UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

'CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

/NOMBRE: Elvira Carreto Flores.

MATRICULA. 93229011.

/LICENCIATURA: Ingeniería Bioquimíca Industnal.

/TITULO DEL PROYECTO: EFECTO HIPOGLUCÉMICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES DE LA CORTEZA DE Guaiacum coulteri.

TIEMPO DE DURACIÓN 10 meses hábiles (4 horas diarias)

LUGAR DONDE SE REALIZAÉL SERVICIO SOCIAL: laboratono de farmacología (s-348) del Departamento de Ciencias Biológicas y de la Salud, de la división de CBS, de la UAM Iztapalapa

FECHA DE INICIO : 6 Abril de 1997.

25 de Enero de 1 9 9 /FECHA DE TERMINACIÓN:

CLAVE DEL SERVICJO SOCIAL: IBI.016.97

J Asesores:

I&. L I \í.

DR. Rubén Román Ramos Profesor Titular C

Área de investigación Médica Depto. de Ciencias de la Salud. División de CBS. División-de CBS

DR. Francisco Javier Alarcón w a r , Profesor Titular C Área de investigación Médica Depto. de Ciencias de la Salud

Elvira Carreto Flores.

U N M B I D A D AUTÓNOMA METROPOLITANA

IZTAPALRPA -

EFECTO HIPOGLUC&#IICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES DE

casaabiertaaltiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DMSION DE a E m = BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que el (la): DR. FRANCISCO JAVIER ALARCdN AGUILAR

del Departamento de de la División de Ciencias Biológicas y-de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO

ALUMNO ELVIRA CARRETO FLORES M ATR ícu LA

PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a catorce de Abril de mil novecientos noventa y ocho.

CIENCIAS DE LA SALUD

- EFECTO HIPOGLUCÉMICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES DE LA CORTEZA DE Guaiscum Couhen'

9322901 1

ABRIL 6,1997 A MARZO 6, 1998 LICENCIATURA INGENIER~A BIOQU~MICA INDUSTRIAL

A T E N T A M E N T E "Casa Abierta al Tiempo"

M. EN I SECRETARIO ACADÉMICO

UNIDAD IRAPALAPA Av. Michoauin y La Punaims lztapalapa 09340 Mexico, D.F. A.P. 55-535 Fax: (5) 61280-83 Talo. 724-46-81 y 85

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NOMBRE: Elvira Carreto Flores. MATRICULA: 9322901 I . LICENCIATURA: Ingenieria Bioquimica Industrial. TITULO DEL PROYECTO: EFECTO HIPOGLUCÉMICO DE EXTRACTOS Y

FRACCIONES DE LA CORTEZA DE Guaiacum codteri. CLAVE DEL SERVICIO SOCIAL: 181.01 6.97 FECHA DE INICIO : 6 Abril de 1997. FECHA DE TERMINACIÓN: 25 de Enero de 1998. NOMBRE DE LOS ASESORES, PUESTO Y ADSCFUPCI~N

1.- DR. Rubén Román Ramos, Profesor Titular C., T.C., Departamento de Ciencias de la Salud , División CBS. 2.- DR. Francisco Javier Alarcón Apilar, Profesor Titular C, T.C., Departamento de Ciencias de la Salud, División CBS. - RESUMEN

El objetivo de este trabajo es el inicio de estudios quimicc-fannacológicos dirigidos a la separación (aislamiento) e identificación de 14s) sustancia(s) mponsable(s) dcl efecto hipoglucemiante de la decpcción acuosa de la corteza de Guaiucum coulteri en modelos animales.

Para obtener alcanzar esta meta, se plantearon los siguientes objetivos particulares: a) Se estudio la influencia de la dococción acuosa de la corteza de Guaiacum coulteri sobre la

b) Se obtuvo el extracto de la planta con disolventes de diferente polaridad (hexano, cloruro de

C) Se estudió la actividad hipog!ucemiante de los extractos obtenidos. d) Se obtuvieron Fracciones del extracto poseedor de la actividad hipoglucemiante mayor. e) Se Investigó la actividad hipoglucemiante de las fracciones obtenidas.

glucemia en modelos animales (conejos y ratones).

metileno, metano1 y agua).

Los resultados obtenidos muestran que: El extracto metanólico reporta un mayor

El extracto acuoso es el poseedor con mayor efecto hipoglucémico en ratones sanos en

La fracción FI obtenida del extracto acuoso presentó el efecto hipoglucémico mayor.

rendimiento.

ayunas.

Las conclusiones son: El extracto acuoso de Guuiucum coulteri, muestra un importante efecto hipoglucémico.

m La fracción acuosa FI, obtenida a partir del extracto acuoso de la corteza de Guuiucum coirlreri muestra el mayor efecto hipoglucémico. Es probable que en esta fracción I se encuentre la sustancia responsable de la actividad hipoglucemiante de Guuiucum coulreri. -

NO ICE

JUSTIFICACI~N ....................................................................... I

INTROOUCCI~N ...................................................................... 2

HlPOTEslS........... .................................................................... 9

OBJETIVOS ...................................... ." ..................................... 9

- MATERIAL

LABORATORIO......................................................................... 10

BIOL~GICO...... ........................................................................ 10

SUSTANCIAS UTILIZADAS...................................................... 11

DIAGRAMA DE FLUJO....r.........................................."."."...... 12

METODOLOdA DE LOS EXTRACTOS DIE Uua/'um cmhd

PROCESO DE wTRnCCióN........ ........................................... 13

L Y 3 7

Y

PRUEBAS BlOL6GiCAS ......................................................... 14

METODOLOGIA DE LAS FRACCIONES DE Guaiacum couhd

PROCESO DE SEPARACIÓN DE LAS FRACCIONES .............. I 5

EXAMEN CUALITATIVO DE LAS FRACCIONES..................... 15

PRUEBAS BiOL.óGiCAS.... ..................................................... 16

ANALISIS E ~ ~ A D ~ ~ ~ I C O . ....................................................... 16

87 a El U a

RESULTADO DE LOS EXTRACTOS

PROCESO De EXrRACClóN.. ................................................ 17

PRUE8AS BIOLÓOICAS ...................................................... 17

RESULTADO DE LAS fRACClONES

PROCESO w SEPARACI~N DE LAS-FRACCIONES. ........... 20

U EXAMEN CUALITATIVO DE LMI FRACCIONES.................. 20

PRUEBAS BlOLóGiCAS........ .............................................. 20

D~SCUSI~N......................................................................... 23 a a CONCLUSI~N ..................................................................... 25

RECOMENDACIOWES......................................................... 25

LIiERAiURA ...................................................................... 26

RESUMEN 29

II U U

...........................................................................

U

JUSTIFICACI~N.

El aislamiento e identificación de principios activos a partir de preparaciones

tradicionales de plantas, ha despertado el interés de muchos cientificos en la actualidad. Se

ha observado que dichas preparaciones presentan en ocasiones problemas de dosificación

debido a la variación en las concentraciones de las sustancias activas lo cual repercute en la

presencia o ausencia del efecto terapéutico o en la toxicidad que puedm presentar

sustancias extrañas contenidas en dichas preparaciones.

Los especialistas fitoquímicos recomiendan la realización de extracciones continuas

a paair de la planta seca y pulverizada con disolventes de polaridad creciente. Los químicos

sugieren extracciones discontinuas con los mismos disolventes, pero a partir de las

preparaciones tradicionales usadas por la población.

Por otra parte las investigaciones etnobotánicas reportan la existencia en México de

150 plantas usadas empíricamente en el control de la Diabetes Mellitus. En la actualidad se

han investigado alrededor de 60 plantas antidiabéticas, y se ha confirmado el efecto

hipoglucémico en la mayoria de ellas.

En estas investigaciones se encuentra reportado que la corteza de Guaiacum coulteri

(guayacán), presenta un importante efecto hipoglucémico, el cual muy probablemente se

debe a la presencia de a i m metabolito secundario con actividad hipoglucemiante.

El presente trabajo está dirigido a la investigación químico famacológica del efecto

hipoglucémico de los extractos y fracciones obtenidas a partir de la corteza seca de

Guaiacum coulteri.

1

El uso de plantas en la cura y control de diferentes enfermedades tiene ongenes muy

remotos. Los primeros indicios de su empleo medicinal se remontan a los pueblos asiáticos

y posteriormente, a los egipcios, hebreos y fenicios, entre 8000 y 2000 años a. de C. Más

tarde, su uso se d i h d i ó entre los griegos y posteriormente en el mundo occidental antiguo.

A principios de nuestra era surgen las primeras descripciones de plantas medicinales por

Teofiasto , Galeno y Celso. En las culturas prehispánicas de Mesoamérica, se tienen

vestigios antropológicos acerca de las prácticas de “hechiceros” o “magos” que preparaban

mezclas de hierbas y plantas durante el ritual mágico practicado en el proceso curativo de

los enfermos(i.2)

A fines del siglo XW materias tales como galénica, botánica, farmacéutica,

quimicafarmacéutica, farmacología y farmacognosía, empiezan a adquirir el carácter de

disciplinas autónomas. Posteriormente comienzan a tomar relevancia los medicamentos de

síntesis, más fáciles de dosificar y controlar. A consecuencia de esto, las preparaciones

tradicionales a partir de planta medicinales tendieron a desaparecer, mientras que los

medicamentos de síntesis comenzaron a adquirir mayor importancia. (3.4)

Hoy en día las plantas medicinales siguen siendo importantes. Por un lado tenemos

que las plantas medicinales continúan siendo utilizadas, sobretodo en aquellos países en

donde los servicios de salud son insuficientes para cubrir las necesidades de la población ,.I)

L. rc I C E E E o

a3 U IQ a O 10 U m - D D rn

a

A partir de los años 70 la medicina experimental inicio la revaloración de los

conocimientos empíricos sobre la acción de muchas plantas, estos estudios han sido

encaminados al descubrimiento de huevos medicamentos a partir de productos naturales.

Así por ejemplo, se ha logrado reconocer ia función que la medicina tradicionai y las

plantas medicinales cumplen en la población de los países en desarrollo en el tratamiento de

enfermedades gastrointestinales, oncológicas, nerviosas, parasiiarias, etc., incluyendo la

diabetes mellitus (2)

El término “diabetes” proviene del griego que significa sifón y se refiere a la

poliuria característica de dos procesos patológicos, a saber diabetes insípida, en la cual la

orina es diIuida y relativamente insípida, y diabetes sacarina, en la cual la orina tiene sabor

dulce por su elevado contenido de glucosa. La palabra “diabetes” usada sola se considera

habitualmente sinónimo de diabetes Sacarina ya que es con mucho la más común de ambas

alteraciones (5.6)

-

La diabetes mellitus (DM) es uno de los padecimientos más importantes a nivel

mundial, y constituye la tercera causa de muerte en los países industrialipdos. Además, se

encuentra dentro de las primeras diez causas de deceso en los países en vías de desarrollo (7)

La DM se puede definir como un síndrome caracterizado por un estado de

hiperglucemia crónica que obedece a la falta, parcial o total de la actividad insuiinica lo

cual origina anormalidades en el metabolismo de carbohidmtos, Iípidos y proteínas, así

como en el equilibrio hidroelectrolítico. Las principales anomalías se manifiestan en

diversos síntomas y signos caractdsticos como son poiiuria, polidipsia, polifagia, astenia,

glucosuria, hiperglucemia, cetonemia, etc., y pueden llevar ai paciente a desarrollar

3

complicaciones agudas o crónicas tales como: detoacidbsis, coma hiperosmolar, macro-y

microangiopatia, nefropatia retinopatía, neuropatía e infecciones recurrentes. Dichas

complicaciones son las principales causas de la invalidez y mortalidad de los pacientes que

padecen esta enfermedad(7.s.9.10) . Los síntomas de la DM se deben principalmente a la baja utilización de la glucosa

por los tejidos al faltar la acción insulínica, aumentando consecuentemente la glucemia. A

medida de que aumenta la concentración de glucosa sanguínea, sobrepasando los 180

mgídl, se supera la capacidad de resorción para la glucosa y ésta es eliminada en la oMa,

llevándose agua consigo por una acción osmótica; las elevadas concentraciones originan

una intensa deshidratación de las células, produciendo la resequedad de las mucosas y sed

intensa. Al faltar la acción insulínica, la glucosa no puede pasar la membrana de la mayoría

-

de las células (excepto entrocitos y celdas cerebrales), privando su uso en los procesos

energéticos. Las células, para abastecerse de energía, tienen que recurrir a otros procesos

metabólicos. El catabolism0 pr6teínico aumentado disminuye el contenido de proteínas; los

aminoácidos son utilizados en exceso para la gluconeogénesis, de manera que se produce

atrofia muscular. La urea en sangre aumenta y se pierde nitrógeno con la orina. Hay

aumento en la desintegración de la grasa con el incremento de la oxidación de ácidos libres.

El diabético no tratado puede movilizar tanta grasa que el plasma se vuelve lactecente

(hiperlipemia). Estos trastornos metabólicos llevan al paciente diabético al adelgazamiento

y a padecer de astenia, volviéndolo susceptible a recurrentes infecciones. También aparece

una producción excesiva de cetoácidos que pueden superar la capacidad del cuerpo para

metabolizarlos, de manera que el pH de los humores disminuye. La acidosis puede

aumentar hasta el punto que se pierda el conocimiento (coma diabético), si no se trata la

.

4

c: t E t t F t t C E t: F iF rl $3 6; o a iI?

deshidratación, se afectan los niveles de elecWolitbS que. conjuntamente con la cetoacidosis.

deprimen progresivamente el sistema nervioso central, viene el coma y la muerte. (10.11.iz.13)

Actualmente se tiene conocimiento de 4 tipos principales de diabetes, pero se

conocen dos tipos principales: tipo 1 , (antes conocida como DM insulinodependiente,

DMD) y tipo 2 (antes conocida como DM no insulinodependiente, DMNDD). La diabetes

tipo 1 también se conoce como diabetes juvenil, ya que tiende a presentarse en la infancia,

sin embargo también puede preseníarse a una edad avanzada. Los pacientes carecen de

insulina endógena y presentan tendencia a la cetoacidosis y a otras complicaciones agudas o

crónicas. La predisposición genética de esta enfermedad es compleja e incierta. Se

considera que los factores hereditarios tienen cometido, principalmente para establecer la

susceptibilidad a los factores ambientales, las infecciones y los trastornos autoinmunitarios

que provocan el daiio irreversible de las células p productoras de insulina; hay una

asociación entre ciertos antigenos tisulares (antigenos de histocompatibilidad) y la

-

susceptibilidad a la diabetes dependiente de insulina(14.1~~6.1~.

La diabetes tipo 2 se desarrolla maS lentamente. Probablemente algunos indicios

pueden detectame en forma temprana por medio de estudios intensivos, pero el diagnóstico

definitivo es por lo general posible Solo hacia la mitad o al final de la vida, por 10 que antes

se conocía como diabetes del adulto. El páncreas de éstos pacientes genera y libera insulina,

pero ésta resulta insuficiente. Se considera que dentro los principales factores

desencadenantes de este tipo de DM están la obesidad, la cual se presenta entre el 80 y 90

% de los pacientes, la tensión emocional y el factor genético (15.16). -

5

A la fecha la DM es una enfermedad incurable. Una vez manifestada. el paciente la

padece durante to& su vida. Por lo tanto, quien la desarrolla tiene que aprender a

controlarla y a sobrevivir con ella<,7,.

El control de la DM debe es& enfocado hacia remediar los síntomas y prevenir las

complicaciones agudas y crónicas. La base en el control adecuado de la DM lo constituyen:

La educación del paciente en cuanto a la enfermedad, ya que se necesita la participación

activa y la participación del paciente en el manejo de su padecimiento.

La dieta juega un papel fundamental en el control de la DM. Es importante que al

prescribir una dieta ésta deba cumplir las necesidades energéticas de cada individuo de

acuerdo al tipo de diabetes que padece.

El ejercicio fisico es necesario para todas las personas y en especial para los pacientes

diabéticos, gracias a l a actividad muscular más o menos intensa, es posible metabolizar

glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos circulantes en la sangre.

El uso de medicamentos hibglucemiantes, se recomienda en aquellos casos de diabetes

tipo 1, , en los que la dieta y el ejercicio fisico no resultan ser eficaces en el control de la

glucemia y en todos los casos de diabetes tipo 2.

-

Dentro de los medicamentos hipoglucemiantes orales más importantes se encuentran

las sulfonilureas y las biguanidas. Existe controversia considerable sobre sus mecanismos

de acción, indicaciones terapéuticas y especialmente sobre su seguridad en el uso a largo

plazo, ya que se ha llegado a asegurar que aumentan la incidencia de los problemas

cardiovasculares. La insulina es el fármaco hipoglucemiante más efectivo y está indicado

tanto para pacientes con diabetes tipo 1, como para pacientes con diabetes tipo 2 cuya

hiperglucemia no responde al tratamiento dietético solo O combinado con hipoglucemiantes

6

orales. A pesar de que la insulina tiene un alto grado de efectividad, no puede evitar el

desarrollo de las complicaciones vasculares y muchas veces, por su administración

necesariamente parenteral, llega a producir en los pacientes reacciones adversas imprevistas

(8.1 1.12 16.17.18.19)

En el control de la DM también se utilizan plantas medicinales cuyas propiedades

curativas no están bien comprobadas y cuya composición química se desconoce. Sin

embargo, existen otras plantas en las cuales se ha podido demostrar actividad famacológica

a nivel experimental, se ha logrado determinar que dicha actividad se debe a la presencia de

metabolitos Secundarios. Estos compuestos se caracterizan por ser útiles para el

crecimiento, o la reproducción de la planta, o bien por poseer funciones de defensa Dichos

compuestos han contribuido a la clasificación taxonómica de las especies

(Quimiotaxonomía). En muchos casos se han podido identificar todos los componentes, y

en algunas ocasiones se ha comprobado que ninguno de ellos en particular tiene las

-

propiedades curativas de to& ¡a planta; lo que hace suponer que los distintos componentes

reaccionan entre si por sinergia, para producir el efecto conocido y deseado. Sucede

también que los diversos órganos de una planta producen un componente químico diferente

y por consiguiente, poseen propiedades distintas, benéficas o no. Dentro de los metabolitos

secundarios encontramos compuestos como alcaloides, flavonas, esteroides, terpenoides,

etc. (20.21.22).

Investigaciones etnobotánicas reportan la existencia en México de aproximadamente

150 plantas usadas empíricamente por la población mexicana en el control de la DM. Sin

embargo, a pesar de que estas plantas representan una alternativa viable, al alcance de la

mayoría de la población mexicana para el control de la DM y que representan una fuente

-

7

potencial de materia prima para la obtención de nuevos famiacos hipoglucemiantes orales,

su investigación experimental y clínica es de inicio reciente (23.24)

En México, hasta ahora sólo se ha investigado el efecto hipoglucémico de plantas

antidiabéticas confirmándose dich8 efecto en la mayoría de ellas, Por su parte, a las

investigaciones quimico-farmacológicas enfocadas a la obtención de sustancias a partir de

remedios tradicionales, no se les ha prestado la atención debida. Entre las preparaciones

tradicionales reportadas con efecto hipoglwémico importante se encuentra la decocción

acuosa de la corteza de Guaiacum codteri; planta conocida tradicionalmente como

guayacán,ia planta ha mostrado actividad hipoglucemiante tanto en animales sanos como en - animales diabéticos por lo que resulta interesante iniciar estudios que permitan purificar e

identificar la sustancia o sustancias con actividad hipoglucemiante de esta planta

8

ti a HIPÓTESIS.

La decocción acuosa de la corteza de Guaiacum coulteri contiene al menos una

sustancia hipoglucemiante. Dicha sustancia puede ser aislada usando una metodología

extractiva con disolventes de polaridad creciente y métodos cmmtogdficos.

OWETIVOS. O a Q a a

11 $3

El objetivo de este trabajo fue iniciar - un estudio químico-farmacológko dirigido al

aislamiento y purificación química de 14s) sustancia(s) responsable(s) de la acción

hipoglucemiante de la corteza de Guaiacum coulreri.

Para alcanzar esta meta, se plantearon los siguientes objetivos particulares:

a) Obtener extractos de la planta con disolventes de diferente polaridad (hexano, clonvo de

metileno, metano1 y agua).

5 b) Estudiar la actividad hipoglucemiante de los extractos obtenidos.

c) Obtener &acciones del extracto poseedor de la actividad hipoglucemiante mayor.

d) Investigar la actividad hipoglucemiante de las fracciones obtenidas.

b

9

1

I- C.

F4

C h

t c c c c

P..

G c 4

E I L U u

- c

c

ii

MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO.

Balanza analitica.

Liofilizadora

Mareriai de vidrio.

placas para cromatografia en capa fina.

Silica gel 60 F 0.25 mm.

Columna de fase inversa exmlut.

ReflectdmeUO reflolux 11-M.

Rotavapor.

Refrigerador

Estufa.

Lampara UV de longitud de onda corta y larga

Tennómeiro.

Tubos capilares

Jeringas.

Tiras reactivas Hacmo-Glukotest 20-800.

MA~ERIAL EMOL~GICO.

Ratones machos (Mus musculus) sanos, cepa CD-1 con un peso de 25 a 35 gramos.

o Corteza de Guaiacum coulteri.

I O

I - ,. ..

I ,-- "I

I- I- -

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SUSTANCIAS UTILIZADAS.

Aceite de inaíz.

Agua destilada.

Cloruro de metileno.

c loloformo.

Hexano.

Metanol. - Solución salina isotónica esterilizada y libre de pirógenos.

Solución de glucosa al 50 % (solución inyectable esterilizada libre de pirógenos).

E-

DIAGRAMA DE TRABAJO

Corteza seca de Guaiacum couíteri .1

Extracciones con hexano, cloruro de metileno,

metano1 y agua J.

Extractos - -Disolvente

Estudio farmacológico en ratones Desechar adultos sanos (determinación de la glucemia por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa.-

.1 .1

.1

.1 Fraccionamiento del extracto poseedor del mayor efecto

hipoglucémico por cromatografia en fase inversa usando columna extrelut.

.1 Estudio cromatografico por CCF

del extracto con mayor efecto hipoglucémico

J

Fracciones - --Disolvente

Estudios farmacológicos en Desechar ratones sanos (determinacíón de la glucemia por el método

de glucosa oxidasa-peroxidasa)

.1 .1

- .1

Comunicar resultados.

12

METODOLOGCA.

Obtención y valoración de los extractos de Guaiacum

cou/fed en ratones sanos.

.a GI . A) Se llevó a cabo la maceración con la corteza seca de la planta en diferentes disolventes

de la siguiente manera:

1) Se pesaron 500 gramos de la corteza Seca de la planta.

2) La corteza se colocó en un matraz erlenmeyer con un volumen de 5 litros,

3) Al matraz que contenía la corteza se le agregaron periódicamente los disolventes

en orden creciente de polaridad: apolar a muy polar, con un volumen de 1200 a

1500 ml de solvente.

4) Los disolventes ut i l i ios fueron: h a m o , diclommetauo (cloruro de metileno),

metanol y agua.

5) El cambio de disolventes se llevó a cabo hasta completar La extracción.

B) La solución que se obtuvo (disolvente mb extracto) de la maceración se filtró y

concentró en un rotavapor a una presión y temperatura específica, ( excepto ai extracto

acuoso).

En total fueron 9 extracciones con hexano, 10 con diclorometano y 1 1 con metanol,

dejando para cada extracción 2 días de reposo ( es decir, contacto entre solvente y lacorteza

de la planta)

13

C) En el caso del extracto acuoso, este se liofilizó hasta la eliminación total de la fase

liquida ( de este extracto sólo se hicieron 2 extracciones).

D)Los extractos resultantes se pesaron en una balanza analítica para calcular los

rendimientos y las dosis necesarias para su administración, previa resuspensión en un

vehículo adecuado, a ratones sanos en ayunas de 18 horas.

m Iv

PRUEBAS BiOLdGiCAS.

Extracto hexánico

Extracto diciomrnetánico

a) Se formaron 6 grupos de 8 ratones cada uno y se trabajó de la siguiente manera:

V

I II Aceite vegetal (control) I

I I

Extracto metanólico

I VI I Extracto acuoso I I

Todas estas sustancias fueron administradas a razón de 300 mgkg con excepción de

los controles, los cuales se administraron, a razón de 4 mgkg de peso, por vía

intraperitoneal a los animales de experimentación. Los extractos vegetales se diluyeron en

un volumen iguai (4mgkg. )

b) En cada grupo se hicieron determinaciones de la glucemia sanguínea en ayunas, a los 120

minutos y a los 240 minutos, después de la administración de las sustancias.

14

." . Obtención y valoración de las fracciones de Guaiscum h coulten:

PROCESO DE SE PARACIÓW DE LAS f RACC IONES.

I -

C-

P-

F

A) Dado que el extracto acuoso fue el que presentó mayor efecto hipogiucémico, se

pesaron. De ese 2 gramos.

B) Se disolvió en agua hasta obtener un volumen de 20 ml.

C) La mezcla resultante se agregó a una columna extrelut. Con el fin de separar las

fracciones, éstas se recolectaron en diferentes fiascos, de acuerdo al cambio de color que

se observaba de una fracción a otra.

D) Para obtener las fmcciones se utilizaron mezclas de cloroformo-metano1 en diferentes

concentraciones

E) Se'comeron 5 columnas con la finalidad de obtener la cantidad necesaria para probar las

fracciones resultantes.

c

MEN C UALlTATlVO DE U S FRACC IONES . F

F

a) UM vez obtenidas las fracciones se realizaion con ellas cromatopfias en capa fina para

poder diferenciarlas.

b) Se revelaron con la lámpara de luz ultravioleta.

C) Se juntaron las fracciones que eran iguales.

-

PRUEBAS BIOL~GICAS.

A) Se formaron 3 grupos de 23 ratones cada uno de la siguiente manera:

I GRUPO DE RATONES ADMINISTRACIÓN DE 1 t I I Solución salina isotónica (control) 1 t II Fracción I (FI)

I

I 1 m Fracción iI (FIi)

A cada uno de estos grupos se les administró por vía intraperitoneal una dosis

promedio de 200 m&g de peso corporal, en un volumen de 4mgkg. Este mismo volumen

se administró de solución salina como control.

b) En cada grupo se hicieron detenninaciones de la glucemia sanguíneas en ayunas y a los

120 y 240 minutos, después de la administración de las sustancias

-

ANALISIS ESTAD~STICO.

Todos los resultados acerca del efecto hiopoglucémico causado por los extractos o

las fracciones en ratones sanos, se sometieron ai siguiente anáiisis estadístico.

1) Para cada estudio se calculó las concentraciones medias de glucosa en sangre y su

desviacion estándar.

2) Se calculó la T student de dos colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente

significativas con una p<O.OS.. -

16

Ir h h b

c..

c

' C

I -

1 --

RESULTADOS.

Obtención y valoración de los extractos de Guaiacum

cou/ten'en ratones sanos.

Después de obtenidos los extractos, como se indicó anteriormente en la

metodología, se calculó su rendimiento (cuadro I) y postenomente se procedió a la

valoración de los mismos en ratones sanos. Como controles se utilizaron solución salina

isotónica y aceite de maiz. -

CUADRO I. Rendimiento de los extractos de Guaiacum coukri a partir de 500 mg de

corteza de la planta seca.

Los resultados de la valoración de los extractos se muestran en la cuadro IL, figuras

I y ii. Visto desde la perspectiva del comportamiento del área bajo la curva, se observa que

la pendiente del extracto acuoso es mas pronunciada a los 240 minutos, comparada con el

control (solución salina) y el extracto metanólico.

17

La figura II muestra que la pendiente mhs pronunciada es la del control (aceite de

maíz) y después es el extracto hexánico, sin embargo su pendiente de descenso no se

presenta tan pronunciada como en el-caso anterior del extracto acuoso.

CUADRO U. Efecto hipoglucémico causado por la administración I.P. de extractos de

Guaiucum codíeri en ratones sanos a razón de 300 mgkg de peso.

I

EXPERIMENTO GLUCEMU EN Ya DlSMlNUCION DE LA CLUCEMIA

AYUNAS (Xi D.E.)

( m m ( M I 120 MiNUTOS 240 MINUTOS

Control (Aceite de maiz) 59.M10.7 -16.2i34.8 -19.6

n=8

Control ( Sol. Salina ) 59.8i12.0 l.lf18.2 -3.6f29.4

n 4

Extracto hex4nico 69.6212.4 -19.2f17.8 -2O.Oi30.9

n-8

I

Extracto Dicloromet4nico 67.4f8.7 -2.1i29.7 -4.1i32.2

n-8

r Extracto Meíanólico 69.8i11.5 -5.6f7.5 -4.1f18.3

n-8

Extracto acuoso 67.2f11.6 -8.617.9 -19.4f6.7'

n=S

I

Diferencia significativa con respecto al control respectivo :'P<o.OS.

Esto nos indica que el extracto con mayor actividad hipoglucemiante es el acuoso.

Es aquí donde posiblemente se encuentra en mayor proporcion el principio activo..

18

h

FIGURA I

.

O

FIGURA II

O 24a

Pagina 2

IC L L L L

-.

X .

C.

P..

L L c u u 3c1 ü S 4 ü ii ü u cj

Obtención y valoración de las fracciones da Guaiacum

coultek

PROCESO DE SE PARACIÓN DE U S FRACCIONES

A partir del extracto acuoso fue posible obtener, por cromatografía de fase inversa

(columna extrelut), que posteriormente se identificaron cuaiitativamente varias fracciones,

en fase líquida por la extracción de la mezcla cloroformo-metanol.

U<AMGN CUALITATIVO DE LA FRACC I ONE S

Se realizó el examen cualitativo de las fiacciones por medio de cromatografa en

capa f m y se encontró que sólo exim'an dos fiacciones Fi y Fn, debido a que las

cromatografias realizadas, reveladas con la lámpara de luz ultravioleta, indicaban que

aunque teníamos varias hcciones, algunas eran iguales y las tuvimos que juntar, dando

como resultado dos fracciones, que posteriormente se concentraron con un rotavapor.

Ambas fracciones se disolvieron en solución salina isotónica y se administraron a

razón de 200 mg/kg de peso corporal.

PRUEBAS BIOLÓG ICAS.

Los resultados de estas pruebas se muestran en el cuadro y figura iIi. En éstas se

puede observar, que la concentración sanguínea de la glucosa disminuye más

favorablemente cuando se administra la fracción FI, que cuando se administra la fracción

Fii, esto es notorio a una dosis de 200 mgkg de peso corporal.

-

20

.r-- . . .. . . .-

CUADRO 111. Efecto hipoglucémko causado por la administncióa I.P. de fracciones

de Guaiacum coulten en ratones sanos a razón de 200 mgkg de peso.

Control ( Sol. Salina )

n=t8

FI

0 4

m n=lS

AYUNAS (Xi D.E.)

(mud0 (Mu) 120 MINUTOS . 240 MINUTOS

56.9k8.0 -5.7k17.4 -10.8k15.3

60.6k6.9 -12.6522.2 -28.W14.9* - 64.4k8.9 -3.6k21.7 -10.8332.5

Como se puede observar en los resultados de la figura III, la fracción FI obtenida a

partir del extracto acuoso de la corteza de Guaiacum coulteri, mostró un importante efecto

hipoglucémico en ratones sanos en ayunas. Esta gráfica también nos indica que se mostró

un menor efecto hipoglucémico por la üacción FII

Hoja1

FIGURA 111

FRACCIONES M Gudacun O O U M

O

Para el estudio de las sustancias activas responsables de las propiedades curativas de

muchas plantas, se han ideado muchas metodología extractivas como pueden ser

infusiones, percolaciones (lixiviaciones), maceraciones (continuas y discontinuas),

decocciones etc. Los productos a partir de estas metodología son líquidos impuros,

semisólidos a nivel

clínico.

o polvos que sólo pueden ser utilizados de manera oral o externa

Con la metodología empleada en el presente trabajo obtuvo un bajo rendimiento del

extracto hexánico (0.4746%) en relación con el extracto acuoso, del cual se obtuvo el

mayor rendimiento (10.4343%). Lo que significa que en la corteza de Guaiacum coulferi

existe en mayor cantidad los compuestos con características apolares (solubles en agua).

Sin embargo, en general se puede decir que el rendimiento obtenido en cada extracto

de la corteza de Guaiacum coulteri es muy bajo.

Los resultados de la valoración de los extractos y administrados a razón de 300

mg/kg de peso, utilizando como control solución salina isotónica, reflejan que el extracto

acuoso tiene mayor actividad hipoglucemiante que el extracto metanólico.

Con respecto a la valoración de los extractos utilizando como control al aceite de

maíz. se observa que el efecto hipoglucémico del extracto hexánico es mayor que el del

extracto diclorometanico a los 240 minutos.

Comparando losvalores de porcentaje de disminución de la glucemia a los 120 y

240 minutos entre el extracto hexánico y el acuoso se observa que este úitimo es el que

posee mayor efecto hipoglucémico.

23

AI fraccionar este extracto obteniéndose por medio de las columnas extrelut

(corriéndose 5 columnas) se obiuvo un bajo rendimiento de las fracciones obtenidas, a

pesar de que en estas columnas se probaron diferentes mezclas para la mejor obtención de

fracciones, donde la mezcla que mejor resultados proporcionó fue la mezcla metanol-

cloroformo a diferentes concentraciones.

Al realizar la comda de estas columnas se obtuvieron varias &acciones ( por lo

menos se recolectaban 8 fracciones de cada columna), las cuales al examinarse

cualitativamente por medio del método cromatográfico de capa fina dieron como resultado

únicamente dos fracciones. Probablemente, los resultados se deban a que la columna no da

buenos rendimientos, y tal vez la mezcla utilizada no sea la tan eficiente para la extracción

-

de las fracciones.

AI realizar las pruebas biológicas se observa que de las dos fhcciones obtenidas, la

fracción F1 muestra un i m p o k t e descenso de la concentración de glucosa en sangre tanto

a los 120 minutos y como a los 240 minutos.

Es probable que en la F1 se encuentran los meiabolitos responsables del efecto

hipoglucémico.

Los efectos hipoglucémicos obtenidos tanto de los extractos y de las fracciones se

debe en gran parte al cuidado de la temperatura de trabajo (50°C - 6OOC) en el momento de

la concentración, puesto que a temperaturas alias pueden desnatudkar el metabolito

secundario o sustancias que tenga efecto hipoglucemiante. -

24

CONCLUSIONES:

1 .- El extracto acuoso de Guaiacum coulteri, muestra un importante efecto hipogiucemico

en ratones sanos en ayunas.

2.- La fracción acuosa FI, obtenida a partir del extracto acuoso de la corteza de Guaiacum

coulteri muestra el mayor efecto hipoglucémico en ratones sanos en ayunas.

3.- Es probable que en esta fracción I se encuentre la sustancia responsable de la actividad

hipoglucemiante de Guaiacum coulteri

- RECOMENDACIONES.

La metodología aplicada de maceración en la presente investigación de la corteza de

Guaiacum coulteri has& completar la extracción, es una de las más adecuadas en el

seguimiento químico-farmacológico inicial de la sustancia(s) responsable(s) de la actividad

hipoglucemiante.

La utilización de las columnas extdut de fase inversa es parte de la metodología

que no se había realizado para este tipo de estudios químico-farmacológicos, y que por los

resultados obtenidos en este trabajo creo que no es la mejor técnica para obtener fracciones

y como consecuencia de esto no se obtendrían buenos rendimientos de éstas, aunque es muy

fácil y rápido.

Considero importante que debería de continuarse con el estudio de esta fracción,

para identificar y aislar la sustancia responsable del efecto hipoglucémico que reportó la

corteza seca de Guaiacum coulteri.

25

n L1 Y LI

U .* LI I.-

r-

y i - r ..

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28

NOMBRE: Elvira Camto Flores.

MATRICULA: 9322901 1.

LICENCIATURA: Ingenieria Bioquimica IndurtrhL

UNIDAD: iztapalnpe

DIVISION CBS.

TELEFONO 6-33-40-17.

TRIMEsTRELEmo 97-1

HORAS A LA SEMANA: 4 h o r n diarias durante 6 mua.

TiTIJLO DEL PROYECTO EFECTO HROGLUCEMICO DE EXTRACTOS Y FRACCIONES DE LA CORTEZA DE-Guahm coulteri

CLAVE DEL SERVICIO SOCIAL: IBL016.97

NOMBRE DE LOS ASESORES, PUESm Y ADSCRPCIÓN 1.- D R Rubén Román Ramos, Profesor Titular C., T.C., Departamento de Ciench de la Salud , División CBS. 2.- D R Francisco Javier Alarcón Apilar, Profesor Titnlar C, T.C., Departamento de Ciencias de Is Salud, División CBS.

LUGAR DONDE SE REAElzA EL SERVICIO

de Cien& Biológicas y de Is Salud, de h Universidad Aut6noma Metropolitana, Plantel Iztapalape

FECHA DE iNiCI0 :

Laboratorio de Farmacología ($348) del Departamento de Cien& de la Mud, de la División

&Abril de 1997.

FECHA DE TERMINACION: 25 de Enero de 1998.

& Firma del alumno

Elvira Carreto Flores.

Firma del aaaor D R RubCn Romin R D R Francisco Javier Alarcón A.