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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“FRANCISCO GARCÍA SALINAS”
UNIDAD ACADÉMICA DE BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
UTILIDAD DEL ALBENDAZOL/QUINFAMIDA EN EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR TRICHINELLA SPIRALIS EN MODELO MURINO
TTEESSIISS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRIA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
PRESENTA: Q.F.B. MAYRA JUDITH GARCÍA ROBLES
JUNIO 2009
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“FRANCISCO GARCÍA SALINAS”
UNIDAD ACADÉMICA DE BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
UTILIDAD DEL ALBENDAZOL/QUINFAMIDA EN EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR TRICHINELLA SPIRALIS EN MODELO MURINO
TTEESSIISS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRIA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
PRESENTA: Q.F.B. MAYRA JUDITH GARCÍA ROBLES
ASESORA DE TESIS:
Dra. en C. MARÍA ALEJANDRA MORENO GARCÍA
Junio 2009
Proyecto de tesis realizado dentro del Cuerpo Académico de Biología
Celular y Microbiología.
Línea de Investigación: Relación huésped-parásito de Trichinella spiralis
1
DEDICATORIA
Con mucho cariño para mis padres, hermanos y amigos:
Por su confianza
Por sus ánimos
Por la paciencia
Para volar, debes amar el viento; desear con pasión conquistar las alturas;
tener confianza en tu ser y creer en tus alas.
Alfonso Lara Castilla
2
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fase intestinal del ciclo biológico de T. spiralis. Modificado de Despommier (11) .............................. 14 Figura 2. Fase parenteral y muscular del ciclo biológico de T. spiralis ................................................................. 17 Figura 3. Estructura química del albendazol (50) ................................................................................................... 22 Figura 4. Estructura química del mebendazol(50) .................................................................................................. 23 Figura 5. Estructura química de la quinfamida (60) ................................................................................................ 25 Figura 6. Compresión en placa de tejido del músculo esquelético del grupo ATX y AC observada al microscopio
óptico. ............................................................................................................................................................. 34 Figura 7. Compresión en placa de tejido del músculo esquelético del grupo BTX y BC observada al microscopio
óptico. ............................................................................................................................................................. 35 Figura 8. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo CTX y CC observada al microscopio
óptico. ............................................................................................................................................................. 35 Figura 9. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo DTX y DC observada al microscopio
óptico. ............................................................................................................................................................. 36 Figura 10. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo ETX y EC observada al microscopio
óptico. ............................................................................................................................................................. 36 Figura 11. Tinción con azul tripano de tejidos del músculo esquelético de grupos con tratamiento y control
(diafragma) observados al microscopio óptico a 20x. .................................................................................. 37 Figura 12. Tinción de Hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo ATX y AC observada
al microscopio óptico. .................................................................................................................................... 38 Figura 13. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo BTX y BC observada al
microscopio óptico ......................................................................................................................................... 39 Figura 14. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo CTX y CC observada al
microscopio óptico. ........................................................................................................................................ 39 Figura 15. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo DTX y DC observada al
microscopio óptico. ........................................................................................................................................ 40 Figura 16. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo ETX y EC observada al
microscopio óptico. ........................................................................................................................................ 41 Figura 17. Efecto del tratamiento OXAL® a siete días de infección por T. spiralis en modelo murino .............. 42 Figura 18. Efecto del tratamiento OXAL® a siete días de infección por T. spiralis en modelo murino .............. 43 Figura 19. Efecto del tratamiento OXAL® en grupos de ratas con diferentes día de infección por T. spiralis en
modelo murino. .............................................................................................................................................. 43 Figura 20. MIDD de sueros de ratas que recibieron tratamiento a diferentes días de evolución de infección por T.
spiralis en modelo murino ............................................................................................................................. 44 Figura 21. WB de sueros de ratas que recibieron tratamiento a diferentes días de evolución de infección por
T. spiralis en modelo murino ......................................................................................................................... 45
3
Figura 22. IFI de sueros de ratas de grupos ATX y BTX observado al microscopio confocal ................................. 46 Figura 23. IFI de sueros de ratas de grupos CTX, DTX y ETX observado al microscopio confocal. ......................... 47 Figura 24. Compresión en placa de tejidos del músculo esquelético de grupos ATXA, ATXQ, y AC observada al
microscopio óptico. ........................................................................................................................................ 48 Figura 25. Compresión en placa de tejidos del músculo estriado de grupos BTXA, BTXQ, y BC observada al
microscopio óptico. ........................................................................................................................................ 48 Figura 26. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo estriado de los grupos ATXQ, ATXA, BTXQ y
BTXA observada al microscopio óptico. ......................................................................................................... 49 Figura 27. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en un grupo de ratas con un día de
infección por T. spiralis ................................................................................................................................. 50 Figura 28. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en un grupo de ratas con siete días de
infección por T. spiralis ................................................................................................................................. 51 Figura 29. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en grupos de ratas infectados con
T. spiralis ........................................................................................................................................................ 51 Cuadro 1. Protocolo de los grupos experimentales………………………………………………….…………..28
Cuadro 2. Protocolo de los grupos control ……………………………………………..…………. ……………28
Cuadro 3. Protocolo de los grupos adicionales……………………….………………………………………….28
Cuadro 4. Comparación de carga parasitaria de grupos que recibieron tratamiento y grupos control…………...41
Cuadro 5. Comparación de carga parasitaria de grupos de ratas con tratamiento individual de albendazol y tratamiento de quinfamida……………….……………………………………………………………………….50
4
TABLA DE CONTENIDO
Dedicatoria ..................................................................................................................................... 1
Índice de figuras ............................................................................................................................. 2
Tabla de contenido ......................................................................................................................... 4
Resumen ........................................................................................................................................ 7
Summary ........................................................................................................................................ 8
I. Antecedentes ............................................................................................................................... 9
1. Introducción .................................................................................................................................. 9
2. Trichinella spiralis, taxonomía y biología del parásito ................................................................. 10
2.1. Fases de desarrollo .................................................................................................................. 10
2.1.1. Gusanos adultos .............................................................................................................. 10
2.1.2. Larvas recién nacidas (LRN) .............................................................................................. 11
2.1.3. Larva infectante (LI) ......................................................................................................... 11
2.2. Antigenicidad ........................................................................................................................... 12
3. Ciclo biológico de T. spiralis ........................................................................................................ 12
3.1. Fase intestinal ..................................................................................................................... 13
3.2. Fase parenteral ................................................................................................................... 14
3.3. Fase muscular ..................................................................................................................... 15
4. Interacción hospedero‐parásito .................................................................................................. 17
4.1. Efecto fisiopatológico ......................................................................................................... 17
4.2. Respuesta inmune .............................................................................................................. 18
5. Cuadro clínico ............................................................................................................................. 20
6. Diagnóstico ................................................................................................................................. 21
6.1. Diagnóstico clínico .............................................................................................................. 21
6.2. Diagnóstico parasitoscópico o directo ................................................................................ 21
6.3. Diagnóstico inmunológico o indirecto ................................................................................. 22
7. Tratamiento ................................................................................................................................ 22
8. Quinfamida ................................................................................................................................. 25
9. Albendazol/Quinfamida (OXAL®) ................................................................................................ 26
5
II. Justificación .............................................................................................................................. 27
III. Hipótesis .................................................................................................................................. 28
IV. Objetivo .................................................................................................................................. 28
V. Materiales y Métodos ............................................................................................................... 28
1. Modelo experimental .................................................................................................................. 28
2. Infección del modelo experimental con T. spiralis ....................................................................... 30
3. Técnicas directas......................................................................................................................... 30
3.1. Compresión en placa .......................................................................................................... 30
3.2. Tinción con azul tripano ...................................................................................................... 30
3.3. Tinción de Hematoxilina y Eosina ........................................................................................ 30
3.4. Digestión artificial ............................................................................................................... 31
4. Técnicas indirectas ...................................................................................................................... 31
4.1 Obtención del antígeno soluble total (AST) .......................................................................... 31
4.2. Microinmunodifusión doble (MIDD) ................................................................................... 31
4.3. Inmunoelectrotransferencia (IET) ....................................................................................... 32
4.4. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)..................................................................................... 33
4.4 Modelo Estadístico .............................................................................................................. 33
VI. Resultados ............................................................................................................................... 34
1. Compresión en placa .................................................................................................................. 34
1.1. Grupo A .............................................................................................................................. 34
1.2. Grupo B ............................................................................................................................... 34
1.3. Grupo C ............................................................................................................................... 35
1.4. Grupo D .............................................................................................................................. 36
1.5. Grupo E ............................................................................................................................... 36
2. Tinción con azul tripano .............................................................................................................. 37
3.1. Hematoxilina y eosina .............................................................................................................. 38
3.1. Grupo A .............................................................................................................................. 38
3.2. Grupo B ............................................................................................................................... 38
3.3. Grupo C ............................................................................................................................... 39
3.4. Grupo D .............................................................................................................................. 40
3.5. Grupo E ............................................................................................................................... 40
6
4. Digestión artificial ....................................................................................................................... 42
5. Microinmunodifusión doble (MIDD) ............................................................................................ 44
6. Western blot (WB) ...................................................................................................................... 45
7. Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ............................................................................................. 46
8. Evaluación de albendazol y quindamida ..................................................................................... 48
8.1. Compresión en placa .......................................................................................................... 48
8.2. Hematoxilina y eosina ......................................................................................................... 49
8.3. Digestión artificial ............................................................................................................... 50
VII. Discusión ................................................................................................................................ 52
VIII. Conclusiones .......................................................................................................................... 57
IX. Referencias .............................................................................................................................. 58
Abreviaturas ................................................................................................................................. 65
7
RESUMEN
La trichinellosis es una enfermedad parasitaria ocasionada por el nemátodo
Trichinella spiralis. El ciclo de vida del parásito abarca tres estadios: la fase intestinal,
donde ocurre la invasión y maduración de larvas infectantes en el epitelio columnar del
intestino; la fase parenteral, que abarca la migración de las larvas recién nacidas por el
torrente sanguíneo, y la fase muscular, en la cual se establece la célula nodriza en el
músculo esquelético. Actualmente el tratamiento utilizado para la trichinellosis es la
administración de albendazol o mebendazol. Estos medicamentos son efectivos contra el
parásito, solo si se administran por periodos prolongados; sin embargo existe el
inconveniente de que pueden causar efectos adversos en el hospedero. El objetivo de este
trabajo fue evaluar el efecto terapéutico del medicamento OXAL®
(albendazol/quinfamida) contra la infección por T. spiralis en modelo murino, a
diferentes tiempos de evolución de infección (1, 7, 15, 30 y 60 días) y por un periodo de 3
días. Las muestras de tejidos se analizaron mediante técnicas directas, (compresión en
placa, tinción con azul tripano, tinción con hematoxilina-eosina y digestión artificial) y a
las muestras de suero se les realizaron las técnicas indirectas (microinmunodifusión
doble, inmunoelectrotransferencia e inmunofluorescencia indirecta). Los resultados
obtenidos mostraron que la administración de OXAL® durante 3 días, solo tuvo eficacia
terapéutica durante la fase intestinal, ya que no se obtuvo carga parasitaria en el grupo
con 1 día de infección, y la obtenida en el grupo con 7 días de infección tuvo una
disminución significativa respecto al control, p < 0.05.
8
SUMMARY
Trichinellosis is a parasitic disease caused by the nematode Trichinella spiralis.
The parasite's life cycle comprises three stages: the intestinal phase, where occurs the
invasion and maturation of infective larvae in the columnar epithelium of the intestine,
the parenteral phase, which encompasses the migration of newborn larvae through the
bloodstream, and muscle phase, which establishes the nurse cell in skeletal muscle.
Currently the treatment for Trichinellosis includes the administration of albendazole or
mebendazole. These drugs are effective against the parasite, only if administered for
prolonged periods; however there is a drawback that can cause adverse effects on the
host. The aim of this study was to evaluate the therapeutic efficacy OXAL®
(albendazole /quinfamide) against infection by T. spiralis in mice at different times of
evolution of infection (1, 7, 15, 30 and 60 days) and for a period of 3 days. The tissue
samples were analyzed using direct techniques (compression plate, staining with trypan
blue, hematoxylin-eosin staining and artificial digestion) and serum samples were serum
samples were analyzed using indirect techniques (immunodouble diffusion,
inmunoblotting and indirect immunofluorescence). The results showed that
administration of OXAL® for 3 days, had only effective therapy for intestinal phase,
since there was no parasitic load in the group with 1 day of infection, and the obtained in
the group with 7 days of infection showed a significant decrease with regard to control,
p <0.05.
9
I. ANTECEDENTES
1. Introducción
La triquinelosis es una infección transmitida por el nemátodo Trichinella spiralis,
y ha sido una enfermedad importante desde la antigüedad, aunque frecuentemente no es
reconocida, sin embargo continua siendo una preocupación de salud pública a nivel
mundial. Se estima que aproximadamente diez millones de personas alrededor del mundo
podrían estar infectadas (1).
La infección comienza al ingerir carne cruda o insuficientemente cocida (principalmente
carne de puerco y productos realizados con ella) de animales infectados que contienen
larvas infectantes (LI) en su fase muscular, las LI ingeridas migran y son encapsuladas en
el músculo. La enfermedad clínica en el hombre es altamente variable y puede presentarse
desde una infección asintomática, hasta una fulminante enfermedad fatal (2), los síntomas
se correlacionan con la etapa de la infección y la fase de desarrollo del parásito (3).
Factores como la edad, sexo, estado nutricional, así como el número de larvas ingeridas
viables son relacionados con la severidad de la infección (1).
El diagnóstico de la infección se basa la detección directa o indirecta del parásito en el
hospedero. Las técnicas directas incluyen la triquinoscopia, análisis histológico de tejido
muscular y digestión artificial, mientras que la técnicas indirectas más utilizadas para la
detección de anticuerpos (Ac) específicos de T. spiralis son: Dot-ELISA Western blot e
inmunofluorescencia indirecta (1). En México, el albendazol y mebendazol son utilizados
como tratamiento de elección para la infección por T. spiralis, sin embargo para tener el
efecto terapéutico esperado, su administración debe ser por periodos prolongados y ello
puede ser causa de efectos colaterales.
10
2. Trichinella spiralis, taxonomía y biología del parásito
T. spiralis pertenece al género Trichinella, que a su vez forma parte de la
superfamilia Trichinelloidea. Los nemátodos que pertenecen a esta superfamilia, se
caracterizan por la presencia de esticosoma, bandas bacilares (3), ciclo biológico
desarrollado dentro de un solo hospedero y una etapa larvaria infectante desarrollada en
las células del músculo esquelético(4). El esticosoma es un órgano especializado,
responsable de la secreción de importantes antígenos, (5) presente en las etapas larvales y
adultas de los gusanos redondos de la superfamilia Trichinelloidea (6). Las bandas
bacilares se consideran como un componente integral de la hipodermis, poseen funciones
osmoreguladoras, secretoras y sensoriales, y también se encuentran en todas las etapas de
T. spiralis (4).
Los nemátodos del género Trichinella infectan un amplio rango de mamíferos, aves y
reptiles (7), siendo los mamíferos los hospederos más importantes (8); su ciclo biológico
comprende tres fases: fase intestinal, fase parenteral y fase muscular (7).
Existen 11 especies que comprenden el género Trichinella, las cuales a su vez se
clasifican en dos distintos clados; el clado encapsulado y el no encapsulado; este término
se refiere al desarrollo de una cápsula de colágena alrededor de la célula muscular
infectada con la LI (9), ya que ocurre la transcripción de genes regulatorios que activan la
producción de colágena tipo IV y VI. La cápsula le proporciona características esenciales
al parásito en relación a aspectos fisiológicos e inmunológicos durante la relación
hospedero-parásito (10). T. spiralis pertenece al clado encapsulado, históricamente ha
sido la especie más importante causante de infecciones en humanos (7).
2.1. Fases de desarrollo
2.1.1. Gusanos adultos
Las LI se establecen en el epitelio intestinal hasta madurar a gusanos adultos, lo
que les toma aproximadamente 30 horas. Los machos adultos miden 1.5 mm de longitud
por 36 μm de diámetro y las hembras adultas miden 3 mm de longitud por 36 μm de
diámetro (11).
11
Se ha determinado que las LI realizan 4 mudas; la muda de los machos se da a las 9, 13,
18 y 25 horas posteriores a la infección (hpi), mientras que las hembras lo hacen a las 10,
15, 21 y 28 hpi (12).
La cutícula de la segunda, tercera, cuarta muda, así como la de gusanos adultos, es
prácticamente similar en estructura (13). En cada muda se puede apreciar en machos y
hembras, la presencia o ausencia de apéndices copulatorios, y el desarrollo de la vagina y
útero, respectivamente (12). Los esticositos de los gusanos adultos poseen gránulos tipo I
y II, y muestran diferencias en estructura y antigenicidad respecto a los gránulos de las LI
del músculo esquelético (14). Los gusanos adultos se mantienen en el epitelio intestinal
aproximadamente por 4-5 días, y posteriormente se lleva a cabo la cópula (1).
2.1.2. Larvas recién nacidas (LRN)
Al cabo de 5 días posteriores a la copula (11), las hembras liberan
aproximadamente de 500-1500 LRN (15), sin embargo en modelo murino se ha reportado
que en promedio se liberan de 60-80 LRN (16). Las LRN miden 0.08 mm de longitud por
7 μm de diámetro, y es la única fase de desarrollo del parásito que posee estiletes en la
cavidad oral, lo que les permite crear aberturas de entrada en las células del hospedero,
cuando son diseminadas sistemáticamente a tejidos y órganos durante la migración,
periodo que continua hasta aproximadamente el día 20 posterior a la infección (11).
2.1.3. Larva infectante (LI)
La LI mide 1.2 mm de longitud por 40 μm de diámetro, se encuentra implantada
en el músculo esquelético, en el interior de una estructura denominada célula nodriza.
Esta fase de desarrollo es la responsable de la transmisión de la enfermedad (17). El
esticosoma de la LI consiste de una hilera de 45-55 esticositos, que ocupan la mitad de la
región anterior de la larva (6), contienen 5 tipos de gránulos citoplasmáticos, clasificados
en base a su morfología como α0, α1, α2, β y γ, o 4 tipos (α, β, γ y δ) de acuerdo a la
inmunohistoquímica de sus gránulos (5).
12
2.2. Antigenicidad
Dentro de los gránulos de los esticositos, están contenidos antígenos que
reaccionan con el suero del hospedero (6), cuando estos se degranulan, el contenido de
sus gránulos es liberado hacia el lumen del tracto intestinal del parásito y son excretados.
Estos productos son referidos como productos de secreción y excreción (ES)(18).
Los antígenos de T. spiralis son específicos de acuerdo a la fase de desarrollo del
parásito, y en base a su reconocimiento por anticuerpos monoclonales y policlonales, se
han clasificado en 8 grupos (TSL1-TSL8)(19). Los antígenos TSL1 han sido los más
estudiados. Comprenden un grupo de 6 glicoproteínas que comparten un epítope
inmunodominante de tivelosa de 43kDa. Se les encuentra abundantemente en los
productos de ES, así como en la superficie de la cutícula, y estimulan la respuesta inmune
humoral y celular del hospedero (20).
Las larvas del epitelio intestinal y el esticosoma de las LI musculares, secretan a los
antígenos TSL1 (20). Se ha implicado a estas glicoproteínas como mediadores de la
invasión intestinal, ya que en estudios realizados con líneas celulares y usando
anticuerpos anti-tivelosa, se demostró que estos anticuerpos específicos interfirieron con
el establecimiento del nicho de T. spiralis en el epitelio intestinal (21); asimismo, estudios
han determinado que la proteína de 43 kDa es secretada hacia el miocito por la LI y luego
es translocada al núcleo, por lo que probablemente tiene un papel en la modulación de la
expresión de genes que participan en la formación de la célula nodriza (22).
3. Ciclo biológico de T. spiralis
El ciclo biológico de T. spiralis se completa en un solo hospedero y abarca 3 fases.
La fase intestinal comprende el establecimiento de la infección y la muda de las larvas
hasta gusanos adultos, la migración de las LRN corresponde a la fase parenteral y
finalmente en la fase muscular ocurre el establecimiento de la LI en el miocito (17).
13
3.1. Fase intestinal
Da comienzo cuando una persona o animal come carne infectada con la LI
encapsulada. La LI es liberada de su cápsula por acción de los jugos gástricos del
estómago, ya libre, la larva se dirige hacia el intestino delgado (15). La capa externa de la
cutícula es parcialmente digerida, permitiéndole al parásito recibir señales del ambiente y
seleccionar al epitelio columnar, como el sitio de establecimiento de la infección (11),
específicamente en el citoplasma de los enterocitos a nivel de la plataforma de las criptas
(3). Estudios in vitro han mostrado que la larva transita con un movimiento parecido al de
una serpiente, utilizando su cabeza para sondear y escarbar las superficies celulares,
produciéndoles brechas no letales y así entrar directamente al citoplasma de las células
epiteliales (23).
Sumado a esto, los productos de ES de T. spiralis, contienen proteinasas y
metaloproteinasas, que contribuyen a la degradación de la matriz extracelular y facilita la
penetración del parásito al epitelio columnar (24) (Fig. 1).
La invasión a las células epiteliales le toma aproximadamente 10 minutos, causando
modificaciones en el borde de las vellosidades, lámina propia y músculo liso del yeyuno.
A 30 horas posteriores a la infección (hpi), el parásito realizó 4 mudas, paso de L2 a L5,
hasta alcanzar la fase adulta (17). Mediante SEM, se ha observado que el parásito está en
constante movimiento dentro del epitelio (25). A 5 días posteriores a la infección (dpi),
ocurre la invasión simultánea de células epiteliales por parte de las hembras y machos,
formando un nicho intramulticelular, donde se llevará a cabo la cópula en las siguientes
40 horas (17).
14
Figura 1. Fase intestinal del ciclo biológico de T. spiralis. Modificado de Despommier (11)
3.2. Fase parenteral
La migración comienza cuando las LRN son liberadas entre los 8 y 11 dpi (17),
entran en la lamina propia, penetran a los nódulos linfáticos mesentéricos o al torrente
sanguíneo y son distribuidas por todo el organismo, llegando a varios órganos y tejidos
(11), eventualmente llegan a través de los capilares a las fibras musculares; sin embargo
solo las LRN que invadieron el músculo esquelético sobreviven, maduran a LI y
constituyen la fase muscular de la infección (17).
15
3.3. Fase muscular
Las LRN crecen en forma exponencial y se diferencian poco a poco en LI,
desarrollándose también el esticosoma y el producto de sus gránulos (26). Mientras tanto,
el miocito se transformará en una célula nodriza en aproximadamente 20-28 días (17).
Durante ese tiempo T. spiralis inducirá modificaciones y secretará señales dentro del
miocito, que resultarán en la reprogramación de la expresión genómica de la célula
muscular, y se reflejará por la pérdida de proteínas especificas del músculo, la
sobreexpresión de colágena y el desarrollo de una red de vasos sanguíneos alrededor de la
célula nodriza (3).
La formación de la célula nodriza implica varios cambios dentro del miocito. A 8 días
posteriores a la infección del miocito (pim), ocurre la pérdida de elementos contráctiles,
aumento de núcleos, con nucléolos prominentes, hipertrofia de retículo sarcoplásmico,
vacuolación de mitocondrias (27) y la presencia abundante de un citoplasma basofílico
(28). A partir del día 9 pim comienza la invaginación de la membrana plasmática y el
aumento de grosor del glucocalix. Para el día 10 se desarrolla una doble membrana,
adyacente a la cutícula de la larva y también ahí se sitúan el retículo endoplásmico rugoso
(RER) y mitocondrias (27). Las células satélites son células musculares inactivas
presentes en la superficie de las miofibras; la infección del miocito causa su activación,
proliferación y fusión entre ellas mismas o con las células musculares infectadas,
ocasionando el cambio a un citoplasma eosinofílico y la disminución del citoplasma
basofílico (28). Mientras tanto, la célula nodriza en formación se va rodeando por una
cápsula de colágena entre los días 9-15 pim. Estudios han revelado que la cápsula está
formada por 2 capas de colágena, correspondientes al tipo IV y VI (29).
La formación de la red de vasos sanguíneos comienza a los 12 días pim (30). Se sabe que
T. spiralis induce la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEFG), el
cual estimula la formación de los vasos sanguíneos (31).
En el sarcoplasma de la célula nodriza en formación, se ha detectado el péptido del VEFG
entre los días 7-16 pim, así como en el área circundante a la célula nodriza entre los días
15-17 pim (30).
16
Las redes de vasos sanguíneos que rodean a la célula nodriza, son el resultado de la
angiogénesis inducida durante la infección; estos se caracterizan por ser grandes vasos
que dan lugar a otros más pequeños (32). A través de estos nuevos vasos sanguíneos se
origina un flujo de sangre que le permite al parásito nutrirse, engordar y crecer dentro de
la célula nodriza (31).
Finalmente, cada célula nodriza madura contiene de 20-30 núcleos, mientras que el RER
y mitocondrias son remplazadas por retículo sarcoplásmico (27) (Fig. 2). Otras
modificaciones que ocurren dentro del miocito, son el aumento de la síntesis de grasas,
disminución del glucógeno, del aporte de oxígeno, producción de bióxido de carbono,
mioglobina, creatinina libre y fosfocreatina. En su conjunto, todos estos cambios indican
que la célula muscular ya no es capaz de realizar la contracción (33).
La manera en como T. spiralis induce estas modificaciones en los miocitos, aún no está
bien establecido, sin embargo se tienen varias propuestas. La tivelosa se ha implicado en
los mecanismos involucrados en la formación de la célula nodriza (22).
Aproximadamente a los 8 días pim, la tivelosa es secretada por la LI (34). Asimismo, los
productos de ES con actividad endonucleasa, se han relacionado con el reconocimiento de
las células musculares del hospedero, la detención del ciclo celular en fase G2/M y la
reorganización que ocurre en ellas, lo que conduce al establecimiento de la célula nodriza
(24). Recientemente se ha sugerido que T. spiralis utiliza el mecanismo de reparación de
las células musculares durante el desarrollo de la célula nodriza, ya que existen muchas
similitudes entre el proceso de formación de la célula nodriza y la regeneración de las
células musculares después de alguna lesión en ellas (28).
17
Figura 2. Fase parenteral y muscular del ciclo biológico de T. spiralis
Fotografías del Departamento de Biología Celular y Microbiología de la Unidad Académica de Biología Experimental.
4. Interacción hospedero-parásito
4.1. Efecto fisiopatológico
Las infecciones gastrointestinales por nemátodos, se caracterizan por la atrofia de
vellosidades, hiperplasia de criptas, hiperplasia de células goblet y una marcada
infiltración de células inflamatorias, con predominio de eosinófilos y mastocitos (35), lo
que resulta en una inflamación de mucosas, y aumento de la actividad propulsiva en los
primeros 5 dpi (36).
18
Las células goblet constituyen la principal fuente de mucinas en el intestino. Las mucinas
son glicoproteínas involucradas en la formación del moco que protege la superficie del
epitelio intestinal. En infecciones por nemátodos, entre los que se encuentra T. spiralis, es
común la hiperplasia de las células goblet, aumento en la secreción de moco y la
sobreregulación del gen de mucina secretora (Muc2) y la mucina unida a membrana
(Muc3). Asimismo, en infecciones por T. spiralis también se ha observado la hiperplasia
e hipertrofia del músculo liso, y un aumento de actina y miosina (37).
La liberación de las LRN produce una inflamación local, con un infiltrado de eosinófilos,
neutrófilos y linfocitos (11). Durante la migración de las LRN, se produce destrucción del
tejido muscular, con liberación de enzimas musculares (15). Aproximadamente del día 15
al 22 hay estimulación de reacciones inflamatorias, debido a la penetración de LRN a los
tejidos (17).
Durante la fase muscular, a partir de los 14 días pim se observa un aumento de tamaño de
las fibras musculares, con aspecto edematoso y alteraciones en las estriaciones. Mientras
se va dando la formación de la célula nodriza, también se produce una inflamación
intersticial, con aumento de leucocitos polimorfonucleares y linfocitos (33).
4.2. Respuesta inmune
Las infecciones gastrointestinales por nemátodos, dan lugar a la migración de
leucocitos a tejidos linfoides asociados a intestino (GALT)(38). Cuando la LI de
T. spiralis comienza a invadir los enterocitos, se liberan gránulos del esticosoma y se
expone la cutícula, por lo que sus antígenos son reconocidos y procesados por células del
sistema inmune (39).
Después de la estimulación de los linfocitos T cooperadores por los antígenos del
parásito, y de acuerdo a las citocinas secretadas, se diferencian hacia dos tipos de células
efectoras, los linfocitos TH1 o TH2. La respuesta a infecciones por helmintos está dirigida
por los linfocitos TH2, los cuales secretan IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13 (40) y cuya
principal función es estimular una inflamación rica en eosinófilos y mastocitos (41).
19
Las principales efectos de las citocinas secretadas son: estimular la producción de
eosinófilos en médula ósea, su activación y quimiotaxis (IL-5), estimular la producción y
activación de mastocitos (IL-9), y estimular la proliferación de linfocitos B, producción
de anticuerpos y el cambio de IgG a IgE (IL-4, IL-10 e IL-13) (40). Por su parte, la
respuesta humoral contra los helmintos está dada por la IgG, IgE, IgM e IgA (42).
Durante el periodo de maduración de las larvas, se activa la producción de anticuerpos.
La subsiguiente exposición de los antígenos de los gusanos adultos y las LRN inducen
una mastocitosis y el comienzo de la inflamación del intestino (25).
La IL-4 secretada por los linfocitos TH2, estimula la producción de IgE. Los mastocitos se
unen a la IgE que opsoniza la superficie de las larvas mediante el receptor de superficie
celular para la región constante de IgE (FcεRI), activándolos y provocando la liberación
de los mediadores de sus gránulos (histamina, prostaglandinas, leucotrienos y proteasas),
lo que resulta en un incremento en la motilidad gastrointestinal, hipersecreción de moco,
incremento de la permeabilidad vascular, y el reclutamiento y activación de leucocitos
como parte del mecanismo de expulsión del parásito (43).
Las β-quimasas de los mastocitos aumentan en el torrente sanguíneo y en el lumen del
intestino durante las infecciones por parásitos, ya que participan en su expulsión. Ratones
deficientes de β-quimasa infectados con T. spiralis, tienen una expulsión retardada en
intestino y una mayor implantación de la larva en el músculo esquelético, lo que
demuestra la importancia de la quimasa en la expulsión inmunológica de nemátodos
como T. spiralis (44).
En su conjunto, las citocinas secretadas y las células efectoras, crean un ambiente hostil
para el parásito, ya que se incrementa la secreción de fluido, moco, contractilidad del
músculo intestinal, la actividad propulsiva y se acelera el transito del intestino, lo que
favorece el desalojamiento de parásitos que ya han sido dañados por la respuesta inmune
efectora (43).
20
La migración de las LRN provoca una inflamación aguda, con presencia de eosinófilos,
neutrófilos y linfocitos (11). Los gránulos de los eosinófilos contienen proteínas que son
tóxicas para los helmintos, como la proteína básica principal (MBP) y la proteína
catiónica eosinofilica (ECP)(45). La presencia del parásito desencadena una citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos (ADCC), en la cual la IgG que opsoniza a la larva se
une al receptor de superficie celular para la región constante de IgG (FcγRII) de los
eosinófilos, esta interacción activa al eosinófilo para que libere a la MBP y ECP sobre la
superficie de la larva y ejerzan su acción helmintotóxica (45, 46). Con la invasión de las
LRN al músculo persiste la respuesta humoral y conforme se va formando la célula
nodriza, hay presencia masiva de eosinófilos e inflamación del miocito (39).
5. Cuadro clínico
Los signos y síntomas se correlacionan con la etapa de la infección y la presencia
de la forma infectiva de T. spiralis. La mayoría de los individuos que se infectan después
de consumir la carne infectada con el parásito son asintomáticos, sin embargo algunos
experimentan diarrea leve transitoria y nauseas (15). La severidad de la infección depende
del número de larvas ingeridas viables y la susceptibilidad individual, en la que
intervienen factores, como la edad, sexo, estado nutricional y factores genéticos (1).
Mediante estudios realizados en ratas infectadas con T. spiralis, se comprobó que las
hembras son más resistentes a la enfermedad que los machos, y que la desnutrición es un
factor importante para la susceptibilidad de la enfermedad (47).
Durante la primera semana de la fase intestinal en pacientes con una infección moderada
a severa, los síntomas que se presentan son: dolor abdominal superior, diarrea o
constipación, vomito, malestar y fiebre, lo anterior relacionado con la penetración de las
LI a la mucosa intestinal y el aumento de mastocitos en el área local (15). Después de 2-6
semanas del comienzo de la infección, cuando ocurre la migración de las LRN, se puede
presentar mialgia difusa, edema periobarbital y/o facial, conjuntivitis, fiebre, dolor de
cabeza, dificultad para tragar o abrir la boca, insomnio, pérdida de peso, sensaciones
nerviosas periféricas, disturbios visuales y parálisis de músculos oculares (15).
21
En fase muscular a partir de los 14 días pim se presenta edema, miositis, debilidad, dolor,
fotofobia y dificultad para respirar, en infecciones graves, el enfermo puede presentar
hipotensión, encefalitis, parálisis, coma e incluso la muerte (15, 48).
6. Diagnóstico
6.1. Diagnóstico clínico
Una leucocitosis (12,500-18,000 /mm3) con predominio de eosinófilos
(1,400-8,700/ mm3) es típico en una triquinelosis. Por lo tanto, la eosinofilia es la
principal y más temprana característica de laboratorio encontrada y se correlaciona con la
intensidad de la infección (15). Es común que en el suero de las personas enfermas se
encuentren niveles altos de enzimas musculares, como la creatinina fosfocinasa, 1,6-
difosfofructoaldolasa, lactato deshidrogenasa y aminotransferasa, ya que son liberadas
con la destrucción del tejido muscular, causado por la penetración de las LRN. También
se pueden presentar disturbios bioeléctricos en músculos infectados con T. spiralis, los
cuales son revelados por una electromiografía y consisten en lesiones musculares y
disminución de amplitud de la contracción del músculo (1).
6.2. Diagnóstico parasitoscópico o directo
La triquinoscopia es de gran utilidad en el diagnóstico, ya que detecta las larvas de
T. spiralis y define la intensidad de la infección (número de larvas por gramo de tejido
examinado (1). En el caso de la triquinelosis humana, se consideran infecciones leves
aquéllas en las que existen de 1 a 50 LI por gramo de músculo; moderadas, de 50 a 100
LI, y graves de 100 LI a más (48). Para realizarla, pequeñas muestras de músculo son
comprimidas entre dos laminillas de vidrio y observadas bajo un microscopio de luz (1).
Los análisis histológicos del tejido muscular revelan fragmentos de la larva en los
diferentes estados del desarrollo, la presencia de la capsula de colágena, la transformación
basofílica de la célula muscular infectada y el infiltrado celular. La digestión artificial de
las muestras de músculo con pepsina y HCl son muy útiles para determinar la carga
parasitaria y aislar las larvas para su identificación. Sin embargo, si el tejido muscular es
tomado tempranamente, la larva puede ser destruida; solo las larvas musculares de al
menos 10-12 días pim (2-3 semanas post-infección) no son destruidas por la digestión (1).
22
6.3. Diagnóstico inmunológico o indirecto
Las técnicas más utilizadas para la detección de anticuerpos (Ac) específicos de
T. spiralis son: Dot-ELISA, que es una variante de ELISA (enzyme linked inmunosorbent
assay), Western blot y la inmunofluorescencia indirecta (1, 49). La técnica de ELISA es
la más recomendada y es mejor si se usa en combinación con el Western blot, para
confirmar las muestras positivas de ELISA o excluir resultados falsos positivos (1).
7. Tratamiento
El tratamiento de elección para la infección por T. spiralis, es la administración de
benzimidazoles. Los fármacos más utilizados en México son albendazol y mebendazol. El
albendazol es un antihelmíntico de amplio espectro (Fig. 3). Después de la administración
por vía oral, se absorbe erráticamente y experimenta rápidamente metabolismo de primer
paso en el hígado, hacia el metabolito sulfóxido de albendazol. Una dosis de 400 mg,
alcanza concentraciones máximas variables en el plasma después de tres horas y su vida
media plasmática es de 8-12 horas. El sulfóxido se une predominantemente a proteínas,
distribuyéndose bien en los tejidos y es excretado por la orina (50). En adultos, la dosis
recomendada es de 400 mg, 2 veces al día durante 10-15 días (1)
Figura 3. Estructura química del albendazol (50)
Efectos secundarios leves y transitorios como diarrea, nausea o dolor de cabeza son
presentados cuando es administrado por periodos cortos (1-3 días). En contraste, su uso
por periodo prolongado puede causar dolor abdominal, cefalea, fiebre, fatiga, alopecia,
incremento de enzimas hepáticas y pancitopenia (50).
23
El mebendazol es un benzimidazol sintético con un gran espectro de actividad contra
helmintos (Fig. 4). El medicamento absorbido (menos del 10%) se une a proteínas
plasmáticas y se convierte rápidamente en metabolitos sin actividad (principalmente
durante su primer paso en el hígado). Tiene una vida media de 2-6 horas y se excreta
predominantemente en la orina. La dosis usada para la triquinelosis es de 200-400 mg por
3 días y posteriormente 400-500 mg por 10 días. Reacciones de hipersensibilidad,
agranulocitosis, alopecia y aumento de enzimas hepáticas, son efectos secundarios
ocasionados por la administración a dosis altas (50).
Figura 4. Estructura química del mebendazol(50)
Aunque parte del efecto de los benzimidazoles es alterar diversas reacciones bioquímicas
del gusano, incluida la captación de glucosa, su acción principal se ejerce mediante una
interacción con la β-tubulina, inhibiendo de ese modo la polimerización necesaria para la
formación de los microtúbulos, los cuales además de formar el citoesqueleto participan en
diversas funciones celulares, particularmente en la división celular, el transporte de
nutrientes y la excreción de desechos metabólicos; de tal manera que algunas funciones
del mantenimiento de la forma celular, división celular y transporte intracelular son
alteradas, dando como resultado final la inmovilización y muerte del parásito (51).
El tratamiento con benzimidalozes ha mostrado eficacia para fase intestinal y parenteral
en modelo murino. La acción en fase muscular es más variable, se relaciona con el
tiempo de administración del medicamento, y el tiempo de implantación de la célula
nodriza en tejido muscular (1).
24
Estudios realizados en modelo suino infectados con T. spirlis y tratados con diferentes
antiparasitarios, mostraron que la administración de albedazol tuvo mayor eficacia, ya
que la carga parasitaria disminuyó y se observaron LI en aparente estado necrótico (52).
También existen reportes de eficacia terapéutica de benzimidazoles en humanos. Un
hombre de 49 años de edad fue admitido al hospital y diagnosticado con triquinelosis, ya
que presentaba hipertrofia muscular generalizada, debilidad, eosinofilia y niveles altos de
enzimas musculares. El diagnóstico se confirmó cuando la biopsia del músculo reveló la
presencia de larvas de T. spiralis. Al paciente se le administró albendazol por cuatro
semanas. Después de 3 meses la hipertrofia muscular desapareció, mientras que los
niveles de eosinófilos y enzimas musculares regresaron a los valores normales (53).
También es conveniente la administración simultánea de corticoesteroides, para el alivio
de la fiebre y los efectos colaterales de la inflamación, debido al daño celular que resulta
de la penetración de LRN a los tejidos (15). El uso de prednisona ha mostrado tener
buenos efectos para aliviar los síntomas de la triquinelosis (54)
La Food and Drug Administration (FDA), ha establecido cinco categorías que indican el
nivel de riesgo que poseen los medicamentos para los fetos. El albendazol y el
mebendazol se encuentran en la categoría C, ya que se ha demostrado evidencia de
efectos embriotóxicos y teratogénicos en animales experimentales (55). Un estudio
realizado en ratas preñadas demostró que la exposición prenatal al albendazol entre los
días 9 y 11 es causa de malformaciones, retardo de desarrollo fetal y alteraciones
estructurales hepáticas (56). También se ha comprobado que los fetos muestran un retraso
en crecimiento, marcado por desarrollo anormal y/o nulo en órganos vitales, tanto en
cavidad torácica como en cavidad abdominal (57). Asimismo, existe el reporte de un feto
con efectos teratogénicos causados por la administración de mebendazol por 10 días, a
una mujer embarazada con diagnóstico de triquinelosis (58).
25
8. Quinfamida
La quinfamida es una quinoleína halogenada, cuya estructura básica común es la
quinoleína (Fig. 5). Es de gran eficacia como amebicida luminal y es de gran utilidad para
el tratamiento de la amibiasis. Se administra por vía oral en dosis de 100 mg, tres veces
durante un día (59).
Figura 5. Estructura química de la quinfamida (60)
La concentración sérica máxima se alcanza a 7 horas de la administración. Después de 24
horas, la quinfamida se elimina por vía renal (50%) y en heces (50%) (61). La actividad
amebicida se ha atribuido a la capacidad de quelación del hierro, lo que disminuye las
disponibilidades de este mineral en el entorno, afectando así a la E. histolytica, que
requiere de altas concentraciones de hierro para su multiplicación y desarrollo (59),
estudios in vitro han mostrado que la deficiencia o baja concentración de hierro, afecta
negativamente el crecimiento, adherencia y citotoxicidad de E. histolytica, sumado a ello
(62).
Estudios in vitro han mostrado que la administración de quinfamida por vía oral inhibe el
crecimiento y la motilidad de la amiba, además de controlar su propagación. Sumado a
ello, se ha demostrado la acción terapéutica de la quinfamida en pacientes con amibiasis a
una sola dosis de 300 mg, sin mostrar efectos colaterales (63). Otro estudio demostró que
una dosis de 100 ó 200 mg/3 veces al día también es efectiva como amebicida luminal
(64).
26
En un estudio realizado en la ciudad de Guanajuato, se concluyó que la administración de
quinfamida (300 mg) cada 3 o 6 meses, reduce la frecuencia de quistes de E. histolytica,
por lo que se considera como una buena opción de quimioprofilaxis (65).
Al comparar la eficacia terapéutica de la quinfamida con la etofamida; otro amebicida
luminal, se concluyó que ambos tienen buena actividad amebicida, sin embargo el hecho
de que la administración de la quinfamida sea solo por un día, a diferencia de los 3 a 5
días de la etofamida, posicionan a la quinfamida como una mejor opción para cumplir con
el régimen (66). Cefalea, nausea y dolor abdominal, son algunos de los efectos
secundarios que pueden ser ocasionados por la administración de quinfamida,
generalmente son leves y transitorios. Por lo tanto, la quinfamida se considera un
medicamento efectivo contra la amibiasis a una sola dosis y con muy pocos efectos
adversos.
9. Albendazol/Quinfamida (OXAL®)
Existen antiparasitarios que combinan dos medicamentos, tal es el caso de OXAL®, cuya
formulación contiene albendazol, un antihelmíntico, y la quinfamida, un amebicida
luminal (67). Esta asociación de medicamentos es referida como una interacción
farmacológica. Una interacción farmacológica se define como la acción que un fármaco
ejerce sobre otro, de tal manera que experimente algún cambio cuantitativo o cualitativo
en sus efectos. Los mecanismos de interacción son categorizados como farmacocinéticos
y farmacodinámicos. En la interacción farmacocinética, las modificaciones ocurren sobre
los procesos de absorción, distribución, metabolismo y eliminación, mientras que en la
interacción farmacodinámica ocurren efectos de sinergia, antagonismo y potenciación.
La asociación de fármacos ocurre frecuentemente, ya que se pueden obtener sinergias
funcionales con aplicaciones terapéuticas beneficiosas, aunque también puede tener
consecuencias tóxicas. Las interacciones farmacodinámicas sinérgicas frecuentemente se
utilizan en el aparato circulatorio, la terapéutica anticoagulante, antineoplásica y en la
terapéutica antiinfecciosa, entre otros (68). El medicamento OXAL® está indicado en
amibiasis intestinal aguda causada por E. histolytica, y como antihelmíntico efectivo
contra nemátodos y cestodos (67).
27
II. JUSTIFICACIÓN
Actualmente los medicamentos más utilizados en el tratamiento de la triquinelosis son el
albendazol y mebendazol (50). Estos benzimidazoles son efectivos para el tratamiento de
la infección por T. spiralis; el inconveniente radica en que es necesario administrarlos por
periodos prolongados para tener el efecto terapéutico esperado. Sin embargo se ha
demostrado que su administración puede ser causa de efectos embriotóxicos y
teratogénicos en animales experimentales (56, 57). El uso de estos medicamentos durante
el embarazo puede ser causa de efectos teratogénicos en el feto (58), por lo tanto están
contraindicados en mujeres embarazadas (50). Por ello es importante disponer de otros
medicamentos que sean efectivos contra el parásito, pero que su periodo de
administración sea corto.
El OXAL® es un medicamento que combina la acción del antihelmintico albendazol con
la quinfamida, un amebicida intraluminal (67). Se ha propuesto que la quinfamida actúa
inhibiendo la disponibilidad del hierro e interfiriendo con el crecimiento y motilidad de la
amiba (59, 63). Por su parte, la administración de albendazol resulta en la inmovilización
y muerte de T. spiralis (51), asimismo, se ha reportado que la disponibilidad del hierro
también es importante para su sobrevivencia (69).
El OXAL® es considerado como un antiparasitario capaz de eliminar amibas, nemátodos
y cestodos; su dosificación se administra solo por un día, y si es necesario por tres días
más (67). Puesto que el efecto final de los dos medicamentos es inmovilizar a los
parásitos, es posible que la asociación de albendazol y quinfamida, resulte en una sinergia
que aumentará la inmovilización y posterior muerte del parásito. En base a ello se
propone evaluar si la administración de OXAL® por un periodo de 3 días, disminuirá la
carga parasitaria en grupos de ratas infectados con T. spiralis, evitando el efecto tóxico
del albendazol no solo a nivel de embriones, sino también en hígado, siendo un
medicamento que pudiera tener utilidad en la fase intestinal.
28
III. HIPÓTESIS
La administración oral del albendazol/quinfamida por un periodo de 3 días, tendrá
un efecto terapéutico más eficaz durante la fase intestinal de la infección por Trichinella
spiralis en modelo murino.
IV. OBJETIVO
Evaluar la eficacia terapéutica de la asociación del albendazol/quinfamida, como
tratamiento contra la infección por Trichinella spiralis a diferentes días de evolución en
modelo murino.
V. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Modelo experimental
Para evaluar el efecto terapéutico del OXAL® contra la infección por T. spiralis,
se trabajó con 5 grupos experimentales (ATX, BTX, CTX, DTX y ETX). Cada grupo estuvo
formado por 10 ratas hembras Long Evans de 2.5 meses de edad. Los grupos tuvieron
diferentes días de evolución de infección por T. spiralis (1, 7, 15, 30 y 60 días
respectivamente), lo que nos permitió evaluar las diferentes fases del ciclo biológico.
A los grupos experimentales se les administró OXAL® (albendazol/quinfamida) por vía
oral a una dosis de 15 mg/kg de peso durante 3 días y se sacrificaron 15 días después del
tratamiento (dtx) (Cuadro 1), de esta manera se evaluó si las larvas de T. spiralis
completaron su ciclo biológico. De cada rata se obtuvo una muestra de sangre antes de la
infección y previo al sacrificio. Después del sacrificio se recolectaron muestras de tejidos
(diafragma, lengua, masetero y pierna). Con las muestras de sangre y tejido obtenidas se
realizaron las técnicas directas e indirectas utilizadas en el diagnóstico de T. spiralis.
29
Cuadro 1. Protocolo de los grupos experimentales
Se utilizaron 5 grupos control (AC, BC, CC, DC y EC). Cada grupo estuvo formado por 5
ratas hembras Long Evans de 2.5 meses de edad y tuvieron el tiempo total de evolución
de infección por T. spiralis que el grupo experimental correspondiente, no se les
administró el medicamento (Cuadro 2) y se les realizaron las técnicas directas e indirectas
utilizadas en el diagnóstico de T. spiralis.
Cuadro 2. Protocolo de los grupos control
OXAL® es un medicamento que combina el albendazol, un antihelmíntico de amplio
espectro, con la quinfamida, un amebicida luminal. Por lo que es importante evaluar su
acción de manera independiente. Para ello se utilizaron 4 grupos adicionales ATXALB,
ATXQ, BTXALB y BTXQ, con 1 y 7 días de evolución de infección por T. spiralis
respectivamente. A los grupos ATXALB y BTXALB se les administró albendazol a una dosis
de 15 mg/kg de peso, mientras que a los grupos ATXQ y BTXQ se les administró quinfamida
a una dosis de 2.5 mg/kg de peso. A estos grupos solo se les realizaron las técnicas
directas.
Grupos experimentales
Días de evolución de infección por T. spiralis
Días de tratamiento (OXAL® )
Sacrificio (15 días dtx)
ATX 1 3 19 BTX 7 3 25 CTX 15 3 32 DTX 30 3 48 ETX 60 3 78
Grupos control Tiempo total de evolución de infección por T. spiralis (Sacrificio)
AC 19 BC 25 CC 32 DC 48 EC 78
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Cuadro 3. Protocolo de grupos adicionales
Grupo experimental
Días de evolución de infección por T. spiralis
Días de tratamiento (Albendazol o Quinfamida)
Sacrificio (15 días dtx)
ATXALB 1 3 19 ATXQ 1 3 19 BTXALB 7 3 25 BTXQ 7 3 25
2. Infección del modelo experimental con T. spiralis
Los grupos experimentales y los grupos control fueron infectados con 500 LI de
T. spiralis. Para ello las ratas se separaron en cajas individuales y se le dio de comer una
porción de tejido infectada (previo al conteo de larvas por gramo de carne).
3. Técnicas directas
3.1. Compresión en placa
Se obtuvieron muestras de tejido de las ratas sacrificadas (lengua, masetero, pierna
y diafragma) de aproximadamente 0.5 g. Cada muestra se colocó entre dos laminillas de
vidrio y se comprimió, ocupando un área aproximada de 1 cm x 0.5 cm, se observó al
microscopio con el objetivo de 10x, 20x y 40x, para verificar la presencia o ausencia de
células nodrizas de T. spiralis (70).
3.2. Tinción con azul tripano
Para determinar la viabilidad de las células nodrizas se seleccionaron algunas
muestras de tejido y se tiñeron con una solución de azul tripano al 0.04% durante 1 hora
(52). Posteriormente se colocó el tejido teñido entre dos laminillas y se observaron al
microscopio con objetivo de 10x y 20x.
3.3. Tinción de Hematoxilina y Eosina
Las muestras de tejido se fijaron en formol al 10%. La tinción se realizó de
acuerdo al Manual of Histologic and Special Staining Technics (71). Esta técnica permite
observar la integridad de la célula nodriza y el infiltrado celular presente.
31
3.4. Digestión artificial
El tejido obtenido se trituró hasta obtener un homogenizado, del cual se colocaron
30 g en un tamiz de tul con forma de saco dentro de un embudo de separación, ahí se
suspendió en una solución digestora (3.5 g de pepsina, 7.5 ml de HCl, aforados en 1000
ml de agua destilada) y se incubó a 37 0C por 24 horas. Transcurrido el tiempo se
recolectaron las LI que se depositaron en el fondo del embudo de separación (paquete
larvario), se lavaron 2 veces con solución amortiguadora de fosfatos (PBS), y
posteriormente se observaron al microscopio en una cámara de Newbawer con lente de
10x (70). Al final se realizó el cálculo de la carga parasitaria (en 1 µl de paquete larvario
se encuentran aproximadamente 25 LI).
4. Técnicas indirectas
4.1 Obtención del antígeno soluble total (AST)
Para la obtención del antígeno soluble total de T. spiralis, se utilizaron LI
obtenidas mediante digestión artificial, las cuales se lavaron con PBS, se desengrasaron
con acetona absoluta (hasta evaporación completa de esta) y se mantuvieron en PBS. Para
extraer los antígenos, las larvas contenidas en un tubo cónico se colocaron en una cama
de hielo y se sometieron a sonificación (eficiencia del 50% y 2 minutos por pulso). Al
romperse la cutícula se liberó el contenido antigénico. El homogenizado se centrifugó a
3500 rpm durante 1.5 horas. El sobrenadante obtenido corresponde al antígeno soluble
total (AST) de T. spiralis (70).
4.2. Microinmunodifusión doble (MIDD)
Se preparó un gel de agar al 1% (0.9 g de bactoagar en 100 ml de agua destilada y
0.01 g de azida de sodio). Aproximadamente 4.3 ml del gel se colocaron en un
portaobjetos y se dejo secar. Después de la solidificación se formó una roseta con un
horadador. En el círculo del centro se adicionó el AST del parásito y alrededor de este, los
sueros a analizar (aproximadamente 14 µl). Dos círculos se utilizaron como control
positivo y negativo.
32
Se dejó a temperatura ambiente en una cámara húmeda de 24-48 horas y se observaron
las líneas de precipitación, correspondientes a la interacción del antígeno con los
anticuerpos presentes en los sueros (72).
4.3. Inmunoelectrotransferencia (IET)
Se obtuvo el AST como se describió previamente y se cuantificó la cantidad de
proteína contenida de acuerdo al método de Bradford (73). Posteriormente se realizó el
corrimiento electroforético en geles de 7x7 cm, preparados con dodesil sulfato de sodio
(SDS) en condiciones reductoras. Se utilizó un gel separador al 10% (3.3 ml de
acrilamida-bis acrilamida en una relación en proporción de 30:08 % respectivamente, 2.5
ml de Tris 1.5 M pH 8.8, 4.05 ml de agua tridestilada, 100 µl de SDS al 10 % , 10 µl de
Temed y 50 µl de persulfato de amonio al 10 %) y un gel concentrador al 4% (1.33 ml de
acrilamida-bis acrilamida con una relación en proporción de 30:08%, 2.5 ml de Tris 0.5
M pH 6.8, 6.1 ml de agua destilada, 100 µl de SDS al 10 %, 16 µl de Temed y 80 µl de
persulfato de amonio al 10 %). Se preparó la solución reductora para el AST (Tris-HCL 1
M, pH 6.8, glicerol 20%; SDS al 2%, azul de bromo fenol al 0.5%, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), agua, ditiotreitol 5 mM y 2-mercaptoetanol al 5%)
(74). Se colocaron 24 µl de esta solución a cada carril, (para una concentración de 30
gramos de proteína del AST, de acuerdo a la determinación de proteínas).
El corrimiento se realizó en una cámara de Protean II xi Cell (Bio- Rad), durante 2 horas
a 100 volts. Uno de los geles se tiñó con colorante azul de Coomassie G- 250 y se secó
en una membrana de celofán. Los productos obtenidos (sin teñir) mediante el corrimiento
electroforético se transfirieron a papel de nitrocelulosa en una cámara de Trans blot-cell
Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad) con solución amortiguadora de transferencia
(4.54 g de TrisBase, 45 g de glicina, y agua destilada la necesaria para aforar a 1.2 L) a 35
volts a 4 0C durante toda la noche. Las proteínas se revelaron con el colorante fast green
durante 5 minutos y luego se decoloraron con agua destilada. El papel de nitrocelulosa
con las proteínas transferidas fue cortado en tiras de 2 mm de ancho en forma paralela al
corrimiento y se bloquearon con una solución de PBS-leche descremada en polvo al 3% a
4 0C durante toda la noche. Posteriormente las tiras se lavaron 3 veces con PBS (cada una
por 10 minutos). Se realizó la incubación del primer anticuerpo (suero) en una solución
33
de PBS y leche en polvo al 3%, durante 90 minutos a temperatura ambiente, con agitación
constante. Al término de la incubación, las tiras se lavaron dos veces (por 10 minutos)
con PBS-Tween 20 al 0.3% y una vez con PBS (por 10 minutos). Después las tiras se
incubaron con el segundo anticuerpo (anti-IgG de rata marcada con peroxidasa dilución
1:1000) en una solución de PBS-leche descremada en polvo al 3% por 1 hora a
temperatura ambiente, con agitación constante. Luego se hicieron 2 lavados con PBS-
Tween 20 al 0.3% (por 10 minutos) y se lavó una vez más con PBS. El patrón de bandeo
de las proteínas se reveló en una solución de 3,3´diamino-benzidina (50 mg en 100 ml de
PBS), usando como substrato peróxido de hidrógeno al 30% a 4 0C. Finalmente las tiras
se lavaron 3 veces con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente (75).
4.4. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Esta técnica es muy sensible y permite observar el reconocimiento específico de la
IgG con la cutícula de la larva. Para realizar el análisis previamente se obtuvieron por
digestión artificial LI de T. spiralis. A 20 µl de las LI se les agregó 25 µl de los sueros a
analizar y se incubaron a temperatura ambiente por 45 minutos con agitación constante.
Posteriormente se extrajo la fase líquida, se realizaron 2 lavados con PBS con agitación
suave (por 10 minutos) y se extrajo nuevamente la fase líquida. Al remanente se le
adicionaron 25 µl del conjugado monovalente antigammaglobulina de rata con
fluoresceína (dilución 1: 500) y se incubaron nuevamente a temperatura ambiente por 45
minutos con agitación constante, después se lavaron nuevamente con PBS (por 10
minutos). De esta preparación, a cada laminilla se le colocaron 10 µl, se cubrieron con un
cubreobjetos y se sellaron con resina. Finalmente se observaron con un microscopio
confocal invertido Axiover 200 M (76).
4.4 Modelo Estadístico
Los datos son presentados como mediana (índice de centralización) y rango
intercuartílico (índice de dispersión). Los datos se analizaron mediante las pruebas de
Mann-Whitney y Kruskal. Se consideró un valor de p < 0.05 como estadísticamente
significativo. El análisis estadístico se realizó mediante el paquete GraphPad Prism
versión 5.
34
VI. RESULTADOS
1. Compresión en placa
1.1. Grupo A
En los tejidos del grupo ATX no se encontró presencia de células nodrizas
(Fig. 6A-B). Mientras que en los tejidos del grupo control se encontraron LI
probablemente en proceso de implantación, ya que se observaron aún desenrolladas
(Fig. 6C).
Figura 6. Compresión en placa de tejido del músculo esquelético del grupo ATX y AC observada al microscopio óptico.
ATX: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento, sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis. AC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (diafragma y pierna respectivamente) del grupo ATX a 10x. C: Tejido de músculo estriado (masetero) del grupo AC a 20x. Flecha: LI de T. spiralis en proceso de implantación. Imágenes representativas de los tejidos del grupo ATX y AC.
1.2. Grupo B
En contraste al grupo ATX, los tejidos del grupo BTX si mostraron células nodrizas,
pero al comparar estás con las del grupo control, se observaron algunas diferencias, entre
las que destacan la presencia de la LI dentro de la célula nodriza sin adoptar
completamente la forma de espiral, así como una cápsula muy difusa (Fig. 7A-B). La
célula nodriza del grupo control muestra a la LI totalmente enrollada, y una cápsula
definida que fácilmente se distingue en el tejido (Fig.7C).
35
Figura 7. Compresión en placa de tejido del músculo esquelético del grupo BTX y BC observada al microscopio óptico.
BTX: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección. BC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 25 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo estriado (diafragma y pierna respectivamente) del grupo BTX a 10x. C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo BC a 10x. Flecha: LI de T. spiralis dentro de célula nodriza con cápsula difusa. Imágenes representativas de los tejidos del grupo BTX y BC.
1.3. Grupo C
Se observaron células nodrizas de apariencia similar al control, así como algunas
otras que mostraron a la LI localizada hacia un extremo de la cápsula o aparentemente
fuera de ella (Fig. 8A-B). En las célula nodrizas de los tejidos del grupo control, se
aprecia a la LI dentro de la cápsula, totalmente enrollada y localizada al centro (Fig. 8C).
Figura 8. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo CTX y CC observada al microscopio óptico.
CTX: Grupo de ratas con 15 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 32 posterior a la infección. CC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 32 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (diafragma) del grupo CTX a 10x.C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo CC a 10x. Imágenes representativas de los tejidos del grupo CTX y CC.
36
1.4. Grupo D
La mayoría de las células nodrizas observadas en el grupo DTX tuvieron apariencia normal
respecto al control, esto es la LI enrollada dentro de la cápsula y localizada hacia el centro
(Fig. 9C). Sin embargo también se observaron algunas LI fuera de su cápsula y en
aparente estado necrótico (Fig. 9A-B).
Figura 9. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo DTX y DC observada al microscopio óptico.
DTX: Grupo de ratas con 30 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 48 posterior a la infección. DC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 48 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (diafragma y lengua respectivamente) del grupo DTX a 20x. C: Tejido de músculo esquelético (pierna) del grupo DC a 20x. Imágenes representativas de tejidos del grupo DTX y DC.
1.5. Grupo E
Se observaron células nodrizas de apariencia similar a las del grupo control, pero
algunas mostraron una apariencia redonda no habitual. También se observaron LI fuera
de su cápsula y desenrolladas (Fig. 10A-B).
Figura 10. Compresión en placa de tejido de músculo esquelético del grupo ETX y EC observada al microscopio óptico.
37
ETX: Grupo de ratas con 60 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 78 posterior a la infección. EC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 78 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (masetero y lengua respectivamente) del grupo ETX a 20x. C: Tejido de músculo esquelético (masetero) del grupo EC a 20x. Flecha: LI de T. spiralis en aparente estado necrótico: Imágenes representativas de los tejidos del grupo ETX y EC.
2. Tinción con azul tripano
La tinción con azul tripano no fue realizada en tejidos del grupo ATX, ya que no se
observaron células nodrizas en la técnica de compresión en placa. Los tejidos de los
grupos restantes mostraron a células nodrizas con tinción en la periferia, y en aquellas
células nodrizas en que penetró el colorante, la LI no mostro coloración, por lo que se
considero como una LI viable (Fig. 11).
Figura 11. Tinción con azul tripano de tejidos del músculo esquelético de grupos con tratamiento y control (diafragma) observados al microscopio óptico a 20x.
A: Grupo BTX (7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección), B: Grupo CTX (15 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 32 posterior a la infección), C: Grupo DTX (30 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 48 posterior a la infección), D: Grupo ETX (60 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 78 posterior a la infección), E-F: Grupo DC (32 días posteriores a la infección por T. spiralis). Imágenes representativas de tejidos de los grupos BTX, CTX, DTX, ETX y DC.
38
3.1. Hematoxilina y eosina
3.1. Grupo A
De acuerdo a los resultados obtenidos con la compresión en placa, no se encontró
ninguna célula nodriza en tejidos del grupo ATX (Fig. 12A-B) Mientras que los tejidos del
grupo control, mostraron a una célula nodriza en formación, pues la LI aún se encontraba
paralelamente a la miofibrilla, además se observó infiltrado celular y la desorganización
del tejido muscular (Fig. 12C).
Figura 12. Tinción de Hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo ATX y AC observada al microscopio óptico.
ATX: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 19 posterior a la infección. AC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (masetero y lengua respectivamente) del grupo ATX a 10x. C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo AC a 10x. Imágenes representativas de tejidos de los grupos ATX y Ac.
3.2. Grupo B
En los tejidos del grupo BTX se encontraron a células nodrizas con una cápsula delgada y
menor definición respecto a la del grupo control, el infiltrado celular fue mayor y se
observó en el interior de la célula nodriza (Fig. 13A-B). La célula nodriza del grupo
control presentó una cápsula con mayor grosor, y el infiltrado celular se concentró en la
periferia (Fig. 12C).
39
Figura 13. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo BTX y BC observada al microscopio óptico
BTX: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección. BC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 25 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (masetero y pierna respectivamente) del grupo BTX a 10x, C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo BC a 10x. Flecha: muestra un mayor infiltrado celular, cabeza de flecha: se observa mayor grosor de la cápsula de colágena. Imágenes representativas de tejidos de los grupos BTX y Bc.
3.3. Grupo C
Se observo leve deformidad de la cápsula en células nodrizas de tejidos del grupo
CTX, respecto a tejidos del control (Fig.14A-C), sin embargo, lo más relevante es la
observación de aparentemente restos de LI, rodeada por un masivo infiltrado celular
(Fig. 14B).
Figura 14. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo CTX y CC observada al microscopio óptico.
CTX: Grupo de ratas con 15 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 32 posterior a la infección. CC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 32 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (lengua y pierna respectivamente) del grupo CTX a 40x, C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo CC a 40x. Flecha: señala restos de LI, acompañado por un masivo infiltrado celular. Imágenes representativas de tejidos de los grupos CTX y Cc.
40
3.4. Grupo D
La mayoría de las células nodrizas se observaron con características similares a las
del grupo control, es decir, la LI enrollada al interior rodeada por una cápsula de colágeno
de mayor grosor y poca presencia de infiltrado celular (Fig. 15A), aunque en algunos
casos se encontraron células nodrizas rodeadas por una intenso infiltrado celular
(Fig. 15B).
Figura 15. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo DTX y DC observada al microscopio óptico.
DTX: Grupo de ratas con 30 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 48 posterior a la infección. DC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 48 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (diafragma) del grupo DTX a 20x. C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo DC a 20x. Flecha: presencia de masivo infiltrado celular en la periferia de la cápsula, flecha corta: cápsula de colágena de mayor grosor. Imágenes representativas de tejidos de los grupos DTX yDc.
3.5. Grupo E
Similar a DTX, la mayoría de las células nodrizas del grupo ETX mostraron
apariencia normal, y en algunos casos se observó un masivo infiltrado celular en la
periferia de la cápsula (Fig.16B). Es evidente el aumento de grosor de la cápsula de
colágena (Fig.16C).
41
Figura 16. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo esquelético del grupo ETX y EC observada al microscopio óptico.
ETX: Grupo de ratas con 60 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 78 posterior a la infección. EC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 78 posterior a la infección por T. spiralis. A-B: Tejidos de músculo esquelético (masetero y diafragma respectivamente) del grupo ETX a 20x. C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo EC a 40x. Flecha: presencia de masivo infiltrado celular en la periferia de la cápsula, flecha corta: cápsula de colágena de mayor grosor. Imágenes representativas de tejidos de los grupos ETX y Ec.
42
4. Digestión artificial
El paquete larvario se cuantificó para obtener la carga parasitaria de LI/ml. Los
resultados son presentados como la mediana y el rango intercuartílico. Se analizaron
mediante la prueba de Mann-Whitney, con una p < 0.05 (Fig. 17 y 18, cuadro 4).
Cuadro 4. Comparación de carga parasitaria de grupos que recibieron tratamiento y grupos control
IQR: Rango intercuartílico
S: Significativo, α= 0.05
N.S: No significativo
Los resultados muestran una disminución de carga parasitaria significativa para los
grupos ATX y BTX, con una p < 0.05. Los grupos restantes tuvieron cargas parasitarias
similares respecto a sus controles.
Efecto del tratamiento OXAL® a un día de infecciónpor T. spiralis en modelo murino.
TXA CA
0
500
1000
1500
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 17. Efecto del tratamiento OXAL® a siete días de infección por T. spiralis en modelo murino
ATX: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento, sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis. AC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis.
Grupos con tratamiento
Carga parasitaria
LI/ml
IQR
Grupos control
Carga parasitaria
LI/ml
IQR
p
Significancia
ATX - - AC 1250 250 <0.001 p < 0.05BTX 5625 3750 BC 10000 3130 0.0021 p < 0.05 CTX 8000 2000 CC 7500 2200 0.2453 N.S DTX 6250 2000 DC 6225 50 0.4636 N.S ETX 5000 313 EC 5000 1250 N.S. N.S
43
Efecto del tratamiento OXAL® a siete días de infecciónpor T. spiralis en modelo murino.
TXB CB
0
5000
10000
15000
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 18. Efecto del tratamiento OXAL® a siete días de infección por T. spiralis en modelo murino
BTX: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección. BC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 25 posterior a la infección por T. spiralis.
Mediante la prueba Kruskal-Wallis se compararon las cargas parasitarias de los
grupos con tratamiento. Los resultados mostraron diferencias, con una p < 0.0001
(Fig. 19).
Efecto del tratamiento OXAL® sobre la carga parasitaria en grupos deratas con diferentes días de infección por T. spiralis
TXA TXB TXC TXD TXE
0
5000
10000
15000
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 19. Efecto del tratamiento OXAL® en grupos de ratas con diferentes día de infección por T. spiralis en modelo murino.
ATX: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 19 posterior a la infección. BTX: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección. CTX: Grupo de ratas con 15 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 32 posterior a la infección, DTX: Grupo de ratas con 30 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 48 posterior a la infección, ETX: Grupo de ratas con 60 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 78 posterior a la infección.
44
5. Microinmunodifusión doble (MIDD)
Para confirmar la respuesta inmune generada por el hospedero se realizó una
MIDD. Para ello se tomaron al azar dos muestras de sueros de cada grupo que recibió el
tratamiento y paralelamente se utilizó un control positivo y un control negativo.
Los sueros del grupo ATX no formaron banda de precipitación; esto nos indica que en este
grupo no se generó una respuesta inmune. Por el contrario, los sueros de los grupos BTX,
CTX, DTX y ETX, si formaron banda de precipitación, ya que los anticuerpos generados ante
la infección, interaccionaron con el AST (Fig. 20).
Figura 20. MIDD de sueros de ratas que recibieron tratamiento a diferentes días de evolución de infección por T. spiralis en modelo murino
A1-A2: Sueros del grupo ATX, B1-B2: Sueros del grupo BTX, C1-C2: Sueros del grupo CTX, D1-D2: Sueros del grupo DTX, E1-E2: Sueros del grupo ETX, (+): control positivo, (-): control negativo, AST= antígeno soluble total de T. spiralis.
45
6. Western blot (WB)
El western blot es una prueba sensible y especifica que nos permite detectar la
interacción entre el AST con los anticuerpos específicos del hospedero. Para ello se
tomaron al azar 2 muestras de sueros de los grupos que recibieron tratamiento, un control
positivo y un negativo.
Con los resultados obtenidos no se observó presencia de bandas para el grupo ATX,
mientras que las bandas del grupo BTX fueron de menor intensidad que las observadas en
los grupos CTX, DTX, ETX. Se reconoció el patrón de bandeo de 42, 45 y 49 kDa que
muestra el triplete característico de T. spiralis (Fig. 21).
Figura 21. WB de sueros de ratas que recibieron tratamiento a diferentes días de evolución de infección por T. spiralis en modelo murino
1-2: Sueros del grupo ATX, 3-4: Sueros del grupo BTX, 5-6: Sueros del grupo CTX, 7-8: Sueros del grupo DTX, 9-10: Sueros del grupo ETX, 11: control negativo, 12: control positivo, (-). El corchete indica la presencia del triplete de 42, 45 y 49 kDa de T. spiralis.
46
7. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Esta técnica nos permite observar la interacción de la respuesta inmune del
hospedero con los antígenos del parásito, es decir, se observa el reconocimiento
específico de la IgG presente en el suero, con la cutícula de la larva. Consistente con los
resultados obtenidos anteriormente no se observó fluorescencia en el grupo ATX
(Fig. 22A), mientras que en el grupo BTX se detectó una fluorescencia de menor
intensidad respecto al control positivo (Fig. 22A-B). Es importante mencionar que la baja
detección de fluorescencia observada en el control negativo, se debe a que T. spiralis por
si sola posee inmunofluorescencia inespecífica (Fig. 22C).
Figura 22. IFI de sueros de ratas de grupos ATX y BTX observado al microscopio confocal
ATX: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 19 posterior a la infección. BTX: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 25 posterior a la infección. A: IFI con suero del grupo ATX a 20x, B: IFI con suero del grupo BTX, a 40x C: IFI con suero de control negativo a 200x, D: IFI con suero de control positivo a 400x.
47
La fluorescencia detectada en los grupos CTX, DTX y ETX (Fig. 23A-B-C) fue
similar a la detectada con el grupo control (Fig. 23D).
Figura 23. IFI de sueros de ratas de grupos CTX, DTX y ETX observado al microscopio confocal.
CTX: Grupo de ratas con 15 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 32 posterior a la infección, DTX: Grupo de ratas con 30 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 48 posterior a la infección, ETX: Grupo de ratas con 60 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento y sacrificado al día 78 posterior a la infección. A: IFI con suero del grupo CTX a 40x, B: IFI con suero del grupo DTX a 40x, C: IFI con suero del grupo ETX a 40x, D: IFI con suero de control positivo a 40x.
48
8. Evaluación de albendazol y quindamida
8.1. Compresión en placa
En la compresión en placa del grupo ATXQ se observó presencia de LI de apariencia
similar al control, es decir, la LI se encontró al interior de la célula nodriza, aunque aún
sin enrollar completamente (Fig. 24B-C). En contraste, el tejido del grupo ATXA no
mostró ninguna célula nodriza (Fig. 24A).
Figura 24. Compresión en placa de tejidos del músculo esquelético de grupos ATXA, ATXQ, y AC observada al microscopio óptico.
ATXA: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 19 posterior a la infección, ATXQ: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 19 posterior a la infección. AC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 19 posterior a la infección por T. spiralis A, B, C: Tejidos de músculo esquelético (diafragma) del grupo ATXA, ATXQ y ATXC a 10x respectivamente. Imágenes representativas de tejidos de los grupos ATXA, ATXQ y ATXC.
Las células nodrizas de los grupos BTXQ y BTXA tuvieron apariencia similar a BC. No se
observó alguna diferencia aparente (Fig. 25A-B).
Figura 25. Compresión en placa de tejidos del músculo estriado de grupos BTXA, BTXQ, y BC observada al microscopio óptico.
49
BTXA: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 25 posterior a la infección, BTXQ: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 25 posterior a la infección. BC: Grupo de ratas sin tratamiento sacrificado al día 25 posterior a la infección por T. spiralis A, B, C: Tejidos de músculo esquelético (diafragma) de los grupos BTXQ y BTXA y BC a 10x. Imágenes representativas de tejidos de los grupos BTXA, BTXQ y BTXC.
8.2. Hematoxilina y eosina
A excepción del grupo ATXA (Fig. 26A), en todos los tejidos se encontraron
células nodrizas de apariencia similar al control (Fig. 26B-C-D-E). El grupo BTXA mostró
mayor infiltrado celular respecto a los otros (Fig.26D).
Figura 26. Tinción de hematoxilina y eosina de tejidos del músculo estriado de los grupos ATXQ, ATXA, BTXQ y BTXA observada al microscopio óptico.
ATXA: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 19 posterior a la infección. ATXQ: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 19 posterior a la infección. BTXA: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 25 posterior a la infección BTXQ: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 25 posterior a la infección. A: Tejido del músculo esquelético (lengua) del grupo ATXA a 10x. B: Tejido de músculo esquelético (pierna) del grupo ATXQ a 10x.C: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo AC. D: Tejido de músculo esquelético (pierna) del grupo BTXA a 10x, E: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo BTXQ a 10x, F: Tejido de músculo esquelético (diafragma) del grupo BC a 20x. Imágenes representativas de tejidos de los grupos ATXQ, ATXA, BTXQ y BTXA.
50
8.3. Digestión artificial
El paquete larvario se cuantificó para obtener la carga parasitaria de LI/ml. Los resultados
son presentados como la mediana y el rango intercuartílico. Se analizaron mediante la
prueba de Mann-Whitney, con una p < 0.05 (Cuadro 5, Fig. 27 y 28).
Cuadro 5. Comparación de carga parasitaria de grupos de ratas con tratamiento individual de albendazol y tratamiento de quinfamida
IQR: Rango intercuartílico
S: Significativo, α= 0.05
N.S: No significativo
Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamidaen un grupo de ratas con un día de infección por T. spiralis
TXALB
AQA
0
1000
2000
3000
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 27. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en un grupo de ratas con un día de infección por T. spiralis
ATXA: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 19 posterior a la infección. ATXQ: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 19 posterior a la infección
El análisis estadístico demuestra una disminución de carga parasitaria significativa para
los grupos ATXALB y BTXALB, respecto a ATXQ y BTXQ.
Tx albendazol
Carga parasitaria
LI/ml
IQR
Tx quinfamida
Carga parasitaria
LI/ml
IQR
p
Significancia
ATXALB - - ATXQ 2250 625 <0.001 SBTXALB 5000 250 BTXQ 10000 0 0.0097 S
51
Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamidaen un grupo de ratas con siete días de infección por T. spiralis
TXALB
BTXQ
B
0
5000
10000
15000
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 28. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en un grupo de ratas con siete días de infección por T. spiralis
BTXA: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 25 posterior a la infección BTXQ: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 25 posterior a la infección
También se analizaron los resultados mediante la prueba Kruskal-Wallis. Se obtuvo una
p=0.0015 (Fig. 29).
Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en grupos de ratas infectados con T. spiralis
TXALB
AQA ALB
BQB
0
5000
10000
15000
Grupos de ratas
Carg
a pa
rasi
taria
(LI/m
l)
Figura 29. Efecto individual del tratamiento con albendazol y quinfamida en grupos de ratas infectados con T. spiralis
ATXA: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 19 posterior a la infección. ATXQ: Grupo de ratas con 1 día de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 19 posterior a la infección. BTXA: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con albendazol y sacrificado al día 25 posterior a la infección BTXQ: Grupo de ratas con 7 días de infección por T. spiralis + 3 días de tratamiento con quinfamida y sacrificado al día 25 posterior a la infección.
52
VII. DISCUSIÓN
Actualmente el tratamiento de elección para la triquinelosis es la administración de
albendazol o mebendazol por 10-15 días (1). Como se menciono anteriormente, el uso de
estos benzimidazoles por periodos prologados puede ser causa de efectos embriotóxicos y
teratogénicos en animales experimentales (56, 57), por lo que están contraindicados en
mujeres embarazadas (50). Se ha reportado que la administración de mebendazol durante
el embarazo puede ser causa de efectos teratogénicos en el feto (58). De ahí la
importancia de contar con un tratamiento que sea eficaz contra la infección, pero con un
periodo corto de administración.
La asociación de medicamentos frecuentemente se usa por los beneficios terapéuticos
obtenidos, en relación a sinergismo o potenciación (68). Es por ello que actualmente
existen en el mercado varios medicamentos que combinan la asociación de dos fármacos.
El OXAL® es un medicamento recomendado para infecciones por amibas, nemátodos y
cestodos, que combina la acción del antihelmintico albendazol con la quifamida, un
amebicida intraluminal (67). Es por ello que en este trabajo se evaluó su eficacia
terapéutica contra la infección por el nemátodo T. spiralis a diferentes tiempos de
evolución de la infección, por lo que abarcamos las 3 fases del ciclo biológico de
T. spiralis.
En base a los resultados obtenidos, solamente se comprobó la eficacia terapéutica del
medicamento durante fase intestinal. En el grupo ATX no se encontraron células nodrizas
en tejidos del músculo esquelético (Fig. 6A-B). Durante la fase intestinal temprana del
ciclo biológico de T. spirals, ocurre la implantación de la LI recién liberada de su cápsula
en el epitelio columnar del intestino, evento de vital importancia para el establecimiento
de la infección (17). La ausencia de células nodrizas en músculo esquelético, sugiere que
la administración del medicamento durante fase intestinal temprana, impidió la invasión
de las LI en el epitelio columnar, y por lo tanto no se estableció la infección.
53
La observación de los tejidos de músculo esquelético de BC, mostró a células nodrizas ya
maduras, pues se apreció una cápsula bien definida y una LI al interior con forma de
espiral (Fig. 7C). Por el contrario, las LI de BTX se encontraron aún sin adoptar la forma
de espiral, y con una cápsula difusa (Fig. 7A-B), similar a las características de célula
nodriza inmadura observada en AC. Estas observaciones sugieren que la administración
del medicamento a los siete días de infección de fase intestinal, no interfirió con el ciclo
biológico del parasito, aunque probablemente retardo el proceso de maduración de la
célula nodriza.
Algunas células nodrizas en tejidos de CTX tuvieron algunas diferencias respecto a las de
CC, entre las que destaca la aparente ausencia de cápsula (Fig. 8B). Esto sugiere que la
administración del medicamento durante fase parenteral, tuvo algún efecto sobre algunas
LRN en migración, que alteró la formación de la célula nodriza, sin embargo, no fue
suficiente interferir con la fase muscular del ciclo biológico.
Con la cuantificación del paquete larvario obtenido por digestión artificial, se corroboró
la ausencia de células nodrizas en tejidos del grupo ATX. La poca carga parasitaria
obtenida en el grupo AC, probablemente se debió al hecho de que las células nodrizas eran
inmaduras, ya que se observaron LI dentro de la cápsula, pero sin estar aún
completamente enrolladas (Fig.6C), por otro lado, el poco grosor de la cápsula de
colágena bien pudiera ser otro factor que contribuyó a la destrucción de las LI por la
digestión artificial. Solo las células nodrizas maduras pueden resistir la digestión artificial
(1).
La carga parasitaria obtenida para el grupo BTX tuvo una disminución significativa con
respecto al grupo BC, (P=0.0021); estos resultados sugieren que la administración del
medicamento a 7 días de evolución de la infección (fase intestinal), si tuvo un efecto
terapéutico sobre la infección, pero no fue suficiente para impedir que el parásito
continuara con el ciclo biológico.
De haber existido sinergismo o potenciación en la acción de la quinfamida y/o albendazol
probablemente tendría que haber ocurrido en fase intestinal, ya que la quinfamida solo
actúa a nivel luminal (59).
54
OXAL® es un medicamento que combina al albendazol, un antihelmíntico de amplio
espectro, con la quinfamida, un amebicida luminal. Debido a que solo se demostró
eficacia terapéutica para los grupos ATX y BTX (aunque el efecto fue mucho menor y no
suficiente para el grupo BTX) se evaluó la acción individual del albendazol y la
quinfamida en 4 grupos adicionales: ATXALB, ATXQ, BTXALB y BTXQ, con el mismo tiempo
de evolución de infección por T. spiralis que los grupos ATX y BTX, de esa manera
constatamos si fue el albendazol o la quinfamida quién contribuyó al efecto terapéutico
observado.
En los tejidos del grupo ATXALB, no se encontraron células nodrizas, ni se obtuvo paquete
larvario (Fig. 24A, cuadro 5). Por el contrario, los tejidos del grupo ATXQ, mostraron
células nodrizas de apariencia normal y la carga parasitaria fue similar a la obtenida en el
grupo AC. Los tejidos del grupo BTXALB mostraron a LI sin enrollar totalmente (Fig.25A),
mientras que las células nodrizas de BTXQ y BC tuvieron apariencia similar (Fig. 25B-C).
La carga parasitaria de BTXALB tuvo una disminución significativa con respecto a BTXQ
p < 0.05 (cuadro 5). Estos resultados son muy importantes, ya que se demostró que el
albendazol ocasiono el efecto terapéutico observado en los grupos ATX, BTX, ATXALB y
BTXALB, aunque el efecto fue menor para BTX y BTXALB, ya que el periodo de
administración fue corto y como se había mencionado anteriormente, el albendazol si es
efectivo contra la infección, pero solo si se administra por periodos prolongados (50).
La mayoría de las células nodrizas encontradas en los tejidos de DTX y ETX, tuvieron
apariencia similar al control. Sin embargo algunas mostraron deformidad en cápsula,
también se observaron pocos casos en que la LI se encontró fuera de ella y en un aparente
estado necrótico (Fig. 9B y 10B). La disminución de cargas parasitarias respecto a sus
controles, no fue significativo (cuadro 4). Se demostró el efecto terapéutico de albendazol
en los grupos de fase intestinal (ATX, BTX, ATXALB y BTXALB,), sin embargo, en fase
muscular la acción de albendazol fue mínina, ya que solo se administró por tres días y
para tener el efecto terapéutico esperado, es necesario su administración por periodos
prolongados (1). No se comprobó el efecto terapéutico de la quinfamida por sí sola, a
pesar de ser un medicamento luminal con buena eficacia de inhibición de crecimiento,
motilidad y propagación de la amiba (63).
55
Los tejidos de músculo esquelético de los grupos BTX, CTX, DTX y ETX teñidos con azul
tripano, tuvieron un patrón de tinción similar al observado en los grupos controles
(Fig. 11), en ningún caso se observó coloración de la LI por el azul tripano, y de acuerdo
a Chávez et al.; 2006, esto indica viabilidad de las células nodrizas.
Los tejidos de músculo esquelético teñidos con hematoxilina y eosina, correspondientes a
los grupos BTX, CTX, DTX y ETX, (Fig. 13, 14, 15, 16) mostraron una mayor presencia de
infiltrado celular en los tejidos de los grupos que recibieron el tratamiento OXAL®, así
como las células nodrizas de tejidos del grupo BTXA (Fig. 24). Probablemente, el poco
efecto que tuvo el medicamento, favoreció la respuesta inflamatoria generada ante la
invasión de las células musculares.
Mediante las técnicas indirectas se comprobó la respuesta inmune generada por el
hospedero, ante la presencia de T. spiralis. Con la MIDD se hizo visible la reacción entre
el AST y los anticuerpos presentes en el suero, ya que se observó presencia de bandas
para los grupos BTX, CTX, DTX y ETX, y de acuerdo con los resultados obtenidos mediante
las técnicas directas, en el grupo ATX no se observó presencia de banda de precipitación
(Fig. 20), esto sugiere que el grupo ATX no generó una respuesta inmune en contra del
AST, ya que la administración del medicamento a 1 día de infección, impidió el
establecimiento de la LI en el epitelio columnar del intestino, lo cual es paso crucial para
que se establezca la infección y por lo tanto se genere una respuesta inmune (17).
El WB es una técnica sensible, que nos permite detectar con mayor especificidad la
reacción antígeno-anticuerpo generada por el hospedero. En los grupos BTX, CTX, DTX y
ETX se observó la presencia del triplete característico del AST (Fig. 21), el cual oscila
entre 42, 45 y 49 kDa; probablemente el grupo BTX mostró bandas tenues debido a que la
respuesta inmune generada en contra de la T. spiralis fue menor, puesto que la
administración del medicamento en fase intestinal si tuvo efecto contra el parásito,
aunque no lo suficiente para impedir que T. spiralis completara su ciclo biológico. Por
otro lado, para el grupo ATX no se observó la presencia de bandas, con lo que se reitera
que en este grupo no se generó una respuesta inmune.
56
Finalmente, con la IFI se observó la fluorescencia correspondiente a la reacción entre la
IgG marcada y cutícula en los grupos BTX, CTX, DTX y ETX, (Fig. 22 y 23) aunque en
menor intensidad para BTX, mientras que para el grupo ATX, no se detectó tal
fluorescencia (Fig. 17), con lo que se confirma nuevamente que el grupo ATX no generó
respuesta inmune en contra de T. spiralis, ya que el parásito no fue capaz de establecer la
infección. Cabe resaltar que T. spiralis posee inmunofluorescencia inespecífica, por lo
que se puede apreciar fluorescencia tenue, aun en controles negativos.
57
VIII. CONCLUSIONES
Los resultados del grupo ATX mostraron que la administración del medicamento al
comienzo de la infección, fue eficaz para impedir el establecimiento de la larva en el
epitelio intestinal, por tanto no se completó el ciclo biológico de T. spiralis, lo anterior se
comprobó por la ausencia de células nodrizas en tejido de músculo esquelético.
Asimismo, el grupo BTX mostró una disminución significativa de carga parasitaria,
respecto a su control p <0.05; no obstante la carga parasitaria de los grupos CTX/CC,
ETX/EC y el DTX/DC fueron muy similares. Esto nos indica que la eficacia terapéutica de la
administración del medicamento OXAL® en fase intestinal temprana es efectiva,
mientras que en fase intestinal tardía el efecto fue moderado, los resultados no fueron
favorables para fase parenteral y muscular.
Con los resultados obtenidos en los grupos ATXA, ATXQ y BTXA y BTXQ se comprobó que
tal efecto terapéutico encontrado en los grupos ATX y BTX se debió simplemente a la
acción del albendazol y no a la quinfamida o la acción sinérgica de la combinación de los
medicamentos, por lo que no sería recomendable administrar el medicamento OXAL®
para la triquinelosis, esperando tener mejores resultados solo por el hecho de ser un
medicamento combinado.
58
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65
ABREVIATURAS
Ac: Anticuerpos ADCC: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
AST: Antígeno soluble total de T. spiralis dpi: Días posteriores a la infección dtx: Después del tratamiento
C: Control cm: Centímetro
Dot-ELISA: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima de puntos ECP: Proteína catiónica eosinofílica
EDTA Acido etilendiaminotetraacético ES: Secreción/excreción
ELISA : Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima FcεRI: Receptor de superficie celular para la región constante de IgE
FcγRII: Receptor de superficie celular para la región constante de IgG FDA: Food and Drug Administration
GALT: Tejidos linfoides asociados a intestino HCl: Acido clorhídrico
g: Gramos hpi: Horas posteriores a la infección IgA: Inmunoglobulina de clase A IFI: Inmunofluorescencia indirecta IgE: Inmunoglobulina de clase E IgG: Inmunoglobulina de clase G IgM: Inmunoglobulina de clase M IET: Inmunoelectrotransferencia IL-4: Interleucina 4 IL-5: Interleucina 5 IL-9: Interleucina 9
IL-13: Interleucina 13 Kg: Kilogramos
kDa: KiloDalton LI: Larva infectante
LRN: Larvas recién nacidas M Molaridad
MBP: Proteína básica principal mg: Miligramos
MIDD: Microinmunodifusión doble ml: Mililitros
mm: Milímetros mM: Milimolar PBS: Solución amortiguadora de fosfato
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pH: Potencial de hidrogeno pim: Posterior a la infección del miocito
RER: Retículo endoplásmico rugoso rpm: Revoluciones por minuto
SEM: Microscopía electrónica de barrido SDS: Dodesil sulfato de sodio
Stat6: Transductor de señal y activador de la transcripción-6 inducido por la interleucina-4
Th1: Linfocitos T ayudadores que participan en la inmunidad celular Th2: Linfocitos T ayudadores que participan en la inmunidad humoral
TNF: Factor de necrosis tumoral TSL1-TSL8: Clasificación de los grupos de antígenos de T. spiralis de acuerdo a su
reconocimiento por anticuerpos monoclonales y policlonales Tx: Tratamiento
VEFG: Factor de crecimiento del endotelio vascular µl: Microlitro
µm: Micras