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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

INGENIERÍA AGRONÓMICA

Contenido de flavonoides totales y actividad antioxidante en inflorescencias, hojas y tallos de plantas endémicas: Verbena litoralis

Kunth y Duranta triacantha Juss

Quito DM, 2019

Trabajo de titulación previo a la obtención del título de Ingeniera Agrónoma

AUTORA: Tipantuña Guamán Claudia Soraya

TUTOR: Dr. Edgar Patricio Ruiz Guerra

COTUTORA: MSc. Borja Espín Dayana Paulina

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AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, Claudia Soraya Tipantuña Guamán, en calidad de autora y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN INFLORESCENCIAS, HOJAS Y TALLOS DE PLANTAS ENDÉMICAS: Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, modalidad Presencial, de conformidad con el Art, 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art, 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

_________________________

Claudia Soraya Tipantuña Guamán

C.C. 1722656277

[email protected]

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APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi calidad de tutor del Trabajo de Titulación, presentado por CLAUDIA SORAYA TIPANTUÑA GUAMÁN, para optar por el Grado de Ingeniera Agrónoma, cuyo título es: CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN INFLORESCENCIAS, HOJAS Y TALLOS DE PLANTAS ENDÉMICAS: Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometidos a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 2 días del mes de octubre de 2019

________________

Dr. Edgar Patricio Ruiz Guerra

DOCENTE – TUTOR

C.C. 0602520819

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CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL CO TUTOR

Yo, DAYANA PAULINA BORJA ESPÍN en calidad de co tutora del trabajo de investigación titulado CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN INFLORESCENCIAS, HOJAS Y TALLOS DE PLANTAS ENDÉMICAS: Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, elaborado por la estudiante CLAUDIA SORAYA TIPANTUÑA GUAMÁN de la Carrera de Ingeniería agrónoma, Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador.

En la ciudad de Quito, a los 2 días del mes de octubre de 2019.

____________________

MSc. Dayana Paulina Borja Espín

CI: 1710993849

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CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN INFLORESCENCIAS, HOJAS Y TALLOS DE PLANTAS ENDÉMICAS: Verbena

litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss

INFORME CORREGIDO Y APROBADO PARA GRADO ORAL

Dr. Edgar Patricio Ruiz Guerra _______________________

TUTOR DE LA INVESTIGACIÓN

Dra. Dayana Paulina Borja Espín, MSc. _______________________

COTUTORA DE LA INVESTIGACIÓN

Ing. Agr. Aida Hipatia Arteaga, MSc. _______________________

PPRESIDENTE DEL TRIBUNAL

Ing. Agr. Valdano Leopoldo Tafur, MSc. _______________________

PRIMEL VOCAL DEL TRIBUNAL

Ing. Agr. Venancio Saúl Arahana Bonilla, PhD. _______________________

SEGUNDO VOCAL DEL TRIBUNAL

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DEDICATORIA

Con mucho cariño, para las personas que son mi fuente de inspiración en este arduo camino por culminar.

A la persona que más admiro por su bondad, inteligencia, ternura que me orientó y me enseñó a persistir con entusiasmo y optimismo, diciéndome las palabras justas y necesarias en el momento preciso, para mi madre Gloria.

A mi tía Lourdes que indudablemente sin sus consejos y enseñanzas no hubiese llegado a culminar este proceso, siendo una segunda madre a la que también admiro por su comprensión y apoyo en lo que fuese posible.

Para mi padre Marco que con su bondad y comprensión siempre me estuvo apoyándome y su originalidad me hace ser un ser fabuloso.

Y finalmente a Leandro que fue mi cómplice de momentos y situaciones complicadas e irrealizables, que, con su ternura y bondad, paciencia e inocencia, me enseñó a perseguir mis aspiraciones e ideales a través de sus sabias palabras, siempre estuvo dándome su apoyo incondicional para superar todas las dificultades por las que pase.

Claudia Soraya Tipantuña Guamán.

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AGRADECIMIENTO

A la honorable Universidad Central del Ecuador, prestigiosa institución que me permitió formarme académicamente.

Para todas aquellas personas que de una u otra forma me dieron la confianza para que pueda realizar este trabajo de investigación, personas que siempre creyeron en mis virtudes y habilidades, contribuyendo en mi formación, tanto profesional como personal, reciban mi más sincero reconocimiento.

Dr. Edgar Ruiz director de este trabajo de investigación, por la magnífica orientación y apoyo, tanto científica como moral, laboriosa dedicación, al estar todo el tiempo pendiente de cada avance, convirtiéndose en un consejero, que siempre estuvo dispuesto a ayudar en todo momento.

Dra. Dayana Borja MSc, cotutora de este este trabajo de investigación, por ser mi mentora, a quien le viviré agradecida eternamente, por todo el apoyo ético, moral, emocional, sobre todo en su extraordinaria guía, y calidad humana, su sabiduría, paciencia, y por todos los conocimientos impartidos, y por todos aquellos consejos que me brindo día a día, convirtiéndose en una persona a quien admiro y admiraré eternamente.

Al laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas Universidad Central del Ecuador y al Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública – INSPI, les agradezco por haberme hecho partícipe de uno de sus grandes proyectos de investigación.

A Lisbeth, quien, es una gran persona, que siempre estuvo apoyándome y guiándome mediante la tenacidad de sus palabras en el momento preciso, con quien compartí experiencias maravillosas, brindándome su amistad sincera e incondicional.

Quiero agradecerle a mi mejor amigo Dorado, por ser mi guía, orientación, fuente de inspiración y ser un apoyo emocional en este camino de aprendizaje; que, con su inocencia, sensatez, paciencia y sabiduría me enseñó a perseverar a través de su ternura.

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Índice de contenidos

1 Introducción.............................................................................................................. 1

2 El problema ............................................................................................................... 3

2.1 Planteamiento del problema ............................................................................. 3

2.2 Justificación ........................................................................................................ 3

2.3 Objetivos ............................................................................................................ 4

2.3.1 Objetivo General ......................................................................................... 4

2.3.2 Objetivos específicos .................................................................................. 4

2.4 Hipótesis............................................................................................................. 4

2.4.1 Hipótesis nula (Ho) ..................................................................................... 4

2.4.2 Hipótesis alternativa (Ha) ........................................................................... 4

3 Revisión de Literatura ............................................................................................... 5

3.1 Países megadiversos .......................................................................................... 5

3.2 Especies endémicas ........................................................................................... 6

3.2.1 Definición .................................................................................................... 6

3.2.2 Importancia................................................................................................. 6

3.3 Especies en estudio ............................................................................................ 6

3.3.1 Verbena litoralis Kunth ............................................................................... 6

3.3.2 Duranta triacantha Juss .............................................................................. 7

3.4 Compuestos bioactivos de las plantas ............................................................... 8

3.4.1 Compuestos del metabolismo primario ..................................................... 8

3.4.2 Compuestos del metabolismo secundario ................................................. 8

3.5 Métodos de análisis de metabolitos secundarios ........................................... 15

3.5.1 Métodos de extracción de metabolitos secundarios de plantas ............. 15

3.5.2 Introducción a los métodos espectrométricos ......................................... 16

3.5.3 Métodos de cuantificación de flavonoides .............................................. 19

3.5.4 Métodos para la determinación de la actividad antioxidante ................. 20

4 Materiales y métodos ............................................................................................. 21

4.1 Ubicación.......................................................................................................... 21

4.1.1 Ubicación política y geográfica del lugar de recolección de muestras .... 21

4.1.2 Ubicación política y geográfica del Laboratorio de Productos Naturales 21

4.2 Materiales ........................................................................................................ 21

4.2.1 Material vegetal ........................................................................................ 21

4.2.2 Materiales para recolección de muestras ................................................ 21

ix

4.2.3 Equipos ..................................................................................................... 22

4.2.4 Materiales de laboratorio ......................................................................... 22

4.2.5 Reactivos ................................................................................................... 22

4.3 Métodos ........................................................................................................... 23

4.3.1 Recolección e identificación de la muestra .............................................. 23

4.3.2 Selección, limpieza y desinfección ........................................................... 23

4.3.3 Secado....................................................................................................... 23

4.3.4 Molienda ................................................................................................... 23

4.3.5 Almacenamiento del material vegetal ..................................................... 24

4.3.6 Obtención del extracto etanólico de inflorescencias, hojas y tallos de Duranta triacantha Juss y Verbena litoralis Kunth. ................................................ 24

4.3.7 Separación de clorofila de los extractos hidroalcohólicos ....................... 24

4.3.8 Cuantificación de Flavonoides totales ...................................................... 24

4.3.9 Determinación de la Actividad antioxidante mediante la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). .............................................................................. 26

4.4 Factores en estudio .......................................................................................... 28

4.4.1 Verbena litoralis Kunth ............................................................................. 28

4.4.2 Duranta triacantha Juss ............................................................................ 28

4.5 Tratamientos .................................................................................................... 29

4.6 Unidad experimental ....................................................................................... 30

4.6.1 Verbena litoralis Kunth ............................................................................. 30

4.6.2 Duranta triacantha Juss ............................................................................ 30

4.7 Diseño de la investigación ............................................................................... 31

4.7.1 Nivel de investigación ............................................................................... 31

4.7.2 Diseño experimental................................................................................. 31

4.8 Esquema del análisis de varianza. .................................................................... 31

4.9 Análisis funcional ............................................................................................. 32

4.10 Definición de variables ................................................................................. 32

4.10.1 Cantidad de flavonoides ........................................................................... 32

4.10.2 Actividad antioxidante .............................................................................. 32

4.11 Operacionalización de variables................................................................... 33

5 Resultados y discusión ............................................................................................ 34

5.1 Obtención del extracto etanólico de inflorescencias, hojas y tallos de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss. ................................................................. 34

x

5.2 Precipitación de la clorofila de los extractos hidroalcohólicos para Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss. ................................................................... 34

5.3 Cuantificación de flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth ............... 34

5.4 Cuantificación de flavonoides totales para Duranta triacantha Juss. ............. 37

5.5 Determinación de la actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth......... 41

5.6 Determinación de la actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss. ...... 44

6 Conclusiones ........................................................................................................... 48

7 Recomendaciones................................................................................................... 49

8 Resumen ................................................................................................................. 50

9 Referencias ............................................................................................................. 54

10 Anexos .................................................................................................................... 60

xi

Índice de anexos

Anexo 1. Boucher botánico para Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss. ... 60

Anexo 2. Identificación botánica para las plantas verbena y mote casha ..................... 61

Anexo 3. Resultado de los flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth. ............... 62

Anexo 4. Resultado de los flavonoides totales para Duranta triacantha Juss ............... 63

Anexo 5. Barrido espectral de una solución de DPPH 1000 ppm................................... 64

Anexo 6. Resultado del porcentaje de inhibición del radical DPPH para Verbena litoralis Kunth. ............................................................................................................................. 65

Anexo 7. Resultados del porcentaje de inhibición del radical DPPH para Duranta triacantha Juss ................................................................................................................ 66

Anexo 8. Prueba de Normalidad para las variables en estudio de Verbena litoralis Kunth. ........................................................................................................................................ 67

Anexo 9. Prueba de Normalidad para las variables en estudio de Duranta triacantha Juss. ........................................................................................................................................ 67

xii

Índice de tablas

Tabla 1. Clasificación de los compuestos bioactivos de origen vegetal ........................... 9

Tabla 2. Clasificación de los flavonoides ........................................................................ 11

Tabla 3. Características físico químicas de la Quercetina .............................................. 13

Tabla 4. Símbolos y términos usados en la ecuación de la Ley de Beer ......................... 17

Tabla 5. Preparación de soluciones estándar para la curva de calibración de QE. ........ 25

Tabla 6. Preparación de soluciones estándar para la curva de regresión lineal de ácido ascórbico. ........................................................................................................................ 27

Tabla 7. Tratamientos formulados para la cuantificación de flavonoides y actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth. ........................................................................ 29

Tabla 8. Tratamientos formulados para la cuantificación de flavonoides y actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss. ...................................................................... 30

Tabla 9. Esquema del Análisis de Varianza para Verbena litoralis Kunth. ..................... 31

Tabla 10. Esquema del análisis de varianza para Duranta triacantha Juss. ................... 32

Tabla 11. Operacionalización de variables ..................................................................... 33

Tabla 12. ADEVA para la variable cantidad de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth .............................................................................................................................. 35

Tabla 13. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable cantidad de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth. ............... 36

Tabla 14. ADEVA para la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss. ................................................................................................................................. 38

Tabla 15. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss. .............. 39

Tabla 16. ADEVA para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth. .. 41

Tabla 17. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth. .............................. 42

Tabla 18. ADEVA para la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss .. 44

Tabla 19. Prueba de Tukey para los tratamientos sobre la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss............................................................................................. 45

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Índice de figuras

Figura 1. Estructura general de los flavonoides. ............................................................ 10

Figura 2. Estructura química del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante ........................................................................................................................................ 20

Figura 3. Curva de calibración de QE para la cuantificación de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss (longitud de onda 425 nm) ............. 25

Figura 4. Reacción de coloración violeta a amarillo de la capacidad reductora del DPPH ........................................................................................................................................ 26

Figura 5. Curva de calibración del ácido ascórbico para la determinación de la actividad antioxidante de los extractos de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss (longitud de onda 515 nm). ............................................................................................ 27

Figura 6. Cantidad de flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth ........................ 34

Figura 7. Polinomios ortogonales de la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Verbena litoralis Kunth sobre la variable cantidad de flavonoides totales. .. 37

Figura 8. Cuantificación de flavonoides totales para Duranta triacantha Juss .............. 37

Figura 9. Polinomios ortogonales de la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Duranta triacantha Juss sobre la variable de flavonoides totales. ................ 40

Figura 10. Polinomios ortogonales para la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Verbena litoralis Kunth sobre la variable actividad antioxidante. ................. 43

Figura 11. Porcentaje de inhibición del DPPH de cada tratamiento para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth. ........................................................ 43

Figura 12. Polinomios ortogonales para la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Duranta triacantha Juss en la actividad antioxidante. ................................... 46

Figura 13. Porcentaje de inhibición del radical DPPH para la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss. ...................................................................... 46

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AUTOR: Tipantuña Guamán Claudia Soraya

TUTOR: Edgar Patricio Ruiz Guerra

COTUTORA: Dayana Paulina Borja Espín

RESUMEN

Se analizaron dos especies de la familia Verbenaceae: Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, conocidas como “verbena” y “mote casha”. A través del método de maceración, se preparó los extractos hidroalcohólicos de hojas, tallos e inflorescencias de las especies vegetales para su cuantificación espectrofotométrica de flavonoides totales y determinación de la actividad antioxidante.

Se planteó un Diseño Completamente al Azar (DCA) con arreglo factorial A*B correspondientes a las variables cuantificación de flavonoides totales y porcentaje de inhibición de DPPH para las diferentes combinaciones entre factores de estudio: tiempo de maceración y parte de planta. Con los datos obtenidos en el proceso experimental se realizó el Análisis de Varianza (ADEVA), así como su significancia estadística al 95 % de confianza. Los valores obtenidos para la variable flavonoides totales en la interacción día de maceración y parte de planta fueron en el día 5, en hojas 0,204 mg*mL-1 para verbena y 0,780 mg*mL-1 para mote casa. Mientras que para la variable porcentaje de inhibición en la interacción día de maceración y parte de planta los resultados en el día 3 de maceración fueron 95,067 % para el extracto de hojas de verbena y 95,329 % en las inflorescencias de mote casha.

TÍTULO: Contenido de flavonoides totales y actividad antioxidante en inflorescencias, hojas y tallos de plantas endémicas: Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss

PALABRAS CLAVE: METABOLITOS, PROPIEDADES FARMACOLÓGICAS, PLANTAS ENDÉMICAS, EXTRACTOS HIDROALCOHÓLICOS, MACERACIÓN.

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AUTHOR: Tipantuña Guamán Claudia Soraya TUTOR: Edgar Patricio Ruiz Guerra

COTUTORA: Dayana Paulina Borja Espín

ABSTRACT

Two species of the Verbenaceae family were analyzed: Verbena litoralis Kunth and Duranta triacantha Juss, known as "verbena" and "mote casha". Through the maceration method, hydroalcoholic extracts of leaves, stems and inflorescences of plant species were prepared for their spectrophotometric quantification of total flavonoids and determination of antioxidant activity. A Completely Random Design (CRD) was raised with a factorial arrangement A*B corresponding to the variables quantification of total flavonoids and percentage of DPPH inhibition for the different combinations between study factors: maceration time and part of the plant. With the data obtained in the experimental process, the Variance Analysis (ANOVA) was performed, as well as its statistical significance at 95% confidence. The values obtained for the total flavonoid variable in the day interaction of maceration and part of the plant were on day 5, in leaves 0,204 mg*mL-1 for verbena and 0,780 mg*mL-1 for mote house. While for the variable percentage of inhibition in the interaction day of maceration and part of plant the results on day 3 of maceration were 95,067% for the extract of verbena leaves and 95,329 % in the inflorescences of mote casha.

TITLE: Total flavonoid content and antioxidant activity in inflorescences, leaves and stems of endemic plants: Verbena litoralis Kunth and Duranta triacantha Juss

KEY WORDS: METABOLITES, PHARMACOLOGICAL PROPERTIES, ENDEMIC PLANTS, HYDROALCOHOLIC EXTRACTS, MACERATION.

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1 Introducción

La biodiversidad está desapareciendo a un ritmo acelerado, debido a una serie de causas como, la pérdida de la cobertura natural de bosques, el tráfico ilegal de especies, la sobreexplotación de especies silvestres, la introducción de especies exóticas, la extracción de recursos naturales no renovables, donde estarían incluidos la actividad petrolera, la minería y la contaminación en todas sus formas (Valencia, Pitman, & Leon-Yañez, S y Jordensen, 2011a). Ecuador tiene una gran diversidad cultural, la misma que evidencia una intensa interacción con la naturaleza, puesto que durante siglos los pueblos han desarrollado un medio para conocer las características, propiedades, usos y aplicaciones de los recursos biológicos que les han servido y sirven de sustento. Dichos recursos biológicos y conocimientos tradicionales no sólo son importantes para la humanidad por su valor en sí mismos, sino porque en la actualidad son utilizados en la ciencia, la tecnología, la industria y el comercio en general, situaciones que han llevado al Ecuador a convertirse en una víctima más de un fenómeno llamado biopiratería (Valladolid, 2014).

La biopiratería es una antigua práctica en la cual empresas trasnacionales indagan en regiones biodiversas y se apropian de especies nativas y conocimientos ancestrales para explotarlos industrialmente, sin hacer ninguna retribución a los habitantes de esas zonas (Valencia, Pitman, & Leon-Yañez, S y Jordensen, 2011b). Este tema se repite regularmente y afecta principalmente los intereses sociales, culturales, políticos y económicos de países ricos en biodiversidad como son los países sudamericanos.

Las plantas medicinales son usadas como recursos terapéuticos debido a su fácil acceso y bajo costo. Una gran parte de la población tiene preferencia por el consumo de productos naturales debido a la creencia de que estos son seguros y libres de efectos secundarios. Aunque muchas plantas se emplean en el tratamiento de algunas enfermedades, la mayoría de las veces no hay un fundamento científico que evidencie sus propiedades (Vega-Villa, 2014).

La importancia de investigar especies vegetales deriva de su uso tradicional, Ecuador es un país que se caracteriza por su alta diversidad botánica, donde sus distintas etnias y comunidades utilizan plantas medicinales como agentes terapéuticos debido al conocimiento ancestral que poseen, el cual forma parte de su acervo cultural (Valladolid, 2014).

La utilización irracional de algunas especies, la degradación de los ambientes naturales y la biopiratería están provocando una rápida pérdida del conocimiento ancestral relacionado con la fitoterapia, por ello nace la necesidad de rescatar y conservar la medicina tradicional. Ya que gran parte de esta se basa en el uso de extractos vegetales o de sus componentes activos, en la actualidad ha tomado gran relevancia el estudio de la actividad biológica de las plantas usadas en medicina tradicional, especialmente la actividad antioxidante luego de descubrir que muchas enfermedades se asocian a estados de estrés oxidativo (Valencia et al., 2011a).

En el Ecuador, el Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública (INSPI), constituye un órgano ejecutor de investigación científica, a través del desarrollo de proyectos con la colaboración de otras instituciones como la Universidad Central del Ecuador, busca impulsar la generación de conocimiento en las áreas de investigación prioritarias en salud pública para el país. Tal es el caso del estudio fitoquímico y la evaluación de la

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actividad antioxidante en plantas medicinales endémicas del Ecuador, entre las cuales se encuentran, Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, a fin de rescatar el potencial que representa el conocimiento de sus metabolitos con propiedades medicinales y de interés agronómico.

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2 El problema 2.1 Planteamiento del problema

Según señalan Sarukhan et al (2015)los datos ofrecidos por organismos internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS), Unidad para la Alimentación (FAO), Organización de las Naciones Unidas (ONU), Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), y la Unión Europea (UE), generan preocupación debido al incremento de la extinción de especies endémicas desde el 2014, ya que los humanos están transformando los paisajes naturales de la Tierra de manera tan dramática que un millón de especies vegetales endémicas están en peligro de extinción, lo que representa una amenaza grave a los ecosistemas de los que personas de todo el mundo dependen para su supervivencia.

De acuerdo con Bello et al (2017) el cambio climático es una de las mayores fuerzas impulsoras del actual nivel de pérdida sin precedentes de la biodiversidad, por lo que, a finales de 2050, especies y ecosistemas lucharán para adaptarse a los cambios de la temperatura y el aumento de las lluvias.

Para Flombaum & Sala (2011) el sistema natural que brinda a la humanidad aire, agua y alimentos funciona gracias a 8,7 millones de especies de plantas endémicas. Pero esos seres vivos se están extinguiendo a un ritmo acelerado, amenazando gravemente el futuro del género humano.

Valencia et al (2011a), especialistas en temas de extinción de especies endémicas, argumentan que un total de 4.500 especies de plantas habitan de manera exclusiva en territorio ecuatoriano. De ese universo de plantas endémicas, 353 se encuentran en peligro crítico de extinción. La extinción de especies endémicas constituye también un problema para la comunidad científica, ya que, en su gran mayoría, estas especies tienen propiedades medicinales, las cuales forman parte del acervo ancestral de las comunidades indígenas del país. La posible extinción de plantas no estudiadas como Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, significa la pérdida del potencial que representa el conocimiento de sus metabolitos con propiedades medicinales y de interés agronómico.

2.2 Justificación

La atención intercultural y saberes ancestrales es una de las prioridades del Ministerio de Salud Pública, es por ello, que el estudio del contenido de flavonoides totales y la determinación de la actividad antioxidante de las especies Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, forma parte del proyecto que está ejecutando el INSPI, el cual comprende una proyección de la actividad anti-fúngica y antioxidante en plantas medicinales endémicas del Ecuador contra cepas clínicas y ATCC de Candida sp. Los resultados de esta investigación permiten comprender la importancia de las especies en estudio, puesto que dan a conocer su actividad antioxidante, y despiertan el interés por continuar investigaciones con estas plantas.

Además, a través de la investigación de las propiedades de estas plantas endémicas, se pretende ampliar el conocimiento sobre la eficacia y efectividad de la medicina alternativa, y dar énfasis en la importancia de la conservación de la biodiversidad del Ecuador, tomando acciones inmediatas para evitar la extinción de especies.

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2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivo General

Cuantificar los flavonoides totales y la actividad antioxidante de las plantas endémicas: verbena Verbena litoralis Kunth, y mote casha Duranta triacantha Juss.

2.3.2 Objetivos específicos

- Cuantificar los flavonoides totales presentes en los extractos de las hojas, tallos, e inflorescencias de Verbena litoralis Kunth, y mote casha Duranta triacantha Juss.

- Evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de hojas, tallos, e inflorescencias de Verbena litoralis Kunth, y mote casha Duranta triacantha Juss, mediante la técnica 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

2.4 Hipótesis

2.4.1 Hipótesis nula (Ho)

Los extractos hidroalcohólicos de inflorescencias, hojas y tallos de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss, no son una fuente de flavonoides totales con actividad antioxidante.

2.4.2 Hipótesis alternativa (Ha)

Los extractos hidroalcohólicos de inflorescencias, hojas y tallos de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss, son una fuente de flavonoides totales, con actividad antioxidante.

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3 Revisión de Literatura 3.1 Países megadiversos

Son aquellos países que albergan los mayores índices de biodiversidad, incluyendo un alto contenido de especies endémicas. Aunque solo representan alrededor del 10% de la superficie del mundo, los países megadiversos albergan al menos el 70% de la diversidad biológica terrestre del planeta (McGarigal, Balslev, Navarrete, Torres, & Marcia, 2001).

El Centro de Seguimiento de la Conservación Mundial (WCMC, por sus siglas en inglés), perteneciente al Programa de Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente (PNUMA), ha identificado un total de 17 países megadiversos, los cuales están comprometidos a cumplir con los siguientes objetivos:

Presentar posiciones comunes en los foros internacionales relacionados con la diversidad biológica.

Promover la conservación de la diversidad biológica en los países de origen y el desarrollo de proyectos conjuntos de investigación para realizar inventarios de sus recursos, así como para invertir en el desarrollo y aplicación de tecnologías endógenas en apoyo a la conservación y de actividades económicas sostenibles a nivel local.

Procurar que los bienes, servicios y beneficios provenientes de la conservación y el aprovechamiento sostenible de la diversidad biológica sirvan de sustento al desarrollo de los pueblos.

Explorar conjuntamente vías para intercambiar información y armonizar las respectivas legislaciones nacionales de los países miembros para la protección de la diversidad biológica, así como para el acceso a recursos biológicos y genéticos y el reparto de beneficios derivados de su utilización.

Establecer marcos regulatorios que generen incentivos para la conservación y el uso sostenible de los recursos biológicos.

Impulsar acciones con otros países, con la iniciativa privada y grupos interesados, a fin de que, en un espíritu de cooperación y en beneficio mutuo, demuestren su responsabilidad con el adecuado manejo del capital natural de los países megadiversos, y contribuyan en forma práctica a los objetivos de conservación, aprovechamiento sostenible y distribución de beneficios contenidos en el Convenio sobre Diversidad Biológica.

Combatir conjuntamente la apropiación indebida o ilegítima de recursos genéticos, mediante el intercambio de información sobre el comportamiento negativo de instituciones académicas o privadas y el desarrollo de mecanismos que permitan controlar el destino de los recursos genéticos de los países de origen (McGarigal, Balslev, Navarrete, Torres, & Marcia, 2001)..

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3.2 Especies endémicas

3.2.1 Definición

Una especie endémica es aquella que solamente vive en un determinado lugar, cuya distribución se restringe a una determinada zona geográfica, ya sea una provincia, región, país o continente (McGarigal, Balslev, Navarrete, Torres, & Marcia, 2001).

3.2.2 Importancia

Se ha dado mucha importancia al estudio de plantas endémicas, ya que, por tratarse de especies únicas, su extinción afectaría al conocimiento ancestral, biológico y científico.

Un total de 4500 especies de plantas habitan de manera exclusiva en territorio ecuatoriano. De ese universo de plantas endémicas, 353 (8 %) se encuentran en peligro crítico de extinción. El mayor impacto proviene de la deforestación a pequeña o gran escala, ya sea para extracción de madera o leña, o para el cambio de uso del suelo para agricultura, ganadería, urbanización o minería (Valencia et al., 2011a).

3.3 Especies en estudio

3.3.1 Verbena litoralis Kunth

Conocida generalmente como verbena y garbancito del campo, forma parte de la familia Verbenaceae, y dentro del género Verbena con aproximadamente 250 especies distribuidas preferentemente en las regiones tropicales y temperadas de América (Calzada-Sánchez, Aguilar-Rodríguez, López-Villafranco, & Aguilar-Contreras, 2014)

Sinonimia, según de Lima et al (2018)

- Verbena affinis M, Martens & Galeotti

- Verbena bonariensis var, litoralis (Kunth) Hook, ex Müll, Berol

- Verbena bonariensis var, litoralis (Kunth) Gillies & Hook, ex Hook

- Verbena caracasana Kunth

- Verbena carolina var, glabra Moldenke

- Verbena gentryi Moldenke

- Verbena glabrata var, tenuispicata Moldenke

- Verbena integrifolia Sessé & Moc

- Verbena integrifolia f, albiflora Moldenke

- Verbena lanceolata Willd, ex Spreng

- Verbena longifolia M, Martens & Galeotti

- Verbena nudiflora Nutt, ex Turcz

- Verbena paucifolia Turcz

- Verbena sedula Moldenke

3.3.1.1 Distribución geográfica

A nivel Nacional se encuentra distribuida en las provincias de: Chimborazo, Cuenca, Cotopaxi, Guayas, El Oro, Los Ríos, y Pichincha (Ministerio del Ambiente, 2018)

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3.3.1.2 Descripción botánica

Verbena litoralis Kunth, se destaca por ser una planta leñosa y perenne, en la base con un grosor de 1,5 cm crece con una altura de planta de 150 cm, su tallo es erecto cuadrangular y ramificado, las hojas son opuestas con una lámina lanceolada de hasta 1,0 cm de base ancha y ápice angosto, elíptica u oblonga de 3,0 a 10,0 cm de largo, y de 0,8 a 3,5 cm de ancho, con inflorescencias terminales y pedunculares (espiga de espiga), con brácteas de inflorescencias de 4,0 a 16,0 cm de largo con una corola de color morada (Calzada-Sánchez et al., 2014).

3.3.1.3 Fitoquímica

Presenta una gama de compuestos bioactivos tales como, flavonoides, antracenósidos, saponinas hemolíticas, taninos catéquicos y carotenoides, también se reporta presencia de aceites volátiles, cumarinas y mucílagos, en menor concentración, alcaloides y taninos gálicos no están presentes en esta planta. De acuerdo a la información preliminar etnobotánica y fitoquímica, Verbena litoralis Kunth presenta constituyentes como dímeros de litorachalcona (2’,4’,3’’,2’’’,4’’’- pentahidroxi-4-O4’’-tetrahidrobichalcona), aislada de la parte aérea de Verbena litoralis Kunth, encontrándose además 2 flavonoides: 4’hidroxiwogoninay y 8,3’-dimetoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona (de Lima et al., 2018).

En las partes aéreas de Verbena litoralis Kunth se encuentra una mayor actividad antioxidante, determinada mediante la técnica 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Guex et al., 2018).

3.3.1.4 Información Etnobotánica

Verbena litoralis Kunth, en medicina tradicional, es usada para tratar alteraciones gastrointestinales, inflamación del hígado, congestión nasal, dolor de cabeza, migraña, tos asmática, inflamación ocular y de garganta, cálculos hepáticos y renales, heridas, menstruaciones dolorosas y reumatismo (Guex et al., 2018).

3.3.2 Duranta triacantha Juss

Conocida generalmente como “Mote Casha” y espino bravo, formando parte de la familia Verbenaceae, se contrasta el género Duranta, en el que se encuentran 17 especies de arbustos y pequeños árboles nativos de América, esta planta no está investigada por lo que aún no se ha podido describir sus compuestos bioactivos y sus potenciales que esta especie vegetal brinda a la sociedad (Wong, Leong, & William Koh, 2006).

3.3.2.1 Sinonimia

Duranta dombeyana

Duranta erecta

Duranta lorentzii

Duranta repens

Duranta triacantha

Duranta variegada

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3.3.2.2 Distribución geográfica

A nivel nacional se encuentra en las provincias de Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Bolívar, Carchi, Cuenca, Chimborazo, Azuay, Loja y Napo (Ministerio del Ambiente, 2018).

3.3.2.3 Descripción botánica

Arbusto de hojas verticiladas y enteras con ramas espinosas, vigorosas y arqueadas, inflorescencias de racimos de colores violetas con blanco, su excepcional diferenciación de otros géneros Duranta es el tipo de fruto (drupa) (O’Leary et al., 2012).

3.3.2.4 Información Etnobotánica

De gran importancia para la ganadería (forraje), a futuro será una gran fuente de combustible, usado para tratar afecciones de la piel (manchas, hongos e irritaciones) la drupa madura. Contiene mucílago, utilizado para tratar todo tipo de quemaduras, se utiliza en la fabricación de cosméticos, planta antivírica, donde las inflorescencias, el fruto y las hojas son de suma importancia para contrarrestar carrasperas, fiebre y resfríos (Wong et al., 2006).

3.4 Compuestos bioactivos de las plantas

Los compuestos bioactivos son los compuestos producidos por el metabolismo de la planta para su supervivencia y protección. Estos compuestos generalmente tienen actividades farmacológicas, que pueden ser aplicadas en el área de la salud, generando grandes beneficios para las personas (Barba, Esteve, & Frígola, 2014).

También destacan los compuestos bioactivos con capacidad reductora, puesto que, cumplen las funciones de regular el pH y prevenir el estrés oxidativo causado por los rayos UV del sol en las plantas. Esta capacidad reductora puede ser aplicada o evaluada para la prevención del cáncer de la piel. También son utilizados como agentes reductores naturales para reacciones químicas e incluso como indicadores del pH (Giddings & Newman, 2015).

3.4.1 Compuestos del metabolismo primario

Los compuestos del metabolismo primario corresponden a las biomoléculas: proteínas, lípidos, carbohidratos, glúcidos, enzimas, hormonas, vitaminas que son indispensables para la supervivencia de la especie y por ende son fundamentales en los procesos vitales de la planta (Azmir et al., 2013).

3.4.2 Compuestos del metabolismo secundario

Llamados metabolitos secundarios, ya que son biosintetizados por el metabolismo secundario se encuentran presentes en menor concentración. Pese a no ser indispensables cumplen con funciones como, protección, reproducción (atracción de polinizadores). A diferencia de los metabolitos primarios, no todas las plantas sintetizan los mismos metabolitos secundarios, estos están restringidos a una clase, división, género y en algunos casos solo una especie sintetiza determinado metabolito (Azmir et al., 2013).

3.4.2.1 Clasificación de metabolitos secundarios

Las distintas reacciones químicas del metabolismo para formar los metabolitos son conocidas como vías metabólicas. (Wijngaard, Hossain, Rai, & Brunton, 2012). Los

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metabolitos secundarios (Tabla 1) por su biosíntesis de acuerdo a su vía metabólica se clasifican en:

- Alcaloides: Derivados de los aminoácidos - Compuestos Terpénicos: Derivados del ácido mevalónico - Compuestos Fenólicos: Vía del Ácido shikímico y vía del acetato

De esta clasificación, para efectos de la investigación se revisó con mayor profundidad a la subclase flavonoides, pertenecientes al grupo de compuestos fenólicos.

Tabla 1. Clasificación de los compuestos bioactivos de origen vegetal

Compuestos Definición Sub-clasificación

Alcaloides

Compuestos nitrogenados que suelen presentar actividad farmacológica a bajas dosis con una

gran variedad, algunos son tóxicos como la aconitina.

Alcaloides derivados de la lisina y ornitina

Alcaloides derivados de fenilalanina y

tirosina

Alcaloides derivados del triptófano,

Alcaloides derivados del ácido nicotínico

Alcaloides derivados de la histidina

Compuestos

Terpénicos

Compuestos que resultan de la polimerización de sus unidades isoprénicas y su isómero

dimetilalilpirofosfato.

Monoterpenos

Diterpenos

Iridoides

Sesquiterpenos

Triterpenos

Tetraterpenos

Compuestos Fenólicos

Constituyen un amplio grupo y se caracterizan por presentar en su estructura un anillo benceno

con al menos un grupo hidroxílico

Compuestos fenólicos sencillos

Cromonas

Cumarinas

Benzofuranos

Flavonoides

Quinonas

Lignanos

Taninos Nota: compuestos bioactivos. Fuente: (da Silva, Rocha-Santos, & Duarte, 2016).

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3.4.2.2 Flavonoides

Grupo de metabolitos secundarios biosintetizados a través de la vía del ácido shikímico, son compuestos polifenólicos, y en su gran mayoría se componen de 15 átomos de Carbono, en su núcleo es esencial la composición de un esqueleto difenilpirano (C6C3C6), compuesto por dos anillos fenilo (A y B), enlazados a un anillo pirano (C) (Figura 1) (Birt & Jeffery, 2013). Los flavonoides intervienen en la pigmentación de inflorescencias, flores, frutos y hojas. Las chalconas y auronas son flavonoides que presentan una pigmentación de color amarillo, las antocianinas son de color azul, rojo y violeta. Los flavonoides cumplen múltiples funciones para el desarrollo y funcionamiento de las especies vegetales, por ejemplo: protección contra agentes agresores de las radiaciones de luz ultravioleta (rayos UV y visible), agentes patógenos, y animales herbívoros, ya que los flavonoides dominan la acción de inhibición de enzimas y hormonas vegetales (Hodek, 2012).

Figura 1. Estructura general de los flavonoides.

3.4.2.2.1 Características químicas

Se caracterizan por poseer dos anillos aromáticos de benceno o fenilo, unidos por un puente de tres átomos de carbono (anillo pirano), a los cuales se los designa como anillo A, B y C, y su esqueleto es C6-C3-C6, de bajo peso molecular, y en su estructura tiene un número variable de grupos hidroxilos (OH-), enlazados a estructuras anulares, otorgándole propiedades polares (alta solubilidad en acetona, agua, butanol, DMSO, etanol, metanol). Característica que le proporciona a los flavonoides la formación de puentes de hidrógeno (uniones no covalentes), y la posibilidad de formar complejos con iones metálicos Cobre y Hierro (Kumar & Pandey, 2013)

3.4.2.2.2 Propiedades antioxidantes

La actividad antioxidante de los flavonoides resulta de una combinación de sus propiedades quelantes de hierro y secuestradoras de radicales libres, además de la inhibición de las oxidasas: lipooxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa y la xantina oxidasa; evitando así la formación de especies reactivas de oxígeno y de hidroxiperóxidos orgánicos. Aunado a esto, se ha visto que también inhiben enzimas involucradas indirectamente en los procesos oxidativos, como la fosfolipasa A2; al mismo tiempo que estimulan otras con reconocidas propiedades antioxidantes, como la catalasa y la superóxido dismutasa (Banjarnahor & Artanti, 2014).

Con respecto a su estructura, los flavonoides con sustituyentes dihidroxílicos en posiciones 3´ y 4´ en el anillo B se muestran más activos como antioxidantes y es potenciado este efecto por la presencia de un doble enlace entre los carbonos 2’ y 3’,

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un grupo OH libre en la posición 3 y un grupo carbonilo en la posición 4. Además, las agliconas se muestran más potentes en sus acciones anti lipoperoxidativas que sus correspondientes glicósidos. Conforme a lo anterior mencionado, la quercetina es el flavonoide que reúne los requisitos para ejercer una efectiva función antioxidante, pues ésta es cinco veces mayor que la de las vitaminas C y E, además de poseer una hidrosolubilidad similar a esta última (Banjarnahor & Artanti, 2014).

3.4.2.2.3 Clasificación

Los flavonoides se clasifican de acuerdo a la realización del método de sustitución en el anillo C de su estructura basal, siendo de suma importancia la posición del anillo B en el estado de oxidación del anillo heterocíclico, los cambios en la estructura se realizan por los diferentes procesos de reducción, oxidación y glicosilación, formándose de tal manera los diferentes tipos de flavonoides (Tabla 2) (Panche, Diwan, & Chandra, 2016).

Tabla 2. Clasificación de los flavonoides

Tipo Estructura Característica Ejemplo

Flavona

Grupo carbonilo

en posición 4 del

anillo C y carece

del grupo OH- en

posición 3 del

anillo C.

Diosmetina

Flavanona

Comúnmente se

encuentran

glicosiladas en

posición 7.

Hespertina

O

O

OHOH OH

CH3

OOH

OH

O

OH

O

OOH

OH

OCH3

Flavonol

Grupo carbonilo

en posición 4 y

grupo OH en

posición 3 del

anillo C.

Quercetina

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Flavanol

Grupo OH en

posición 3 del

anillo C.

Catenina

Antocianidi

na

Grupo carbonilo

en posición 4 del

anillo C y carece

del grupo OH en

posición 3 del

anillo C.

Luteolinidina

Flavononol

Presentan dos

carbonos

asimétricos 2 y 3.

Taxifolina

Isoflavona

El anillo B ocupa la

posición 3.

Genisteina

Chalcona

Son cetonas

aromáticas α y β.

Aurona

Posee un

heteciclo

oxigenado de

cinco miembros, o

recilado en un

anillo furano.

Sulfuretina

Nota: OH-; oxhidrilo, O+; ion oxocarbenio; Cl-; ion cloruro, Fuente: (Grotewold, 2006).

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3.4.2.2.4 Quercetina (QE)

Es el flavonol de mayor abundancia en la naturaleza, que representa del 60 % al 75 % del total de flavonoides consumidos, de tal forma que, los flavonoles tienen una amplia gama de actividades biológicas, de compuestos más activos, comercializándose como compuestos puros o suplementos. Posee un bajo peso molecular, y tiene una alta lipofilia, favoreciendo la difusión pasiva por medio de la membrana lipídica (Tabla 3) (Oliveira, Carraro, Auler, & Khalil, 2016).

Tabla 3. Características físico químicas de la Quercetina

Característica Descripción

Fórmula química C15H10O7

Color Amarillo

Forma Polvo

Masa molecular (gmol-1) 302,2

Número CAS 117-39-5

Pérdida por secado ≤ 4 %

pKa 8,25

Pureza ≥ 95 %

Punto de fusión 316,5 °C

Solubilidad acuosa 60 ugmL-1 (16 °C)

Nota: µg; microgramo, mL; mililitro. C15H10O7; quercetina. Fuente: (Ramírez-Navas, 2017).

3.4.2.3 Antioxidantes de origen vegetal

Los compuestos antioxidantes, estabilizan a las especies reactivas (ER), donándoles un electrón, para completar su orbital electrónico, por lo tanto, un antioxidante es aquella sustancia que muestra bajas concentraciones en relación al de una biomolécula (sustrato oxidable), postergando la oxidación del sustrato (Rowland, Dong, & Migdal, 2018).

Los antioxidantes de origen vegetal son un conjunto de fitoquímicos tales como las antocianinas, carotenoides, flavonoides y vitaminas. Este tipo de compuestos puede encontrarse en productos como tomate, uvas, zanahorias, mango, brócoli, aguacate, melón y muestran un amplio espectro de funciones biológicas cuando son consumidos en la dieta (Rowland et al., 2018).

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3.4.2.3.1 Clasificación

La clasificación de los antioxidantes de origen vegetal se realiza tomando en cuenta la fuente, su función, su estructura química, y su mecanismo de acción (Kubilay et al., 2013).

3.4.2.3.1.1 Fuente

Naturales y sintéticos: los antioxidantes naturales normalmente se encuentran en las plantas (ácido ascórbico, carotenoides, polifenoles, tocoferoles). Los antioxidantes sintéticos son obtenidos químicamente mediante evaluaciones toxicológicas para el consumo humano, entre ellos se encuentran: butilhidroxitolueno (BHT), butilhidroxianisol (BHA) (Kurmukov, 2013).

3.4.2.3.1.2 Función

- Inhibidores de la formación de radicales libres, en fases tales como, iniciación o propagación, interrumpiendo de tal forma las denominadas reacciones en cadena.

- Anuladores del oxígeno singlete atómico.

- Quelantes que atrapan iones metálicos los cuales dejan de ser inestables al traspasar uno o más electrones.

- Sinergistas que obtienen la reconstitución de otros antioxidantes en el momento que se localizan en su mismo sistema (Skibsted, 2012).

3.4.2.3.1.3 Estructura química

Composiciones fitoquímicas con distintas estructuras actúan como antioxidantes, a través de los diferentes mecanismos de acción.

- Antioxidantes fenólicos: butilhidroxianisol, butilhidroxitolueno, propil galato.

- Carotenoides: intervienen en la desactivación del oxígeno singlete atómico.

- Ácidos orgánicos débiles: ácido cítrico, etilendiaminoteracético (EDTA) antioxidantes secundarios quelantes de metales (Bueno et al., 2012).

3.4.2.3.1.4 Mecanismo de acción

Primarios y secundarios. Los primarios detienen las reacciones en cadena, a diferencia de los secundarios o preventivos, que difieren la constitución de especies reactivas, y después de intervenir en varios procesos no generan radicales libres (Maisuthisakul, Pasuk, & Ritthiruangdej, 2008).

3.4.2.3.2 Sustancias antioxidantes de mayor importancia

3.4.2.3.2.1 Carotenoides

Conocidos generalmente como tetraterpénidos, corresponden a una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de carbonos que se derivan biosintéticamente a través de dos uniones de geranil-geranilpirofosfato, solubles en solventes apolares, con coloraciones amarillas (β-caroteno), y rojo (licopeno) (Pallett & Young, 2017).

3.4.2.3.2.2 Vitamina C

Enantiómero del ácido L-ascórbico, sus ascorbatos son de sodio y calcio. La vitamina C es un cofactor enzimático, responsable de las reacciones fisiológicas (hidroxilación).

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Indispensable en la síntesis del colágeno y de glóbulos rojos, aportando a un buen funcionamiento del sistema inmunitario (Vannucchi & Rocha, 2012).

3.4.2.3.2.3 Vitamina E

Liposoluble, es decir que se disuelve con gran facilidad en aceites y grasas, conocida comúnmente como Tocoferol, tiende a incorporarse en el organismo mediante una gran proporción de alimentos ricos en grasas. Sus funciones son extremadamente fundamentales para el organismo en la formación de tejidos y para la fertilidad (NIH, 2016).

3.5 Métodos de análisis de metabolitos secundarios

3.5.1 Métodos de extracción de metabolitos secundarios de plantas

3.5.1.1 Percolación

El uso de un solvente alcohólico o una combinación de agua con alcohol (extracto hidroalcohólico), en donde se traspasa la muestra seca pulverizada (masa), en un solo sentido, para concatenar concentraciones, manteniendo la simetría del solvente de forma progresiva. Realizándose esta extracción en percoladores cónicos, alcanzando extracciones totales de principios activos para investigaciones con un rendimiento del 95 % de sustancias extraíbles (USP, 2011).

3.5.1.2 Maceración

Proceso de extracción sólido-líquido, donde la materia prima posee una serie de compuestos solubles en el líquido de extracción que son los que se pretende extraer. El proceso de maceración genera dos productos que pueden ser empleados dependiendo de las necesidades de uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada, así como del líquido de extracción (Tafurt-García, Jiménez-Vidal, & Calvo-Salamanca, 2015).

3.5.1.3 Decocción

Método que consiste en llevar la combinación del material vegetal y el solvente a una temperatura de ebullición de agua, oscilando dicha temperatura entre un tiempo aproximado de 15 a 30 minutos (Gaviria, Correa, Correa, Niño, & Mosquera, 2016).

3.5.1.4 Infusión

Método en que la muestra vegetal seca a priori, se pone en contacto con el solvente en estado de ebullición, por un tiempo de cinco minutos, de tal forma que se encuentra humedecida, luego de todo este proceso se deja enfriar el macerado a temperatura ambiente, es decir 20 °C (Guntero, Longo, Ciparicci, Martini, & Andreatta, 2015).

3.5.1.5 Digestión

Método de maceración que se realiza a temperaturas de entre 50 a 60 °C, de tal forma que al incrementar la temperatura se obtienen altos rendimientos del extracto, por lo que desciende la viscosidad del solvente, y este a su vez se va incorporando velozmente en el interior de las células y, por tanto, tiende a extraer sus principios activos (Luna, 1998).

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3.5.1.6 Soxhlet

Método que potencializa el uso de altas cantidades de muestra vegetal en rangos establecidos desde 30 a 200 gramos, y con periodos de extracción de 3 a 48 horas, dependiendo del compuesto activo que se requiera extraer, el rendimiento depende del solvente con el que se esté trabajando, en la actualidad se puede encontrar una gama de equipos Soxhlet automatizados (Luque de Castro & Priego-Capote, 2010).

3.5.1.7 Ultrasonido

Método que se usa para extraer componentes volátiles de la planta, así como también la extracción de aceites esenciales, disminuyendo el tiempo de extracción y a su vez aumentado la eficiencia de la extracción (Ulloa, & Ramírez, 2013).

3.5.1.8 Microondas

Método que usa pequeñas cantidades de material vegetal activo (10 a 50 gramos), en un tiempo de extracción de entre 25 a 40 minutos, a temperaturas que oscilan entre 80 y 100 °C y tiende a utilizar bajas cantidades de solventes (Flores, 2017).

3.5.1.9 Fluidos súper críticos

Un fluido supercrítico (FSC) es una sustancia que se encuentra en condiciones de presión y temperatura superiores a las de su punto crítico, en estas condiciones, la sustancia posee propiedades tanto de gas como de líquido. La extracción con fluidos supercríticos es una operación unitaria de transferencia de masa que se efectúa por encima del punto crítico del solvente, se diferencia de la extracción clásica porque utiliza como agente extractor un fluido supercrítico en lugar de un líquido ( Wong, 2017).

3.5.2 Introducción a los métodos espectrométricos

Extenso grupo de métodos analíticos que se fundamentan en las espectroscopías atómica y molecular. La espectroscopía es un término universal para la ciencia que estipula las distintas interacciones de radiación con la materia. Las interacciones de tendencia se producían entre la radiación electromagnética y la materia, sin embargo, hoy en día el término espectroscopía se ha profundizado, para introducir las interacciones a través de la materia y otras formas de energía, modelo de ello son las ondas acústicas y los haces de partículas, como iones o electrones. La espectrometría y los métodos espectrométricos hacen referencia a la dimensión de la intensidad de la radiación, entre un detector fotoeléctrico u otro tipo de dispositivo electrónico (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2014).

Los métodos espectrométricos ampliamente utilizados son los que están enlazados con la radiación electromagnética, siendo un tipo de energía que toma varias estructuras de las cuales las más fácilmente reconocibles son los rayos gama y rayos X, la radiación ultravioleta, microondas y radiofrecuencia (Skoog et al., 2014).

3.5.2.1 Espectrometría de absorción molecular ultravioleta/visible

Las medidas de absorción de la radiación ultravioleta y visible se focalizan en una enorme aplicación en la determinación cuantitativa de una gama de especies inorgánicas como orgánicas.

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La espectrometría de absorción molecular se fundamenta en la medida de la transmitancia T, o de la absorbancia A de disoluciones que se coloca en cubetas transparentes (celdas), que tienen un camino óptico de b cm (Skoog, 2013).

Generalmente, la concentración c de un analito absorbente (ion, elemento o compuesto determinado), está directamente relacionado con la linealidad de la absorbancia, como se puede apreciar en la siguiente ecuación:

𝐴 = − log 𝑇 = 𝑙𝑜𝑔𝑃𝑂

𝑃= 𝜀𝑏𝑐

Ecuación 1. Ley de Beer

La ecuación 1 es una representación matemática de la Ley de Beer, las variables de la ecuación se puntualizan en la Tabla 4.

Tabla 4. Símbolos y términos usados en la ecuación de la Ley de Beer

Símbolo Término Definición Símbolo alternativo

P, Po Potencia radiante

Energía (en ergios) de la radiación que incide en el detector, por cm2 y por segundo.

I, Io

A Absorbancia 𝑙𝑜𝑔𝑃𝑂

𝑃

D; E

T Transmitancia 𝑃𝑂

𝑃

T

Ϯb Camino óptico de la radiación

− l, d

Ϯa Absortividad 𝐴

𝑏𝑐

k

ǂε Absortividad molar

𝐴

𝑏𝑐

Nota: I, Io; Intensidad de la radiación, D; Densidad óptica; E; Extinción, k; Coeficiente de extinción, Ϯ; óptica, ε; Épsilon. Fuente: (Skoog, 1971).

3.5.2.2 Ley de Lambert Beer

Desde el punto de vista macroscópico, cuando la radiación solar interactúa con un material, se llevan a cabo diferentes procesos: parte de esta radiación es reflejada especularmente, si la superficie es muy brillante, o difusamente, por superficies opacas cuya reflexión da origen al color de la muestra debido a que la radiación penetra ligeramente en el cuerpo del material. Otra porción de la radiación incidente es esparcida en varias direcciones, debido a los procesos elásticos e inelásticos de dispersión de la radiación. Parte de esta radiación es absorbida por el material, otra parte puede ser dispersada dentro del material y otra puede ser reflejada por su

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superficie interna. Parte de la radiación absorbida puede ser convertida en calor y otra puede ser reemitida como fluorescencia o fosforescencia. Cuando el material en el cual incide la radiación solar es transparente, parte de la radiación es transmitida. La absorción de radiación por los materiales sólidos está regida por la ley de Beer-Lamber (Skoog, 2013).

Esta ley establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de la molécula absorbente; además no toma en cuenta la naturaleza de la radiación electromagnética, no considera las propiedades del material ni el ángulo de incidencia, los cuales, juntos, determinan la cantidad de energía incidente absorbida, reflejada o transmitida. La ley de Beer-Lambert es un medio conveniente para calcular los resultados de experimentos espectroscópicos como el coeficiente de absorción y la concentración de la sustancia absorbente. Aplicable para un medio que contenga más de una clase de sustancias absorbentes, que cumplan los siguientes parámetros:

- Soluciones diluidas

- Valores de concentraciones altos

- El coeficiente de extinción tienda a variar la concentración, que se deben a los fenómenos de dispersión de la luz

- Agregación de moléculas

- Cambios del medio

3.5.2.3 Instrumentación en la medición de absorbancia de luz visible y ultravioleta

La medición de absorbancia de luz a través de moléculas, se realiza mediante un espectrofotómetro. A pesar de que algunos equipos llegan a variar en diseño, especialmente en la incorporación de ordenadores, para análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan de las siguientes partes:

a. Fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

b. Un monocromador para seleccionar los radianes en una determinada longitud de onda (filtros, prismas, redes de difracción).

c. Un compartimento en donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos), que tengan una muestra. Para medir en UV se deben usar celdas de cuarzo o sílice fundido.

d. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en eléctricas.

e. Un sistema de lecturas de datos.

Para la operación del espectrofotómetro, el primer paso es la selección de la longitud de onda a la que se va a medir la muestra. Existen espectrofotómetros con un solo haz (una sola celdilla para la cubeta), y otros con hasta más de 20 haces (Hanlan, Skoog, & West, 2006).

Primeramente, se mide la absorbancia del blanco (disolvente), el cual es asignado el valor de cero, mediante el ajuste de mando, de tal forma, que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), puesto que la absorbancia es cero. Finalmente se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se procede a leer la absorbancia de la misma (Skoog et al., 2014).

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3.5.2.4 Curva de calibración

Para obtener una curva de calibración de un compuesto, se prepara soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de la absorbancia a λmax. Dichos valores de absorbancias serán representados en el eje de las ordenadas, y las concentraciones en el eje de las abscisas, a bajas concentraciones, el aumento de la absorbancia será menor y viceversa, cumpliéndose de tal forma la ley de Lambert Beer (Skoog, 2013).

Para comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer, se debe realizar una curva de calibración; para lo cual, se preparan soluciones de concentraciones conocidas de un estándar y se va midiendo la absorbancia a una longitud de onda establecida. La ecuación de la absorbancia permite calcular el valor del coeficiente de extinción molar, y este a su vez corresponde a la pendiente de la ecuación de la recta (Skoog, 2013).

Mediante una regresión lineal se determina la ecuación de la recta de la curva de calibración (Ecuación 2), a partir de dicha ecuación es posible realizar el cálculo de concentraciones desconocidas de ciertos analitos en una muestra, siempre y cuando las absorbancias estén dentro de las determinadas en la curva de calibración, lo cual asegura el cumplimiento de la Ley de Beer (Skoog, 2013).

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏

Ecuación 2. Ecuación de la recta de regresión lineal

Donde,

y = absorbancia de la muestra

a = pendiente

x = concentración de analito

b = ordenada al origen

3.5.3 Métodos de cuantificación de flavonoides

La cuantificación de flavonoides se puede llevar a cabo a través de la medida de absorción en la región ultravioleta-visible, esta técnica se usa ampliamente debido a las numerosas ventajas que representa, como la simplicidad, bajo costo operativo y la confiabilidad de los resultados (Gracia Nava, 2006a).

El método para la cuantificación de flavonoides se basa en su complejación con cloruro de aluminio (AlCl3) y la determinación espectrofotométrica del complejo formado, que proporciona un desplazamiento batocrómico y el efecto hipercrómico; el efecto batocrómico del complejo formado entre flavonoides-Al desempeña un papel importante en la especificidad del método Gracia Nava (2006a). Puesto que el complejo flavonoides-Al exhibe su máxima absorción a una longitud de onda de 425 nm, lo más adecuado es usar lámparas de Tungsteno en el espectrofotómetro, ya que estas lámparas producen un espectro radiante entre 390 – 950 nm.

El procedimiento permite la estimación del contenido total de flavonoides con especificidad de la mayoría de las agliconas (flavonoides libres y o-glicosilados), aumentando la representatividad del análisis y minimizando las posibilidades de desviaciones (Gracia Nava, 2006b).

20

3.5.4 Métodos para la determinación de la actividad antioxidante

Se ha determinado tres métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante: (i), método indirecto: Bringgs Rauscher (BRR), fenoles totales, metil linoleato, poder oxidante de reducción férrica (FRAP), reducción de Fe3+, (ii), método que usa metabolitos de oxidación lipídica: ácido tiobarbitúrico (TBA), rancimat, productos volátiles, (iii), método que se fundamenta en la capacidad de capturar radicales libres: potencial antioxidante total (TRAP), capacidad de absorción de radical oxígeno (ORAC), acido 2,2’-azino –bis(3- etilbenzotiazolin)-6-sulfonico) (ABTS), 2,2’- Difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Polak, Bartoszek, & Chorążewski, 2015).

3.5.4.1 Capacidad atrapadora de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)

Sharma & Bhat (2009) determinaron la actividad antioxidante en extractos utilizando al radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH•) (Figura 2), en una solución metanólica.

El decrecimiento del (DPPH•), se observa a través de la reducción de la absorbancia, longitud de onda característica, en forma de radical libre, (DPPH•), absorbe 517 nm, y tiende a reducirse por un antioxidante, y esta absorción se oculta. Este efecto hace que la desaparición del DPPH• facilite un indicador, para estimar la actividad antioxidante del compuesto de ensayo, para atrapar radicales libres (Hirano et al., 2001).

La siguiente reacción química explica la capacidad reductora de un compuesto formado como antirradical se expresa de la siguiente manera:

Figura 2. Estructura química del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante

Fuente: (Villaño, Fernández-Pachón, Moyá, Troncoso, & García-Parrilla, 2007).

La reacción química consiste en que el radical libre DPPH* sustrae un átomo de hidrógeno (radical libre estable), proveniente de un donador (compuesto químico puro o extracto), por lo que su electrón es deslocalizado en su estructura, producto de este cambio se desarrolla un cambio de color, de violeta a amarillo, al disminuir la concentración del radical libre; cuya intensidad se lee en el espectrofotómetro UV-visible, a una longitud de onda de 515 nm, después de un tiempo estimado de 30 minutos de que se haya realizado dicha reacción química (Polak et al., 2015).

21

4 Materiales y métodos 4.1 Ubicación

Fase de campo

4.1.1 Ubicación política y geográfica del lugar de recolección de muestras

Verbena litoralis Kunth

Provincia: Pichincha

Cantón: Rumiñahui

Parroquia: Sangolquí

Barrio: Loreto

Latitud: 0°24’55,26’’ S

Longitud: 78°24’16,04’’ O

Altitud: 2902 m.s.n.m.

Duranta triacantha Juss


Cantón: Rumiñahui

Parroquia: Sangolquí

Barrio: Cashapamba

Latitud: 0°19’49,85’’ S

Longitud: 78°25’34,35’’ O


Fase de laboratorio

Se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en la Ciudadela Universitaria.

4.1.2 Ubicación política y geográfica del Laboratorio de Productos Naturales


Cantón: Quito

Parroquia: Santa Prisca

Latitud: 0°11’52,48’’ S

Longitud: 78°30’17,22’’ O


4.2 Materiales

Fase de campo

4.2.1 Material vegetal

Partes aéreas de Verbena litoralis Kunth: hojas, tallos e inflorescencias

Partes aéreas de Duranta triacantha Juss: hojas, tallos e inflorescencias

4.2.2 Materiales para recolección de muestras

Fundas plásticas industriales

Tijeras

Flexómetro

Tijeras de podar

Papel de empaque

22

Fase de laboratorio

4.2.3 Equipos Balanza analítica, METTLER TOLEDO

Bomba de vacío

Estufa, THELCO

Microscopio invertido motorizado IX51 Olympus

Espectrofotómetro, FISHER SCIENTIFIC SP-2100UVPC

Molino ultra centrífugo ZM 200

Molino de corte SM 300

Mufla BINDER FD

Rotavapor Büchi B-490

4.2.4 Materiales de laboratorio Balones aforados (5, 10, 25, 50, 100 y 1000 mL)

Crisoles

Desecador

Embudo Büchner

Espátula

Frascos de vidrio con tapa de 250 mL

Guantes

Matraz Kitasato de 1000 mL

Porta objetos (20*40 mm)

Cubre objetos (20*20 mm)

Micropipetas de volúmenes variables (20 – 200 µL y 100 – 1000 µL)

Papel aluminio

Papel de empaque

Papel filtro

Papel filtro cuantitativo

Pera de succión

Plástico film

Pipetas graduadas de 5 y 10 mL

Probeta de 100 mL

Puntas para micropipeta

4.2.5 Reactivos

2, 2-Difenil-1-Picril Hidrazilo (DPPH) 200 ppm

Acetato de Etilo 99,5 %

Acetato de Plomo 4 %

Ácido Acético Glacial 99 %

Ácido Ascórbico 99,8 %

Ácido Clorhídrico 10 %

Agua destilada

Etanol 76 %

Etanol 95 %

Hipoclorito de Sodio 1 %

Metanol 99,9 %

Quercetina (QE) 95,3 %

Tricloruro de Aluminio 2 %

23

4.3 Métodos

4.3.1 Recolección e identificación de la muestra

Para este trabajo de investigación primero se obtuvo el certificado de identificación taxonómica (Anexo 2), por parte del Ing. Agr. Valdano Tafur, Docente de Botánica General y Sistemática de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador para las muestras vegetales tanto de verbena como de mote casha, que fueron identificadas como Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss respectivamente, de la familia Verbenaceae. Posteriormente, se recolectaron las muestras de hojas, tallos e inflorescencias de 10 plantas de cada especie en estudio, en el cantón Sangolquí, en los barrios Loreto y Cashapamba, teniendo en cuenta los materiales botánicos en un estado de desarrollo fisiológico maduro. Se consideró para Duranta triacantha Juss un aspecto liso y de color verde oscuro en las hojas, tallos leñosos y con espinos e inflorescencias de color morado, mientras que para Verbena litoralis Kunth, se tomó en cuenta un aspecto rugoso y verde claro para las hojas, tallos rugosos, e inflorescencias de color morado pálido.

Las muestras recolectadas de cada especie se empacaron en fundas plásticas para su traslado al Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

4.3.2 Selección, limpieza y desinfección

Se realizó la separación de inflorescencias, hojas y tallos de cada especie. La limpieza del material vegetal se llevó a cabo mediante el lavado con abundante agua a fin de reducir las impurezas superficiales de la muestra. Se desinfectó con una solución de hipoclorito de sodio al 1 %, durante 5 min, para su posterior secado (Soto Vásquez, 2011).

4.3.3 Secado

Se colocó 1000 g de cada parte de planta en cajas de papel, las muestras se etiquetaron y se secaron en una estufa THELCO a 35 °C. El secado de las inflorescencias de ambas especies se realizó durante 24 h, mientras que, para las hojas, los periodos de secado variaron de acuerdo a la especie, debido a su forma y tamaño, es así que para las hojas de verbena por su forma aserrada el secado duró 24 h y para las hojas de mote casha con forma ovoide, el proceso de secado se realizó durante 48 h.

En el caso de los tallos de ambas especies vegetales, previo al secado, se procedió a reducir su tamaño, con una tijera de podar, hasta alcanzar un corte de tres centímetros de largo, con el propósito de conseguir un procedimiento más rápido y uniforme, el cual se realizó durante 72 h (Kebele, Oromia, Belachew, & Zuberi, 2015).

4.3.4 Molienda

Debido a la contextura del material vegetal, para el proceso de molienda se utilizó un molino ultra centrífugo para materiales blandos y un molino de corte para materiales semiduros y fibrosos. Las muestras de hojas de ambas especies y, las inflorescencias de Duranta triacantha Juss fueron molidas en un molino ultra centrífugo, hasta un tamaño de partícula de 0,5 mm.

Por otro lado, para el material vegetal tallos de ambas especies, e inflorescencias de Verbena litoralis Kunth se empleó el molino de corte con el mismo tamaño de partícula, obteniéndose un polvo seco y uniforme (Salavati-Niasari, Javidi, & Dadkhah, 2013).

24

4.3.5 Almacenamiento del material vegetal

La cantidad de 500 g de cada una de las muestras secas y molidas se almacenaron en seis frascos de vidrio autoclavables TELCO, previamente etiquetados, con una capacidad de volumen de 1L.

4.3.6 Obtención del extracto etanólico de inflorescencias, hojas y tallos de Duranta triacantha Juss y Verbena litoralis Kunth.

Una muestra seca de 30 g se colocó en un frasco de 250 mL previamente cubierto con papel aluminio, se añadió un volumen de 120 mL de etanol al 76% y se mezcló. Cada muestra por triplicado se dejó macerar a temperatura ambiente y en un lugar protegido de la luz del sol, durante 3, 5 y 7 d (de Souza, Manfron, Zanetti, Hoelzel, & Pagliarin, 2005).

Una vez transcurrido el tiempo de maceración, cada extracto se filtró al vacío y se almacenó en refrigeración en frascos protegidos de la luz con papel aluminio.

4.3.7 Separación de clorofila de los extractos hidroalcohólicos

Se midió el volumen de cada extracto hidroalcohólico y se añadió un volumen igual de solución de acetato de plomo al 4 %: ácido acético al 0,5 %. Esta mezcla se dejó en reposo durante 15 minutos y se filtró (Rojas, Uribe, Martínez, & Niño, 2008).

Cada extracto de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss se llevó a un Rotavapor a fin de evaporar el solvente hasta un volumen constante de 50 mL, las condiciones de trabajo utilizadas fueron una temperatura de 35 °C, una frecuencia de 40 rpm, y un tiempo de 30 min. Los extractos fueron almacenados en frascos de vidrio ámbar previamente etiquetados, a 4 °C.

4.3.8 Cuantificación de Flavonoides totales

4.3.8.1 Preparación de la solución de Quercetina (QE)

Se preparó una solución concentrada de QE de 150 mgL-1 (ppm) en acetato de etilo al 100 %. A partir de esta solución se realizó una curva de calibración en intervalos de concentración de 1,5 mgL-1 hasta 10,5 mgL-1 (Tabla 5, Figura 3). Para preparar cada estándar se tomó un volumen de solución concentrada de acuerdo a la Tabla 5, en el cual se añadió 200 µL AlCl3 al 2 %, y se completó el volumen a 5000 µL con CH3COOH:MeOH al 5 %, se dejó en reposo durante 30 min en la obscuridad, posteriormente se leyó en el espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda de 425 nm (Hajdari et al., 2016).

25

Tabla 5. Preparación de soluciones estándar para la curva de calibración de QE.

Estándar Concentración,

mgL-1

Solución concentrada,

µL

ALCl3 2 %, µL

CH3COOH:MeOH 5 %, µL

1 1,5 50 200 4750

2 3,0 100 200 4700

3 4,5 150 200 4650

4 6,0 200 200 4600

5 7,5 250 200 4550

6 9,0 300 200 4500

7 10,5 350 200 4450

Nota: mg; miligramo, L; litro, μL; microlitro, AlCl3; Tricloruro de Aluminio, CH3COOH:MeOH; ácido acético en Metanol.

Figura 3. Curva de calibración de QE para la cuantificación de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss (longitud de onda 425 nm)

4.3.8.2 Preparación de la muestra

Se tomó 500 µL de extracto y se colocó en un tubo de ensayo, en el cual se añadió 200 µL de AlCl3 al 2 %, se completó el volumen a 5000 µL en CH3COOH: MeOH al 5 %, y se dejó en reposo durante un tiempo de 30 minutos en la obscuridad, posteriormente se leyó en el espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda de 425 nm.

y = 0,0698x + 0,009R² = 0,9979

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

Concentración quercetina, mg*L-1

26

4.3.9 Determinación de la Actividad antioxidante mediante la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH).

4.3.9.1 Barrido espectral

Se realizó un barrido espectral de una solución de DPPH a una concentración de 1000 ppm a una longitud de onda comprendida entre 190 y 800 nm en un intervalo de 1 nm. Mediante el barrido espectral se logró identificar la longitud de onda a la cual se trabajó para la determinación de la actividad antioxidante tanto de los estándares de ácido ascórbico como de los distintos extractos, misma que fue de 515 nm (Anexo 5).

4.3.9.2 Preparación de la solución concentrada de ácido ascórbico

Se preparó una solución concentrada de ácido ascórbico 1000 mgL-1 (ppm), en una solución de ácido acético en metanol al 5%. A partir de esta solución se realizó una curva de regresión lineal en intervalos de concentración de 2 mgL-1 hasta 14 mgL-1 (Tabla 6, Figura 5).

Para preparar cada estándar se tomó un volumen de solución patrón de acuerdo a la Tabla 6, en el cual se añadió 1500 µL de solución de DPPH 200 ppm, y se completó el volumen a 5000 µL con CH3COOH:MeOH al 5 %, se dejó en reposo durante 30 min en la oscuridad (Figura 4), se leyó en el espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda de 515 nm. Para la preparación del blanco se agregó 1500 µL de solución de DPPH y se completó el volumen a 5000 µL con CH3COOH:MeOH al 5 %, se dejó en reposo durante 30 min en la oscuridad, posteriormente, se leyó en el espectrofotómetro UV-visible a una longitud de onda de 515 nm (Anexo 32), (Milardovic, Ivekovic, Rumenjak, & Grabaric, 2005).

Figura 4. Reacción de coloración violeta a amarillo de la capacidad reductora del DPPH

27

Tabla 6. Preparación de soluciones estándar para la curva de regresión lineal de ácido ascórbico.

Estándar Concentración, mgL-1 Solución

patrón, µL DPPH,

µL CH3COOH:MeOH 5 %, µL

1 2 10 1500 3490

2 4 20 1500 3480

3 8 30 1500 3470

4 10 40 1500 3460

5 12 50 1500 3450

6 14 60 1500 3440

7 16 70 1500 3430

Nota: mg; miligramo, L; litro, μL; microlitro, DPPH; 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo, CH3COOH:MeOH; ácido acético en Metanol.

Figura 5. Curva de calibración del ácido ascórbico para la determinación de la actividad antioxidante de los extractos de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss

(longitud de onda 515 nm).

4.3.9.3 Preparación de la muestra

Se calculó el volumen de extracto necesario para alcanzar una concentración de flavonoides de 14 ppm a partir de la cantidad de flavonoides totales ya determinada, el volumen calculado se colocó en un tubo de ensayo cubierto con papel aluminio y se añadió 1500 µL de solución de DPPH 200 ppm, se completó el volumen a 5000 µL con ácido acético en metanol al 5%; se dejó en reposo por 30 minutos en la oscuridad y se leyó a 515 nm en el espectrofotómetro UV - visible. El mismo procedimiento se replicó para todos los extractos, constatado que la absorbancia resultante esté dentro del rango de absorbancias correspondiente a la curva de regresión lineal del ácido ascórbico.

y = -0,1186x + 1,5983R² = 0,982

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Ab

sorb

anci

a

Concentración ácido ascórbico, mg/L

28

Posteriormente, con los valores de las absorbancias obtenidas se determinó el porcentaje de inhibición del DPPH.

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = [1 − (𝐴2 − 𝐴3

𝐴1)]

Ecuación 3. Cálculo del porcentaje de inhibición del DPPH

Donde,

A1 = Absorbancia del patrón de referencia

A2 = Absorbancia de la muestra

A3 = Absorbancia del blanco de la muestra

4.4 Factores en estudio


Variables dependientes

Cantidad de flavonoides

Actividad antioxidante

Variables independientes

Factor A: Tiempo de maceración

D3= 3 días

D5= 5 días

D7= 7 días

Factor B: Parte de la planta

H1 = hoja

T1 = tallo

I1 = inflorescencia


Variables dependientes



29

Variables independientes

Tiempo de maceración

D3= 3 días

D5= 5 días

D7= 7 días

Parte de la planta

H2 = hoja

T2 = tallo

I2 = inflorescencia

4.5 Tratamientos

Tabla 7. Tratamientos formulados para la cuantificación de flavonoides y actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth.

Tratamiento Código Interpretación

T1 D3H1 Tiempo de maceración de hojas de Verbena litoralis Kunth, en el día 3.

T2 D3T1 Tiempo de maceración de tallos de Verbena litoralis Kunth, en el día 3.

T3 D3I1 Tiempo de maceración de inflorescencias de Verbena litoralis Kunth, en el día 3.







Nota: D; día, H; hoja, T; tallo, I; inflorescencia

30

Tabla 8. Tratamientos formulados para la cuantificación de flavonoides y actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss.

Tratamiento Código Interpretación

T1 D3H2 Tiempo de maceración de hojas de Duranta triacantha Juss, en el día 3.

T2 D3T2 Tiempo de maceración de tallos de Duranta triacantha Juss, en el día 3.

T3 D3I2 Tiempo de maceración de inflorescencias de Duranta triacantha Juss, en el día 3.







Nota: D; día, H; hoja, T; tallo, I; inflorescencia.

4.6 Unidad experimental


El estudio se aplicó en extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth, que consistieron en 30 g de muestra en 50 mL de extracto.

Número de observaciones 3

Número de tratamientos 9

Número total 27


El estudio se aplicó en extractos hidroalcohólicos de Duranta triacantha Juss, que consistieron en 30 g de muestra en 50 mL de extracto.

Número de observaciones 3

Número de tratamientos 9

Número total 27

31

4.7 Diseño de la investigación

4.7.1 Nivel de investigación

Esta investigación englobó el nivel exploratorio y correlacional, permitiendo analizar los extractos hidroalcohólicos de las hojas, tallos e inflorescencias de plantas endémicas, verbena y mote casha con mayor concentración de flavonoides totales expresados en mg*mL-1 de extracto, estudiar la actividad antioxidante de los extractos y comparar con el día de maceración y la parte de planta.

4.7.2 Diseño experimental

El modelo de análisis estadístico experimental que se utilizó fue diseño completamente aleatorizado A*B, este se aplicó para cada planta por separado. Se estudió un total de 27 unidades experimentales tanto para Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, que consistieron en extractos hidroalcohólicos de 30 g de muestra en 50 mL de extracto. Se realizó el análisis de la varianza (ADEVA) (Tabla 9, Tabla 10), donde se utilizó nueve tratamientos (Tabla 7, Tabla 8), con tres observaciones.

4.8 Esquema del análisis de varianza.

Tabla 9. Esquema del Análisis de Varianza para Verbena litoralis Kunth.

Fuentes de variación GL CM

Total 26

Tiempo de maceración 2 -

Parte de planta 2 -

Tiempo de maceración (A) * Parte de planta (B) 4 -

Error experimental 16

CV -

Promedio -

32

Tabla 10. Esquema del análisis de varianza para Duranta triacantha Juss.


Total 26

Tiempo de maceración 2 -

Parte de planta 2 -

Tiempo de maceración (A) * Parte de planta (B) 4 -

Error experimental 16

CV -

Promedio -

4.9 Análisis funcional

Con los datos obtenidos se realizó la prueba de Shapiro-Wilks para verificar el cumplimiento de los supuestos de normalidad requeridos para el ADEVA. Se realizó la prueba de Tukey (Alpha = 0,05) para las variables paramétricas, a fin de comparar las interacciones entre los factores en estudio, tiempo de maceración y parte de planta en las especies Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss. Se empleó el software estadístico Infostat versión estudiantil 2018.

4.10 Definición de variables

4.10.1 Cantidad de flavonoides

Se cuantificó la cantidad de flavonoides totales en cada extracto de las hojas, tallos e inflorescencias de las especies vegetales de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss, en un periodo de tiempo de 3, 5 y 7 días de maceración. El resultado se expresó en mg de QE*mL-1 de extracto hidroalcohólico, en donde se midió el grado de absorbancia a una longitud de onda de 425 nm, en relación con el tiempo de maceración. Esta variable se evaluó con la ayuda de un espectrofotómetro.

4.10.2 Actividad antioxidante

Se evaluó el grado de absorbancia con la ayuda de un espectrofotómetro, el medio de reacción en relación con el tiempo de maceración de cada extracto de las hojas, tallos e inflorescencias de cada una de las especies vegetales Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss. La absorbancia fue medida con un espectrofotómetro a 515 nm, y el resultado se expresó como porcentaje de inhibición del radical DPPH.

33

4.11 Operacionalización de variables

Se realizó la operacionalización de variables (Tabla 11) para descomponer cada variable según su tipo e identificar los indicadores que permitieron realizar su medición de forma cuantitativa.

Tabla 11. Operacionalización de variables

Variable Tipo de variable

Operacionalización Indicadores Nivel de medición

Unidad de medida

Índice


Dependiente

Determinación cuantitativa de la cantidad de flavonoides totales en cada extracto

Grado de absorbancia medido a 425 nm en relación con el tiempo de maceración que presenta cada extracto

Numérico

mg de quercetina (QE)* mL-1 de extracto hidroalcohólico

Flavonoides totales cuantificados a 425 nm


Dependiente

Cuantificación de la reducción de la absorbancia del radical DPPH por antioxidantes presentes en el extracto alcohólico

Grado de absorbancia medido a 517 nm en relación con el tiempo de maceración que presenta cada extracto

Numérico % de inhibición del radical DPPH

Secuestro del radical DPPH cuantificado a 517 nm

Tiempo de maceración

Independiente

Días que está en contacto el material vegetal seco con el etanol 76°

Días de maceración Nominal Días Maceración a los 3, 5 y 7 días

Parte de la planta

Independiente

Polvo seco de las distintas partes aéreas de Verbena litoralis K, y Duranta triacantha J,

Hojas, tallos e inflorescencias de Verbena litoralis K, y Duranta triacantha J,

Nominal Gramos Masa de cada parte de la especie vegetal

34

5 Resultados y discusión 5.1 Obtención del extracto etanólico de inflorescencias, hojas y tallos de Verbena

litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss.

En la obtención de los extractos hidroalcohólicos de hojas, tallos e inflorescencias de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, el tiempo de maceración constituye una variable independiente debido a que se quiere conocer la influencia del tiempo en la extracción de los flavonoides totales de las dos especies botánicas en estudio, para la posterior cuantificación de flavonoides totales y determinación antioxidante de los mismos.

5.2 Precipitación de la clorofila de los extractos hidroalcohólicos para Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss.

La precipitación de clorofilas de los extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, se realizó para evitar la interferencia de las clorofilas en la cuantificación de flavonoides totales. Según Benmehdi, Hasnaoui, Benali, & Salhi, (2012), la precipitación de clorofilas tiene como finalidad eliminar el color verde obscuro de los extractos, puesto que este podría producir un valor de absorbancia erróneo en la cuantificación de flavonoides por el método espectrofotométrico.

5.3 Cuantificación de flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth

Se realizó una curva de calibración del flavonoide quercetina para la cuantificación de flavonoides totales, presentes en los extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss. El coeficiente de correlación obtenido fue de 0,9979 (Figura 3), el cual es adecuado, para trabajar con la ecuación de la recta determinada, misma que permite el cálculo de la concentración de flavonoides en cada extracto.

Figura 6. Cantidad de flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Tratamiento

Flav

on

oid

es t

ota

les,

mg/

mL

extr

acto

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

35

En el Anexo 3 y Figura 6, se observan las cuantificaciones de flavonoides totales expresados en mg*mL-1 de extracto, para tres tiempos de maceración (3, 5 y 7 d) procedentes de hojas, tallos e inflorescencias de Verbena litoralis Kunth. La mayor concentración de flavonoides se encontró en el material botánico hojas en el día 5 de maceración, con una media de 0,204 mg*mL-1, el cual se comparó con el valor obtenido en el estudio de Garrido, Ortiz, & Pozo (2013), en el que maceraron hojas en etanol al 78 %, de Lampaya medicinalis F. Phil de la familia Verbenaceae y reporta un valor de 0,136 mg*mL-1.

Tabla 12. ADEVA para la variable cantidad de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth


Total 26

Tiempo de maceración 2 0,0013***

Parte de planta 2 0,03***

Tiempo de maceración*Parte de planta

4 0,0028***

Error 18 0,0000

CV (%) 6,17

Promedio 0,12 mg*mL-1

Nota: *** p-valor 0,01 – 0,0001 = diferencias estadísticas altamente significativas.

Se realizó las pruebas de normalidad Shapiro-Wilks (Anexo 28), las cuales muestran que los datos tienen una distribución normal.

La Tabla 12 indica los resultados obtenidos en el ADEVA para la variable cantidad de flavonoides de Verbena litoralis Kunth, se determinó diferencias estadísticas altamente significativas para el tiempo de maceración, parte de planta y para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, el valor promedio obtenido fue de 0,12 mg*mL-1 con un coeficiente de variación (CV) de 6,17%.

36

Tabla 13. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable cantidad de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth.

Tratamiento Tiempo de maceración

Parte de planta

Medias n e.e

T4 5 Hojas 0,20 3 0,00 a

T7 7 Hojas 0,18 3 0,00 b

T9 7 Inflorescencias 0,14 3 0,00 c

T6 5 Inflorescencias 0,14 3 0,00 c

T3 3 Inflorescencias 0,12 3 0,00 c d

T1 3 Hojas 0,12 3 0,00 d

T2 3 Tallos 0,07 3 0,00 e

T5 7 Tallos 0,04 3 0,00 f

T8 5 Tallos 0,04 3 0,00 f

Nota: n; número de datos, e.e; error estándar. Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).

El resultado de la prueba de Tukey al 5 % para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, identificó 6 rangos de significancia estadística (Tabla 13).

Encontrándose en el primer rango con la mejor respuesta a la variable, se ubicó la interacción día 5*hojas de Verbena litoralis Kunth con una media de 0,20 mg*mL-1 de extracto, y con la menor respuesta ocupando el sexto rango se ubicaron las interacciones día 5*tallos y día7*tallos de Verbena litoralis Kunth con medias de 0,04 mg*mL-1 de extracto respectivamente, resultados que concuerda con los obtenidos por Gracia (2009) en el que menciona que en las hojas es donde se biosintetizan los flavonoides, como pigmentos hidrosolubles. Calzada-Sánchez, Aguilar-Rodríguez, López-Villafranco, & Aguilar-Contreras (2014) hacen mención que la mayor cantidad de flavonoides están presentes en las hojas, tal como los resultados obtenidos en esta investigación, además, en este estudio se encontraron pequeñas cantidades de flavonoides en el material vegetal inflorescencias.

37

Figura 7. Polinomios ortogonales de la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Verbena litoralis Kunth sobre la variable cantidad de flavonoides totales.

En la Figura 7 se observa la evolución de los mg*mL-1 de extracto hidroalcohólico en las partes de planta de Verbena litoralis Kunth durante el tiempo de maceración. Verbena litoralis Kunth alcanzó su pico de tiempo de maceración en el día 5 y en el material vegetal hojas.

Los flavonoides totales han sido reportados en diversas especies de la familia Verbenaceae realizándose estudios sobre especies del género Aloysia, Lantana, Lippia y Lampaya (Pérez Trueba & Martínez Sánchez, 2001). Sin embargo, a pesar del interés demostrado por el estudio de esta familia, las investigaciones sobre la especie Verbena litoralis Kunth son mínima. En este estudio, se extrajo casi la totalidad de flavonoides en las hojas, según Harborne (2003) las altas concentraciones de flavonoides se debe al crecimiento celular de las hojas el cual ocurre en áreas altamente expuestas a la radiación UV, lo que incrementa la biosíntesis de flavonoides.

5.4 Cuantificación de flavonoides totales para Duranta triacantha Juss.

Figura 8. Cuantificación de flavonoides totales para Duranta triacantha Juss

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

3 5 7

Flav

on

oid

es t

ota

les,

mg/

mL

extr

acto

Tiempo, días

Hojas

Tallos

Inflorescencias

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

Tratamiento

Flav

on

oid

es t

ota

les,

mg/

mL

extr

acto

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

38

En el Anexo 4 y la Figura 8 se reportan las cuantificaciones de los flavonoides totales expresados en mg*mL-1 de los extractos hidroalcohólicos, para un periodo de maceración de 3, 5 y 7 días, en tres diferentes partes de material botánico: hojas, tallos e inflorescencias para Duranta triacantha Juss. Encontrándose una mayor concentración de flavonoides totales, en el material vegetal hojas con una media de 0,779 mg*mL-1, correspondiente al día de maceración 5, dicho valor de investigación, se comparó con el estudio de Coll Aráoz & Abdala (2005) en el que maceraron hojas con etanol al 98 % de Lippia turbinata Griseb (Verbenaceae), reportando una mayor concentración de flavonoides totales en las hojas con un valor de 0,16 mg*mL-1. Por lo que el contenido de flavonoides totales presentes en las hojas, varía de acuerdo a la especie, puesto que los valores de Duranta triacantha Juss supera a Lippia turbinata Griseb.

Tabla 14. ADEVA para la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss.


Total 26




4 0,01***

Error 18 0,0000

CV (%) 4,00

Promedio 0,34 mg*mL-1


Se realizó las pruebas de Normalidad de Shapiro-Wilks (modificado), donde se demostró que los resultados de los datos evaluados durante la investigación, presentan distribución normal (Anexo 8).

Los resultados obtenidos en el análisis de varianza (ADEVA) para la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss se presentan en la Tabla 14. Se determinó diferencias estadísticas significativas para el tiempo de maceración, parte de planta y para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, el valor promedio obtenido fue de 0,34 con un coeficiente de variación (CV) de 4,00%.

39

Tabla 15. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss.


Parte de planta

Medias n e.e

T4 5 Hojas 0,78 3 0,01 a

T1 3 Hojas 0,64 3 0,01 b

T7 7 Hojas 0,54 3 0,01 c

T6 5 Inflorescencias 0,33 3 0,01 d


T9 7 Inflorescencias 0,26 3 0,01 e

T8 7 Tallos 0,06 3 0,01 f

T5 5 Tallos 0,06 3 0,01 f

T2 3 Tallos 0,06 3 0,01 f


El resultado de la prueba de Tukey al 5 % para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, identificó 6 rangos de significancia (Tabla 15). Encontrándose en el primer rango con la mejor respuesta a la variable cantidad de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss, y se ubicó la interacción día5*hojas de Duranta triacantha Juss con una media de 0,78 mg*mL-1 de extracto, y con la menor respuesta ocupando el sexto rango se ubicaron las interacciones día 7*tallos, día 5*tallos y día 3*tallos de Duranta triacantha Juss con medias de 0,06 mg*mL-1 de extracto respectivamente.

Juss. Verma & Siddiqui (2011) en su estudio de compuestos bioactivos en Verbena officinalis Linn, demuestran que la abundancia de flavonoides se encuentran en las hojas con valores de 0,15 mg*mL-1 y 0,12 mg*mL-1. En las hojas es en donde se realizan las reacciones de biosíntesis de principios activos, entre dichas reacciones está la de los flavonoides totales, con lo que se corrobora los datos que se obtuvieron en esta investigación.

Ricco, Wagner, & Gurni (2011) maceraron hojas, de Aloysia citrodora Paláu (cedrón) correspondiente a la familia Verbenaceae, y encontraron que en este órgano vegetal están presentes una alta cantidad de flavonoides, a través de la ruta del ácido shikímico y la ruta de los policétidos. También se encontraron pequeñas cantidades de flavonoides totales en las inflorescencias porque en las flores se encuentran los mecanismos de

40

regulación y diversas funciones metabólicas de suma importancia para la formación de flavonoides (Candeias, Assoah, & Simeonov, 2018)

Figura 9. Polinomios ortogonales de la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Duranta triacantha Juss sobre la variable de flavonoides totales.

En la Figura 9 se observa la evolución de las concentraciones de flavonoides totales en la parte de planta de Duranta triacantha Juss durante el tiempo de maceración, una clara evidencia es la presencia de una tendencia cuadrática de los polinomios ortogonales que a medida que aumenta el día de maceración incrementa los flavonoides totales de igual forma los días de maceración 3 y 7 presentaron una menor cantidad de flavonoides totales respectivamente, Duranta triacantha Juss alcanzó su pico de tiempo de maceración en el día 5 y en el material botánico hojas.

Las rutas metabólicas comprendidas para la síntesis de flavonoides totales incluyen las rutas del ácido shikímico y del acetato que a su vez depende de la capacidad de la planta para poner a disposición de su batería enzimática los compuestos precursores de estas moléculas y que indirectamente dependen de factores tales como la especie vegetal, la época de recolección, y las funciones características que cumplen dentro de la especie vegetal las cuales permiten la derivación metabólica a la síntesis de compuestos específicos y que hoy en día se vinculan también con el metabolismo primario de la planta (Candeias et al., 2018).

La importancia de la presencia de flavonoides totales radica en su actividad como antioxidantes naturales. Estudios recientes, como el presentado por Villarreal La Torre (2019), han demostrado que muchos constituyentes de compuestos flavonoides derivados de plantas son antioxidantes más eficaces que la vitamina C.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

3 5 7

Flav

on

oid

es t

ota

les,

mg/

mL

extr

acto

Tiempo de maceración, días

Hojas

Tallos

Inflorescencias

41

5.5 Determinación de la actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth.

En el Anexo 6 se muestra el porcentaje de inhibición del radical DPPH en la determinación de la actividad antioxidante, encontrándose un valor promedio de 95,067 %, correspondiente al tratamiento 1 (día de maceración 3, material botánico hojas), estos resultados están en relación directa con las altas concentraciones de flavonoides totales presentes en los extractos hidroalcohólicos en estudio, razón por la cual se considera que los flavonoides son de suma importancia en la captación del radical DPPH, tal como lo señala Garrido et al (2013). En esta investigación se reporta un valor de 84,912 % de inhibición para las hojas de Lampaya medicinalis F. Phil, y se argumenta que los flavonoides poseen una estructura química adecuada para ejercer una acción antioxidante actuando como captadores de radicales libres.

Tabla 16. ADEVA para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth.


Total 26




4 22,03***

Error 18 0,68

CV (%) 0,91

Promedio (%) 89,82

Nota: *** p-valor 0,01 – 0,0001 = diferencias estadísticas altamente significativas

Se realizó las pruebas de Normalidad Shapiro-Wilks (modificado), donde se demostró que los residuos de los datos evaluados durante la investigación presentan una distribución normal (Anexo 8).

Los resultados obtenidos en el análisis de varianza (ADEVA) para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth se muestran en la Tabla 16. Se determinó diferencias estadísticas altamente significativas para el tiempo de maceración, parte de planta y para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, el valor promedio obtenido fue de 89,82%, con un coeficiente de variación (CV) de 0,91%.

42

Tabla 17. Prueba de Tukey de las interacciones tiempo de maceración*parte de planta para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth.


Parte de planta

Medias n e.e

T1 3 Hojas 95,07 3 0,48 a

T4 5 Hojas 92,99 3 0,48 b

T5 5 Tallos 92,40 3 0,48 c

T8 7 Tallos 92,21 3 0,48 c

T7 7 Hojas 91,54 3 0,48 c d


T6 5 Inflorescencias 89,78 3 0,48 d e

T9 7 Inflorescencias 88,04 3 0,48 e f

T2 3 Tallos 86,36 3 0,48 f


El resultado de la prueba de Tukey al 5 %, para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, identificó 6 rangos de significancia (Tabla 17). Encontrándose en el primer rango con la mejor respuesta a la variable, se ubicó la interacción día3*hojas de Verbena litoralis Kunth con una media de 95,07 % de inhibición y con la menor respuesta ocupando el sexto rango se ubicó la interacción día 3*tallos de Verbena litoralis Kunth con una media de 86,36 % de inhibición respectivamente.

Según el estudio de Aguado, Nuñez, Bela, Okulik, & Bregni (2013), donde se identifica la actividad antioxidante en las hojas de Aloysia polystachya Griseb & Mold. (Verbenaceae), los flavonoides ejercen un rol importante en la captación de radicales libres responsables de la oxidación. En esta investigación, se presenta el mecanismo en el que los flavonoides ejercen su actividad antioxidante mediante el método de inhibición de determinadas oxidasas, el cual está relacionado con la estructura de los flavonoles.

43

Figura 10. Polinomios ortogonales para la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Verbena litoralis Kunth sobre la variable actividad antioxidante.

En la Figura 10 se observa la evolución del porcentaje de inhibición del DPPH en la parte de planta hojas de Verbena litoralis Kunth durante el tiempo de maceración, una clara evidencia es la presencia de una tendencia cuadrática de los polinomios ortogonales, puesto que, a medida que el porcentaje de inhibición incrementa, aumenta el día de maceración, de igual forma los días de maceración 5 y 7 presentaron una menor cantidad de inhibición del radical DPPH, Verbena litoralis Kunth alcanzó su pico de tiempo de maceración en el día 3 y en el material botánica hojas. Por ende, los flavonoides totales contienen en su estructura un número de grupos hidroxilos tipo fenólicos con excelentes propiedades de quelación de hierro y otros metales de transición lo que le confiere una gran capacidad antioxidante.

Los resultados de la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohólicos para los diferentes días de maceración y partes de material botánico hojas, tallos e inflorescencias indican que la mayor capacidad antioxidante la exhiben las hojas, en sus extractos obtenidos por maceración durante 3 días. Por lo expuesto anteriormente los extractos hidroalcohólicos analizados, ricos en flavonoides totales y con una marcada actividad antioxidante posteriormente podrían constituir una opción validada en la aplicación de usos medicinales (Xu et al., 2017).

Figura 11. Porcentaje de inhibición del DPPH de cada tratamiento para la variable actividad antioxidante de Verbena litoralis Kunth.

La Figura 11 indica el porcentaje de inhibición del DPPH por parte de los extractos de Verbena litoralis Kunth, comparado con el porcentaje de inhibición del DPPH de

82,00

84,00

86,00

88,00

90,00

92,00

94,00

96,00

3 5 7

Po

rce

nta

je d

e in

hib

ició

n

de

l DP

PH

, %


Hojas

Tallos

Inflorescencias

80,00

82,00

84,00

86,00

88,00

90,00

92,00

94,00

96,00

98,00

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Ácidoascórbico

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

D

PP

H, %

Tratamientos

44

estándar ácido ascórbico (vitamina C). Los resultados de la actividad antioxidante, expresados como el porcentaje de inhibición del DPPH, de las diferentes muestras de extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth, indican una actividad antioxidante significativa en los tratamientos 1 y 4, correspondiente a los extractos obtenidos de hojas de verbena en los días de maceración 3 y 5.

Stashenko, Jaramillo, & Martínez (2003), investigaron la actividad antioxidante en tres plantas de la Familia Verbenaceae, se encontró que existen diferentes mecanismos que evitan la oxidación, entre los que se citan, la interrupción de la reacción en cadena de la peroxidación, y la formación de quelatos en forma de iones metálicos. Por lo tanto, la capacidad antioxidante de compuestos bioactivos como flavonoides es alta, ya que está relacionada con varios mecanismos de protección contra la peroxidación.

5.6 Determinación de la actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss.

En el Anexo 7 se presenta los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohólicos de Duranta triacantha Juss expresados como porcentaje de inhibición del DPPH. En esta investigación se encontró el mayor porcentaje de inhibición promedio en el material botánico inflorescencias, para el día de maceración 3, con un valor de 95,329 %. Puesto que se determinó la mayor cantidad de flavonoides en hojas de Duranta triacantha Juss, se esperaba que la mejor actividad antioxidante también sea producida por este extracto, sin embargo, el mayor porcentaje de inhibición lo exhibió el extracto de inflorescencias de mote casha, lo cual se debería al efecto total de una mezcla de componente presentes en este extracto. De acuerdo al estudio Aguado et al (2013), en Aloysia polystachya Griseb. & Moldenke., (Verbenaceae), la actividad antioxidante se debe en parte a la presencia de flavonoides y otros compuestos activos en los extractos hidroalcohólicos, de Duranta triacantha Juss, puesto que, su estructura química tiene grupos funcionales que actúan atrapando radicales libres o donando hidrógenos o electrones para evitar la oxidación (Xu et al., 2017).

Tabla 18. ADEVA para la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss


Total 26




4 49,88***

Error 18 0,20

CV (%) 0,50

Promedio (%) 90,52


45

Se realizó la prueba de Normalidad Shapiro-Wilks (modificado), en donde se demostró que los residuos de los datos evaluados durante la investigación presentan distribución normal (Anexo 9).

Los resultados obtenidos en el análisis de varianza (ADEVA), para la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss se indican en la Tabla 18 Se determinó diferencias estadísticas altamente significativas para el tiempo de maceración, parte de planta y para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, el valor promedio obtenido fue de 90,52 % con un coeficiente de variación (CV) de 0,50 %.

La actividad antioxidante de los flavonoides totales resulta de una combinación de sus propiedades quelantes de hierro y secuestradoras de especies reactivas del oxígeno (ERO), además de la inhibición de enzimas, tales como: lipoxigenasa, ciclo-oxigenasa, mieloperoxidasa y NADPH oxidasa; evitando así la formación de especies reactivas del oxígeno e hidroxi-peróxidos orgánicos (Enciso & Arroyo, 2013).

Tabla 19. Prueba de Tukey para los tratamientos sobre la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss.


Parte de planta

Medias n e.e

T3 3 Inflorescencias 95,33 3 0,26 a

T9 7 Inflorescencias 94,87 3 0,26 a

T2 3 Tallos 92,93 3 0,26 b

T7 7 Hojas 92,14 3 0,26 b

T4 5 Hojas 90,26 3 0,26 c

T5 5 Tallos 89,09 3 0,26 c

T1 3 Hojas 87,12 3 0,26 d


T8 7 Tallos 86,23 3 0,26 d


El resultado de la prueba de Tukey al 5 % para la interacción tiempo de maceración*parte de planta, se identificó 4 rangos de significancia (Tabla 19). Los nueve tratamientos si presentan diferencias significativas, sin embargo, se encontró una alta cantidad del porcentaje de inhibición en las inflorescencias de Duranta triacantha Juss para la variable actividad antioxidante. Celis, Escobar, Isaza, Stashenko, & Martínez (2007) reportan que los flavonoides ejercen su actividad antioxidante, mediante la inhibición en diversas enzimas. Como, por ejemplo, han demostrado poseer un efecto inhibitorio sobre la enzima xantina oxidasa (XO), siendo los flavonoides totales los que poseen un mayor efecto inhibitorio en las inflorescencias de Duranta triacantha Juss. Respecto a la relación estructura actividad antioxidante, la capacidad neutralizadora de

46

radicales libres de los flavonoides depende de los oxidrilos en el anillo B y también de la presencia de un grupo 3-OH-1 libre. A este grupo se le atribuye, en parte, la superioridad que posee los flavonoides totales de mote casha de inhibir el daño oxidativo inducido tanto por metales, ya que se aumenta la estabilidad del radical flavonoide como lo señala Londoño (2012).

Figura 12. Polinomios ortogonales para la interacción tiempo de maceración*parte de planta de Duranta triacantha Juss sobre la variable actividad antioxidante.

Los resultados obtenidos en esta investigación indican que la actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss, incrementan conforme aumente el día de maceración del extracto hidroalcohólico; es así que la mayor actividad antioxidante se presenta en los extractos de inflorescencias correspondientes a los días 3 y 7 de maceración. Para el análisis de la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohólicos (Figura 12), se comparó con el estudio de Rafael A. Ricco et al (2010), en el que usaron extractos hidroalcohólicos de tallos e inflorescencias de Lippia graveolens HBK var. berlandieri Schauer, presentando un mayor porcentaje de inhibición por el método del radical DPPH en inflorescencias, además, en este estudio se explica que los flavonoides poseen una estructura química adecuada para ejercer una acción antioxidante, actuando como agentes reductores de radicales libres.

Figura 13. Porcentaje de inhibición del radical DPPH para la variable actividad antioxidante de Duranta triacantha Juss.

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

3 5 7

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

del

D

PP

H, %


Hojas

Tallos

Inflorescencias

80,00

82,00

84,00

86,00

88,00

90,00

92,00

94,00

96,00

98,00

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 ÁcidoascórbicoP

orc

enta

je d

e in

hib

ició

n d

el D

PP

H,

%

Tratamientos

47

La Figura 13 permite comparar el porcentaje de inhibición del radical DPPH de los extractos hidroalcohólicos de Duranta triacantha Juss con el porcentaje de inhibición del estándar (Vitamina C). Se puede apreciar que los tratamientos 3 y 9 son similares al ácido ascórbico, dichos tratamientos corresponden a los extractos de inflorescencias de mote casha obtenidos en 3 y 7 días de maceración. Si bien la actividad antioxidante está relacionada con la cantidad de flavonoides totales, en esta investigación existe un contraste, ya que la mayor cantidad de flavonoides determinados para mote casha se encuentra en sus hojas, se cree que esta diferencia es debida a que las plantas presentan en su composición cantidades variables de otros metabolitos secundarios, como alcaloides y fenoles, que también poseen actividad antioxidante y quizá produjeron un efecto sinérgico.

48

6 Conclusiones

Mediante la cuantificación de flavonoides totales expresados en mg*mL-1 de extracto hidroalcohólico, para las muestras de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss y con el análisis de varianza ADEVA, se establece que el mejor periodo de maceración fue el día 5 en ambas plantas endémicas con el material vegetal hojas, obteniendo una concentración de 0,204 mg*mL-1 para Verbena litoralis Kunth en el tratamiento 4 y, 0,780 mg*mL-1 para Duranta triacantha Juss en el tratamiento 4.

La mejor actividad antioxidante, expresada como porcentaje de inhibición de DPPH, se obtuvo en las hojas de Verbena litoralis Kunth en el tratamiento 1 correspondiente al día de maceración 3, con un valor de 95,067 %. Para el caso de Duranta triacantha Juss la mejor actividad antioxidante corresponde al tratamiento 3, es decir inflorescencias en un tiempo de maceración de 3 días, resultando un valor de inhibición promedio de 95,329 %.

Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss son plantas endémicas importantes para investigaciones en compuestos bioactivos, en esta investigación se encontró una alta cantidad de flavonoides totales, al igual que el porcentaje de inhibición, por lo que la mayor abundancia de flavonoides totales se encuentra en las hojas para las dos plantas endémicas y para el porcentaje de inhibición del DPPH en las inflorescencias de mote casha y en las hojas de verbena.

49

7 Recomendaciones

Mediante cromatografía líquida de alta resolución (HLPC), y cromatografía de masas investigar que otros compuestos bioactivos están presentes en las dos plantas estudiadas.

Seguir investigando en Verbena litoralis Kunth, Duranta triacantha Juss, y en otras plantas endémicas, hasta que se puntualice en libros de Botánica, especialmente de especies endémicas.

Proponer protocolos de manejo agrotecnológico de plantas endémicas para evitar su extinción.

50

8 Resumen

Ecuador es un país que se caracteriza por su diversidad botánica, donde sus comunidades y etnias poseen un conocimiento ancestral en cuanto al uso de distintas plantas como agentes terapéuticos para tratar múltiples afecciones. A pesar de que muchas plantas se emplean para el tratamiento de algunas enfermedades, muchas veces no existe fundamento científico que sustente sus propiedades medicinales.

Por otro lado, debido al cambio climático, el uso irracional de algunas especies y la biopiratería, en los últimos, años se ha producido una pérdida acelerada del conocimiento ancestral relacionado con la fitoterapia, es por ello que surge la necesidad de investigar la actividad biológica de las plantas usadas en medicina ancestral, en especial de las plantas endémicas. Tal es el caso de Verbena litoralis Kunth, (verbena) y Duranta triacantha Juss, (mote casha).

Es por ello que esta investigación estuvo enfocada en el estudio del contenido de flavonoides totales y la determinación de la actividad antioxidante de plantas endémicas: Verbena litoralis Kunth (verbena), y Duranta triacantha Juss (mote casha). Las especies botánicas fueron recolectadas en el cantón Rumiñahui, parroquia Sangolquí en los sectores de Loreto (verbena) y Cashapamba (mote casha). La parte experimental se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador.

Ya en la fase de laboratorio, se procedió a obtener los extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, para cada planta se plantearon 9 tratamientos correspondientes a las variables independientes tiempo de maceración (3, 5 y 7 días) y parte de la planta (hoja, tallo e inflorescencia), cada tratamiento tuvo un número de 3 observaciones, lo que quiere decir que se realizaron 27 extractos de cada planta.

Posteriormente se procedió a cuantificar los flavonoides totales en cada extracto mediante el método espectrofotométrico, elaborando una curva de calibración con quercetina como estándar. Los resultados se expresaron en mg*mL-1 de extracto hidroalcohólico para las muestras de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss, mediante el análisis de varianza y la prueba de Tukey se estableció que la extracción de flavonoides totales fue mejor en el tratamiento 4 correspondiente al día de maceración 5 para las dos plantas en estudio, obteniéndose una mayor concentración de flavonoides en Duranta triacantha Juss (0,780) en comparación con Verbena litoralis Kunth (0,204).

La siguiente parte de la investigación consistió en determinar la actividad antioxidante de los extractos hidroalcohólicos de Verbena litoralis Kunth, y Duranta triacantha Juss, este procedimiento se efectuó mediante el método del DPPH, donde los flavonoides actúan como agentes reductores del radical DPPH debido a su estructura química. Se encontró que para Verbena litoralis Kunth el mejor tratamiento fue el número 1, es decir, el extracto obtenido de las hojas en un tiempo de maceración de 3 días, con un valor de 95,067 %. Por otro lado, Duranta triacantha Juss mostró la mejor actividad antioxidante con el tratamiento 3, es decir, el extracto obtenido de inflorescencias en un tiempo de maceración de 3 días, resultando un valor de inhibición promedio de 95,329 %.

Existen diferencias entre los días de maceración para la cuantificación de flavonoides totales y la actividad antioxidante esto se debe a que las dos plantas estudiadas, Verbena

51

litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss, presentan otros metabolitos secundarios, que posiblemente contribuyen con la actividad antioxidante.

52

Summary

Ecuador is a country characterized by its botanical diversity, where its communications and ethnicities have an ancestral knowledge regarding the use of different plants as therapeutic agents to treat multiple conditions. Although many plants are used to treat some diseases, there is often no scientific basis to support their medicinal properties.

On the other hand, due to climate change, the irrational use of some species and biopiracy, in recent years there has been an accelerated loss of ancestral knowledge related to phytotherapy, which is why the need arises to investigate the biological activity of plants used in ancestral medicine, especially endemic plants. Such is the case of Verbena litoralis Kunth, (verbena) and Duranta triacantha Juss, (mote casha).

That is why this research was focused on the study of the content of total flavonoids and the determination of the antioxidant activity of endemic plants: verbena Verbena litoralis Kunth, and mote casha Duranta triacantha Juss. The botanical species were collected in the canton of Rumiñahui, Sangolquí parish in the sectors of Loreto (verbena) and Cashapamba (mote casha). The experimental part was carried out in the Laboratory of Natural Products of the Faculty of Chemical Sciences of the Central University of Ecuador; as a first instance, a quality control of the botanical material was carried out to verify whether it meets the parameters established for later use.

After quality control of the two plants under study, the hydroalcoholic extracts of Verbena litoralis Kunth and Duranta triacantha Juss were obtained, for each plant 9 treatments corresponding to the variables were proposed independent maceration time (3, 5 and 7 days) and part of the plant (leaf, stem and inflorescence), each treatment had a number of 3 observations, which means that 27 extracts were made from each plant.

Subsequently, the total flavonoids in each extract were quantified using the spectrophotometric method, developing a calibration curve with quercetin as standard. The results were expressed in mg*mL-1 of hydroalcoholic extract for samples of Verbena litoralis Kunth, and Duranta triacantha Juss, through the analysis of variance and the Tukey test it was established that the extraction of total flavonoids was better in the treatment 4 corresponding to the day of maceration 5 for the two plants under study, obtaining a higher concentration of flavonoids in Duranta triacantha Juss (0.780) compared to Verbena litoralis Kunth (0.204).

The next part of the research consisted of determining the antioxidant activity of the hydroalcoholic extracts of Verbena litoralis Kunth, and Duranta triacantha Juss, this procedure was performed using the DPPH method, where flavonoids act DPPH radical reducing agents due to its chemical structure. It was found that for Verbena litoralis Kunth the best treatment was number 1, that is, the extract obtained from the leaves in a time of maceration

3 days, with a value of 95.067%. On the other hand, Duranta triacantha Juss showed the best antioxidant activity with treatment 3, that is, the extract obtained from inflorescences in a maceration time of 3 days, resulting in an average inhibition value of 95.329 %.

There are differences between the days of maceration for the quantification of total flavonoids and antioxidant activity this is because the two plants studied, Verbena

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litoralis Kunth and Duranta triacantha Juss, have other secondary metabolites, which have other secondary metabolites, which have other secondary metabolites, which have other secondary metabolites, which possibly contribute to antioxidant activity.

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60

10 Anexos

Anexo 1. Boucher botánico para Verbena litoralis Kunth y Duranta triacantha Juss.

Verbena litoralis Kunth Duranta triacantha Juss

61

Anexo 2. Identificación botánica para las plantas verbena y mote casha

62

Anexo 3. Resultado de los flavonoides totales para Verbena litoralis Kunth.

Tratamiento Wm (g) Con (mg*L-1) Abs FT (mg QE*mL-1 extracto)

T1 30,0098 2,407 0,177 0,120

T1 30,0690 2,379 0,175 0,119

T1 30,0236 2,364 0,174 0,118

T2 30,1663 2,852 0,208 0,071

T2 30,3581 2,852 0,208 0,071

T2 30,1310 2,794 0,204 0,070

T3 30,0007 2,393 0,176 0,120

T3 30,0008 2,493 0,183 0,125

T3 30,0029 2,565 0,188 0,128

T4 30,0385 3,826 0,276 0,191

T4 30,0269 4,428 0,318 0,221

T4 30,0003 3,984 0,287 0,199

T5 30,0396 1,705 0,128 0,043

T5 30,0075 1,648 0,124 0,041

T5 30,0086 1,619 0,122 0,040

T6 30,0010 2,780 0,203 0,139

T6 30,0050 2,680 0,196 0,134

T6 30,0054 2,966 0,216 0,148

T7 30,0090 3,783 0,273 0,176

T7 30,0021 3,754 0,271 0,171

T7 30,0953 3,855 0,278 0,187

T8 30,0018 1,763 0,132 0,040

T8 30,0066 1,949 0,145 0,043

T8 30,0037 1,849 0,138 0,041

T9 30,0076 3,138 0,228 0,151

T9 30,0040 2,837 0,207 0,133

T9 30,0017 2,981 0,217 0,149

63

Anexo 4. Resultado de los flavonoides totales para Duranta triacantha Juss

Tratamiento Wm (g) Con (mg*L-1) Abs FT (mg QE*mL-1 extracto)

T1 30,0012 6,721 0,478 0,672

T1 30,0004 6,319 0,450 0,632

T1 30,0290 6,219 0,443 0,622

T2 30,0013 2,321 0,171 0,058

T2 30,0010 2,250 0,166 0,056

T2 30,0008 2,522 0,185 0,063

T3 30,0013 6,491 0,462 0,325

T3 30,0098 6,391 0,455 0,320

T3 30,0120 6,491 0,462 0,325

T4 30,0017 7,824 0,555 0,782

,T4 30,0002 7,695 0,546 0,769

T4 30,0080 7,867 0,558 0,787

T5 30,0027 2,250 0,166 0,056

T5 30,0084 2,407 0,177 0,060

T5 30,0044 2,450 0,180 0,061

T6 30,0008 6,391 0,455 0,320

T6 30,0012 6,305 0,449 0,315

T6 30,0044 6,864 0,488 0,343

T7 30,0029 5,574 0,398 0,557

T7 30,0051 5,560 0,397 0,556

T7 30,0050 5,173 0,370 0,517

T8 30,0018 2,479 0,182 0,062

T8 30,0051 2,436 0,179 0,061

T8 30,0004 2,407 0,177 0,060

T9 30,0005 5,101 0,365 0,255

T9 30,0011 5,445 0,389 0,272

T9 30,0015 5,073 0,363 0,254

64

Anexo 5. Barrido espectral de una solución de DPPH 1000 ppm.

65

Anexo 6. Resultado del porcentaje de inhibición del radical DPPH para Verbena litoralis Kunth.

Tratamiento Wm (g) Con (mg*L-1) Abs Porcentaje de inhibición de DPPH

(%)

T1 0,094 0,020 1,527 95,154

T1 0,099 0,023 1,527 95,023

T1 0,095 0,019 1,527 95,023

T2 0,231 0,021 1,527 86,248

T2 0,257 0,022 1,527 84,610

T2 0,200 0,020 1,527 88,212

T3 0,171 0,026 1,527 90,504

T3 0,186 0,025 1,527 89,456

T3 0,180 0,028 1,527 90,046

T4 0,108 0,014 1,527 93,844

T4 0,134 0,012 1,527 92,010

T4 0,118 0,013 1,527 93,124

T5 0,185 0,059 1,527 91,749

T5 0,180 0,059 1,527 92,076

T5 0,162 0,061 1,527 93,386

T6 0,176 0,022 1,527 89,915

T6 0,181 0,022 1,527 89,587

T6 0,177 0,022 1,527 89,849

T7 0,140 0,016 1,527 91,880

T7 0,139 0,014 1,527 91,814

T7 0,154 0,015 1,527 90,897

T8 0,190 0,076 1,527 92,534

T8 0,181 0,055 1,527 91,749

T8 0,181 0,064 1,527 92,338

T9 0,210 0,022 1,527 87,688

T9 0,194 0,024 1,527 88,867

T9 0,210 0,020 1,527 87,557

66

Anexo 7. Resultados del porcentaje de inhibición del radical DPPH para Duranta triacantha Juss

Tratamiento Abs

muestra Abs blanco de muestra

Abs DPPH

% de Inhibición de DPPH

T1 0,218 0,010 1,527 86,379

T1 0,208 0,010 1,527 87,033

T1 0,194 0,010 1,527 87,950

T2 0,136 0,026 1,527 92,796

T2 0,136 0,028 1,527 92,927

T2 0,134 0,028 1,527 93,058

T3 0,083 0,009 1,527 95,154

T3 0,080 0,010 1,527 95,416

T3 0,081 0,011 1,527 95,416

T4 0,155 0,007 1,527 90,308

T4 0,155 0,005 1,527 90,177

T4 0,153 0,005 1,527 90,308

T5 0,183 0,014 1,527 88,933

T5 0,190 0,016 1,527 88,605

T5 0,193 0,036 1,527 89,718

T6 0,264 0,058 1,527 86,509

T6 0,264 0,059 1,527 86,575

T6 0,255 0,058 1,527 87,099

T7 0,136 0,008 1,527 91,618

T7 0,128 0,008 1,527 92,141

T7 0,121 0,009 1,527 92,665

T8 0,233 0,014 1,527 85,658

T8 0,226 0,014 1,527 86,117

T8 0,213 0,013 1,527 86,902

T9 0,083 0,008 1,527 95,088

T9 0,085 0,004 1,527 94,695

T9 0,084 0,005 1,527 94,826

67

Anexo 8. Prueba de Normalidad para las variables en estudio de Verbena litoralis Kunth.

Los parámetros a seguir son:

P-valor ≥ 0,05 = Normalidad

P-valor ≤ 0,05 = No existe Normalidad

mg*mL-1 de flavonoides totales de Verbena litoralis Kunth

Shapiro-Wilks (modificado)

Variable n Media D.E W* p(Unilateral D)

RDUO mg*mL-1 de flavonoides totales 27 0,12 0,06 0,89 0,2160

% de inhibición del radical DPPH de Verbena litoralis Kunth



RDUO % de inhibición del radical DPPH 27 90,93 0,06 2,66 0,5700

Anexo 9. Prueba de Normalidad para las variables en estudio de Duranta triacantha Juss.

Los parámetros a seguir son:

P-valor ≥ 0,05 = Normalidad

P-valor ≤ 0,05 = No existe Normalidad

mg*mL-1 de flavonoides totales de Duranta triacantha Juss



RDUO mg*mL-1 de flavonoides totales 27 0,34 0,26 0,83 0,9358

% de inhibición del radical DPPH de Duranta triacantha Juss



RDUO % de inhibición del radical DPPH 27 90,52 3,37 0,87 0,9751

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