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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
DESPLIEGUE DIFERENCIAL DE GENES CANDIDATOS QUE SE ACTIVAN
DURANTE EL CULTIVO IN VITRO DE HIPOCÓTILOS DE NARANJILLA
Solanum quitoense Lam var. quitoense.
TRABAJO DE GRADO PREVIO A LA OBTECIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERA AGRÓNOMA
LUZ MARÍA SOTO HARO
TUTOR: ING. AGR. ANÍBAL POZO ESP.
QUITO, SEPTIEMBRE 2016
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DEDICATORIA
Este trabajo de titulación dedico a mi madre por su apoyo incondicional, por su esfuerzo inmenso y amor a lo largo de mi vida estudiantil.
A mis hermanos Abigail, Jaime, Doménica, Israel y Manuel por ser un apoyo fundamental en mi desarrollo personal y profesional.
Luz María
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la oportunidad de culminar esta etapa de mi vida y ser mi guía y sustento.
A mi madre por su apoyo y confianza depositada en mí, durante esta etapa de mi vida.
Manifiesto mi sincero agradecimiento al Ing. Aníbal Pozo por compartir su tiempo y conocimientos al dirigir mi trabajo de titulación, de igual forma al Dr. Venancio Arahana PhD., Ing. Jorge Caicedo, e Ing. Andrea Cevallos por su apoyo en esta investigación, aportando con sus conocimientos y su tiempo.
Expreso mi sincero y más grande agradecimiento a la Facultad de Ciencias Agrícolas, en especial a los docentes que aportaron con su conocimiento para la realización de este trabajo.
A mis amigas Cynthia y Vanessa por su motivación y apoyo incondicional.
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Contenido CAPÍTULO PÁGINAS
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 1
1.1. Objetivos ......................................................................................................................... 2
2. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................................................. 3
2.1. Cultivo de naranjilla ........................................................................................................ 3
2.1.1. Origen e importancia................................................................................................................ 3
2.1.2. Descripción morfológica........................................................................................................... 3
2.1.3. Contenido nutricional y usos .................................................................................................... 3
2.1.4. Problemas en Naranjilla ........................................................................................................... 3
2.1.5. Mejoramiento genético de la naranjilla ................................................................................... 3
2.2. Cultivo in vitro de tejidos vegetales ............................................................................... 4
2.3. Organogénesis ................................................................................................................ 4
2.4. Callogénesis .................................................................................................................... 5
2.5. Factores que afectan la organogénesis y callogénesis ................................................... 5
2.6. Fitohormonas que influyen en la organogénesis ........................................................... 5
2.6.1. Auxinas ..................................................................................................................................... 5
2.6.2. Citoquininas .............................................................................................................................. 7
2.6.3. La relación auxina/citoquinina regula la morfogénesis en cultivos de tejidos ........................ 8
2.7. Análisis del transcriptoma para elucidar procesos vitales ............................................. 9
2.7.1. Métodos para estudiar el transcriptoma ............................................................................... 10
2.7.1.1. Despliegue diferencial ......................................................................................................... 10
2.7.1.2. Etiquetas de secuencias expresadas (ESTs) ........................................................................ 11
2.7.1.3. Análisis serial de la expresión de genes (SAGE) .................................................................. 11
2.7.1.4. Hibridación substractiva ...................................................................................................... 11
2.7.1.5. Hibridación de microarreglos .............................................................................................. 11
2.7.1.6. Tecnología RNA-seq ............................................................................................................ 12
2.7.2. Estudios de expresión diferencial de genes mediante análisis del transcriptoma ............... 12
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CAPÍTULO PÁGINAS
2.8. Genes expresados en procesos de organogénesis ....................................................... 13
3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................... 15
3.1. UBICACIÓN .................................................................................................................... 15
3.2. MATERIALES .................................................................................................................. 15
3.2.1. Material Vegetal ..................................................................................................................... 15
3.2.2. Cultivo in vitro ........................................................................................................................ 15
3.2.2.1. Esterilización de semillas de naranjilla ................................................................................ 15
3.2.2.2. Medios de cultivo ................................................................................................................ 15
3.2.2.3. Equipos utilizados para el cultivo in vitro de naranjilla ....................................................... 15
3.2.3. Extracción de ARN de tejidos de naranjilla ............................................................................ 15
3.2.4. Cuantificación de ácidos nucleicos ........................................................................................ 16
3.2.5 Retrotranscripción de ARN de naranjilla ................................................................................. 16
3.2.6. Amplificación de ADNc ........................................................................................................... 16
3.2.7. Electroforesis en geles de agarosa ......................................................................................... 16
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida ............................................................................... 17
3.2.9. Extracción de bandas de geles de poliacrilamida .................................................................. 17
3.3. MÉTODOS ..................................................................................................................... 18
3.3.1. Aislamiento de hipocótilos ..................................................................................................... 18
3.3.2. Inducción de callo, vástagos y raíces en medios con fitohormonas ...................................... 18
3.3.3. Colección de los productos inducidos para análisis de expresión diferencial ....................... 18
3.3.4. Despliegue Diferencial............................................................................................................ 19
3.3.4.2. Cuantificación de ARN total ................................................................................................ 19
3.3.4.3. Síntesis de la primera hebra de ADNc ................................................................................. 19
3.3.4.4. Amplificación de ADNc (mediante PCR) .............................................................................. 19
3.3.4.5. Electroforesis en geles de Poliacrilamida ............................................................................ 19
3.3.4.6. Tinción del gel de poliacrilamida ......................................................................................... 19
3.3.4.7. Aislamiento de ADN a partir de bandas diferenciales en geles de poliacrilamida.............. 20
x
CAPÍTULO PÁGINAS
4. RESULTADOS ................................................................................................................................ 21
4.1. Inducción de callo vástagos y raíces en medios con fitohormonas ............................. 21
4.2. Despliegue Diferencial .................................................................................................. 22
5. DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 26
6. CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 29
7. RECOMENDACIONES ................................................................................................................... 30
9. REFERENCIAS ............................................................................................................................... 33
10. ANEXOS ...................................................................................................................................... 39
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO PÁG. 1 Lista de familias de genes involucrados en procesos
organogénicos de nuevos vástagos y/o raíces laterales.
39
2 Días de transcurridos desde la siembra al corte de las estructuras
hipocótilos, callo, vástagos y raíces.
41
3 Protocolo de extracción de ARN y purificación (PURELINK® RNA
MINI KIT).
41
4 Electroforesis en gel de agarosa al 2% del ARN total extraído de
hipocótilos, callo, vástagos y raíces de naranjilla inducidos in
vitro. Ladder 100 pb; Ca: callo; V: vástagos y L: raíces
42
5 Concentración y pureza del ARN extraído de explantes somáticos
de naranjilla.
42
6 Mezclas de reacción y condiciones para la retrotranscripción con
la enzima SUPERSCRIPT III TRANCRIPTASA REVERSA del ARN.
43
7 Mezclas de reacción y condiciones para la retrotranscripción con
la MMLV Reverse Transcriptase del Kit RNAImage de GenHunter.
43
8 Mezcla de reacción y condiciones de amplificación de ADNc
mediante PCR.
44
9 Concentraciones de las soluciones para teñir el gel de
poliacrilamida
44
10 Cámara de Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% con
muestras de ADN de callo, vástagos y raíces
45
11 Análisis de Bandas diferenciales en la inducción de callo, vástagos
y raíces a partir de hipocótilos.
45
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ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA PÁG.
1 Esquema fundamental del despliegue diferencial. Consiste en cuatro
pasos sencillos: extracción de ARN, retrotranscripción utilizando
primers de unión a la cola poli A, amplificación con oligonucleótidos
cortos y electroforesis en geles de poliacrilamida donde se puede
identificar las bandas diferenciales resultantes.
10
2 Diagrama de flujo de la metodología empleada para el análisis de la
expresión diferencial de genes durante la inducción de callo, raíces y
vástagos adventicios a partir de hipocótilos de Naranjilla.
18
3 Callos, vástagos y raíces inducidos a partir de hipocótilos de naranjilla.
A. A1: Callo inducidos en un medio de cultivo (MS + 1 mg/L ANA 2 mg/L
BAP). A2: Imagen aumentada del callo inducido. B. B1: Vástagos
inducidos en un medio (MS + 7,5 mg/L BAP). B2: Imagen aumentada del
vástago inducido. C. C1: Raíces inducidas en un medio de cultivo (MS +
0,5 mg/L AIA). C2: Imagen aumentada de raíces inducidas.
22
4 Gel resultante de la electroforesis en poliacrilamida al 6% de los
productos de amplificación correspondiente a las muestras inducidas
con las distintas combinaciones de fitohormonas con 6 combinaciones
distintas de cebadores (HAP2-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A,
HAP6-HT11G, HAP7-HT11G, HAP8-HT11G). El marcador de peso
molecular utilizado fue 100bp de Invitrogen. De izquierda a derecha,
primero está el ladder (100pb) seguido por el testigo (hipocótilo) y las
tres muestras inducidas. HP: hipocótilos; Ca: callo; V: vástago y L: raíz.
G6: Cebadores HT-11G-HAP6; G7: Cebadores HT-11G-HAP7; G8:
Cebadores HT-11G-HAP8; A2: Cebadores HT-11A-HAP2; A7: Cebadores
HT-11A-H-AP7; A8: Cebadores HT-11A-HAP8. Ejemplos: bandas
diferenciales exclusivas: CA2-5 y LA7-5; banda diferencial
sobreexpresada: VG6-17.
23
xiii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
GRÁFICO PÁG. 1 Número de bandas diferenciales encontradas por combinación de
primers (HAP2-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A, HAP6-HT11G, HAP7-HT11G, HAP8-HT11G).
24
2 Numero de bandas diferenciales totales obtenidas en hipocótilos,
callo, vástago y raíz de naranjilla inducidos in vitro a partir de hipocótilo.
24
3 Número de bandas diferenciales exclusivas, subexpresadas y
sobreexpresadas en hipocótilo, callo, vástago y raíz de naranjilla inducidos in vitro a partir de hipocótilo
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DESPLIEGUE DIFERENCIAL DE GENES CANDIDATOS QUE SE ACTIVAN DURANTE EL
CULTIVO IN VITRO DE HIPOCÓTILOS DE NARANJILLA Solanum quitoense Lam Var
quitoense
Autor: Luz María Soto Haro
Tutor: Ing. Agr. Aníbal Pozo, ESP
RESUMEN
En esta investigación se evidenció, mediante despliegue diferencial, la activación o
represión de genes involucrados en las fases de cultivo in vitro que conducen a la
formación de callos, vástagos y raíces a partir de hipocótilos de Naranjilla (Solanum
quitoense Lam var. quitoense). Se utilizó el medio de cultivo MS suplementado con varias
concentraciones de fitohormonas: 1 mg/L ANA + 2 mg/L BAP para inducción de callo, 7,5
mg/L BAP para inducción de vástagos, y 0,5 mg/L AIA para inducción de raíces. Se obtuvo
un total de 23 bandas diferenciales, de las cuales ocho pertenecen a vástagos, seis a callo,
cinco a raíz y cuatro a hipocótilos, y de estas, algunas fueron exclusivas para hipocótilo,
callo, vástago o raíces, otras fueron subexpresadas o sobreexpresadas en los tejidos
evaluados. Nuestros resultados contribuirán a identificar los genes relacionados con los
procesos de formación de callos, vástagos y raíces.
PALABRAS CLAVE: EXPRESIÓN DIFERENCIAL, INDUCCIÓN DE VÁSTAGOS, INDUCCIÓN DE
CALLO, INDUCIÓN DE RAÍCES, FITOHORMONAS.
xv
DIFFERENTIAL DISPLAY OF CANDIDATE GENES THAT ARE ACTIVATED DURING IN VITRO
CULTURE HYPOCOTYLS OF NARANJILLA Solanum quitoense Lam var. quitoense
Author: Luz María Soto
Tutor: Ing. Agr. Aníbal Pozo, ESP
ABSTRACT
In this study we evidenced, by differential display, the activation or suppression of genes involved in different phases of in vitro culture that lead to formation of callus, shoots and roots from hypocotyls of naranjilla (Solanum quitoense Lam var quitoense). The MS culture medium supplemented with different concentrations of phytohormones was used: 1 mg / L ANA + 2 mg / L BAP for callus induction, 7.5 mg / L BAP for shoot induction, and 0.5 mg / L IAA for root induction. A total of 23 differential bands were obtained, of which eight belong to shoots, six to callus, five to roots and four to hypocotyls, and of these, some were unique to hypocotyl, callus, shoots or roots, others were down regulated or up regulated in the tissues tested. Our findings will help with the identification of genes related to the processes of callus, shoots and roots formation.
KEY WORDS: DIFFERENTIAL EXPRESSION, SHOOT INDUCTION, CALLUS INDUCTION,
ROOT INDUCTION, PHYTOHORMONES.
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1. INTRODUCCIÓN
La naranjilla (Solanum quitoense Lam), es un frutal nativo de los bosques subtropicales de la cordillera de los Andes. Se la cultiva en países como: Perú, Colombia, Panamá, Costa Rica y Ecuador (Valverde, Espinoza, & Bastidas, 2010), muy apetecido a nivel nacional e internacional por su sabor agridulce, además de un alto contenido de vitaminas (C, B1, B2) y minerales (calcio y fósforo) (FAO, 2002).
En Ecuador existen 3643 ha cultivadas, con rendimientos de 5,4 t ha-1 involucra a mas de 5992
unidades productivas agropecuarias (UPAs) que tienen un manejo tradicional (MAGAP-SISAGRO,
2011). Representa un rubro económico de importancia para el agricultor, también presenta
grandes perspectivas económicas para el mercado de exportación del Ecuador, debido a que
posee el potencial necesario para convertirse en una fruta tropical de consumo a nivel global
(National Research Council, 1989).
Según Revelo & Sandoval (2003), la susceptibilidad del cultivo a fitopatógenos, tales como el gusano del fruto (Neoleucinodes elegantalis Gueneé), barrenador del tallo (Alcidon sp.), marchitez (Fusarium sp.), etc, son una de las causas para la disminución de la productividad; también el uso indiscriminado de pesticidas y la falta de tecnología en el manejo del cultivo ha generado un incremento de costos y una baja rentabilidad (Andrade, 2005). Por estas razones es necesario generar tecnologías para el cultivo, como el mejoramiento genético, obteniendo plantas con características deseables y con resistencia a fitopatógenos, aunque estudios realizados han determinado que es una planta que presenta muy poca variabilidad morfológica, fisiológica y organoléptica a nivel inter específico, debido a que continúa en un periodo de domesticación. Esta singularidad del cultivo ha impedido el hallazgo de genotipos que puedan ser empleados en la resolución de sus problemas de producción, entre los cuales la susceptibilidad a plagas es una prioridad (Soria, 1997). Ensayos de cruzamientos interespecíficos con parientes cercanos de la sección Lasiocarpa ha generado descendientes con ciertos niveles de resistencia a patógenos, pero con problemas de infertilidad de las semillas (Heiser y Anderson, 1999). La propagación de plantas in vitro es una alternativa para obtener plantas sanas en menor tiempo, además permite el estudio fundamental de la biología de la planta (Castillo, 2004). Por tanto, la determinación de los genes involucrados en los procesos de organogénesis in vitro podría facilitar el establecimiento de protocolos de micropropagación eficientes. Existen estudios previos de los procesos biológicos-moleculares que se desencadenan en la diferenciación y desdiferenciación de tejidos vegetales en Arabidopsis, maíz, arroz, guisantes, pino, ramio, etc. (Higuchi et al., 2006; Lim et al., 2000; Kurakawa et al., 2007; Sassa, Matsushita, Nakamura, & Nyunoya, 2001; Sole, 2012; Huang et al., 2014), pero ningún estudio relacionado a la organogénesis in vitro en Naranjilla.
En la presente investigación se estudió la expresión diferencial de genes en el proceso de inducción de callo, raíces y vástagos en naranjilla S. quitoense Lam Var quitoense mediante la técnica de despliegue diferencial, para mejorar el conocimiento y compresión de los mecanismos moleculares y circuitos de regulación de genes importantes para la desdiferenciación y diferenciación en hipocótilos de naranjilla.
2
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo General
Evidenciar la expresión diferencial de genes candidatos que se activan durante el cultivo in vitro de hipocótilos de naranjilla Solanum quitoense var quitoense, mediante despliegue diferencial.
1.1.2. Objetivos específicos
Inducir in vitro callogénesis, caulogénesis y rizogénesis en naranjilla mediante la inclusión de combinaciones hormonales en el medio de cultivo.
Determinar en geles de poliacrilamida la expresión diferencial de genes en los procesos de callogénesis, caulogénesis y rizogénesis en medios de cultivo suplementados con fitohormonas.
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2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Cultivo de naranjilla
2.1.1. Origen e importancia
La naranjilla (Solanum quitoense Lam) es un frutal nativo de los bosques subtropicales de la cordillera de los Andes (Valverde et al., 2010). En el Ecuador se la cultiva principalmente en la Amazonía entre los 800 y 1700 msnm, con temperaturas entre 14 y 22 °C y precipitaciones superiores a los 1500 mm año-1 , en suelos fértiles con buen drenaje; cubre una superficie de 3643 ha con rendimientos de 5,4 t ha-1, involucra a más de 5992 unidades de producción que tienen un manejo tradicional basado en el uso excesivo de pesticidas y la deforestación de bosque primario para mantener la producción comercial del cultivo (INIAP, 2011; MAGAP-SISAGRO, 2011).
2.1.2. Descripción morfológica
La naranjilla es una planta que se ramifica en tallos gruesos y semi-leñosos que producen
hojas de forma oblonga ovalada de 30 a 45 cm de largo, sostenidas por un peciolo de 15 cm.
El fruto de forma redonda a ovoide llega a medir de 4 a 6 cm de diámetro y el color de la
cubierta varía de amarillo a anaranjado o pardo. La fruta en su interior se divide en cuatro
compartimentos, cada uno lleno de pulpa de color verdoso y numerosas semillas pequeñas
(PRODAR, 2002).
2.1.3. Contenido nutricional y usos
Es una fruta rica en vitaminas A, C, B1 y B2; además, cada 100 g de parte comestible de
naranjilla aporta a los consumidores 23 calorías y en promedio 5.7 g de carbohidratos; 0.6 g
de proteína; 2.5 g de fibra; 9.15 mg de calcio; 28 mg de fósforo; 0.49 mg de hierro; 1.5 mg de
niacina, entre otras vitaminas del complejo B. La naranjilla no solo es una fruta exótica de
sabor especial y apetecido, sino que también cuenta con cualidades nutricionales que la
convierten en una fruta con un gran potencial de comercialización en los mercados
internacionales. Se utiliza en la elaboración de jugos, néctares, mermeladas, jaleas, postres y
cocteles (SICA, 2001; Valverde et al., 2010).
2.1.4. Problemas en Naranjilla
Los principales problemas de la naranjilla son de tipo fitosanitarios como: Marchitez vascular
Fusarium oxysporum, nemátodos del nudo de la raíz Meloidogyne incognita y el Gusano del fruto
Neoleucinodes elegantalis Gueéne (Vásquez C. et al., 2011)
Esto ocasiona la aplicación de agroquímicos tales como Carbofurán, Metamidofos y 2-4-D
(productos prohibidos internacionalmente), poniendo en riesgo la salud, el ambiente e
incrementando los costos de producción (Revelo & Sandoval, 2003; Andrade, 2005).
2.1.5. Mejoramiento genético de la naranjilla
A nivel mundial el mejoramiento genético de la naranjilla es escaso, principalmente por su
reducida variabilidad genética. Una alternativa prometedora puede ser la hibridación de naranjilla
con miembros inter-específicos de la sección Lasiocarpa de Solanum, en los cuales pueden existir
genes de resistencia para diferentes patógenos (Heiser, 1993). En Ecuador el primer híbrido
interespecífico (Solanum quitoense × Solanum sessiliflorum) fue denominado “Puyo”. Este híbrido
es altamente productivo, pero sus frutos son pequeños por lo que requiere la aplicación de 2-4-D
para incrementar su tamaño, además de que sus semillas son estériles (Heiser & Anderson, 1999).
El Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) de Ecuador, obtuvo el híbrido
“Palora” (Solanum quitoense × Solanun sessiliflorum), que presenta un fruto más grande, que no
4
requiere el uso de 2–4-D, y cuyo jugo empieza a oxidarse pasadas las 24 horas desde su
preparación, es decir, mucho después del jugo de la naranjilla convencional y que el jugo del
híbrido “Puyo”. Sin embargo, el híbrido “Palora” no tuvo la aceptación esperada en los
consumidores, puesto que el color de la pulpa es blanco y el consumidor prefiere la pulpa de color
verde (Heiser, 2001; Coronel, 2001).
Según Benítez et. al (1991), los híbridos interespecíficos no pueden propagarse sexualmente
debido a la pérdida progresiva del genotipo de interés causado por la segregación genética en
generaciones posteriores y debido a incompatibilidades de los genomas. Por tanto para preservar
y reproducir híbridos interespecíficos importantes, la propagación in vitro representa una gran
alternativa para desarrollar programas de fitomejoramiento.
Estudios realizados sobre la regeneración de plantas de Naranjilla (Solanum quitoense Lam var.
quitoense) en Colombia, mediante embriogénesis somatica, confirmó el carácter recalcitrante de
lulo por la germinación precoz de los embriones en el medio con hormonas, así como la relación
directa entre número de subcultivos y la variabilidad genética (Criollo Escobar, 2013).
2.2. Cultivo in vitro de tejidos vegetales
Experimentos de regeneración de brotes se han probado de explantes foliares de Solanum candidum, S. quitoense y S. sessiflorum, siendo S. quitoense la menos sensible (Kirchof, Litz, & Hendrix, 1987). La regeneración de plantas a partir de explantes de hojas jóvenes también se ha intentado en Solanum surattense y Solanum melongena. En estos experimentos los brotes se obtuvieron con diferentes combinaciones de auxinas y citoquininas en medios sólidos (Tylicki, Burza, Kuras , & Malepszy, 2000). El cultivo in vitro de plantas, consiste en cultivar porciones de tejido de una planta llamados explantes, en recipientes cerrados que contienen medios nutritivos estériles, bajo condiciones controladas de luz y temperatura (Bonga & Park, 2003). Esto, es posible gracias a la totipotencialidad de las células, que determina la capacidad de éstas para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos, y con una eficiencia altamente superior a las metodologías tradiconales (Segretín, 2011; Bonga & Park, 2003).
2.3. Organogénesis
La organogénesis es el proceso por el cual, tejidos desdiferenciados o embrionarios se diferencian y dan origen a los órganos de la planta. Para que la organogénesis ocurra se deben producir cambios que conduzcan a la organización celular. Este proceso involucra diferenciación celular, interacción celular y reacción de la célula a señales específicas (González, 2009).
La mitosis juega un papel importante en la organogénesis, la cual consiste en la formación de un número crítico de células en división activa, los meristemoides, son regiones localizadas de células en división activa se asemejan a meristemas verdaderos, estos son capaces de responder las señales de desarrollo, ya que poseen conexiones vasculares con el callo o el tejido circundante. Bajo condiciones apropiadas de cultivo pueden formar yemas o raíces primarias, se componen de células pequeñas, isodiamétricas, con un citoplasma denso, vacuolas pequeñas y núcleos prominentes; usualmente contienen varios orgánulos y grandes cantidades de almidón del cual necesitan en cantidad considerable durante su diferenciación (Agronómica, 2003). La organogénesis puede ser directa si ocurre sin la formación previa de callo o indirecta si se requiere la formación previa de callo (Segretín, 2011). En procesos organogénicos se diferencian tres etapas morfológicas: (i) desdiferenciación celular (adquisición de competencia morfogénica), (ii) inducción (determinación de células para la formación de órganos específicos en respuesta a fitohormonas exógenas), y (iii) diferenciación morfológica (formación de órganos independientemente de fitohormonas) (Duclercq, Sangwan-Norree, & Sangwan, 2011).
5
Dentro de la sección Lasiocarpa de Solanum, se han realizado experimentos de regeneración de brotes a partir de explantes foliares de Solanum candidum, S. quitoense y S. sessiflorim, siendo S. quitoense la de menor respuesta (Kirchof, Litz, & Hendrix, 1987). La regeneración de plantas a partir de explantes de hojas jóvenes también se ha intentado en Solanum surattense y Solanum melongena. En estos experimentos los brotes se obtuvieron con diferentes combinaciones de auxinas y citoquininas en medios sólidos (Tylicki et al., 2000).
2.4. Callogénesis
El tejido calloso es una masa amorfa de células vegetales poco diferenciadas y de rápida proliferación, en el cual un tejido diferenciado inicia con la división de células a manera de tumoraciones, de forma desorganizada “callo”, mediante la aplicación de fitoreguladores. La producción de callo requiere de un explante inicial, el que puede tener una alta diferenciación de sus tejidos, como un trozo de raíz, tallo u hoja, o bien la utilización de tejidos menos diferenciados como hipocótilos y cotiledones de plántulas recién germinadas e incluso embriones zigóticos maduros e inmaduros, la inducción de callo representa un proceso de desdiferenciación y división celular intensiva de apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar diferentes tipos morfológicos, los cuales varían según la apariencia externa, textura y composición celular, pero por lo general son heterogéneos en su composición celular. La coloración de este tejido también varía, aun derivando de la misma especie (se pueden presentar callos que carecen de pigmentación, mientras otros pueden ser de diferentes tonos de verde, amarillo, café o rojo) (Rodríguez et al., 2014).
Una de las propiedades importantes del tejido calloso es la llamada friabilidad, esta se puede definir, como la tendencia de las células a separarse unas de otras, por cual un callo friable es aquel que se disgrega con facilidad. Desde el punto de vista morfogénico, la característica más importante del callo es la totipotencialidad de sus células, ya que, en general, con un manejo adecuado de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la capacidad de desarrollar brotes, raíces, embriones, etc., los cuales pueden llegar a formar plántulas completas (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
2.5. Factores que afectan la organogénesis y callogénesis
Entre los factores que afectan la organogénesis están la edad fisiológica y la ontogenia de los explantes, su tamaño, el tejido y órgano de donde provengan, así como el estado fisiológico de la planta madre y la época del año en que se realice el cultivo (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2013)
En cuanto a la edad y tamaño del explante, se ha observado que los tejidos juveniles poseen alto grado de actividad meristemática, sin embargo, se puede ocupar todas las partes de la planta para la iniciación de callo (Litz & Jarret, 1997).
El tamaño del explante también juega un papel importante en la organogénesis, los de mayor tamaño, aunque son más difíciles de desinfectar que los de menor tamaño, tienen un potencial regenerador mayor al contrario de los explantes más pequeños (Litz & Jarret, 1997)
En el medio de cultivo la concentración de sacarosa es usada como variable para inducir organogénesis debido a que es a menudo la fuente principal carbonada. El inositol como vitamina en los medios MS, puede ser un componente importante para el crecimiento e inducción de callos. El nitrógeno orgánico, en forma de glutamina es beneficioso para la iniciación y crecimiento de callos (Litz & Jarret, 1997)
2.6. Fitohormonas que influyen en la organogénesis
2.6.1. Auxinas
Las auxinas son un grupo de fitohormonas que regulan muchos aspectos del desarrollo y crecimiento de las plantas. En cantidades pequeñísimas, las auxinas pueden estimular la
6
formación y el crecimiento de las raíces. No obstante, en cantidades algo mayores, inhiben el crecimiento de las raíces primarias, aunque puede promover la formación de nuevas raíces secundarias. En el cultivo in vitro, estimula la formación de raíces adventicias y la formación de callo, en este último caso, actúan solas o en combinación con citoquininas (Srivastava, 2002). El ácido indol acético (AIA) es la forma más predominante de auxina que se encuentran en las
plantas. Otras formas naturales de auxinas son el ácido 4-cloro-indolacético (4-Cl-IAA), ácido
fenilacético (PAA), ácido indol butírico (IBA) y el ácido indol propiónico (Ludwig-Müller & Cohen
2002). Las auxinas en su mayoría se encuentran en regiones de crecimiento activo;
principalmente en meristemos apicales, hojas jóvenes y frutos en desarrollo. Las plantas usan dos
rutas biosintéticas para producir AIA, una dependiente del triptófano (Trp) y otra independiente
de él, a partir del indolglicerolfosfato (Jordán & Casaretto, 2006).
En cuanto al mecanismo de acción de las auxinas, se conoce que ellas aumentan la plasticidad de
la pared celular, lo que permite la expansión de la célula. La elongación inducida por auxinas se
inicia al unirse esta hormona al receptor, lo que desencadena una cascada de eventos que
determinan la secreción de protones por la célula. Como resultado de esta acidificación, se
activan proteínas que rompen los enlaces cruzados entre las moléculas de celulosa y permiten la
elongación cuando aumenta la presión de turgencia (Magaña , Bucio, & Beltrán, 2015).
La regulación de la concentración AIA en un tejido u órgano depende de ciertos procesos tales como la biosíntesis de la hormona in situ, el transporte de llegada y la hidrólisis de conjugados (auxina más azúcares, aminoácidos y péptidos) que permiten la acumulación de AIA, y la disminución de esta es favorecida por procesos de conjugación, oxidación y transporte de salida (Acosta, Sánchez, & Bañón, 2008). El transporte polar de auxinas es fundamental para la distribución de estas a través de distancias
cortas y ocurre de célula a célula a través de diversas familias de transportadores. La familia
AUXIN RESISTANT 1/LIKE-AUX1 (AUX1/LAX) incluye transportadores de entrada y los
transportadores de salida están agrupados en la familia PIN-FORMED (PIN) y la sub familia ATP-
binding casette B/resistente a multidrogas/P-glicoproteínas (ABCB/MDR/PGP) (Petrásek & Friml,
2009).
Ambos tipos de transportadores establecen el gradiente de auxinas, el cual es regulado por la
expresión y localización subcelular de las proteínas transportadoras en respuesta a señales
ambientales y durante el desarrollo (Friml, 2010).
PIN1 transporta más auxinas formando un máximo de auxinas temporal, que consecuentemente
activará la formación de órganos, también causa una disminución temporal de auxinas alrededor
de cada primordio emergente, inhibiendo la iniciación de nuevos primordios en la vecindad del
primordio. La creación y mantenimiento de un máximo de auxinas en el ápice del nuevo órgano es
crucial para formación de los primordios de las raíces laterales. En los órganos aéreos las auxinas
son transportadas a través de las capas internas hacia la punta del primordio en desarrollo y en la
parte interior del órgano (Michniewicz , Brewer , & Friml , 2007).
Existen dos familias de proteínas que actúan como receptores de auxinas: unas se localizan tanto
en la membrana plasmática como en el retículo endoplásmico (ABP1; AUXIN BINDING PROTEIN 1)
y otras que se localizan en el núcleo (TIR1/auxin-signaling F box proteins (AFBs)) (Ljung , 2013).
El gen TIR (Transport Inhibitor response 1) de Arabidopsis codifica proteínas que pertenecen a la
clase F-box solubles; se comprobó que AIA se une a la proteína TIR1 y reclutan proteínas restantes
y forman el complejo SCFTIR1, por lo tanto, TIR 1 actúa como receptor de auxinas. Existen genes de
expresión rápida en respuesta a la auxina como SAUR (Small Auxin Up-regulated RNA) que se
induce en hipocótilos de soya al cabo de 2-5 minutos de ser tratados con auxina, GH3 se inducen
en soya o en Arabidopsis después de 5 minutos de tratamiento con auxina y AUX/AIA estos genes
son inducidos 5-60 minutos después de la aplicación de auxinas, las proteínas que expresan estos
genes tienen localización nuclear. En estos genes de expresión rápida existen promotores con
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secuencias TGTCTC características que reciben el nombre de elementos de respuesta a la auxina
(AuxRe), a estos se unen los factores de respuesta (ARF), son proteínas nucleares que actúan
como factores de transcripción, en esta unión existe alta especificidad lo que determina la
activación o represión del gen.
Las proteínas AUX/AIA también se unen a las ARF permitiendo la regulación de la transcripción de
genes, una AUX/AIA reprime la transcripción cuando la ARF es un factor activador y la activa
cuando ARF es un factor represor (Acosta, Sánchez, & Bañón, 2008).
2.6.2. Citoquininas
Las citoquininas han sido consideradas estructuralmente como derivadas de adeninas o purinas, y dentro de este grupo se incluyen la kinetina, zeatina y benzilaminopurina. Según su origen se pueden distinguir dos tipos de citoquininas: aquellas naturales generadas por las plantas y otras artificiales, sintetizadas por el hombre. Todas las citoquininas naturales se generan a partir de DMAPP (vía del ácido mevalónico) y 5’-AMP (Adenosoina 5’-monofosfato) y su síntesis acontece principalmente en la raíz. La mayoría de las citoquininas naturales y artificiales conservan la base adenina, aunque a las segundas se les ha ligado diversas moléculas, generándose así, por ejemplo, la benciladenina (BA) y la furfurilaminopurina (kinetina). Los reguladores sintéticos como BA, kinetina o tidiazurom TDZ, son más potentes que las hormonas naturales endógenas (zeatina, trans-zeatina o isopentiladenina), debido a que las artificiales no pueden ser degradadas o metabolizadas por el tejido. TDZ es considerado uno de los inductores más potentes en la formación de nuevos brotes o embriones somáticos tanto en plantas leñosas como herbáceas. (Huetteman & Preece, 1993).
Su efecto hormonal fue visualizado al inducirse, en compañía de auxina, diferentes tipos de morfogénesis en tejidos de tabaco y de otras especies bajo condiciones in vitro. Debido a su variación estructural se ha llegado a clasificar en citoquininas isoprenoides y aromáticas. Este grupo de fitohormonas es considerado el responsable de los procesos de división celular, entre los que se encuentran la formación y crecimiento de brotes axilares, la germinación de semillas, la maduración de cloroplastos, la diferenciación celular y también el control de varios procesos vegetales como el retardo de la senescencia y en la transducción de señales (Sakakivara, 2006). Se cree que las citoquininas son sintetizadas en tejidos jóvenes o meristemáticos como ápices radiculares, yemas del tallo, nódulos de raíces de leguminosas, semillas en germinación, especialmente en endospermas líquidos y frutos jóvenes; desde donde se transportan vía xilema hacia la hoja donde se acumulan, para luego ser exportadas vía floema hacia otros órganos como los frutos (Srivastava, 2002).
La inclusión de citoquininas en el medio de cultivo permite formar callos en varias especies vegetales, aunque principalmente induce que regiones meristemáticas multicelulares se diferencien en estructuras organizadas. Las citoquininas participan activamente en la regulación del ciclo celular, específicamente en la división celular de los meristemos apicales de tallo y raíz; el mantenimiento indeterminado del meristemo apical depende la expresión continua del gen KNOX, ya que las citoquininas promueven la transcripción de este gen, y la sobreexpresión del mismo incrementa los niveles de citoquinina (Segura, 2008).
La etapa limitante de la velocidad de la biosíntesis de citoquinina es catalizada por enzimas codificadas por la familia de genes ATP / ADP isopenteniltransferasa (IPT). Análisis del patrón de expresión de los diferentes genes IPT revela que las citoquininas se producen en etapas específicas de desarrollo y en diferentes órganos, incluyendo raíces, brotes y tejido vascular (Miyawaki et al., 2004). El catabolismo de la citoquinina está estrechamente regulado por la actividad de siete citoquininas oxidasas / deshidrogenasas (CKXs) (CKX1-7), que catalizan la degradación irreversible de las citoquininas. Como IPTs, los genes CKX muestran un patrón diferencial de la expresión durante el desarrollo de la planta, con la actividad más alta en las
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regiones de crecimiento activo (brotes, meristemas de la raíz y las hojas emergentes) (Werner et al., 2003).
La percepción y vía de señalización de las citoquininas ocurre a través de múltiples fosforilaciones. En Arabidopsis thaliana , se ha identificados tres quinasas de histidina transmembranales (ARABIDOPSIS HIS KINASE 2 (AHK2), AHK3 and AHK4/WOL1 (WOODENLEG 1)/CRE1 (CYTOKININ RESPONSE 1)), que actúan como receptores de citoquininas , al unirse las citoquinias a los receptores estos se autofosforilan y a través de más fosforilaciones la señal se transfiere a los miembros de la familia de ARABIDOPSIS HIS PHOSPHOTRANSFER PROTEINS (AHPs), que se translocan al núcleo para fosforilar a los miembros de familia de proteínas (ARR) denominados reguladores de respuesta de Arabidopsis (ARR) de tipo A y B. Al mismo tiempo, las proteínas fosfotranfersas (AHPs) permiten la acumulación en el núcleo de factores de respuesta a las citoquinnas (CRFs). La activación del regulador de respuesta (ARR) tipo B, que actúa como factor de transcripción induce la transcripción de genes de respuesta a la citoquinina, incluyendo ARRs de tipo A y factores de respuesta a la citoquinina (CRF). La activación del regulador de respuesta tipo A, actúa negativamente en la vía de señalización de citoquininas mediante un mecanismo desconocido. Los factores de respuesta a la citoquinina (CRF) junto con los reguladores de respuesta (ARRs) tipo B, median la expresión de genes de citoquinina que al final dirigen las acciones fisiológicas de estas fitohormonas (To et al., 2007; Segura, 2008).
Las citoquininas regulan la proteína SHOOT MERISTEMLESS (STM), el cual es un factor de transcripción necesario para mantener la división celular y prevenir diferenciación celular, que a su vez activa el gen IPT7. Sin embargo, el factor de transcripción Wuschel (WUS), es un regulador positivo de la proliferación de células madre, reprime directamente la expresión de algunos ARRs de tipo A, incluyendo ARR5 y ARR7. Por lo tanto, STM y WUS, a través de su localización específica en la célula, espacialmente restringen la actividad de la citoquinina en el meristemo apical de yemas (SAM) (Shani , Yanai, & Ori, 2006).
Las citoquininas determinan el tamaño del meristemo de la raíz, controlando tasa de diferenciación de las células en el tejido vascular en la zona de transición, Ya que mutantes de genes IPT y ARR muestran meristemos radiculares más grandes, como en el caso del agotamiento de citoquinina por la sobreexpresión de CKX en el tejido vascular en la zona de transición (Perilli, Moubayidin , & Sabatini, 2010).
2.6.3. La relación auxina/citoquinina regula la morfogénesis en cultivos de tejidos
Los estudios de las interacciones que envuelven a la auxina y a las citoquininas están ayudando a los fisiólogos a entender cómo las hormonas de las plantas (fitohormonas) trabajan para producir el patrón de crecimiento global de cada planta. Es obvio que una célula vegetal indiferenciada tiene dos opciones: bien puede alargarse, dividirse, alargarse, y volverse a dividir de nuevo, o bien puede alargarse sin sufrir posteriores divisiones. Las células que se dividen repetidamente permanecen esencialmente indiferenciadas, o meristemáticas, mientras que las células que se alargan tienden a diferenciarse, o especializarse (Agronómica, 2003) Alterando ligeramente las concentraciones relativas de auxina y citoquinina, los investigadores han podido modificar el desarrollo de las células indiferenciadas en los cultivos de tejidos. Una concentración más o menos igual de las dos hormonas, hace que las células sigan indiferenciadas, formando tejido calloso. Cuando la concentración de auxina es superior, el tejido indiferenciado organiza raíces y con una concentración superior de citoquinina, se forman yemas caulinares. Con un cuidadoso equilibrio de las dos hormonas se puede producir raíces y yemas, y, por lo tanto, una plantita incipiente (vástagos). Gran parte de las respuestas de totipotencia celular, de morfogénesis in vitro y de regeneración de plantas, ocurre en presencia de niveles apropiados de citoquininas vs. auxinas (Coen & Lomax, 1997).
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La relación alta de auxinas y citoquininas, y no las auxinas por si solas dan lugar a la iniciación de
órganos laterales que surgen solo de la zona periférica del meristemo y no desde la zona central,
a pesar que en esta hay presencia de auxinas (Treml et al.; Reinhardt et al., 2003).
Las citoquininas juegan un papel importante para la conversión de primordios de órganos en vástagos adventicios, pero el éxito de esto no solo depende de las citoquininas sino que también es controlado por la interacción de auxina-citoquinina, se ha demostrado que en la formación y crecimiento de la raíz, las citoquininas regulan la expresión de genes transportadores de flujo de salida de auxinas (PIN), además, citoquininas inducen la biosíntesis de auxina tanto en tejido foliar joven y durante la regeneración de brotes, lo que contribuye al establecimiento del gradiente de auxina. Por otra parte, la auxina controla los niveles de citoquinina por la supresión de la expresión del gen STM (MERISTEMLESS), que promueve la biosíntesis de citoquinina. Auxina también influye en la distribución de citoquinina por la regulación negativa de IPT, que implica la respuesta factores de auxina ARF3 y MP / ARF5 y las de tipo A, ARRs ARR7 y ARR15. Durante el desarrollo de brotes embrionarios el inductor de citoquinina WUS activa TOPLESS (TPL), el cual reduce la vía de señalización de auxinas con la interacción IAA12/BDL y MP/ARF5 (Motte et al., 2013).
2.7. Análisis del transcriptoma para elucidar procesos vitales
La transcriptómica estudia los perfiles de expresión de todos los genes presentes en el genoma, a través de estudio del transcriptoma se analiza todos los mRNAs presentes en una célula, tejido u órgano, en un momento dado y bajo condiciones determinadas. Hay que recordar que, la información genética cifrada en el ADN y contenida en los genes se expresa a través de los mecanismos de transcripción y traducción, a partir de los cuales se producen moléculas de ARNm y proteínas, respectivamente (ArgenBio, 2010). La transcripción es un proceso nuclear cuya activación depende de estímulos intra o extracelulares que activan cascadas de señalización para determinar cuáles genes deben expresarse o reprimirse de acuerdo con el tipo de estímulo inicial, generando una expresión diferencial, dependiendo del evento o proceso involucrado. Eventos celulares como la replicación, la diferenciación y la división celular y otros caracteres macroscópicos tales como rasgos fenotípicos, morfológicos, funcionales y de respuesta ante estímulos son producto de la expresión diferencial de genes (Soto, 2012). La regulación de la transcripción depende de la unión de activadores o represores en los elementos del promotor ubicados en la región 5’ de la secuencia codificante. Los activadores o represores dictaminan la tasa de síntesis de ARNm que debe producir la maquinaria basal de transcripción, la cual está constituida por los factores de transcripción generales (GTF) y la ARN polimerasa II (Proudfoot, Furger, & Dye, 2002), estos se unen a la caja TATA (secuencia de consenso parte del promotor) del ADN y la interacción de los factores de transcripción generales tales como la proteína de unión a la caja TATA (TBP) de TFIID, TFIIA y TFIIB unidos al promotor provee una base para la unión posterior de la polimerasa II con su TFIIF, una vez que estos están en posición en el DNA, otro par de proteínas (TFIIE y TFIIH) se unen al complejo y convierten a la polimerasa en forma activa de la maquinaria de transcripción (Karp, 2008). La fosforilación de la región carboxilo terminal de la subunidad más grande de la ARN polimerasa II, puede actuar como desacoplante de la enzima del GTF lo que permite a la enzima salir del complejo de preinicio (GTF y ARN polimerasa II) y detener el proceso de transcripción de esta forma (Karp, 2008). El estudio global del transcriptoma permite también establecer patrones de regulación génica coordinada, lo que contribuye no solo a dilucidar la función y agrupamiento de varios genes bajo un estímulo o condición específica, sino también a identificar elementos promotores comunes a varios genes, de ellos se puede deducir cómo opera la célula para dirigir las distintas funciones y determinar los destinos celulares (Soto, 2012).
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2.7.1. Métodos para estudiar el transcriptoma
2.7.1.1. Despliegue diferencial
Método basado en la amplificación de ADN complementario (ADNc) por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o más muestras. La primera etapa consiste en generar ADNc haciendo una transcripción reversa de una fracción de las moléculas de ARNm de una muestra, esto se logra utilizando como cebador de la transcripción reversa a un Oligo-poliT anclado con una o más bases adicionales al extremo 3´ del ARN mensajero (por ejemplo (Liang, 2002). Estos oligonucleótidos se fijan al ARN mensajero a través de la unión de las bases adicionales, impidiendo que el poliT “resbale” sobre distintas zonas del poli A. El único grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las moléculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. Luego de haberse realizado la síntesis de la primera hebra del ADNc, se amplifican segmentos de los transcriptos usando pares múltiples de cebadores de PCR (INTA, 2010). Un esquema específico de cómo funciona la técnica se muestra en la Figura 1.
(Liang, 2002)
Figura 1. Esquema fundamental del despliegue diferencial. Consiste en cuatro pasos sencillos: extracción de ARN, retrotranscripción utilizando primers de unión a la cola poli A, amplificación con oligonucleótidos cortos y electroforesis en geles de poliacrilamida donde se puede identificar las bandas diferenciales resultantes.
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2.7.1.2. Etiquetas de secuencias expresadas (ESTs)
Las ESTs son secuencias cortas obtenidas a partir de clones de ADNc (ADN complementario) y sirven como identificadores cortos de genes. Las EST son típicamente del rango de 300 a 500 nucleótidos de longitud obtenidos a partir de ya sea el extremo 5’ o 3’ de los insertos de ADNc. Las diferencias en la expresión de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Para generar datos de EST, se seleccionan al azar clones de las bibliotecas de ADNc. Los datos de EST son capaces de proporcionar una estimación aproximada de los genes que se expresan de forma activa en un genoma bajo una condición fisiológica en particular. Esto es debido a que las frecuencias de EST particulares reflejan la abundancia del ARNm correspondiente en una célula, que a su vez corresponde a los niveles de expresión génica bajo la condición dada (Pérez, 2013).
2.7.1.3. Análisis serial de la expresión de genes (SAGE)
El análisis serial de la expresión de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versión acelerada de la secuenciación de EST. Está basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequívocamente a un transcripto, siempre y cuando esté ubicada en una posición definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste típicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del último sitio de reconocimiento de una endonucleasa específica en el transcripto blanco. Múltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reacción de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo. Una etiqueta SAGE representa un único transcripto de ARNm, es posible obtener una visión general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresión de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE específicas en diferentes bibliotecas (Pérez, 2013).
2.7.1.4. Hibridación substractiva
Este método consiste en la hibridación de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman moléculas de ARNm/ADNc híbridas, mientras que las secuencias de ADNc que están presentes únicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las moléculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografía en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca (INTA, 2010)
2.7.1.5. Hibridación de microarreglos
Los microarreglos de DNA surgen de la necesidad de analizar la cantidad de información procedente de los grandes proyectos de secuenciación de genomas. El análisis de microarrays de DNA es una tecnología que permite estudiar simultáneamente la expresión de miles de genes y analizar su expresión bajo distintas condiciones experimentales. Permiten elaborar mapas finos de transcripción y proporcionan información indirecta de los niveles de proteínas.
Los microarreglos de DNA constan de miles de conjuntos ordenados de moléculas de DNA de secuencia conocida depositados en un soporte sólido (~ 2 cm2) como cristal, nylon o silicio (UAM, 2009).
Los tres tipos generales de microarreglos incluyen: i) «chips» de oligonucleótidos, construidos realizando la reacción de síntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucleótidos, construidos depositando oligonucleótidos sobre placas de vidrio o
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membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas de vidrio o membranas de nylon. Los productos de PCR son purificados y luego depositados en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usados para la producción de microarreglos han mejorado en los últimos años. Las opciones varían desde la construcción de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. Independientemente de cuál sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que está siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretación exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porción de los fragmentos organizados (INTA, 2010).
2.7.1.6. Tecnología RNA-seq
El RNA-seq es una herramienta transcriptómica actual que está fundamentada en la secuenciación de ADNc basada en los desarrollos NGS (NGS (del inglés Next Generation Sequencing) tecnologías de nueva generación). En esta tecnología se captura el ARN total o ARNm, el cual se fragmenta al usar primers que se unan al extremo 5’de la cola poli A de ARNm y convierte en una librería de ADNc luego de la retrotranscripción. Uno de los pasos fundamentales es la obtención de un ARN de buena calidad que represente todos los transcritos que se producen en la condición y tejido de estudio. La fragmentación del ARN o del ADNc se realiza o bien por nebulización, por digestión con enzimas de restricción o a través del uso de cationes divalentes bajo condiciones de presiones elevadas. Generalmente el fraccionamiento se realiza posteriormente a la síntesis de ADNc. Esta síntesis se realiza con procedimientos estándares bien establecidos para la mayoría de organismos que hacen uso de la enzima transcriptasa reversa (Wang et al., 2010). Una vez obtenido el ADNc se ligan adaptadores de tal forma que cada fragmento generado contendrá un adaptador ligado en sus extremos 3´y 5´. Las secuencias de estos adaptadores se conocen y serán necesarias para que cada fragmento pueda ser secuenciado, y en algunos casos pueden emplearse para diferenciar otros grupos de fragmentos obtenidos a partir de muestras de ADNc diferentes; sin embargo, no en todos los casos se requiere la ligación de adaptadores, lo cual dependerá de la plataforma de secuenciación a emplear, dichos adaptadores se pueden ligar directamente a la muestra de ARN, previa síntesis de ADNc (Core, Waterfall, & John, 2008).
2.7.2. Estudios de expresión diferencial de genes mediante análisis del transcriptoma
Se han realizado varios estudios de expresión genética en plantas para conocer los cambios que ocurren en el metabolismo de las mismas, debido a factores externos que afectan su desarrollo. En un estudio realizado en tomate de árbol (Solanum betaceum) se identificaron genes que codifican proteinas de resistencia a estrés, fotosíntesis, estructura de la pared celular secundaria, metabolismo y regulación de la expresión génica, todos estos relacionados con la tolerancia a estrés abiótico (Jaramillo, 2013). En plantas de Zantedeschia spp. se estudió la expresión diferencial de genes en tubérculo, hoja y brote, para comprender procesos de dormacia y crecimeinto activo de la planta, mediante despliegue diferencial de ARN mensajero. El análisis de sus secuencias reveló homología con genes descritos en la literatura, que incluyen proteínas despolimerizantes de actina, proteínas inducidas por elicitor y deshidratación, proteínas de respuesta a bajas temperaturas y salinidad, proteínas tipo Fap y Skp1 y una activadora de rubisco (Leal, Gutierrez, & Destefano, 2007). A partir de la expresión diferencial de ARNm de plántulas in vitro de dos accesiones de Ullucus tuberosus Loz.(olluco) altamente tolerantes a estrés osmótico, fueron seleccionados 31 fragmentos diferenciales de ADNc relacionados con tolerancia a sequía (Romero & Estrada, 2005). En Mexico se estudiaron los genes involucrados en la tolerancia a la salinidad en dos variedades de chile: poblano y chiltepin (Capsicum Annum var Annuum y Capsicum Annum var Glabriusculum), al realizar el análisis comparativo se reportaron genes con niveles de expresion
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opuesta y probablemente sea la diferencia en la resistencia al estrés salino entre el chile chiltepin y el chile poblano (Medina, 2009).
2.8. Genes expresados en procesos de organogénesis
Kerstetter (1994) encontró que los genes (KNOX I) (Knotted-like homeobox-) son expresados específicamente en los meristemos apicales en vástagos, y promueven la actividad meristemática, mientras los genes KNOX II son más ampliamente expresados en tejidos vegetales (Meng, Zhang , & Lemaux, 2010).
En Arabidopsis el gen HOBBIT es requerido para la división y diferenciación celular en los meristemos, este gen codifica un homólogo de la subunidad Cdc27 el cual pertenece al complejo promotor de la anafase, y en genes mutantes de HOBBIT se muestra que existe acumulación de un represor transcripcional de auxina (AIA) (Bilou et al., 2002).
En Arabidopsis, el gen AtSCR además de su papel principal en identidad celular y patrón radial de la raíz se expresa en otros órganos como hipocótilo, meristemo caulinar y primordios foliares, apoyando la hipótesis de que este gen podría tener un papel en la división celular en tejidos con alta capacidad de división tanto en órganos radiculares como en órganos aéreos (Wysocka-Diller et al., 2000).
En Arabidopsis existen mutantes dentro de la familia de trasportadores de Auxinas, estos presentan fenotipos con alteraciones mínimas, sin embargo, cuando los mutantes son dobles, triples y cuádruples de distintos miembros de la familia PIN, especialmente cuando el gen PIN2 aparece alterado, presentan fenotipos con graves alteraciones en la raíz (Friml et al., 2003).
Se encontraron cinco genes (PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, y PIN7) que colectivamente controlan la distribución de auxina para regular la división celular y la expansión celular en raíces primarias, además estos genes están involucrados en patrones de formación referente a la máxima distribución de auxina y la restricción de la expresión de genes Plethora que son los principales determinantes para la especificación de células madre de la raíz, estas interacciones controlan el patrón y el crecimiento del primordio de raíz (Blilou et al., 2005).
La familia GRAS está compuesta por proteínas con función reguladora de la expresión génica, algunos miembros de esta familia, tales como SCR y SHR podrían ser genes que participen activamente en la formación y desarrollo de raíces adventicias ya que se ha descrito su relevancia en los procesos de formación y mantenimiento radicular (Sabatini et al., 2003).
En el enraizamiento adventicio de Pino (Pinus radiata D. Don) se identificó estos genes: PrSCL1 y PrSHR como factores transcripcionales en proceso de formación de raíces en esta especie (Sole, 2012).
El papel de las citoquininas en el desarrollo de meristemos apicales se conoce mediante el estudio del Gen del arroz, llamado Lonely Guy (LOG), este codifica una nueva enzima acitvadora de citoquininas y el paso final de la síntesis bioactiva de citoquininas. La pérdida de la función de LOG causa la terminación prematura del meristemo del brote. LOG se expresa específicamente en el ápice del brote, lo que sugiere la activación específica de citoquininas como un mecanismo para regular la función de meristemos apicales de brotes (Kurakawa et al., 2007).
La señalización de auxina comienza con la percepción de la acumulación de auxina por los complejos SCFTIR1 / AFB1-5, incluyendo las proteínas, co-receptor de auxina llamado TIR1 (Resistencia Inhibidor de transporte), las proteínas F-box auxina co-receptor TRANSPORTE INHIBIDOR Resistencia1 (TIR1) y AUXIN F-BOX BINDING1-5 (AFB1-5), los cuales desencadenan la degradación de Aux / IAA como represores transcripcionales (Villalobos et al. , 2012).
Durante el desarrollo de las raíces laterales, cuando la auxina se acumula en las células del periciclo, el centro marcador de la raíz inactivo o en reposo llamada WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5 (WOX5) se expresa en las células fundadoras. (Ditengou, Tealea , Kochersperger , &
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Flittner , 2008), esto va acompañado por la expresión del marcador de estela de la raíz (Raíz corta) o en inglés conocida como SHORT ROOT (SHR). En la punta de la raíz primaria, el SHR activa el gen conocido como SCARECROW (SCR), el cual marca la endodermis de la raíz y el centro quiescente, y el factor de transcripción PLETHORA 1 (PLT1) se expresa corriente debajo de WOX5 (Lucas et al., 2011). Luego a través de la acción concertada de PLT1, SHR, y SCR, los genes PIN son expresados (Xu et al., 2006).
En tomate (Solanum lycopersicum) se identificó genes (RG1) y (PRO), a estos se les atribuye ser de gran importancia en la adquisición de la competencia de un vástago como tal (Lombardi-Crestana et al., 2012).
El gen receptor de citoquinina de Arabidopsis llamado HISTIDINA KINASE4 (AHK4), podría ser un marcador molecular debido a que en un medio inductor de callo la expresión localizada de AHK4 puede identificar los sitios futuros de transcripción del inductor de citoquininas WUS con la posterior incubación en un medio inductor de vástago que contiene citoquininas (Gordon et al., 2009).
El gen IAA20 es altamente expresado en respuesta a la sobreexpresión del gen ENHANCER OF SHOOT REGENERATION2 (ESR2), la cual confiere citoquinina independiente para la regeneración de vástagos a partir de explantes de raíces (Ikeda et al., 2006).
En Arabidopsis se estudió la subexpresión de múltiples genes CDK (quinasas dependientes de ciclina) por la sobreexpresión de genes inhibidores de CDK / KRP, mediante mutaciones en el quíntuple ICK1 / 2/5/6/7, la planta de Arabidopsis que poseía el mutante tenía más células en la capa cortical del meristemo apical de la raíz (RAM) que el tipo salvaje (WT), esto implica que el mutante tuvo un ritmo más rápido en su ciclo celular, los efectos de la subexpresión de los genes ICK (mutaciones ICK1 / 2/5/6/7 ) en explantes de cotiledón en cultivo in vitro, formaron callo de manera eficiente en ausencia de citoquinina y con una menor concentración de 2,4-D en el medio de cultivo, en comparación con las plantas WT, esto indica el aumento de la competencia para la inducción de callo en el mutante; por lo tanto la actividad de CDK es un factor importante que mejora la inducción de callo y el aumento de la proliferación celular (Cheng, Wang, & Han, 2015).
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. UBICACIÓN
País: Ecuador Provincia: Pichincha Cantón: Quito Sector: Ciudadela Universitaria UBICACIÓN GEOGRÁFICA Latitud: 00°11’54,8’’ S Longitud: 78°30’25,1’’ O Altitud: 2870 msnm
3.2. MATERIALES
3.2.1. Material Vegetal
Hipocótilos extraídos de semillas de naranjilla híbrido Puyo.
3.2.2. Cultivo in vitro
3.2.2.1. Esterilización de semillas de naranjilla
Solución de alcohol potable al 70% Solución de hipoclorito de sodio al 2.5% Tween 20 Agua destilada estéril
3.2.2.2. Medios de cultivo
Medio para inducción de callo
MS (Murashige y Skoog, 1962), sacarosa 40gL-1, Bacto Agar DifcoTM 8gL-1, pH 5.7, 1.0 mg/L Acido Naftaleno Acético (ANA) y 2 mg/L Benzil Amino Purina (BAP).
Medio para inducción de vástagos
MS, sacarosa 90gL-1, Bacto Agar DifcoTM 8gL-1, pH 5.8, 7,5 mg/L Benzil Amino Purina (BAP).
Medio para inducción de raíces
MS, sacarosa 40gL-1, Bacto Agar DifcoTM 8gL-1, pH 5.7, 0.5 mg/L de Ácido Indol, Butírico (IBA).
3.2.2.3. Equipos utilizados para el cultivo in vitro de naranjilla
Potenciómetro JENWAY 3510 Autoclave All American 75 X Cámara de Flujo Laminar Streamline Incubadora Memet Estereomicroscopio Olympus
3.2.3. Extracción de ARN de tejidos de naranjilla
PureLink® RNA Mini Kit Ambion by Life Solución de etanol absoluto Scharlau al 75% Agua tratada con DEPC InvitrogenTM Tubos Eppendorf tratados con DEPC Morteros lavados con DEPC y autoclavados Pinza y bisturí lavados con DEPC y autoclavados Micropipetas LambdaTM plus Microcentrífuga 5415D EppendorfTM
16
Cabina PCR BIOBASE PCR-01
3.2.4. Cuantificación de ácidos nucleicos
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
3.2.5 Retrotranscripción de ARN de naranjilla
Agua tratada con DEPC InvitrogenTM dNTP Mix 10mM InvitrogenTM Primer H-T11G y H-T11A, RNAimage ARNm Differential Display system GenHunterTM
CorporationTM
Secuencia H-T11G 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
Secuencia H-T11A 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
SuperScript III Trancriptasa Reversa InvitrogenTM 200U MM-LV Reverse Transcriptasa Buffer 5X First Strand InvitrogenTM DTT (Dithiothreitol) 0.1M InvitrogenTM Muestras de ARN total de hipocótilos, vástagos, raíces y callo diluidas a 100ng/uL Microcentrífuga 5415D EppendorfTM Termociclador Techne Flexigene
3.2.6. Amplificación de ADNc
Agua tratada con DEPC InvitrogenTM
dNTP Mix 10mM InvitrogenTM
Primers H-AP1, H-AP2, H-AP3, H-AP4, H-AP6, H-AP7, H-AP8, RNAimage ARNm Differential Display system GenHunter CorporationTM Secuencia H-AP1 5’- AAGCTTGATTGCC- 3’ Secuencia H-AP2 5’- AAGCTTCGACTGT- 3’ Secuencia H-AP3 5’- AAGCTTTGGTCAG- 3’ Secuencia H-AP4 5’- AAGCTTCTCAACG- 3’ Secuencia H-AP6 5’- AAGCTTGCACCAT- 3’ Secuencia H-AP7 5’- AAGCTTAACGAGG- 3’ Secuencia H-AP8 5’- AAGCTTATCGAGG- 3’
Taq DNA Polimerasa Platinum InvitrogenTM 5U/μL
Buffer 10X para PCR Sigma Aldrich
Cloruro de Magnesio 50mM Sigma Aldrich
Microcentrífuga 5415D EppendorfTM
Termociclador Techne Flexigene
Cabina PCR BIOBASE PCR-01
3.2.7. Electroforesis en geles de agarosa
Agarosa LE InvitrogenTM
Ladder 100bp InvitrogenTM
Tris Base InvitrogenTM
Ácido bórico AmpTM
EDTA InvitrogenTM
Cámara de electroforesis OWL Easycast B1A Thermo Scientific
Fotodocumentador Gel Doc XR Bio-RadTM
17
3.2.8. Electroforesis en geles de poliacrilamida
TBE 10x (Tris base InvitrogenTM 108g/L, Ácido bórico Merck 55g/L, EDTA Sigma 7.44g/L)
Solución poliacrilamida 6% (Acrilamida InvitrogenTM 57g/L, Bisacrilamida InvitrogenTM 3g/L, TBE 1x, Urea InvitrogenTM 300g/L)
Persulfato de amonio 10% Sigma
Temed Sigma Aldrich
Alconox Sigma Aldrich
Ladder 100bp (Ladder 10bp InvitrogenTM 20%, Bluejuice InvitrogenTM 10%)
Blue juice InvitrogenTM
Solución Alcohol absoluto Scharlau, ácido acético glacial J.T. Baker 0.5%
Bind Silane (3- Methacryloxypropyltrimethoxysilane) GE Healthcare Life Sciences
Alcohol potable al 96%
Cámara vertical de electroforesis #SG-400-33 C.B.S. Scientific Co.
Fuente de poder E865 Consort
Solución Fijación/ Parada (Alcohol Absoluto Scharlau 10% v-v, Ácido Acético Glacial J.T. Baker 1% v-v)
Solución Tinción (Nitrato de Plata Casa del químico 2g/L, Formaldehído ACS Reagent 37% 0.024% v-v)
Solución Revelado (Hidróxido de Sodio MerckTM 15g/L, Formaldehído ACS Reagent 37% 0.024% v-v)
Transiluminador
Cámara de Fotos EOS Rebel T5i Canon
3.2.9. Extracción de bandas de geles de poliacrilamida
TE (Tris HCl InvitrogenTM 10mM, EDTA InvitrogenTM 0.1mM)
Shaker MaxQ 4000 Thermo Scientific
18
3.3. MÉTODOS
Figura 2. Diagrama de flujo de la metodología empleada para el análisis de la expresión diferencial de genes durante la inducción de callo, raíces y vástagos adventicios a partir de hipocótilos de Naranjilla.
3.3.1. Aislamiento de hipocótilos
Los hipocótilos se obtuvieron a partir de semillas de S. quitoense Lam var quitoense, previamente desinfectadas con alcohol al 70% por 5 minutos, seguido de una inmersión en una solución de hipoclorito de sodio 2.5% + tween 20 durante 5 minutos con agitación constante y varios lavados con agua destilada estéril para eliminar todos los restos del desinfectante. Posteriormente, las semillas fueron colocadas en el medio de agar-agua durante cinco días para ablandar la testa de las mismas. Los hipocótilos fueron extraídos del embrión utilizando pinza, bisturí, y el estereomicroscopio.
3.3.2. Inducción de callo, vástagos y raíces en medios con fitohormonas
Los medios de cultivo utilizados para la inducción de callo, vástagos y raíces se indican en el acápite 3.2.2.2. En todos los casos, se cultivaron 40 hipocótilos por caja, 8 cajas por tratamiento, para un total de 320 hipocótilos por medio de cultivo. Las cajas fueron incubadas a 30° C por 15 días, en oscuridad, para la inducción de callos, 20 días, con fotoperíodo de 16 horas luz, para la inducción de vástagos y 9 días, en oscuridad, para la inducción de raíces.
3.3.3. Colección de los productos inducidos para análisis de expresión diferencial
Con la ayuda de pinza, bisturí y estereomicroscopio, se colectó 100 mg de cada uno de los
productos inducidos (callo, vástago y raíz) y se los colocó en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml,
los cuales fueron almacenados en una congeladora a -20º C hasta el momento de la extracción de
Siembra de hipocótilos en medios con
hormonas para inducir callo, vastagos y raíces
Colecta de material inducido (callo, vastagos
y raices)
Extracción de ARN de callos vastagos y raices
Retro-transcripción de ARN a ADNc
Amplificación de ADNc mediante Reaccion en
Cadena de la Polimerasa (PCR)
Electroforesis en geles de poliacrilamida
Identificación de bandas diferenciales
19
ARN. El mismo procedimiento se realizó con el explante original (hipocótilo) que se lo utilizó como
testigo.
3.3.4. Despliegue Diferencial
3.3.4.1. Extracción de ARN
Se extrajo el ARN total de los hipocótilos, vástagos, callo y raíces de naranjilla utilizando el kit de extracción PureLink® RNA Mini Kit Ambion by Life (Anexo 3).
3.3.4.2. Cuantificación de ARN total
La cuantificación de ARN se realizó mediante espectrofotometría ultravioleta utilizando el equipo Nanodrop 2000 (Anexo 5).
Todas las muestras de ARN se diluyeron a una concentración final de 100 ng/μL.
3.3.4.3. Síntesis de la primera hebra de ADNc
La retrotranscripción del ARN se realizó utilizando las enzimas Superscript III Reverse Transcriptase de InvitrogenTM y MM-LV Reverse Transcriptase del kit RNAimage de Genhunter de acuerdo a las condiciones sugeridas por el respectivo fabricante. Se utilizó los oligosT H-T11G y HT11A de GenHunter CorporationTM que se unen a la cola poli A de los ARNm (Anexo 6 y 7).
3.3.4.4. Amplificación de ADNc (mediante PCR)
La amplificación del ADNc se realizó utilizando Taq DNA Polimerasa Platinum InvitrogenTM con 16 diferentes combinaciones de primers: primer H-APx GenHunterTM como forward y primer H-T11M GenHunterTM como reverse. Las mezclas de reacción, así como las condiciones de la PCR fueron las sugeridas en el protocolo de Taq DNA Polimerasa Platinum InvitrogenTM en un volumen final de 20μL (Anexo 8).
3.3.4.5. Electroforesis en geles de Poliacrilamida
Para la electroforesis vertical en gel de poliacrilamida se utilizó la cámara CBS Scientific de CBS Scientific Co Inc.
En primer lugar, se lavó los vidrios cuidadosamente utilizando el detergente Alconox. Se dió a cada vidrio un tratamiento especial, primero con alcohol al 70% seguido de Bind Silane (1mL ácido acético glacial+ 3μL Bind SilaneTM) al vidrio donde se pega el gel y de 800μL de SigmacoteTM al vidrio de la cámara. Una vez tratados los vidrios se armó la cámara siguiendo las instrucciones del proveedor y se inyectó 40 mL de la solución de poliacrilamida al 6% previamente preparada junto con 140 de persulfato de amonio 10% y 15,5 μL de TemedTM. Se dejó polimerizar la acrilamida durante una hora con la cámara en sentido horizontal y con el peine colocado en sentido contrario a los dientes para formar el frente de corrida. Transcurrido este tiempo, se ensambló la cámara en posición vertical, se agregó 2L de TBE 1X. Se introdujo el peine en dirección normal para formar los pocillos. Se retiró la urea de cada pocillo con ayuda de una pipeta Pasteur. A continuación, se cargó las muestras (3μL de ADN y 3 μL Blue juice 10x) y se las corrió durante 5 horas a 600 V.
3.3.4.6. Tinción del gel de poliacrilamida
Transcurrido el tiempo de corrida se llevó a cabo la tinción del gel con nitrato de plata. En primer lugar, se colocó el gel en la solución fijadora, previamente refrigerada, durante 10 minutos, acto seguido se lo colocó en la solución de tinción durante 16 minutos con agitación constante. Posteriormente se lavó el gel por 10 segundos con agua destilada para después colocarlo en la solución reveladora con agitación constante hasta el aparecimiento de las bandas (más o menos 20-30 minutos). Una vez que las bandas aparecieron se colocó al gel por 5 minutos en la solución de parada y finalmente se le dio un último lavado con agua destilada por 10 segundos.
20
3.3.4.7. Aislamiento de ADN a partir de bandas diferenciales en geles de poliacrilamida
Una vez terminada la electroforesis en gel de poliacrilamida se dejó secar el gel. A continuación, se colocó el vidrio sobre el transiluminador y se realizó una comparación prolija entre los tratamientos: testigos, callo, yemas adventicias, primordios radiculares, al fin de identificar las bandas expresadas diferencialmente (no expresión, sub o sobre expresión, y expresión exclusiva). Con la ayuda de un bisturí se extrajo por separado cada una de estas bandas y se las colocó en tubos de microcentríguga de 1.5mL con 25μL de TE. Las bandas extraídas se colocaron en la incubadora a 37°C y con agitación durante toda la noche. A la mañana siguiente se recuperó todo el líquido de cada muestra y se desechó los residuos de gel de poliacrilamida.
Para la identificación de las bandas diferenciales se aplicó la siguiente codificación: para indicar la procedencia de la muestra se usó las letras HP para hipocótilos, V para vástagos, Ca para callo y L para raíz; luego la letra que identifica al oligo anclado o primer reverse que es G para HT11-G y A para HT11-A, el número que acompaña a la letra del primer anclado es la que pertenece al primer forward o arbitriano (H-APx) y por último el número de la banda identificada. Ejemplo: CaA2-5, es la muestra de callo con la combinación de primers HT11A- HAP2, y el número de la banda es 5 (Figura 4).
21
4. RESULTADOS
4.1. Inducción de callo vástagos y raíces en medios con fitohormonas
La inducción de callo, vástagos y raíces a partir de hipocótilos fue exitosa, con 100% de inducción de los mismos (Figura 3). En A, se observa el callo inducido en el medio de cultivo MS + 1 mg/L ANA 2 mg/L BAP incubado durante 15 días en completa oscuridad; en B, se presentan los vástagos inducidos en el medio de cultivo MS + 7,5 mg/L BAP incubado durante 20 días con un fotoperíodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad; en C se evidencia las raíces inducidas en el medio de cultivo MS + 0,5 mg/L AIA incubado durante 9 días en completa oscuridad. La temperatura de incubación fue de 30º C para todos los tratamientos y procesos inductivos. En todos los casos, en la esquina superior derecha de la figura se muestra una imagen aumentada del callo, el vástago y las raíces al momento en el que fue tomada la muestra para el análisis de despliegue diferencial.
A
B
A1
A2
B1
B2
22
C
Figura 3. Callos, vástagos y raíces inducidos a partir de hipocótilos de naranjilla. A. A1: Callo inducidos en un medio de cultivo (MS + 1 mg/L ANA 2 mg/L BAP). A2: Imagen aumentada del callo inducido. B. B1: Vástagos inducidos en un medio (MS + 7,5 mg/L BAP). B2: Imagen aumentada del vástago inducido. C. C1: Raíces inducidas en un medio de cultivo (MS + 0,5 mg/L AIA). C2: Imagen aumentada de raíces inducidas.
4.2. Despliegue Diferencial
Los patrones de bandas presentes en el gel de poliacrilamida, después de la electroforesis de los productos amplificados de ADNc provenientes de callos, vástagos y raíces inducidos in vitro, permiten evidenciar la expresión diferencial de genes, al compararlos entre sí y con el hipocótilo que se lo usó como testigo (Figura 4). La expresión diferencial es notoria por la ausencia de banda en ciertos casos o la diferente intensidad de las bandas en el gel, lo cual se puede resumir en tres categorías: expresión exclusiva, cuando la banda aparece solo en uno de los productos inducidos; subexpresión, cuando la banda de uno o más de los productos inducidos es menor que la de los demás y sobreexpresión, cuando la banda de uno o más de los productos inducidos es de mayor intensidad que la de los otros.
La imagen de la Figura 4 corresponde al resultado de amplificar mediante PCR el ADNc de los diferentes órganos inducidos, con 6 combinaciones de primers del kit de GenHunter (HAP2-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A, HAP6-HT11G, HAP7-HT11G, HAP8-HT11G).
C1
C2
23
Figura 4. Gel resultante de la electroforesis en poliacrilamida al 6% de los productos de amplificación correspondiente a las muestras inducidas con las distintas combinaciones de fitohormonas con 6 combinaciones distintas de cebadores (HAP2-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A, HAP6-HT11G, HAP7-HT11G, HAP8-HT11G). El marcador de peso molecular utilizado fue 100bp de Invitrogen. De izquierda a derecha, primero está el ladder (100pb) seguido por el testigo (hipocótilo) y las tres muestras inducidas. HP: hipocótilos; Ca: callo; V: vástago y L: raíz. G6: Cebadores HT-11G-HAP6; G7: Cebadores HT-11G-HAP7; G8: Cebadores HT-11G-HAP8; A2: Cebadores HT-11A-HAP2; A7: Cebadores HT-11A-H-AP7; A8: Cebadores HT-11A-HAP8. Ejemplos: bandas diferenciales exclusivas: CA2-5 y LA7-5; banda diferencial sobreexpresada: VG6-17.
VG6-17 CaA2-5
LA7-5
G6 G7 G8 A2 A7 A8
24
Las 6 combinaciones de cebadores seleccionadas para realizar el despliegue diferencial de ADNc de hipocótilo, callo, vástago y raíz, generó un total de 180 bandas (30 bandas promedio por combinación). De éstas, solo 23 bandas fueron diferenciales entre los tejidos evaluados. La combinación de primers que generó el mayor número de bandas fue HT11G-H-AP6, seguidos por las combinaciones HT11G – H-AP7, HT11G – H-AP8, y HT11A-H-AP8 con igual número de bandas (Gráfico 1).
Gráfico 1. Número de bandas diferenciales encontradas por combinación de cebadores (HAP2-HT11A, HAP7-HT11A, HAP8-HT11A, HAP6-HT11G, HAP7-HT11G, HAP8-HT11G.)
Se generó un total de 23 bandas diferenciales, la mayor cantidad de bandas diferenciales fueron para vástago, seguido por las bandas diferenciales de callo y raíces, el menor número de bandas pertenecen a la muestra del testigo (hipocótilos) (Gráfico 2).
Gráfico 2. Numero de bandas diferenciales totales obtenidas en hipocótilos, callo, vástago y raíz de naranjilla inducidos in vitro a partir de hipocótilo.
0
2
4
6
8
10
12
HT11-G - H-AP6
HT11-G - H-AP7
HT11-G - H-AP8
HT11-A - H-AP2
HT11-A - H-AP7
HT11-A - H-AP8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Hipocótilos Vástagos Callo Raíces
Bandas diferenciales
25
De las 23 bandas diferenciales identificadas, algunas fueron exclusivas para hipocótilo, callo, vástago o raíces, otras fueron subexpresadas o sobreexpresadas en los tejidos evaluados. El mayor número de bandas exclusivas fue para vástagos y callo, tanto que el mayor número de bandas sobreexpresadas fue para callo, y el mayor número de bandas subexpresadas fue para hipocótilo (testigo) (Gráfico 3).
Gráfico 3. Número de bandas diferenciales exclusivas, subexpresadas y sobreexpresadas en hipocótilo, callo, vástago y raíz de naranjilla inducidos in vitro a partir de hipocótilo.
0
1
2
3
4
5
6
Hipocótilos Vástagos Callo Raíces
Bandas exclusivas Bandas sobreexpresadas Bandas subexpresadas
26
5. DISCUSIÓN
Los métodos de análisis del transcriptoma permiten identificar poblaciones de RNAm presentes en un momento dado, en un órgano específico y bajo condiciones determinadas. Esto a su vez, está asociado con la expresión de los genes responsables de las manifestaciones morfológicas y fisiológicas de las células frente a los estímulos que inciden sobre ellas. Por tanto, este tipo de análisis puede ayudar a elucidar, a nivel de genes, los procesos de desdiferenciación y diferenciación celular, organogénesis, embriogénesis, así como interacciones de las plantas con microorganismos patógenos y benéficos y agentes abióticos (Soto, 2012).
El principal objetivo de este estudio fue determinar la expresión diferencial de genes que se activan o se reprimen durante las fases de cultivo in vitro que conducen a la formación de callos, vástagos y raíces. Por tanto, la primera fase consistió en inducir la formación de estos tejidos y órganos in vitro bajo la influencia de combinaciones hormonales apropiadas. Pruebas preliminares usando diferentes explantes y combinaciones hormonales, permitieron determinar como mejor explante para este propósito al hipocótilo extraído de la semilla y las combinaciones hormonales que se reportan en este documento. La técnica usada fue la de despliegue diferencial (Liang, 1994) usando el kit de GenHunter.
Es conocido que en la inducción de brotes o vástagos en cultivo in vitro se consigue con un exceso de citoquinas sobre las auxinas, promueve la formación de brotes en un callo, mientras que un exceso de auxina induce la formación de raíces (Veit, 2009). Así mismo, la formación de callo puede darse por combinaciones de auxinas y citoquininas en concentraciones equitativas o concentraciones bajas de auxina sola (Pierik, 1997). Siguiendo estos criterios, se eligieron las diferentes concentraciones y combinaciones de fitohormonas, las cuales generaron estructuras características: callo, vástagos y raíces a partir de hipocótilos.
En estudios con Ramie (Boehmeria nivea L. Gaud) para la inducción de vástagos in vitro, se observó que la máxima expresión de ARN mensajero ocurría entre los 28-30 días de cultivo (Huang et. al, 2014); en nuestro caso, la aparición de los vástagos inducidos ocurrió a los 20 días, lo cual resulta cercano a periodo de máxima expresión de ARNm en el estudio de Huang et al., 2014, aunque esto puede variar entre especies. Por tanto, a este tiempo se obtuvo las muestras de vástagos inducidos para el análisis de la expresión diferencial de genes. Para callos se colectó las muestras a los 15 días y para raíces a los 9 días.
En el despliegue diferencial se obtuvieron bandas diferenciales exclusivas para vástagos, para callo y para raíces. En el caso de los vástagos, las bandas exclusivas fueron VG6-16, VA8-4, VG6-19, VG7-7 y VG8-1; de este hecho se infiere que existen genes que solo se expresan en los tejidos del vástago en formación mientras que en el testigo (hipocótilos), callo y raíces, estos mismos genes probablemente estarían reprimidos o silenciados. En Arabidopsis se han identificado genes que codifican proteínas y estas actúan como receptores de citoquinina (ARABIDOPSIS HIS KINASE 2 (AHK2), AHK3 and AHK4/WOL1 (WOODENLEG 1) /CRE1 (CYTOKININ RESPONSE 1)) y luego de una cascada de señalizaciones, la señal se trasfiere a miembros de la familia de ARABIDOPSIS HIS PHOSPHOTRANSFER PROTEINS (AHPs), que se translocan el núcleo para fosforilar a los miembros de familia de proteínas (ARR) denominados reguladores de respuesta de Arabidopsis (ARR) de tipo A y B. La activación del regulador de respuesta (ARR) tipo B, actúa como factor de transcripción induciendo la transcripción de genes de respuesta a la citoquinina, incluyendo ARRs de tipo A y factores de respuesta a la citoquinina (CRF). Los factores de respuesta a la citoquinina (CRF) junto con los reguladores de respuesta (ARRs) tipo B, median la expresión de genes de citoquinina que al final dirigen las acciones fisiológicas de estas fitohormonas (To et al., 2007). La secuenciación de las bandas exclusivas de vástagos encontradas en este estudio, permitirán la identificación de los genes correspondientes, los cuales podrían ser receptores de citoquinina,
27
proteínas fosfotransferasas, reguladores de respuesta de citoquinina y factores de respuesta a citoquininas, de acuerdo a los genes que se mencionaron anteriormente en Arabidopsis.
En la inducción de callo se obtuvo las bandas diferenciales exclusivas CaG8-2, CaA2-4, CaA2-5, CaA8-2, y CaA8-5. Como en el caso anterior, se infiere que existe genes que solo se están expresando en el callo, mientras que en el testigo (hipocótilos), vástago y raíz estos genes estarían silenciados. La formación de callo y la iniciación de primordios están regulados por cambios en la expresión de genes implicados en la formación de raíces laterales (Higuchi et al., 2006). El gen WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5 (WOX5) se expresa en las células fundadoras, cuando hay acumulación de auxinas en el periciclo de las células (Ditengou et al., 2008). Estudios de regeneración de brotes demuestran que el callo no es un solo un grupo de células indiferenciadas si no que, posee características de primordios ya sea para formar vástagos o raíces laterales. Durante la fase de incubación en medio inductor de callo conducente a la formación de vástagos, muchos de los genes implicados en la iniciación de raíces laterales son inducidos, así, lo que demuestra los fuertes puntos en común en el desarrollo de los primordios radiculares laterales y de los primordios que finalmente dan lugar a brotes o vástagos. (Motte et al., 2013). Debido a que un proceso de iniciación similar de una raíz lateral está en base a la regeneración de brotes, es probable que los factores determinantes para identificar una raíz genuina solo se producen en etapas posteriores de formación de raíces laterales como BDL / IAA12-MP / ARF5 y SHY2 / IAA3. Sin embargo, desde BDL / IAA12-MP / ARF5 también está involucrado en el control del nicho de células madre de brotes y la regulación de ESR1 durante el desarrollo de los brotes. (Zhao et al., 2010). Varios marcadores para identificar primordios de raíces tales como WOX5, SCR, SHR, PLT1, RCH1, QC25 o J0121, se expresan también en los primordios prematuros de vástagos durante la regeneración y por lo tanto no pueden ser usados para definir la identidad de la raíz. La ciencia aún no ha descrito ningún marcador genético que indique el compromiso irreversible de un primordio de órgano para convertirse en una raíz (Sugimoto, Jiao , & Meyerowitz, 2010).
En la inducción de raíces se obtuvo las bandas diferenciales exclusivas LG6-4, LG8-4, y LA7-5, las
cuales, existe la posibilidad que correspondan a genes que solo se expresan durante los procesos
de rizogénesis. Estudios en Arabidopsis en la regeneración de raíces adventicias han identificado
genes que actúan como represores transcripcionales (Transporte Inhibidor Resistencia1 (TIR1) y
Auxin F-BOX Binding1-5 (AFB1-5)), cuando las auxinas entran en contacto con la membrana
celular; también se activan factores de respuesta a la presencia de estas hormonas (ARF) que
median la expresión de los genes dependientes de auxina. Existen transportadores de auxina de
entrada de la familia AUXIN RESISTANT 1/LIKE-AUX1 (AUX1/LAX) y transportadores de salida están
agrupados en la familia PIN-FORMED (PIN) y la sub familia ATP-binding casette B/resistente a
multidrogas/P-glicoproteínas (ABCB/MDR/PGP), estos contribuyen a la acumulación de auxina
local durante la primera etapa de regeneración de raíces laterales (Petrásek & Friml, 2009). Es
probable que las bandas diferenciales identificadas en la inducción de raíces, pertenezcan a
familias de genes de factores de respuesta a auxinas (ARF), a transportadores de auxina de
entrada (AUX1/LAX) o a transportadores de salida (PIN).
Las bandas para hipocótilos HPG6-18, HPG7-5, y HPG6-3 mostraron subexpresión en comparación
al vástago y callo, la banda para callo CaG6-15, mostró subexpresión en comparación al vástago,
la banda para vástago VG6-1 se subexpresó en comparación al callo y por último las bandas para
raíz LG6-5, LG7-5 fueron subexpresadas en comparación al vástago y callo respectivamente. Esto
indica que los genes de estas bandas se están expresando con menor intensidad que en las otras
muestras inducidas. La literatura reporta genes que se subexpresan cuando están en medios
inductores de brotes adventicios como receptores de citoquinina (AHK2 y AHK3), reguladores
negativos de citoquininas tipo A (ARR-3, ARR-5, ARR-6, ARR-7, ARR-17) y reguladores de
citoquinina tipo B (ARR1-1, ARR-2, ARR-11), todos estos identificados en Arabidopsis. Genes
28
relacionados con auxinas tales como (IAA19/MSG2 IAA20 IAA28; PIN2, PIN5) que forman parte de
factores de respuesta auxina y transportadores de salida de auxinas, muestran subexpresión
durante la formación de vástagos adventicios en presencia de auxinas y genes relacionados con el
meristemo apical de vástago CUC3 muestra subexpresión en presencia de auxinas (Duclercq et al.,
2011). Es probable que genes de esto grupos son los que se están subexpresando cuando hay una
sobreexpresión en vástagos debido que son genes que se activan en medios con citoquininas o
cuando hay sobreexpresión en callo en medios con auxinas.
Las bandas VG6-17, VG7-4, y CaG6-2 mostraron sobreexpresión en el proceso de inducción de
vástagos y callo respectivamente, la banda de vástago mostro sobreexpresión en comparación al
testigo (hipocótilos) callo y raíz, la banda de callo se sobreexpresó en comparación al testigo,
vástagos y raíz. La sobreexpresión se refiere a que los genes correspondientes a estas bandas se
están expresando en mayor intensidad que en las otras muestras inducidas. En estudios en
Arabidopsis se identificaron genes que se sobreexpresan en presencia de citoquininas en la
formación de vástagos adventicios, como los receptores de citoquina (AHK4/CRE1/WOL1),
reguladores de respuesta tipo B (ARR-10, ARR-14), relacionados con el transporte de entrada y
salida de auxinas (IAA26; PIN1, PIN4, PIN6, PIN7) y genes relacionados con meristemos apicales de
vástagos (WUS STM CLV3, CUC1, CUC2, RGD3) (Duclercq et al., 2011). Las bandas
sobreexpresadas encontradas en esta investigación, probablemente correspondan a algunos de
estos genes que se sobreexpresan en la regeneración de brotes adventicios.
Se obtuvo una sola banda diferencial exclusiva en el testigo (hipocótilos- HPA7-4), en comparación con las estructuras inducidas de callo, vástago y raíz, se infiere que la expresión de este gen se silenció para estas estructuras y que solo se estaba expresando en el testigo, no se han reportado genes en hipocótilos por tal razón no se indica que gen probablemente corresponda a la banda diferencial.
La secuenciación de las bandas diferenciales encontradas en este estudio permitirá la identificación de los genes posiblemente responsables de los procesos de callogénesis, caulogénesis y rizógenesis inducidos in vitro.
Estimaciones del porcentaje de cobertura del genoma de la naranjilla con las 6 combinaciones de primers evaluados en este estudio dan un valor del 15%. Esto se obtiene de las siguientes deducciones: los primers aleatorios (HAPx) en su región variable consta de 7 nucleótidos, por lo que se puede obtener un promedio de 16000 primers aleatorios (47=16308). Se asume que el tamaño promedio de un ARNm es de 600pb, y que en un momento particular una célula contiene 10 000 ARNm transcritos, la probabilidad de que uno de los primers aleatorios se hibride con un ARNm es de 4% (600/16000). En base a esto se establece la fórmula de cobertura del genoma
como P= 1-(0.96)n, donde n es el número de primers randómicos que se utilizan, en este estudio se utilizó cuatro primers (Liang, Zhu, Zhang, Guo, & O’Connell, 1994). Interesante será la utilización de un número mayor de combinaciones de primers para alcanzar la cobertura cercana al 100% del transcriptoma de los procesos de callogénesis, caulogénesis y rizogénesis, que eventualmente permitirá elaborar un esquema de las rutas genéticas determinantes de estos interesantes procesos.
29
6. CONCLUSIONES
Se indujo callogénesis, caulogénesis y rizogénesis a partir de hipocótilos de naranjilla mediante la inclusión de combinaciones hormonales en el medio de cultivo MS. En la formación de callo indujo con éxito el medio (MS+ 1 mg/L ANA 2 mg/L BAP), la formación de vástagos indujo con éxito el medio (MS+ 7,5 mg/L BAP) y la formación de raíces adventicias indujo con éxito el medio (MS+ 0,5 mg/L AIA).
Se evidenció la expresión diferencial de genes candidatos en la inducción de callogénesis caulogénesis y rizogénesis en naranjilla, lo cual se reflejó en la distinta intensidad de las bandas presentes en geles de poliacrilamida, luego de la amplificación de ADNc de callos, vástagos y raíces inducidos in vitro.
Se obtuvo un total de 23 bandas diferenciales, de las cuales ocho pertenecen a vástagos, seis a
callo, cinco a raíz y cuatro a hipocótilos.
Se analizó aproximadamente el 15% del genoma de la naranjilla con las combinaciones de
cebadores utilizadas en este estudio.
30
7. RECOMENDACIONES
Utilizar otros tejidos somáticos de Naranjilla, para conocer su respuesta en la formación de callo, vástagos y raíces con el uso de diferentes concentraciones de fitohormonas.
Secuenciar las bandas diferenciales obtenidas en la inducción de callo, vástagos y raíces.
Identificar los genes de las bandas obtenidas utilizando la base de datos del GenBank utilizando la
herramienta de búsqueda BLAST del NCBI.
Cuantificar la expresión de los genes de las bandas sobreexpresadas y subexpresadas mediante PCR en tiempo real.
Aumentar la cobertura del genoma, incrementando el número de combinaciones de cebadores utilizados en el despliegue diferencial.
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8. RESUMEN
La naranjilla (Solanum quitoense Lam) es un frutal nativo de los bosques subtropicales de la cordillera de los Andes (Valverde et al., 2010). En el Ecuador se la cultiva principalmente en la Amazonía y cubre una superficie de 3643 ha con rendimientos de 5,4 t ha-1, involucra a más de 5992 unidades de producción que tienen un manejo tradicional basado en el uso excesivo de pesticidas y la deforestación de bosque primario para mantener la producción comercial del cultivo (INIAP, 2011; MAGAP-SISAGRO, 2011). Los principales problemas de la naranjilla son de tipo fitosanitarios como: Marchitez vascular Fusarium oxysporum, nemátodos del nudo de la raíz Meloidogyne incognita y el Gusano del fruto Neoleucinodes elegantalis Gueéne (Vásquez C., y otros, 2011). Esto ocasiona la aplicación de pesticidas tales como Carbofurán, Metamidofos y 2-4-D (productos prohibidos internacionalmente), poniendo en riesgo la salud, el ambiente e incrementando los costos de producción (Revelo & Sandoval, 2003; Andrade, 2005). A nivel mundial el mejoramiento genético de la naranjilla es escaso, principalmente por su reducida variabilidad genética. Una alternativa prometedora puede ser la hibridación de naranjilla con miembros inter-específicos de la sección Lasiocarpa de Solanum, en los cuales pueden existir genes de resistencia para diferentes patógenos (Heiser, 1993). La propagación de plantas in-vitro abren una nueva ventaja para el campo del fitomejoramiento, además permite el estudio fundamental de la biología de la planta (Castillo, 2004). Por tanto, la determinación de los genes involucrados en los procesos de organogénesis in vitro podría facilitar el establecimiento de protocolos de micropropagación eficientes.
En este estudio se determinó la expresión diferencial de genes que se activan o se reprimen
durante las fases de cultivo in vitro que conducen a la formación de callos, vástagos y raíces en
medio de cultivo suplementados con fitohormonas mediante la técnica de despliegue diferencial.
El medio (MS+ 1 mg/L ANA 2 mg/L BAP) indujo con éxito la formación de callo; el medio (MS+ 7,5
mg/L BAP) indujo con éxito la formación de vástagos adventicios y el medio (MS+ 0,5 mg/L AIA)
indujo con éxito la formación de raíces adventicias. En todos los casos, se cultivaron 40 hipocótilos
por caja, 8 cajas por tratamiento, para un total de 320 hipocótilos por medio de cultivo. Las cajas
fueron incubadas a 30º C por 15 días, en oscuridad, para la inducción de callos, 20 días, con
fotoperíodo de 16 horas luz, para la inducción de vástagos y 9 días, en oscuridad, para la
inducción de raíces. Para el despliegue diferencial se extrajo primeramente el ARN de las
muestras de callo, vástagos, raíces e hipocótilos (testigo), luego se procedio a retrotranscribir el
ARNm a ADNc, posteriormente la electroforesis en el gel de poliacrilamida de los productos
amplificados de ADNc evidenciaron la expresión diferencial de acuerdo al patron de las bandas en
el gel.
Se obtuvieron un total de 23 bandas diferenciales, de las cuales ocho pertenecen a vástagos, seis
a callo, cinco a raíz y cuatro a hipocótilos, y de estas, algunas fueron exclusivas para hipocótilo,
callo, vástago o raíces, otras fueron subexpresadas o sobreexpresadas en los tejidos evaluados.
La secuenciación de las bandas diferenciales encontradas en este estudio permitirá la
identificación de los genes posiblemente responsables de los procesos de callogénesis,
caulogénesis y rizógenesis.
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SUMMARY
Naranjilla (Solanum quitoense Lam) is a native fruit of subtropical forests of the Andes (Valverde et al., 2010). In Ecuador it is grown mainly in the Amazon and covers an area of 3643 ha with yields of 5.4 t ha-1, involves more than 5992 production units with a traditional management based on the excessive use of pesticides and deforestation of primary forest to maintain commercial production of the crop (INIAP, 2011; MAGAP-SISAGRO, 2011).
The main problems of Naranjilla are of plant protection type as vascular wilt caused by Fusarium
oxysporum, root knot nematoes caused by Meloidogyne incognita and the screwworm from the
fruit Neoleucinodes elegantalis (Vasquez C., et al, 2011). This causes the application of pesticides
such as carbofuran, methamidophos and 2-4-D (internationally banned products), putting at risk
the health, environment and increasing production costs (Revelo & Sandoval, 2003; Andrade,
2005).
Worldwide, the genetic improvement of naranjilla is scarce, mainly because of its reduced genetic
variability. A promising alternative may be hybridization with interspecific naranjilla members
lasiocarpa Solanum section, which may be different resistance genes to pathogens (Heiser, 1993).
Plant propagation in vitro open a new advantage for plant breeding, also allows the fundamental
study of plant biology (Castillo, 2004). Therefore, the determination of genes involved in
processes in vitro organogenesis could facilitate efficient protocols micropropagation.
In this study the differential expression of genes that are activated or suppressed during in vitro culture phases that lead to the formation of callus, shoots and roots in culture medium supplemented with phytohormones was determined by the technique of differential display. The medium (MS + 1 mg / L NAA 2 mg / L BAP) successfully induced callus formation; medium (MS + 7.5 mg / L BAP) successfully induced the formation of adventitious shoots and the medium (MS + 0.5mg / L IAA) successfully induced the formation of adventitious roots. In all cases, 40 hypocotyls by box, 8 boxes per treatment were cultured for a total of 320 hypocotyls culture medium. The boxes were incubated at 30 ° C for 15 days in darkness, callus induction, 20 days, 16 light hour photoperiod, for induction of stems and 9 days in darkness, for the induction of roots.
For differential display was first extracted RNA samples callus, stems, roots and hypocotyls (control), then proceeded to reverse transcribe mRNA into cDNA, subsequently electrophoresis in polyacrylamide gel of the amplified products of cDNAs revealed the according to differential expression pattern of the bands in the gel. A total of 23 differential bands were obtained, of which eight belong to shoots, six of callus, five of roots and four to hypocotyls, and of these, some were unique to hypocotyl, callus, shoots or roots, others were down expressed or overexpressed in the tissues tested. Sequencing of differential bands found in this study will allow identifying genes responsible possibly of the callus, shoots and roots formation process.
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39
10. ANEXOS Anexo 1. Lista de familias de genes involucrados en procesos organogénicos de nuevos vástagos y/o raíces laterales.
Familia Nombre Función durante la organogénesis de nuevos brotes
Patrones de Expresión de genes durante el desarrollo de nuevos brotes
Medio inductor de callo
Medio inductor de vástago
Receptor de citoquinina
AHK2 Mutantes ahk son resistentes a la organogénesis de brotes nuevos
Baja expresión
Baja expresión
AHK3 No cambia Baja expresión
AHK4/CRE1/WOL1 Baja expresión
Alta expresión
Tipo A-ARR (reguladores negativos de vía de citoquininas)
ARR-3, ARR-5, ARR-6, ARR-7, ARR-17
No cambia Baja expresión
ARR-15 Baja expresión
Alta expresión
Tipo B-ARR (factores de transcripción de la vía de citoquininas)
ARR-1 No cambia Baja expresión
ARR-2 Baja expresión
Baja expresión
ARR-10 No cambia Alta expresión
ARR-11 Baja expresión
Baja expresión
ARR-12 Baja expresión
No cambia
ARR-14 Alta expresión
Alta expresión
Genes relacionados con las auxinas
IAA/AXR5 IAA12/BLD IAA26
Los genes AUX / IAA se ven afectadas durante organogénesis de vástagos.
Alta expresión
Alta expresión
IAA2/IAA3/SHY2 Alta expresión
No cambia
IAA5/IAA14/SLR Alta expresión
Baja expresión
40
IAA19/MSG2 IAA20
IAA28 Baja expresión
No cambia
Transporte de auxina
PIN1, PIN4, PIN6, PIN7
Los transportadores de auxinas osn importantes para la distribución de auxina y el patro de los nuevos meristemos.
Alta expresión
Alta expresión
PIN2, PIN5 Baja expresión
Baja expresión
PIN3/AUX1 Alta expresión
No cambia
Genes relacionados con meristemos apicales de vástagos
WUS STM Genes relacionados con el meristemo apical de vástago están involucrados en la iniciación y desarrollo de nuevos brotes.
No cambia Alta expresión
CLV3, CUC1, CUC2, RGD3
Alta expresión
Alta expresión
CUC3 Baja expresión
No cambia
RID3 Alta expresión
No cambia
AP2/ERF ESR1 ESR2 está involucrado en la formación de brotes a través de la regulación transcripcional de CUC1 ESR1 confiere a la formación de brotes citoquinina independiente, podría interactuar con proteínas HD-ZIP III.
Se desconoce
Se desconoce
Class III HD-ZIP ATHB 5/hoc ATBB/PBV PHV (phavoluta) REV (revoluta)
El mutante Arabidopsis hoc sobreproduce citoquinina y muestra la capacidad única para regenerar toda una planta a partir de un explante de raíz que ha crecido en un medio sin añadir hormonas.
Alta expresión
Alta expresión
41
(Duclercq, Sangwan-Norree, & Sangwan, 2011)
Anexo 2. Días de transcurridos desde la siembra al corte de las estructuras hipocótilos, callo, vástagos y raíces.
Muestras Código Concentración Fecha siembra
Fecha corte Días
Vástagos V 7,5 mg/L BAP 26/05/2016 15/06/2016 20
Raíces L 0,5 mg/L IAA 09/03/2016 09/03/2016 9
Callo Ca 1 mg/L ANA, 2 mg/L BAP
12/04/2016
27/04/2016
15
Hipocotilos Embrion (Testigo)
HP Ninguna 23/06/2016 0
Anexo 3. Protocolo de extracción de ARN y purificación (PURELINK® RNA MINI KIT).
1. Pesar 0.1 g de muestra.
2. Colocar la muestra en el mortero y agregar 600 uL del lysis buffer.
3. Macerar hasta obtener una solución homogénea.
4. Tomar 600 uL de la solución homogénea con una micropipeta y colocarla en recovery tube.
5. Homogenizar manualmente y centrifugar a 12000 rpm 2 minutos
6. Tomar el sobrenadante y estimar la cantidad extraída con la micropipeta, colocar en recovery tube nuevo.
7. Agregar la misma cantidad extraída con etanol al 70% al recovery tube correspondiente conteniendo la muestra.
8. Homogenizar la muestra manualmente que contiene el etanol y la muestra.
9. Tomar 700 uL de esa solución y colocarla en spin catridge del kit.
10. Centrifugar a 12000 rpm a 15 segundos, descartar la solución que queda en el fondo del tubo, y volver a utilizar el mismo collection tube.
11. Procesar el resto de la muestra (solución etanol mas concentrado correspondiente y centrifugar a 12000 rpm a 15 segundos, descartar la solución que queda en el fondo del tubo, y volver a utilizar el mismo collection tube.
12. Añadir a cada spin catridge 700 uL de WAsh Buffer I.
13. Centrifugar a 12000 rpm a 15 segundos, descartar la solución que queda en el fondo del tubo, y poner el spin catridge en un nuevo collection tube.
14. Añadir al spin catridge 500 uL del Wash Buffer II y centrifugar a 12000 rpm a 15 segundos, descartar la solución que queda en el fondo del tubo, y volver a utilizar el mismo collection tube.
15. Repetir el paso 14
42
16. Centrifugar a 12000 rpm 2 minutos, descartar el collection tube y colocar el spin catridge en recovery tube.
17. Añadir 50 uL de RNase free water en el centro del spin catridge
18. Dejar reposar el tubo durante un minuto.
19. Centrifugar el spin catridge a 12000 rpm durante 2 minutos, en el recovey tube se encuentra el ARN listo y purificado.
Anexo 4. Electroforesis en gel de agarosa al 2% del ARN total extraído de hipocótilos, callo, vástagos y raíces de naranjilla inducidos in vitro. Ladder 100 pb; Ca: callo; V: vástagos y L: raíces.
Anexo 5. Concentración y pureza del ARN extraído de explantes somáticos de naranjilla
Explante Concentración (ng/uL) Pureza
Hipocótilos (testigo) 161,9 2,19
Callo 438,7 2,14
Vástagos 147,2 1,91
Raíces 305,8 2,01
43
Anexo 6. Mezclas de reacción y condiciones para la retrotranscripción con la enzima SUPERSCRIPT III TRANCRIPTASA REVERSA del ARN.
1. Reactivo Concentración de partida
Concentración final Volumen uL
Agua tratada con DEPC
7
dNTPs mix 10 mM 1 mM 1,0
Primer HT11M 2 uM 0,2 uM 1,0
ARN ng/uL 100 ng/uL 10 ng/uL 1,0
Volumen total 10
Esta mezcla se sometió a un proceso de desnaturalización que consistió en calentamiento por 5 minutos a 65°C e incubación en hielo por 1 minuto.
Simultáneamente se preparó una segunda mezcla de reacción que se incorporó a la primera, transcurridos los 6 minutos de incubación previamente mencionados:
2. Reactivo Concentración de partida
Concentración final Volumen final uL
First Strand Buffer 5X 3,6 X 4 uL
DTT 0,1 M 0,01 M 1 uL
Superscrpit III RT 200 U/uL 18,1 U/uL 0,5 uL
Volumen total 5.5 uL
El volumen final de la reacción (15,5 uL), estas se llevaron al termociclador a 50°C por 50 minutos para la síntesis de la primera hebra de ADNc y después a 85°C por 5 minutos para detener la reacción.
Anexo 7. Mezclas de reacción y condiciones para la retrotranscripción con la MMLV Reverse Transcriptase del Kit RNAImage de GenHunter.
Reactivos Concentración inicial Concentración final Volumen por reacción uL
Agua con DEPC 7,4
Buffer 5x 1x 4
DTTs 0,1 M 6,2 Um 2
DNTPs 250 uM 20 Um 1,6
Primer HT11G 2uM 0,1 Um 2
RNA 100 ng 5ng/ul 2
TOTAL 20 uL
En el Termociclador: primer programa: 65 °C x 5 min y 37 °C x 10 min Luego se coloca la enzima 1 ul por reacción Segundo programa: 37°C por 50 min y 95° C por 5 min
44
Anexo 8. Mezcla de reacción y condiciones de amplificación de ADNc mediante PCR.
Reactivo Concentración inicial Concentración final Volumen final 20 uL
dNTPs 10mM 0,5 mM 1
Cl2Mg 50mM 1,5 mM 0,6
PCR buffer minus Mg 10X 1X 2
HAP1 primer 2uM 0,2 uM 2
HT11G primer 2uM 0,2 uM 2
cDNA 20 ng/uL 2ng/uL 2,0
Taq polimerasa 5U/ul 0,1 U 0,4
Agua con DEPC 10
Volumen total 20 uL
Programa utilizado en el termociclador:
Paso Temperatura Tiempo Número de Ciclos
Denaturación inicial 94°C 4 minutos 1
Denaturación 94°C 30 segundos 35
Annealing 40°C 2 minutos 35
Extensión 72°C 30 segundos 35
Extensión final 72°C 5 minutos 1
Anexo 9. Concentraciones de las soluciones para teñir el gel de poliacrilamida
Solución de Fijación o Parada (1000 ml)
Alcohol absoluto (10%)
100 ml
Ácido acético Glacial (1%)
5 ml
Agua destilada 895 ml
Volumen final 1000 ml
Solución de Tinción (1000 ml)
Nitrato de plata
2 g
Formaldehído (Ci: 37% - Cf: 0,024%)
0,650 ml
Solución de Tinción (1000 ml)
HIdroxido de sodio
15 g
Formaldehído (Ci: 37% - Cf: 0,024%)
0,650 ml
45
Anexo 10. Cámara de Electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% con muestras de ADN de callo, vástagos y raíces.
Anexo 11. Análisis de Bandas diferenciales en la inducción de callo, vástagos y raíces a partir de hipocótilos.
Código de banda
Hipocótilos Callo Vástago Raíz
VG6-16 No expresado No expresado Expresado No expresado
VG6-17 Subexpresado Subexpresado Sobreexpresado No expresado
VG6-19 No expresado No expresado Expresado No expresado
LG6-4 No expresado No expresado No expresado Expresado
CaG6-2 Subexpresado Sobreeexpresado Subexpresado Subexpresado
VG7-4 Subexpresado No expresado Sobreexpresado Subexpresado
VG7-7 No expresado No expresado Expresado No expresado
VG8-1 No expresado No expresado Expresado No expresado
CaG8-2 No expresado Expresado No expresado No expresado
46
LG8-4 No expresado No expresado No expresado Expresado
CaA2-4 No expresado Expresado No expresado No expresado
CaA2-5 No expresado Expresado No expresado No expresado
HPA7-4 Expresado No expresado No expresado No expresado
LA7-5 No expresado No expresado No expresado Expresado
CaA8-2 No expresado Expresado No expresado No expresado
VA8-4 No expresado No expresado Expresado No expresado
CaA8-5 No expresado Expresado No expresado No expresado