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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLOGÌA
ESTUDIO INVITRO DEL EFECTO ANTI FÚNGICO DEL
ACEITE ESENCIAL DEL PELARGONIUM GRAVEOLENS
(GERANIO) AL 25%, 50%, 75% Y 100% SOBRE CEPAS DE
CANDIDA ALBICANS ATCC ® 10231™
Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del
título de Odontóloga
Autora: Navas Ortega Edda Priscila
Tutor: Dr. Guillermo Alberto Lanas Terán
Quito, mayo 2017
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Navas Ortega Edda Priscila en calidad de autora del trabajo de investigación:
“Estudio invitro del efecto anti fúngico del aceite esencial del Pelargonium
graveolens (Geranio) al 25%, 50%, 75% y 100% sobre cepas de Candida
albicans ATCC ® 10231™”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a
hacer uso del contenido total o parcial que me pertenecen, con fines estrictamente
académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en
los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y
su Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización
y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación
Superior.
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Edda Priscila Navas Ortega
C.C. Nº 1311987141
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo, Guillermo Alberto Lanas Terán, en mi calidad de tutor del trabajo de
titulación, modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por EDDA
PRISCILA NAVAS ORTEGA: cuyo título es: “Estudio invitro del efecto anti
fúngico del aceite esencial del Pelargonium Graveolens (Geranio) al 25%,
50%, 75% y 100% sobre cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™”,
previo a la obtención de Grado de Odontóloga: considero que el mismo reúne los
requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y epistemológico, para
ser sometido a la evaluación por parte del tribunal examinador que se designe,
por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con
el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito a los 4 días del mes de mayo del año 2017
--------------------------------------------------
Dr. Guillermo Alberto Lanas Terán
DOCENTE-TUTOR
C.C. Nº 1708044639
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dr. Portilla Yépez William Vicente, Dr. Álvarez
Razo Cristhian Fabián y Dr. Rosero Salas Fabián Giovanny. Luego de receptar la
presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del título de
odontóloga, presentado por la señorita Navas Ortega Edda Priscila
Con el título: “ESTUDIO INVITRO DEL EFECTO ANTI FÚNGICO DEL
ACEITE ESENCIAL DEL PELARGONIUM GRAVEOLENS (GERANIO) AL
25%, 50%, 75% Y 100% SOBRE CEPAS DE CANDIDA ALBICANS ATCC ®
10231™”
Emite el siguiente veredicto APROBADO
Fecha: jueves 4 de mayo del 2017
Para la constancia de lo actuado firman:
Nombre y Apellido Calificación Firma
Presidente Dr. Portilla Yépez William
Vicente
17 ………………..
Vocal 1 Dr. Álvarez Razo Cristhian
Fabián
18 ………………...
Vocal 2 Dr. Rosero Salas Fabián
Giovanny
19 …………………
v
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios, por la salud, paciencia y bendiciones que ha dado a mi
vida y me ha llevado al lugar donde estoy ahora.
A mi padre Enrique Navas, quien desde el cielo ha guiado mi camino y me
acompaña cada momento.
A mi madre Priscila Ortega por su entrega y amor total, que siempre ha dado lo
mejor de ella para que yo pueda ser una profesional.
A mis hermanos, Manuel y Beatriz, quienes nunca me dejaron sola y me han
ayudado de diversas formas durante toda mi vida.
A mis abuelitas Edda y Emma, que siempre se preocuparon por mis estudios y me
dieron sus bendiciones para que pueda salir adelante.
vi
AGRADECIMIENTO
A Dios, por estar junto a mí bendiciendo cada paso que doy y abrir tantas puertas,
por permitirme cumplir una meta más junto a las personas que quiero y sin Él este
trabajo no hubiera sido posible realizar.
A mi familia por apoyarme en cada paso que daba, confiar en mí, alentarme
cuando veía todo imposible, fueron son y serán las personas más importantes de
mi vida, sin ellos yo no sería la misma persona, sé que estén donde estén, siempre
me desearan lo mejor y me ayudaran a superarme como persona y profesional.
A la Facultad de Odontología de la Universidad Central del Ecuador, en donde he
recibido las mejores enseñanzas académicas para convertir de mí en la gran
profesional que anhelo ser, donde además encontré personas extraordinarias, que
compartieron sus conocimientos, no solo en las aulas o área clínica, en los pasillos
y áreas administrativas de toda mi universidad.
A mi director de tesis, Dr. Guillermo Lanas de quien jamás recibí un no por
respuesta, quien siempre estuvo predispuesto a guiarme, a corregirme y darme
palabras de aliento para seguir adelante, porque sin los conocimientos y tutoría de
él mi trabajo no se hubiera desarrollado correctamente.
A mis co-tutores, los químicos Max Bonilla e Isabel Carrillo, quienes guiaron
cada parte del proceso experimental de mi tesis, fueron muy pacientes y amables,
que ahora no son más que dos docentes, son verdaderos amigos.
A todos mis amigos y compañeros de curso y clínicas, con los que siempre me
sentí apoyada y recorrieron conmigo el proceso de educación.
Gracias a todos.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DERECHOS DE AUTOR ...................................................................................... ii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL ......................... iv
DEDICATORIA ..................................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ........................................................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................ vii
LISTA DE TABLAS ............................................................................................ xii
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... xiii
LISTA DE ANEXOS ............................................................................................ xv
RESUMEN ........................................................................................................... xvi
ABSTRACT ........................................................................................................ xvii
CAPITULO I ........................................................................................................... 1
1.1. Introducción .................................................................................................. 1
1.2. Planteamiento del problema ......................................................................... 2
1.3. Objetivos de investigación............................................................................ 3
1.3.1. Objetivo general ............................................................................ 3
1.3.2. Objetivos específicos ..................................................................... 3
1.4. Justificación .................................................................................................. 4
1.5. Hipótesis ....................................................................................................... 4
CAPITULO II ......................................................................................................... 5
2. MARCO TEORICO ......................................................................................... 5
2.1. Fitoterapia ......................................................................................... 5
2.1.1. Aceites esenciales. ..................................................................... 6
2.1.1.1. Grupos funcionales de los aceites esenciales. ....................... 7
2.1.1.2. Métodos de obtención de aceites esenciales ......................... 8
2.1.1.2.1. Hidrodestilación .......................................................... 8
2.1.1.2.2. Pelado o raspado ......................................................... 8
2.1.1.2.3. Enfleurage, enflorado o enfloración ............................ 8
2.2. Geranio .............................................................................................. 8
viii
2.2.1. Familia geraniacea ..................................................................... 9
2.2.1.1. Géneros más importantes ...................................................... 9
2.2.1.1.1. Pelargonium graveolens.................................................. 9
2.2.1.1.1.1. Descripción de la planta ........................................... 9
2.2.1.1.1.2. Hábitat. ..................................................................... 9
2.2.1.1.1.3. Multiplicación. ....................................................... 10
2.2.1.1.1.4. Sinonimia ............................................................... 10
2.2.1.1.1.5. Propiedades y aplicaciones .................................... 10
2.2.1.1.1.6. Principios activos ................................................... 10
2.2.2. Aceite de geranio ..................................................................... 12
2.2.2.1. Propiedades ......................................................................... 13
2.2.2.2. Indicaciones ......................................................................... 13
2.2.2.3. Precauciones. ....................................................................... 14
2.2.2.4. Almacenamiento.................................................................. 14
2.3. Candida ........................................................................................... 14
2.3.1. Tipos ........................................................................................ 15
2.3.2. Reproducción ........................................................................... 15
2.3.3. Factores de virulencia .............................................................. 15
2.3.3.1. Adherencia. ......................................................................... 15
2.3.3.2. Morfología ........................................................................... 16
2.3.3.3. Dimorfismo fenotípico. ....................................................... 16
2.3.3.4. Enzimas hidrolíticas. ........................................................... 16
2.3.3.5. Secreción de aspartil proteasa (sap) .................................... 16
2.3.3.6. Fosfolipasas (fp) .................................................................. 16
2.3.4. Candidiasis ............................................................................... 16
2.3.4.1. Epidemiología ..................................................................... 16
2.3.4.2. Factores de oportunismo. .................................................... 17
2.3.4.2.1. Condiciones de los hongos para el oportunismo. ......... 17
2.3.4.2.2. Factores locales del huésped. ........................................ 17
2.3.4.2.2.1. Factores específicos que afectan la distribución de
candida en la cavidad bucal ....................................... 17
2.3.4.2.3. Factores sistémicos ....................................................... 18
ix
2.3.4.3. Manifestaciones clínicas. .................................................... 19
2.3.4.3.1. Tegumentaria ................................................................ 19
2.3.4.3.1.1. Candidiasis oral o muguet. ..................................... 19
2.3.4.3.1.1.1. Candidiasis oral aguda ......................................... 19
2.3.4.3.1.1.2. Candidiasis oral crónica....................................... 20
2.3.4.3.1.1.3. Candidiasis cutáneo mucosa generalizada ............. 20
2.3.4.3.1.1.4. Diagnóstico ........................................................ 21
2.3.4.3.1.1.5. Tratamiento ........................................................ 22
2.3.4.3.1.2. Candidiasis vulvovaginal. ...................................... 22
2.3.4.3.1.3. Candidiasis intertriginosa ....................................... 22
2.3.4.3.1.4. Candidiasis oniquia o paroniquia ........................... 22
2.3.4.3.1.5. Candidiasis de tipo granulomatoso ........................ 22
2.3.4.3.2. Visceral ......................................................................... 23
2.3.4.3.3. Septicémica ................................................................... 23
2.3.5. Prevención y control de candida albicans ................................ 23
2.4. Antifúngicos .................................................................................... 23
2.4.1. Azoles. ..................................................................................... 24
2.4.2. 5-Flucitosina ............................................................................ 24
2.4.3. Polienos .................................................................................... 24
2.4.3.1. Nistatina .............................................................................. 24
2.4.3.1.1. Estructura química de la nistatina ................................. 25
2.4.3.1.2. Mecanismo de acción de la nistatina ............................ 25
2.4.3.1.3. Espectro antifúngico de la nistatina .............................. 25
2.4.3.1.4. Metabolismo de la nistatina .......................................... 25
2.4.3.1.5. Efectos adversos de la nistatina .................................... 25
2.4.3.1.6. Indicaciones de la nistatina ........................................... 26
2.4.3.1.7. Contraindicaciones de la nistatina ................................ 26
2.4.3.1.8. Dosis de la nistatina ...................................................... 26
CAPÍTULO III ...................................................................................................... 28
3. METODOLOGÍA .......................................................................................... 28
3.1. Diseño de estudio ............................................................................ 28
x
3.2. Sujetos y tamaño de la muestra ....................................................... 28
3.3. Criterios de inclusión y exclusión ................................................... 28
3.3.1. Criterios de inclusión. .............................................................. 28
3.3.2. Criterios de exclusión. ............................................................. 28
3.4. Selección de muestra ...................................................................... 29
3.5. Variables ......................................................................................... 29
3.6. Organización y planificación de la investigación ........................... 30
3.6.1. Recursos materiales ................................................................. 30
3.6.1.1. Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del extracto
oleoso de geranio. .......................................................................... 30
3.6.1.2. Equipos, materiales e instrumental para la evaluación
microbiológica de los extractos. ...................................................... 2
3.6.1.3. Material Biológico................................................................. 2
3.6.1.4. Materiales e instrumentos para eliminación y o desecho de
muestras microbiológicas ................................................................ 2
3.7. Procedimiento de investigación ........................................................ 2
3.7.1. Aceite esencial ........................................................................... 2
3.7.1.1. Extracción del aceite esencial ............................................. 33
3.7.2. Reactivación de la cepa bacteriana .......................................... 35
3.7.2.1. Traspaso de las colonias de Candida albicans ATCC ® 10231™ a
caldo BHI ....................................................................................... 37
3.7.3. Método de difusión en disco, en medio de cultivo agar Muller
Hinton ............................................................................................ 40
3.7.3.1. Agar Muller Hinton. ............................................................ 40
3.7.4. Método de macro dilución en caldo, en caldo BHI (caldo infusión
cerebro corazón) ............................................................................ 44
3.7.4.1. Caldo Infusión Cerebro Corazón......................................... 44
3.8. Manejo de desechos ........................................................................ 48
3.8.1. Manejo de desechos laboratorio de química ............................ 48
3.8.2. Manejo de desechos centro de biología ................................... 48
3.9. Aspectos bioéticos ........................................................................... 48
3.9.1. Riesgos potenciales del estudio ............................................... 49
xi
3.9.2. Beneficios potenciales del estudio ........................................... 49
3.9.3. Idoneidead ética, experticia del investigador, tutor ................ 49
3.9.4. Declaración de conflicto de interés .......................................... 49
CAPITULO IV ...................................................................................................... 50
4.1. Análisis de datos ............................................................................. 50
4.2. Análisis estadístico .......................................................................... 54
4.3. Discusión ......................................................................................... 60
CAPITULO V ....................................................................................................... 64
5. Conclusiones y recomendaciones .................................................................. 64
5.1. Conclusiones ................................................................................... 64
5.2. Recomendaciones ............................................................................ 64
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 65
ANEXOS .............................................................................................................. 71
xii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Resultados del método de difusión en disco ...................................................... 50
Tabla 2 Resultados de ausencia y presencia de crecimiento fúngico .............................. 52
Tabla 3 Concentración mínima inhibitoria y Concentración mínima antifúngica .......... 53
Tabla 4 Pruebas de normalidad ....................................................................................... 55
Tabla 5 Descriptivos ....................................................................................................... 56
Tabla 6 ANOVA ............................................................................................................. 56
Tabla 7 Comparaciones múltiples ................................................................................... 57
Tabla 8 Medidas en mm. Prueba Tukey.......................................................................... 59
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Pétalos de geranio ................................................................................... 33
Figura 2 Equipo de destilación para obtención del aceite ..................................... 34
Figura 3 Obtención del aceite de geranio .............................................................. 34
Figura 4 KWIK-STIK con Agar Sabouraud ......................................................... 35
Figura 5 Cultivo principal con el registro de control de calidad ........................... 35
Figura 6 KWIK-STIK, liberación del líquido hidratante ...................................... 36
Figura 7 KWIK-STIK Trituración del sedimento en el líquido ............................ 36
Figura 8 Hisopado del material hidratado al medio de cultivo ............................. 37
Figura 9 Incubación de la placa del cultivo principal ........................................... 37
Figura 10 Tubos con caldo BHI ............................................................................ 38
Figura 11 Colonias de Candida albicans ............................................................... 38
Figura 12 Esterilización del asa ............................................................................ 39
Figura 13 Toma de colonia con asa estéril ............................................................ 40
Figura 14 Inoculación de colonia de Candida albicans en BHI ............................ 40
Figura 15 Siembra de la Candida albicans en la superficie del agar Muller Hinton
............................................................................................................................... 41
Figura 16 Cajas Petri de agar Muller Hinton inoculadas con Candida albicans ... 42
Figura 17 Discos de papel embebidos en el aceite de geranio concentraciones del
100% 75% 50% 25% ............................................................................................ 42
Figura 18 Discos de papel embebidos en nistatina y suero fisiológico................. 43
Figura 19 Colocación de discos de papel en las cajas Petri de agar Muller Hinton
inoculadas con Candida albicans .......................................................................... 43
Figura 20 Incubación de cajas Petri de agar Muller Hinton inoculadas con
Candida albicans y con los discos impregnados de aceite de geranio .................. 43
Figura 21 Tubos de ensayo con distintas concentraciones de aceite de geranio,
obtenidos del aceite de geranio al 50% ................................................................. 45
Figura 22 Inoculación de 2ml de Candidad albicans para obtener CMI y CMA .. 45
Figura 23 Incubación de tubos con caldo BHI inoculadas con Candida albicans
con aceite de geranio al 50% en concentraciones de 50% al 70% ........................ 46
Figura 24 Asa de digralsky sometida a calor ........................................................ 46
xiv
Figura 25 Inoculación del contenido del tubo de ensayo con BHI C. albicans y
aceite de geranio en caja Petri de agar Muller Hinton ......................................... 47
Figura 26 Siembra con asa de digralsky ............................................................... 47
Figura 27 Incubación de cajas Petri de agar Muller Hinton, para obtención de CMI
CMA ...................................................................................................................... 48
Figura 28 Halos de inhibición con aceite de geranio al 25% ................................ 51
Figura 29 Halos de inhibición con aceite de geranio al 50% ................................ 51
Figura 30 Halos de inhibición con aceite de geranio al 75% ................................ 51
Figura 31 Halos de inhibición con aceite de geranio al 100% .............................. 51
Figura 32 Halo de inhibición con Nistatina, control positivo ............................... 52
Figura 33 Candida albicans con suero fisiológico, control negativo .................... 52
Figura 34 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido de T1 T2
T3 .......................................................................................................................... 53
Figura 35 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido T4 T5 T6
............................................................................................................................... 53
Figura 36 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido T7 T8 T9
............................................................................................................................... 54
Figura 37 Medidas en mm. Prueba Tukey ............................................................ 60
xv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Factura de compra cepa de Candida albicans ATCC ® 10231™ ......71
Anexo 2. Certificado de autenticidad de Candida albicans ATCC ® 10231™ 72
Anexo 3. Certificado de taxonomía de muestra vegetal .....................................73
............................................................................................................................73
Anexo 4. Certificado de centro de biología de la Universidad Central ..............74
Anexo 5. Certificado de Unidad Académica de Química de la Universidad
Central del Ecuador ............................................................................................75
Anexo 6. Normas de bioseguridad .....................................................................76
Anexo 6.1. Manejo de desechos .........................................................................85
Anexo 7. Idoneidead ética, experticia del investigador, tutor ............................88
Anexo 8. Declaración de conflicto de interés .....................................................90
xvi
TEMA: Estudio invitro del efecto anti fúngico del aceite esencial del
Pelargonium graveolens (Geranio) al 25%, 50%, 75% y 100% sobre cepas de
Candida albicans ATCC ® 10231™
Autor: Edda Priscila Navas Ortega
Tutor: Dr. Guillermo Alberto Lanas Terán
RESUMEN
Se determinó el efecto antifúngico mediante un estudio in vitro del aceite esencial
de geranio, aplicado sobre cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™,
mediante el método de difusión en disco. Se elaboró el aceite de geranio al 100%
75% 50% y 25%, se utilizaron 16 cajas Petri con agar Muller Hinton sobre las
cuales se inoculó la levadura Candida albicans ATCC ® 10231™, se colocaron
los discos embebidos de aceite de geranio al “25%, 50%, 75% y 100%”, por cada
concentración se hicieron 3 repeticiones, un control negativo con suero fisiológico
y controles positivos con nistatina; se incubó a 37°C durante 24 horas. A partir del
aceite de geranio al 50%, concentración que dio mayor halo de inhibición se
prepararon 9 concentraciones en el rango de 50%-70%. Posteriormente se inoculó
cada tubo con una suspensión de 0,5 ml de Candida albicans ATCC ® 10231™,
más 0,5 ml de cada concentración de aceite; se incubó a 37 °C durante 24 horas.
Pasadas las 24 horas sembramos cada tubo en una caja Petri de agar Muller
Hinton con asa de digralsky; se incubó a 37 °C por 24 horas. La media de los
halos producidos fue de 16,03 mm 19,93 mm 18,6 mm y 18,66 mm para el aceite
de geranio de 25%, 50% 75% y 100% respectivamente. El aceite de geranio tiene
efecto antifúngico frente a la Candida albicans, produciendo mayores halos de
inhibición al 50%, la concentración mínima inhibitoria es 5,93 mg/ml y la
concentración mínima antifúngica es 5,65 mg/ml
PALABRAS CLAVES: PELARGONIUM GRAVEOLENS, CANDIDA
ALBICANS.
xvii
TOPIC: Anti-fungal effect of the Pelargonium graveolens (Geranium) oil at
25%, 50%, 75% and 100% on Candida albicans ATCC ® 10231™ strains. In
vitro-study.
Author: Edda Priscila Navas Ortega
Tutor: Dr. Guillermo Alberto Lanas Terán
ABSTRACT
Through and in-vitro study, it was determined the anti-fungal effect of the
geranium oil on the strain of Candida albicans ATCC ® 10231™, using the
method of disc diffusion. The geranium oli was elaborated at 100% 75% 50% and
25%, as well as 16 Petri dishes that contained agar Muller Hinton, in which the
yeasts of Candida albicans ATCC ® 10231™ were inoculated. There were put
the discs saturated with geranium oil at 25%, 50%, 75% and 100%. For each
concentration, three repetitions were made, as well as a negative control with
saline solution and positive control with nystatin. It was incubated at 37°C for 24
hours. From the geranium oil, concentrated at 50%, which showed a greater
inhibition, there were prepared 9 concentrations between 50%-70%. Then, each
test tube was inoculated with a suspension of 0.5 ml of Candida albicans ATCC
® 10231™, plus 0.5 ml of each concentration of oil. It was incubated at 37°C
during 24 hours. These were later put in a Petri dish with agar Muller Hinton and
Digralsky Spreader; they were incubated at 37°C for 24 hours. The measures of
the halos produced were 16.03 mm, 19.93 mm, 18.6 mm and 18.66 mm with the
25%, 50% 75% and 100% concentrations, respectively. Geranium oil has an anti-
fungal effect against Candida Albicans, producing greater inhibition halos at 50%.
The minimum inhibitory concentration is 5.93 mg/ml, and the minimum anti-
fungal concentration is 5.65 mg/ml.
KEY WORDS: PELARGONIUM GRAVEOLENS, CANDIDA ALBICANS.
1
CAPITULO I
1.1. Introducción
La Candida es una levadura que posee más de doscientas especies con
características muy diversas. La especie más patógena desde el punto de vista
médico-odontológico es la Candida albicans. (1)
Algunas plantas sintetizan metabolitos secundarios como terpenoides, que actúan
contra Candida albicans. (2)
Los terpenos están hechos de combinaciones de varias unidades a base de 5-
carbono llamados isopreno; el acoplamiento de dos isopreno forma a los
monoterpenos, como el geraniol y linalol. Siendo el geraniol principal
constituyente del aceite de geranio, (3) y presenta actividad contra la C. albicans y
no C. albicans. (2)
Pelargonium graveolens, aquella planta de la que extraeremos el aceite esencial
de geranio, pertenece a la familia geraniácea, es una planta anual o bienal, cuyas
ramas, peciolos foliares y nudos tienen color rojizo. (4)
El objetivo de la investigación fue determinar el efecto anti fúngico mediante un
estudio in vitro del aceite esencial del Pelargonium graveolens (Geranio),
aplicado sobre cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™. A partir de lo cual
encontramos la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima
antifúngica.
El tipo de la investigación es experimental in vitro trasversal
Operamos con cepas de Candida albicans ATCC® 10231™ identificadas
anteriormente por laboratorios Microbiologics e importadas por Medibac – Inc
S.A
Trabajaremos con 100 gramos de Pelargonium graveolens de la provincia de
Pichincha, para extraer 20 ml aceite esencial de geranio, mediante la técnica de
destilación por arrastre de vapor.
2
TIPO DE MUESTRA. Muestreo por conveniencia. Dirigido por Q. Al. Isabel
Carrillo, responsable del área de microbiología, en el Centro de Biología de la
Universidad Central del Ecuador. (3)
El análisis del efecto antifúngico se dio utilizando 4 concentraciones del aceite
esencial de geranio 25%, 50%, 75% y 100%, tres repeticiones de cada una,
utilizando el método de difusión en disco. La concentración que presentó mayor
efecto anti fúngico fue la del 50%, la misma que utilizamos para realizar la prueba
de macrodilución en caldo y obtuvimos la concentración mínima inhibitoria y la
concentración mínima antifúngica.
1.2. Planteamiento del problema
La Candida es una levadura con más de doscientas especies, que poseen
características muy diversas. De todas las especies, la Candida albicans es la
especie más patógena. (1)
La Candida albicans está en la familia Cryptococcaceae. Forma parte de la
microbiota oral, aunque también se la aísla del tracto gastrointestinal. (1)
Los hongos del género Candida provocan lesiones en cualquier órgano o tejido, es
por esto que producirá micosis superficiales y profundas. (1)
A pesar de que el hongo posee factores de virulencia, el hospedador también
aporta causas predisponentes para que se desarrolle la enfermedad. Por lo que a la
candidiasis se la llama también “enfermedad del enfermo”. (5)
Un 25% y 50% de personas sanas, son portadoras del género Candida, en la
microflora normal de la cavidad oral. De las que el 70% y 80% corresponde a la
Candida albicans. (5)
Sabemos que algunas especies del género Candida son resistentes a fármacos
como el fluconazol, por lo que es importante el desarrollo de nuevos antifúngicos.
(2)
Algunas plantas sintetizan variedad de metabolitos secundarios como terpenoides,
isoprenoides que actúan contra Candida albicans. Se han realizado estudios sobre
3
el geranio, cuya aceite esencial muestra poder inhibitorio del crecimiento de
Candida albicans. (2)
Por lo tanto, la principal interrogante de esta investigación es ¿Existe un efecto
anti fúngico del aceite esencial del Pelargonium graveolens (geranio) al 25%,
50%, 75% y 100% sobre “Candida albicans”? y ¿cuál de ellos presenta mayor
efecto anti fúngico?
1.3. Objetivos de investigación
1.3.1. Objetivo general
Determinar el efecto antifúngico mediante un estudio in vitro del aceite esencial
del Pelargonium graveolens (Geranio), aplicado sobre cepas de Candida albicans
ATCC ® 10231™, mediante el método de difusión en disco
1.3.2. Objetivos específicos
o Identificar por el método de difusión en disco la concentración de aceite
esencial del Pelargonium graveolens (Geranio) que presente mayor
efectividad antifúngica al 25%, 50%, 75% y 100% frente a la Candida
albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas.
o Identificar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial
del Pelargonium graveolens (Geranio), por el método de macrodilución en
caldo a partir de la concentración de mayor efectividad antifúngica frente a
la Candida albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas
o Identificar la Concentración Mínima Antifúngica (CMA) del aceite
esencial del Pelargonium graveolens (Geranio), por el método de
macrodilución en caldo a partir de la concentración de mayor efectividad
antifúngica frente a la Candida albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas.
o Comparar los halos de inhibición del aceite esencial del Pelargonium
graveolens (Geranio) y la nistatina frente a la Candida albicans ATCC ®
10231™ a las 24 horas.
4
1.4. Justificación
La candidiasis oral es muy común en el área de salud bucodental, para que se
desencadene, el huésped está relacionado con factores locales y sistémicos.
Factores locales como: pacientes portadores de prótesis dentales, portadores de
aparatología ortodóncica, pacientes con un flujo salival reducido, dietas ricas en
carbohidratos. Factores sistémicos como es el caso de trastornos endócrinos,
inmunosupresión, uso prolongado de antibióticos de amplio espectro y
deficiencias nutricionales. (5)
Tomando en cuenta que la medicina natural pretende enriquecer el conocimiento
terapéutico con un método eficaz e inofensivo, es importante que los
profesionales de salud investiguemos y aportemos con tratamientos naturales, para
beneficio de toda la sociedad. (6)
El geranio es fuente importante en el área médica, de la cual es posible extraer
aceites esenciales, los cuales poseen actividades farmacológicas y biológicas
significativas, incluyendo actividades antioxidantes, antimicrobiana y anti
fúngica. (7)
Comprobar el efecto anti fúngico del aceite esencial del Pelargonium graveolens
sobre la Candida albicans ATCC ® 10231™, abriría un puerta importante en la
investigación, para desarrollar un medicamento a base de medicina natural para
combatir la candidiasis.
1.5. Hipótesis
H1: El aceite esencial del Pelargonium graveolens (geranio) posee efecto anti
fúngico sobre la Candida albicans ATCC ® 10231™
Ho: El aceite esencial del Pelargonium graveolens (geranio) no posee efecto anti
fúngico sobre la Candida albicans ATCC ® 10231™
5
CAPITULO II
2. MARCO TEORICO
2.1. Fitoterapia
La fitoterapia o tratamiento a través de vegetales. El concepto de fitoterapia
implica la utilización de fitofármacos, con el fin de prevenir, atenuar o curar
alguna enfermedad. Los fitofármacos son extractos de plantas, estandarizados y
aptos para el consumo humano. (8)
Los estudios en fitofármacos quieren salvar el conocimiento de la flora medicinal,
para revelar la potencialidad terapéutica y obtener un fitofármaco en las dosis
apropiadas, que el médico pueda prescribir en un sin número de enfermedades. (8)
Indiscutiblemente las plantas medicinales son de gran utilidad en tratamientos
médicos. En efecto la Organización Mundial de la Salud (OMS), en 1975,
comenzó a promover el uso de medicina tradicional. Se pretende que en el año
2020, se consuma en mayor medida los fitofármacos y se administre sólo el 15%
de medicamentos de síntesis química. (8)
Las últimas décadas, se observa un incremento del uso de plantas medicinales en
el Occidente, las cuales son utilizadas en atención primaria en salud y
complemento terapéutico. Creer que los fitofármacos, están orientados en la
población de bajos recursos económicos, es una idea equívoca, ya que en el
occidente la población económicamente favorecida utiliza en gran cantidad
fitofármacos, prefiriéndola ante fármacos sintetizados químicamente, los que
quedan en casos de dolencias más graves. (8)
A pesar de que los fitofármacos, son una alternativa natural, la OMS indica que es
necesario determinar eficacia, dosis adecuada, efectos secundarios, interacciones,
contraindicaciones, que garanticen la calidad del producto fitoterapéutico. (8)
Podemos mencionar algunos beneficios de los fitofármacos como: (8)
6
o Obtención de principios activos de una forma más económica, debido a
que si deseamos conseguir en síntesis química ciertos principios activos,
llevará más tiempo y dinero. (8)
o Acción combinada, en una planta podemos encontrar varios principios
activos que logren mejores resultados terapéuticos. (8)
o Diversidad de efectos, al haber varios principios activos en una planta,
pueden beneficiar a más de un órgano y tratar más de una patología a la
vez. (8)
o Mínima posibilidad de encontrar efectos secundarios. (8)
o No produce desechos tóxicos, ya que los residuos que se producen al
elaborar un fitofármaco son reutilizados como abonos naturales. (8)
Es importante ser conscientes que hay que trabajar bajo normas estrictas de
recolección, manipulación y elaboración del fitofármaco. (8)
La preparación de los productos fitoterapéuticos puede ser de varias formas
como: (8)
o Pulverizar o trocear el vegetal para su utilización, drogas vegetales. (8)
o Adquirir los principios activos por extracción: tinturas, extractos fluidos,
extractos blandos, extractos secos. (8)
o Obtener el principio activo por destilación: aceites esenciales. (8)
No se debe confundir una droga vegetal con una planta medicinal. (8)
Según la OMS, planta medicinal es cualquier planta de la que se puede lograr
fines terapéuticos, a través de sustancias que se encuentren en una o más de las
partes de la planta. (8)
La definición de la OMS para droga vegetal es una parte de la planta que tiene
acciones terapéuticas. (8)
2.1.1. Aceites esenciales.
Los aceites esenciales son sustancias volátiles de compuestos orgánicos que a
través de distintos método físicos, se consiguen de plantas aromáticas. (9)
7
Paracelso médico y paramédico (XVI), introdujo el término aceite esencial,
además que la consideró como la quinta esencia, lo cual propuso Aristóteles 2000
años antes. (10)
Los aceites esenciales empezaron a elaborarse en las farmacias entre los siglos
XVI y XVII, hasta la llegada de las vacunas y antibióticos, por lo que se produjo
un declive en el uso de aceites esenciales. Hasta el siglo XIX, en donde se notó un
incremento de demanda. (10)
El término esencial puede conceptualizarse de dos formas. Si nos referimos a
ácidos grasos, esencial significa “necesario”, como por ejemplo el ácido linoleico
es un ácido graso esencial para el crecimiento y desarrollo de animales. Al hablar
de aceites esenciales, el vocablo “esencial” es un adjetivo de “esencia”. (11)
En el tejido de las semillas, flores, hojas o frutos, específicamente en las glándulas
o espacios intercelulares, se va a almacenar el aceite esencial. (9)
2.1.1.1. Grupos funcionales de los aceites esenciales.
o Cetonas: tuyona, pulegona. Son regeneradores celulares, neurotóxico,
mucolítico. (10)
o Aldehídos: benzoico, cinámico, butanal, propanal. Las propiedades que
posee son: sedativo, espasmolítico y antiviral. (10)
o Ésteres: acetato de linalilo, acetato de geranilo. Acción antifúngica,
sedante y espasmolítico. (10)
o Alcoholes terpenos: linalol, geraniol, citronelol, mentol, nerol.
Antiséptico, actúa contra microorganismos, tonificante y espasmolíticos.
(10)
o Cineol, llamado también eucaliptol, su efecto es expectorante. (12)
o Ácidos: acético, palmítico. (10)
o Fenoles: anetol, eugenol. Irritante, estimula al sistema inmunológico y
antimicrobiano. (10)
8
2.1.1.2. Métodos de obtención de aceites esenciales
2.1.1.2.1. Hidrodestilación
Consiste en la destilación de partes de la planta a través del vapor de agua.
Cuando se da la ebullición y al mezclarse el aceite esencial con el agua, el vapor
de agua arrastra el aceite esencial, pasa por el condensador, se enfría y se separa el
aceite esencial, llamada fase orgánica, del agua, fase acuosa. Como la fase
orgánica es de menor densidad e inmiscible, flota sobre la fase acuosa, lo que hace
fácil la liberación del agua, quedando solo el aceite esencial. (10)
2.1.1.2.2. Pelado o raspado
Este método sirve para obtener el aceite esencial de los cítricos. (10)
Consiste en seccionar la fruta en dos partes, para descartar la pulpa y colocar la
corteza en remojo, de la que se liberarán los aceites esenciales de la corteza,
formando una emulsión. Para obtener el aceite esencial, se coloca la emulsión en
un tanque homogenizador y a un sistema centrífugo para romper la emulsión. (10)
2.1.1.2.3. Enfleurage, enflorado o enfloración
Es un método antiguo, que se utiliza en casos que la cantidad de aceite esencial es
tan bajo que se queda en el agua en métodos como hidrodestilación o en caso de
aceites que son sensibles al calor. (10)
Se utiliza grasa fría compuesta por 1 parte de sebo purificado y 2 partes de
manteca de chancho, estabilizante y alumbre para coagular las impurezas de la
mezcla. La grasa es colocada en placas de vidrio, se raya la grasa con peines de
madera y se colocan los pétalos, se apilan las placas en un sótano. A las 24 u 48
horas se cambian los pétalos, dependiendo cuando las flores empiecen a
marchitarse. Se repite este proceso durante toda la cosecha. Al final la grasa se
coloca en batidoras y se adiciona con alcohol etílico, batiéndola por varios días,
hasta obtener el aceite esencial. (10)
2.2. Geranio
Es una de las plantas con más relevancia y popularidad en los cultivos que se
producen en el mundo. Son utilizados para ornamentar jardineras, balcones y
9
terrazas, existen gran número de géneros, los cuales se han extendido por todas
partes y son valoradas por su floración y agradable olor. (13)
2.2.1. Familia geraniacea
Plantas herbáceas anuales o perennes, arbustos, con pubescencia de pelos
glandulares que contienen aceites esenciales. Hojas simples o compuestas, enteras
o aserradas, opuestas o alternas. (14) Sus flores son solitarias, hermafroditas, con
simetría radial. (15)
Es una familia medianamente representada en la flora ecuatoriana con
especímenes cultivados que tienen utilidad medicinal u ornamental. (15)
2.2.1.1. Géneros más importantes
o Geranium (300-400 spp)
o Pelargonium (250-280 spp)
o Erodium (60-90 spp) (14)
2.2.1.1.1. Pelargonium graveolens
El termino Pelargonium proviene del vocablo griego Pelargos, que significa
cigüeña, debido a la forma de su fruto (16)
2.2.1.1.1.1. Descripción de la planta
Son subarbustos que llegan a crecer 1-1,20 metros de altura, erguida y muy
ramificada. (17)
Hojas: el haz es de color verde oscura y el envés más claro. Son alternas,
pecioladas y lobuladas. (16)
Flores: conglomeradas en falsas umbelas, los colores pueden ser: rosadas, blancas
o violáceas, muy pequeñas. (16)
Frutos: envoltura en donde encontramos semillas muy pequeñas. (16)
2.2.1.1.1.2. Hábitat.
Nativo de Sudáfrica. Cultivado en Madagascar, Marruecos, Francia y España (16)
10
2.2.1.1.1.3. Multiplicación.
o Semillas. Se siembra culminando el invierno, en resina mastic o bajo
vidrio. Para que las plantas sean llevadas al campo deben tener 3 o 4 hojas.
Utilizado para obtener flores de vistosos colores. (16)
o Esquejes: es el método más utilizado que proporciona excelentes
resultados. Los esquejes son tallos fuertes de 20-25 cm de largo con 2-3
nudos, los cuales serán plantados en arena o tierra fértil. (16)
2.2.1.1.1.4. Sinonimia
o Pelargonium roseum
o Geraniospermum terebintaceum (Spreng.) Kuntze
o Geranium graveolens (L'Hér.) Thunb.
o Geranium terebinthinaceum Cav.
o Pelargonium intermedium Kunth
o Geranium barcinonense Sennen
o Geranium briceanum Sweet
o Geranium rubellum Moench
o Robertianum nostrum Goldb.
o Robertiella robertianum (L.) Hanks. (4)
Nombres comunes: geranio rosa, rosa geranio de olor, malva silvestre y
pelargonium rosa perfumado. (4)
2.2.1.1.1.5. Propiedades y aplicaciones
Se podrán realizar decocciones, infusiones y extractos fluidos con las plantas y
hojas, que servirán en gastroenteritis, hemorragias, amigdalitis y diabetes, ya que
poseen propiedades antisépticas, tónicas y astringentes. Incluso las raíces son
astringentes. (16)
2.2.1.1.1.6. Principios activos
Geraniol: Es un alcohol terpeno, tiene propiedades antiinflamatoria y actividad
de fluidificación de la membrana celular de hongos y bacterias (3) (2)
Diversos aceites esenciales y sus componentes se han mostrado como
antibacterianos, antifúngicos, antioxidantes, antitumorales y analgésicos. Las
propiedades antifúngicas se da gracias a los terpenos, los cuales atraviesan la
11
pared celular del hongo y localizan las cadenas de ácidos grasos de la bicapa
lipídica, alterando el embalaje de lípidos, por lo tanto modifican la estructura de la
membrana celular, produciendo perdida del material citoplasmático e inhibición
de la cadena respiratoria. (3)
El geraniol ha presentado excelente actividad contra la C. albicans y C. no
albicans. Dicha actividad no está del todo clara, pero se la relaciona con la
inhibición de la actividad de la enzima HMG-CoA reductasa, la cual es capaz de
bloquear la producción de colesterol y por la detención de las células en la fase S
del ciclo celular. (2)
Otro mecanismo con el que se asocia la actividad contra la C. albicans del
geraniol, nos dice que el geraniol afecta la fluidez y funciones de las proteínas de
la membrana que actúan en el transporte y señalización de sustancias, por lo que
aumenta la sensibilidad de la Candida. (2)
Citronelol: Alcohol terpeno. Se ha reportado que el citronelol tiene gran efecto
contra E. coli y Pseudomonas spp. , sin embargo, aunque en menor proporción
también encontramos efecto frente al crecimiento de C. albicans en este estudio.
El mecanismo de acción se desconoce, pero se cree que es similar que el del
geraniol (2)
Nerol: Pertenece al grupo funcional de alcohol monoterpeno. Se lo puede
encontrar en varias plantas medicinales como Lippia spp y Melissa officinalis.
(18)
Entre sus propiedades terapéuticas podemos mencionar que es utilizado como
agente sedante y espasmolítico. Se han realizado estudios veterinarios en los que
se obtuvieron efectos vasodilatadores en perros, conejos y ratones; además se
detectaron propiedades antineoplásicas y antivirales contra linfoma de pollo y
leucosis aviar en pollos. (18)
Linalol: Es otro componente que forma parte del grupo funcional de alcoholes
terpenos. Se cree que es capaz de inducir el sueño y ser usado como
anticonvulsivo. Además puede utilizarse para tratar las pulgas en animales. (19)
12
Terpenol: Es uno de los alcoholes monoterpenos más extendidos en la naturaleza
podemos encontrarlos en flores como narcisos y fresas, en hierbas como el
orégano y romero, en el árbol de té. (20)
Bórneol: Es un terpeno con olor a alcanfor. Su densidad es mayor que la del agua
y es insoluble en agua. Utilizado en perfumería, alivio de las hemorroides,
analgésico, antibacterial, ayuda el sistema digestivo. (21)
Taninos (10-28%): Sustancias producidas por algunas plantas, de sabor
astringente, lo que les garantiza usos medicinales y veterinarios, tales como
antidiarreicos y antiinflamatorios. (22)
Flavonoides: quercetina. Los flavonoides son pigmentos naturales responsables
de proporcionar color a las plantas. Existen varios beneficios de los flavonoides
en el ser humano, ya que se le atribuyen cualidades antioxidantes, antivirales,
antiinflamatorias y anticancerígenas. Quercetina, es uno de los flavonoides más
activos, que podemos obtenerlas en plantas medicinales, reduce el riesgo
cardiovascular y es anticancerígeno. (23)
Principio amargo (geranina): se encuentra en la raíz del geranio, posee
propiedades astringentes. (4)
Ácidos málicos y cítricos. (4)
2.2.2. Aceite de geranio
El aceite de geranio se obtiene de las distintas especies de geranio que existen,
como por ejemplo del Pelargonium graveolens, Pelargonium odoratissimum,
Pelargonium capitatum y perlagonium fragrans. Este aceite es ocupado en el
norte de África y sur de Europa, principalmente para la perfumería. La
reproducción se da por esquejes. Las fechas en las que se llevan a cabo las
recolecciones son desde abril a junio y desde octubre a noviembre. El geraniol, es
el componente primordial del aceite de geranio. (24)
El color del aceite de geranio va de diversos rangos, dorado, amarillo-dorado,
amarillo, café y verde esmeralda. Se cree que la coloración del aceite dependerá
del origen de la planta. Las plantas originadas de California son verde esmeralda,
13
mientras que aquellas producidas en China darán aceites de color dorado, amarillo
o café. (25)
2.2.2.1. Propiedades
Según Sellar las propiedades del aceite de geranio son:
o Alivia el dolor
o Anticoagulante
o Ayuda a cicatrizar tejidos
o Antidepresivo
o Antiséptico.
o Desodorante
o Hemostático
o Hipoglucémico
o Estíptico
o Vasoconstrictor
o Ayuda en la liberación de toxinas en los riñones y el hígado.
o Antiinflamatorio (26)
o Uso en perfumería. (16)
2.2.2.2. Indicaciones
Muñoz señala que el geranio está indicado para:
o Neuropatía en los diabéticos y dolores neurálgicos de varios tipos.
o Utilizados como flebotónicos en aerosoles para varices y cremas faciales
que disminuyen las venas de hilo, ya que ayudan a estimular la circulación
de la linfa y la sangre.
o Problemas hormonales femeninos, como trastornos menstruales:
menorragia, síndrome premenstrual y síntomas de la menopausia.
o Para estimular el estado de ánimo en casos de tristeza y dolor, en
aromaterapia
o Tienen efecto relajante, calman la ansiedad, inquietud y agitación.
o Sirve como repelente contra insectos.
o Actúa contra infecciones de garganta y boca
14
o Actúa contra el acné, ya que regula la secreción de las glándulas sebáceas.
(16)
2.2.2.3. Precauciones.
El aceite de geranio no es tóxico, por lo que no causa efectos secundarios. No es
irritante, pero puede producir irritaciones en pieles sensibles. (27)
Mujeres embarazadas y mujeres que toman anticonceptivos deben evitar este
aceite, ya que regula el sistema hormonal. (26)
En caso de ingerirlo, es contraindicado para personas con gastritis o úlcera
gástrica, ya que disminuye las mucosidades del sistema digestivo. (26)
2.2.2.4. Almacenamiento.
Los aceites esenciales son sustancias volátiles, por lo que es importante
almacenarlos en frascos de vidrio oscuro que permanezcan completamente
sellados. No debe exponerse a temperaturas extremas, por lo que se recomienda
tenerlos en refrigeración. (27)
Si el aceite esencial se almacena correctamente, su vida útil será de 6 meses hasta
2 años. (27)
2.3. Candida
Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene quitina y β-
glucanos. Cano indica que los hongos en función de la temperatura de crecimiento
se dividen en:
o Termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C)
o Termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C
o Mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C)
o Psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C) (28)
Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Las levaduras crecen en
agregados de células independientes. (28)
El género Candida, pertenece a la familia Crypteococcaceae, de la división
Deuteromycotina. (28)
15
2.3.1. Tipos
La Candida crece como levaduras redondeadas, ovales o con forma de yema de 4
a 6 µm de las más de 150 especies del género Candida, menos de 10 son
patógenos en humanos. (29)
Desde el punto de vista médico-odontológico, la Candida albicans es la especia
más patógena, seguida de: C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis y
otras Candida no albicans. (1)
Candida albicans es uno de los hongos oportunistas más importante, puede crecer
en muchos medios a 37 °C, afecta al hombre endógenamente. Es frecuente en las
mucosas normales de boca, vagina y tubo digestivo. Puede invadir al individuo,
cuando este presenta una baja de defensas. (30)
2.3.2. Reproducción
Candida albicans se reproduce como levadura con gemación mediante la
formación de blastoconidias, puede formar hifas, estimulada por temperatura, pH
y nutrientes. Las hifas en las etapas iniciales, tienen el aspecto de retoños,
denominados tubos germinales. Las seudohifas, son formas elongadas con
restricciones a intervalos, carecen de paredes paralelas y de la tabicación que se
observa en las hifas verdaderas. (29)
2.3.3. Factores de virulencia
2.3.3.1. Adherencia.
La C. albicans puede adherirse al tejido epitelial oral o a dispositivos protésicos u
ortodóncicos. La unión a dichas superficies orales pueden ser específicas y no
específicas, las no específicas implican interacciones hidrofóbicas. En la
superficie de la Candida encontramos moléculas implicadas a la adherencia, que
son las adhesinas. Dichas adhesinas son de gran número e incluyen las
monoproteínas, las adhesinas fibrilares que se unen a los receptores, los cuales son
el componente de la célula huésped con el que la adhesina interactúa. (5)
16
2.3.3.2. Morfología
Pueden crecer en varios estados morfológicos, como gemaciones de la célula de
levadura, pseudohifas e hifas filamentosas, que reduce la probabilidad de
fagocitosis e
2.3.3.3. Dimorfismo fenotípico.
Se refiere a la modificación antigénica a través de frecuentes cambios en la
superficie celular. (5)
2.3.3.4. Enzimas hidrolíticas.
Contribuyen a la destrucción de los tejidos del huésped. (5)
2.3.3.5. Secreción de aspartil proteasa (sap)
Es confuso el papel exacto de esta enzima, sin embargo se conoce la capacidad de
degradar proteínas extracelulares de la matriz del huésped. Se han encontrado 10
diversos genes que codifican para la Candida SAP (5)
2.3.3.6. Fosfolipasas (fp)
Son las enzimas que hidrolizan fosfolípidos en los ácidos grasos. Existen 4 tipos
(A, B, C, D). Se cree que pueden contribuir al daño de la membrana del huésped.
(5)
2.3.4. Candidiasis
Conocida también como la enfermedad del enfermo, ocurre en forma localizada,
que se observa como eritema y placas blanquecinas en tejidos superficiales o
diseminados en tejidos profundos, de manera casi exclusiva en individuos con
inmunosupresión. (29)
Para que se desarrolle la enfermedad, encontraremos factores relacionados con el
huésped, los cuales son locales y sistémicos. (5)
2.3.4.1. Epidemiología
La candidiasis es una enfermedad universal, que ataca al encontrarse con los
factores de oportunismo, sin predilección de género o edad. La candida es un
hongo que está presente en la flora normal de todas las personas, por lo tanto la
vía de entrada es endógena. (31)
17
2.3.4.2. Factores de oportunismo.
2.3.4.2.1. Condiciones de los hongos para el oportunismo.
Bonifaz indica que las condiciones de los hongos para el oportunismo son:
o Tolerar temperaturas de 37°C. (32)
o Efectuar un cambio bioquímico, el hongo necesita captar nuevas enzimas
ya que las condiciones del huésped se vuelven más ricas. (32)
o Poder cambiar de forma, generalmente el hongo reduce su tamaño. (32)
o Poseer los factores de virulencia. (32)
o Relación con el huésped. (32)
2.3.4.2.2. Factores locales del huésped.
o Uso de esteroides inhalados
o Dieta rica en carbohidratos
o Reducción del flujo salival
o Uso de prótesis (5)
2.3.4.2.2.1. Factores específicos que afectan la distribución de
candida en la cavidad bucal
Saliva.
Se ha comprobado que la C. albicans absorbe mucinas salivales, lo cual le facilita
la adhesión a las superficies de acrílico de las prótesis. (33)
pH
La C. albicans coloniza en un medio bucal con pH ácido. (33)
Adherencia
Se cree que para que exista adherencia de la C. albicans, intervendrán los ligandos
de la Candida y los receptores de las células del huésped. (33)
Otros estudios señalan que las blastoporas de la Candida se adhieren mejor a los
materiales plásticos y a las células de la mucosa bucal en la fase exponencial de
crecimiento, lo cual está relacionado con la hidrofobicidad de la superficie celular.
(33)
18
Por otro lado se cree que los cambios hidrofóbicos e hidrofílicos de la C. albicans,
se debe a las variaciones de las proteínas de la capa externa de la pared celular de
la Candida. Las células hidrofóbicas de C. albicans se unirán sin dificultad y
copiosamente a los tejidos del hospedador; mientras que las células hidrofílicas
serán más selectivas, uniéndose a macrófagos. (33)
Las fuerzas de atracción de London-Van der Walls, Fuerzas hidrofóbicas y
fuerzas electrostáticas, son las que explican la adherencia de la C. albicans a
superficies plásticas. Esta adherencia también se puede facilitar por
microorganismos existentes del hospedador. (33)
Bacterias de la cavidad bucal
Jenkinson y colaboradores, pusieron en evidencia que “la coagregación de
Streptococcus sanguis, Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis y
Streptococcus anginousus con C. albicans se incrementa en ausencia de glucosa”.
Los mismos autores comprobaron que con calor o presencia de proteasas, se
destruirá la coagregación ya mencionada. (33)
Hifas.
Varios estudios relacionan a las hifas con la capacidad invasiva de la C. albicans,
debido a que estas segregan proteinasas, las cuales destruyen la integridad de la
mucosa bucal. (33)
Para que exista la transformación de blastosporas a hifas, debe existir una
temperatura de 37 °C a 40°C, ph entre 6,5 y 7. (33)
Enzimas.
La fosfolipasas juega importante papel en la entrada de la C. albicans a las células
epiteliales del hospedador. (33)
Además, en la adherencia e invasión de la Candida, las proteinasas también
intervendrán. (33)
2.3.4.2.3. Factores sistémicos
o Inmunosupresión (5)
19
o Edades tempranas o edades avanzadas (5)
o Deficiencias nutricionales (5)
o Uso prolongado de antibióticos de amplio espectro (5)
o Trastornos endocrinos como diabetes. (5)
o Enfermedades como hepatitis, tuberculosis. (32)
2.3.4.3. Manifestaciones clínicas.
Según Romero, las manifestaciones clínicas de la candidiasis se clasificarán de
acuerdo a su localización, partiremos de tres grandes grupos los cuales son: (31)
o Tegumentaria
o Visceral
o Septicémica (31)
2.3.4.3.1. Tegumentaria
La candidiasis tegumentaria es la más frecuente y menos fatal, dentro de la cual
tenemos: oral, vulvovaginal, intertriginosa, oniquia o paroniquia, cutáneo mucosa
generalizada y granuloma. (31)
2.3.4.3.1.1. Candidiasis oral o muguet.
El paciente presenta lengua blanquecina o lechosa, ya que la formación de una
película o pseudomembrana cubre la lengua, carrillos y paladar. Se manifiesta de
forma aguda en recién nacidos que se contagian en el canal de parto, en madres
que han padecido candidiasis vaginal, en niños con defensas bajas o malnutridos.
La forma aguda y crónica es común en adultos después de tratamientos
antibacterianos prolongados o en diabéticos. (30) (32)
2.3.4.3.1.1.1. Candidiasis oral aguda
Aftas o candidiasis pseudomembranosa. Son placas blancas en la membrana de
la mucosa oral y de la faringe. Común en pacientes sometidos a quimioterapia o
con avitaminosis. (30)
Las pseudomembranas ocurren en la superficie de la mucosa labial y bucal,
paladar duro y blando. Al raspar las lesiones serán removidas, pero se revelará la
mucosa eritematosa subyacente. (5)
20
Clínicamente observamos placas seudomembranosas, blancas y cremosas, con
base eritematosa. El paciente presentará dolor y ardor. (32)
Atrófica aguda. Afectará a los pacientes que han sido sometidos a tratamientos
prolongados con antibióticos. Se encontrará mayormente en la lengua y en menor
grado en el paladar. Produce un intenso ardor y se observaran zonas eritematosas,
erosionadas, con un velo blanquecino. (32)
2.3.4.3.1.1.2. Candidiasis oral crónica
Hiperplásica o “lengua vellosa”. Se puede confundir con la lengua vellosa
producida por el virus de Epstein-Barr, se localizará en los bordes laterales de la
lengua y en la mucosa yugal, con el aspecto de “lengua vellosa” por la
parasitación completa de la lengua; es posible encontrar úlceras y fisuras
dolorosas. Los pacientes fumadores y con VHI-SIDA, pueden originar “lengua
negra vellosa”. (32)
Al intentar remover la lesión mediante raspado se producirá sangrado. (5)
Queilitis angular. Son lesiones eritematosas en las esquinas de la boca. (5)
Clínicamente observaremos placas eritematosas, escamosas y erosionadas. En los
pacientes con VIH-SIDA, linfomas y leucemias se diseminará la infección bucal
hacia la faringe, laringe, esófago y tráquea. (32)
Crónica atrófica o estomatitis subplaca. Es una patología frecuente en pacientes
con prótesis mal adaptadas. Se observa una placa eritematosa bien adherida. (32)
2.3.4.3.1.1.3. Candidiasis cutáneo mucosa generalizada
En este tipo de candidiasis las lesiones se presentaran en la mucosa, así como las
lesiones de candidiasis oral, pero las lesiones serán muy intensas, muy
eritematosas y con características generalizadas como ocurre en la candidiasis
intertriginosa. (31)
Candidiasis eritematosa aguda. Presenta zonas enrojecidas, dolorosas en
mucosa oral, por lo general en el dorso de la lengua. Se cree que pacientes que se
administran antibióticos a largo plazo permiten que aumente la Candida en
número. (5)
21
Candidiasis eritematosa crónica. Asociada a la estomatitis protésica. Presenta
enrojecimiento de la mucosa debajo de la prótesis. Factores asociados son
pacientes con deficiente higiene oral y prótesis mal adaptadas. (5)
Formas secundarias de candidiasis oral.
Glositis romboidal media. Patología relacionada con la inhalación de esteroides y
fumadores. Las papilas filiformes estarán atrofiadas, observaremos un área
simétrica en la línea media del dorso de la lengua. (5)
Conductos radiculares infectados. Aunque las bacterias se encuentran en mayor
cantidad en los conductos radiculares infectados, se ha detectado presencia de
Candida albicans. El uso de antibióticos para tratar estas infecciones, permite la
proliferación de la Candida albicans, lo que es contrarrestado con la irrigación
intraconducto con hipoclorito de sodio al 2,5% o clorhexidina al 2%. (34)
2.3.4.3.1.1.4. Diagnóstico
Para diagnosticar la candidiasis oral podemos observar las características clínicas,
aunque es importante realizar una identificación microbiológica, porque existen
especies que presentan reducida sensibilidad a los antifúngicos más comunes. (5)
Para identificar las especies de Candida, se utilizaran métodos de aislamiento
como: (5)
o Cultivo total de saliva, utilizado en los casos donde no se encuentre una
lesión obvia o el acceso a la lesión es complicado, es un método sensitivo,
se aislaran los organismos viables. Lamentablemente, al realizar la
recolección pueden haber inconvenientes. (5)
o Enjuague oral concentrado, como ocurre en el caso anterior, útil en casos
donde es difícil llegar a la lesión o la lesión no es obvia, es un método
cuantitativo. El inconveniente es que al momento de realizar el enjuague,
algunos pacientes tendrán dificultad. (5)
o Hisopo, utilizado cuando la lesión sea obvia, aislaremos las células
viables, es un método sencillo. (5)
o Frotis. Es un método fácil de utilizar, pero no se determinan las células
viables y no se confirma la identidad de una especie. (5)
22
o Cultivo de la impresión. Utilizado en lesiones delimitadas, es un método
cuantitativo en el que se aislaran las células viables. Es difícil tomar
muestras de algunos sitios. (5)
o Biopsia, método específico para la candidiasis hiperplásica crónica. Es un
método invasivo que no se recomienda utilizar en cualquier candidiasis.
(5)
2.3.4.3.1.1.5. Tratamiento
Para el tratamiento de candidiasis mucosas y cutáneas, se emplearan antifúngicos
del grupo azoles, los cuales encontraremos en lociones, pomadas, cremas tópicas
y supositorios. Solo en infecciones profundas recurriremos a tratamientos
sistémicos, utilizando fármacos como fluconazol. (5)
2.3.4.3.1.2. Candidiasis vulvovaginal.
Formación de una pseudomembrana blanquecina en mucosa vaginal y flujo denso
blanquecino lechoso. La población en riesgo son las mujeres que han sido
sometidas a largos periodos de tratamiento antibiótico, mujeres con bajas defensas
y mujeres diabéticas.
2.3.4.3.1.3. Candidiasis intertriginosa
Afecta a los pliegues cutáneos y de flexión en donde se reserve humedad como
ingle, axila, surco submamario. Clínicamente se observaran placas
eritematoescamosas, con un borde bien definido eritematoso. (31)
2.3.4.3.1.4. Candidiasis oniquia o paroniquia
Afecta al lecho ungueal de la uña. Se observará una pequeña zona eritematosa
alrededor de la uña, con cambios de coloración en la uña, a veces obscura,
negruzca y otras amarillo ocre. (31)
2.3.4.3.1.5. Candidiasis de tipo granulomatoso
Presenta respuesta inflamatoria intensa, debido a que es una micosis más
profunda. Clínicamente notaremos nodulaciones, resecas, amarillentas, que
deforman las regiones que afectan; pueden ser un granuloma o un tipo más
general, a veces circunscritas y otras diseminadas. (31)
23
2.3.4.3.2. Visceral
Generalmente el hongo invade la vía sanguínea produciendo la candidiasis
visceral, casos como: un cuadro broncopulmonar crónico o agudo por Candida
albicans, puede diseminarse al corazón produciendo una endocarditis; en tipos
subagudos puede generar meningitis, encefalitis o meningoencefalitis. (31)
Otros tipos de candidiasis visceral más frecuente son la urinaria y las candidiasis
del área del pañal. (31)
2.3.4.3.3. Septicémica
La candidiasis septicémica o candidemia es aquella en la que encontramos al
hongo en la sangre con o sin envolvimiento visceral. Por estar el hongo en la
sangre se pueden colonizar muchos órganos, provocando la formación de
múltiples microabscesos. La candidemia es una causa frecuente de sepsis en
pacientes hospitalarios, producido por el uso indiscriminado de antibióticos de
amplio espectro, catéteres intravenosos, procedimientos quirúrgicos que no
respetan normas de bioseguridad, uso de corticoesteroides, uso de drogas
inmunosupresivas. (35)
2.3.5. Prevención y control de candida albicans
Es importante reconocer como podemos combatir la Candida albicans, para evitar
posibles infecciones. Los desinfectantes utilizados serán: hipoclorito de sodio al
1%, glutaraldehido al 2%, formaldehido; además presentará sensibilidad
moderada frente al etanol al 70%. La inactivación física se da por calor húmedo a
121 °C durante 15 minutos. (36)
2.4. Antifúngicos
El desarrollo de los antifúngicos no es tan avanzado como se ve en antibióticos,
una de las causas es el reciente descubrimiento que tienen los hongos en el
desarrollo de patologías y la dificultad de crear un agente eficaz, que actúe sobre
el hongo sin toxicidad sobre las células eucariotas. (5)
Se ha registrado resistencia de los hongos frente a los antifúngicos, la cual puede
ser por la prolongada exposición del antifúngico a la levadura, resistencia
24
inherente; o una resistencia propia del hongo, sin que haya existido previa
exposición del antifúngico, resistencia intrínseca. (5)
2.4.1. Azoles.
Los azoles inhiben la enzima lanosterol 14-α-desmetilasa dependiente del
citocromo P450. Esta enzima interviene en la transformación del lanosterol en
ergosterol, al ser inhibida, se trastornará la síntesis de la membrana celular del
hongo. Los azoles son excelentes fungistáticos, los más usados son fluconazol e
itraconazol, que son bien absorbidos en intestinos por lo que su administración es
por vía oral. (37) (5)
2.4.2. 5-Flucitosina
Esta droga se fija al hongo a mediantes una permeasa de la citosina, la cual se
transformará en 5-fluorouracilo, el cual se une a la molécula de ARN y detendrá la
elaboración de proteínas y síntesis de ADN del hongo. (5)
2.4.3. Polienos
Son aquellos que causan la salida de los componentes celulares, debido a que
interactúan con el ergosterol, el cual va a crear poros en la membrana celular. Los
polienos tienen el espectro más amplio de la actividad antifúngica, los principales
son anfotericina B y nistatina. Los polienos no se absorben a través de los
intestinos, por lo que son utilizados tópicamente, los encontramos en suspensiones
y pastillas. (5)
2.4.3.1. Nistatina
La nistatina fue descubierta en el año 1954, muy útil en el tratamiento contra
infecciones por hongos, específicamente contra la candidiasis bucafaríngea o
vaginal. (38)
La nistatina es un antimicótico derivado de la fermentación del Streptomyces
noursei. Se encuentra dentro de la clasificación de antibióticos polienos, al igual
que la anfotericina B. Siendo los antibióticos poliénicos aquellos que presentan
numerosos enlaces dobles en su estructura química. (39)
25
2.4.3.1.1. Estructura química de la nistatina
Los polienos son moléculas anfipáticas, es decir sus estructuras poseen funciones
opuestas. Presentan una región hidrofílica, formada de anillos macrólidos; una
región hidrofóbica, donde encontraremos cuatro enlaces covalentes conjugados
(tetraeno), propio de la nistatina. (40)
2.4.3.1.2. Mecanismo de acción de la nistatina
Muestran afinidad por el ergosterol presente en los hongos, que es el principal
esterol en la membrana de las células de los mamíferos. (41)
La unión de los polienos con el ergosterol afectará la permeabilidad de la
membrana tanto en células en crecimiento como en reposo, los componentes
celulares saldrán y se producirá muerte del microorganismo. (40)
La nistatina es fungistática, con acción fungicida en concentraciones altas. Es
demasiado tóxica si se utiliza sistémicamente, ya que al estar unidas células
humanas con los hongos, producirá que la célula humana pierda contenidos
celulares y potasio intracelular. (42)
2.4.3.1.3. Espectro antifúngico de la nistatina
Será limitado a las infecciones muco cutáneas producidas por Cándidas spp. en
especial C. albicans. (40)
Estudios in vitro demuestran que los siguientes hongos son susceptibles a la
nistatina: “Guilliermondii candida, Candida Krusei, Lacti geotrichum”. (42)
2.4.3.1.4. Metabolismo de la nistatina
A pesar de poderse administrar por vía oral, este fármaco tiene poca absorción en
el aparato gastrointestinal, de igual manera no habrá absorción en grado
significativo a través de piel o mucosas. (38)
2.4.3.1.5. Efectos adversos de la nistatina
El principal efecto adverso es su sabor desagradable, náuseas, vómitos, dolor
abdominal y diarrea. La nistatina tiene poca toxicidad. (38) (42)
Al ser usada tópicamente puede producir irritación en piel y mucosas. (40)
26
Ya que algunas formulaciones de la nistatina tienen sacarosa, se pueden encontrar
casos de hiperglucemia. (42)
2.4.3.1.6. Indicaciones de la nistatina
Utilizada en el tratamientos de candidiasis bucofaríngea, gastrointestinal, vaginal,
cutánea y mucocutánea. (43)
Útil en la candidiosis del recién nacido, lactante e inmunodeprimido. (44)
2.4.3.1.7. Contraindicaciones de la nistatina
Está contraindicado en pacientes con hipersensibilidad al fármaco. (43)
Pacientes con hipersensibilidad al parabeno, ya que la nistatina tiene
propilparabeno y metilparabeno. (42)
Es necesario tener cuidado en pacientes diabéticos ya que presentaciones de la
nistatina tiene sacarosa. (42)
En pacientes embarazadas, la nistatina oral tiene categoría C y los óvulos
vaginales categoría D. (42)
2.4.3.1.8. Dosis de la nistatina
La encontramos en forma de tabletas o líquidos para administración bucal o
vaginal, y como ungüento o crema para uso tópico o vaginal. (38)
En odontología, la nistatina se aplica de a manera tópica y es la segunda elección,
después del clotrimazol, contra estomatitis por: dentaduras postizas y la asociada
con antibióticos. (39)
Casos de candidiasis orofaríngea.
Adultos y niños: El paciente debe realizarse colutorios con 4-6 ml de suspensión
de nistatina de 100000 U/ml, reteniendo la suspensión por unos segundos y luego
eliminarlo. Se realizaran 4 veces al día, hasta dos días después que la lesión haya
desaparecido clínicamente. (34)
Infantes: cuatro veces al día de 200000 U PO de nistatina o cuatro veces al día
100000 U aplicado en cada lado de la boca. (42)
27
Neonatos: 100000 U PO 4 veces al día o 50000 U en cada lado de la boca 4 veces
al día. (42)
Candidiasis cutánea / mucocutánea.
Adultos y niños: aplicar 2-3 veces al día, la nistatina en polvo, pomada o crema de
100000 U durante 2 semanas. La lesión debe estar seca y sin vendajes. (42)
Candidiasis vaginal
Un ovulo intravaginal de 100000 U una vez al día durante 14 días. (42)
Candidiasis oftálmica.
Adultos: inyección subconjuntival o aplicación local de nistatina. (42)
28
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1. Diseño de estudio
La investigación es experimental in vitro, debido a que existe una manipulación
artificial y pruebas controladas.
3.2. Sujetos y tamaño de la muestra
Operamos con cepas de Candida albicans ATCC® 10231™ identificadas
anteriormente por laboratorios Microbiologics e importadas por Medibac – Inc
S.A. (ANEXO 1 Y 2)
Trabajamos con 100 gramos de pétalos de Pelargonium graveolens de las
provincias de Pichincha, para extraer 20 ml aceite esencial de geranio (ANEXO 3)
Para el método de difusión en disco, utilizamos 16 cajas Petri con agar Muller
Hinton inoculados con Candida albicans ATCC ® 10231™, realizamos 3
repeticiones para cada concentración obtenida del aceite esencial de geranio, 25%,
50%, 75% y 100, 3 repeticiones para la nistatina, la cual fue control positivo y 1
repetición para el control negativo con suero fisiológico. Usamos 3 repeticiones,
tomando de referencia estudios ya realizados. (3)
3.3. Criterios de inclusión y exclusión
3.3.1. Criterios de inclusión.
o Replicaciones de cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™
o Cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™ que no hayan tenido
contacto con ningún tipo de reactivo o medicamento.
o Aceite esencial del Geranio del tipo Pelargonium graveolens
3.3.2. Criterios de exclusión.
o Cepas de hongos que no sean Candida albicans ATCC ® 10231™
o Cepas de hongos incapaces de restablecerse en el medio de cultivo.
29
o Aceites esenciales de Geranio que no pertenezca al Pelargonium
graveolens
3.4. Selección de muestra
Muestreo por conveniencia. Dirigido por Q. Al. Isabel Carrillo, responsable del
área de microbiología, en el Centro de Biología de la Universidad Central del
Ecuador.
3.5. Variables
Variables Definición
operacional
Indicadores
categoricos
Escalas Estandarización
Dependiente
Efecto anti
fúngico
Medir halos
de inhibición.
Halos de
inhibición en
mm
Numérica –
Cuantitativa.
En
milímetros
Dirigido por
Q. Al. Isabel
Carrillo,
responsable
del área de
microbiología,
en el Centro
de Biología de
la Universidad
Central del
Ecuador.
Independiente
Aceite esencial
de
Pelargonium
graveolens
(geranio)
25% 50%
75% 100%.
(2)
Mínima
Concentración
Inhibitoria.
(CMI)
Mínima
Concentración
Antifúngica.
(CMA)
Ordinal
Nominal
Dirigido por
Q. Al. Isabel
Carrillo,
responsable
del área de
microbiología,
en el Centro
de Biología de
la Universidad
Central del
Ecuador.
Nistatina 100.000 U Mínima Numérica – Dirigido por
30
. (19) Concentración
Inhibitoria.Halos
de inhibición en
mm
Mínima
Concentración
Antifúngica.
Cuantitativa.
Ordinal
Nominal
Q. Al. Isabel
Carrillo,
responsable
del área de
microbiología,
en el Centro
de Biología de
la Universidad
Central del
Ecuador.
3.6. Organización y planificación de la investigación
Recursos humanos
Personal del laboratorio del Centro de Biología de la Universidad Central del
Ecuador, bajo consentimiento del Coordinador del Centro, Dr. Franklin
Gavilánez, dirigido por Q. Al. Isabel Carrillo responsable del Área de
Microbiología y el Blgo. Richard Cabezas responsable del Área de Botánica.
Personal de la Unidad Académica de Química de la Universidad Central del
Ecuador tutoreado por Quim. Max Bonilla.
3.6.1. Recursos materiales
3.6.1.1. Equipos, materiales e instrumental para la elaboración del
extracto oleoso de geranio.
o Matraces de fondo plano de
500ml
o Una columna de destilación
o Refrigerante.
o Conectores de vidrio silicato
borado.
o Trampa de agua
o Mangueras para entrada y
salida de líquido
o Cocineta o mechero
o Embudo de separación
o Dos varillas agitadoras
o Matraz Erlenmeyer de 150 y
250 ml
o Pipetas de 1ml
o Puntas de pipeta
o Goteros
o Reactivos: geranio
o Diclorometano
o Glicerina 100%
2
o Tween 65, 75, 85 o Estufa de Evaporización
3.6.1.2. Equipos, materiales e instrumental para la evaluación
microbiológica de los extractos.
o Cabina de bioseguridad tipo
II.
o Incubadora
o Refrigeradora
o Matraz de Erlenmeyer
o Placas Petri
o Pinzas estériles
o Mechero
o Lámparas de alcohol.
o Tubos de ensayo
o Gradilla
o Micropipeta
o Puntas de pipetas estériles
o Papel filtro de tamaño de
poro de 50 micrómetros.
o Discos de papel filtro
estériles de 6 mm de diámetro
o Guantes
o Gorro desechable
o Mascarilla
o Hisopos estériles
o Gasas
o Reactivos.
o Aceite esencial de geranio al
25%, 50%, 75% y 100%
o Nistatina
o Suero fisiológico
o Agua destilada
o Agar Muller Hinton
o Caldo de Infusión Cerebro
Corazón
o Emulsificante neutro tween
veinte
3.6.1.3. Material Biológico
o Cepas de Candida albicans ATCC® 10231™
3.6.1.4. Materiales e instrumentos para eliminación y o desecho de
muestras microbiológicas
o Autoclave
o Bolsas rojas
o Recipientes herméticos para material descartable corto punzante
o Cuarto de depósito de desechos contaminados.
3.7. Procedimiento de investigación
3.7.1. Aceite esencial
33
Se recolectaron 100 gramos de pétalos de geranio, las cuáles se llevaron a la
estufa en la Unidad Académica de Química de la Universidad Central del
Ecuador, para secar las plantas.
Figura 1 Pétalos de geranio
Fuente: Autora. Elaboración: Propia
3.7.1.1. Extracción del aceite esencial
El procedimiento para la extracción del aceite se hizo mediante la técnica de
destilación por arrastre de vapor o método directo es una técnica que separa
sustancias orgánicas insolubles en agua y ligeramente volátiles, de otras no
volátiles. (47)
Esta técnica se emplea a menudo para separar aceites esenciales de tejidos
vegetales, los aceites esenciales están almacenados en glándulas, conductos,
sacos, o simplemente reservorios dentro del vegetal. Los aceites esenciales son
productos naturales aplicados en diferentes industrias, como son la farmacéutica,
alimenticia, en perfumería, entre otros usos. (48)
Procedimiento.
1. Se colocó agua destilada y pétalos de geranio en el matraz no. 1, donde se
generó vapor. En el matraz no. 2 se colocaron los pétalos de geranio y
agua destilada. (48)
34
Figura 2 Equipo de destilación para obtención del aceite
Fuente: Autora. Elaboración: Unidad Académica de Química UCE
2. Se sometió a ebullición el matraz no. 1, para generar vapor del matraz no.
2, para extraer el aceite esencial, inmediatamente el aceite fue arrastrado
por el vapor de agua. Se suspendió el calentamiento cuando obtuvimos 20
ml de volumen destilado. (48)
Figura 3 Obtención del aceite de geranio
Fuente: Autora. Elaboración: Unidad Académica de Química UCE
35
3. De este destilado se extrajo totalmente el aceite esencial colocando en el
embudo de separación el destilado y separando la mayor parte de la
fracción acuosa. (48)
4. Además se diluyó el aceite puro para obtener concentraciones del aceite al
“25%, 50%, 75% y 100%”. La extracción del aceite fue dirigida y
supervisada por el Químico Max Bonilla, que trabaja en del departamento
de la Unidad de Química de la Universidad Central del Ecuador
3.7.2. Reactivación de la cepa bacteriana
1. Sin abrir la bolsa KWIK-STIK™ se dejó que se equilibre a temperatura
ambiente. Posteriormente se abrió la bolsa por la muesca y retiró la unidad
KWIK-STIK™. (49)
Figura 4 KWIK-STIK con Agar Sabouraud
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
2. Se sacó la lengüeta para retirar la etiqueta y se la colocó en la placa del
cultivo principal o el registro de control de calidad. (49)
Figura 5 Cultivo principal con el registro de control de calidad
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
36
3. Se apretó la ampolla en la parte superior de KWIK-STIK™ situado en la
tapa y se liberó el líquido hidratante. (49)
Figura 6 KWIK-STIK, liberación del líquido hidratante
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
4. Se sujetó en posición vertical y golpeó sobre una superficie dura para que
fluya de líquido a través del eje hacia la parte inferior de la unidad que
contiene el sedimento. Se dejó que el líquido hidratante fluya a través del
eje del hisopo y hacia la parte inferior de la unidad que contiene el
sedimento. (49)
5. Se trituró el sedimento en el líquido hasta que la suspensión del sedimento
fue homogénea. (49)
Figura 7 KWIK-STIK Trituración del sedimento en el líquido
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
37
6. En seguida se saturó bien el hisopo en el material hidratado y se transfirió
a un medio de cultivo con agar. (49)
Figura 8 Hisopado del material hidratado al medio de cultivo
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
7. Se utilizó un método de desecho de riesgo biológico adecuado para
descartar KWIK-STIK™. (49)
8. Inmediatamente se incubó la placa del cultivo principal inoculado a la
temperatura y las condiciones adecuadas para los microorganismos. (49)
Figura 9 Incubación de la placa del cultivo principal
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
3.7.2.1. Traspaso de las colonias de Candida albicans ATCC ® 10231™
a caldo BHI
1. Se preparó 4 tubos con caldo BHI (28)
38
Figura 10 Tubos con caldo BHI
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
2. Se tomó las cajas Petri, sembradas hace 24 horas, donde notamos el
crecimiento de las colonias de Candida albicans. (28)
Figura 11 Colonias de Candida albicans
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
3. Se esterilizó un asa al rojo vivo. (28)
39
Figura 12 Esterilización del asa
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
40
4. Se enfrió el asa en el agar y con ella se tomó una colonia del hongo. (28)
Figura 13 Toma de colonia con asa estéril
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
5. Se llevó la colonia al interior del BHI.
Figura 14 Inoculación de colonia de Candida albicans en BHI
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
6. Se incubó durante 24 horas a una temperatura de 37°C.
3.7.3. Método de difusión en disco, en medio de cultivo agar Muller
Hinton
3.7.3.1. Agar Muller Hinton.
Fórmula
o Infusión de carne 300 gr.
o Ácidos de Casamino, técnicos 17,5 gr.
o Almidón 1,5 gr.
41
o Agar 17 gr. (50)
Preparación. El medio se rehidrató, suspendiendo 38 gramos de él en 1000 ml de
agua destilada, se calentó hasta el punto de ebullición para que se disuelva por
completo. Se esterilizó con 16 cajas Petri en la autoclave durante 15 minutos a 15
libras de presión (121°C). Se llevó a la cabina de bioseguridad tipo II en donde se
distribuyó el medio en las cajas Petri. (50)
Siembra de cajas de Petri Agar Muller Hinton.
1. Se prepararon 16 cajas Petri con agar Muller Hinton. (51)
2. Con hisopos estériles se tomaron la muestra de una colonia de levadura
Candida albicans ATCC ® 10231™. (51)
3. Se inoculó la muestra haciendo una siembra en superficie, que consistió
en depositar 0,1 ml de la levadura Candida albicans ATCC ® 10231™,
en la superficie del agar. (28)
Figura 15 Siembra de la Candida albicans en la superficie del agar Muller Hinton
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
42
4. Se esperó de 2 a 3 minutos a que se seque el inóculo. (28)
Figura 16 Cajas Petri de agar Muller Hinton inoculadas con Candida albicans
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
5. Con la ayuda de pinzas estériles, se colocó en cada placa los respectivos
discos (un disco por placa) embebidos cada uno con 4 ml del aceite
esencial del geranio a concentraciones de “25%, 50%, 75% y 100%”,
por cada concentración se hicieron 3 repeticiones, además tuvimos un
control negativo con suero fisiológico y un control positivo con
nistatina. (28)
Figura 17 Discos de papel embebidos en el aceite de geranio concentraciones del 100% 75% 50% 25%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
43
Figura 18 Discos de papel embebidos en nistatina y suero fisiológico
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 19 Colocación de discos de papel en las cajas Petri de agar Muller Hinton inoculadas con Candida
albicans
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
6. Se invirtieron las cajas con la base hacia arriba y las incubamos a 37°C
durante 24 horas. (28)
Figura 20 Incubación de cajas Petri de agar Muller Hinton inoculadas con Candida albicans y con los
discos impregnados de aceite de geranio
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
44
3.7.4. Método de macro dilución en caldo, en caldo BHI (caldo infusión
cerebro corazón)
3.7.4.1. Caldo Infusión Cerebro Corazón.
Fórmula
o Infusión con cerebro de ternero 200 gr.
o Infusión con corazón de buey 250 gr.
o Proteosa y pepetona de Difco10 gr.
o Dextrosa 2 gr.
o Cloruro sódico 5 gr.
o Fosfato sódico 2,5 gr. (50)
Preparación. El medio se rehidrató, disolviendo 9,25 gramos de Infusión Cerebro
Corazón en 250 ml de agua destilada. Se esterilizó por 15 minutos a 5 libras de
presión (121°) junto a los 10 tubos de ensayo necesitados. Se llevó a la cabina de
bioseguridad tipo II en donde distribuimos el medio en los tubos de ensayo. (50)
Siembra en tubos de ensayo Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI).
En esta prueba se realizaron varias diluciones del aceite esencial en el caldo,
utilizando la concentración de aceite de geranio de 50% ya que fue la de mayor
efectividad en la prueba de difusión en disco; después se agregó la levadura
Candida albicans ATCC ® 10231™, (52)
1. En este método se utilizaron 10 tubos de ensayo que contienen Caldo de
Infusión Cerebro Corazón. Al ser el aceite de geranio al 50% el que dio los
mejores resultados se diluyó en forma seriada desde 50%, 52,5%, 55%,
57,2%, 60%, 62,5%, 65%, 67,5%, 70%. (52)
45
Figura 21 Tubos de ensayo con distintas concentraciones de aceite de geranio, obtenidos del aceite de
geranio al 50%
Fuente: Autora. Elaboración: Unidad Académica de Química (UCE)
2. El tubo número 10 no tuvo aceite esencial de geranio, utilizándose como
control de crecimiento. Siendo el tubo 9 el de 70%, hasta llegar al tubo 1
el de 50%. (52)
3. Posteriormente se inoculó cada uno de los tubos 0,5 ml de Candida
albicans ATCC ® 10231™. (52)
Figura 22 Inoculación de 2ml de Candidad albicans para obtener CMI y CMA
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
46
4. Consecutivamente se colocó 0,5 ml del aceite de geranio se incubó a 37 °C
durante 24 horas. (52)
Figura 23 Incubación de tubos con caldo BHI inoculadas con Candida albicans con aceite de geranio al
50% en concentraciones de 50% al 70%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Posteriormente se procedió a inocular 9 cajas Petri de agar Muller Hinton con el
contenido de cada tubo de ensayo con asa de digralsky para observar el número de
colonias que crecen en cada caja y determinar CMI y CMA.
1. Se esterilizó el asa de digralsky, primero se sumergió en un poco de agua,
luego en alcohol y finalmente se sometió a calor con un mechero y se deja
enfriar. (28)
Figura 24 Asa de digralsky sometida a calor
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
47
2. Se colocó 0,5 ml del contenido del tubo de ensayo con BHI inoculado con
C. albicans y aceite de geranio, en el centro de la caja Petri de agar Muller
Hinton. (28)
Figura 25 Inoculación del contenido del tubo de ensayo con BHI C. albicans y aceite de geranio en caja
Petri de agar Muller Hinton
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
3. Se extendió los 0,5 ml del contenido del tubo de ensayo con BHI
inoculado con C. albicans y aceite de geranio, con el asa de digralsky por
toda la superficie del agar. (28)
Figura 26 Siembra con asa de digralsky
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
48
4. Se incubaron las cajas Petri durante 24 horas a 37 °C. (28)
Figura 27 Incubación de cajas Petri de agar Muller Hinton, para obtención de CMI CMA
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
3.8. Manejo de desechos
3.8.1. Manejo de desechos laboratorio de química
Una vez realizada la extracción del aceite esencial de geranio, se procedió a
enfriar el equipo de destilación; se recogió el residuo sólido producto de lo
obtenido anteriormente; se lo recolectó en funda de papel, se lo revisó
organolepticamente constatando que es desecho orgánico celulocico, que se lo
podrá ocupar como abono natural.
3.8.2. Manejo de desechos centro de biología
El manejo de desechos en el Centro de Biología, se realizó en base al Manual de
Bioseguridad en el Laboratorio de la OMS. (ANEXO 6.1)
3.9. Aspectos bioéticos
Según el Registro Oficial N° 279, al ser un estudio que será ejecutado en el Centro
de Biología y la Unidad de Química de la Universidad Central del Ecuador en
condiciones controladas, sin compromiso de seres vivos, únicamente de cepas
biológicas que crecen en un ambiente controlado y con materiales e instrumental
de laboratorio estandarizados, no es necesario un consentimiento informado.
49
3.9.1. Riesgos potenciales del estudio
No existen riesgos potenciales, porque se siguieron las normas de bioseguridad,
utilizadas en el Centro de Biología de la Universidad Central del Ecuador en base
al Manual de Bioseguridad en el Laboratorio de la OMS. (ANEXO 6)
3.9.2. Beneficios potenciales del estudio
Los beneficios directos serán para los profesionales odontólogos, ya que se
proporcionará un estudio cualitativo sobre el uso del aceite esencial de geranio útil
en tratamientos contra la Candida albicans, al mismo tiempo este estudio abrirá
puertas para investigaciones posteriores con el fin de obtener un medicamento a
base de aceite esencial de geranio. Además la población en general y en especial
los pacientes que tengan afecciones causadas por la Candida albicans, serán los
beneficiarios indirectos, porque tendrán información para combatir dichas
afecciones a través del aceite esencial de geranio; también existirá contribución a
grupos delimitados como pacientes alérgicos a los medicamentos que se usan para
tratar las infecciones ocasionadas por Candida albicans y los pacientes portadores
de Candida albicans resistente a fármacos ya existentes en el mercado. Por otro
lado, gracias a este estudio se implementará el uso de preparaciones herbarias en
el Ecuador.
3.9.3. Idoneidead ética, experticia del investigador, tutor
Se detallará en el Anexo 7
3.9.4. Declaración de conflicto de interés
Se detallará en el Anexo 8
50
CAPITULO IV
4.1. Análisis de datos
A las 24 horas de incubar a 37°C las 14 cajas Petri de agar Muller Hinton
inoculadas con Candida albicans ATCC ® 10231™ y con los discos impregnados
de aceite de geranio al 25% 50% 75% 100%, se observó el crecimiento de la
levadura en la superficie del agar y fue posible realizar las mediciones de los halos
de inhibición que produjo el aceite de geranio en cada concentración.
Tabla 1 Resultados del método de difusión en disco
MÉTODO DE DIFUSIÓN EN DISCO
ACEITE DE
GERANIO
HALOS mm RESISTENTE
<14mm
INTERMEDIO
14mm-17mm
SENSIBLE
≥18mm R1 R2 R3 Media
25% 17,9
mm
14,1
mm
16,1
mm
16,03
mm
X
50% 21,9
mm
19,8
mm
18,1
mm
19,93
mm
X
75% 19,8
mm
18,1
mm
18,1
mm
18,66
mm
X
100% 19,8
mm
18,1
mm
118,1
mm
18,66
mm
X
NISTATINA 24,1
mm
23,1
mm
25,2
mm
24,1
mm
X
SUERO
FISIOLÓGICO
0 mm X
R1= Repetición 1, R2= Repetición 2, R3= Repetición 3
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
51
Figura 28 Halos de inhibición con aceite de
geranio al 25%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 29 Halos de inhibición con aceite de
geranio al 50%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 30 Halos de inhibición con aceite de
geranio al 75%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 31 Halos de inhibición con aceite de
geranio al 100%
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
52
Figura 32 Halo de inhibición con Nistatina,
control positivo
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 33 Candida albicans con suero
fisiológico, control negativo
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Para determinar la CMI y la CMA, se sembró en medios de cultivo agar Muller
Hintong con asa digralsky, el contenido del caldo BHI inoculado con Candida
albicans y las concentraciones de aceite de geranio que van de 50%-70%,
rotuladas como T1-T9.
Tabla 2 Resultados de ausencia y presencia de crecimiento fúngico
ACEITE DE
GERANIO
PRESENCIA
CRECIMIENTO
AUSENCIA DE
CRECIMIENTO
50% X
52,5% X
55% X
57,5% X
60% X
62,5% X
65% X
67,5% X
70% X
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
53
Tabla 3 Concentración mínima inhibitoria y Concentración mínima antifúngica
ANTIFÚNGICO C. albicans
CMI CMA
Aceite de geranio % mg/ml % mg/ml
52,5 5,93 50 5,65
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 34 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido de T1 T2 T3
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Figura 35 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido T4 T5 T6
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
54
Figura 36 Cajas Petri con Agar Muller Hinton inoculadas con contenido T7 T8 T9
Fuente: Autora. Elaboración: Centro de Biología UCE
Al observar las Cajas Petri con Agar Muller Hinton, se determinó que a menor
concentración de aceite de geranio, hubo mayor inhibición contra la C. albicans.
Por lo tanto la concentración mínima inhibitoria corresponde a la concentración
de aceite de geranio de 52,5%, que se encontraba en la caja Petri de Agar Muller
Hinton inoculada con el contenido T2 y la concentración mínima antifúngica
corresponde a la concentración de aceite de geranio al 50%, que se encontraba en
la caja Petri de Agar Muller Hinton inoculada con el contenido T1.
4.2. Análisis estadístico
Prueba de Normalidad:
Primeramente se debe verificar que las muestras tomadas provienen de una
población con distribución Normal, esto se realiza con las pruebas de
Kolmogorov - Smirnov o con la prueba de Shapiro - Wilk (menor a 20 datos).
Si las muestras provienen de poblaciones con distribución normal entonces se
realizan pruebas paramétricas (media, desviación estándar): T student, ANOVA.
Si las muestras No provienen de poblaciones con distribución normal entonces se
realizan pruebas no paramétricas (orden, signos): Mann Whitney, Kruskal Wallis,
Wilcoxon
Hipótesis a demostrar
Ho: Las muestras provienen de poblaciones con distribución Normal
55
Ha: Las muestras NO provienen de poblaciones con distribución Normal
Advertencias
SUERO FISIOLÓGICO es constante.
Tabla 4 Pruebas de normalidad
Pruebas de normalidad
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
ACEITE GERANIO 0.25 ,181 3 . ,999 3 0,942
ACEITE GERANIO 0.50 ,195 3 . 0,996 3 0,884
ACEITE GERANIO 0.75 ,385 3 . 0,750 3 0,000
ACEITE GERANIO 1.00 ,385 3 . 0,750 3 0,000
NISTATINA ,179 3 . 0,999 3 0,948
gl: grados de libertad
Sig. nivel de significación dela prueba
Estadístico: valor calculado en la prueba
Según la prueba de Normalidad de Shapiro-Wilk, la mayor cantidad de valores del
nivel de significación (Sig.) son superiores a 0,05 (95% de confiabilidad) luego
aceptamos Ho, esto es las muestras provienen de poblaciones con distribución
Normal, entonces procedemos a realizar pruebas paramétricas para la
comparación de medias, en este caso ANOVA.
En este tipo de casos con pocos datos un solo valor puede cambiar de prueba
paramétrica a no paramétrica, se hace por mayoría de muestras que cumplen Ho.
56
Estadístico descriptivo
Tabla 5 Descriptivos
Tabla 6 ANOVA
ANOVA
MEDIDAS mm
Suma de cuadrados gl Media cuadrática F Sig.
Entre grupos 1054,509 5 210,902 123,254
0,000 Dentro de grupos 20,533 12 1,711
Total 1075,043 17
Descriptivos
MEDIDAS mm
N Media
Desviación
estándar
Error
estándar
95% del intervalo de
confianza para la media
Mínimo Máximo
Límite
inferior
Límite
superior
ACEITE DE
GERANIO 25% 3 16,033 1,9009 1,0975 11,311 20,755 14,1 17,9
ACEITE DE
GERANIO 50% 3 19,933 1,9035 1,0990 15,205 24,662 18,1 21,9
ACEITE DE
GERANIO 75% 3 18,667 0,9815 0,5667 16,228 21,105 18,1 19,8
ACEITE DE
GERANIO 100% 3 18,667 0,9815 0,5667 16,228 21,105 18,1 19,8
NISTATINA 3 24,133 1,0504 0,6064 21,524 26,743 23,1 25,2
SUERO
FISIOLÓGICO 3 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
Total 18 16,239 7,9522 1,8744 12,284 20,193 0,0 25,2
57
De la prueba Anova, el valor del nivel de significación es de 0,00 este valor es
inferior a 0,05 (95% de confiabilidad), luego alguna de las medias no es similar a
las demás, para verificar cual no es similar se realiza la prueba de Tukey que
relaciona dos a dos las muestras.
Pruebas post hoc
Tabla 7 Comparaciones múltiples
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: MEDIDAS mm
HSD Tukey
(I)
SUSTANCIAS (J) SUSTANCIAS
Diferencia
de medias
(I-J)
Error
estándar Sig.
95% de intervalo de confianza
Límite
inferior
Límite
superior
ACEITE DE
GERANIO 25%
ACEITE DE
GERANIO 50% -3,9000 1,0681 0,031 -7,488 -,312
ACEITE DE
GERANIO 75% -2,6333 1,0681 0,209 -6,221 ,954
ACEITE DE
GERANIO 100% -2,6333 1,0681 0,209 -6,221 ,954
NISTATINA -8,1000 1,0681 0,000 -11,688 -4,512
SUERO
FISIOLÓGICO 16,0333 1,0681 0,000 12,446 19,621
ACEITE DE
GERANIO 50%
ACEITE DE
GERANIO 25% 3,9000 1,0681 0,031 ,312 7,488
ACEITE DE
GERANIO 75% 1,2667 1,0681 0,835 -2,321 4,854
ACEITE DE
GERANIO 100% 1,2667 1,0681 0,835 -2,321 4,854
NISTATINA -4,2000 1,0681 0,019 -7,788 -,612
SUERO
FISIOLÓGICO 19,9333 1,0681 0,000 16,346 23,521
58
ACEITE DE
GERANIO 75%
ACEITE DE
GERANIO 25% 2,6333 1,0681 0,209 -,954 6,221
ACEITE DE
GERANIO 50% -1,2667 1,0681 0,835 -4,854 2,321
ACEITE DE
GERANIO 100% ,0000 1,0681 1,000 -3,588 3,588
NISTATINA -5,4667 1,0681 0,003 -9,054 -1,879
SUERO
FISIOLÓGICO 18,6667 1,0681 0,000 15,079 22,254
ACEITE DE
GERANIO
100%
ACEITE DE
GERANIO 25% 2,6333 1,0681 0,209 -,954 6,221
ACEITE DE
GERANIO 50% -1,2667 1,0681 0,835 -4,854 2,321
ACEITE DE
GERANIO 75% ,0000 1,0681 1,000 -3,588 3,588
NISTATINA -5,4667 1,0681 0,003 -9,054 -1,879
SUERO
FISIOLÓGICO 18,6667 1,0681 0,000 15,079 22,254
NISTATINA ACEITE DE
GERANIO 25% 8,1000 1,0681 0,000 4,512 11,688
ACEITE DE
GERANIO 50% 4,2000 1,0681 0,019 ,612 7,788
ACEITE DE
GERANIO 75% 5,4667 1,0681 0,003 1,879 9,054
ACEITE DE
GERANIO 100% 5,4667 1,0681 0,003 1,879 9,054
SUERO
FISIOLÓGICO 24,1333 1,0681 0,000 20,546 27,721
SUERO
FISIOLÓGICO
ACEITE DE
GERANIO 25% -16,0333 1,0681 0,000 -19,621 -12,446
ACEITE DE
GERANIO 50% -19,9333 1,0681 0,000 -23,521 -16,346
59
ACEITE DE
GERANIO 75% -18,6667 1,0681 0,000 -22,254 -15,079
ACEITE DE
GERANIO 100% -18,6667 1,0681 0,000 -22,254 -15,079
NISTATINA -24,1333 1,0681 0,000 -27,721 -20,546
Los valores marcados indican diferencias entre ese par de muestras, se resume en
el siguiente cuadro:
Subconjuntos homogéneos
Tabla 8 Medidas en mm. Prueba Tukey
MEDIDAS mm
HSD Tukey
SUSTANCIAS N
Subconjunto para alfa = 0.05
1 2 3 4
SUERO FISIOLÓGICO 3 0,000
ACEITE DE GERANIO 25% 3 16,033
ACEITE DE GERANIO 75% 3 18,667 18,667
ACEITE DE GERANIO 100% 3 18,667 18,667
ACEITE DE GERANIO 50% 3 19,933
NISTATINA 3 24,133
Sig. 1,000 ,209 ,835 1,000
Lo que indica la prueba dos a dos es que el suero fisiológico está muy por debajo
de las otras sustancias con un valor de cero, luego sigue un grupo donde el valor
más bajo es ACEITE DE GERANIO 25, le sigue otro grupo con valores más altos
donde el valor alto es el ACEITE DE GERANIO 50%, y al final muy por encima
de estos grupos está el que contiene a la NISTATINA
60
Figura 37 Medidas en mm. Prueba Tukey
En el Figura de bigotes no se observan puntos atípicos dentro de las muestras
4.3. Discusión
La eficacia del aceite de geranio frente a la C. albicans, ya ha sido comprobada en
estudios realizados anteriormente, los cuales utilizaron métodos distintos para
llegar a estos resultados, como Zore et al 2009, quien analizó compuestos del
aceite de geranio: geraniol, acetato de geranilo, citronelol, los cuales tuvieron
excelentes resultados contra la C. albicans, incluso se probaron contra la C.
albicans resistente a fluconazol, teniendo resultados favorables. Con nuestro
estudio no comprobamos que dichos compuestos realizaron el efecto antifúngico,
ya que utilizamos el aceite de geranio, sin fraccionar ni separar algún principio
activo en especial, por lo que sería importante hacer un estudio que determine los
principios activos del P. graveolens, y los porcentajes en los que se encuentran
cada uno de ellos.
La concentración mínima inhibitoria que obtuvimos fue de 5,93 mg/ml que
discrepa en gran medida con la concentración mínima inhibitoria del estudio
realizado por Özçelik et al 2010, la cual fue 8µg/ml (0,008 mg/ml), sin embargo
debemos tomar en cuenta que la especie y extracto utilizada en este estudio es
distinto al nuestro. Los extractos utilizados en este estudio fueron alcohólicos y
61
acuosos de las raíces de Geranium pyrenaicum, se obtuvieron disolviendo dichos
extractos con dimetil sulfóxido (DMSO), la cual es una sustancia altamente polar
empleada como disolvente en sustancias fungicidas no solubles en agua, Akram
2008 realizó un estudio del dimetil sulfóxido, en el cual demuestra que inhibe el
crecimiento de C. albicans, concluyó que esta sustancia puede producir un efecto
aditivo o causar sinergismo al mezclarlo con un fungicida. Hazan 2013, también
demostró que el dimetil sulfóxido inhibe el crecimiento de levadura candida,
concluye que adicionar DMSO puede proporcionar CMI engañosa. En nuestro
estudio usamos aceite de geranio al 100% y solo adicionamos tween 20, para
obtener las concentraciones necesarias, por lo que damos fe que el efecto
antifúngico producido en nuestro estudio se debe únicamente al efecto del aceite
de geranio.
Radulovi´c, et al 2010, determinó concentración mínima inhibitoria utilizando los
aceites esenciales de dos especies más de geranio. Geranium columbinum L. 0,437
mg/ml del aceite obtenido de las partes aéreas de la planta, 1,75 mg/ml del aceite
obtenido de las raíces de la planta y 0,837 mg/ml del aceite de G. lucidum L.
Además, la concentración mínima antifúngica también fue determinada, siendo
1,75 mg/ml para el aceite de las partes aéreas del G. columbinum L., 3,50 mg/ml
de aceite de la raíz del G. columbinum L. y 3,35 mg/ml del aceite de G. lucidum L.
Los resultados en este estudio, se acercan más al de nuestro estudio, sin embargo
aún notamos diferencia, por lo que es importante acotar que también utilizaron
DMSO para obtener las distintas concentraciones del aceite. Conjuntamente se
investigó los componentes que se encontraban en cada aceite, encontrando
diferencias dentro de la misma planta, como es el caso del aceite de G.
columbinum obtenido de las partes aéreas y de las raíces de la planta, esto es de
gran importancia, debido a que si encontramos distintos componentes en la misma
planta entre especies los componentes variaran en mayor medida, lo que se
reflejará en los resultados de cada especie frente a la levadura.
Muhammad Ismail et al 2012, trabajó con extracto crudo de G. wallichianum, con
el cual obtuvo halos de inhibición de 40 mm, el doble de la media de los halos
obtenidos en nuestro estudio con el aceite de P. graveolens al 50%. Asimismo
62
determinó la concentración mínima inhibitoria del extracto crudo de G.
wallichianum, de 110,8 µm/ml (0,1108 mg/ml). En este caso como en los
anteriores notamos diferencias significativas, ya que se trabajó con extracto crudo
y no con aceite esencial. El extracto se elaboró macerando las hojas de la planta
con metanol durante 15 días. Una vez obtenido el extracto crudo, también se
mezcló con DMSO.
Es claro que la presencia del dimetil sulfóxido y la utilización de otra especie, con
otra clase de extracto, producirán resultados variables. La combinación de los
principios activos del geranio, más la unión de otras sustancias como el DMSO,
producirán inhibición en la C. albicans, en mayor grado, que la inhibición
producida por los principios activos puros del geranio. Otro punto a tomar en
cuenta es la especie del geranio utilizada, si bien es cierto tienen los mismos
principios activos, la cantidad de dichos principios variará en cada especie y en
cada parte de la misma planta, como se da el caso en el G. columbinum. Esto
afectará en gran medida la eficacia antifúngica.
Pombo et al (2016) evaluó el espectro antimicrobiano y la composición química
del aceite esencial del Pelargonium odoratissimum, encontrando una
concentración mínima inhibitoria <3,9 µm/ml frente a la C. albicans. El autor
realizó la comparación química de 3 aceites esenciales del P. odoratissimun, el
primer aceite obtenido de cultivos en Bogotá, donde encontró 12,69% de geraniol,
compuesto de mayor porcentaje en este aceite; el segundo aceite de República
Checa, con 24,86% de β –citronelol seguido de 12,50% de geraniol y el tercero de
una especie de Brasil presentaba 96,8% de metileugenol. Estos resultados indican
como varían los porcentajes de principios activos de acuerdo al sitio donde fue
cultivada la planta, puedo acotar que no conocemos las condiciones en las que
fueron cultivadas las plantas ni el tiempo en las que se recolectaron; factores que
van a producir variaciones del efecto antifúngico.
A pesar de que los datos obtenidos en nuestro estudio difieren con los de estudios
anteriores, coinciden que el aceite de geranio indistintamente de la especie a la
que pertenezca, producirá inhibición en mayor o menor concentración en la C.
albican, por lo que no podemos descartar las posibilidades de realizar más
63
estudios en diversos microorganismos y otras especies de geranio que
encontramos en Ecuador y por qué no, utilizar otro extracto, que no sea aceite de
geranio, ya que es claro que de acuerdo a la especie y tipo de extracto utilizados,
los valores de los resultados van a variar.
64
CAPITULO V
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
o Se comprobó que el aceite esencial de geranio tiene efecto antifúngico,
aplicado sobre cepas de Candida albicans ATCC ® 10231™,
mediante el método de difusión en disco
o Se identificó que el aceite esencial de geranio al 50% es el que
presenta mayor efectividad antifúngica en relacionas a las otras
concentraciones 25%, 75% y 100% frente a la Candida albicans
ATCC ® 10231™ a las 24 horas.
o Se determinó que el aceite de geranio al 52,5% frente a la Candida
albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas corresponde a la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).
o Se determinó que el aceite de geranio al 52,5% frente a la Candida
albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas corresponde a la
Concentración Mínima Antifúngica (CMA).
o Se comprobó que el halo de inhibición de la nistatina es mayor en
relación a los halos de inhibición del aceite esencial de geranio frente
a la Candida albicans ATCC ® 10231™ a las 24 horas.
5.2. Recomendaciones
o Realizar estudios sobre el aceite de geranio como potenciador de
antimicóticos, ya existentes en el mercado.
o Hacer comparaciones del aceite de geranio sobre cepas de Candida
albicans que presenten resistencia a medicamentos utilizados en
candidiasis.
o Ampliar estudios del aceite de geranio frente a otros microorganismos que
afecten la salud oral de los pacientes.
o Utilizar diversos extractos del geranio y comparar dichos extractos sobre
la Candida albicans.
65
BIBLIOGRAFÍA
1. Negroni M. Microbiología Estomatológica. Fundamentos y guía práctica.
Segunda ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2009.
2. Zore G, Thakre A, Karuppayil , Karuppayil M. Evaluation of anti-Candida
potential of geranium oil constituents against clinical isolates of Candida
albicans differentially sensitive to fluconazole: inhibition of growth,
dimorphism and sensitization. Mycoses. 2010 Diciembre; 54.
3. Marcos-Arias C, Eraso E, Madariaga L, Quindós G. In vitro activities of
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71
ANEXOS
Anexo 1. Factura de compra cepa de Candida albicans ATCC ®
10231™
72
Anexo 2. Certificado de autenticidad de Candida albicans ATCC ®
10231™
73
Anexo 3. Certificado de taxonomía de muestra vegetal
74
Anexo 4. Certificado de centro de biología de la Universidad Central
75
Anexo 5. Certificado de Unidad Académica de Química de la
Universidad Central del Ecuador
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Anexo 6. Normas de bioseguridad
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Anexo 6.1. Manejo de desechos
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Anexo 7. Idoneidead ética, experticia del investigador, tutor
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Anexo 8. Declaración de conflicto de interés
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