dos suspensiones transferosomales. Los
resultados obtenidos de este ensayo MIC, NIC, IC50 y coeficiente de determinación
(R2), se muestran en la tabla 24, los datos representan el promedio de tres
determinaciones con su respectiva desviación estándar.
Tabla 24. Valores de MIC, NIC, IC50, R2 de las muestras ensayadas.
Muestra MIC(µM) NIC(µM) IC50(µM) R2
Transferosomas
120 nm
329,1 ± 62,7 65,06 ± 13,6 140,30 ± 19,4 0,9704
Transferosomas
50 nm
256,40 ± 26,9 22,41 ± 4,6 72,55 ± 7,7 0,9783
Transferosomas
sin carga 120 nm
286,43 ± 8,3 42,14 ± 3,0 103,57 ± 3,8 0,9555
Transferosomas
sin carga 50 nm
127,53 ± 14,9 9,8 ± 2,4 33,62 ± 4,5 0,9687
Enrofloxacina 5169,00 ± 577 441,60 ± 116 1470,67 ± 109 0,9670
Antimoniato de
meglumina
517082 ± 108237 70797,67 ± 11030,7 209456 ± 20229 0,9806
Realizado por Loachamin. G
Para calcular la concentración del MIC, NIC e IC50 de los transferosomas sin carga
se utilizó el peso molecular del sodio desoxicolato; cabe recalcar que los
transferosomas están compuestos además de una mezcla fosfolípidos cuyo peso
molecular no está determinado.
En la siguiente figura se puede observar el gráfico de barras de los valores del MIC e
62
IC50 de los resultados obtenidos en la tabla 24. Se realizó un corte del eje Y, desde las
concentraciones de 500 µM hasta 1000 µM y desde 5000 µM hasta 100000 µM para
poder comparar tanto el MIC como el IC50 de todas las muestras.
Figura 20. Comparación de los valores de MIC e IC50 de las muestras ensayadas.
Autora Loachamin. G
La enrofloxacina encapsulada dentro de transferosomas presentó mayor actividad
leishmanicida que la enrofloxacina en solución, sus valores de MIC e IC50 fueron
mucho menores. El mecanismo que podría explicar esta actividad es la fusión, donde el
contacto estrecho de los liposomas conduce a la mezcla y difusión de lípidos
liposomales con los lípidos de la membrana plasmática de la célula huésped,
permitiendo así que los agentes atrapados (fármacos) en el compartimiento acuoso se
inyecten directamente en el citoplasma, por otro lado, los agentes encapsulados en la
bicapa lipídica se administran en la membrana de la célula (Alhariri, 2013).
Con respecto al antimoniato de meglumina, medicamento de primera línea en el
tratamiento de leishmaniasis cutánea, demostró ser menos efectiva que la enrofloxacina
en solución y los transferosomas, ya que se necesita una mayor concentración de este
fármaco para producir la inhibición de los promastigotes.
Los transferosomas sin carga mostraron tener actividad leishmanicida, hecho similar
al resultado obtenido con nanoemulsiones sin fármaco que presentaron un IC50 similar
al de antimoniato de meglumina en solución (Santander, 2010). Hunter también detalla
la reducción de la carga de parásitos (amastigotes) del hígado, expresada como
porcentaje de supresión, lograda dosificando ratones infectados a través de la vena de la
cola con suspensiones de niosomas y liposomas vacíos, mencionándonos que el
mecanismo para esta aparente actividad antiparasitaria de las vesículas vacías no es
conocido (Hunter, 1988).
La actividad leishmanicida que presentan los transferosomas sin carga puede deberse
al hecho que la estructura de este tipo de liposomas es similar a una membrana celular
63
que consiste en lípidos organizados en configuración de bicapa, permitiéndoles
interactuar con las células mediante diversos mecanismos como el intercambio de
lípidos por el cual los materiales lipofílicos se pueden transferir de los liposomas a la
membrana celular. Este mecanismo se puede dar posiblemente por tres formas, una de
ellas es la transferencia de monómeros de lípidos mediados por proteínas de
intercambio de lípidos que existen en la superficie celular; también es posible que la
monocapa externa de vesículas y la membrana celular experimenten una fusión
transitoria reversible; finalmente, un intercambio enzimático de la cadena de acilo
puede tener lugar entre los liposomas y los lípidos de la membrana plasmática de las
células huésped (Alhariri, 2013).
Se realizó la comparación del valor del MIC de los transferosomas con la
enrofloxacina en solución mediante un análisis de varianza.
Estableciendo las siguientes hipótesis:
Ho: �̅�1 = �̅�2 =………… �̅�k = �̅�
HA: �̅�i ≠ �̅�j para algún i ≠ j
Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 25.
Tabla 25. Resultados obtenidos del ANOVA.
Fuente
GL
SC
CM
F
Valor p
Factor
4
58142764
14535691
215,15
0,000
Error
10
675598
67560
Total
14
58818362
Realizado por Loachamin. G
GL: Grados de libertad; SC Suma de cuadrados; CM: Cuadrados medios; F: estadístico
de prueba; Valor p: significancia observada.
Dado que p tienen un valor de cero, que es menor al valor de nivel de significancia
(α = 0,05); se rechazó Ho, siendo necesario determinar cuáles tratamientos fueron
diferentes, para lo que se realizó una comparación de medias de tratamientos, mediante
el método de Tukey.
64
Tabla 26. Resultados del análisis del método de Tukey.
N Media(µM) Agrupación
Enrofloxacina 3 5169 A
Transferosomas de 120 nm 3 329 B
Transferosomas sin carga de 120 nm 3 286 B
Transferosomas de 50 nm 3 256 B
Transferosomas sin carga de 50 nm 3 128 B
Realizado por Loachamin. G
N: Número de réplicas de cada muestra
El valor de las medias del MIC de las muestras ensayadas que no comparten una
letra, son significativamente diferentes.
Los resultados de la tabla 26 muestran que el valor medio del MIC de los
transferosomas y la enrofloxacina en solución son diferentes, siendo los primeros más
eficaces frente a Leishmania mexicana (figura 20).
Las medias del valor de MIC de transferosomas con y sin carga no tuvieron
diferencia estadísticamente significativa; este resultado puede deberse a que el valor del
MIC de los transferosomas sin carga fue calculado utilizando el peso molecular del
sodio desoxicolato (componente de los transferosoma) que es muy similar al de la
enrofloxacina. Siendo necesario determinar si transferosomas con y sin carga tienen el
mismo mecanismo de acción frente a los promastigotes.
Este resultado inesperado además da paso a la realización de nuevas investigaciones
de los transferosomas sin carga como posible tratamiento para Leishmaniasis cutánea.
En la figura 21, se pueden observar las representaciones gráficas de las diferentes
muestras analizadas. Las curvas están dadas en función al logaritmo de la concentración
versus la señal de fluorescencia. Como se puede observar todas las gráficas se ajustan a
la curva de la función de Gompertz.
65
E n ro flo x a c in a
lo g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 1 2 3 4 5
8 0 0 0
1 0 0 0 0
1 2 0 0 0
1 4 0 0 0
1 6 0 0 0
1 8 0 0 0
A n tim o n ia to d e m e g lu m in a
lo g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 2 4 6 8
1 0 0 0 0
1 2 0 0 0
1 4 0 0 0
1 6 0 0 0
1 8 0 0 0
2 0 0 0 0
T ra n s fe ro s o m a s d e e n ro flo x a c in a 5 0 n m
lo g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 1 2 3 4
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
D a ta
T ra n s fe ro s o m a s s in c a rg a 5 0 n m
L o g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 1 2 3 4
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
D a ta
T ra n s fe ro s o m a s d e e n ro flo x a c in a 1 2 0 n m
lo g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 1 2 3 4
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
T ra n s fe ro s o m a s 1 2 0 n m
T ra n s fe ro s o m a s s in c a rg a 1 2 0 n m
L o g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 1 2 3 4
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
Figura 21. Gráficas de log C vs Fluorescencia de las muestras ensayadas. Autora
Loachamin. G
En la figura 22 se pueden observar la comparación de las curvas de todas muestras
analizadas. Apreciándose claramente que la efectividad leishmanicida de los
transferosomas es mayor que la enrofloxacina en solución y la solución de antimoniato
de meglumina.
66
lo g C
Flu
ore
sc
en
cia
0 2 4 6 8
0
1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 0 0
E n ro flo x a c in a
A n tim o n ia to d e m e g lu m in a
T ra n s fe ro s o m a s s in c a rg a 5 0 n m
T ra n s fe ro s o m a s 5 0 n m
T ra n s fe ro s o m a s s in c a rg a 1 2 0 n m
T ra n s fe ro s o m a s 1 2 0 n m
Figura 22. Gráficas de log C vs Fluorescencia de todas las muestras analizadas.
Autora Loachamin. G
67
Capítulo V
Conclusiones y recomendaciones
Conclusiones
Se desarrollaron transferosomas cargados de enrofloxacina por el método de
hidratación de la película delgada, y se los caracterizó en términos de tamaño, índice de
polidispersión, potencial zeta, porcentaje de atrapamiento, liberación de principio
activo y estabilidad física.
En la fase de screening de la formulación, el tamaño de los transferosomas mostró
ser dependiente del tiempo y la amplitud de sonicación, hecho que se consideró en la
etapa de optimización para obtener transferosomas de menor tamaño. Por otra parte, el
potencial zeta de los transferosomas fue dependiente de la interacción fosfolípido
surfactante y pH del buffer.
Se optimizaron las condiciones con las cuales se obtendría la suspensión
transferosomal final, siendo seleccionadas la relación fosfolípido surfactante de 90:10,
cantidad de principio activo de 25 mg, pH del buffer de 7 y sonicación al 33% de
amplitud por 5 minutos
Los transferosomas optimizados que fueron extruidos por los filtros de 13 mm
presentaron un tamaño entre 100 y 120 nm, un índice de polidispersión entre 0,4 y 0,6,
un potencial zeta entre -41 y -45 mV y un porcentaje de atrapamiento de 46,56%. Estos
transferosomas liberaron el 71,75% de droga incorporada según cinética de orden cero
a los 105 minutos, además mostraron ser estables durante al menos cuatro semanas
tanto a 4°C como a temperatura ambiente. Los transferosomas extruidos por filtros de
33 mm presentaron tamaño de 50 nm, índice de polidispersión de 0,2 y potencial zeta
de -39,5 mV.
Se determinó el MIC, NIC e IC50 en promastigotes de Leishmania mexicana para
los transferosomas, enrofloxacina en solución y meglumina antimoniato.
Determinándose que los transferosomas con y sin carga son más efectivos que la
enrofloxacina en solución y que a su vez la enrofloxacina tanto en solución como en
transferosomas es más efectiva que el tratamiento de primera línea.
68
Recomendaciones
Estudiar el efecto de la extrusión múltiple y cambio de diámetro del filtro en la
variación del tamaño e índice de polidispersión de los transferosomas.
Realizar un estudio de la estabilidad química del fosfolípido para determinar la
presencia de endoperóxidos y productos de degradación.
Realizar un estudio de la interacción droga-excipientes mediante análisis de
calorimetría diferencial (DSC).
Estudiar el efecto de las variables de formulación y proceso en el porcentaje de
atrapamiento y la liberación de enrofloxacina de los transferosomas.
Dilucidar el mecanismo de acción de los transferosomas con y sin carga en los
promastigotes de Leishmania mexicana.
Determinar la actividad leishmanicida de los transferosomas en amastigotes de
Leishmania mexicana.
Realizar ensayos de permeabilidad transdermal ex vivo con los transferosomas a
partir de diferentes matrices.
Realizar ensayos in vivo en modelos animales para determinar la actividad
leishmanicida y la toxicidad de los transferosomas administrados por vía transdermal.
69
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74
Anexos
Anexo A. Árbol de problemas
Tratamientos para la leishmaniasis con menor toxicidad y efectos adversos.
Dosis menores para el
tratamiento.
Disminución de la absorción a través de la membrana biológica (piel, mucosas).
La enrofloxacina puede ingresar más fácilmente al parásito.
¿La actividad leishmanicida de los transferosomas de enrofloxacina es mayor que la enrofloxacina en
solución frente a promastigotes de L. mexicana?
Alta permeabilidad de los transferosomas a través de las membranas celulares.
En solución la enrofloxacina se encuentra ionizada en un amplio rango de pH (zwitterion).
75
Anexo B. Diagrama de flujo de la elaboración de los transferosomas
Preparar
Dispersar
Elaboración de transferosomas
SoluciónCloroformo-Metanol 1:1
FOSFOLIPIDO(Lecitina de soya)
HomogenizarVortex
5 min, velocidad 10
CentrifugarCentrifuga
5 min, 4200 rpm
RetirarSobrenadante
AgregarSURFACTANTE
(Sodiodesoxicolato)
HomogenizarVortex
15 s, velocidad 10
Dispersar
PRINCIPIO ACTIVO(Enrofloxacina)
Vortex15 s, velocidad 10
Trasvasar
Evaporar
DispersionBalón de rotavapor
1L
Solventes cloroformo-metanol
Rotavapor10 min, 50°C, 100
rpm, 337 mbar
Agregar
76
Hidratar filmTampón fosfato salino
(pH 7)Rotavapor
1h, 60 rpm, 25°C
ReposarDispersion2 h, temperatura
ambiente
SonicarSonificador33 %, 5 min,
pulso 30 s
ExtruirFiltros de jeringa
0,45 um y 0,22 um
Almacenar4°C, protegida de la
luz
FIN
ReposarFilm formado1 día , temperatura
ambiente
77
Anexo C. Instrumento de recolección de datos
Formulación
Screening
Corrida Tamaño
(nm)
Índice de
polidispersión
Potencial zeta
(mV)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
78
19
20
21
22
23
24
Realizado por Loachamin G
Optimización
Tratamiento Tamaño
(nm)
Índice de
polidispersión
Potencial zeta
(mV)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Realizado por Loachamin. G
79
Actividad leishmanicida
Media de las determinaciones
Transferosomas
de
enrofloxacina
Transferosomas
sin carga
Solución de
enrofloxacina
Solución de
antimoniato de
meglumina
MIC (µM)
NIC (µM)
IC50 (µM)
Realizado por Loachamin.G
80
Anexo D. Resultados pruebas preliminares
FCS: Fosfaditilcolina serina; SDC: Sodio desoxicolato: SLS Sodio lauril sulfato
sonicador de baño sonicador de sonda 33 66
Esencial Forte Tween 80 NO 30 NO NO NO SI SI 6,5 24 238,8 -3,9
Lecitina de soya Tween 80 NO 30 NO NO NO SI SI 6,5 24 195,9 -3,6
NO 30 NO NO NO SI SI 5,6 48 7509,2 -1,9
NO 30 NO NO NO SI SI 6,6 48 10367 -8,7
NO 30 NO NO NO SI SI 7,6 48 235,8 -8,7
FCS Tween 80 NO 30 NO NO NO SI SI 7,6 48 4679,2 -3
NO 30 NO NO NO SI SI 4,5 24 184,9 -1,8
NO 30 NO NO NO NO SI 6,5 48 5365,1 -0,1
NO 30 NO NO NO NO SI 7,5 48 6526,3 -6,5
NO 2 NO NO NO NO NO 6,5 0 126420 -0,1
NO 2 NO NO NO SI SI 6,5 0 28698,4 --
NO 10 NO NO NO NO NO 6,5 0 90537,7 --
NO 10 NO NO NO SI SI 6,5 0 6505,2 --
NO 30 NO NO NO NO NO 6,5 0 41433,4 --
NO 30 NO NO NO SI SI 6,5 0 5032,9 --
NO 30 NO NO NO SI SI 7,5 24 79,9 -15,1
NO 60 NO NO NO SI NO 7,5 24 408,4 --
NO 30 NO NO NO SI SI 7,5 24 98,7 -15,4
NO 60 NO NO NO SI NO 7,5 24 no se leyó --
5 NO NO NO NO 7,5 0 3782,7 -12
10 NO NO NO NO 7,5 0 387,5 --
20 NO NO NO NO 7,5 0 159,8 --
5 SI NO SI SI 7,5 0 122,7 -13,6
10 SI NO SI SI 7,5 0 543,7 --
5 SI SI SI 7,5 0 566,4 --
10 SI SI SI 7,5 0 113,2 --
0 103,5 -12,4
24 433,2 --
0 106,6 -1,6
24 52,2 -3,5
0 41,4 -11,9
24 3783,1 --
0 50,1 -4,3
48 6470,3 -2,2
Filtración
0,22 nmpH
Potencial zeta
(mV)Tipo de fosfolípido Surfactante Vortex (min)
Amplitud de sonicación
(%) Filtración
0,45 nm
Tiempo de reposo
antes de lectura
(horas)
Tamaño
(nm)
Esencial SDC
FCS Tween 80
Esencial Tween 80
Esencial
SDC
SDC:SLS
Lecitina de soya SDC NO
Lecitina de soya SDC 5 NO
5
SI SI 7,5
Lecitina de soya Tween 80 5 NO 5 SI
Lecitina de soya SDC 5 NO 5 SI
FCS SDC 5 NO 5
FCS Tween 80 5 NO 5 NO SI SI 7,5
Tiempo de sonicación (min)
NO SI SI 7,5
SI
NO SI SI 7,5
SI
NO
81
Anexo E. Espectros de los componentes de los transferosomas
Espectro de metanol grado analítico
Espectro de lecitina de soya grado alimenticio en metanol
Espectro sodio desoxicolato en metanol
82
Espectro de enrofloxacina en metanol
Espectro de transferosomas cargados de enrofloxacina
Espectro de transferosomas vacíos
83
Anexo F. Curva de calibración de enrofloxacina en metanol
Concentración
(ppm) Absorbancia
1 0,1002
2 0,2235
3 0,3301
4 0,4488
5 0,5544
7 0,7547
8 0,8368
Realizado por Loachamin.G
y = 0,1055x + 0,0119R² = 0,9974
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ab
sorb
anci
a
Concentracion (ppm)
Concentracion vs Absorbancia
84
Anexo G. Datos obtenidos en el perfil de liberación de la formulación final de transferosomas
Tiempo( min) M1 M2 Solucion M1 corregidaM2 corregida M1(mg/L) M2(mg/L) M1(mg/L) M2 M1 M2 M1 M2 Promedio
5 0,1025 0,1 0,0371 0,0654 0,0629 0,5071 0,4834 1,0141 0,9667 0,10141219 0,0966733 14,83 14,13 14,48
10 0,1301 0,1477 0,0614 0,0687 0,0863 0,5383 0,7051 1,0767 1,4103 0,10766752 0,14102929 15,74 20,62 18,18
15 0,1697 0,1697 0,0852 0,0845 0,0845 0,6881 0,6881 1,3762 1,3762 0,13761729 0,13761729 20,12 20,12 20,12
30 0,2865 0,2499 0,1243 0,1622 0,1256 1,4245 1,0776 2,8490 2,1552 0,28490191 0,21552459 41,65 31,51 36,58
45 0,3662 0,3601 0,1635 0,2027 0,1966 1,8084 1,7505 3,6167 3,5011 0,36167188 0,35010899 52,88 51,19 52,03
60 0,3972 0,4029 0,1652 0,232 0,2377 2,0861 2,1401 4,1721 4,2802 0,41721164 0,4280163 61,00 62,58 61,79
75 0,4409 0,4394 0,1807 0,2602 0,2587 2,3533 2,3391 4,7067 4,6782 0,47066629 0,46782296 68,81 68,40 68,60
90 0,4432 0,458 0,1848 0,2584 0,2732 2,3363 2,4765 4,6725 4,9531 0,46725429 0,4953085 68,31 72,41 70,36
105 0,4479 0,4499 0,1781 0,2698 0,2718 2,4443 2,4633 4,8886 4,9265 0,48886361 0,49265472 71,47 72,03 71,75
120 0,4289 0,43 0,1876 0,2413 0,2424 2,1742 2,1846 4,3484 4,3693 0,4348403 0,43692541 63,57 63,88 63,73
135 0,4218 0,4308 0,1733 0,2485 0,2575 2,2424 2,3277 4,4849 4,6555 0,44848829 0,46554829 65,57 68,06 66,82
150 0,4122 0,3883 0,1778 0,2344 0,2105 2,1088 1,8823 4,2176 3,7646 0,42176097 0,37645721 61,66 55,04 58,35
180 0,3955 0,3854 0,1703 0,2252 0,2151 2,0216 1,9259 4,0432 3,8518 0,40432187 0,38517676 59,11 56,31 57,71
210 0,4033 0,3849 0,2211 0,1822 0,1638 1,6141 1,4397 3,2281 2,8793 0,322813 0,28793479 47,19 42,10 44,65
240 0,3555 0,4004 0,1555 0,2 0,2449 1,7828 2,2083 3,5655 4,4166 0,35655388 0,4416643 52,13 64,57 58,35
270 0,3366 0,3723 0,1444 0,1922 0,2279 1,7088 2,0472 3,4177 4,0944 0,34176855 0,40943986 49,97 59,86 54,91
300 0,3289 0,3174 0,2166 0,1123 0,1008 0,9516 0,8426 1,9031 1,6851 0,19031371 0,16851483 27,82 24,64 26,23
1140 0,2936 0,3754 0,1387 0,1549 0,2367 1,3553 2,1306 2,7106 4,2612 0,27106435 0,42612075 39,63 62,30 50,96
1320 0,3116 0,3642 0,1425 0,1691 0,2217 1,4899 1,9884 2,9798 3,9769 0,29798123 0,39768742 43,56 58,14 50,85
1440 0,2855 0,3416 0,1452 0,1403 0,1964 1,2169 1,7486 2,4339 3,4973 0,24338925 0,34972988 35,58 51,13 43,36
ABSORBANCIA Correcion con diluciónA=0,10551xC+0,01190 mg de pa Abs muestra - Abs solucion % de droga liberado
85
Anexo H. Fotografías del proceso de obtención de los transferosomas
Dispersión de lecitina de soya en solución Centrifugación de la dispersión de lecitina
cloroformo-metanol (1:1) de soya
Suspensión de lecitina de soya centrifugada Formación del film en el balón
86
Hidratación del film con buffer Sonicación de la suspensión
Filtracion de la suspensión transferosomal Suspensión transferosomal final
87
Anexo I. Fotografía del disolutor durante el ensayo de liberación de la droga