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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
Tema
Desarrollo de una técnica de cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC) para cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en
Catharanthus roseus, aplicando el enfoque del Analytical Quality by Design (AQbD)
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de
Químico Farmacéutico
Autor: Alejandro Osorio Quiroz
Tutora: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia
DM Quito, 2017
i
DEDICATORIA
A mis padres, Paulina y Marcos, por su apoyo incondicional, su ejemplo de
responsabilidad, trabajo, paciencia y amor inagotable. Sus consejos y por sentar las bases,
para mi formación como un hombre de bien. A mi hermano Diego, que a pesar de nuestras
diferencias y muchos desacuerdos siempre prevalecerá un cariño y apoyo especial que solo
los hermanos sabremos dar.
Este sencillo pero esmerado trabajo de investigación es por y para ustedes. “Per aspera
ad Astra”
ii
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, por participar activamente durante toda mi formación profesional, tanto
física como psicológicamente. La infinita paciencia que tuvieron en los buenos y malos
momentos. Solo puedo decir que no me alcanzará la vida para terminar de agradecerles.
A mi abuelito, Napoleón, mi tío Juan, y mis primos Gabriel, Jonathan y Evelyn quienes
con sus sabias y acertadas palabras me extendieron su mano para afrontar los momentos
difciles de la formación universitaria. Sin olvidar que estuvieron siempre pendientes de mi
bienestar.
A mi tutora, Dra. Martha Suárez, me faltan palabras para agradecer su guía desde el
primer día que fui su alumno hasta alcanzar la culminación de mi carrera. Quiero reconocer
su comprensión, paciencia y serenidad que transmite ante los obstáculos que se presentan.
Pero sobre todo la confianza depositada, en cada responsabilidad que como alumno,
ayudante de cátedra, pasante y tesista supo delegarme.
A mis maestros, Dr. Javier Santamaría, Dra. Dayana Borja, Dra. Liliana Naranjo, y Dr.
Ramiro Acosta quienes fueron luz inspiradora que iluminó el camino para la busqueda de
la excelencia académica.
A mis amigos David, Carlitos, Alejo, Mateo, con quienes compartimos buenas
anécdotas en nuestros años de trabajo como estudiantes y como tesistas en los laboratorios
de Química Orgánica y Productos Naturales. Mis amigos Adrián, Danny, David C, Verito
S, Gercita, Stefy, Yady, Mony quienes con su alegría, y toque personal hicieron más
llevaderos los últimos tramos de nuestra formación profesional. Mis eternas compañeras de
laboratorio Lis y Verito O, que me enseñaron el significado del trabajo en equipo no solo
en la universidad sino en la vida cotidiana. Tambien a Pablo, Nico y Jonathan quienes
acompañaron en los momentos de desventuras personales y siempre me dieron palabras de
aliento para no dejarme derrotar.
iii
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACUTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Alejandro Osorio Quiroz en calidad de autor del trabajo de investigación:
Desarrollo de una técnica de cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC) para cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en
Catharanthus roseus, aplicando el enfoque del Analytical Quality by Design (AQbD),
autorizo a la Universidad Central del Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me
pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de
investigación.
Los derechos que como autor me corresponden son excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizó a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Quito, al día 18 del mes de mayo de 2017.
…………………………………..
Alejandro Osorio Quiroz
CI: 1724391378
iv
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FACUTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Martha Suárez Heredia en calidad de tutora del trabajo de investigación titulado
Desarrollo de una técnica de cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC) para cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en
Catharanthus roseus, aplicando el enfoque del Analytical Quality by Design (AQbD),
elaborado por el estudiante Marcos Alejandro Osorio Quiroz de la Carrera de Química
Farmacéutica, Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador,
considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que sea
sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.
Quito, al día 23 del mes de mayo de 2017.
Dra. Martha Suárez Heredia
CI: 1707242838
v
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QUÍMICA FARMACÉUTICA
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL
TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dra. Martha Suárez, Dr. Javier Santamaría y Dra.
Dayana Borja, luego de revisar el trabajo de investigación titulado: Desarrollo de una
técnica de cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) para
cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en Catharanthus
roseus, aplicando el enfoque del Analytical Quality by Design (AQbD), previo a la
obtención del título de Químico Farmacéutico presentado por el señor Marcos Alejandro
Osorio Quiroz, APRUEBA el trabajo presentado.
Para la constancia de lo actuado firman:
Dr. Rodrigo Javier Santamaría Aguirre Dra. Dayana Paulina Borja Espín
CI: 1802467132 CI: 1710983849
Dra. Martha Suárez Heredia
CI: 1707242838
vi
LUGAR DONDE SE REALIZO LA INVESTIGACIÓN
El presente trabajo se realizo en las instalaciones del LABORATORIO DE
PRODCUTOS NATURALES de la Facultad de Ciencias Químicas de la UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR como parte del proyecto “Estudio de colorantes naturales y
desarrollo de formas estables con aplicación en al industria alimenticia y cosmética”
vii
Índice de contenidos
Resumen ............................................................................................................................ xvii
Abstract............................................................................................................................... xix
Introducción ........................................................................................................................... 1
Capítulo I ............................................................................................................................... 2
Planteamiento del problema............................................................................................... 2
Objetivos ............................................................................................................................ 3
Objetivo general. ............................................................................................................ 3
Objetivos específicos. .................................................................................................... 3
Importancia y justificación ................................................................................................ 4
Capítulo II .............................................................................................................................. 6
Antecedentes ...................................................................................................................... 6
Fundamentación teórica ..................................................................................................... 8
Métodos analíticos. ........................................................................................................ 8
Desarrollo de métodos analíticos. ................................................................................ 12
Estandarización de métodos analíticos......................................................................... 19
Validación de métodos analíticos................................................................................. 20
Fundamento metodologico .............................................................................................. 24
Estandarización de la muestra vegetal. ........................................................................ 24
Cuantificación de alcaloides. ....................................................................................... 25
Cuantificación mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento, HPTLC. ... 26
Hipótesis .......................................................................................................................... 30
Capitulo III .......................................................................................................................... 32
Diseño de la investigación ............................................................................................... 32
viii
Población y muestra ......................................................................................................... 32
Materiales y métodos ....................................................................................................... 32
Estandarización de muestra. ......................................................................................... 32
Extracción de alcaloides. .............................................................................................. 33
Separación y cuantificación de alcaloides – vincristina y vinblastina – mediante
cromatografía en capa fina de alto rendimiento. .......................................................... 34
Diseño Experimental........................................................................................................ 36
Matriz de operacionalización de variables....................................................................... 38
Técnicas de análisis e interpretación de resultados ......................................................... 38
Capitulo IV .......................................................................................................................... 40
Análisis y discusión de resultados ................................................................................... 40
Estandarización de muestra. ......................................................................................... 40
Pruebas preliminares. ................................................................................................... 42
Aplicación del enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD). ............................ 44
Cuantificación de alcaloides vincristina y vinblastina en las muestras estandarizadas
de Catharanthus roseus................................................................................................ 65
Capítulo V ........................................................................................................................... 68
Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................... 68
Conclusiones. ............................................................................................................... 68
Recomendaciones ......................................................................................................... 71
Bibliografía .......................................................................................................................... 72
ix
Índice de anexos
Anexo A............................................................................................................................... 77
Esquema causa efecto ...................................................................................................... 77
Anexo B ............................................................................................................................... 78
Diagrama de flujo ............................................................................................................ 78
Anexo C ............................................................................................................................... 80
Marco legal ...................................................................................................................... 80
Anexo D............................................................................................................................... 83
Aplicación del algoritmo de Yates para el cálculo de los efectos ................................... 83
Anexo E ............................................................................................................................... 85
Placas desarrolladas, espectros generados y datos de Rf de los diferentes tratamientos de
los alcaloides vincristina y vinblastina. ........................................................................... 85
Anexo F ............................................................................................................................. 115
Espectros de los volúmenes de la curva de calibración de los estándares de vincristina y
vinblastina, correspondientes al tratamiento ensayado que permitió la optimización de la
respuesta experimental (Resolución) ............................................................................. 115
Anexo G............................................................................................................................. 118
Curvas de calibración obtenidas mediante la aplicación del software VideoScan, para
cuantificación de lo alcaloides de Catharanthus roseus ................................................ 118
x
Índice de figuras
Figura 2-1. Pirámide de información en procesos de validación ....................................... 21
Figura 2-2. Formación de sal de amina y regeneración de amina ...................................... 26
Figura 2-3. Resolución de picos cromatográficos en TLC ................................................. 29
Figura 4-1. Ensayo preliminar a 254nm, fase móvil: acetato de etilo, metanol,hidróxido de
amonio (3:7:1) ..................................................................................................................... 44
Figura 4-2. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina) .......... 51
Figura 4-3. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
............................................................................................................................................. 52
Figura 4-4. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
............................................................................................................................................. 52
Figura 4-5. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
............................................................................................................................................. 53
xi
Índice de tablas
Tabla 2-1. Descripción de los tipos de métodos analíticos cuantitativos ............................. 9
Tabla 2-2. Generalidades de la clasificación de los métodos cromatográficos .................. 11
Tabla 2-3. Pasos a seguir para aplicar AQbD ..................................................................... 13
Tabla 2-4. Criterios de desempeño del método analítico ................................................... 14
Tabla 2-5. Diseños experimentales frecuentes en el enfoque AQbD ................................. 16
Tabla 2-6. Parámetros de operación sugeridos para HTPLC ............................................. 18
Tabla 2-7. Parámetros en orden decreciente de importancia en TLC ................................ 18
Tabla 2-8. Parámetros de validación para procedimientos analíticos de uso frecuente ..... 20
Tabla 2-9. Descripición de los parámetros de validación para el proceso de cromatografía
de capa fina de alto rendimiento (HPTLC) ......................................................................... 23
Tabla 2-10. Ventajas del empleo de cromatografía en capa fina........................................ 26
Tabla 2-11. Ejemplos de sistema de elución para muestras vegetales (alcaloides) ............ 28
Tabla 2-12. Descripción de funciones de las etapas de ejecución de la HPTLC ............... 31
Tabla 3-1. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC ....... . 35
Tabla 3-2. Parámetros de cuantificación para VideoScan .................................................. 35
Tabla 3-3. Codificación de los niveles, de los factores de estudio principales .................. 37
Tabla 3-4. Matriz codificada de experimentos en orden estándar ...................................... 38
Tabla 3-5. Matriz de operacionalización de variables ........................................................ 38
Tabla 4-1. Determinación de humedad total en muestra fresca de Catharanthus roseus
............................................................................................................................................. 40
Tabla 4-2. Determinación de humedad total en muestra fresca de Catharanthus roseus
............................................................................................................................................. 40
Tabla 4-3. Determinación del contenido de fase lipídica en muestrasestandarizadas de
Catharanthus roseus ............................................................................................................ 41
Tabla 4-4. Determinación del rendimiento de extracto total obtenido por percolación ácida
............................................................................................................................................. 42
Tabla 4-5. Valores de operación de factores accesorios ..................................................... 43
xii
Tabla 4-6. Volúmenes y concentraciones en peso de los estándares de alcaloides de
estudio para elaboración de curva de calibración ................................................................ 44
Tabla 4-7. Descripción de las características de desempeño planteadas en el perfil analítico
objetivo (ATP) para la técnica HPTLC de cuantificación de VC y VB .............................. 45
Tabla 4-8. Categorías de los modos de falla, de acuerdo a RPN obtenido ......................... 46
Tabla 4-9. Análisis de riesgos de metodología HPTLC, mediante técnica FMEA ............ 47
Tabla 4-10. Matriz de experimentos aleatorizada .............................................................. 50
Tabla 4-11. Distribución de pistas de siembra en placa para análisis HPTLC ................... 50
Tabla 4-12. correspondientes a replica 1 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina) ...... 52
Tabla 4-13. correspondientes a replica 2 del tratamiento Ts1A-1 1 (vincristina) ...... 53
Tabla 4-14. correspondientes a replica 3 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina) ...... 53
Tabla 4-15. Valores de de los alcaloides de estudio, correspondientes a la matriz de
experimentos aleatorizada ................................................................................................... 54
Tabla 4-16. alores de resoluci n de alcaloides de estudio en orden est nda .......... 58
Tabla 4-17. Cálculo de efectos para Rs de vincristina mediante algoritmo de Yates......... 59
Tabla 4-18. Cálculo de efectos para de vinblastina mediante algoritmo de Yates ....... 59
Tabla 4-19. Resumen de efectos analizados para resolución de alcaloides de estudio ...... 60
Tabla 4-20. Determinación de desviación estándar de la respuesta (Vincristina) .............. 60
Tabla 4-21. Determinación de desviación estándar de la respuesta (Vinblastina) ............. 61
Tabla 4-22. Resumen de efectos ± SEfecto para resolución de alcaloides de estudio ........... 61
Tabla 4-23. Significancia estadística de los efectos , , y sus respectivas
interacciones sobre de vincristina .................................................................................. 62
Tabla 4-24. Significancia estadística de los efectos , , y sus respectivas
interacciones sobre de vinblastina ................................................................................. 62
Tabla 4-25. Valores de máximo de muestras analizadas y estándares de alcaloides VC
y VB..................................................................................................................................... 65
Tabla 4-26. Contenido en peso de los estándares correspondientes al tratamiento Ts-1A-
1 1 para la cuantificación de los alcaloides de estudio..................................................... 66
Tabla 4-27. Valores de VC y VB obtenidos de la cuantificación mediante VideoScan .... 66
xiii
Tabla 4-28. Características de desempeño (linealidad), obtenida conforme del ATP,
propuesto ............................................................................................................................. 67
Tabla 4-29. Contenido de alcaloide vincristina y vinblastina por cada 100g de muestra
seca ...................................................................................................................................... 67
Tabla 5-1. Caracteristicas de la muestra estandarizada de Catharanthus roseus ............... 68
Tabla 5-2. Rendimiento de extracto seco de Catharanthus roseus, para los diferentes
tratamientos ensayados ........................................................................................................ 69
Tabla 5-3. Efectos estadísticamente significativos y modelo matemático de
comportamiento para de alcaloide VC .......................................................................... 69
Tabla 5-4. Efectos estadísticamente significativos y modelo matemático de
comportamiento para de alcaloide VB .......................................................................... 70
Tabla 5-5. Cuantificación de alcaloides de estudio en muestra seca (MS) de Catharanthus
roseus ................................................................................................................................... 70
xiv
Índice de ecuaciones
Ecuación 2-1. Razón de frentes. ......................................................................................... 27
Ecuación 2-2. Cálculo para número de platos teóricos o altura de plato............................ 28
Ecuación 2-3. Deteminación de la resolución en cromatografía de capa fina .................... 29
Ecuación 3-1. Factores que influyen en la respuesta experimental .................................... 36
Ecuación 3-2. Cálculo de .......................................................................................... 39
Ecuación 3-3. Criterio para determinar significancia estadística de efectos ...................... 39
Ecuación 4-1. Cálculo del RPN .......................................................................................... 46
Ecuación 4-2. Modelo matemático que describe el comportamiento de en función de los
efectos estadísticamente significativos (Vincristina) .......................................................... 64
Ecuación 4-3. Modelo matemático que describe el comportamiento de en función de los
efectos estadísticamente significativos (Vinblastina) .......................................................... 64
xv
Lista de abreviaturas
A: Tiempo de preacondicionamiento de placa
A máx: Área máxima
AQA: Sistema analítico de calidad
AQbD: Analytical Quality by Design
ARCSA: Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria
As: Factor de asimetría
ATP: Analytical Target Profile
B: Longitud de banda
C: Forma de cámara cromatográfica
D: Distancia de desarrollo
DOE: Diseño Experimental
: Grado de modificación de fase estacionaria
FMEA: Análisis de fallos y efectos
: Polaridad de la mezcla eluyente
H: Altura de plato
H máx: Altura máxima
HPTLC: Cromatografía en capa fina de alto rendimiento
%HR: Porcentaje de humedad relativa
I.C.: Intervalo de confianza
ICH: Conferencia Internacional sobre Armonización
K: Coeficiente de distribución
xvi
MODR: Región de diseño operable del método
N: Número de platos teóricos
OOT: Fuera de tendencia
QbD: Quality by Design
: Razón de frente
RPN: Número de prioridad de riesgo
: Resolución
Sefecto: Desviación estándar del efecto
Sresp: Desviación estándar de respuesta experimental
TLC: Cromatografía en capa fina
Ts: Tiempo de saturación de cámara
V: Volumen de aplicación
VB: Vinblastina
VC: Vincristina
xvii
DESARROLLO DE UNA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE
ALTO RENDIMIENTO (HPTLC) PARA CUANTIFICACIÓN DE LOS
ALCALOIDES VINCRISTINA Y VINBLASTINA PRESENTES EN
CATHARANTHUS ROSEUS, APLICANDO EL ENFOQUE DEL ANALYTICAL
QUALITY BY DESIGN (AQBD).
Autor: Alejandro Osorio Quiroz
Tutor: Dra. Martha Azucena Suárez Heredia
Resumen
Se desarrolló una metodología de cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC), que permitió la cuantificación de los alcaloides representativos vincristina y
vinblastina, en muestras silvestres de Catharanthus roseus, aplicando el enfoque de calidad
Analytical Quality by Design (AQbD).
Las muestras vegetales se preacondicionaron mediante: desinfección, secado, molienda,
homogenización del tamaño de partícula, determinación de humedad total y relativa. La
extracción de alcaloides se realizó por percolación ácida a un flujo constante hasta agotar
la muestra.
Se aplicó el enfoque de calidad AQbD con la utilización del perfil analítico objetivo,
ATP, por sus siglas en inglés. Se elaboró una matriz de riesgos y fallas mediante la
herramienta FMEA (Análisis de fallos y efectos) y se establecieron los puntos críticos para
el desarrollo de la metodología analítica. Partiendo de los resultados del FMEA se planteó
un diseño factorial 23, que permitió calcular el valor de la resolución (Rs) de los alcaloides
representativos, para las diferentes combinaciones entre los factores de estudio: tiempo de
saturación de cámara (Ts), tiempo de preacondicionamiento de placa (A) y grado de
modificación de fase estacionaria ( E).
Con los datos de resolución ( ), obtenidos en el proceso experimental se calculó la
magnitud y sentido de los efectos de los factores de estudio mediante el algoritmo de
Yates, así como su significancia estadística al 95% de confianza. Los valores obtenidos del
xviii
factor de resolución para el alcaloide vincristina: A = -0,36±0,05; = 0,52±0,05; Ts.A = -
0,11±0,05 unidades de resolución; mientras que para el alcaloide vinblastina: A = -
0,33±0,07; = 0,50±0,07; Ts.A = -0,09±0,07; A. = 0,13±0,07 unidades de resolución.
Los resultados indicados, permitieron establecer estrategias de control y propuestas para
una mejora continua del método.
La aplicación del método desarrollado se basó en la cuantificación de vincristina y
vinblastina, utilizando las condiciones establecidas; para lo cual se definieron los
parámetros iniciales de separación: volumen de siembra, ancho de banda y fase móvil. La
metodología desarrollada permitió cuantificar los alcaloides en las muestras silvestres de
Catharanthus roseus, obteniéndose como resultado: 0,00420 ± 0,00136% y 0,00267 ±
0,00065% de vincristina y vinblastina respectivamente.
Palabras clave: CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ALTO RENDIMIENTO,
DISEÑO DE MÉTODOS ANALÍTICOS, VINCRISTINA, VINBLASTINA,
CATHARANTUS ROSEUS.
xix
DEVELOPMENT OF A HIGH PERFORMANCE THIN LAYER
CHROMATOGRAPHY TECHNIQUE (HPTLC) FOR THE QUANTIFICATION
OF THE ALKALOIDS VINCRISTINE AND VINBLASTINE PRESENT IN
CATHARANTHUS ROSEUS, APPLYING THE APPROACH ANALYTICAL
QUALITY BY DESIGN (AQbD)
Abstract
A high performance thin layer chromatography (HPTLC) methodology was developed,
which allowed the quantification of the representative alkaloids vincristine and vinblastine
in wild samples of Catharanthus roseus, by applying the quality approach Analytical
Quality by Design (AQbD). Plant samples were preconditioned by: disinfection, drying,
grinding, particle size homogenization, total and relative humidity determination. The
extraction of alkaloids was performed by acid percolation at a constant flow until the
sample was exhausted.
The AQbD quality approach was applied by the use of the objective analytical profile,
ATP, for its acronym in English. A matrix of risks and failures was developed using the
FMEA (Failure and effects analysis) tool son the critical points were established for the
development of the analytical methodology. Then, based on the results of the FMEA, a
factorial design 23 was used to calculate the value of the resolution (Rs) of the
representative alkaloids for the different combinations of study factors: chamber saturation
time (Ts), plate preconditioning time (A) and degree of stationary phase change ( E).
Using the resolution data (Rs) obtained in the experimental process, it was calculated
the magnitude and direction of the effects of the study factors on the base of Yates
algorithm, as well as its statistical significance at 95% confidence level. Vincristine
alkaloid got following resolution values: A = -0,36±0,05; E = 0,52±0,05; Ts.A = -
0,11±0,05. On the other hand vinblastine alkaloid got A = -0,33±0,07; E = 0,50±0,07;
Ts.A = -0,09±0,07; A. E = 0,13±0,07 resolution units. The application of the developed
method was based on the vincristine and vinblastine quantification, so using the established
conditions; for which the initial separation parameters were defined as seed bulk,
bandwidth and mobile phase. Developed methodology allowed quantifying alkaloids in
sylvan samples of Catharanthus roseus. Quantifications results were 0,00420 ± 0,00136%
by vincristine and 0,00267 ± 0,00065% by vinblastine.
Key words: HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CROMATOGRAPHY,
ANALYTICAL QUALITY DESIGN, VINCRISTINE, VINBLASTINE,
CATHARANTUS ROSEUS
1
Introducción
El enfoque Analytical Quality by Design, por sus siglas en ingles AQbD, permite el
desarrollo de un método analítico eficaz, robusto y económico. Permite la libertad de
cambiar los parámetros del método, dentro del espacio de diseño, instaurando la región de
diseño operable del método (MODR). Hasta la fecha no hay una experiencia
insatisfactoria, de la aplicación del AQbD para el desarrollo de un método analítico.
La cromatografía en capa fina es una técnica de amplio uso, para la extracción, el
análisis y purificación de alcaloides y otros metabolitos secundarios, debido a que presenta
ventajas como: utilización en metodologías cualitativas, semicuantitativas y cuantitativas,
rapidez de análisis y generación de cromatogramas para uso como referencia o huella
digital. La presente investigación aplicará el enfoque de Analytical Quality by Design
(AQbD), en el desarrollo de la metodología de cuantificación de los alcaloides vincristina y
vinblastina presentes en Catharanthus roseus, mediante la utilización de cromatografía en
capa fina de alto rendimiento (HPTLC).
El Capitulo I, describe el planteamiento del problema, los objetivos de la investigación,
y se resalta la importancia y justificación del tema. El Capitulo II, se señalan estudios
previos del tema, que se analizaron y que servieron como base para la ejecución del
mismo. Además, incluye el fundamento teórico y metodológico que sustentan la
investigación. En el Capítulo III, se establece la metodología, el diseño experimental,
variables y consideraciones estadísticas para el análisis de datos obtenidos a partir de los
ensayos de experimentales.
Para finalizar, los Capítulos IV y V, establece en detalle la discusion sobre los
resultados alcanzados en el trabajo de investigación; las conclusiones, que indican el
cumpliento de los objetivos planteados y las recomendaciones propuestas para mejorar el
desarrollo experimental, de trabajos posteriores concordantes con esta línea de
investigación.
2
Capítulo I
Planteamiento del problema
El análisis cualitativo y cuantitativo de metabolitos secundarios de especies vegetales,
precisa el uso de metodologías versátiles, debido a que estos se encuentran en bajas
concentraciones o a la compleja variabilidad de su matriz. Una de las técnicas analíticas
que satisface estos requerimientos es la cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HPTLC). Esta técnica propicia una adecuada separación de los analitos de interés en
matrices complejas (Reich, Schibli, & DeBatt, 2008), además presenta ventajas entre las
que destacan: disminución de costos y tiempos de análisis, capacidad de analizar muestras
en bruto que contienen múltiples componentes, amplia elección de los disolventes,
aplicación de varias muestras simultáneamente (Rashmin, Mrunali, Nitin, Nidhi, & Bharat,
2012).
Sin embargo, debe recordarse que cualquiera de los procesos mencionados deberá estar
debidamente validado, cumpliendo parámetros que eviten que sus resultados generen
desconfianza. Los parámetros de validación que son de amplio uso para el desarrollo de
metodologías analíticas, han sido descritos por la Conferencia Internacional sobre
Armonización, ICH por su siglas en inglés, en su guía Q2-R1 - Validación de procesos
analíticos -. Pero esta constituye solo una base para su discusión general, cálculo e
interpretación (Rashmin et al., 2012).
Por ello en los últimos años han nacido enfoques de calidad analítica derivados del
Quality by Design (QbD) (Winkle, 2007), como el Analytical Quality by Design (AQbD),
cuya aplicación permite alcanzar un método analítico robusto. Además, mejora su
entendimiento, haciendo posible reducir y controlar de manera apropiada las fuentes de
variabilidad (Chatterjee, 2013). Sus principios pueden aplicarse al desarrollo de cualquier
metodología tanto cualitativa como cuantitativa, permitiendo que se conviertan en
herramientas de rutina, ya que se asegura un nivel superior al de una validación
convencional.
3
Por los antecedentes expuestos, se desarrollará una metodología analítica en
cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC), aplicable al análisis de
compuestos de especies vegetales, utilizando del enfoque de AQbD para alcanzar mejores
resultados, respecto al conocimiento global del procedimiento HPTLC.
Para el desarrollo de la metodología analítica, se utilizará como especie vegetal
Catharanthus roseus, la cual de acuerdo a la investigación realizada Matsuura, Rau, &
Fett-Neto (2014) presenta una concentración promedio de - , de los
alcaloides vincristina (VC) y vinblastina (VB). En vista de las bajas concentraciones
existentes para estos alcaloides, se precisan metodologías analíticas con una alta
sensibilidad y resolución, requerimiento satisfecho por la técnica propuesta, HPTLC.
Además, al conocer los metabolitos de la planta, se facilita el uso de estándares de
referencia accesibles, necesarios para el desarrollo metodológico; de esta manera se puede
extender su aplicación para el análisis de nuevos compuestos, en especies no estudiadas.
Objetivos
Objetivo general.
Desarrollar una metodología de cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina
presentes en Catharanthus roseus silvestre, mediante cromatografía en capa fina de alto
rendimiento (HPTLC), aplicando el enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD).
Objetivos específicos.
- Estandarizar la muestra seca de Catharanthus roseus, mediante homogenización del
tamaño de partícula y determinación de humedad relativa.
- Obtener por el método de percolación ácida, el extracto total que contenga los
alcaloides vincristina y vinblastina, a partir de la muestra estandarizada de C. roseus.
- Aplicar el enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD), para desarrollar una
metodología de cuantificación de los alcaloides vincristina y vinblastina, en muestra
estandarizada utilizando cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HTPLC).
4
- Cuantificar los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en muestras
estandarizadas de Catharanthus roseus, mediante el método de cromatografía en capa
fina de alto rendimiento (HTPLC).
Importancia y justificación
La normativa ecuatoriana para la obtención del registro sanitario y control de productos
naturales procesados de uso medicinal, y de los establecimientos en donde se fabrican,
almacenan, distribuyen y comercializan, en los Art. 10, 16, y 18, que se describen en el
Anexo C, establece que esta categoría de productos, deben proporcionar las
especificaciones y límites de contenido del recurso natural utilizado. Y se expresaran
mediante la composición cuantitativa en peso. Además, describe en el Art. 41.- “La
Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria-ARCSA, cuando
considere necesario podrá solicitar al titular del Registro Sanitario para efectos de control
posterior, los patrones de referencia y los certificados de análisis de los Productos
Naturales Procesados de Uso Medicinal objeto de esta Normativa Técnica Sanitaria.”
(Agencia Nacional de Regulación & Pública, 2015).
De acuerdo a lo establecido en la normativa, es imprescindible realizar el control de
calidad – cualitativo y cuantitativo - de la materia prima vegetal a ser utilizada para la
elaboración de un producto natural procesado de uso medicinal. El control de calidad debe
estar directamente asociado a la utilización de una metodología analítica farmacopeica o no
compendial, debidamente desarrollada y validada.
Los componentes vegetales son analitos que por provenir de matrices complejas,
requieren técnicas versátiles, como la HPTLC. Esta técnica analítica presenta
características tales como: desarrollo de etapas en forma independiente y capacidad de
analizar muestras en bruto que contienen múltiples componentes. Permite la aplicación
simultánea de varias muestras y estándares mediante la técnica de spray-on. Ofrece una
amplia elección de los disolventes y evaporación completa de las fases móviles antes de la
etapa de detección. Además procesa los estándares y las muestras de forma idéntica en una
misma placa (Rashmin et al., 2012). También se consideran como ventajas de la
metodología HPTLC, el uso de instrumental moderno, escáneres de vídeo, densitómetros, y
5
nuevas cámaras cromatográficas; la inclusión de técnicas de elución más eficaces, así como
adsorbentes de alta resolución. Adicionalmente, la capacidad de combinación con otras
técnicas instrumentales y programas informáticos para su optimización (Rashmin et al.,
2012). Sin embargo, para que esta sea utilizada de manera rutinaria y sus resultados
garanticen confianza y calidad, debe ser desarrollada y validada adecuadamente.
Los parámetros de validación de uso general para el desarrollo de métodos analíticos, se
describen en la guía Q2-R1 de la Conferencia Internacional de Armonización, ICH por sus
siglas en inglés. Sin embargo, esta constituye solo una base para una discusión general de
los parámetros, su cálculo e interpretación. Y deja como función del analista la
identificación de las características relevantes para la realización del procedimiento
analítico dado, así como el diseño de protocolos de validación apropiados, que incluyan los
criterios de aceptación, para llevar a cabo una evaluación adecuada (Rashmin et al., 2012).
Por ello la aplicación de enfoques de calidad como Analytical Quality by Design (AQbD),
desde el comienzo del desarrollo de la metodología analítica, permite abarcar estas
características relevantes, ya que se basa en principios de entendimiento, reducción y
control de las fuentes de variabilidad para generar un método robusto, flexible dentro de la
normativa (Chatterjee, 2013).
La presente investigación aplicó el enfoque de AQbD, para el desarrollo de una
metodología analítica de cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC), para el
análisis cuantitativo de los alcaloides representativos (vincristina y vinblastina) en la
especie vegetal Catharanthus roseus. Es importante mencionar que la cuantificación de
los alcaloides, requiere una metodología analítica con una alta sensibilidad y resolución;
debido a su baja concentración en la especie vegetal de estudio. Requisito que es satisfecho
por la metodología HPTLC propuesta.
6
Capítulo II
Antecedentes
El desarrollo de metodologías analíticas implica llevar a cabo un proceso de validación,
el cual incluye las siguientes características: selectividad, linealidad, rango, exactitud,
precisión, límite de detección, límite de cuantificación y robustez. Sin embargo, la sola
aplicación de estos parámetros, no asegura la calidad y confianza de los resultados del
método diseñado. Para evitar estas inconsistencias, han empezado a aplicarse enfoques de
calidad para su desarrollo. Estos enfoques son derivados de los principios de calidad por
diseño de productos (Quality by Design), que permiten desarrollar metodologías robustas,
de calidad y confiables tanto para matrices simples y complejas.
A continuación, se describen algunas investigaciones que incluyen procesos de
validación y/o enfoques de calidad analítica, aplicados al desarrollo de metodologías
analíticas TLC o HPTLC, para matrices de origen semisintético o natural
La investigación de Jadhav & Tambe (2013a), realizó la implementación del
enfoque QbD al desarrollo de una metodología HPTLC para la cuantificación de
propafenona hidrocloruro. Los autores aplicaron herramientas como el diagrama de
Ishikawa para determinar los parámetros críticos del método. Siendo los
principales: tiempo de saturación, ancho de banda, altura de corrimiento, volumen
de fase móvil y fase móvil. Para la validación del procedimiento analítico,
aplicaron las directrices ICH-Q2-R1, con la finalidad de convertirlo en un análisis
rutinario específico y robusto. A continuación, se presentan los resultados de las
características de validación realizadas: linealidad - , porcentaje de
recuperación , límite de detección , límite de cuantificación
, precisión en términos de %RSD intradía e interdía .
El trabajo realizado por Magagula, Mohanlall, & Odhav (2012), aplicó HTPLC y
señala que la vincristina pudo ser detectada desde un mínimo de 0,0055% a 10 μL
de volumen de inyección. Sin embargo, la vinblastina no fue tan sensible, es así que
sólo puede detectarse desde concentraciones altas como 0,05% para 10 μL de
volumen de inyección. Los autores también determinaron que la mayoría de los
7
estándares de alcaloides son detectables a una concentración de 0,05%, por lo que
se prepararon mediante la disolución de 5 mg en 10 ml de metanol.
En el artículo de Jian, Khatal, Jivani, & Surana (2011), se desarrolló y se validó un
método TLC, para determinar simultáneamente brimodinina tartrato y timolol
maleato, en materia prima y en una forma farmacéutica. Las características de
validación analizadas fueron linealidad y exactitud que presentaron los siguientes
datos para brimodinina y timolol respectivamente:
( - ⁄ - ⁄ ), la exactitud se evaluó en
función del porcentaje de recuperación
En la investigación de Dhaneshwar, Patre, & Mahadik (2008), se validó un método
de cromatografía en capa fina (TLC), para la determinación simultanea de dos
principios activos – besilato de amlodipino y valsartán –, en materia prima y una
forma farmacéutica. El método presentó exactitud y confianza, conforme a los
lineamientos que describen las directrices ICH-Q2-R1. Los resultados para los
criterios de validación fueron: linealidad
- ⁄ - ⁄ , precisión intradía en términos de
%RSD - - , precisión interdía - - y
exactitud , para amlodipino y valsartán,
respectivamente.
En la publicación de Khedr & Sheha (2003), se desarrolló un método de análisis
cuantitativo de HPTLC, para impurezas y productos de degradación, de
azitromicina en materia prima y en cápsulas. El procedimiento siguió los
lineamientos de validación descritos por la ICH-Q2-R1, selectividad, sensibilidad,
exactitud, precisión, linealidad, rango, robustez. Y obtuvo los siguientes resultados:
rango - ), límite de cuantificación , precisión
intradía e interdía en términos de %RSD, no mayor a , respectivamente
Los artículos de referencia expuestos, muestran que la mayoría de metodologías
analíticas de cromatografía en capa fina, basan su desarrollo conforme a la guía ICH-Q2-
R1. Esta permite el cumplimiento de parámetros de validación convencionales, sin
8
embargo, no garantizan la calidad y confiabilidad de los resultados del método analítico
empleado.
En el trabajo realizado por Jadhav & Tambe (2013a), los autores introducen el concepto
de calidad QbD, para el desarrollo de su método HPTLC. Alcanzando mejores resultados,
respecto al conocimiento global de su procedimiento, que los que ofrecen los principios de
validación convencional.
Como refieren los trabajos citados, la aplicación de un enfoque de calidad para
desarrollar una metodología cuantitativa HPTLC, resulta factible y apropiado; porque
genera una técnica analítica económica, versátil y que cumple con características de
calidad, confianza y robustez. Además, como indica la investigación de (Magagula et al.,
2012) esta técnica cromatográfica puede ser aplicada a una matriz compleja como es el
extracto de Catharanthus roseus o sus fracciones.
Es importante indicar que, en el medio ecuatoriano no se han realizado trabajos que
aborden esta línea de investigación, y que puedan ser tomados como referencia para el
desarrollo de una metodología analítica apropiada para este tipo de matriz. Así también, la
aplicación del enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD), todavía no está siendo
considerada, lo cual brinda una mayor relevancia y es el potencial diferenciador de esta
investigación.
Fundamentación teórica
Métodos analíticos.
Corresponden al conjunto de técnicas, que son útiles en todos los campos de la ciencia,
que permiten obtener información cuantitativa y cualitativa de las muestras objeto de
análisis. El análisis cualitativo establece la identidad de los elementos que componen la
muestra, mientras que el análisis cuantitativo, indica la cantidad relativa de especies o
analitos que conforman la sustancia (Skoog, West, Holler, & Crouch, 2015).
Tipos de métodos analíticos cuantitativos.
9
Los resultados de una metodología analítica cuantitativa, pueden ser obtenidos a través
de métodos químicos también llamados clásicos o por métodos físicos (instrumentales). La
tabla 2.1, realiza una descripción más amplia sobre los métodos analíticos referidos.
Tabla 2-1. Descripción de los tipos de métodos analíticos cuantitativos
Tipos de métodos
analíticos
Métodos
específicos
Descripción Ejemplos
Métodos
Químicos
(métodos clásicos)
Métodos
gravimétricos
Determinan la masa de un
compuesto puro, con el que
el analito está relacionado
químicamente
Gravimetría por
precipitación
Gravimetría por
volatilización
Electrogravimetría
Métodos
volumétricos
Establecen el volumen del
reactivo patrón (valorante)
necesario, para reaccionar de
manera estequiométrica,
conocida y reproducible, con
el analito.
Titulaciones acido base
Titulaciones redox
Titulaciones
complexométricas
Métodos Físicos
(métodos
instrumentales)
Métodos
electroquímicos
Obtienen las velocidades de
transferencia de cargas, de
masas, quimiosorción y
constantes de velocidad y
equilibrio de reacciones
químicas. A través de la
propiedades eléctricas de una
solución de analito cuando
forma parte de una celda
electroquímica.
Potenciometría
Coulombimetría
Voltametría
Métodos
espectroscópicos
Calculan la cantidad de
radiación que absorben o
producen, los átomos o
moléculas de interés.
Espectroscopia UV-Vis
Espectroscopia IR
Espectroscopia de RMN
Espectrometría de masas
Espectroscopia de
absorción molecular
Espectroscopia de
fluorescencia molecular
Métodos
cromatográficos
Separan los componentes de
una mezcla, a partir de las
diferencias de velocidad a la
que son transportados por
una fase móvil, a través de
una fase estacionaria.
Cromatografía en
columna
Columna plana
Fuente: (Skoog et al., 2015) y (Skoog, Holler, & Crouch, 2008) Elaborado por.
Alejandro Osorio
10
Métodos cromatográficos.
Los métodos cromatográficos se desarrollan a través de dos componentes principales:
una fase móvil, que puede ser líquida o gaseosa, cuya función es la disolución de la
muestra, para que atraviese una fase estacionaria, que es fija y puede ubicarse sobre una
superficie sólida o empaquetarse en una columna (Skoog et al., 2008) .
Dependiendo del grado de interacción entre la fase estacionaria, la fase móvil y la
muestra, se produce el avance o la retención de los componentes de la muestra, y se
generan zonas o bandas de separación, características para ese analito en particular. La
ventaja de la cromatografía es que, facilita la separación de diversos componentes de una
muestra, en especial aquellos que pertenecen a una matriz compleja, previo a su
determinación por cualquiera de las técnicas instrumentales. Es importante mencionar que
la cromatografía, es aplicable en todas las ramas de la ciencia (Skoog et al., 2008).
Existen dos tipos de métodos cromatográficos: cromatografía en columna y
cromatografía plana, la tabla 2-2 indica algunas generalidades de los métodos referidos.
11
Tabla 2-2. Generalidades de la clasificación de los métodos cromatográficos Clasificación general Tipo de
cromatografía
Método especifico Fase estacionaria Tipo de equilibrio
Cromatografía en
columna
Cromatografía de
gases
Gas-líquido Líquido adsorbido o unido
a superficie sólida
Reparto entre gas y líquido
Gas- sólido Sólido Adsorción
Cromatografía
líquida
Reparto o Líquido -
líquido
Líquido adsorbido o unido
a superficie sólida
Reparto entre líquidos inmiscibles
Adsorción o Líquido
- sólido
Sólido Adsorción
Intercambio iónico
Resina de intercambio
iónico
Intercambio iónico
Exclusión por
tamaño
Líquido en los intersticios
de un polímero
Reparto/ tamizado
Afinidad Líquido con grupo
específico unido a
superficie sólida
Reparto entre líquido superficial u
líquido móvil
Cromatografía de
fluidos supercríticos
Especie orgánica unida a
superficie sólida
Reparto entre fluido supercrítico y
superficie unida
Cromatografía plana Cromatografía en
capa fina
Adsorción o Líquido
- sólido
Sólido Adsorción
Cromatografía en
papel
Adsorción o Líquido
- sólido
Sólido (celulosa) Adsorción
Modificado de: (Skoog et al., 2008) y (Bauer, Gros, & Sauer, 1992) Elaborado por. Alejandro Osorio
12
Cromatografía en capa fina.
La cromatografía de capa fina es un método de separación rápido, para el análisis tanto
cualitativo como cuantitativo de pequeñas cantidades de muestra. Se fundamenta en la
sepración por partición sólido – líquido y generalmente desarrollo la elución, en forma
ascendente, por capilaridad (Spangenberg, Weins, & Poole, 2014), (Srivastava, 2011) .
La fase estacionaria, se encuentra adherida a una superficie lisa, formando una delgada
capa de 100µm de espesor, sobre ella una pequeña cantidad de muestra entre 2-20µg es
adsorbida para su separación. Mientras que, la fase móvil, que se ubica en la cámara de
desarrollo, recorre la superficie de la placa, transporantado y permitiendo la separación de
los compuestos de interés (Spangenberg et al., 2014).
Desarrollo de métodos analíticos.
Analytical Quality by Design (AQbD).
El AQbD es un enfoque, que ayuda en el desarrollo de un método analítico eficaz,
robusto y económico.
La mayoría de trabajos, que se publican sobre el desarrollo de métodos analíticos, no
definen una forma clara de implantar el AQbD, ya que se considera inadecuada la
aplicación de un diseño experimental en el método analítico es QbD, lo cual es incorrecto.
Además, reflejan un conocimiento insuficiente sobre los aspectos del métodos como:
Analytical Target Profile (ATP), características de desempeño, evaluación de riesgos,
elección de diseño experimental, optimización de la MODR, verificaciones entre otras
(Peraman et al., 2015).
Inicialmente, la implementación de AQbD, depende de los aspectos del método
descritos, hasta llegar a la inclusión de estrategias de control y mejora continua
Etapas del AQbD.
El enfoque de AQbD considera al menos seis etapas, como indica la tabla 2-3.
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Tabla 2-3. Pasos a seguir para aplicar AQbD Enfoque de AqbD
Etapa 1 Medición de objetivos
Etapa 2 Selección del método analítico
Etapa 3 Evaluación de riesgos
Etapa 4 Desarrollo del método
Etapa 5 Estrategias de control
Etapa 6 Mejora continua
Fuente (Chatterjee, 2013)
Medición de objetivos.
La medición de objetivos, consiste en determinar: qué medir, donde y cuando medirlo, y
su desarrollo se basa en los requerimientos del producto. Para el caso de métodos analíticos
estos requerimientos se denominan ATP (Analytical Target Profile), que son una
declaración del propósito, y es utilizado para conducir la selección del método, el diseño y
las actividades del desarrollo (Peraman et al., 2015).
Dentro de la definición de requisitos que satisfacen el ATP del método analítico, se
debe incorporar un criterio común para la exactitud y precisión, que permita definir la
aceptabilidad en cuanto a la incertidumbre de los resultados que genera el método (Reid,
Morgado, Harrington, Wang, & Fortin, 2013). En la guía ICH Q2-R1, se indican los
criterios de desempeño, que deben definirse para la metodología analítica, estos se
describen en la tabla 2-4 (Chatterjee, 2013).
14
Tabla 2-4. Criterios de desempeño del método analítico Característica de
desempeño
Definición Categorización
Exactitud Corresponde a la cercanía entre los
valores de prueba y el valor verdadero
Variabilidad
sistemática
Especificidad Capacidad de garantizar
inequívocamente la existencia del
analito en presencia de otros
componentes que pueden estar presentes
Linealidad Capacidad de elucidar que los resultados
de los ensayos son directamente o están
bien definidos por una transformación
matemática, proporcional a la
concentración del analito en las
muestras dentro de un rango dado
Precisión El grado de concordancia a lo largo de
ensayos individuales
Variabilidad
aleatoria
Límite de detección La menor cantidad de analito que puede
ser detectado en la muestra
Límite de
cuantificación
La menor cantidad de analito que puede
ser determinado en la muestra con
precisión y exactitud aceptable
Rango Intervalo entre el mayor y menor nivel
de analito, en el que se ha demostrado
una aceptable linealidad, precisión y
exactitud No Aplica
Robustez Capacidad de permanecer sin afectación,
por pequeñas pero deliberadas
variaciones en parámetros del
procedimiento
Fuente. (Reid et al., 2013)
El ATP constituye un parámetro clave en el enfoque AQbD, que facilita la elección y
mejora continua de los métodos analíticos.
Selección del método analítico.
La selección del método analítico, se realiza con referencia a su capacidad de adaptarse
acorde a lo definido en el ATP. También debe considerarse que cada técnica tiene sus
puntos fuertes y débiles (Reid et al., 2013). Además la técnica de elección, deberá
satisfacer los parámetros necesarios de validación de métodos, como indica la normativa
(Chatterjee, 2013).
15
Evaluación de riesgos.
La gestión de riesgos de la calidad es un proceso sistemático para la evaluación, el
control, la comunicación y la revisión de los riesgos de calidad de producto/método
analítico a lo largo del ciclo de vida del mismo. Corresponde a una parte integral del
enfoque AQbD. Su aplicación facilita la identificación y ponderación de los parámetros
que podrían influir en el desempeño del método y la conformidad con el ATP (Reid et al.,
2013), (Chatterjee, 2013), (Peraman et al., 2015).
En AQbD esta etapa comienza con el planteamiento de las operaciones de unidad
analítica, que constituyen el método. A través del uso de herramientas tales como la
evaluación de riesgos con FMEA (Análisis de fallos y efectos) o diagrama de espina de
pescado entre otros, se obtienen los parámetros críticos del método que pueden estar
asociados a: configuración de los instrumentos, características y preparación de la muestra,
condiciones ambientales (Reid et al., 2013), (Chatterjee, 2013), (Jadhav & Tambe, 2013b),
(Peraman et al., 2015).
Desarrollo del método.
En esta etapa se examinan las probables interacciones multivariables, con el objeto de
entender la robustez y solidez del método (Chatterjee, 2013). Para un apropiado desarrollo
del método, se sugiere emplear un diseño estadístico apropiado junto con un software
estadístico para minimizar el análisis requerido y aumentar la información obtenida. Para la
implementación de un diseño experimental en la etapa de desarrollo del método, se debe
tener conocimiento para la selección de las variables de entrada y la de salida – respuesta -
(Reid et al., 2013).
En la tabla 2-5, se detallan las características de los diseños experimentales de mayor
frecuencia, aplicados en el enfoque AQbD.
16
Tabla 2-5. Diseños experimentales frecuentes en el enfoque AQbD Diseño Número de
variables y
utilización
Ventajas Desventajas
Factorial
completo
Optimización/ 2-
5 variables
Identificar el efecto
principal y el de
interacción sin otras
confusiones
El número de corridas
experimentales se
incrementa con el
número de variables
Factorial
fraccionado o
Métodos de
Taguchi
Optimización/ y
tamizaje de
variables
Requiere menor número
de corridas experimentales
La resolución de las
confusiones de
interacciones/efectos
resulta un trabajo difícil
Método de
Plackett-
Burman
Tamizaje/ o
identificación de
unos pocos
factores a partir
de un amplio
número de
variables
Requiere muy pocas
corridas para un amplio
número de variables
No revela efectos de
interacción
Método Pseudo
-Monte Carlo
sampling
Análisis
cuantitativo de
riesgos/
optimización
Puede investigar
comportamiento y cambios
en el modelo. Este es
preferido donde se puede
realizar un cálculo exacto
Este método resulta de
difícil empleo, para
espacios de diseño no-
convexos. Los números
aleatorios provienen de
un algoritmo que genera
números aleatorios
Fuente. (Peraman et al., 2015)
Con la información obtenida del diseño experimental aplicado, se establece la región de
diseño operable del método (MODR). Esta es un rango de operación o zona experimental,
para las variables de entrada críticas, que producen resultados que son consistentes y
satisfacen las metas planteadas en el ATP (Reid et al., 2013).
Estrategias de control.
Las estrategias de control permiten definir el espacio de control e idoneidad del sistema,
cumpliendo con los criterios de rendimiento del método (Chatterjee, 2013). Realizan un
monitoreo de todos los parámetros del método que presenten influencia significativa. Su
concepción no difiere mucho de las estrategias de control tradicionales, sin embargo, estos
métodos de control deben garantizar que se establezca una relación entre el propósito del
método y el desempeño del mismo (Peraman et al., 2015).
17
Mejora continua.
La etapa final del AQbD, tiene por objetivos: monitorear el rendimiento del método y
actualizar procesos y técnicas analíticas, de ser necesarias. Sin embargo, esto no es
considerado como un cambio en el método analítico (Chatterjee, 2013). La mejora
continua también permite al analista: detectar, identificar y direccionar cualquier
anormalidad o fuera de tendencia (OOT) en el desempeño del método analítico. Esto
puede realizarse a través de herramientas como: cuadros de control o métodos de
investigación relacionados (Peraman et al., 2015).
Ventajas de aplicación de AQbD.
La aplicación de los principios de AQbD, para el desarrollo de métodos analíticos
incluye los siguientes beneficios: identificacion, entendimiento y minimización de las
fuentes de variabilidad, que conducen a una mala robustez del método. Cumplimiento de
los requisitos esperados del método durante todo su ciclo de vida. Desarrollo de un método
robusto. Flexibilidad dentro de la normativa, ya que su aplicación no se considera un
cambio en el método analítico (Reid et al., 2013), (Chatterjee, 2013).
Aplicación del enfoque AQbD a la HPTLC.
El enfoque AQbD, para su aplicación a cualquier método analítico precisa desarrollar
las etapas descritas en la tabla 2-3. Sin embargo, dependiendo de la técnica analítica estas
tendrán particularidades conforme a sus características. Así tenemos que, para la HPTLC
las etapas de manejo de objetivos, evaluación de riesgos, desarrollo, control y mejora
continua presentan las consideraciones que se detallan a continuación.
Para desarrollar una metodología cualitativa o cuantitativa de HPTLC, debe
considerarse que esta presenta parámetros de operación, señalados en la tabla 2-6.
18
Tabla 2-6. Parámetros de operación sugeridos para HTPLC Parámetro de operación Valor sugerido
Volumen aplicación (µL) 1-5
Longitud de banda (mm) 5-10
Distancia de desarrollo (cm) 6-8
Tiempo de saturación cámara (min) 20 min
% humedad relativa Debe mantenerse constante, en un valor que
depende de la sal que se esté utilizando para
el control.
Fuente. (Rahul Kasar, Ashish Gogia, Kartik Shah, 2013), (United States Pharmacopeia
Convention, 2015a)
Adicional a los parámetros descritos, el analista debe considerar que existen otros, que
influyen en la separación cromatográfica en capa fina, y que se listan en la tabla 2-7.
Tabla 2-7. Parámetros en orden decreciente de importancia en TLC
Parámetros de importancia en la separación cromatográfica en capa fina
Naturaleza de la fase estacionaria
Fase móvil
Tipo de cubeta
Adsorción previa de una mezcla de disolventes (acondicionamiento)
Distancia entre la posición de la sustancia y el nivel del eluyente en la cubeta de separación
Gradientes de eluyente (distribución irregular a lo largo del recorrido de los distintos
componentes del eluyente)
Velocidad de flujo de la fase móvil
Magnitud del Rf
Temperatura
Convecciones en la fase gaseosa de la cubeta de separación
Tipo de desarrollo (flujo ascendente/ descendente/ horizontal de la fase móvil)
Impurezas en el eluyente
pH
Fuente. (Bauer et al., 1992)
La naturaleza del material de la placa cromatográfica, solventes que constituyen la fase
móvil, son aquellos que presentan una mayor influencia sobre la aptitud y desempeño
esperado de la metodología a desarrollarse (Rahul Kasar, Ashish Gogia, Kartik Shah,
2013). En conjunto ejercen influencia sobre la separación cromatográfica, ya que esta
inicia con el equilibrio entre las fases móvil y estacionaria. La composición de la primera
depende de la naturaleza de los solventes que la conforman, quienes determinan el tipo de
separación a suceder. Y también definen el tipo de interacción con la fase estacionaria y la
fase de vapor, que puede cambiar durante el proceso de desarrollo (Spangenberg et al.,
2014).
19
La fase estacionaria empleada en HPTLC, se compone de una capa uniforme,
generalmente de 200 µm de espesor, de partículas irregulares porosas (tamaño de poro de
60 Å) de gel de sílice de entre 2 y 10 µm y un tamaño promedio de partícula de 5 µm,
además de un aglutinante polimérico y un indicador fluorescente (F254) recubriendo un
soporte que por lo general es una placa de vidrio o lámina de aluminio. Otras fases
estacionarias tales como fases modificadas químicamente (C8, C18, CN, NH2, DIOL) o
celulosa microcristalina, también están disponibles con y sin indicador fluorescente. El
tamaño de partícula de la fase estacionaria de la HPTLC, determina una mejor separación,
lo cual miniaturiza el sistema cromatográfico, permitiendo el uso de cámaras más pequeñas
y distancias de desarrollo más cortas de 60–80 mm. Además, la calidad de la capa mejora
debido al menor tamaño de partícula, que influye sobre la relación señal-ruido y, por ende,
tiene efectos sobre la capacidad de detección de los componentes de la muestra separados
(United States Pharmacopeia Convention, 2015a).
La validación de un método analítico no puede estar separada de su proceso de
desarrollo, ya que desde su concepción este debe indicar que alcanza el propósito para el
que está destinado. Si es una metodología de cuantificación, este será la determinación
correcta de los valores del analito (Spangenberg et al., 2014). Para HPTLC los parámetros
de validación que indica la tabla 2-8 presentan particularidades, que se describiran en los
siguientes apartados.
Estandarización de métodos analíticos.
El proceso de estandarización se considera como un examen. Que demuestra mediante
evidencias objetivas que un método analítico, cumple con requisitos particulares como
repetibilidad, reproducibilidad, entre otros, para un uso específico en un laboratorio;
asegurando que los procedimientos desarrollados son adecuados para el fin propuesto
(Villas-Boas, Koulman, & Lane, 2008), (IDEAM, 2006).
Es un proceso riguroso, que puede requerir un tiempo considerable, que suele
extenderse por sobre los seis meses. En función del número de parámetros de
estandarización, el proceso empleado para su desarrollo, así como del tipo de técnica
analítica, la naturaleza de la matriz y del analito de interés (IDEAM, 2006).
20
La estandarización inicia con el seguimiento sistemático del método, mediante gráficos
de control y con ensayos que permitan ajustar los puntos débiles o que no se cubrieron
durante la etapa de desarrollo. Se alcanza el parámetro de precisión, en términos de
repetibilidad. Y como siguiente objetivo, se precisa generar reproducibilidad, primero entre
analistas y finalmente, entre laboratorios (Villas-Boas et al., 2008).
Validación de métodos analíticos.
El proceso de la validación de un método analítico, tiene por objetivo demostrar que un
procedimiento es apto para un determinado propósito. Además, es un requerimiento que
garantiza calidad y confiabilidad de los resultados obtenidos (Ermer & Miller, 2005a),
(Agency, 2011). En la tabla 2-8, se presentan los parámetros de validación para algunos
procedimientos analíticos de uso frecuente.
Tabla 2-8. Parámetros de validación para procedimientos analíticos de uso frecuente
Parámetro de
validación
Procedimiento analítico
Identificación Determinación de
impurezas
Cuantificación
Cuantificación Límites
Selectividad Sí Sí Sí Sí
Linealidad No Sí No Sí
Rango No Sí No Sí
Exactitud No Sí No Sí
Precisión
No
Sí
No
Sí Repetibilidad
Precisión
intermedia
No Sí No Sí
Reproducibilidad No Sí No Sí
Límite de
detección
No No Sí No
Límite de
cuantificación
No Sí No No
Fuente. (Agency, 2011)
La tabla 2-8 no incluye a la robustez como parámetro de validación, sin embargo, si
debe ser considerada durante el desarrollo del método (Agency, 2011).
Existen documentos, que se utilizan como lineamientos para llevar a cabo la validación
de un método, siendo los de mayor aplicación el de la agencia de regulación
norteamericana (FDA) y la convención internacional de armonización (ICH), la guía Q2-
21
R1. La ICH-Q2-R1, se considera como la base filosófica para la validación de métodos
analíticos, sin embargo, es responsabilidad de la organización o persona que la esté
aplicando elegir el protocolo y procedimiento que más apto para su producto (Ermer &
Miller, 2005b).
Una falta de conocimiento o mala interpretación de la eficiencia, produce que los
resultados de la validación y el verdadero desempeño del método analítico sean
insuficientes o parciales. Este tipo de inconvenientes se presentan con mucha frecuencia en
publicaciones relacionadas a validación analítica (Ermer & Miller, 2005b).
La validación por tanto, no debe tomarse como una actividad aislada sino como una
parte sustancial del ciclo de vida del método analítico. Durante este, el desarrollo,
optimización y el desempeño del método, deben presentar una interrelación hacia los
requerimientos planteados, volviéndolo un proceso dinámico. Permitiendo que los datos
obtenidos durante su aplicación, puedan traducirse en información, que mejore su
entendimiento y control, generando lo que se conoce como pirámide de información
(Ermer & Miller, 2005b), resumida en la figura 2-1.
Figura 2-1. Pirámide de información en procesos de validación Modificado de (Ermer &
Miller, 2005a)
La integración entre entendimiento, información y datos, permite que el proceso de
validación ingrese a un sistema analítico de calidad (AQA), que incluye: calidad, confianza
de los resultados del método, calificación de equipos, pruebas de aptitud (system
suitability), documentación, cuadros de control (Ermer & Miller, 2005a).
22
Validación del proceso de HPTLC.
La tabla 2-9 indica la descripición de los parámetros de validación sugeridos por
Srivastava (2011) para el proceso de cromatografía de capa fina de alto rendimiento. El
autor considera los siguientes aspectos: exactitud, selectividad, linealidad, precisión, límite
de detección, límite de cuantificación, rango y robustez. Además suguiere la inclusión de
otro parámetro, como la estabilidad.
23
Tabla 2-9. Descripición de los parámetros de validación para el proceso de cromatografía de capa fina de alto rendimiento (HPTLC)
Aspectos sugeridos
para validación de
metodología HPTLC
Descripción
Exactitud Grado de concordancia entre el valor real y el valor analítico medio, obtenido de la aplicación del método de prueba varias
veces. Se calcula realizando seis determinaciones de al menos tres concentraciones. Y resulta adecuada si el valor de
recuperación es cercano a 100% y con una desviación estándar relativa (RSD) inferior a 5%.
Selectividad Detección del analito, en presencia de los otros componentes de la matriz. En HPTLC esto se comprueba al desarrollar el
analito de interés con su estándar, para determinar: razón de frentes ( ), factor de asimetría ( ) y resolución ( ). La
separación cromatográfica se considera, en terminos de selectividad: muy buena si es igual a 1,25 y buena si es lo más
cercana a 1.
Linealidad Capacidad de detección de un analito en proporción directa a la concentración, dentro de una curva de calibración. Para
HPTLC la relación lineal solo se obtiene mediante detectores UV, mientras que las relaciones no lineales se asocian a
detección óptica o fluorométricas.
Precisión Indica el error aleatorio, y expresa sus resultados como RSD o coeficiente de variación (COV). Su verificación se realiza en
términos de repetibilidad y precisión intermedia. Y se considera adecuada cuando el área del pico cromatográfico presenta una
RSD menos a 2%, para 7 mediciones de una misma mancha.
Límite de detección
(LOD)
Corresponde a la cantidad más baja de analito que puede ser detectada, no mayor al 10% del límite de impureza individual. Si
esto no resulta posible, se debe aumentar la cantidad del mismo.
Límite de
cuantificación (LOQ)
Señala la cantidad más baja de analito que puede cuantificarse, y deber ser no mayor al 20% de impurezas individuales
Robustez Determina la resistencia del método analítico, frente a variaciones deliberadas pero esperadas. En HPTLC, deben evaluarse los
siguientes procedimientos: preparación de la muestra, siembra de la muestra y condiciones cromatográficas. Así, como
visualización, localización y evaluación cuantitativa.
Estabilidad Muestra resistencia a la descomposición del analito durante el desarrollo cromatográfico. El criterio se satisface si la sustancia
es estable en solución al menos 30 minutos, 15 minutos en la fase estacionaria y si la intensidad de la mancha es constante por
lo menos 60 minutos.
Fuente. (Spangenberg et al., 2014), (Srivastava, 2011). Elaborado por. Alejandro Osorio
24
Fundamento metodologico
Estandarización de la muestra vegetal.
Para el desarrollo de la metodología cuantitativa de HPTLC, se debe utilizar una
muestra que presente características estandarizadas, que disminuya la introducción de
factores adicionales, que no son motivos de estudio. La estandarización de la muestra
incluye: limpieza, desinfección, secado, reducción del tamaño de partícula y determinación
de humedad relativa. Las operaciones expuestas se describirán a continuación.
Limpieza y desinfección.
El proceso de limpieza se realiza de forma mecánica y permite separar, aquellos
organismos o sustancias ajenas al material vegetal tales como: insectos, arena, polvo,
piedras, tierra, entre otros. Adquiridas en el medio ambiente, o debido a inadecuadas
condiciones de recolección o almacenamiento.Es importante indicar que, tambíen se retiran
los componentes que presenten alteraciones, por ejemplo flores marchitas y hojas con
agujeros (Miranda, 2008), (World Health Organization. Pharmaceuticals Unit, 1998).
A continuación, se realiza la desinfección del material vegetal seleccionado, empleando
agentes químicos como hipoclorito de sodio, permanganato de potasio, diluidos, entre
otros. Para eliminar e impedir la proliferación de microorganismos que puedan alterar los
componentes vegetales a ser utilizados (World Health Organization. Pharmaceuticals Unit,
1998).
Secado.
El secado de la muestra vegetal, permite retirar el exceso de agua, asegurando la
interrupción de procesos enzimáticos a nivel celular e impidiendo el crecimiento de
microorganismos (bacterias y hongos). También facilita el transporte y almacenamiento,
sin el riesgo de deterioro, se debe establecer las condiciones en que se realice el secado ,
tomando en cuenta la naturaleza de los constituyentes de la muestra (Sharapin, 2000).
25
Reducción del tamaño de partícula.
La reducción del material vegetal, hace que las membranas se encuentren parcialmente
destruidas, lo cual facilita la entrada del solvente a los componentes celulares. No se debe
llegar a una disminución excesiva, ya que algunas técnicas extractivas pueden verse
afectadas, por fenómenos de compactación, por ejemplo, la percolación. Un adecuado
proceso de molienda también incluye una separación previa de impurezas, presentes en la
muestra (Sharapin, 2000).
Determinación de humedad relativa.
La determinación de humedad relativa, permite conocer la cantidad de agua de un
sólido, que ha sido sometido a secado a 40°C. Se denomina relativa porque la desecación a
esa temperatura, todavía mantiene un pequeño porcentaje de agua, que no puede
determinarse de manera exacta. Sin embargo, los resultados obtenidos presentan menor
variabilidad, debido a la elevada eliminación del contenido de agua presente en el sólido.
El procedimeinto puede realizarse de forma tradicional, calculando la diferencia entre el
peso inicial y final de la muestra, al ser sometida a calentameinto a 110°C. En la
actualidad, se prefiere el uso de equipo especializado, como la balanza halogena porque
disminuye los tiempos de análisis (Venegas, 2016).
Cuantificación de alcaloides.
Extracción de alcaloides.
La extracción de alcaloides se realiza con soluciones ácidas, por ejemplo ácido
clorhídrico diluído, lo que permite la protonacion del nitrógeno presente en la estructura,
dando lugar a una sal de amina, la misma que es más soluble en agua que la amina de la
cual procede.
La formacion de la sal de amina propicia la separación de las aminas de componentes
menos básicos. En presencia de ácido diluido, el compuesto nitrogenado forma la sal y se
26
disuelve, al alcalinizar esta solución la amina es regenerada, como se indica en la figura 2-
2, el compuesto nitrogenado puede ser separado de la solución acuosa o ser extraido con
solventes orgánicos (Wade, 2012).
Figura 2-2. Formación de sal de amina y regeneración de amina (Wade, 2012)
Concentración de los extractos.
Tiene como finalidad aumentar el contenido de sólidos, para alcanzar una determinada
cantidad en el residuo seco o fabricar extractos blandos. Las soluciones que contienen
solventes estables pueden ser concentradas en equipos comunes y a presión normal o al
vacío, sin embargo la mayoría de los extractos precisan ser evaporados, en lo posible a
temperaturas bajas y al vacío, para evitar las degradación de sus componentes (Sharapin,
2000).
Cuantificación mediante cromatografía en capa fina de alto rendimiento, HPTLC.
La cromatografía en capa fina es una técnica de amplio uso, para la extracción, el
análisis y purificación de alcaloides, y otros metabolitos secundarios, debido a que presenta
ventajas como indica la tabla 2-10.
Tabla 2-10. Ventajas del empleo de cromatografía en capa fina Técnica analítica Ventajas
Cromatografía en
capa fina
Permite realizar metodologías cualitativas,
semicuantitativas y cuantitativas
Presenta rapidez de análisis
Genera cromatogramas, empleados como referencia o
huellas digitales
Fuente: (Aniszewski, 2007)
El proceso cromatográfico en capa fina, siempre comienza en un estado sin equilibrar,
que generalmente nunca es alcanzado (United States Pharmacopeia Convention, 2015a),
N
R
R
R Cl-
N+
R
R
R
H
amina
(insoluble en agua)
sal de amina
(soluble en agua)
NaOH (acuoso)
HCl (acuoso)
27
cuando una muestra que contiene al menos entre - de analito. Los analitos son
transportados por la fase móvil a su lado opuesto, atravesando la capa, denominada fase
estacionaria (Aniszewski, 2007). La mezcla de eluyentes, debe ser capaz de interactuar con
la muestra para comenzar la cromatografía. Impulsada por la acción capilar, la velocidad
de la fase móvil disminuye a medida que se incrementa la distancia de migración debido a
que también se incrementa la resistencia de la fase estacionaria contra el flujo (United
States Pharmacopeia Convention, 2015a).
La transferencia de solidos entre la fase móvil y la estacionaria, puede ser determinada
por su coeficiente de distribución (K). El movimiento del analito se expresa por la razón de
frentes ( ), que es la relación entre la distancia recorrida por el analito desde el origen y la
de la mezcla eluyente, también desde el origen (Aniszewski, 2007) y se representa en la
ecuación 2-1.
Ecuación 2-1. Razón de frentes, (Aniszewski, 2007). Donde: razón de frentes, distancia recorrida por el analito desde el origen, distancia recorrida
por la mezcla eluyente desde el origen
La fase móvil influye de manera significativa en el desarrollo cromatográfico, por lo
cual es importante la elección de un sistema apropiado a las características de la muestra.
Para ello (Bladt, 2009), propone los sistemas de elución (tabla 2-11), que toman en cuenta
el tipo de análisis a realizar y la muestra vegetal.
28
Tabla 2-11. Ejemplos de sistema de elución para muestras vegetales (alcaloides)
Sistema de elución Tipo de análisis Muestra vegetal Índice de
polaridad de
muestra
Tolueno: Acetato de
etilo: Dietilamina
(70:20:10)
Determinación para
alcaloides en general
Plantas en general que
contengan alcaloides
2,56
Acetato de etilo:
Metanol (90:10)
Determinación de
alcaloides indólicos
Vinca herbae (Vinca
minor)
4,47
Acetato de etilo:
Metanol (60:20)
Determinación de
alcaloides indólicos
Catharanthi folium
(Catharantus roseus)
4,58
n-butanol: ácido
acético: agua
(40:10:10)
Determinación de
alcaloides indólicos
Catharanthi folium
(Catharantus roseus)
5,26
Metanol y solución A
(7:3)
Valoración sulfato de
vincristina
No aplica 6,19
Solución A y Solución
B (38:62)
Valoración sulfato de
vinblastina
No aplica 6,62
Donde solución A para sulfato de vincristina es: dietilamina y agua (1:59) ajustada con ácido fosfórico a pH
7,5. Para el sulfato de vinblastina la solución A es: dietilamina y agua (14:986) ajustada con ácido fosfórico a
pH 7,5 y la solución B: acetonitrilo y metanol (20:80) Fuente: (Bladt, 2009), (United States
Pharmacopeia Convention, 2015b)
La primera información que se obtiene de un cromatograma terminado es el
comportamiento de elución de las sustancias separadas, expresado por el parámetro razón
de frentes (Rf). Sin embargo, este se considera solo como valor orientativo ya que depende
de múltiples e incontrolables factores, que intervienen en la retención, (Bauer et al., 1992).
Otra información, más objetiva, que brinda una placa cromatográfica desarrollada tiene
relación con la eficacia y selectividad de separación del sistema empleado. La eficacia se
manifiesta por el ensanchamiento de la mancha de la sustancia aplicada, a través del
recorrido cromatográfico y se describe por el número de platos teóricos ( ) o la altura de
plato ( ), expresada en la ecuación 2-2.
(
)
Ecuación 2-2. Cálculo para número de platos teóricos o altura de plato, (Bauer et al., 1992)
La eficacia tiene relación con el ensanchamiento del pico, pero un adecuado desarrollo
cromatográfico en capa fina, además precisa calidad de la separación entre dos sustancias
29
diferentes. Esto se conoce como selectividad, cuyo parámetro de medición es la resolución
( ) (Bauer et al., 1992) y se calcula de acuerdo a la ecuación 2-3.
Ecuación 2-3. Deteminación de la resolución en cromatografía de capa fina, (Bauer et al.,
1992)
Se debe mencionar que, si el desarrollo cromatográfico alcanza un valor de igual 1,
esto es indicativo de que las sustancias de interés se encuentran separadas por la línea base.
Y se generan picos de separación como indica la figura 2-3.
Figura 2-3. Resolución de picos cromatográficos en TLC, (Bauer et al., 1992)
Cuantificación de alcaloides (vincristina y vinblastina).
La determinación cuantitativa mediante HPTLC, se desarrolla por densitometría,
siguiendo un método optimizado y estandarizado. Se obtienen datos reproducibles, con
límites de detección, en absorción de 10-100ng y en fluorescencia se alcanza 0,1 a 10ng.
La obtención de resultados no siempre se logra a través de una regresión lineal, sino que se
puede utilizar por una regresión polinomial. Es un método simple, rápido, eficiente
30
confiable, lo cual lo coloca como una solución analítica (Hajnos, Sherna, & Kowalska,
2008).
Existen metodologías cuantitativas de referencia, la cuales constan en la colección de
métodos de la HPTLC Association. Estas metodologías se desarrollan con el Scanner 3 de
TLC, mismo que emplea el software winCATS o se basan en imágenes digitales con
VideoScan (International Association for the Advancement of High Performance Thin
Layer Chromatography, 2012).
La tabla 2-12, describe las funciones de las etapas de ejecución de la HPTLC,
propuestas por el protocolo de Srivastava (2011), para la realización de esta técnica
cuantitativa.
Hipótesis
Hi: La aplicación del enfoque Analytical Quality by Design (AQbD) permite desarrollar
una metodología de cuantificación por medio de cromatografía en capa fina de alto
rendimiento, para los alcaloides vincristina y vinblastina, presentes en Catharanthus
roseus.
Ho: La aplicación del enfoque Analytical Quality by Design (AQbD) no permite
desarrollar una metodología de cuantificación por medio de cromatografía en capa fina de
alto rendimiento, para alcaloides vincristina y vinblastina, presentes en Catharanthus
roseus.
31
Tabla 2-12. Descripción de funciones de las etapas de ejecución de la HPTLC
Etapa de ejecución Función
Preparación de estándares y
muestras.
Asegurar en función de la carateristicas de la muestra, su completa solubilización en el
solvente de elección. Además, eliminar compuestos no disueltos a través de filtración o
centrifugación.
Activación de las placas Elevar el número de centros activos en los que pueden adsorberse las sustancias. Mediante
la evaporación de moléculas de agua, acumuladas en estos centros. Estableciendo un
equilibrio entre el agua de la capa y el agua de la humedad del aire.
Aplicación de muestras y
estándares
Distribuir las muestras en bandas o manchas sobre la superficie de la placa. Controlando
parámetros como: volumen de siembra y posición
Selección de fase móvil Definir a partir de: literatura, estudios similares, análisis propios o ensayos de prueba y
error, los componentes y proporciones de la fase móvil. Así como la inclusión de agentes
reguladores de pH, que mejoren la separación y resolución cromatográfica.
Acondicionamiento, desarrollo y
secado.
Establecer condiciones controladas de operación como: % de humedad relativa, tiempo de
preacondicionamiento de placa, distancia de migración, tiempo de saturación, entre otras.
Para alcanzar las mejores carateristicas de separación del analito de interés.
Detección y visualización. Permitir la observación de los analitos, posterior al desarrollo cromatográfico. Se pueden
utilizar: Tecnicas destructivas como los reactivos reveladores, que generen coloración
específica en las zonas de la muestra. O técnicas no destructivas como lámparas UV de
longitud de onda corta (254nm) o longitud de onda larga (366nm), que evitan la
modificación del compuesto de interés.
Cuantificación Calcular el contenido del analito deseado en la muestra. A través de la medición in situ de
las zonas de la muestra y sus respectivos estándares. Utilizando densitómetros o
fotodocumentación. Las tecnincas HPTLC cuantitativas, permiten establecer relaciones
lineales y no lineales.
Fuente. (Camag, 2016), (Rashmin et al., 2012), (Bauer et al., 1992). Elaborado por. Alejandro Osorio
32
Capitulo III
Diseño de la investigación
La presente investigación puede ser catalogada dentro del paradigma cuantitativo, ya
que como indican los autores (Cook & Reichardt, 1986) y (Alvarez-Gayou, 2003),
transcurre a través de mediciones, y presenta características como: confiabilidad, validez, y
muestreo. Resulta valida porque los procesos de observación, medición o apreciación, se
enfocan en la realidad que se busca conocer. Es confiable ya que permite la obtención de
resultados estables, seguros y congruentes, iguales a sí mismos en diferentes tiempos. Y
referente al muestreo, este sustenta la representatividad del universo, para generalizar
resultados. Además, como señala (Cabrero & Richard, 1996) si las metodologías son lo
suficientemente refinadas permiten la obtención de datos repetibles y sólidos.
La investigación es experimental de nivel explicativo, ya que va a valorar y emitir un
juicio de valor sobre un diseño metodológico planteado. Finalmente, presenta un carácter
experimental, ya que se manipularán variables.
Población y muestra
La población que utilizará la investigación corresponde a especies vegetales de la
familia Apocynaceae, de la cual se tomará como muestra las que pertenecen al género
Catharantus y la especie Catharantus roseus. Debido a que esta especie presenta en su
composición química los alcaloides vincristina y vinblastina, de los cuales se cuenta con
estándares de referencia para su desarrollo.
Materiales y métodos
Estandarización de muestra.
Se seleccionó del material vegetal recolectado de Catharanthus roseus, las hojas que
presentaban las mejores condiciones de apariencia (color y textura). El material
seleccionado se desinfecto, utilizando una solución de KMnO4 0,01% P/V, a continuación
se retiró el exceso de esta con agua tipo I y se aclaró con agua destilada.
33
La muestra de Catharanthus roseus, obtenida del procedimiento anterior se colocó en
una caja de papel corrugado de tamaño apropiado. Y se secó en estufa de convección de
aire caliente marca BINDER, a una temperatura de 40°C, por 6 días, alcanzando una
textura rugosa/áspera.
Se redujo el tamaño de partícula de la muestra seca obtenida del proceso anterior en el
molino de granos marca CORONA.
Se estandarizó el tamaño de partícula de la muestra seca, en una tamizadora eléctrica
marca GILSON, con el tamiz No 20. El sólido obtenido se pesó en la balanza analítica
DENVER, A±0,0001g.
Determinación de humedad relativa y total.
Se pesó por triplicado, aproximadamente 0,500g de muestra seca estandarizada y
muestra fresca de Catharanthus roseus, en la balanza halógena HX204 METLER
TOLEDO, A±0,0001 g, y se programó las siguientes condiciones de secado: 70°C hasta un
peso constante bajo el parámetro de desconexión de 1mg/50s y 105°C hasta un peso
constante bajo el parámetro de 1mg/20s, respectivamente.
Extracción de alcaloides.
Se pesó en la balanza analítica DENVER (A±0,0001g), 1,0000g de muestra seca
estandarizada de Catharanthus roseus. Se desengrasó mediante una extracción Söxleth,
durante un tiempo de 5 horas, utilizando hexano como solvente (Tiong et al., 2013). El
sólido desengrasado se dejó secar en la estufa de convección a 40°C, durante 1h:15min
para eliminar los residuos de solvente. Se pesó en la balanza analítica y se determinó por
diferencia de peso el contenido de fase lipídica en la muestra.
La muestra desengrasada se percoló con ácido clorhídrico 1% en metanol a una
velocidad de flujo promedio de 23 gotas por minuto, como sugiere (Suárez & Mora, 2016),
durante 3h, hasta que la reacción de Dragendorff resultó negativa. El extracto obtenido, se
almacenó en frascos ámbar, protegidos de la luz.
34
El extracto colectado de la percolación, se evaporo con un rotavapor SELECTA RS
3000-V, hasta alcanzar un volumen inferior a 100mL. Se llevó al volumen de aforo de
100mL y se tomó una alícuota de 50mL y se evaporó a sequedad a 40°C en cajas Petri soda
– previamente taradas –. Se pesó la caja Petri con el residuo en la balanza analítica
DENVER, hasta que alcanzó peso constante y se determinó el rendimiento porcentual de
extracto total de las muestras estandarizadas de Catharanthus roseus.
Separación y cuantificación de alcaloides – vincristina y vinblastina – mediante
cromatografía en capa fina de alto rendimiento.
Se prepararon los estándares de los alcaloides vincristina (VC) y vinblastina (VB) de
concentración final 1mg/mL, utilizando como solvente metanol.
Para la preparación de las muestras de Catharanthus roseus, se pesó entre 12-15mg de
extracto seco, y se disolvió en 200μL de metanol. A continuaci n, se adicion 800μL de
solución de estándar del alcaloide VC o VB, completando un 1mL de mezcla para el
análisis.
Utilizando el módulo de aplicación LINOMAT-5, se inyectaron los volúmenes de
estándar y de muestra, que se indican en la tabla 3-1, sobre una placa cromatográfica de 10
x 10cm, previamente activada durante 1h. La placa con estas condiciones se desarrolló en
el módulo automatizado ADC-2 configurado los parámetros de control de humedad,
secado, saturación y desarrollo en el software WinCats, que se indican en la tabla 3-1.
La fotodocumentación de las placas se realizó a una longitud de onda de 254nm, en el
módulo TLC-VISUALIZER. Las fotografías que se obtuvieron se almacenaron en la
librería respectiva, en un formato no editable (.cpf) y se utilizaron para la cuantificación.
35
Tabla 3-1. Condiciones experimentales del desarrollo cromatográfico por HPTLC Parámetros Condiciones de desarrollo
Pre-secado Tiempo 5 minutos
Inyección Volumen de la jeringa 100µL
Volumen de inyección extracto 4.5µL
Volúmenes de inyección
estándares
3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.5µL
Velocidad de inyección 150nL/seg
Control de humedad Tiempo 10 minutos
Solución Cloruro de magnesio
Volumen de llenado 800 Ml
Humedad relativa 33%
Secado Tiempo 5 minutos
Saturación Almohadilla de saturación No aplica
Volumen fase móvil 25 mL
Solvente Acetato de etilo: Metanol: NH4OH
(3:7:1)
Desarrollo Distancia de migración 70,0 mm
Ancho de banda 6 mm
Volumen de fase móvil 10 mL
Fase móvil Acetato de etilo: Metanol: NH4OH
(3:7:1)
Fuente. (Narváez, 2016) Modificado por. Alejandro Osorio
Se cuantificaron de los alcaloides VC y VB, en las muestras de Catharanthus roseus,
mediante el software VideoScan, el cual se configuró conforme los parámetros de la tabla
3-2.
Tabla 3-2. Parámetros de cuantificación para VideoScan Parámetros Condiciones
Método de corrección de línea base Pendiente más baja (Lowest Slope)
Corrección de línea base compensada Si
Dirección de cromatografía Ascendente
Altura mínima pico 100
Ancho mínimo del pico 7 pixeles
Área mínima del pico 100
Numero de tracks 8
Elaborado por. Alejandro Osorio
36
Diseño Experimental
La ecuación 3-1, señala los factores que influyen en la respuesta experimental,
resolucion ( ), planteada en la investigación. Al existir un elevado número de factores
(11), y como sugerían (Vega, 2016) y (Box, Hunter, & Hunter, 2009), se debío distinguir
entre aquellos que serían factores de estudio y accesorios.
Ecuación 3-1. Factores que influyen en la respuesta experimental
Dónde: , , ,
, , ,
, ,
, ,
Para la selección de los factores de estudio: grado de modificación de fase estacionaria
( ) tiempo de preacondicionamiento de placa ( ) y tiempo de saturación cámara ( ), se
consideró el criterio de la tabla 2-7, que establecía un orden de importancia de los
parámetros que influyen en la separación cromatográfica en capa fina. Además, estos tres
factores no presentaban resultados de experimentación previa, reportados en las
investigaciones citadas. Por otro lado, los ocho factores restantes:
, pasaron a ser accesorios, porque a partir de los datos
expuestos en las investigaciones citadas, así como los resultados de sus pruebas
preliminares, se podían establecer valores constantes de operación.
La evaluación experimental de los factores de estudio seleccionados: tiempo de
saturación de cámara ( ), tiempo de preacondicionamiento de placa ( ) y grado de
modificación de fase estacionaria ( ), utilizó un diseño factorial completo 23. La tabla 3-3
presenta la codificación respectiva de los diferentes niveles para cada factor.
37
Tabla 3-3. Codificación de los niveles, de los factores de estudio principales
Factor Codificación
- +
Tiempo de saturación de
cámara ( )
20 minutos 30 minutos
Tiempo de
preacondicionamiento de placa
( )
10 minutos 20 minutos
Grado de modificación de fase
estacionaria (
C18-50/UV254 C18-100/UV254
Elaborado por. Alejandro Osorio
La tabla 3-4 indica que, de acuerdo al diseño experimental, se tuvieron 8 corridas
experimentales, que generaron 7 efectos posibles, divididos en primarios, secundarios y
ternarios, a continuación, se detalla el número de efectos por cada tipo:
Efectos primarios: 3
Efectos secundarios: 3
Efectos ternarios: 1
Solo las magnitudes de los efectos primarios y secundarios presentan utilidad práctica,
ya que el ternario generalmente presenta un valor similar a la desviación estándar del
efecto. Esta particularidad hace que este, en la práctica no sea considerado, porque no logra
ser distinguido o diferenciado del ruido experimental (Vega, 2016), (Box et al., 2009). Sin
embargo, su magnitud permite realizar el análisis estadístico, pertinente al diseño
experimental planteado.
38
Tabla 3-4. Matriz codificada de experimentos en orden estándar Nº Corrida
experimental
Tiempo de
saturación de cámara
( )
Tiempo de
preacondicionamiento de
placa ( )
Grado de
modificación de fase
estacionaria ( )
1 - - -
2 + - -
3 - + -
4 + + -
5 - - +
6 + - +
7 - + +
8 + + +
Elaborado por. Alejandro Osorio
Matriz de operacionalización de variables
La tabla 3-5, definida como matriz de operacionalización de variables, permitio registrar
los valores que tomo la respuesta experimental (resolución, ), al evaluar los factores
selccionados, con sus respectivos niveles de estudio.
Tabla 3-5. Matriz de operacionalización de variables
Factores Niveles Respuesta
Tiempo de saturación de
cámara ( )
20 minutos
30 minutos
Tiempo de
preacondicionamiento de
placa ( )
10 minutos
20 minutos
Grado de modificación
de fase estacionaria ( )
C18-50/UV254
C18-100/UV254
Elaborado Por: Alejandro Osorio
Técnicas de análisis e interpretación de resultados
Los datos experimentales obtenidos de la tabla 3-5, se utilizaron para el cálculo de los
efectos mediante el algoritmo de Yates (Vega, 2016), (Box et al., 2009).
El cálculo de la significancia estadística de los efectos se realizó de acuerdo al método
de réplica de diseño completo con un 95% de confianza (Vega, 2016), que permite
calcular la desviación estándar de los efectos de acuerdo a la ecuación 3-2.
39
√
Ecuación 3-2. Calculo de , (Vega, 2016)
Como señala (Box et al., 2009), el valor que se obtiene de la desviación estándar de los
efectos mediante la ecuación 3-2, corresponde al intervalo de confianza I.C. para 1σ y
deja a criterio del investigador, su ajuste conforme sus requerimientos. Para esta
investigación, como parte de su planteamiento inicial, se estableció que el I.C. para la
resolución, sería del 95% es decir 2 σ.
La significancia estadística utilizó el criterio expuesto por (Vega, 2016), con la ecuación
3-3. Donde se considera a un efecto como estadísticamente significativo si su valor
absoluto es mayor que la , correspondiente al I.C. seleccionado por el investigador.
| |
Ecuación 3-3. Criterio para determinar significancia estadística de efectos, (Vega, 2016)
40
Capitulo IV
Análisis y discusión de resultados
Estandarización de muestra.
La muestra de Catharanthus roseus, presentó el valor promedio de humedad total que
indica la tabla 4-1, el cual es concordante con las condiciones ambientales en que se
desarrolla la planta. Correspondientes al clima ecuatorial uniforme megatérmico, donde la
humedad ambiental alcanza un valor de 77% (Velasco, 2012).
Tabla 4-1. Determinación de humedad total en muestra fresca de Catharanthus roseus
Peso muestra
fresca
Temperatura
secado
% humedad
total
% humedad
total promedio
0,336 70°C 83,55 %
83,08 ± 0,82 % 0,340 70°C 82,13 %
0,336 70°C 83,55 %
Elaborado por. Alejandro Osorio
El porcentaje de humedad relativa promedio obtenido, presentado en la tabla 4-2,
correspondiente a la muestra seca Catharanthus roseus, evidenció la evaporación del agua
presente en su estructura. Disminuyendo la fuente de contaminación asociada al
crecimiento de microorganismos.
Tabla 4-2. Determinación de humedad relativa en muestra estandarizada de Catharanthus
roseus
Peso muestra
seca
Temperatura
secado
% humedad
relativa
% humedad
relativa promedio
0,500 g 105°C 5,00 %
5,12 ± 0,20 % 0,505 g 105°C 5,35 %
0,500 g 105°C 5,00 %
Elaborado por. Alejandro Osorio
Debido a los bajos contenidos de alcaloides VB y VC, en Catharanthus roseus,
reportados por (Matsuura et al., 2014), 0,0003 a 0,01% MS y (Zhang et al., 2014), 0,01 a
0,1mg/g MS, y para facilitar su extracción desde la muestra estandarizada, se realizó un
desengrasado previo. Este procedimiento elimino los compuestos de naturaleza apolar tales
como: clorofilas, grasas, ceras, entre otros; los porcentajes obtenidos (tabla 4-3) se
expresaron como fase lipídica de las muestras estandarizadas.
41
Tabla 4-3. Determinación del contenido de fase lipídica en muestras estandarizadas de
Catharanthus roseus
Número de
muestra
Contenido promedio
de fase lipídica (%)
1 6,53 ± 0,82%
2 7,38 ± 1,09%
3 5,90 ± 2,33%
4 5,59 ± 0,28%
5 5,53 ± 0,72%
6 6,30 ± 0,06%
7 5,49 ± 1,53%
8 5,74 ± 1,37%
Elaborado por. Alejandro Osorio
El solvente empleado, ácido clorhídrico 1% en metanol, corresponde a una mezcla de
metanol acidificado, de uso frecuente para la obtención de estos compuestos aminados,
como indican (Zhang et al., 2014), ácido sulfúrico 0,1% en metanol, y (Tam, Nikolova-
Damyanova, & Pyuskyulev, 1995), ácido cítrico 2N en metanol.
También, es importante mencionar que la preferencia de este tipo extracción en frío, se
dio porque se disminuye el grado de afectación que experimentan los compuestos de
interés, frente a técnicas que incluyen calor. Otro criterio de selección para la extracción
por percolación, fue que siempre utiliza cambio de solvente, facilitando el proceso ya que
se evita la saturación, que ocurre en técnicas como la maceración (Sharapin, 2000).
Las cantidades de extracto total seco de la tabla 4-4, se obtuvieron mediante la
concentración del extracto total de Catharanthus roseus. Este procedimeinto se realizó
para elevar la concentración de los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en la
muestra, y reducir la probabilidad de contaminación de las muestras por microorganismos.
Los datos alcanzados permitieron culminar el proceso cuantitativo llevado a cabo durante
toda la estandarización. Además, se utilizaron en los cálculos posteriores, del desarrollo de
la metodología de cuantificación
42
Tabla 4-4. Determinación del rendimiento de extracto total obtenido por percolación ácida
Número de
muestra
Rendimiento promedio de
extracto seco (%)
1 29,04 ± 0,97%
2 30,16 ± 0,28%
3 29,17 ± 0,61%
4 25,10 ± 6,16%
5 28,76 ± 1,40%
6 28,09 ± 1,36%
7 27,93 ± 0,78%
8 27,42 ± 2,20%
Elaborado por. Alejandro Osorio
Las investigaciones citadas de, (Matsuura et al., 2014), (Zhang et al., 2014) y (Tam et
al., 1995), así como la presente no tuvieron por objetivo determinar la eficacia de
extracción de los alcaloides VC y VB, en función de la técnica empleada. Sin embargo, la
estandarización de la muestra de Catharanthus roseus, que fue desarrollada de forma
ordenada. Permitió establecer características iniciales como: humedad total y relativa,
contenido de fase lipídica y rendimiento de extracto seco, para considerarlas como un
parámetro de control, de la calidad del material vegetal empleado.
Pruebas preliminares.
Se realizaron 12 ensayos experimentales, para definir los parámetros de operación de
los factores accesorios, descritos en el apartado diseño experimental (Capitulo III).
La tabla 4-5 indica los valores de operación que fueron ensayados, a partir de los
criterios de selección, sugeridos por la United States Pharmacopeia Convention, (2015a).
Para los factores accesorios: longitud de banda ( ), % de humedad relativa ( ),
distancia de desarrollo ( ) y forma de la cámara cromatográfica ( ).
43
Tabla 4-5. Valores de operación de factores accesorios
Factor accesorio Valor de operación
Longitud de banda ( ) 6,0 mm
% de humedad relativa ( ) 33%
Distancia de desarrollo ( ) 70,0 mm
Forma de la cámara
cromatográfica ( )
Cámara gemela rectangular 40x40
Elaborado por. Alejandro Osorio
Mientras que, los valores de los ensayos del volumen de aplicación ( ), polaridad de
mezcla eluyente ( ), tiempo de activación de placa ( ) y pH, se tomaron de
investigaciones anteriores como: Magagula et al. (2012), Bladt (2009) y Paci, Mercier, &
Bourget (2003).
La fase móvil seleccionada presento la siguiente composición: [acetato de etilo:
metanol: hidróxido de amonio (3:7:1)], con un índice de polaridad de 4,44. Este valor fue
concordante con el índice de polaridad utilizado por la fase móvil reportada por (Bladt,
2009), que es de 4,47. Es importante mencionar que el pH de la fase móvil, asociado a la
presencia del hidróxido de amonio, eliminó colas y mejoró la compactación de las bandas
de separación de las muestras y de los estándares de los alcaloides de estudio.
La distribución de los compuestos en la placa cromatográfica, se definió en un máximo
de 8 pistas de siembra, de las cuales la 1, 3 y 7 de la figura 4-8, correspondían a las
muestras. El volumen de aplicaci n fue fijado en 4,5 μL, es importante mencionar que
debido al bajo contenido de vinblastina y vincristina reportado por (Matsuura et al., 2014)
y (Zhang et al., 2014), se estableció la adición de estándar interno, que se detalló en el
capítulo III, para la preparación de la muestra. Las pistas restantes corresponen a los
volúmenes de estándares de alcaloide de la tabla 4-6, que permitieron establecer los valores
de concentración en peso para la curva de calibración en placa, requerida para la
cuantificación posterior.
44
Tabla 4-6. Volúmenes y concentraciones en peso de los estándares de alcaloides de
estudio para elaboración de curva de calibración Volumen de siembra (μL) Concentración de peso (ng)
3,0 3000,00
3,5 3500,00
4,0 4000,00
5,0 5000,00
6,5 6500,00
Elaborado por. Alejandro Osorio
Finalmente, la figura 4-1 muestra las placas desarrolladas de vincristina y vinblastina
con los valores de operación fijados para factores accesorios descritos en este apartado.
Figura 4-1. Ensayo preliminar a 254nm, fase móvil: acetato de etilo: metanol: hidróxido
de amonio (3:7:1) Donde, St 1: Estándar 1, St 2: Estándar 2, St 3: Estándar 3, St 4: Estándar 4 y St 5: Estándar 5.
Aplicación del enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD).
Etapa 1 Perfil analítico objetivo (ATP).
La primera etapa del enfoque AQbD, definió el perfil analítico objetivo, ATP por sus
siglas en inglés, que debía cumplir la técnica analítica a desarrollarse. El ATP que se
planteo fue: desarrollar una técnica HPTLC que separe los alcaloides vincristina (VC) y
vinblastina (VB), permitiendo su posterior cuantificación. Como indica (Jadhav & Tambe,
45
2013a), el ATP planteado, además del objetivo esperado de la metodología, debía incluir
las características de desempeño que permitirían su cumplimiento. Estas se describen en la
tabla 4-7 a través de los parámetros esperados para la resolución y la linealidad.
Tabla 4-7. Descripción de las características de desempeñó planteadas en el perfil analítico
objetivo (ATP) para la técnica HPTLC de cuantificación de VC y VB
Características de
desempeño
Parámetros Criticidad
Resolución Mayor a 0, lo más cercana a 1 Mayor
Linealidad Expresión matemática que presente un R2:
0,99 o C ≤ 10%
Mayor
Elaborado por. Alejandro Osorio
Se seleccionaron la resolución y la linealidad como parámetros de medición de las
características de desempeño del método, tomando en consideración lo expuesto por
Jadhav & Tambe (2013a). Que indica que la decisión es exclusiva y a criterio del
investigador. Y se excluyeron: la exactitud, la repetibilidad, la reproducibilidad, el rango y
la robustez, porque se encuentran fuera del alcance planteado para esta investigación.
Además, como se describen en la guía ICH Q2-R1, corresponden a un proceso de
validación.
Etapa 2 Análisis de riesgos.
El análisis de riesgos, se realizó mediante la técnica de análisis de modos de falla y
efectos (FMEA). La matriz diseñada tomo en cuenta los posibles modos de falla, que se
producen en la realizacion de la metodología de cuantificación HPTLC, los cuales se
encuentran en las etapas de siembra y desarrollo.
Para su análisis se consideraron tres criterios: probabilidad de ocurrencia, impacto que
genera en la técnica y detectabilidad. La escala de ponderación empleada fue de 1 a 3,
donde 1 corresponde a baja calificación y 3 indica una alta calificación, para los criterios
de probabilidad e impacto. Sin embargo, el tercer criterio, debe resaltar el grado de
detectabilidad del modo de falla, por lo que se realiza una inversión en la escala de
ponderación, donde 1 es alta y 3 es baja.
46
Para determinar, si uno o más de los modos de falla planteados en la matriz FMEA,
deben recibir un control especial durante el desarrollo de la metodología, primero se
calculó el número de prioridad de riesgo, RPN por sus siglas en inglés, mediante la
ecuación 4-1.
Ecuación 4-1. Cálculo del RPN, (van Leeuwen et al., 2009).
A continuación, se dividió la escala de ponderación en tres categorías como indica la
tabla 4-8, conforme al valor de RPN obtenido, partiendo del valor máximo y mínimo de
RPN, que un modo de falla puede tomar, 27 y 1, respectivamente. Se debe mencionar que
la categorización de la escala de ponderación, se realiza de forma arbitraria por el
investigador.
Tabla 4-8. Categorías de los modos de falla, de acuerdo a RPN obtenido Escala de ponderación Criticidad
1-8 Baja
9-17 Media
18-27 Alta
Elaborado por. Alejandro Osorio
47
Tabla 4-9. Análisis de riesgos de metodología HPTLC, mediante técnica FMEA Nº Modo de Falla Probabilidad Impacto Detectabilidad RPN Medida Probabilidad Impacto Detectabilidad RPN
Siembra 1 Adsorción irregular en sitio
de siembra
2 3 1 6 Evitar utilización de
solventes que presentan
baja presión de vapor
1 3 1 3
2 Dispensación errónea de
volumen de siembra
2 2 1 4 Elaborar un registro de
uso de la jeringa, que
determine número de
inyecciones permitidas
Evitar formación de
burbujas de aire en la
jeringa de inyección
1 2 1 2
3 Sembrado atípico de la
banda de muestra para
cromatografía
2 3 1 6 Realizar ensayos previos
que determinen el mejor
solvente para
preparación de muestra
1 3 1 3
4 Taponamiento de la jeringa
de inyección de muestras
2 3 1 6 Utilizar solventes que
disminuyan la presencia
de partículas insolubles
en la solución a ser
inyectada
Recurrir al uso de filtros
previa la inyección de la
muestra
1 3 1 3
5 Sembrado de las bandas de
muestra a alturas no
uniformes
2 2 1 4 Revisar la posición de
siembra de la placa en el
equipo, previo al inicio
de la operación
1 2 1 2
Desarrollo 6 Separación de la fase móvil 2 3 2 12 Agitación manual o
mecánica de 1 min. de la
fase móvil previa
utilización, que genere
un sistema estable en el
tiempo de uso
1 3 2 6
7 Inadecuada saturación de
cámara
2 3 3 18 Configurar un tiempo de
saturación mínimo de 20
min.
1 3 3 9
8 Distancia de corrido 2 3 2 12 Establecer una distancia 1 3 2 6
48
deficiente, de las manchas
durante cromatografía
de desarrollo de placa
entre 60-80mm
Elaborado por. Alejandro Osorio
Nº Modo de Falla Probabilidad Impacto Detectabilidad RPN Medida Probabilidad Impacto Detectabilidad RPN
9 Aparición de ruido
prominente en diferentes
carriles de la placa
2 3 3 18 Acondicionar la placa en
el equipo y/o externo,
previo a su utilización
para alcanzar
homogeneidad de puntos
activos de la fase
estacionaria
1 3 3 9
10 Deficiente resolución de
las manchas
3 3 2 18 Desarrollar ensayos
preliminares para definir
volumen de siembra,
proporción de fase móvil
y tipo de fase
estacionaria
2 3 2 12
11 Presencia de efecto borde
en placa desarrollada
2 2 1 4 Definir una distancia de
siembra del eje x de
15mm, para la primera y
la última banda de
siembra de la placa
1 2 1 2
49
Este tipo de técnicas no se realizan bajo el criterio de una sola persona, sino que se
precisan la participación de varios colaboradores, con diferentes competencias, (van
Leeuwen et al., 2009). Por ello la tabla 4-9, se construyó con el aporte de un equipo
multidisciplinario, conformado por docentes miembros del tribunal del trabajo de
investigación. Quienes con sus conocimientos sobre la técnica HPTLC, orientada al
análisis de compuestos de origen natural, así como la gestión de calidad, a nivel de la
industria farmacéutica, contribuyeron a la aplicación de este análisis de riegos conforme a
los principios de AQbD.
Se plantearon once posibles modos de falla (tabla 4-9) entre las etapas de siembra y
desarrollo de la técnica HPTLC. Los cinco modos de falla de la etapa de siembra
presentaron RPNs entre 4 y 6, por lo que se catalogaron como de baja criticidad (tabla 4-8).
Por lo que las acciones correctivas planteadas en la tabla 4-9, se enfocaron hacia la
optimización en el uso del instrumental y la adecuada preparación de la muestra. Mientras
que los seis modos de falla de la etapa del desarrollo, obtuvieron RPNs entre 12 y 18, es
decir que su criticidad se encontraba entre media y alta. Para todos ellos se planteó una o
más medidas correctivas, que disminuyeran su valor de RPN.
La disminución fue satisfactoria para los modos de falla 6, 8 y 11, porque se consiguió
cambiar su nivel criticidad de medio a bajo. Sin embargo, para las fallas 7, 9 y 10, el
planteamiento de las medidas correctivas respectivas, (ver tabla 4-9) solo varió la
criticidad, de alta a media.
El nivel de criticidad medio, confirmó que los agentes causantes de los modos de falla
7, 9 y 10, si debían ser considerados como variables de estudio. Para entender su relación
funcional con la respuesta esperada del método HPTLC que se desarrollaba. Mediante un
análisis estadístico, derivado del planteamiento de un diseño experimental.
Etapa 3 Diseño Experimental (DOE).
La tabla 4-10, indica la aleatorización de la matriz experimental estandarizada (ver tabla
3-4), realizada con el software JMP©, para reducir la variabilidad, introducida por el
investigador. Se debe mencionar que la matriz aleatorizada, fue utilizada para los ensayos
de los alcaloides de estudio (vincristina y vinblastina).
50
Tabla 4-10. Matriz de experimentos aleatorizada N° corrida
experimental
Tiempo de
saturación de
cámara ( )
Tiempo de
preacondicionamiento
de placa ( )
Grado de modificación
de fase estacionaria ( )
2 +1 −1 −1
6 +1 −1 +1
5 −1 −1 +1
8 +1 +1 +1
3 −1 +1 −1
4 +1 +1 −1
1 −1 −1 −1
7 −1 +1 +1
Elaborado por. Alejandro Osorio
La distribución de las pistas de siembra en placa, para cada tratamiento de los alcaloides
de estudio, se realizó de acuerdo al orden indicado en la tabla 4-11. Al finalizar el proceso
de desarrollo cromatográfico, se registraron las fotográfias de las placas a una longitud de
onda de 254nm en modo de fluorescencia. Y mediante el software VideoScan, las
imágenes obtenidas de cada tramiento, generaron los espectros de las muestras y estándares
de alcaloides VC y VB, en un formato no editable (.cpf). La información que registraron
los espectros: inicial, máximo y final, se utilizó para el cálculo de la resolución de
los alcaloides de estudio, que se indica en el siguiente apartado.
Tabla 4-11. Distribución de pistas de siembra en placa para análisis HPTLC Pista de siembra Compuesto aplicado
1 Muestra correspondiente a replica 1
2 Estándar 1
3 Muestra correspondiente a replica 2
4 Estándar 2
5 Estándar 3
6 Estándar 4
7 Muestra correspondiente a replica 3
8 Estándar 5
Elaborado por. Alejandro Osorio
Determinación de Resolución de Vincristina (VC) y Vinblastina (VB).
La figura 4-2 indica la placa desarrollada a 254nm, del tratamiento Ts1A-1 -1 para el
alcaloide vincristina. Donde las pistas 1, 3 y 7, pertenecientes a las muestras del extracto
total de Catharanthus roseus, mostraron 2 bandas cromatográficas. Las posiciones de
51
máximo de los compuestos de la pista 1 (réplica 1) fueron: 0,724 y 0,749, respectivamente.
Es importante indicar que, en el apartado Cuantificación de alcaloides vincristina y
vinblastina en muestras estandarizadas de Catharanthus Roseus, se hace referencia a la
concordancia entre los valores de máximo entre las muestras y los estándares de
alcaloide. Que permitió el proceso de cuantificación de VC y VB.
Figura 4-2. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
En la fotografía de la placa, así como en los espectros generados por VideoScan
presentados en las figuras 4-3, 4-4 y 4-5, se evidenció una separación entre los compuestos
observados; que se expresó en términos de resolución ( ).
El tratameinto Ts1A-1 -1, obtuvo un valor de resolución de 0,34 (tabla 4-16), que se
calculo con la ecuación 2-3; utilizando los datos de de la replica 1 señalados en la tabla
4-12.
52
Figura 4-3. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
Tabla 4-12. correspondientes a replica 1 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
1 Muestra 19 0,648 0,721 0,741 5289,5 139756,9
1 Muestra 19 0,741 0,749 0,813 4664,6 96408,6
Elaborado por. Alejandro Osorio
Figura 4-4. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
53
Tabla 4-13. correspondientes a replica 2 del tratamiento Ts1A-1 1 (vincristina) Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
2 Muestra 15 0,674 0,727 0,749 4928,1 117502,6
2 Muestra 15 0,749 0,756 0,809 3754,0 740408,2
Elaborado por. Alejandro Osorio
Figura 4-5. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina)
Tabla 4-14. correspondientes a replica 3 del tratamiento Ts1A-1 -1 (vincristina) Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
3 Muestra 4 0,660 0,725 0,747 4770,0 119382,3
3 Muestra 4 0,747 0,750 0,798 3528,5 60697,4
Elaborado por. Alejandro Osorio
Los tratamientos, así como las replicas restantes de ambos alcaloides, utilizaron igual
procedimiento (aleatorización y distribución de carriles de siembra en placa) para obtener
las placas desarrolladas (Anexo E), los espectros de separación (Anexo E) y los datos de Rf
cuyos resultados se presentan en la tabla 4-15.
54
Tabla 4-15. Valores de , de los alcaloides de estudio, correspondientes a la matriz de experimentos aleatorizada
Alcaloide Vincristina
Tratamiento Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
Ts1A-1 1
1 Muestra 22 0,660 0,717 0,750 5119,6 156612,5
1 Muestra 22 0,750 0,781 0,822 4665,8 133022,8
2 Muestra 3 0,670 0,730 0,764 5312,5 166910,4
2 Muestra 3 0,764 0,791 0,898 4571,0 177903,2
3 Muestra 11 0,689 0,732 0,770 5018,1 146893,0
3 Muestra 11 0,770 0,795 0,840 4211,1 115938,5
Ts-1A-1 1
1 Muestra 18 0,689 0,733 0,770 2264,2 72334,7
1 Muestra 18 0,770 0,805 0,837 2027,4 55763,6
2 Muestra 24 0,669 0,735 0,767 2512,2 74886,3
2 Muestra 24 0,786 0,809 0,842 2062,9 51795,3
3 Muestra 20 0,679 0,735 0,776 2703,8 75502,0
3 Muestra 20 0,782 0,815 0,846 2253,5 62247,4
Ts1A1 1
1 Muestra 14 0,628 0,676 0,706 4835,2 136084,4
1 Muestra 14 0,706 0,729 0,797 4006,2 132124,8
2 Muestra 23 0,637 0,686 0,721 4727,3 135471,6
2 Muestra 23 0,721 0,743 0,805 3616,9 106868,2
3 Muestra 9 0,628 0,690 0,721 5537,4 161162,5
3 Muestra 9 0,721 0,743 0,809 4215,6 133921,0
Ts-1A1 -1
1 Muestra 17 0,616 0,671 0,747 -------- ------------
2 Muestra 13 0,608 0,676 0,749 -------- ------------
3 Muestra 1 0,620 0,680 0,768 -------- ------------
Ts1A1 1
1 Muestra 8 0,611 0,666 0,740 -------- ------------
2 Muestra 16 0,629 0,674 0,758 -------- ------------
3 Muestra 7 0,615 0,682 0,773 -------- ------------
55
Tratamiento Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
Ts-1A-1 -1
1 Muestra 21 0,663 0,716 0,735 4701,5 109962,4
1 Muestra 21 0,741 0,747 0,800 3490,6 60795,4
2 Muestra 2 0,679 0,728 0,745 4939,1 110529,5
2 Muestra 2 0,745 0,753 0,805 4130,3 80094,4
3 Muestra 6 0,673 0,726 0,747 4222,4 93522,0
3 Muestra 6 0,747 0,759 0,794 3062,7 50807,5
Ts-1A1 1
1 Muestra 12 0,602 0,671 0,698 4420,5 140274,9
1 Muestra 12 0,698 0,713 0,770 3933,4 112028,2
2 Muestra 10 0,620 0,682 0,708 4655,5 145483,4
2 Muestra 10 0,708 0,725 0,784 4105,9 124243,4
3 Muestra 5 0,649 0,696 0,723 4695,7 127808,6
3 Muestra 5 0,723 0,754 0,821 4044,2 136302,7
Alcaloide Vinblastina
Ts1A-1 -1
1 Muestra 19 0,646 0,719 0,736 5076,6 121617,8
1 Muestra 19 0,736 0,754 0,809 4461,2 93874,4
2 Muestra 15 0,674 0,729 0,748 5068,4 112568,1
2 Muestra 15 0,748 0,760 0,818 4062,1 82814,7
3 Muestra 4 0,654 0,729 0,746 5083,8 125235,6
3 Muestra 4 0,746 0,758 0,803 4228,8 75513,9
Ts1A-1 1
1 Muestra 22 0,666 0,736 0,775 4824,4 158087,4
1 Muestra 22 0,775 0,814 0,884 4384,5 136144,3
2 Muestra 3 0,672 0,722 0,761 4555,4 132728,2
2 Muestra 3 0,761 0,798 0,841 4144,4 115023,6
3 Muestra 11 0,662 0,713 0,751 4415,5 128667,3
3 Muestra 11 0,751 0,794 0,845 4134,6 134317,3
56
Tratamiento Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
Ts-1A-1 1
1 Muestra 18 0,676 0,723 0,760 4753,6 130424,2
1 Muestra 18 0,760 0,799 0,842 4230,5 124348,7
2 Muestra 24 0,659 0,721 0,764 4415,4 137962,5
2 Muestra 24 0,764 0,805 0,865 3700,9 125709,3
3 Muestra 20 0,661 0,715 0,758 4606,8 151072,8
3 Muestra 20 0,758 0,797 0,856 4072,0 142074,6
Ts1A1 1
1 Muestra 14 0,615 0,667 0,698 5188,7 150908,9
1 Muestra 14 0,698 0,730 0,802 5298,9 196170,8
2 Muestra 23 0,615 0,673 0,708 4488,2 146280,5
2 Muestra 23 0,708 0,733 0,792 3914,0 127503,9
3 Muestra 9 0,607 0,656 0,693 4254,3 134865,3
3 Muestra 9 0,693 0,730 0,796 3985,0 149994,2
Ts-1A1 -1
1 Muestra 17 0,603 0,661 0,732 -------- ------------
2 Muestra 13 0,609 0,663 0,747 -------- ------------
3 Muestra 1 0,615 0,665 0,683 -------- ------------
3 Muestra 1 0,683 0,685 0,747 -------- ------------
Ts1A1 -1
1 Muestra 8 0,604 0,651 0,725 -------- ------------
2 Muestra 16 0,608 0,653 0,665 -------- ------------
3 Muestra 7 0,616 0,669 0,755 -------- ------------
Ts-1A-1 -1
1 Muestra 21 0,675 0,718 0,735 5077,5 103754,4
1 Muestra 21 0,735 0,747 0,798 4579,1 93419,7
2 Muestra 2 0,679 0,724 0,739 4937,6 103105,9
2 Muestra 2 0,739 0,749 0,809 4510,4 97079,9
3 Muestra 6 0,671 0,710 0,732 4970,6 107465,2
3 Muestra 6 0,732 0,741 0,802 4368,4 85040,2
57
Tratamiento Replica Compuesto inicial máximo final H máx. A máx.
Ts-1A1 1
1 Muestra 12 0,618 0,681 0,710 4924,6 158770,9
1 Muestra 12 0,710 0,738 0,818 5041,8 181161,1
2 Muestra 10 0,609 0,677 0,705 4672,1 157869,0
2 Muestra 10 0,705 0,734 0,793 4978,9 155828,8
3 Muestra 5 0,618 0,671 0,701 4498,4 128970,3
3 Muestra 5 0,701 0,730 0,806 4297,7 153399,2
Elaborado por. Alejandro Osorio
58
Finalmente, a partir de los datos de de la tabla 4-15, correspondientes a la primera
replica de cada tratamiento, y mediante la aplicación de la ecuación 2-3, se obtuvieron los
valores de resolución ( ) de vincristina y vinblastina, que se presentan en la tabla 4-16
Tabla 4-16. Valores de resolución ( ) de alcaloides de estudio en orden estándar Resolución de alcaloide vincristina
N° Corrida Experimental Tratamiento 1 Ts-1A-1 E-1 0,47
2 Ts1A-1 E-1 0,34
3 Ts-1A1 E-1 0,00
4 Ts1A1 E-1 0,00
5 Ts-1A-1 E1 0,97
6 Ts1A-1 E1 0,79
7 Ts-1A1 E1 0,50
8 Ts1A1 E1 0,63
Resolución de alcaloide vinblastina
1 Ts-1A-1 E-1 0,47
2 Ts1A-1 E-1 0,43
3 Ts-1A1 E-1 0,00
4 Ts1A1 E-1 0,00
5 Ts-1A-1 E1 0,92
6 Ts1A-1 E1 0,72
7 Ts-1A1 E1 0,57
8 Ts1A1 E1 0,67
Elaborado por. Alejandro Osorio
Los valores de resolución ( ) de la tabla 4-16, no presentan homogeneidad entre los
datos, lo cual se consideró como un primer indicativo, de la existencia de efectos asociados
a las variables , y , así como a sus respectivas combinaciones.
Cálculo de los efectos sobre la respuesta.
Los efectos de los factores de estudio sobre la resolución ( ), se calcularon mediante el
algoritmo de Yates con los datos de la tabla 4-16. Determinándose la magnitud y sentido,
para los efectos de , y yo sus respectivas combinaciones (tablas 4-17 y 4-18)
conforme al procedimiento descrito en el Anexo D.
59
Tabla 4-17. Cálculo de efectos para de vincristina mediante algoritmo de Yates
N° Corrida
Experimental
Variables de
matriz
experimental
Algoritmo Identificación
Respuesta
Experimental
(1) (2) (3) Divisor Efectos
1 - - - 0,47 0,81 0,81 3,70 8 0,46 Promedio
2 + - - 0,34 0,00 2,89 -0,18 4 -0,05 Ts
3 - + - 0,00 1,76 -0,13 -1,44 4 -0,36 A
4 + + - 0,00 1,13 -0,05 -0,44 4 -0,11 Ts . A
5 - - + 0,97 -0,13 -0,81 2,08 4 0,52
6 + - + 0,79 0,00 -0,63 0,08 4 -0,03 Ts .
7 - + + 0,50 -0,18 0,13 0,18 4 0,05 A .
8 + + + 0,63 0,13 0,31 0,18 4 0,05 Ts . A .
Elaborado por. Alejandro Osorio
Tabla 4-18. Cálculo de efectos para de vinblastina mediante algoritmo de Yates N° Corrida
Experimental
Variables de
matriz
experimental
Algoritmo Identificación
Respuesta
Experimental
(1) (2) (3) Divisor Efectos
1 - - - 0,47 0,90 0,90 3,78 8 0,47 Promedio
2 + - - 0,43 0,00 2,88 -0,14 4 0,04 Ts
3 - + - 0,00 1,64 -0,44 -1,30 4 -0,33 A
4 + + - 0,00 1,24 -0,10 -0,34 4 -0,09 Ts . A
5 - - + 0,92 -0,04 -0,90 1,98 4 0,50
6 + - + 0,72 0,00 -0,40 -0,06 4 -0,02 Ts .
7 - + + 0,57 -0,20 0,04 0,50 4 0,13 A .
8 + + + 0,67 0,10 0,30 0,26 4 0,07 Ts . A .
Elaborado por. Alejandro Osorio
A partir de los valores de los efectos de los alcaloides de estudio de las tablas 4-17 y 4-
18, se construyó la tabla 4-19. Esta agrupó los datos de los alcaloides VC y VB en tres
categorías de efectos: primarios, secundarios y ternario.
60
Tabla 4-19. Resumen de efectos analizados para resolución de alcaloides de estudio
Alcaloide vincristina
Tipo de efecto Variables Valor de efecto
Primarios
-0,05
-0,36
0,52
Secundarios
. -0,11
. 0,02
. 0,05
Ternario . . 0,05
Alcaloide vinblastina
Primarios
-0,04
-0,33
0,50
Secundarios
. -0,09
. -0,02
. 0,13
Ternario . . 0,07
Elaborado por. Alejandro Osorio
Cálculo de la significancia estadística de los efectos.
La significancia estadística de los efectos se calculó mediante la réplica del diseño
completo. Para ello se utilizaron los valores que indican las tablas 4-20 y 4-21, para
determinar la desviación estándar de los efectos ( ), mediante la ecuación 3-2.
Tabla 4-20. Determinación de desviación estándar de la respuesta (Vincristina) N° Corrida Experimental Tratamiento Desviación estándar de
las réplicas (Sreplica)
Desviación
estándar de la
respuesta (Sresp)
2 Ts1A-1 -1 0,03
0,05
6 Ts1A-1 1 0,15
5 Ts-1A-1 1 0,02
8 Ts1A1 1 0,05
3 Ts-1A1 -1 0,00
4 Ts1A1 -1 0,00
1 Ts-1A-1 -1 0,07
7 Ts-1A1 1 0,08
Elaborado por. Alejandro Osorio
61
Se debe recordar que la investigación estableció un intervalo de confianza (I.C.) para la
resoluci n del 95% 2 σ . Por ello como indica (Box et al., 2009), la desviación estándar
del efecto ( es para vincristina y para vinblastina, como muestran la
tabla 4-22.
Tabla 4-21. Determinación de desviación estándar de la respuesta (Vinblastina) N° Corrida Experimental Tratamiento Desviación estándar de
las réplicas (Sreplica)
Desviación
estándar de la
respuesta (Sresp)
2 Ts1A-1 -1 0,05
0,07
6 Ts1A-1 1 0,08
5 Ts-1A-1 1 0,02
8 Ts1A1 1 0,07
3 Ts-1A1 -1 0,18
4 Ts1A1 -1 0,04
1 Ts-1A-1 -1 0,05
7 Ts-1A1 1 0,03
Elaborado por. Alejandro Osorio
Tabla 4-22. Resumen de efectos ± SEfecto para resolución de alcaloides de estudio
Alcaloide vincristina
Tipo de efecto Variables Valor de efecto
Primarios
-0,05 ± 0,05
-0,36 ± 0,05
0,52 ± 0,05
Secundarios
. -0,11 ± 0,05
. 0,02 ± 0,05
. 0,05 ± 0,05
Ternario . . 0,05 ± 0,05
Alcaloide vinblastina
Primarios
-0,04 ± 0,07
-0,33 ± 0,07
0,50 ± 0,07
Secundarios
. -0,09 ± 0,07
. -0,02 ± 0,07
. 0,13 ± 0,07
Ternario . . 0,07 ± 0,07
Elaborado por. Alejandro Osorio
Es importante mencionar que para los dos alcaloides el efecto ternario ( . . ), es
estadísticamente no significativo, porque que su valor es similar a la , esto indica que,
62
. . no se distingue del ruido propio de la experimentación realizada, que concuerda
con la teoría planteada (Vega, 2016).
Tabla 4-23.Significancia estadística de los efectos , , y sus respectivas
interacciones sobre de vincristina
Efecto Significancia estadística
Ts Estadísticamente no significativo
A Estadísticamente significativo
Estadísticamente significativo
Ts . A Estadísticamente significativo
Ts . Estadísticamente no significativo
A . Estadísticamente no significativo
Ts . A . Estadísticamente no significativo
Elaborado por. Alejandro Osorio
Tabla 4-24. Significancia estadística de los efectos , , y sus respectivas
interacciones sobre de vinblastina
Efecto Significancia estadística
Ts Estadísticamente no significativo
A Estadísticamente significativo
Estadísticamente significativo
Ts . A Estadísticamente significativo
Ts . Estadísticamente no significativo
A . Estadísticamente significativo
Ts . A . Estadísticamente no significativo
Elaborado por. Alejandro Osorio
Los datos de las tablas 4-22 y 4-23, correspondientes al alcaloide vincristina, mostraron
que el mayor incremento en el número de unidades de resolución, +0,52; solo estaba
asociado al efecto del grado de modificación de la fase estacionaria ( ). La influencia
positiva producida por el cambio en el grado de modificación de la fase estacionaria ( ),
desde – 1 (nano sílica-C18-50) a +1 (nano sílica-C18-100), mejora las propiedades de
retención, debido a la mayor accesibilidad de grupos silanol de la fase estacionaria. Al
existir todavía un 45% de grupos silanol reactantes en la superficie de la placa, se favorece
el modelo interfacial de distribución del soluto (alcaloide VC) entre el bulk de la fase
63
móvil y la superficie de fase estacionara solvatada, implicado en la separación de los
compuestos (Poole, 2014), (Spangenberg et al., 2014).
Los decrementos estadísticamente significativos de , pudieron ser atribuidos a la
combinación Ts . A y al tiempo de preacondicionamiento de placa (A). Sin embargo, entre
estos efectos de influencia negativa, el tiempo de preacondicionamiento de placa (A)
presentó un mayor valor de reducción en unidades de resolución, que fue de –0,36. La
variación en el tiempo de preacondicionameinto de placa (A), desde – 1 (10 minutos) a +1
(20 minutos) y que ocurre a continuación de la saturación de cámara, si se realiza durante
exposiciones prolongadas generalmente no produce mejoras en la separación; porque se
favorece la saturación adsortiva o preacondicionameinto extremo de la capa. Que genera
una separación del estado de equilibrio, entre la capa de moléculas de fase móvil que
recubren la superficie de la fase estacionaria con la fase de vapor saturada. Reduciendo el
número de centros activos que podían ser ocupados en el transcurso de los sucesivos
intercambios entre las moléculas de la muestra (alcaloide VC), las de la fase móvil y las de
la fase de vapor (Camag, 2016), (United States Pharmacopeia Convention, 2015a),
(Spangenberg et al., 2014).
Para el alcaloide vinblastina (VB), las tablas 4-22 y 4-24, indican que el incremento en
unidades de resolución, también se produjo por la combinación A. , y al grado de
modificación de la fase estacionaria ( ). Al igual que para el alcaloide vincristina, el
efecto del grado de modificación de la fase estacionaria ( ), presento el valor más
elevado, que fue de +0,50 unidades de resolución. Por otro lado, los efectos del tiempo de
preacondicionameinto de placa (A) y la combinación de Ts . A, generaron una influencia
negativa sobre la resolución. Siendo el decremento de –0,33 unidades de resolución, el de
mayor valor, relacionado con el cambio en el tiempo de preacondicionamiento de placa
(A).
Los alcaloides de estudio compartieron la influencia positiva sobre la resolución ( ,
debida al efecto del grado de modificación de la fase estacionaria ( ). Mientras que la
influencia negativa se relacionaba a los efectos del tiempo de preacondicionameinto de
placa (A) y la combinación de Ts . A.
64
Es importante mencionar que las características del análisis estadístico aplicado en esta
investigación, permitieron establecer modelos matemáticos de comportamiento dentro de
la región experimental estudiada (-1 y 1).
Las ecuaciones 4-2 y 4-3 que resumen el comportamiento de la resolución ( , también
pueden ser aplicables a valores codificados externos de la zona de estudio, para dar mayor
relevancia al análisis realizado en la presente investigación
Ecuación 4-2. Modelo matemático que describe el comportamiento de en función de los efectos estadísticamente significativos (Vincristina)
Ecuación 4-3. Modelo matemático que describe el comportamiento de en función de los
efectos estadísticamente significativos (Vinblastina)
Etapa 4 Estrategias de control.
A partir de los datos obtenidos de la etapa 4 del enfoque de calidad, se plantearon
criterios de control, que deberían ser considerados para que la metodología HPTLC
desarrollada, pueda ser utilizada como un análisis rutinario. Siendo el más importante, la
configuración de parámetros de desarrollo cromatográfico, de la tabla 3-1 correspondientes
a las variables tiempo de saturación de cámara (Ts), grado de modificación de la fase
estacionaria ( ) y tiempo de preacondicionameinto de placa (A), con los valores del
tratamiento Ts-1A-1 1. Como indica la tabla 4-16, este tratamiento presentó el mayor
incremento sobre las unidades de resolución de los alcaloides: 0,52 ± 0,05 para vincristina
y 0,50 ± 0,07 para vinblastina.
Etapa 5 Mejora continua.
La última etapa del enfoque de calidad AQbD, para el desarrollo de la metodología de
cuantificación HPTLC de los alcaloides VC y VB, no se llevó a cabo. Porque precisaba la
elaboración de un historial de análisis con los parámetros definitivos de operación, que
65
permitiese comparar en diferentes intervalos de tiempo las tendencias y comportamientos
de los resultados de los análisis. Y a partir de estos, dependiendo de los datos proponer
acciones que aporte a la mejora del método analítico.
Cuantificación de alcaloides vincristina y vinblastina en las muestras
estandarizadas de Catharanthus roseus.
De acuerdo a los parámetros de desempeño del enfoque de calidad AQbD, establecidos
en el ATP (véase tabla 4-7), se seleccionaron los valores de operación del tratamiento Ts-
1A-1 1, para la cuantificación de los alcaloides de estudio. Esta selección, se justificó
porque los valores elevados de resolución (véase tabla 4-16), evidenciaron una mejor
separación de los compuestos presentes en la muestra, que aseguran que los valores
calculados correspondan al contenido real de los alcaloides VC y VB. Además, existió una
coincidencia de los valores de máximo entre las muestras y los estándares de alcaloide
VC y VB, como indica la tabla 4-25, que permite llevar a cabo el proceso de
cuantificación.
Tabla 4-25. Valores de máximo de muestras analizadas y estándares de alcaloides VC y
VB Tratamiento Muestras Estándares de alcaloides de estudio
Replica 1 Replica 2
Replica 3
Ts-1A-1 1
(Vincristina)
0,733 0,735 0,735 0,744 ± 0,0186
Ts-1A-1 1
(Vinblastina)
0,723 0,721 0,715 0,733 ± 0,0183
Elaborado por. Alejandro Osorio
Para la construcción de las curvas de calibración, que permitieron la cuantificación de
los alcaloides VC y VB, se utilizaron los valores indicados en el anexo F, que
corresponden a la razón de frentes ( ), la altura y al área de los diferentes volúmenes (3,0;
3,5; 4,0; 5,0 y 6,5μL) de estándares de alcaloides vincristina y vinblastina. Sin embargo, la
configuración del software VideoScan, también requeria los valores de concentración en
peso de los estándares de alcaloides, que se indican en la tabla 4-26; para completar el
proceso matemático, que determinó el contenido de VC y VB (ver tabla 4-27), en el
volumen de siembra de la muestra (4,5 µL).
66
Tabla 4-26. Contenido en peso de los estándares correspondientes al tratamiento Ts-1A-
1 1 para la cuantificación de los alcaloides de estudio Contenido en
peso (ng)
Tratamiento
Estándar 1
Estándar 2 Estándar 3 Estándar 4 Estándar 5
Ts-1A-1 1 (Vincristina)
3069,00 3580,50 4092,00 5115,00 6649,50
Ts-1A-1 1 (Vinblastina)
3043,64 3550,91 4058,18 5072,73 6594,55
Elaborado por. Alejandro Osorio
Las curvas de calibración obtenidas, se indican en el Anexo G, para para las siguientes
relaciones: altura vs. contenido en peso y área vs. contenido en peso. Tanto para los ajustes
de tipo lineal y polinomial. Sin embargo, puesto que el proceso empleado para la
cuantificación fue mediante fotodocumentación, es adecuado seleccionar el ajuste
polinomial, como suguiere Srivastava (2011).
Tabla 4-27.Valores de VC y VB obtenidos de la cuantificación mediante VideoScan
Tratamiento Replica Contenido alcaloide (ng)
Ts-1A-1Fe1
(Vincristina)
1 659,18
2 1156,67
3 1273,91
Ts-1A-1Fe1
(Vinblastina)
1 483,49
2 913,66
3 721,12
Elaborado por. Alejandro Osorio
La tabla 4-28 indica las expresiones matemáticas de tipo polinomial, para la
cuantificación de los alcaloides de estudio vincristina y vinblastina. Las ecuaciones
obtenidas (véase tabla 4-28) presentaron un coeficiente de variación (%CV), que cumple
con los parámetros previamente establecidos en el ATP del método analítico desarrollado.
67
Tabla 4-28. Características de desempeño (linealidad), obtenida conforme del ATP,
propuesto Características de
desempeño
Parámetros Resultado
Linealidad Expresión matemática que
presente un C ≤ 10%
VC: y = -0,0005x2 + 9,8096x + 39168
%CV = 5,6 %
VB: y = -0,0001x2 + 1,6564x - 724,7
%CV = 4,03%
Elaborado por. Alejandro Osorio
El contenido de alcaloides VC y VB, de la tabla 4-27, se dan en referencia al volumen
de muestra analizado (4,5 µL), sin embargo el alcance de la investigación, precisaba
expresar la cantidad de VC y VB en muestra seca. Por ello en la tabla 4-29 se indica el
contenido en gramos de los alcaloides expresado por cada 100 g de planta seca, cuyos
valores son semejantes a los presentados ene otras investigaciones tales como Matsuura et
al. (2014) y Zhang et al. (2014).
Tabla 4-29. Contenido de alcaloide vincristina y vinblastina por cada 100g de muestra
seca Alcaloide Replica Contenido en g por 100g
de muestra seca (MS)
Contenido promedio en g por
100g de muestra seca (MS)
Vincristina 1 0,00263
0,00420 ± 0,00136 g 2 0,00497
3 0,00501
Vinblastina 1 0,00204
0,00267 ± 0,00065 g 2 0,00334
3 0,00262
Elaborado por. Alejandro Osorio
68
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones.
Se estandarizo la muestra seca de Catharanthus roseus, mediante homogenización del
tamaño de partícula y determinación de humedad total y relativa, presentando las
características que indica la tabla 5-1.
Tabla 5-1. Características de la muestra seca estandarizadas de Catharanthus roseus Tamaño de partícula
(μm)
% humedad total %humedad relativa
850 83,07 ± 0,82 % 5,12 ± 0,20 %
Elaborado por. Alejandro Osorio
Se obtuvo por el método de percolación ácida, a partir de la muestra estandarizada de C.
roseus, los porcentajes de extracto total seco que se indican en la tabla 5-2. Se debe
manifestar que el extracto en mención, de acuerdo a las pruebas cualitativas realizadas
contenía los alcaloides vincristina y vinblastina, respectivamente.
69
Tabla 5-2. Rendimiento de extracto seco de Catharanthus roseus, para los diferentes
tratamientos ensayados
N° Corrida
Experimental
Tratamiento Rendimiento promedio
de extracto seco (%)
1 Ts1A-1 -1 29,04 ± 0,97 %
2 Ts1A-1 1 30,16 ± 0,28 %
3 Ts-1A-1 1 29,17 ± 0,61 %
4 Ts1A1 1 25,10 ± 6,16 %
5 Ts-1A1 -1 28,76 ± 1,40 %
6 Ts1A1 -1 28,09 ± 1,36 %
7 Ts-1A-1 -1 27,93 ± 0,78 %
8 Ts-1A1 1 27,42 ± 2,20 %
Elaborado por. Alejandro Osorio
Se aplicó el enfoque de Analytical Quality by Design (AQbD), para desarrollar la
metodología de cuantificación por cromatografía en capa fina de alto rendimiento
(HTPLC) para los alcaloides vincristina y vinblastina, en muestra seca estandarizada de
Catharanthus roseus. Se determinaron los efectos estadísticamente significativos y los
modelos matemáticos de comportamiento de para los alcaloides de estudio, que se
presentan en las tablas 5-3 y 5-4, respectivamente.
Tabla 5-3. Efectos estadísticamente significativos y modelo matemático de
comportamiento para de alcaloide VC Efecto resolución VC Estimado
Efectos principales
A -0,36 ± 0,05
0,52 ± 0,05
Efectos de interacción de 2 factores
Ts . A -0,11 ± 0,05
Modelo matemático de comportamiento de
Elaborado por. Alejandro Osorio
70
Tabla 5-4. Efectos estadísticamente significativos y modelo matemático de
comportamiento para de alcaloide VB Efecto resolución VB Estimado
Efectos principales
A -0,33 ± 0,07
0,50 ± 0,07
Efectos de interacción de 2 factores
Ts . A -0,09 ± 0,07
A . 0,13 ± 0,07
Modelo matemático de comportamiento de
Elaborado por. Alejandro Osorio
Se cuantificaron los alcaloides vincristina y vinblastina presentes en muestras
estandarizadas de Catharanthus roseus, mediante el método de cromatografía en capa fina
de alto rendimiento (HTPLC). Se empleó para el cálculo de la tabla 5-5, el tratamiento Ts-
1A-1 1, porque presentó los mejores resultados de resolución.
Tabla 5-5. Cuantificación de alcaloides de estudio en muestra seca (MS) de Catharanthus
roseus Alcaloide Contenido en g por 100g de muestra seca (MS)
Vincristina 0,00420 ± 0,00136 g
Vinblastina 0,00267 ± 0,00065 g
Elaborado por. Alejandro Osorio
Se comprobó la hipótesis nula de la investigación, que indica que la aplicación del
enfoque Analytical Quality by Design (AQbD) si permitió el desarrollo una metodología
de cuantificación por medio de cromatografía en capa fina de alto rendimiento, para los
alcaloides vincristina y vinblastina, presentes en Catharanthus roseus.
71
Recomendaciones
Se recomienda utilizar las condiciones correspondientes al tratamiento TS-1A-1 1, de
la metodología de cuantificación de los alcaloides de estudio, para generar un historial de
análisis y obtener una cantidad suficiente de datos. Para desarrollar una estandarización del
método analítico, que incluya el parámetro de precisión, en términos de repetibilidad y
reproducibilidad.
A continuación, realizar el proceso de validación respectiva, como indica la ICH-Q2R1,
para metodologías de cuantificación, permitiendo que el método propuesto pueda ser
utilizado como un análisis de rutina, en el laboratorio que asi lo requiera.
72
Bibliografía
1. Agencia Nacional de Regulación, C. y V. S., & Pública, M. de S. NORMATIVA
TÉCNICA SANITARIA SUSTITUTIVA PARA LA OBTENCIÓN DEL
REGISTRO SANITARIO Y CONTROL DE PRODUCTOS NATURALES
PROCESADOS DE USO MEDICINAL, Y DE LOS ESTABLECIMIENTOS EN
DONDE SE FABRICAN, ALMACENAN, DISTRIBUYEN Y
COMERCIALIZAN., RESOLUCIÓN ARCSA-DE-XXXX-2015-GGG 1–25
(2015). Ecuador: Ministerio de Salud Pública. http://doi.org/10.1007/s13398-014-
0173-7.2
2. Agency, E. M. (2011). European Medicines Agency: An unacceptable choice.
Prescrire International, 20(121), 278. http://doi.org/10.1136/bmj.333.7574.873-a
3. Alvarez-Gayou, J. (2003). Cómo hacer investigación Cualitativa. Fundamentos Y
Metodología, 1–11.
http://doi.org/http://www.ceppia.com.co/Herramientas/Herramientas/Hacer-
investigacion-alvarez-gayou.pdf
4. Aniszewski, T. (2007). ALKALOIDS – SECRETS OF LIFE (First). Amsterdam:
Elsevier Publications.
5. Bauer, K., Gros, L., & Sauer, W. (1992). Cromatografía de Capa Fina. Heidelberg:
Mitterweger Werksatz.
6. Bladt, S. (2009). Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas.
Springer Science & Business Media. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=CdVKAAAAQBAJ&pgis=1
7. Box, G., Hunter, J. S., & Hunter, W. (2009). Statistics Experimenters. Book
(Second). New Jersey: John Wiley & Sons.
http://doi.org/10.1080/00401706.1979.10489788
8. Cabrero, J., & Richard, M. (1996). El debate investigación cualitativa frente a
investigación cuantitativa. Enfermería Clínica, 6(5), 212–217.
9. Camag. (2016). Instrumental Thin-layer Chromatography. Muttenz: Climate
Partner. http://doi.org/10.1038/2161168a0
10. Chatterjee, S. (2013). QbD Considerations for Analytical Methods - FDA
Perspective. Presentation.
11. Cook, T., & Reichardt, C. (1986). Métodos cualitativos y cuantitativos en
73
investigación evaluativa. Metodos cualitativos y Cuantitativos en Investigacion
evaluativa (Primera). Madrid: Ediciones Morata S.L.
12. Dhaneshwar, S. R., Patre, N. G., & Mahadik, M. V. (2008). Validated TLC Method
for Simultaneous Quantitation of Amlodipine Besylate and Valsartan in Bulk Drug
and Formulation. Chromatographia, 69(1–2), 157–161.
http://doi.org/10.1365/s10337-008-0858-1
13. Ermer, J., & Miller, J. (2005a). Method validation in pharmaceutical analysis. A
Guide to best Practice. Wiley: New York.
http://doi.org/10.1002/3527604685.fmatter
14. Ermer, J., & Miller, J. (2005b). Method validation in pharmaceutical analysis. A
Guide to best Practice. Wiley: New York.
http://doi.org/10.1002/3527604685.fmatter
15. Hajnos, M., Sherna, J., & Kowalska, T. (2008). Thin Layer Chromatography in
Phytochemistry. Boca Raton: CRC Press. Retrieved from
https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=fBCDK_Tgh10C&pgis=1
16. IDEAM. (2006). Procedimiento para la estandarización de métodos analíticos
(TP0131 No. 2). Estandarización de métodos analíticos. Bogotá.
17. International Association for the Advancement of High Performance Thin Layer
Chromatography. (2012). HPTLC methods for identification of medicinal plants.
Basel.
18. Jadhav, M. L., & Tambe, S. R. (2013a). Implementation of QbD Approach to the
Analytical Method Development and Validation for the Estimation of Propafenone
Hydrochloride in Tablet Dosage Form. Chromatography Research International,
2013, 1–9. http://doi.org/10.1155/2013/676501
19. Jadhav, M. L., & Tambe, S. R. (2013b). Implementation of QbD Approach to the
Analytical Method Development and Validation for the Estimation of Propafenone
Hydrochloride in Tablet Dosage Form. Chromatography Research International,
2013, 1–9. http://doi.org/10.1155/2013/676501
20. Jian, P. S., Khatal, R. N., Jivani, H. N., & Surana, S. J. (2011). Development and
validation of TLC-densitometry method for simultaneous estimation of brimonidine
tartrate and timolol maleate in bulk and pharmaceutical dosage form. Journal of
Chromatography & Separation Techniques, 2(3), 113–117.
http://doi.org/10.4172/2157-7064.1000113
21. Khedr, A., & Sheha, M. (2003). Quantitative Thin-Layer Chromatographic Method
of Analysis of Azithromycin in Pure and Capsule Forms, 41(January), 10–16.
74
22. Magagula, N. L., Mohanlall, V., & Odhav, B. (2012). Optimized thin layer
chromatographic method for screening pharmaceutically valuable alkaloids of
Catharanthus roseus (Madagascar Periwinkle). International Journal of Sciences,
1–20. Retrieved from http://ir.dut.ac.za/handle/10321/977
23. Matsuura, H. N., Rau, M. R., & Fett-Neto, A. G. (2014). Oxidative stress and
production of bioactive monoterpene indole alkaloids: Biotechnological
implications. Biotechnology Letters, 36(2), 191–200.
http://doi.org/10.1007/s10529-013-1348-6
24. Miranda, M. (2008). Farmacongnosia y Productos Naturales. La Habana.
25. Narváez, G. (2016). Estabilización de las antocianinas presentes en el fruto del
mortiño (Vacciniun floribundum Kunth) mediante el método de copigmentación
molecular para la obtención de pigmentos antocianos con potencial aplciación en
la industria farmacéutica y cosmética. Universidad Central del Ecuador.
26. Paci, a., Mercier, L., & Bourget, P. (2003). Identification and quantitation of
antineoplastic compounds in chemotherapeutic infusion bags by use of HPTLC:
Application to the vinca-alkaloids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 30, 1603–1610. http://doi.org/10.1016/S0731-7085(02)00541-1
27. Peraman, R., Bhadraya, K., & Padmanabha Reddy, Y. (2015). Analytical quality by
design: A tool for regulatory flexibility and robust analytics. International Journal
of Analytical Chemistry, 2015. http://doi.org/10.1155/2015/868727
28. Poole, C. (2014). Instrumental Thin-Layer Chromatography. Retrieved from
https://books.google.com/books?hl=es&lr=&id=dmJzAwAAQBAJ&pgis=1
29. Rahul Kasar, Ashish Gogia, Kartik Shah, V. and C. A. (2013). Critical Factor That
Governs a Successful TLC/ HPTLC Analysis of Herbal Medicinal Products
(HMPS). Research and Reviews: Journal of Pharmaceutical Analysis, 2(4), 1–8.
30. Rashmin, P., Mrunali, P., Nitin, D., Nidhi, D., & Bharat, P. (2012). HPTLC method
development and validation: Strategy to minimize methodological failures. Journal
of Food and Drug Analysis, 20(4), 794–804.
http://doi.org/10.6227/jfda.2012200408
31. Reich, E., Schibli, A., & DeBatt, A. (2008). Validation of high-performance thin-
layer chromatographic methods for the identification of botanicals in a cGMP
environment. Journal of AOAC International, 91(1), 13–20.
http://doi.org/10.1016/j.bbi.2008.05.010
32. Reid, G., Morgado, J., Harrington, B., Wang, J., & Fortin, D. (2013). Analytical
75
Quality by Design (AQbD) in Pharmaceutical Development | American
Pharmaceutical Review - The Review of American Pharmaceutical Business &
Technology. Retrieved April 16, 2016, from
http://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/144191-
Analytical-Quality-by-Design-AQbD-in-Pharmaceutical-Development/
33. Sharapin, N. (2000). Fundamentos de tecnología de productos fitoterapéuticos.
Santafé de Bogotá: Convenio Andrés Bello. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=XH2HzSlJPywC&pgis=1
34. Skoog, D., Holler, J., & Crouch, S. (2008). Principios de Análisis Instrumental
(Sexta). México D.F.: Cengage Learninig Editores.
35. Skoog, West, Holler, & Crouch. (2015). Fundamentos de Química analítica Skoog,
West,. (C. L. Editores, Ed.) (Novena). Mexico D.F.
36. Spangenberg, B., Weins, C., & Poole, C. F. (2014). Quantitative Thin-Layer
Chromatography. Igarss 2014. Berlin: Springer-Verlag.
http://doi.org/10.1007/s13398-014-0173-7.2
37. Srivastava, M. (2011). High-performance thin-layer chromatography (HPTLC).
(M. Srivastava, Ed.)High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC).
London: Springer. http://doi.org/10.1007/978-3-642-14025-9
38. Suárez, M., & Mora, S. (2016). Procedimientos operativos estándar para formas
farmacéuticas sólidas (Primera). Saarbrucken: Editorial Académica Española.
39. Tam, M. N., Nikolova-Damyanova, B., & Pyuskyulev, B. (1995). Quantitative Thin
Layer Chromatography of Indole Alkaloids. II. Catharanthine and Vindoline.
Journal of Liquid Chromatography, 18(5), 849–858.
http://doi.org/10.1080/10826079508010396
40. Tiong, S. H., Looi, C. Y., Hazni, H., Arya, A., Paydar, M., Wong, W. ., …
Awang, K. (2013). Antidiabetic and antioxidant properties of alkaloids from
Catharanthus roseus (L.) G. Don. Molecules, 18(8), 9770–9784.
http://doi.org/10.3390/molecules18089770
41. United States Pharmacopeia Convention. (2015a). Identificación de artículos de
origen botánico mediante el procedimiento de cromatografía en capa delgada de
alta resolución. United States Pharmacopeia, 1–11.
42. United States Pharmacopeia Convention. (2015b). Monografía vincristina,
vinblastina. United States Pharmacopeia.
43. van Leeuwen, J. F., Nauta, M. J., de Kaste, D., Odekerken-Rombouts, Y. M. C. F.,
76
Oldenhof, M. T., Vredenbregt, M. J., & Barends, D. M. (2009). Risk analysis by
FMEA as an element of analytical validation. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 50(5), 1085–1087. http://doi.org/10.1016/j.jpba.2009.06.049
44. Vega, R. (2016). Curso de Diseño Experimental y Análisis Estadístico. Quito:
Escuela Politécnica Nacional.
45. Velasco, J. B. (2012). Nuestra Tierra Manual ilustrado de Geografía. (G.
Siguenza, Ed.) (Primera). Quito: El Comercio.
46. Venegas, A. (2016). Utilización de perfiles cromatográficos con fines de control
posregistro en formas farmacéuticas sólidas de fitomedicamentos con actividad
gastroprotectora. Universidad Centrald el Ecuador.
47. Villas-Boas, S., Koulman, A., & Lane, G. (2008). Analytical methods from the
perspective of method standardization. Topics in Current Genetics, 20(August
2007), 51–79. http://doi.org/10.1007/4735
48. Winkle, H. (Fda). (2007). Evolution of the Global Regulatory Environment: A
Practical Approach to Change. Focus, 20.
49. World Health Organization. Pharmaceuticals Unit. (1998). Quality control methods
for medicinal plant materials. G O , 122.
http://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004
50. Zhang, L., Gai, Q.-H., Zu, Y.-G., Yang, L., Ma, Y.-L., & Liu, Y. (2014).
Simultaneous quantitative determination of five alkaloids in Catharanthus roseus by
HPLC-ESI-MS/MS. Chinese Journal of Natural Medicines, 12(10), 786–793.
http://doi.org/10.1016/S1875-5364(14)60120-5
77
Anexo A
Esquema causa efecto
Desarrollo de metodología HPTLC
(Factor de resolución Rs)
Parámetros de
operación
Fase estacionaria
Inyección
Fase móvil
Solvente
Volumen de inyección
pH
Composición
de mezcla Polaridad de
mezcla
%HR
Tipo de cámaraDistancia de desarrollo
Tiempo de saturación
cámara
Tiempo de
preacondicionamiento placa
Sílica gel 60
F254
Sílica gel C18-100UV
F254
78
Anexo B
Diagrama de flujo
E1: Se recolecta especies silvestres de Catharanthus roseus, en cantidad suficiente para
desarrollar los procedimientos de la investigación.
E2: Se realiza desinfección, secado, molienda, homogenización del tamaño de partícula,
determinación del porcentaje de humedad relativa y desengrasado.
INICIO
Recolectar muestra
Estandarizar muestra
Extraer alcaloides
Cuantificar alcaloides
Realizar tratamiento estadístico
Establecer conclusiones
FIN
79
E3: Se extrae la fracción que contiene los alcaloides (VC y VB) presentes en
Catharanthus roseus, a partir de la muestra estandarizada, mediante la técnica descrita en
el Capitulo III.
E4: Se desarrolla la metodología HPTLC para cuantificación de alcaloides vinblastina y
vincristina, aplicando el enfoque AQbD conforme se describe en el marco metodológico
del Capítulo II.
E5: Se aplica el tratamiento estadístico apropiado para comprobar la hipótesis planteada
por la investigación.
E5: Se realiza las conclusiones, a partir de los resultados obtenidos del tratamiento de
los datos experimentales.
80
Anexo C
Marco legal
Normativa técnica sanitaria sustitutiva para la obtención del registro sanitario y
control de productos naturales procesados de uso medicinal, y de los establecimientos
en donde se fabrican, almacenan, distribuyen y comercializan.
CAPÍTULO IV
DE LA OBTENCIÓN DEL REGISTRO SANITARIO
Art. 10.- A la solicitud de Registro Sanitario se adjuntará los siguientes requisitos:
a. Requisitos para demostrar la calidad del producto terminado:
1. Descripción del o los recursos naturales.- La información como mínimo deberá
contener:
i. Nombre
ii. Género y especie; cuando corresponda.
iii. Parte utilizada;
iv. Método de extracción de la materia prima, según corresponda.
2. Especificaciones y límites de contenido de la materia prima o recurso natural:
i. Identificación de componentes activos o marcador;
ii. Sustancias extrañas o impurezas;
iii. Análisis microbiológico.
3. Descripción de la preparación:
i. Descripción detallada del proceso de fabricación del producto terminado:
ii. Método analítico haciendo referencia a la farmacopea oficial en base a la
cual se realiza el control de calidad. Cuando no se trate de métodos
oficiales, deberán ser métodos validados por el laboratorio fabricante, para
lo cual se deberá presentar el protocolo de validación.
81
iii. Si no es posible cuantificar el principio activo o marcador, bastará con
identificar una sustancia o mezcla de sustancias características para velar
por la calidad uniforme de la preparación.
4. Descripción del producto terminado:
I. Descripción detallada de la formula incluida la cantidad de excipientes;
II. Especificaciones del producto terminado: Físicas, físico-químicas,
químicas y microbiológicas. El producto terminado deberá satisfacer los
requisitos generales para la forma farmacéutica correspondiente;
III. Identificación y cuantificación del principio activo o del marcador en el
producto terminado; según corresponda.
IV. Descripción del envase primario y secundario con especificaciones
técnicas de los mismos;
V. Proyecto de etiquetas en castellano con las dimensiones en las que se va
a comercializar el producto natural procesado de uso medicinal;
VI. Prospecto con la información respecto al producto; según corresponda;
VII. Interpretación del código de lote.
CAPÍTULO VI
DEL ENVASE, ETIQUETAS Y PROSPECTO
Art. 16.- De las etiquetas: Las etiquetas de los productos naturales procesados de uso
medicinal importados y nacionales deberán estar redactadas en idioma castellano y en
caracteres claramente legibles e indelebles, y deberán contener la siguiente información:
a. Nombre comercial del producto;
b. Nombre científico del/los recurso/s natural/es;
c. Cantidad contenida en el envase;
d. Composición cuantitativa en peso de recurso natural;
e. Forma farmacéutica o presentación comercial, según corresponda;
f. Vía de administración;
g. Posología y tiempo máximo de uso; cuando corresponda
h. Advertencias y Contraindicaciones
82
i. Modo de empleo; según corresponda,
j. Condiciones de almacenamiento;
k. Modalidad de venta;
l. Indicaciones terapéuticas; cuando corresponda
m. Fechas de elaboración y vencimiento;
n. Número de lote;
o. Nombre del laboratorio fabricante, ciudad y país;
p. Código de registro sanitario;
Art. 18.- En el caso que las etiquetas del envase primario que por su naturaleza no puedan
incluir toda la información antes descrita, deberán contener mínimo la siguiente
información:
a. Nombre comercial del producto;
b. Nombre científico del recurso natural;
c. Composición cuantitativa en peso de recurso natural utilizado;
d. Vía de administración;
e. Fecha de vencimiento;
f. Número de lote;
g. Código de Registro Sanitario;
CAPÍTULO XII
DE LA VIGILANCIA Y CONTROL
Art. 41.- La Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria-ARCSA,
cuando considere necesario podrá solicitar al titular del Registro Sanitario para efectos de
control posterior, los patrones de referencia y los certificados de análisis de los Productos
Naturales Procesados de Uso Medicinal objeto de esta Normativa Técnica Sanitaria.
Art. 44.- Para efectos de control de calidad el análisis de los productos será conforme a la
metodología analítica presentada para la obtención del Registro Sanitario.
83
Anexo D
Aplicación del algoritmo de Yates para el cálculo de los efectos
Para el cálculo del efecto aplicando el algoritmo de Yates, se realiza la construcción de
la tabla D-1, conforme indica (Box et al., 2009). Esta incluye la matriz experimental en el
orden estándar, y las respuestas obtenidas de las corridas experimentales. Además,
establece la columna de divisor, cuyo valor corresponde a la mitad de las corridas
experimentales, de acuerdo al diseño planteado (factorial 23).
Tabla D-1. Cálculo de efecto mediante algoritmo de Yates
Núme
ro de
corrid
a
Variables de
matriz
experimental
Algoritmo Identifica
ción
Ts A Fe Respuesta
experimental
1 2 3 Divis
or
Efectos
1 - - - Respuesta 1 X1 Y1 Z1 8 Promed
io
promedio
2 + - - Respuesta 2 X2 Y2 Z2 4 Efecto 1 Ts
3 - + - Respuesta 3 X3 Y3 Z3 4 Efecto 2 A
4 + + - Respuesta 4 X4 Y4 Z4 4 Efecto 3 Ts, A
5 - - + Respuesta 5 X5 Y5 Z5 4 Efecto 4 Fe
6 + - + Respuesta 6 X6 Y6 Z6 4 Efecto 5 Ts, Fe
7 - + + Respuesta 7 X7 Y7 Z7 4 Efecto 6 A, Fe
8 + + + Respuesta 8 X8 Y8 Z8 4 Efecto 7 Te, A, Fe
Los valores de las columnas (1), (2) y (3), son obtenidos conforme a la ecuación D-1,
que realiza sumas algebraicas, entre las parejas de las 8 respuestas experimentales. Para los
siguientes intervalos de datos: X1 a X4, Y1 a Y4 y Z1 a Z4.
Ecuación D-1. Cálculo de la primera mitad de valores de las columnas (1), (2), (3)
Mientras que la ecuación D-2, aplica restas algebraicas, entre las parejas de las 8
respuestas experimentales. Para los intervalos de datos restantes: X5 a X8, Y5 a Y8 y Z5 a
Z8.
Ecuación D-2. Cálculo de la segunda mitad de valores de las columnas (1), (2), (3)
84
Finalmente, para obtener los valores de los efectos, se utiliza la ecuación D-3, que
realiza la división de la columna (3), para la columna del divisor.
Ecuación D-3. Cálculo de la segunda mitad de valores de las columnas (1), (2), (3)
85
Anexo E
Placas desarrolladas, espectros generados y datos de Rf de los diferentes tratamientos
de los alcaloides vincristina y vinblastina.
Figura E-1. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vincristina)
Figura E-2. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vincristina)
86
Figura E-3. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vincristina)
Figura E-4. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vincristina)
87
Figura E-5. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (vincristina)
Figura E-6. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (vincristina)
88
Figura E-7. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (vincristina)
Figura E-8. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (vincristina)
89
Figura E-9. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A1Fe1 (vincristina)
Figura E-10. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vincristina)
90
Figura E-11. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vincristina)
Figura E-12. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vincristina)
91
Figura E-13. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A1Fe-1 (vincristina)
Figura E-14. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A1Fe-1 (vincristina)
92
Figura E-15. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A1Fe-1 (vincristina)
Figura E-16. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A1Fe-1 (vincristina)
93
Figura E-17. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vincristina)
Figura E-18. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vincristina)
94
Figura E-19. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vincristina)
Figura E-20. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vincristina)
95
Figura E-21. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A-1Fe-1 (vincristina)
Figura E-22. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vincristina)
96
Figura E-23. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vincristina)
Figura E-24. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vincristina)
97
Figura E-25. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vincristina)
Figura E-26. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vincristina)
98
Figura E-27. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vincristina)
Figura E-28. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vincristina)
99
Figura E-29. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A-1Fe-1 (vinblastina)
Figura E-30. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A-1Fe-1
(vinblastina)
100
Figura E-31. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A-1Fe-1
(vinblastina)
Figura E-32. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A-1Fe-1
(vinblastina)
101
Figura E-33. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vinblastina)
Figura E-34. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vinblastina)
102
Figura E-35. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vinblastina)
Figura E-36. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A-1Fe1 (vinblastina)
103
Figura E-37. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (vinblastina)
Figura E-38. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A-1Fe1
(vinblastina)
104
Figura E-39. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A-1Fe1
(vinblastina)
Figura E-40. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A-1Fe1
(vinblastina)
105
Figura E-41. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A1Fe1 (vinblastina)
Figura E-42. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vinblastina)
106
Figura E-43. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vinblastina)
Figura E-44. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A1Fe1 (vinblastina)
107
Figura E-45. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A1Fe-1 (vinblastina)
Figura E-46. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A1Fe-1
(vinblastina)
108
Figura E-47. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A1Fe-1
(vinblastina)
Figura E-48. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A1Fe-1
(vinblastina)
109
Figura E-49. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vinblastina)
Figura E-50. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vinblastina)
110
Figura E-51. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vinblastina)
Figura E-52. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts1A1Fe-1 (vinblastina)
111
Figura E-53. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A-1Fe-1 (vinblastina)
Figura E-54. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vinblastina)
112
Figura E-55. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vinblastina)
Figura E-56. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A-1Fe-1
(vinblastina)
113
Figura E-57. Placa desarrollada a 254nm del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vinblastina)
Figura E-58. Espectro correspondiente a replica 1 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vinblastina)
114
Figura E-59. Espectro correspondiente a replica 2 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vinblastina)
Figura E-60. Espectro correspondiente a replica 3 del tratamiento Ts-1A1Fe1 (vinblastina)
115
Anexo F
Espectros de los volúmenes de la curva de calibración de los estándares de vincristina y vinblastina, correspondientes al tratamiento
ensayado que permitió la optimización de la respuesta experimental (Resolución)
Figura F-1. Espectros generados correspondientes a los estándares empleados para el tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vincristina)
116
Tabla F-1. Rf correspondientes a los estándares del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vincristina) Estándar Rf inicial Rf máximo Rf final Altura max. Área máx.
1 0.695 0.743 0.784 2186.28 64453.20
2 0.695 0.745 0.794 2212.18 67223.40
3 0.696 0.743 0.792 2303.41 69715.40
4 0.693 0.747 0.796 2403.59 75700.30
5 0.683 0.741 0.788 2750.00 80354.80
Elaborado por. Alejandro Osorio
Figura F-2. Espectros generados correspondientes a los estándares empleados para el tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vinblastina)
117
Tabla F-2. Rf correspondientes a los estándares del tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vinblastina)
Estándar Rf inicial Rf máximo Rf final Altura max. Área máx.
1 0.702 0.741 0.784 3335.55 79718.00
2 0.694 0.737 0.782 3638.13 83749.50
3 0.692 0.737 0.784 4080.79 100045.00
4 0.682 0.733 0.786 4834.37 138716.00
5 0.667 0.719 0.772 5236.09 146269.00
Elaborado por. Alejandro Osorio
118
Anexo G
Curvas de calibración obtenidas mediante la aplicación del software VideoScan, para
cuantificación de lo alcaloides de Catharanthus roseus
Figura G-1. Curva de calibración para el tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vincristina)
Figura G-2. Curva de calibración para el tratamiento Ts-1A-1Fe1 (Vinblastina)
y = -0,0005x2 + 9,8096x + 39168
0,00
10000,00
20000,00
30000,00
40000,00
50000,00
60000,00
70000,00
80000,00
90000,00
0,00 1000,00 2000,00 3000,00 4000,00 5000,00 6000,00 7000,00
Área
(%
)
Contenido (ng)
Calibración mediante área para Vincristina
y = -0,0001x2 + 1,6564x - 724,7
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
0,00 1000,00 2000,00 3000,00 4000,00 5000,00 6000,00 7000,00
Altura
Contenido (ng)
Calibración mediante altura para Vinblastina