universidad autÓnoma de nuevo leÓn facultad de …eprints.uanl.mx/2802/1/1080237547.pdf · 4.7.1...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EVALUACIÓN DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS DE ZONAS CITRÍCOLAS
SOBRE Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae)
Por
Q.B.P. FÁTIMA LIZETH GANDARILLA PACHECO
Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
Noviembre 2012
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EVALUACIÓN DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS DE ZONAS CITRÍCOLAS
SOBRE Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae)
Por
Q.B.P. FÁTIMA LIZETH GANDARILLA PACHECO
Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
Noviembre 2012
RC- 07- 098 REV. 01- 03 / 09
TABLA DE CONTENIDO
Sección Página AGRADECIMIENTOS ………………………………………………... i DEDICATORIA ………………………………………………............. iii LUGAR DE TRABAJO ………………………………………………. v LISTA DE TABLAS ………………………………………………...... vi LISTA DE FIGURAS ………………………………………………..... vii NOMENCLATURA ………………………………………………....... ix RESUMEN ……………………………………………….................... xi ABSTRACT ………………………………………………................... xii 1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………......... 1 2. HIPÓTESIS ………………………………………………............... 4 3. OBJETIVOS ……………………………………………….............. 4
3.1 Objetivo general ……………………………………………….. 4 3.2 Objetivos particulares ………………………………………… 4
4. ANTECEDENTES ………………………………………………..... 6 4.1 Diaphorina citri Kuwayama …………………………………... 6
4.1.1 Ubicación taxonómica …………………………………. 6 4.1.2 Ciclo de vida …………………………………………….. 6 4.1.3 Plantas hospedantes …………………………………… 8 4.1.4 Huevo ………………………………………………........ 9 4.1.5 Ninfas ………………………………………………........ 9 4.1.6 Adulto ………………………………………………......... 10 4.1.7 Distribución ……………………………………………... 11 4.1.8. Daños ………………………………………………....... 12
4.1.8.1 Daño directo ……………………………………. 12 4.1.8.2 Daño indirecto ………………………………….. 14
4.2 Huanglongbing (HLB) ………………………………………… 14 4.2.1 Agente causal …………………………………………… 14 4.2.2 Modo de infección ……………………………………… 15 4.2.3 Síntomas ………………………………………………... 15 4.2.4 Distribución ……………………………………………… 16
4.3 Métodos de control ……………………………………………. 17 4.3.1 Control químico …………………………………………. 17 4.3.2 Control biológico ………………………………………... 18
4.3.3.1 Depredadores ………………………………….. 18 4.3.3.2 Parasitoides ……………………………………. 20 4.3.3.3 Hongos entomopatógenos ……………………. 21
4.4 Generalidades de los hongos entomopatógenos ………….. 22 4.4.1 Beauveria bassiana …………………………………….. 23
4.4.1.1 Ubicación taxonómica ………………………… 24 4.4.1.2 Rango de hospederos ………………………… 24 4.4.1.3 Morfología ………………………………………. 25
4.4.2 Isaria fumosorosea ……………………………………... 25 4.4.2.1 Ubicación taxonómica ………………………… 26
4.4.2.2 Rango de hospederos ………………………… 27 4.4.2.3 Morfología ………………………………………. 27
4.4.3 Metarhizium anisopliae ………………………………… 28 4.4.3.1 Ubicación taxonómica ………………………… 28 4.4.3.2 Rango de hospederos ………………………… 29 4.4.3.3 Morfología ………………………………………. 29
4.5 Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos …. 29 4.5.1 Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero … 30 4.5.2 Germinación de la espora ……………………………... 30 4.5.3 Penetración del integumento ………………………….. 31 4.5.4 Penetración a través de cuerpos abiertos …………… 33 4.5.5 Replicación en el hemocele …………………………… 33 4.5.6 Dispersión de las esporas ……………………………... 34
4.6 Enzimas ………………………………………………………… 35 4.6.1 Función de las enzimas durante el proceso de infección ………………………………………………………... 35 4.6.2 Lipasas …………………………………………………... 36 4.6.3 Proteasas y Quitinasas ………………………………… 38
4.7 Producción de hongos entomopatógenos ………………….. 40 4.7.1 Requerimientos nutricionales …………………………. 41 4.7.2 Medios de cultivo ……………………………………….. 41 4.7.3 Tecnologías para la producción de hongos entomopatógenos ……………………………………………... 42
4.7.3.1 Cultivos bifásicos ………………………………. 43 4.7.3.2 Cultivos líquidos agitados o fermentaciones líquidas ..................................................................... 44
4.8 Actividad tóxica de hongos entomopatógenos sobre Diaphorina citri ……………………………………………………... 45
5. MÉTODOS ………………………………………………………….. 48
5.1 Reactivos y material biológico ……………………………….. 48 5.2 Equipo ………………………………………………………….. 50 5.3 Estrategia experimental ………………………………………. 50 5.4 Selección de medios de cultivo para la producción de conidios en placa ………………………………………………….. 53
5.4.1 Activación de las cepas ………………………………... 53 5.4.2 Inoculación e incubación de medios de producción… 54
5.4.2.1 Evaluación de la producción de conidios …… 54 5.4.2.2 Evaluación del crecimiento micelial …………. 54
5.4.3 Análisis Estadístico …………………………………….. 55 5.5 Producción de conidios para bioensayos …………………... 55
5.5.1 Viabilidad ………………………………………………… 55 5.6 Cría de Diaphorina citri ………………………………………. 56 5.7 Bioensayos con adultos de D. citri………………………….. 56
5.7.1 Bioensayos preliminares con adultos de D. citri ….... 57 5.7.1.1 Aspersión directa a la plántula ……………….. 57 5.7.1.2 Aspersión directa a los insectos ……………... 58
5.7.2 Ensayos de supervivencia con adultos de D. citri…… 58 5.7.2.1 Aspersión directa a la plántula ……………….. 59 5.7.2.2 Aspersión directa a los insectos ……………... 59 5.7.2.3 Análisis Estadístico ……………………………. 60
5.7.3 Bioensayo por contacto con adultos de D. citri ……… 60 5.8 Bioensayos con ninfas de D. citri ……………………………. 61
5.8.1 Bioensayos preliminares con ninfas de D. citri ……… 61 5.8.2 Bioensayos por aspersión con ninfas de D. citri ……. 62
5.8.2.1 Análisis estadístico ……………………………. 63 5.8.3 Bioensayos por método sumergido con ninfas de D. citri ………………………………………………………………. 63
5.9 Actividad enzimática en placa ……………………………….. 64 5.9.1 Preparación de la suspensión de conidios …………... 64 5.9.2 Composición de los medios de cultivo ……………….. 65
5.9.2.1 Medio hidrólisis de caseína …………………... 65 5.9.2.2 Medio quitinasas ………………………………. 65 5.9.2.3 Medio Tween 20 ……………………………….. 65
5.9.3 Inoculación e incubación de medios …………………. 66 5.9.4 Medición de la actividad enzimática ………………….. 66 5.9.5 Interpretación de la actividad enzimática en medios sólidos ………………………………………………………….. 66 5.9.6 Análisis Estadístico …………………………………….. 66
5.10 Producción de conidios en sustrato sólido ………………... 67 5.10.1 Preparación del precultivo …………………………… 67 5.10.2 Preparación e inoculación del sustrato ……………... 67
5.10.2.1 Medición de la productividad del sustrato …. 68 5.10.2.2 Pruebas de sobrevivencia …………………... 68
5.10.3 Análisis estadístico ……………………………………. 68 5.11 Ensayos con insectos benéficos …………………………… 69
5.11.1 Cría de insectos depredadores ……………………… 69 5.11.2 Preparación de la suspensión de conidios …………. 70 5.11.3 Bioensayos con Hippodamia convergens ………….. 70
5.11.4 Bioensayos con C. valida y E. punctinervis……….. 71 6. RESULTADOS …………………………………………………….. 72
6.1 Evaluación de la producción de conidios……………………. 72 6.1.1 Producción de conidios por efecto del medio de cultivo …………………………………………………………… 72 6.1.2 Producción de conidios entre los aislados y cepas…. 72
6.2 Evaluación del crecimiento micelial………………………….. 73 6.2.1 Crecimiento micelial por efecto del medio de cultivo... 73 6.2.2 Crecimiento micelial entre los aislados y cepas…….. 73
6.3 Viabilidad………………………………………………………. 78 6.4 Bioensayos con adultos de Diaphorina citri ……………….. 78
6.4.1 Bioensayos preliminares con adultos de D. citri ……. 78 6.4.1.1 Aspersión directa a la plántula ……………….. 78 6.4.1.2 Aspersión directa a los insectos ……………... 79
6.4.2 Ensayos de supervivencia con adultos de D. citri …... 80 6.4.2.1 Aspersión directa a la plántula ……………….. 81 6.4.2.2 Aspersión directa a los insectos ……………. 82
6.4.3 Bioensayo por contacto con adultos de D. citri …….. 84 6.5 Bioensayos con ninfas de D. citri ……………………………. 85
6.5.1 Bioensayos preliminares con ninfas de D. citri……… 85 6.5.2 Bioensayos por aspersión con ninfas de D. citri……. 86 6.5.3 Bioensayos por método sumergido con ninfas de D. citri ………………………………………………………………. 86
6.6 Actividad enzimática en placa ……………………………….. 89 6.6.1 Relación de la mortalidad de D. citri con la actividad
enzimática……………………………………………………… 89 6.7 Producción de conidios en sustrato sólido …………………. 93
6.7.1 Pruebas de sobrevivencia ……………………………... 94 6.8 Ensayos con insectos benéficos …………………………….. 96
6.8.1 Bioensayos con Hippodamia convergens …………… 96 6.8.2 Bioensayos con Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis…………………………………………………….. 97
6.8.2.1 Bioensayos con larvas de tercer estadio de E. punctinervis ………………………………………….. 97 6.8.2.2 Bioensayos con larvas de primer estadio de
C. valida …………………………………………………. 98 6.8.2.3 Bioensayos con larvas de segundo estadio
de C. valida……………………………………………… 98 7. DISCUSIÓN ………………………………………………………… 100 8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES………………….... 115 APENDICES………………………………………………………….... 119 Biología de Diaphorina citri ………………………………………... 119 Distribución de D. citri ……………………………………………… 120 Daño directo causado por D. citri …………………...................... 122 Daño indirecto causado por D. citri ……………………………….. 123 Distribución mundial del Huanglongbing………………………….. 124
Insecticidas y otros productos de origen químico seleccionados por causar alta mortalidad de D. citri. Experimentos regionales en la citricultura de México en el año 2010………………………………………………………………… 125
Depredadores de D. citri…………………………………………….. 128 Parasitoides de D. citri ………………………………………........... 130 Hongos entomopatógenos que infectan a D. citri ……………….. 131 Morfología de Beauveria bassiana ………………………………… 132 Morfología de Isaria fumosorosea …………………………………. 133 Morfología de Metarhizium anisopliae …………………………….. 134 LITERATURA CITADA …………………………………………….. 135 RESUMEN BIOGRÁFICO………………………………………….. 151
i
AGRADECIMIENTOS
A las Instituciones:
Al Consejo Nacional para la Ciencia y Tecnología (CONACYT) por
la beca otorgada para la realización de mis estudios de posgrado. Al Instituto de Biotecnología de la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León (IB-FCB, UANL) por haberme recibido en sus instalaciones y darme la oportunidad de desarrollarme profesionalmente.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y
Pecuarias (INIFAP), específicamente al Laboratorio de Investigación en Control Biológico del Campo Experimental General Terán, Nuevo León por las facilidades otorgadas para la realización de los bioensayos.
A las personas:
A la Dra. Isela Quintero Zapata por su valiosa asesoría en la dirección de esta investigación, por su apoyo incondicional a todas mis ideas y proyectos en el desarrollo de este trabajo, por creer en mí como profesional y como ser humano y lo más importante, por el honor de considerarme su amiga, gracias maestra.
A la Dra. Myriam Elías Santos por haber formado parte de mi comité
tutorial y de tesis, por su apoyo durante esta investigación y por su amistad. A la Dra. Lilia H. Morales Ramos por su apoyo durante esta
investigación y por formar parte de mi comité de tesis.
A la Dra. Katiushka Arévalo Niño por sus positivos y valiosos
comentarios hacia este trabajo.
ii
Al Dr. Luis J. Galán Wong por formar parte de mi comité de tesis, así como por sus sugerencias y aportaciones para esta investigación.
Al Dr. Carlos F. Sandoval Coronado por haber formado parte de mi
comité tutorial y de tesis, así como por sus valiosos comentarios y observaciones para esta investigación.
Al Dr. José I. López Arroyo por las facilidades otorgadas para la
realización de los bioensayos y sugerencias para esta investigación. Al Dr. Raúl Rodríguez Guerra por sus valiosos comentarios y
sugerencias para esta investigación. A todo el L6 especialmente a la Biol. Eugenia G. Ortiz Lechuga,
Ricardo Pérez, Ileana Castro, Biol. Héctor D. Nava González, Q.B.P Claudia B. López Alvarado y a los que alguna vez pasaron por este laboratorio: Q.B.P Aldo E. Salcedo Morales, Julián, Wisho, Rafa, Dinora, Gaby y Mariana, por el tiempo que compartimos, su apoyo y compañerismo.
A todo el personal que conforma el Instituto de Biotecnología FCB-
UANL por las facilidades otorgadas para el desarrollo de esta investigación. A mis compañeras en el Campo experimental de General Terán N.L.
Yessy, Jimena, Erika, Sarahi, Ivonne, Lucia, Gaby y Reyna, por su apoyo durante mi estancia y especialmente para María Luisa Rodríguez Ibarra por su apoyo incondicional para la realización de los bioensayos, y por brindarme su amistad.
A todo el personal administrativo y de investigación del Campo
Experimental del INIFAP en General Terán, N.L por las facilidades otorgadas para el desarrollo de esta investigación.
A todo el personal de la subdirección de posgrado de la Facultad de
Ciencias Biológicas, UANL por las facilidades otorgadas para el desarrollo de este trabajo.
Y a todas las personas que de alguna u otra manera contribuyeron
con la realización de este trabajo, muchas gracias!!
iii
DEDICATORIA
Dios:
Gracias por darme el regalo más maravilloso que existe… la vida Gracias por darme salud para cumplir cada uno de los objetivos que me he propuesto Gracias por darme una familia en la que crecí y de la cual aprendí lo más valioso del mundo… el amor incondicional
A mi madre: Sra. Ma. Isabel Pacheco Fernández
La mujer más valiente y excepcional que conozco Gracias por darme la vida y porque desde que llegue a este mundo nunca dejaste de luchar para que yo sea la persona que soy ahora, porque nunca te dejas vencer a pesar de las adversidades… Gracias por enseñarme con tu ejemplo que el trabajo es la mejor manera de trascender en la vida… Gracias por ser mi mamá, te quiero mucho mami…
A mi hermana Magdalena Arisveth Montoya Pacheco Mi hermanita
Mi única hermana, sabes que aunque nuestra visión de la vida sea distinta te quiero mucho y deseo lo mejor del mundo para ti… Gracias por los momentos compartidos y por todo lo que de alguna u otra manera hemos aprendido en el camino de la vida… Que Dios te bendiga siempre…
A mi abuelo: † Sr. J. Dimas Pacheco Hernández
El mejor abuelo y padre que pude haber tenido Siempre pensé que cuando llegara esta momento estaría a mi lado, como lo estuvo hasta el último día, se que desde el cielo está feliz porque este también era su sueño, quiero que sepa que todos los esfuerzos y sacrificios valieron la pena… Gracias por su ejemplo, por su cariño, por sus consejos y por haber cuidado de mí siempre, sé que algún día nos volveremos a ver… Gracias por todo lo que hizo por mí, lo quiero mucho, y lo extraño aun más…
iv
A mi abuela Sra. María del Rosario Vda. De Pacheco
La mejor abuela del mundo Que puedo decirte, que estoy feliz porque Dios me permite la dicha de que compartas este momento conmigo, más que solo mi abuela, eres como mi segunda madre, por tu dedicación, por tu esfuerzo, nunca olvidare todo lo que has hecho por mí… Gracias por tu ejemplo, por tus consejos, por tu cariño, por estar conmigo y apoyarme siempre, te quiero mucho que Dios te bendiga eternamente…
Al amor de mi vida: Alberto de Jesús Ríos Torres
El mejor hombre que he conocido Gracias por llegar a mi vida, y transformarla llenándola de sueños, ilusiones y felicidad… Gracias por enseñarme tanto en tan poco tiempo… Gracias por estar siempre conmigo, por apoyarme y comprenderme, pero sobre todo, por el inmenso amor que sientes por mí, al igual que el que yo siento por ti, te amo… Tu amor y dedicación hacia mí es lo más maravilloso de mi vida, y le pido a Dios que me permita compartir mi vida contigo y estar juntos eternamente… Ahora sabes que eres el hombre que me salvo en todas las formas en que una persona puede ser salvada… I love you so much…
Ustedes son mi familia y les dedico este trabajo porque sin su apoyo no hubiera sido posible llegar hasta aquí, son mi fuerza, mi motor, mis ganas de vivir y de seguir adelante… los amo
v
LUGAR DE TRABAJO
El presente trabajo se desarrollo en el laboratorio L6 del Instituto de
Biotecnología, FCB-UANL y en el Laboratorio de Investigación en Control
Biológico del Campo Experimental General Terán, Nuevo León del
INIFAP.
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla
Página
I. Estadios ninfales de Diaphorina citri…………………………. 10 II. Hongos entomopatógenos aislados en suelo donde se
cultivan cítricos en diferentes estados de México………… 52 III. Composición de los medios de producción de conidios en
placa…………………………………………………………… 53 IV. Producción promedio de conidios por efecto de los
diferentes medios de cultivo a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2°C)………………... 74
V. Producción promedio de conidios por aislado y/o cepa a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2°C)……………………………………………………… 75
VI. Evaluación del crecimiento micelial promedio por efecto de los diferentes medios de cultivo a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2 °C)….. 76
VII. Evaluación del crecimiento micelial promedio por aislado y/o cepa a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2 °C)……………………………………….. 77
VIII. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de hongos entomopatógenos por dos métodos diferentes de inoculación bajo condiciones de laboratorio (26±2ºC, 60±5 % H.R., 16:8 h L:O) …………………………………… 83
IX. Efecto de conidios de aislado nativos y cepas de colección de hongos entomopatógenos sobre ninfas de Diaphorina citri bajo condiciones de laboratorio (26 ± 2ºC, 60±5 % H.R., 16:8 h L: O.)……………………………………………. 87
X. Índice enzimático entre los diferentes aislados y cepas de hongos entomopatógenos a las 120 h de incubación bajo condiciones de laboratorio , 25 ± 2 º C ……………………… 92
XI. Estabilidad de los conidios de B. bassiana e I. fumosorosea almacenados a 4 ± 2 º C durante doce semanas……………………………………………………….
95 XII. Mortalidad promedio de Eremochrysa punctinervis por
aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O…………………………………………. 97
XIII. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O…………………………………………………… 98
XIV. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O…………………………………………………… 99
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1. Etapas de desarrollo de Diaphorina citri…………………………………………………………. 8
2. Esquema del desarrollo de un hongo entomopatógeno…………………………………………. 35
3. Representación de la interacción entre las enzimas extracelulares y la degradación de la cutícula de los insectos…………………………………………………… 39
4. Representación esquemática de la estrategia experimental……………………………………………… 51
5. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a la plántula bajo condiciones de laboratorio, 24ºC; 52% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar……………………………………………………. 79
6. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I .fumosorosea mediante el método de aspersión directa a los insectos bajo condiciones de laboratorio, 24ºC; 52% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar…………………………………………………… 80
7. Porcentaje de supervivencia de D. citri en arenas experimentales sin manipulación del insecto, bajo condiciones de laboratorio, 26±1ºC; 60±5% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar…………………………………………………… 81
8. Mortalidad de D. citri por dos diferentes métodos de inoculación. A) Adultos de D. citri micosados por el aislado HIB-19 de I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a la plántula y B) Adultos de D. citri micosados por el aislado HIB-32 de I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a los insectos.................................................. 82
9. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana, I. fumosorosea, M. anisopliae e H. citriformis bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC; 52% H.R; 16 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar……………………………………………………
84
viii
10. Mortalidad de ninfas de D. citri causada por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. fumosorosea bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC; 60±5% H.R;16:8 h L:O. Líneas en las barras indican el error estándar…………………………………
85 11. Mortalidad de ninfas de D. citri causada por aislados
de B. bassiana bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC; 60±5% H.R; 16:8 h L: O………………………. 88
12. Ninfas de D. citri micosadas por B. bassiana. A) HIB-2, B) HIB-3, C) HIB-4 y D) HIB-5 mediante el método de sumergido…………………………………………….. 88
13. Actividad enzimática en placa. A) Actividad lipolítica en medio Tween 20 del aislado HIB-10 de B. bassiana, B y C) Actividad quitinolítica en medio quitinasas de los aislados HIB-1 y HIB-19 de B. bassiana e I. fumosorosea y D) Actividad proteolítica en medio hidrólisis de caseína del aislado HIB-6 de B. bassiana. Nótese el halo de inhibición característico en medios de cultivo sólido…………….. 93
14. Producción de conidios entre los diferentes aislados de B. bassiana e I. fumosorosea a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 25±2ºC. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencia significativa según la prueba de Scheffé (p≤ 0.05). Promedio ± DE= (9.50 x 108±0.24 conidios g-1 de arroz). Líneas en las barras indican el error estándar. …………………………………………………... 94
15. Conidios germinados del aislado HIB-4 de B. bassiana. Nótese la formación del tubo germinativo, tan largo como la mitad del diámetro de la espora característico de una espora germinada…………….. 95
16. Mortalidad de H. convergens por aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O. …………………………………………….. 96
ix
NOMENCLATURA ADN Acido desoxirribonucleico ARN Acido ribonucleico α Alfa ANOVA Análisis de varianza & ampersand ARSEF Agricultural Research Service Collection of
Entomopathogenic Fungi β beta °C Grados centigrados Ca+2 Ion calcio CaCl2 Cloruro de calcio CaCl2.H2O Cloruro de calico dihidratado CL50/ DL50 Concentración letal media/ Dosis letal media CL99 Concentración letal 99 % cm3 Centímetro cubico cm Centímetro DE Desviación estándar EPPO European and Mediterranean Plant Protection
Organization FCB Facultad de Ciencias Biológicas ° Grados GlcNAc N-acetil-D-glucosamina γ Gamma g Gramo h horas HLB Huanglongbing H.R. Humedad relativa ITS espaciador interno transcrito KCl Cloruro de potasio KH2PO4 Fosfato de potasio monobasico KNO3 Nitrato de potasio L. Linneo L Litro lbs. Libras log10 Logaritmo base 10 (L:O) Luz:oscuridad + Mas Mg+2 Ion magnesio MgSO4.7H2O Sulfato de magnesio heptahidratado > Mayor que mL Mililitro mm Milímetro mm2 Milímetro cuadrado msnm Metros sobre el nivel del mar ≤ Menor o igual que
x
NaCl Cloruro de sodio NAGasa N-acetilglucosamidasas NaNO3 Nitrato de sodio (NH4)2SO4 Sulfato de amonio NH4H2PO4 Fosfato de amonio monobasico PDA Papa dextrosa agar % Porcentaje pH Potencial de hidrogeno rDNA Acido desoxirribonucleico recombinante rpm Revoluciones por minuto SENASICA Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria SINAVIMO Sistema Nacional Argentino de Vigilancia y
Monitoreo de Plagas spp Especies TL50 Tiempo letal medio UANL Universidad Autónoma de Nuevo León USDA-ARS United States Department of Agriculture-
Agricultural Research Service µm Micra µL Microlitro v/v Volumen/volumen
xi
RESUMEN Diaphorina citri es el vector de una de las enfermedades más devastadoras a nivel mundial que afecta exclusivamente a plantas del genero Citrus y Murraya, esta patología es conocida como Huanglongbing, la cual afecta la calidad de los frutos e incluso puede ocasionar la pérdida total de áreas cultivadas con cítricos. Debido a que D. citri, se encuentra presente en México es necesario buscar alternativas para controlar su peligrosa diseminación. Entre las alternativas para tratar la problemática que representan las plagas de cítricos y el uso desmedido de plaguicidas, se encuentra el control biológico, el cual ha sido aplicado exitosamente y en el caso de la citricultura, se consideran a los hongos entomopatógenos como uno de los grupos con potencial para el manejo de plagas. Por lo cual en el presente trabajo se evaluaron 33 aislados de hongos entomopatógenos provenientes de suelo de cultivos citrícolas y ocho cepas de colección GHA, Asdel 139, A-48 y A-44 (B. bassiana), Pfr-612 y Pfr-114 (I. fumosorosea), Met (M. anisopliae) y Hir-1 (H. citriformis) para determinar su patogenicidad sobre ninfas y adultos de D.citri, así mismo se evaluó la producción de conidios en placa en cinco diferentes medios de cultivo, actividad enzimática (lipasa, proteasa y quitinasa) y producción en grano de arroz (Oryza sativa L.) como sustrato sólido. Finalmente, se realizaron ensayos de inocuidad con los insectos depredadores Ceraeochrysa valida, Eremochrysa punctinervis e Hippodamia convergens. Dentro de los resultados obtenidos, para los bioensayos por aspersión con adultos de D. citri los aislados HIB-19 y HIB-32 (I. fumosorosea) y HIB-24 (B. bassiana) fueron los más efectivos en inducir mortalidad. Mientras que en los bioensayos por contacto con adultos del psílido la cepa Pfr-114 causó hasta un 100% de mortalidad. Respecto a los bioensayos por aspersión con ninfas de D. citri la cepa Pfr-612 mostró el mayor porcentaje de mortalidad (84.26%), por otra parte en los bioensayos por sumergido con ninfas, los aislados HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5 (B. bassiana) mostraron un 100% de mortalidad. Con respecto a la producción en placa el aislado HIB-4 (B. bassiana) presentó la más alta concentración de conidios mL-
1, mientras que la cepa Met presentó el mayor crecimiento micelial. Respecto a la actividad quitinasa el aislado HIB-19 presentó el mayor índice enzimático (1.50) , mientras que no existió relación entre la actividad enzimática (lipasa, quitinasa y proteasa) y la mortalidad de ninfas y adultos de D. citri. Para la producción de conidios en grano de arroz el valor máximo (1.77x109 conidios g-
1) se registró para el aislado HIB-4. Finalmente en los ensayos de inocuidad con los insectos benéficos que atacan a D. citri en su estadio ninfal, la cepa Pfr-114 presentó el valor mínimo de mortalidad para H. convergens. Respecto a los crisopidos en larvas de tercer estadio de E. punctinervis el valor mínimo de mortalidad se registró para el aislado HIB-5, mientras que para larvas de primer y segundo estadio de C. valida el valor mínimo de mortalidad se registro para los aislados HIB-4 y HIB-5, respectivamente. El contar con agentes microbianos como alternativa para el control de D. citri, es de vital importancia ya que permitirá alternar a éstos microorganismos con el uso extensivo de insecticidas convencionales, logrando así un mejor manejo de la posible resistencia del insecto mediante el uso de hongos entomopatógenos como agentes de control biológico, debido a la facilidad para producirlos masivamente lo cual constituye una ventaja sobresaliente, ya que en el país existen laboratorios comerciales que podrían involucrarse inmediatamente en la producción y distribución de los mismos, lo cual generará esquemas de control del psílido con menor riesgo de efectos colaterales en la ecología de las áreas citrícolas.
xii
ABSTRACT Diaphorina citri is the vector of one of the most devastating diseases worldwide which affects only plants of the genus Citrus and Murraya, this condition is known as Huanglongbing, which affects the quality of the fruits and can even result in total loss of areas cultivated with citrus. Because D. citri is present in Mexico is necessary to find alternatives to control its spread dangerous. Among the alternatives to treat the problems posed by pests of citrus and the excessive use of pesticides, we found with the biological control, which has been successfully applied and in the case of the citriculture, can be consider to the entomopathogenic fungi as one of the groups with potential for pest management. Therefore in the present study we evaluated 33 isolates of entomopathogenic fungi from citrus crop soil and eight strains of collection, GHA, Asdel 139, A-48 and A-44 (B. bassiana), Pfr-114 and Pfr-612 (I. fumosorosea), Met (M. anisopliae) and Hir-1 (H. citriformis) for determining its pathogenicity on D. citri nymphs and adults, also was evaluated in the production of conidia plate in five different culture media , enzymatic activity (lipase, protease and chitinase) and the production on grain rice (Oryza sativa L.) as a solid substrate. Finally, safety tests were conducted with the predatory insects Ceraeochrysa valida, Eremochrysa punctinervis and Hippodamia convergens. Among the results obtained, the bioassays for spraying adult D. citri the isolates HIB-19 and HIB-32 (I. fumosorosea) and HIB-24 (B. bassiana) were the most effective in inducing mortality. While in the bioassays by contact with adults of the psyllid, the strain Pfr-114 caused up to 100% mortality. Regarding spray bioassays with nymphs of D. citri the strain Pfr-612 showed the highest mortality rate (84.26%),on the other hand in bioassays by submerged with nymphs, the isolates HIB-2, HIB-3, HIB-4 and HIB-5 (B. bassiana) showed 100% mortality. With regard to production in plate, the isolated HIB-4 (B. bassiana) had the highest concentration of conidia mL-1, while the Met strain showed the highest mycelial growth. Regarding the chitinase activity, the isolated HIB-19 enzyme had the highest enzymatic index (1.50), whereas there was no relationship between the enzyme activity (lipase, protease and chitinase) and mortality of nymphs and adults of D. citri. For production of conidia on rice grain the maximum value (1.77x109 conidios g-1) was recorded for the isolated HIB-4. Finally in safety trials with beneficial insects that attack D. citri in its nymphal stage, Pfr-114 strain showed the lowest value of mortality for H. convergens. Regarding the lacewings, in third instar larvae of E. punctinervis the minimum value of mortality was recorded for the isolated HIB-5, while for the first and second larval stage C. valida the minimum value of mortality was recorded for the isolated HIB-4 and HIB-5, respectively. Having alternative microbial agents for the control of D. citri, is vital as it will allow to alternate these microorganisms with the use extensive of conventional insecticides, to achieve better management of the insect possible resistance using entomopathogenic fungi as biological control agents, because of the ease to produce them mass which is an outstanding advantage, since the country has commercial laboratories that could be involved immediately in the production and distribution of them, thus generating schemes for the psyllid control with less risk of side effects on the ecology of citrus areas.
1
1. INTRODUCCIÓN
A nivel mundial, la citricultura representa una de las industrias más
importantes en el área frutícola, ya que tan solo para la temporada 2011-
2012 la producción global de cítricos se estimó en un total de 85,357 millones
de toneladas métricas de las cuales el 59.87 % corresponde a naranjas,
26.50 % a mandarinas y tangerinas, el 7.27 % a limas y limones y el 6.35 %
a toronjas (USDA, 2012).
Para México esta industria representa una actividad de gran
importancia dentro de la fruticultura nacional, ya que la superficie establecida
en 23 estados de la república abarca 549 mil hectáreas de las cuales el 61 %
corresponde a naranja, 19 % a limones variedades mexicano y persa, y el 20
% a toronjas, mandarinas y tangerinas. En promedio, la producción anual se
estima en 7 millones de toneladas de fruta con un valor de 10,206 millones
de pesos, una exportación de fruta con un valor de 322 millones de dólares,
la exportación de jugo de 225 millones de dólares y una exportación de
aceite de 27 millones de dólares, lo cual sitúa a nuestro país como el cuarto
productor a nivel mundial de cítricos (SENASICA, 2012).
Sin embargo, los cítricos son los frutales que probablemente albergan la
mayor cantidad de plagas y enfermedades como la cancrosis de los cítricos,
muerte regresiva de los cítricos, Stubborn, gomosis, fumagina, psorosis,
tristeza de los cítricos, entre otras, las cuales reducen la producción, calidad
del fruto y muchas veces causan la muerte de los árboles. Entre los grupos
de microorganismos patógenos que afectan a los cítricos se encuentran
bacterias (Xanthomonas campestris pv. citri), fitoplasmas, spiroplasmas
(Spiroplasma citri), hongos (Phytophhtora spp., Capnodium spp., entre otros),
además de virus (psorosis de los cítricos, virus de la tristeza de los cítricos) y
viroides (Exocortis, viroide de la caquexia).
2
Anualmente, los cítricos establecidos en el país son atacados por al
menos 74 especies de artrópodos perjudiciales, como la escama roja de
California (Aonidiella aurantii; Hemiptera: Diaspididae), diversas especies de
mosca blanca (mosquita blanca lanuda, Aleurothrixus floccosus; mosquita de
los cítricos, Tetraleurodes ursorum; mosca prieta, Aleurocanthus woglumii;
Hemíptera: Aleyrodidae), ácaro de Texas (Eutetranychus banski; Acari:
Tetranychidae), negrilla o arador (Phyllocoptruta oleivor; Acari: Eriophyidae),
trips (Scirtothrips citri, Thysanoptera: Thripidae), minador de la hoja
(Phyllocnistis citrella, Lepidoptera: Gracillariidae), mosca mexicana de la fruta
(Anastrepha ludens, Diptera: Tephritidae) y el pulgón café de los cítricos
(Toxoptera citricida, Hemiptera: Aphididae), de los cuales la negrilla o arador,
la mosca mexicana de la fruta, mosca prieta, diversas especies de mosca
blanca, trips y el pulgón café de los cítricos representan comúnmente las
especies de mayor importancia (López-Arroyo et al., 2004,
http://www.concitver.com).
En México se encuentra desde el 2002, Diaphorina citri el vector de
una de las enfermedades más devastadoras de los cítricos alrededor del
mundo, esta patología es conocida como Huanglongbing (HLB), la cual
afecta la calidad de los frutos provocando que no sean útiles para consumo
humano e incluso puede ocasionar la pérdida total de áreas cultivadas con
cítricos.
El agente causal de esta enfermedad es Candidatus Liberibacter asiaticus,
una bacteria limitada al floema, la cual es transmitida y diseminada por este
insecto. El HLB fue detectado en Julio de 2009, en Tizimín, Yucatán; en ese
mismo año se detectó su presencia en Quintana Roo, Nayarit y Jalisco; para
el año 2010 se encontró en Campeche, Colima, Sinaloa y Michoacán, y
durante 2011 en los estados de Baja California Sur, Chiapas e Hidalgo, lo
cual representa un problema serio para la citricultura ante la posibilidad del
desarrollo de epidemias severas que impliquen el deterioro de esta
3
importante actividad económica (López-Arroyo et al., 2009; SENASICA,
2012).
Una alternativa a la problemática que representan las plagas de
cítricos y al uso desmedido de plaguicidas, la constituye el uso del control
biológico, el cual ha sido aplicado exitosamente contra diversas plagas en el
país (Rodríguez y Arredondo, 2007); sin embargo, en el caso de la
citricultura, existe aún una gran cantidad de especies plagas en las cuales es
posible aplicar agentes de control biológico; de éstos, se consideran a los
entomopatógenos como uno de los grupos con potencial para el manejo de
plagas.
Debido a la seria amenaza que representa Diaphorina citri para la
producción citrícola del país, en este trabajo se plantea evaluar la
patogenicidad de diferentes cepas nativas de hongos entomopatógenos
provenientes de muestras de suelo de cultivos citrícolas, para determinar su
potencial como controladores del psílido asiático de los cítricos.
4
2. HIPÓTESIS
Los aislados nativos de la zona citrícola de México de hongos
entomopatógenos pertenecientes a Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea
y Metarhizium anisopliae son patógenos al psílido asiático de los cítricos
Diaphorina citri.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar la patogenicidad de los aislados nativos de hongos
entomopatógenos de Beauveria bassiana, Isaria fumosorosea y Metarhizium
anisopliae sobre el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri.
3.2 Objetivos particulares
1. Seleccionar el medio de cultivo para la producción de conidios en
placa de los diferentes aislados nativos y cepas de colección de Beauveria
bassiana, Isaria fumosorosea y Metarhizium anisopliae.
2. Realizar bioensayos preliminares sobre adultos y ninfas de
Diaphorina citri con los diferentes aislados nativos y cepas de colección de
hongos entomopatógenos.
3. Estandarizar un método de bioensayo para evaluar las diferentes
aislados nativos y cepas de colección de hongos entomopatógenos sobre
adultos y ninfas de Diaphorina citri.
5
4. Evaluar la actividad enzimática en placa (lipasa, quitinasa y
proteasa) entre los diferentes aislados nativos y cepas de colección de
hongos entomopatógenos.
5. Producir conidios en sustrato sólido (Oryza sativa L.) del aislado (s)
y/o cepa (s) con mayor potencial para el control de Diaphorina citri.
6. Realizar ensayos con insectos depredadores no-blanco
(Hippodamia convergens, Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis)
que atacan a Diaphorina citri, para evaluar la inocuidad de los aislados y/o
cepas que presentaron mayor mortalidad sobre ninfas o adultos del psílido
asiático de los cítricos.
6
4. ANTECEDENTES
4.1 Diaphorina citri Kuwayama
Diaphorina citri (=Euphalarus citri) Kuwayama 1908 fue descrito a
partir de cítricos en Shinchiku, Taiwán en 1907 y publicado en un volumen
doble en 1908. Las especies de Diaphorina usualmente son separadas en
base al patrón de maculación en las alas anteriores y la forma de los conos
genales. Diaphorina citri tiene un patrón distinto en las alas anteriores y se
puede distinguir con facilidad de la mayoría de otras especies de psílidos que
afectan a los cítricos y sus relativos (Halbert and Manjunath, 2004).
4.1.1 Ubicación taxonómica
4.1.2 Ciclo de vida
D. citri como todos los hemípteros tienen desarrollo paurometábola o
gradual, por lo que presentan las fases de huevo, ninfas y adulto (Figura 1).
Super reino Eukaryota Reino Metazoa Filum Artropoda Superclase Hexapoda Clase Insecta Sub-clase Neoptera Infra clase Paraneoptera Orden Hemíptera Super Familia Psylloidea Familia Psyllidae Genero Diaphorina Especie citri Nombre binomial Diaphorina citri Kuwayama 1908 Nombre común Psílido asiático de los cítricos
7
Los huevos son depositados en las puntas de los brotes tiernos y
entre las hojas. Las hembras pueden ovipositar más de 800 huevos durante
su vida. El ciclo total, requiere de 15 a 47 días, dependiendo de la estación.
Puede haber de 9 a 10 generaciones en un año (Halbert and Manjunath,
2004). Viven entre uno y dos meses en dependencia de la temperatura y la
planta hospedante en la que se alimenten (Liu and Tsai, 2000). Se señala
una longevidad promedio para la hembra de 39.6 a 47.5 días a una
temperatura de 25°C, con la característica particular de que pueden vivir por
varios meses esperando hasta que llegue el periodo de brotación de las
plantas hospedantes. Los apareamientos se realizan después de uno a tres
días de la emergencia bajo condiciones favorables y se caracterizan por la
presencia de brotes en las plantas. La oviposición comienza un día después
del apareamiento (Étienne et al., 2001). Los adultos se pueden encontrar en
condiciones naturales durante todo el año, depositando huevos dondequiera
que haya brotes disponibles (Huang et al., 1984). A causa de la corta
duración del ciclo del desarrollo, pueden observarse rápidamente numerosas
ninfas que dan lugar a los adultos, los cuales se presentan en una menor
cantidad, en virtud de que se mueven hacia otros brotes para depositar sus
huevos luego de la cópula y continuar la infestación.
Otro elemento a resaltar es que existe buena sincronización entre el
desarrollo del brote y el ciclo de vida de estos insectos, por lo que los brotes
en crecimiento constituyen un factor fundamental en el comportamiento de la
especie (Fernández y Miranda, 2005).
También se ha afirmado que no tolera humedades cercanas al punto
de saturación debido a que esto favorece las epizootias fúngicas a las cuales
las ninfas son muy susceptibles; sin embargo se han encontrado pocas
muestras de individuos infectados por hongos en esta región, a pesar de
existir condiciones de alta humedad relativa (Halbert and Manjunath, 2004).
8
En periodos secos los adultos son numerosos, mientras que las ninfas
usualmente están ausentes (OEPP/EPPO, 2005).
Figura 1. Etapas de desarrollo de Diaphorina citri (Tomado: Cattling, 1970).
4.1.3 Plantas hospedantes
Se desarrollan exclusivamente sobre plantas de la familia Rutaceae, con
preferencia por los cítricos y Murraya spp. (OEPP/EPPO, 2005). Existen
numerosas observaciones acerca de los hospedantes preferenciales de D.
citri, Tsai and Liu (2000) realizaron un estudio comparativo a nivel de
laboratorio, donde probaron las especies Murraya paniculata L., Citrus
jambhiri Luch, Citrus aurantium L. (limón rugoso) y Citrus paradisi
MacFadyen (toronja). C. paradisi resultó ser el mejor hospedante, mientras
que entre las otras especies no se encontraron diferencias significativas.
9
4.1.4 Huevo
Miden aproximadamente 0.31 mm de longitud y 0.15 mm de ancho.
Presentan un extremo redondeado y el otro puntiagudo lo cual le da la
apariencia de diminutas peras o almendras. Recién ovipositados son de color
crema claro y con el desarrollo del embrión se tornan más amarillentos. Se
insertan entre las hojas y los tallos individualmente, uno seguido del otro con
el extremo romo sobre la base (apéndice A).
La fase fenológica preferida para la oviposición es la brotación
vegetativa verde cuando está en punta de lanza (Fernández y Miranda, 2005;
OEPP/EPPO, 2005). El numero de huevos ovipositados puede depender de
la planta hospedera. Por ejemplo, una media de 857 huevos por hembra fue
depositado en plantas de toronja (Citrus paradisi Macfadyen), mientras que
una media de 572 huevos fue depositada en limón rugoso (Citrus jambhiri
Lush). A 25 ºC los huevos eclosionan en 4 días (Tsai and Liu 2000).
4.1.5 Ninfas
D. citri presenta cinco estadios ninfales, las cuales varían su
morfología de acuerdo a la edad (Tabla I) (OEPP/EPPO, 2005). Las ninfas
recién eclosionadas tienen una coloración amarillo cremoso. Las ninfas del
primer estadio, presentan un color amarillo claro. Sus tres pares de patas se
caracterizan por el grosor que presentan y en el extremo terminal se
observan dos setas conspicuas, rodeando la garra en que termina el tarso.
En el transcurso de los días aumentan de tamaño. Se mueven
lentamente sobre el substrato dejando como huella la cera que expulsan por
la estructura anal (apéndice A). No presentan esbozos alares y la coloración
es más intensa. Las antenas son gruesas y presentan una larga y gruesa
10
seta en el extremo distal. Ventralmente se distingue el aparato bucal
caracterizado por tener un largo estilete succionador de savia.
Tabla I. Estadios ninfales de Diaphorina citri
El extremo terminal del abdomen está bordeado de conspicuas setas
en número de 10, las cuales están relacionadas con la cera que
abundantemente secretan durante su desarrollo. La cera es producida por la
pared del cuerpo, la cual está formada por una capa de células muy
modificada. Estas estructuras dermales, variables en tamaño, son huecas y
con el extremo apical abierto. En posición ventral se destaca la abertura anal
de gran tamaño y en forma de media luna. Las ninfas mayores (segundo,
tercer, cuarto y quinto estadio) presentan los esbozos alares, que aumentan
su tamaño en dependencia de la edad (Fernández y Miranda, 2005).
4.1.6 Adulto
Miden generalmente de 3 a 4 mm de largo, cuerpo marrón moteado, la
cabeza de color marrón claro y ligeramente más estrecha que el tórax. El
aparato genital permite la distinción entre los sexos. El dimorfismo sexual, a
pesar de no ser muy acentuado, permite distinguir al macho de la hembra por
presentar más rojizos los ojos y el abdomen más puntiagudo y pequeño.
Estadio Longitud del
cuerpo (mm)
Longitud de la
antena (mm)
Color
1 0.33-0.35 0.06 amarillo claro
2 0.49–0.53 0.08 amarillo
3 0.69–0.72 0.14 amarillo
4 0.98–1.05 0.19 marrón amarillento
5 1.45–1.58 0.27–0.30 marrón amarillento
11
El primer par de alas; las alas anteriores, son más amplias hacia la mitad
apical, moteadas y con una banda marrón que se extiende alrededor de la
periferia de la mitad externa del ala, la banda está ligeramente interrumpida
cerca del ápice. El patrón de la venación es la típica de los psílidos; el
segundo par es membranosa transparente. Las antenas poseen una longitud
de 0.48 mm, punta de color negro y dos pequeñas manchas de color marrón
claro en los segmentos medios (apéndice A).
Generalmente el abdomen es negro en su parte dorsal y blanco-
verdoso en la parte ventral (OEPP/EPPO, 2005), sin embargo el abdomen de
una hembra adulta puede tornarse de un color amarillo-naranja brillante
cuando esta grávida. La longitud del cuerpo del macho es de 1.53 - 1.66 mm
y para la hembra de 1.90 - 2.06 mm.
Los adultos viven de 1 a 2 meses y la duración de su ciclo de vida
puede verse influenciado por la temperatura y la planta hospedera (Tsai and
Liu, 2000). Son activos saltadores y cuando se les perturba saltan cortas
distancias, generalmente se alimentan en el envés de las hojas y cuando
está en reposo flexiona el primer par de patas, por lo que, con relación a la
superficie de la hoja, el cuerpo forma un ángulo agudo de aproximadamente
45 º característico cuando se está alimentando (Fernández y Miranda, 2005).
4.1.7 Distribución
D. citri ha sido reconocida como una de las principales plagas que
afectan a los cítricos en Asia subtropical y tropical, inicialmente en la India y
en otros lugares de la región (Husain and Nath 1927; Pruthi and Mani, 1945).
La evidencia disponible sugiere que es originario del subcontinente Indio
(Hollis, 1987) y se ha extendido de esta región a otras productoras de cítricos
en Asia
12
incluyendo países como Arabia Saudita, Afganistán, Bangladés, Lao,
Myanmar, Camboya, China, Filipinas, Hong Kong, Indonesia, Irán, Japón,
Malasia, Pakistán, Singapur, Sri Lanka, Taiwán, Tailandia, Vietnam, Yemen.
En África en Islas Réunion y República de Mauricio.
Respecto al continente americano se detectó en países como
Argentina, Bolivia, Colombia, Paraguay, Brasil (da Graca 1991), Venezuela
(Cermeli et al., 2000; Halbert and Núñez, 2004), Bahamas, Belice, Costa
Rica, Cuba, El Salvador, Islas Guadalupe (Étienne et al., 1998), Guatemala,
Hawaii, Honduras, Islas Caimán, Jamaica, México, Puerto Rico, República
Dominicana, Uruguay, Estados Unidos, específicamente en los estados de
Texas (French et al., 2001), Louisiana y Florida (Halbert et al., 2002).
En México, la presencia del psílido asiático de los cítricos data del año
2002 en los estados de Campeche y Quintana Roo (Thomas, 2002);
Coronado y Ruiz lo reportan en 2004, posteriormente, en un período de seis
años fue registrado en el resto de las áreas citrícolas del país (López-Arroyo
et al., 2009) (apéndice B).
4.1.8. Daños
Los daños causados por este insecto se pueden clasificar en directos,
al alimentarse de la planta e indirectos cuando transmiten la bacteria
causante la enfermedad denominada Huanglongbing (Chien and Chu, 1996).
4.1.8.1 Daño directo
El psílido asiático de los cítricos afecta a la mayoría de las especies de
la familia Rutaceae incluyendo plantas ornamentales. El daño directo a la
planta
13
ocurre como resultado de una alta población de psílidos (Halbert and
Manjunath 2004). Los psílidos extraen grandes cantidades de savia de las
plantas como forma de alimentación y producen grandes cantidades de
túbulos cerosos. Estos túbulos cubren las hojas de los arboles fomentando el
crecimiento de la fumagina que es una patología de las plantas producida por
el desarrollo de un hongo saprófito (Capnodium, Cladosporium, entre otros)
en la superficie de las hojas (apéndice C). Estos hongos al ser saprófitos se
alimentan de las secreciones azucaradas que producen los insectos. La
fumagina repercute en la calidad y cantidad de la producción de los
productos agrícolas. Los consumidores rechazan productos manchados con
fumagina. La cobertura que hace la fumagina impide la fotosíntesis y la
acción de los estomas, también facilita la transmisión de virus y otros
patógenos.
Además al alimentarse, el psílido, inyecta una toxina salivar que
detiene la elongación terminal y causa malformación de hojas y brotes
(Michaud, 2004). Una sola ninfa del psílido alimentándose en una hoja de
cítrico por menos de 24 horas es capaz de causarle malformaciones.
A menudo, en infestaciones iniciales los psílidos se agregan en altas
cantidades en árboles individuales dentro de huertos de cítricos. La
agregación y la alimentación causan una distorsión en los brotes tiernos lo
que permite que los psílidos ovipositen los sitios en mejores condiciones.
La brotación resulta severamente dañada y puede ocasionar la
abscisión de hojas y brotes tiernos o malformación de hojas maduras. Los
árboles maduros pueden soportar este daño por la pérdida de hojas o brotes
en una pequeña porción de la copa del árbol, no así árboles de vivero o
nuevas plantaciones (apéndice C) (Halbert and Manjunath, 2004).
14
4.1.8.2 Daño indirecto
El daño más serio causado por D. citri es debido a su particularidad de
ser un eficiente vector de Candidatus Liberibacter asiaticus causante de la
enfermedad del enverdecimiento de los cítricos conocida como
Huanglongbing (HLB) vocablo chino que significa enfermedad del dragón
amarillo (Halbert and Manjunath, 2004).
4.2 Huanglongbing (HLB)
El Huanglongbing (HLB) es una enfermedad destructiva que afecta a
los cítricos. En este caso, la abreviatura HLB se utilizará como el nombre
genérico de la enfermedad, independientemente del país donde se produzca.
Los dos insectos vectores de esta enfermedad son: para África, el psílido
Trioza erytreae y para Asia, D. citri (Halbert and Manjunath, 2004).
4.2.1 Agente causal
Candidatus Liberibacter asiaticus es una bacteria Gram negativa
persistente no propagativa (se reproduce dentro del insecto pero no se
transmite a otras generaciones). Se multiplica en la hemolinfa y dentro de las
células de las glándulas salivales de los psílidos (apéndice D). El vector pica
la planta y transmite la enfermedad. La bacteria circula por el floema y al
tapar los vasos floemáticos impide la circulación de los nutrientes. El periodo
de incubación de la enfermedad es de aproximadamente seis meses (Halbert
and Manjunath, 2004).
15
4.2.2 Modo de infección
La principal vía de transmisión de la bacteria en el campo es mediante
el insecto vector. Diversos trabajos han demostrado que un tiempo de
alimentación de 5-7 horas es suficiente para adquirir y transmitir el patógeno.
Los adultos y el cuarto y quinto instar son capaces de transmitir el patógeno
por vía de secreción salivar después de un periodo de latencia que varía
desde 1-25 días. Otra de las vías por las cuales se transmite el patógeno es
mediante los injertos, con una eficiencia variable en dependencia de la parte
de la planta que se emplee, la cantidad de tejido y el aislamiento del
patógeno en cuestión.
Sobre la transmisión por semillas se posee poca información, la
mayoría de los frutos caen prematuramente al suelo y en aquellos que
permanecen en la planta, tienen una alta proporción de semillas abortadas.
En las posturas procedentes de semillas de plantas enfermas se pueden
observar síntomas típicos de la enfermedad (Halbert and Manjunath, 2004).
4.2.3 Síntomas
En los estados avanzados de la enfermedad pueden observarse hojas
de color amarillo pálido con áreas de color verde irregulares (moteado)
asimétricas, defoliación, engrosamiento y aclaración de las nervaduras,
asimetría y difusión de colores en las nervaduras y foliolos, hojas pequeñas,
intensa defoliación de las ramas afectadas y caída de los frutos; los síntomas
comienzan a aparecer en otras ramas de la planta, llegando a tomar toda la
copa; inclusive las puntas pueden llegar a secarse y morir; se afecta el
desarrollo del sistema radicular; en el floema se observan lesiones
necróticas, acumulación de almidón y efecto sinergístico con otras
enfermedades.
16
También se puede observar caída prematura de los frutos,
deformación y asimetría de los mismos, reducción del tamaño, coloración
irregular. La deformación de los frutos aparece donde hay síntomas en las
hojas.
Internamente puede observarse diferencia de maduración y aborto de
semillas, desviación del eje y amarillamiento de las venas. Los frutos
presentan elevada acidez, baja proporción de jugo y bajo contenido de
azúcar, por lo que resultan no aptos para el consumo. En las plantas adultas
los síntomas se localizan en las partes jóvenes, las plantas infestadas
pueden manifestar defoliación severa, seguida de brotación irregular y
floración fuera de época y en caso de infecciones muy severas, ocurre la
muerte progresiva de la planta (Alemán et al., 2007).
4.2.4 Distribución
El HLB ha afectado gravemente la producción de cítricos en diferentes
países de Asia, África, Sub continente Indio y en la Península Arábiga. El
HLB se ha detectado en Arabia Saudita; Bangladesh, Bhután, Birmania
(Myanmar), Camboya, China, Filipinas, India, Indonesia, Japón, Malasia,
Nepal, Papua Nueva Guinea, Paquistán, Tailandia, Taiwán, Timor Oriental,
Vietnam, Yemen, Laos, Burundi, Camerún, Etiopía, Isla Mauricio, Kenya,
Madagascar, Malawi, Nigeria, República Centroafricana, Réunion, Rwanda,
Somalia, Sudáfrica, Swaziland, Tanzania, Zimbabwe (Halbert and Manjunath,
2004).
En el continente americano fue descubierta en Brasil en 2004, Estados
Unidos en 2005, Cuba en 2007, República Dominicana en 2008 y
recientemente detectada en Belice y México en el año 2009 (apéndice E).
17
En Julio de 2009 se encontraron los primeros psílidos y árboles con la
bacteria causante del HLB en Tizimín, Yucatán; sin embargo, para
septiembre de 2011 los informes de presencia de la enfermedad registran a
los estados de Baja California Sur, Campeche, Colima, Chiapas, Hidalgo,
Jalisco, Nayarit, Michoacán, Quintana Roo y Sinaloa (SENASICA, 2011)
(apéndice B).
4.3 Métodos de Control
4.3.2 Control Químico
Insecticidas como el Imidacloprid y abamectina han sido aplicados
para suprimir poblaciones del psílido pero requieren múltiples aplicaciones
(arriba de 6-8), generalmente son costosos, perturban el equilibrio de los
enemigos naturales y pueden conducir al desarrollo de resistencia en el
psílido (Srinivasan et al., 2008). Las condiciones ambientales, principalmente
la temperatura, afectan significativamente la toxicidad de los insecticidas y su
eficacia (Scott, 1995). Además otros factores como la especie del insecto, el
intervalo de temperatura probado, el modo de acción del insecticida, el
método de aplicación, y la cantidad de insecticida que es ingerida o está en
contacto con el insecto, se conoce que pueden tener influencia en la relación
temperatura-toxicidad, la cual puede ser positiva, negativa o mixta (Sparks et
al., 1982; Toth and Sparks, 1990).
En México, López-Arroyo et al. (2010) con el objetivo de contribuir en
el desarrollo de un plan regional para el manejo de D. citri y el
Huanglongbing en el país, han evaluado más de 40 diferentes productos
insecticidas en experimentos desarrollados en diversas áreas agroecológicas
donde se encuentra establecida la citricultura nacional.
18
Los productos evaluados incluyeron organofosforados, piretroides,
neonicotenoides, aceites minerales, botánicos, jabones, etc. De estos
estudios se seleccionaron los productos que causaron mortalidad mayor a
85%. Con el propósito de evitar el posible desarrollo de resistencia en D. citri
hacia los insecticidas, se ha sugerido un plan para el uso de estos basado en
la rotación de los grupos toxicológicos de los productos.
El plan elaborado incluye las dosis de aplicación de los productos, el
momento para efectuarlas en cítricos dulces y agrios, así como en árboles
adultos y jóvenes. El programa promueve el uso de insecticidas registrados
así como de productos alternativos que ejercen control de la plaga a un costo
económico bajo. Durante el año 2011, el programa fue evaluado en
diferentes áreas de la citricultura nacional (apéndice F).
4.3.3 Control biológico
Diaphorina citri Kuwayama está sujeta a varios niveles de control
biológico en toda su distribución geográfica, principalmente por varios tipos
de depredadores, parasitoides y en los últimos años, algunos hongos
entomopatógenos (Hall, 2008).
4.3.3.1 Depredadores
D. citri es atacada comúnmente por depredadores generalistas como
escarbajos (Coleoptera: Coccinellidae), como Harmonia axyridis Pallas, Olla
v-nigrum Mulsant, Cycloneda sanguinea L. y Curinus coeruleus Mulsant
(Michaud 2001, 2002, 2004; Michaud and Olsen, 2004) atacando a D. citri.
19
Sírfidos (Diptera: Syrphidae) del género Allograpta se han encontrado
atacando a D. citri en Réunion, Nepal (Aubert, 1987) y Allograpta obliqua Say
en Florida (Michaud, 2002); crisopas (Neuroptera: Chrysopidae,
Hemerobiidae) como Ceraeochrysa spp. y Chrysoperla rufilabris Burmeister
Okamoto y C. septempunctata Wesmael (Michaud 2004;Yang et al., 2006) y
arañas (Araneae) como Hibana velox (Becker) (Michaud, 2004).
Zelus longipes L. (Hemíptera: Reduvidae) es un depredador ocasional
de D. citri en Florida (Hall et al., 2008). Z. renardii (Hemíptera: Reduvidae)
fue reportado depredando adultos de D. citri bajo condiciones de campo en
Colima (Sánchez- González y Arredondo-Bernal, 2009).
Jasso-Argumedo et al. (2010) reportan a Cycloneda sanguínea,
Chrysoperla spp., Ceraeochrysa y Olla v-nigrum como depredadores de D.
citri en huertas de limón persa en Yucatán, México.
Cortez-Mondaca et al. (2011) reportaron la presencia de cinco
especies de Chrysopidae asociados a D. citri en huertas de cítricos de
naranja y limón mexicano en Sinaloa, México: Chrysoperla comanche,
Chrysoperla rufilabris, Chrysoperla carnea, Ceraeochrysa valida y
Ceraeochrysa claveri.
Sobresaliendo C. comanche y C. valida en abundancia. C. comanche
y C. rufilabris mostraron mayor consumo de las presas en diferentes tiempos
de exposición, pero en la última lectura, a las 24 h de exposición, la
capacidad de depredación fue prácticamente similar para todas las especies,
alrededor de 100 especímenes por depredador (apéndice G).
20
4.3.3.2 Parasitoides
Tamarixia radiata (Hymenoptera:Eulophidae) y Diaphorencyrtus
aligarhensis (Hymenoptera: Encyrtidae) son las dos especies principales de
parasitoides que atacan a D. citri.
Las hembras de T. radiata atacan el tercer, cuarto o quinto estadio
ninfal de D. citri (McFarland and Hoy, 2001; Skelley and Hoy, 2004). Las
hembras depositan uno o dos huevos por debajo de la ninfa, la larva se
desarrolla y alimenta externamente en el lado ventral de las ninfas,
transformando al hospedero en una especie de momia sellada al tejido de la
planta.
La pupación ocurre dentro de la momia y los nuevos adultos emergen
dejando un hoyo en la región torácica y de la cabeza de la momia. Aunque
las hembras depositan más de un huevo, usualmente solo una de las larvas
alcanza el estado adulto, por lo tanto T. radiata es considerado como un
parasitoide solitario. Además de matar a las ninfas a través de parasitismo,
las hembras adultas se alimentan de ninfas jóvenes (Chien, 1995; Skelley
and Hoy, 2004) (apéndice H).
Sánchez-González et al. (2011) reportan que en Colima, México T. radiata es
producido dentro de un programa gubernamental para la cría masiva,
liberación y evaluación en campo como alternativa para el control de D. citri.
Mencionan que durante el tiempo de liberación y monitoreo de la fluctuación
poblacional de ninfas de D. citri, se observa una tendencia en la reducción
del nivel poblacional de ninfas del tercer al quinto instar en la huerta bajo
tratamiento en comparación con la huerta donde no se realizaron
liberaciones. Reportando, reducciones de hasta el 92.6 % en la huerta bajo
liberaciones de T. radiata.
21
En contraste, en la huerta sin liberaciones se ha observado una tendencia a
la estabilidad del nivel poblacional de ninfas de D. citri al igual que al número
de ninfas parasitadas presentes.
Diaphorencyrtus aligarhensis es un endoparasitoide nativo de la India
y registrado en Filipinas, Vietnam y China (Aubert, 1987), (Yang et al., 2006).
Las hembras de D. aligarhensis parasitan del segundo al cuarto estadio
ninfal de D. citri además de alimentarse de ellas. Las ninfas del cuarto instar
se convierten en momias en 10 días y los parasitoides adultos emergen de
siete a ocho días después por un hoyo de salida en la región abdominal de la
ninfa momificada (Skelley and Hoy, 2004) (apéndice H).
4.3.3.3 Hongos entomopatógenos
Un importante número de especies de hongos entomopatógenos han
sido reportadas infectando a D. citri alrededor de mundo entre las que se
incluyen a: Isaria fumosorosea Wize (= Paecilomyces fumosoroseus)
(Samson, 1974; Subandiyah et al., 2000); Hirsutella citriformis Speare
(Rivero-Aragón and Grillo-Ravelo, 2000; Subandiyah et al., 2000; Étienne et
al., 2001); Cephalosphorium lecanii Zimm (Verticillium lecanii) (Rivero-Aragón
and Grillo-Ravelo, 2000; Xie et al., 1988); Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.
(Rivero- Aragón and Grillo-Ravelo, 2000; Yang et al., 2006); Cladosporium
sp. nr. oxysporum Berk. & M.A. Curtis y Capnodium citri Berk. and Desm.
(Aubert 1987); Paecilomyces javanicus (Friederichs & Bally) AHS Brown & G.
Smith, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas, Acrostalagmus aphidum Oudem
(Yang et al., 2006).
22
C. sp. nr. oxysporum y C. citri han sido considerados un factor
importante de mortalidad de D. citri en Islas Réunion; mortalidades de 60-70
% ocurrieron cuando la humedad excedió cerca del 88% (Aubert,1987). Por
otra parte H. citriformis ha sido reportado en Guadalupe en periodos en los
que la humedad fue superior al 80 % (Étienne et al., 2001).
En Florida, cadáveres de adultos de D. citri fueron reportados
infectados por H. citriformis e I. fumosorosea (Meyer et al., 2007; 2008).
Reyes-Rosas et al (2010) reportan la presencia en Tamaulipas, México de
una infección causada por un hongo entomopatógeno sobre poblaciones del
psílido, el hongo se identificó como Hirsutella citriformis. El inicio de la
epizootia ocurrió entre los meses de julio y agosto, teniendo los picos
máximos de infección entre septiembre y noviembre, período en el cual, las
temperaturas (media entre 25 y 28ºC) y la humedad relativa promedio
(alrededor del 80%) le son favorables para generar infecciones. No se
detectaron ninfas atacadas por el hongo.
Hall et al (2012) condujeron un estudio a nivel de campo durante dos
años en un huerto de naranjos (Citrus reticulata Blanco, C. sinensis (L.)
Osbeck y C. reshni Hort) para caracterizar la fenología de H. citriformis
Speare infectando adultos de D. citri. En promedio se registró una
mortalidad de 23 % de insectos adultos observados en hojas maduras. Los
psílidos muertos se caracterizaron por estar momificados y cubiertos con
varios sinemas producidos por el hongo (apéndice I).
4.4 Generalidades de los hongos entomopatógenos
Los hongos entomopatógenos constituyen el grupo de mayor
importancia en el control biológico de insectos plagas. Virtualmente todos los
insectos son susceptibles a las enfermedades causadas por hongos.
23
Se conocen diversas especies de hongos entomopatógenos,
correspondientes a alrededor de 100 géneros. Entre los géneros más
importantes podemos mencionar: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia,
Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Fusarium, Hirsutella,
Hymenostilbe, Paecilomyces y Verticillium (Monzón, 2001).
4.4.1 Beauveria bassiana
La historia temprana de B. bassiana se inició en 1835. Agostino Bassi
di Lodi en Italia, fue el primero en demostrar que un hongo puede causar
enfermedades en los insectos, lo cual lo llevó a enunciar la teoría de los
gérmenes de la enfermedad. Él observó una enfermedad del gusano de
seda, Bombyx mori, a la que denominó “muscardina blanca” y comenzó con
los primeros experimentos de infección. El hongo fue estudiado y descrito por
el naturalista italiano Giuseppe Gabriel Balsamo-Crivelli en 1835, quien le dio
el nombre Botrytis bassiana, en honor a Bassi. En 1911 Beauverie estudió el
hongo de nuevo y en 1912 Vuillemin creó el nuevo género en honor a
Beauverie, de los cuales la especie Beauveria bassiana se convirtió en la
especie tipo. Actualmente Beauveria bassiana es la especie más
ampliamente distribuida del género, y es considerado un hongo
entomopatógeno ubicuo que ha sido aislado de una amplia variedad de
insectos de todos los órdenes (Zimmermann, 2007a).
24
4.4.1.1 Ubicación taxonómica
4.4.1.2 Rango de hospederos
Li (1988) enlistó 707 especies de insectos hospederos de B. bassiana,
esto comprende 521 géneros y 149 familias en 15 ordenes. Además de 13
especies de Acarina distribuidos en siete géneros y seis familias. Los
órdenes de insectos en las cuales B. bassiana ha sido catalogado como
patógeno son: Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Diptera,
Hemiptera, Ortoptera, Siphonaptera, Isoptera, Thysanoptera, Mantodea,
Neuroptera, Dermaptera, Blattodea y Embioptera.
Sin embargo, a pesar de la prevalencia de B. bassiana en un gran
número de artrópodos, se sabe que la mayoría de los aislados de este hongo
tienen una gama de hospederos limitada (Vestergaard et al., 2003). Existen
varios ejemplos en que aislados de B. bassiana a partir de un insecto
Super reino Eukaryota
Reino Fungi
Sub-reino Dikarya
Filum Ascomycota
Sub-filum Pezizomycotina
Clase Sordariomycetes
Sub-clase Hypocreomycetidae
Orden Hypocreales
Familia Cordycipitaceae
Género Cordyceps (= Beauveria)
Especie bassiana
Nombre binomial Beauveria bassiana
Nombre común Hongo de la muscardina blanca
25
huésped distinto o desde el suelo son altamente virulentas contra otras
plagas blanco (Cottrell and Shapiro-Ilan, 2003). Por lo tanto, es necesario
evaluar la virulencia de diferentes aislados contra una especie de insectos
blanco con la finalidad de seleccionar el más virulento.
4.4.1.3 Morfología
B. bassiana se caracteriza por presentar un micelio blanco, las
colonias presentan un aspecto aterciopelado a polvoriento; blancas en los
bordes que se vuelven amarillo-pálidas, algunas veces rojizas, incoloras al
reverso, amarillas o rojizas. Conidióforos abundantes, que se levantan a
partir de las hifas vegetativas sosteniendo grupos de células conidiógenas
que se pueden ramificar para originar más células globosas o en forma de
botella en la parte basal con un raquis de hasta 20 µm de largo, en su
mayoría formando un zig-zag.
Los conidios son hialinos, lisos, globosos a ligeramente elipsoidales (2-3 x
2.0-2.5 µm), generalmente forman racimos parecidos a bolas de nieve o de
algodón (Zimmermann, 2007a) (apéndice J).
4.4.2 Isaria fumosorosea
La primer descripción de I. fumosorosea fue realizada por Wize en 1904
cuando lo aisló de una larva del picudo de la remolacha Cleonus
punctiventris en Ucrania. Posteriormente basándose en el estudio
monográfico del género Paecilomyces realizado por Samson (1974), I.
fumosorosea Wize se incluyó en la sección recién creada denominada
Paecilomyces sect. Isarioidea y desde entonces se le denominó
Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith por muchos años
(Zimmermann, 2008).
26
A través de los años, varias investigaciones filogenéticas demostraron
que el género Paecilomyces es polifilético (Obornik et al., 2001; Luangsa-ard
et al., 2005; Inglis and Tigano, 2006). Luangsa-ard et al (2005) estudiaron las
relaciones filogenéticas de las especies pertenecientes a la sección
Paecilomyces sect. Isarioidea utilizando el gen de la β-tubulina y el
espaciador interno transcrito (ITS) rDNA.
Ellos encontraron que la sección es polifilético dentro de los
Hypocreales (Ascomycota), y un grupo monofilético fue reconocido y
designado como el clado Isaria, que incluye I. farinosa e I. fumosorosea.
Estos resultados fueron apoyados por Inglis y Tigano (2006) al analizar el
rDNA 5.8 S y las secuencias ITS1 e ITS2.
4.4.2.1 Ubicación taxonómica
Super reino Eukaryota
Reino Fungi
Sub-reino Dikarya
Filum Ascomycota
Sub-filum Pezizomycotina
Clase Sordariomycetes
Sub-clase Hypocreomycetidae
Orden Hypocreales
Familia Cordycipitaceae
Genero Isaria(= Paecilomyces)
Especie fumosorosea
Nombre binomial Isaria fumosorosea
27
4.4.2.2 Rango de hospederos
En lo que respecta a su distribución mundial I. fumosorosea tiene un
rango relativamente amplio de hospederos predominantemente
Lepidópteros, pero relativamente más estrecho en comparación con B.
bassiana (Zimmermann, 2007a, 2008). De acuerdo al catalogo de la USDA-
ARS correspondiente a la colección de cultivos de hongos entomopatógenos
(ARSEF) (Humber and Hansen, 2005) las principales ordenes de insectos
que afecta I. fumosorosea son: Acari, Blattodea, Coleoptera, Díptera,
Hemiptera, Hymenoptera, Isóptera, Lepidoptera, Neuroptera y Thysanoptera.
4.4.2.3 Morfología
I. fumosorosea es un hongo de rápido crecimiento. En ocasiones las
colonias basalmente tienen aspecto de fieltro o pueden tener un aspecto
polvoriento, granular. Producen coremios definidos que son polvorientos
cuando el hongo es aislado por primera vez. Al principio las colonias son
blancas, y pueden permanecer así o cambiar con el tiempo a tonalidades
rosadas y grisáceas. Los conidióforos se producen solos o en grupos, de
paredes lisas, hialinas, con verticilos ramificados con grupos de 3-6 fiálides.
Algunas veces el patrón verticilado se rompe y sobre el conidióforo se
producen ramas sencillas. Fiálides con una base ancha globosa a elipsoidal
que se adelgaza a un cuello delgado y largo, como en forma de botella. Los
conidios son cilíndricos a fusiformes (3-4 x 1-2 µm), con extremos
redondeados, lisos, hialinos o ligeramente rosados, formando estructuras tipo
cadenas (Zimmermann, 2008) (apéndice K).
28
4.4.3 Metarhizium anisopliae
Metarhizium anisopliae, anteriormente conocido como Entomophthora
anisopliae, es un hongo ampliamente distribuido que habita en el suelo. El
primer uso de M. anisopliae como un agente microbiano contra los insectos
fue en 1879, cuando Elie Metchnikoff lo aisló del escarabajo del trigo,
Anisoplia austriaca (Herbst) descrito por Sorokin. Más tarde fue usado para
controlar el gorgojo de la remolacha azucarera, Cleonus punctiventris
(Bischoff et al., 2009).
4.4.3.1 Ubicación taxonómica
Super reino Eukaryota
Reino Fungi
Sub-reino Dikarya
Filum Ascomycota
Sub-filum Pezizomycotina
Clase Sordariomycetes
Sub-clase Hypocreomycetidae
Orden Hypocreales
Familia Clavicipitaceae
Genero Metarhizium
Especie anisopliae
Nombre binomial Metarhizium anisopliae
Nombre común Hongo de la muscardina verde
29
4.4.3.2 Rango de hospederos
M. anisopliae frecuentemente puede ser aislado de suelos en los
trópicos y en las regiones templadas; parasitan una amplia gama de
especies de insectos y es un agente de alto potencial en el control biológico
de plagas agrícolas. Se considera que ataca naturalmente más de 300
especies de insectos de diversos órdenes (Ferrón, 1981).
M. anisopliae se ha utilizado para el manejo y la prevención de
infestaciones de varias especies de la superfamilia Acridoidea, incluyendo
langostas y saltamontes (Milner and Pereire, 2000; Hunter et al., 2001;
Lomer et al., 2001).
4.4.3.3 Morfología
Las colonias presentan un margen micelial blanco. Conidióforos con
aspecto de "terrones" que se colorean con el desarrollo de las esporas. El
color varía desde oliváceo hasta amarillo-verde o verde oscuro. Esporas
formadas sobre hifas columnares, a veces discretos esporodoquios, como
costras. Al reverso incoloras o color miel. Conidióforos abundantes,
usualmente con 2-3 ramificaciones por nodo. Fiálides cilíndricas o clavadas
que se adelgazan abruptamente hacia el ápice. Conidios en cadena
formados en los ápices de las fiálides, estrechos, cilíndricos, delgados y
truncados en ambos extremos, hialinos a oliváceos o verdes (Bischoff et al.,
2009) (apéndice L).
4.5 Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos
El desarrollo de micosis puede estar dividido en tres fases: (1)
adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto, (2)
30
penetración en el hemocele y (3) desarrollo del hongo. Lo cual generalmente
resulta en la muerte del insecto (Alean-Carreño, 2003).
4.5.1 Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero
El primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero
es por la cutícula la cual está compuesta principalmente de proteínas,
quitina, lípidos y compuestos fenólicos, los cuales funcionan como una
barrera contra la invasión de microorganismos y medio ambiente (Hegedus y
Khachatourians, 1995). Las características físicas y químicas de las
superficies de la cutícula del insecto y la espora son las responsables de esta
unión.
En algunos hongos la adhesión es un fenómeno inespecífico, mientras
en otros esto es un proceso específico. Algunas glicoproteínas pueden servir
como un receptor específico para las esporas (Tanada and Kaya, 1993). Se
ha sugerido que iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 reducen las fuerzas
de repulsión electrostática de la superficie del insecto, por lo que pueden
afectar su hidrofobicidad y promover la adhesión pared celular fúngica-
cutícula, creando condiciones favorables para el establecimiento de la espora
y la subsecuente invasión del hospedero (Barnes y Moore, 1997; Jeffs et al.,
1997; Wessels, 1999).
4.5.2 Germinación de la espora
Se entiende por germinación al proceso mediante el cual una espora
emite uno o varios pequeños tubos germinales, los cuales por crecimiento y
alargamiento dan origen a las hifas (Volcy y Pardo, 1994). La germinación de
las esporas se inicia con el hinchamiento de la misma, que es favorecido por
una humedad alta (70% durante 14h); la germinación es disparada por
mensajeros que generalmente son carbohidratos presentes en las proteínas
31
cuticulares del insecto (Hegedus y Khachatourians, 1995; Khachatourians,
1996).
La hidratación de la espora es favorecida por la acción antidesecante
de su cubierta mucilaginosa, que además funciona como protector ante la
presencia de polifenoles tóxicos y enzimas, secretadas por sistema inmune
del insecto. Este proceso depende en gran parte depende de la humedad
ambiental y temperatura, y en menor grado de las condiciones de luz y
nutricionales (Tanada and Kaya, 1993).
El nivel de agua es determinante en el crecimiento de los hongos y
pequeñas diferencias en los niveles de humedad relativa después de la
aplicación de conidios, pueden determinar de un modo u otro el éxito del
hongo en el control de insectos plaga (Gillespie, 1988).
El resultado de la germinación y la penetración puede no depender
necesariamente del porcentaje total de germinación sino del tiempo de
duración de la germinación, modo de germinación, agresividad del hongo, el
tipo de espora y la susceptibilidad del hospedero (Samson et al., 1988).
4.5.3 Penetración del integumento
La penetración de la cutícula del insecto por conidias germinadas,
ocurre como resultado de una combinación entre la degradación enzimática
de la cutícula y la presión mecánica por el tubo germinal (Gillespie, 1988). El
modo de penetración principalmente depende de las propiedades de la
cutícula, grosor, esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y
nutricionales (Charnley, 1984).
La fuerza mecánica es notable en el extremo de una hifa invasiva
donde la capa cuticular es deformada por presión (Tanada and Kaya, 1993).
32
Se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula
y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la
penetración al interior del cuerpo del insecto.
En la penetración participa un mecanismo físico y uno químico, el
primero consiste en la presión ejercida por la estructura de penetración, la
cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula.
El mecanismo químico consiste en la acción enzimática,
principalmente proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan
degradación del tejido en la zona de penetración, lo que facilita la
penetración física (Monzón, 2001). Las enzimas descubiertas en el tubo
germinativo son proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-
glucosamidasa quitinasas).
Estudios in vitro indican que en la digestión del integumento sigue una
secuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada and Kaya, 1993). Una vez
dentro del insecto, el hongo prolifera formando cuerpos hifales secundarios,
que se ramifican en la procutícula conformada principalmente de fibrillas
lameladas de quitina embebidas en una matriz proteínica que actúa como
cubierta física protectora ante las secreciones extracelulares del patógeno.
Posteriormente, los cuerpos hifales se encuentran con la capa epidérmica y
con su respectiva membrana basal y se diseminan a través del hemocele
(Deshpande, 1999). Así, invaden diversas estructuras como tejidos
musculares, cuerpos grasos, tubos de Malpighi, mitocondrias, hemocitos,
retículo endoplásmico y membrana nuclear.
Cabe destacar que durante la penetración del hongo desde la cutícula
del insecto hasta el hemocele, la hifa queda inmersa en proteínas, quitina,
lípidos, melanina, difenoles y carbohidratos; algunos de ellos son
nutrimientos pero otros pueden inhibir su crecimiento, ya que el insecto
33
activa su sistema inmune a través de procesos como la melanización,
fagocitosis, nodulación y encapsulamiento (St. Leger y Roberts, 1997).
Sin embargo, los hongos desarrollan una serie de actividades que les
permiten evitar este tipo de defensas, tales como cambios en la pared celular
y producción de sustancias inmunomodulatorias o toxinas fúngicas
(Khachatourians, 1991).
4.5.4 Penetración a través de cuerpos abiertos
Los hongos pueden infectar insectos a través de la cavidad bucal,
espiráculos y otras aberturas externas de un insecto. Puesto que la humedad
no es un problema en el tracto alimenticio, la espora puede germinar rápido
en este ambiente; por otra parte, los fluidos digestivos pueden destruir la
espora o la hifa germinativa. En algunos casos, la digestión de estructuras
fúngicas puede causar la muerte por toxicidad más que por micosis
(Charnley, 1984).
4.5.5 Replicación en el hemocele
Después de llegar al hemocele, la mayoría de los hongos convierten el
crecimiento micelial en una fase de levadura o sea crecimiento por
gemación. Se producen toxinas y enzimas, aunque algunos hongos
aparentemente carecen de toxinas, matan el insecto al consumir todos los
nutrientes o por destrucción física (Bustillo, 2001).
Las toxinas causan la muerte del insecto debido a la degeneración de
los tejidos, producto de la pérdida de la integridad estructural de las
membranas seguido de la deshidratación de las células por pérdida de fluido
(Ferrón, 1981). Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis
34
induce a síntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como
convulsiones, carencia de coordinación y comportamientos alterados.
Ocurre una competencia entre el hongo y la flora intestinal. En la
mayoría de los casos los hongos producen sustancias antibacteriales y
cambio de color del cadáver (Ferrón, 1978).
Cuando el insecto muere y al agotarse los nutrientes, el hongo inicia
un crecimiento miceliar invadiendo todos los órganos del hospedero.
Finalmente, las hifas penetran la cutícula desde el interior del insecto y
emergen a la superficie, e inician la formación de esporas cuando la
humedad relativa es adecuada (Gillespie y Claydon, 1989).
La esporulación sobre el cadáver produce inóculo para infectar a otros
insectos. Si las condiciones no son favorables, queda dentro del cadáver del
insecto, donde puede sobrevivir por algunos meses y eventualmente
producirá esporas cuando lleguen las condiciones favorables. La
esporulación ocurre generalmente en cadáveres pero puede también ocurrir
en insectos vivos (Tanada and Kaya, 1993).
4.5.6 Dispersión de las esporas
La dispersión de la espora puede ser un proceso activo o pasivo y
depende de las características de la espora y el esporangio. Cada conidia
puede adherirse o pasar de un invertebrado a otro por dispersión (Tanada
and Kaya, 1993). El mecanismo de acción de los entomopatógenos se
resume en forma esquematizada en la figura 2.
35
Figura 2. Esquema del desarrollo de un hongo entomopatógeno. 1. Adhesión de la espora a la cutícula del insecto, 2. Germinación y formación del apresorio, 3. Penetración de la cutícula, 4. Crecimiento lateral y penetración en la epidermis, 5. Agregación de los hemocitos en el lugar de penetración fúngica, 6. Fagocitosis de cuerpos hifales por células fagócitas del insecto, 7. Transformación a cuerpos levaduriformes, 8. Evasión del sistema inmune, 9. Propagación en el hemocelele, 10. Transformación a cuerpo hifal, 11. Esporulación y germinación atravesando la cutícula del insecto, 12. Diseminación de las esporas (Tomado de Téllez-Jurado et al., 2009).
4.6 Enzimas
4.6.1 Función de las enzimas durante el proceso de infección
El éxito en la penetración de la cutícula de los insectos depende
principalmente de varias enzimas hidrolíticas que degradan las proteínas,
quitinas y lípidos en el integumento del insecto y proporcionan nutrientes
para el hongo (Feng et al., 1994; Hegedus y Khachatourians, 1995). Los
niveles de enzimas específicas que degradan la cutícula como la lipasa,
quitinasa, proteasa, quimoelastasa, y quimotripsina tienen relación con los
parámetros de virulencia específica (Gupta et al., 1994).
36
Indudablemente, muchas enzimas patogénicas son importantes al
determinar la virulencia debido a que permiten al patógeno coexistir con el
proceso de cambios metabólicos asociados al estado de la enfermedad del
hospedero (Hajek y St. Leger, 1994). Sin embargo, las enzimas no son el
único factor que influye en el fenómeno de la virulencia, o en el éxito del
proceso de la infección (Champlin et al., 1981). Otros factores pueden ser el
éxito de la adhesión de la conidia a la cutícula, presencia de ácidos grasos
en la superficie de la cutícula, crecimiento fúngico antes de la penetración, y
la producción y regulación de otras toxinas (Bidochka y Khachatourians,
1990).
Las lipasas y proteasas actúan antes que las quitinasas, la producción
secuencial de estas enzimas se puede interpretar con respecto a la
estructura física de la cutícula del insecto, las fibras de quitina son rodeadas
por una capa de proteína; por consiguiente, la quitina no puede ser
degradada hasta que las proteínas son removidas (Bidochka et al., 1997;
Leathers y Gupta, 1993).
Estas enzimas son sintetizadas en una manera coordinada con
relación a la estructura cuticular, y son inducidas in vitro cuando son
cultivadas sobre cutícula de insecto; la significancia de alguna de las
enzimas depende de las características cuticulares, y estado fisiológico del
insecto, así como de los mecanismos de invasión por el hongo (Hegedus y
Khachatourians, 1995).
4.6.2 Lipasas
Las lipasas son enzimas que hidrolizan triglicéridos a ácidos grasos y
glicerol, y bajo ciertas condiciones catalizan la reacción inversa. Algunas de
estas enzimas son también capaces de catalizar reacciones de
transesterificación (Pokorny et al., 1994).
37
Los lípidos de la epicutícula son la primer barrera en cruzar, por lo que
las lipasas son importantes en el proceso de la infección; la composición de
estos lípidos incluye aproximadamente 65% de alcanos, 25% de ésteres
cerosos secundarios, triglicéridos, alcoholes, y ácidos grasos; además de
lípidos, la cutícula contiene aminoácidos, y aminoazúcares que funcionan
como nutrientes para la germinación del hongo (Bidochka et al., 1997).
La incapacidad para utilizar los lípidos que predominan sobre la
superficie de la cutícula puede reducir la virulencia de algunos hongos; estos
lípidos son suficientemente heterogéneos y contribuyen en la especificidad
de la relación patógeno-hospedero (St. Leger, 1993). La importancia de las
lipasas depende principalmente del sistema de especificidad patógeno-
hospedero (Hegedus y Khachatourians, 1995).
Los estudios preliminares indican que existen dos posibles funciones
de los lípidos cuticulares de los insectos en la actividad de los hongos
entomopatógenos; algunos de ellos podrían ser usados como recursos
pobremente accesibles de energía para la germinación de la espora.
Otros podrían tener una actividad antifúngica específica
probablemente expresada en el crecimiento hifal, polaridad, insaturación, o
ramificación como longitud de cadenas de los lípidos cuticulares
probablemente involucrados en cada proceso.
Es necesario realizar investigaciones sobre la posible correlación entre
cepas infectivas y los lípidos cuticulares de los hospederos (Leucona et al.,
1997).
38
4.6.3 Proteasas y Quitinasas
Una vez que la superficie Iípidica de la epicutícula es degradada por
las lipasas, el hongo produce grandes cantidades de proteasas (Prl), para
degradar el material proteínico de la procutícula que se encuentra adherido
como una cubierta de la quitina. Las enzimas proteolíticas (comúnmente
llamadas proteasas) pertenecen al grupo de las hidrolasas (Guadix et al.,
2000), degradan las cadenas polipeptídicas de las proteínas-sustrato
(Carrera, 2003), e hidrolizan enlaces peptídicos con diferentes grados de
intensidad y de selectividad. Una vez liberadas las fibras de quitina, las
proteínas solubilizadas son degradadas por aminopeptidasas y
exopeptidasas, para ser convertidas en aminoácidos útiles como nutrientes
para el hongo (Bidochka et al., 1997).
La degradación de la cubierta de proteína permite accesar a las
enzimas quitinolíticas hacia las fibras de quitina para degradarlas, lo cual
induce a la producción de más quitina (GlcNAc), y esta a su vez a la síntesis
de más quitinasa, reduciendo la actividad de las proteasas (Hegedus y
Khachatourians, 1995; Bidochka et al., 1997). Las quitinasas son enzimas
que degradan la quitina, un polisacárido de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc)
con enlaces β (1, 4), sobre los cuales actúan, hidrolizándolos.
Las quitinasas extracelulares o N-acetilglocusamidasas (NAGasa) son
producidas después que las proteasas; esta secuencia en la producción de
las enzimas se debe a la estructura física de la cutícula del insecto. Las
fibras de quitina se encuentran cubiertas por una capa de proteína, la cual
debe ser degradada para poder activar a las quitinasas e hidrolizar la quitina
(Bidochka et al., 1997); sin embargo, la degradación parcial de lípidos es
suficiente para abrirle el camino a las quitinasas (Samsináková et al., 1971).
39
Las proteasas extracelulares solubilizan las proteínas cuticulares, las
cuales ayudan en la penetración y proporcionan nutrientes para una mayor
proliferación del hongo dentro del insecto (Bidochka et al., 1997). Durante los
primeros estados de infección, la proteasa Pr1 de B. bassiana se localiza
próxima a la hifa, pero es indispensable la separación mecánica de las
proteínas, en los últimos estados, Pr1 se distribuye en toda la región de
invasión (Hegedus y Khachatourians, 1995) (Figura 3).
Figura 3. Representación de la interacción entre las enzimas extracelulares y la degradación de la cutícula de los insectos. (Tomado de España-Luna, 2000).
Se ha identificado una amplia variedad de enzimas catabólicas en hongos
entomopatógenos; alcalino fosfatasa, esterasa C4, esterasa/lipasa C8, lipasa
C14, leucina aminopeptidasa, valina aminopeptidasa, cisteína
aminopeptidasa, tripsina, quimotripsina, ácido fosfatasa, fosfohidrolasa α-
galactosidasa, β-galatosidasa, β-glucuronidasa, α-glucosidasa, β-
glucosidasa, β-glucosaminidasa, α-mannosidasa y α- fucosidasa, y β-
40
galactosidasa. Aun no se ha descifrado con claridad la contribución de estas
enzimas en los procesos de infección (Hegedus y Khachatourians, 1995).
4.7 Producción de hongos entomopatógenos
La producción de hongos entomopatógenos se basa en la
multiplicación masiva del hongo y sus estructuras reproductivas en un
sustrato (Monzón, 2001).
El proceso de desarrollo de un agente de control microbiano con lleva
varias etapas desde el aislamiento hasta su uso, las cuales deben tener una
secuencia determinada. La etapa inicial comprende el aislamiento del
microorganismo y la evaluación de su actividad biocontroladora, seguida de
su caracterización y conservación (Cotes, 1997); además de definir un medio
de cultivo y un sistema adecuado para la obtención masiva del inóculo que
permita una buena relación costo-rendimiento en la producción (Fernández y
Juncosa, 2002).
Un factor clave en la selección de nuevos aislados como potenciales
agentes de control biológico, específicamente en hongos entomopatógenos,
es la capacidad de la cepa para ser producida en grandes cantidades (altas
tasas de esporulación), tener un rápido crecimiento y no perder su viabilidad
e infectividad (Goettle and Roberts, 1992; Feng, et al., 1994).
Sin embargo, una limitante para lograr estos objetivos suelen ser el
medio y el método de cultivo ya que la elección de ambos parámetros
depende en gran medida de las especies fúngicas a utilizar y el tipo de
propágulo requerido para la formulación y el método de aplicación
(Derakhshan et al., 2008).
41
4.7.1 Requerimientos nutricionales
Existen dos requerimientos nutricionales principales en el desarrollo
de la esporulación, que son la fuente de carbono y nitrógeno. La glucosa es
la fuente de carbono más ampliamente utilizada por los hongos (Pérez y
Ramírez, 2000), la fructosa y la manosa son las siguientes azúcares más
utilizadas seguidas de la galactosa, sacarosa, lactosa, maltosa y
polisacáridos como el almidón, celulosa, pectina (Griffin, 1981), quitina
(Hegedus et al., 1990), trehalosa, sorbitol y manitol (Bidochka et al., 1990).
Por su parte, el nitrógeno es requerido por los hongos para sintetizar
aminoácidos, proteínas, y ácidos nucleicos necesarios para la construcción
del protoplasma (Pérez y Ramírez, 2000). Los hongos en su gran mayoría
prefieren fuentes de nitrógeno orgánico como urea e hidrolizado de caseína
(Griffin, 1981), peptona, levadura (Hegedus et al., 1990), líquido de remojo
de maíz (Blachere et al., 1973) y casaminoácidos (Jackson et al., 1997). Sin
embargo también se menciona el uso de fuentes inorgánicas de nitrógeno
como KNO3, NaNO3 y (NH4)2SO4 (Bidochka et al., 1990).
4.7.2 Medios de cultivo
Todos los medios de cultivo utilizados en la propagación de hongos
deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de sus
estructuras (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc). El pH debe
ser preferentemente ácido para facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir
al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos, incluso se utilizan
algunos antibióticos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas
que suelen contaminar las muestras (Alean-Carreño, 2003).
42
Existen tres tipos de medios de cultivo para los hongos de acuerdo a
su procedencia y origen de sus componentes:
Medios naturales: se caracterizan por estar preparados por
compuestos de origen natural y su composición no es exacta, como pedazos
o infusiones de frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos animales.
Estos medios varían mucho en su composición, no son fácilmente
reproducibles, ni de amplio uso.
Medios semi-sintéticos, están conformados por compuestos de origen
natural y químico, estos medios de cultivo están preparados con peptonas,
extractos de plantas, agar y otros compuestos de procedencia desconocida o
variable.
Medios sintéticos, presentan composición química definida cuantitativa
y conocida. La mayoría de las fórmulas de los medios de cultivo utilizados
para hongos contienen peptona, algún carbohidrato y agar (Alean-Carreño,
2003).
4.7.3 Tecnologías para la producción de hongos
Los métodos de producción varían considerablemente. Muchos están
basados en fermentaciones sobre sustrato sólido con granos de cereales
donde el arroz es el más universal. Otros usan sustratos no nutritivos como
gránulos de arcilla. Algunos producen conidios aéreos en la superficie de
cultivos líquidos estáticos. Otras tecnologías se desarrollan en tanques de
fermentación para obtener productos a base de micelio, blastoesporas o
conidios sumergidos.
En general, los tipos de cultivo más comúnmente utilizados en la
producción de hongos se pueden clasificar en cultivos bifásicos y cultivos
líquidos agitados o fermentaciones líquidas.
43
4.7.3.1 Cultivos bifásicos
En este tipo de cultivo se desarrolla el inóculo en líquido agitado y
luego se pasa al soporte sólido. En los sistemas bifásicos siempre se debe
optimizar el cultivo de la fase líquida para que promueva un rápido
crecimiento del aislado. Es el más utilizado a nivel mundial, se obtienen
estructuras infectivas de alta calidad y se acorta el tiempo cuando la fase
líquida se hace por cultivo líquido agitado.
Un amplio rango de sustratos sólidos está disponible para su uso en la
producción de hongos entomopatógenos para el control biológico. La
selección del sustrato depende de varios factores, incluyendo la
disponibilidad, costos y preferencia del aislado. Un sustrato ideal es aquel
que proporciona grandes espacios para la aireación, que mantiene sus
partículas individuales separadas después de la hidratación y esterilización
para proveer espacios entre partículas y la formación de conidios. Las
partículas de los sustratos que son agrupadas cuando se agrega el agua,
reducen el área superficial y limitan el espacio donde la esporulación puede
ocurrir. Los sustratos sólidos pueden ser nutritivos o inertes. Una de las
ventajas ofrecidas por el uso de sustratos inertes es la oportunidad de
agregar los nutrientes al sustrato para la esporulación óptima del aislado
(Jenkins et al., 1998).
Los cereales y los residuos agroindustriales son los sustratos nutritivos
más utilizados en la producción de hongos entomopatógenos, aunque estos
permiten menos control sobre el ambiente nutricional. Durante el crecimiento
y la esporulación, los hongos utilizan una cierta cantidad de nutrientes
suministrados por estos granos y residuos (Dalla et al., 2005).
44
El sustrato nutritivo comúnmente seleccionado para la producción de
conidios de hongos es el arroz (Oryza sativa L.) debido a su balance
nutricional, costos amplia disponibilidad a nivel mundial, características
físicas como el tamaño del grano, propiedades de hidratación e integridad
estructural después de ser colonizado por el hongo (Jenkins et al., 1998). Sin
embargo se han probado otros cereales para inducir la propagación masiva
de hongos entomopatógenos como por ejemplo: cebada (Hordeum
vulgare L.), avena (Avena sativa L.), frijol (Phaseolus vulgaris L.), trigo
(Triticum spp.) y soya (Glycine max L.) (Figueroa et al., 2007).
4.7.3.2 Cultivos líquidos agitados o fermentaciones líquidas
Este tipo de cultivos poseen un alto grado de automatización del
proceso, son muy rápidos, pero tienen como desventaja que muchos
aislados tienden a crecer como pellets miceliales. En este tipo de cultivos
tienden a formarse abundantes blastoesporas. En estos sistemas se logra un
óptimo aprovechamiento de los nutrientes. Pueden llegar hasta niveles
industriales.
Uno de los aspectos a considerar para el incremento de la utilización
de los agentes microbianos de control biológico es el mejoramiento de la
eficiencia de los procesos de producción masiva, lo que debe incluir la
optimización de los métodos de cultivo (Lacey et al., 2001). La optimización
de un medio líquido que garantice el rápido crecimiento de un determinado
aislamiento es uno de los pasos en el desarrollo de un procedimiento de
producción masiva. Estos medios deben contener fuentes de carbono y de
nitrógeno, así como microelementos y factores de crecimiento (Jenkins et al.,
1998; Fargues et al., 2002).
45
Una forma especial de cultivo con tecnología avanzada lo constituyen
las fermentaciones en estado sólido que han dado la oportunidad a la
industria de desarrollar producciones de bioplaguicidas en biorreactores
sellados con un grado alto de automatización, con principios similares a
aquellos de la fermentación líquida, lo que reduce costos de mano de obra y
permite un control eficiente del proceso de producción donde se logra
biomasa de alto valor infectivo y más resistente a condiciones ambientales
adversas. En estos sistemas también se logra un óptimo aprovechamiento de
los nutrientes pero la inversión de capital inicial es muy alta.
4.8 Actividad tóxica de hongos entomopatógenos sobre Diaphorina citri
Subandiyah et al (2000) reportaron ensayos a nivel laboratorio con
una cepa de P. fumosoroseus aislada de adultos de D. citri infectados. Se
asperjaron suspensiones de esporas de 107, 108 y 109 sobre plántulas de
cítricos y una vez seco el follaje se introdujo de 5 a 10 adultos de D. citri. Las
macetas de plántulas fueron examinadas diariamente para comprobar la
supervivencia y la infección por hongos hacia los insectos, reportándose a
los seis días mortalidades de 10%, 35 % y 55.6 %.
Padulla y Alves (2009), realizaron bioensayos a nivel laboratorio con
tres cepas de B. bassiana, provenientes de insectos infectados, a una
concentración de 5 x 107 conidias mL-1, obteniendo mortalidades en el rango
del 54-72 % a los siete días de aplicación.
En otro estudio Mellín-Rosas et al (2009) evaluaron cepas de I.
fumosorosea, M. anisopliae y B. bassiana aisladas de Bemisia sp y
Aenolamia sp. a una concentración de 1 x 107 conidios mL-1, obtuvieron
46
mortalidades de 80.79 a 90.00 % para las cepas de I. fumosorosea, de 76.09
a 79.49 % para cepas de M. anisopliae, y para B. bassiana las mortalidades
oscilaron entre 16.44 y 30.40 %.
Avery et al (2009) probaron la infectividad y transferencia horizontal de
Isaria fumosorosea Wize entre Diaphorina citri. En el bioensayo usaron una
hoja despegada, rociaron 1.2 - 1.7 x 103 blastosporas/mm2 sobre secciones
de hojas de cítricos o sobre etiquetas plásticas de color amarillo (superficie
de atrayente artificial). La mortalidad causada por I. fumosorosea para el
adulto del psílido ocurrió a los 4.9 ± 0.21 - 6.1 ± 0.37 días después de
exponerlo al patógeno.
La tasa de colonización de I. fumosorosea sobre los adultos en las
cámaras con secciones de hojas no tratadas y con una etiqueta amarilla
tratada fue tan efectiva en inducir mortalidad como en las cámaras con una
sección de hoja tratada a los 8 días después de la aplicación. El mismo
fenómeno, de la infección del psílido y el esparcir el hongo a hojas no
tratadas fue observado cuando los psílidos fueron puestos en cámaras con
una etiqueta amarilla tratada.
Hoy et al (2010) realizaron bioensayos a nivel laboratorio con una
nueva cepa de Isaria fumosorosea aislada de cadáveres de insectos adultos
de D. citri. Psílidos adultos fueron asperjados con esporas a los 28ºC, los
valores obtenidos del tiempo letal (TL50) fueron de 111 y 102.5 h a la
concentración de esporas de 1x107 y 1x108 esporas mL-1, respectivamente.
Después de 192 h, el valor de CL50 fue de 6.8 x 105 esporas mL-1 y la CL99
fue de 2.2 x 108 esporas mL-1.
47
Sánchez- González et al (2011) evaluaron la efectividad en campo de
cuatro hongos entomopatógenos contra Diaphorina citri, mismos que se
seleccionaron con base en la virulencia; fueron tres cepas de Isaria
fumosorosea Pf15, Pf17 y Pf21 y una de Metarhizium anisopliae Ma59. En el
estudio, la mortalidad obtenida varió de 47.90 a 90.34%, y con base en el
análisis estadístico la cepa que presentó mayor porcentaje de mortalidad fue
la cepa Pf21 con 90.72 %, seguida de Ma59 con 72.82 % y Pf17 con 58.29%,
mientras que Pf15 registró la mortalidad más baja con 47.90%. Considerando
mortalidad por micosis comprobada, las cepas Pf21 con 59.79 % y la Pf17
con 45.93% mostraron los mejores resultados seguidas de las cepas Pf17
con 15.64 % y Ma59 con 7.40%.
Lezama-Gutiérrez et al (2012) reportaron la actividad de diferentes
cepas de M. anisopliae, Cordyceps bassiana e I. fumosorosea contra ninfas y
adultos de D. citri bajo condiciones de campo. Las cepas fueron aplicadas a
una concentración de 2 x 1013 conidias por hectárea con un intervalo de 15
días entre aplicaciones. El porcentaje de control de C. bassiana, M.
anisopliae e I. fumosorosea fue de 60, 50, 40 y 35 % en ninfas y 50, 50, 42 y
22 % en adultos, respectivamente. M. anisopliae, C. bassiana e I.
fumosorosea aplicados en huertos de limón persa fueron más efectivos en
reducir las altas densidades de ninfas que de adultos de D. citri.
Stauderman et al (2012) desarrollaron ensayos de laboratorio para
evaluar cepas de I. fumosorosea contra D. citri, reportando hasta el 100 % de
insectos adultos muertos a concentraciones entre 106 y 107 blastoesporas
mL-1 después de 12 días, con valores de CL50 (a los 7 días post-tratamiento)
entre 1.4 x 105 y 2.0 x 106 blastoesporas mL-1. Las tasas de micosis fueron
dependientes de la dosis alcanzando hasta el 100% de esporulación en
cadáveres a 108 blastoesporas mL-1 y declinando a bajas concentraciones.
48
5. MÉTODOS
5.1 Reactivos y material biológico
Las cepas nativas de hongos entomopatógenos se obtuvieron de
suelo de áreas donde se cultivan cítricos en México. En el presente trabajo
se seleccionaron 33 aislados (Tabla II) y ocho cepas de colección: GHA,
Asdel 139, A-48, A-44 (B. bassiana), Pfr-612, Pfr-114 (I. fumosorosea), Met
(M. anisopliae) pertenecientes a la colección del Instituto de Biotecnología,
FCB-UANL, almacenadas en estado criogénico (glicerol al 10 % a -80 ºC),
además de un aislado de Hirsutella citriformis (INIFAP-Hir-1) perteneciente a
la colección del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y
Pecuarias (INIFAP).
Se trabajó con ninfas y adultos de Diaphorina citri (Hemiptera:Psyllidae)
para la realización de los bioensayos para evaluar la patogenicidad de los
hongos entomopatógenos anteriormente mencionados; mientras que para la
sección correspondiente a los bioensayos con adultos de D. citri se utilizaron
plántulas de mandarina Cleopatra (Citrus reshni Hort), mientras que para los
bioensayos con ninfas de D. citri se utilizaron brotes tiernos de naranjo agrio
(Citrus aurantium L.). Respecto a los ensayos con insectos benéficos se
utilizaron adultos de Hippodamia convergens (Coleoptera: Coccinellidae) y
larvas de Ceraeochrysa valida de primer y segundo instar y Eremochrysa
punctinervis (Neuroptera: Chrysopidae) de tercer instar.
Para la implementación de la cría de D. citri se utilizaron brotes tiernos
u hojas maduras de plantas de naranjo agrio, Citrus aurantium L., y de
naranjo trifoliado, Poncirus trifoliata (L.) y plantas de limón Volkameriana
(Citrus volkameriana V. Ten. & Pasq.).
49
Para la cría de Hippodamia convergens se utilizaron los siguientes
ingredientes: azúcar estándar, levadura de cerveza, polen, alga spirulina,
ácido sórbico, miel de abeja, agua y huevo congelado de Sitotroga cerealella
Olivier, y miel de abeja diluida en agua al 80%, mientras que para la cría de
C. valida y Eremochrysa punctinervis se utilizó levadura de cerveza, leche en
polvo, azúcar y miel.
Para la sección correspondiente a la selección de medios de cultivo
para la producción de conidios en placa se utilizaron los siguientes reactivos:
agar papa dextrosa (PDA), peptona de caseína, extracto de levadura,
glucosa anhidra, agar dextrosa Sabouraud y agar bacteriológico.
Para la parte de actividad enzimática en placa se utilizaron los
siguientes reactivos: KH2PO4, KCl, MgSO4.7H2O, CaCl2.H2O, glucosa, agar
bacteriológico, agar leche descremada, NH4H2PO4, CaCl2, quitina coloidal,
agar papa dextrosa, NaCl y Tween 20.
Para el punto de producción de conidios en sustrato sólido se utilizó
grano de arroz (Oryza sativa L.), caldo dextrosa Sabouraud y caldo papa
dextrosa.
Para la conservación de los aislados y cepas se utilizó glicerol al 10
%.Para la activación de los aislados y/o cepas se utilizó agar papa dextrosa,
para la preparación de las suspensiones de conidios se utilizó Tween 80 al
0.1 % (v/v) y para la viabilidad se utilizo agar papa dextrosa y azul algodón
lactofenol.
50
5.2 Equipo
Los equipos utilizados para el desarrollo del presente trabajo se
describen a continuación: Campana de flujo laminar (Labconco© Corp.
Bioseguridad II), Refrigerador (Whirlpool®),Placa de calentamiento con
agitación magnética (Thermolyne Cimarec 3), Potenciómetro (Beckman
Instruments ™ 390), Balanza semi-analítica (Mettler Toledo© International
Inc. PG4402-S), Balanza analítica (Mettler Toledo© International Inc. AB204),
aspersor manual (Thermo Scientific Nalgene© modelo 15-232-8), Incubadora
(Thermo Scientific Precision™), Baño metabólico sin agitación (Thermo
Scientific Precision™), Vortex ( MaxiMix* II vortex mixer Thermo Fisher
Scientific© Inc. y VWR Minivortexer VWR® International), Autoclave (All
American® pressure sterilizer 1925 X), Microscopio estereoscópico
(Olympus© 52H- 1LLK), Cámara de video Hitachi© Ltd. KDP-51 conectada a
un microscopio Olympus© CX 30, Microscopio (Olympus© CHK2-F3-
100),Shaker rotatorio (New Brunswick Scientific© Co.),Cámara bioclimática,
Congelador (Torrey®) , Centrifuga Allegra (Beckman Coulter© Inc. 21R),
Centrifuga (Beckman Coulter © Inc.J2-21).
Para el procesamiento de datos y esquemas se empleó una
computadora Compaq presario MV540 (Compaq), el procesador de texto
Microsoft Word XP (Microsoft Corporation, 2007), el procesador de gráficos
Microsoft Power Point XP (Microsoft Corporation, 2007) y la hoja de cálculo
Microsoft Excel XP (Microsoft Corporation, 2007). Para los cálculos
estadísticos se utilizó el programa estadístico IBM ® SPSS ® v.19 Inc., NY.,
EE.UU.
5.3 Estrategia experimental
En la Figura 4 se ilustra el diagrama general de la estrategia
experimental.
51
Figura 4. Representación esquemática de la estrategia experimental.
Para los experimentos realizados en el presente trabajo se
seleccionaron aislados y cepas de colección de Beauveria bassiana , Isaria
fumosorosea, Metharizium anisopliae e Hirsutella citriformis para evaluar su
patogenicidad sobre ninfas y adultos de D.citri; además se evaluó la
producción de conidios en placa en cinco diferentes medios de cultivo,
actividad enzimática (lipasa, proteasa y quitinasa) en tres diferentes medios
de cultivo sólidos para los diferentes aislados y cepas evaluadas en los
bioensayos sobre ninfas y adultos de D. citri. Finalmente, se realizaron
ensayos de seguridad con los insectos depredadores Eremochrysa
punctinervis, Ceraeochrysa valida e Hippodamia convergens denominados
insectos no-blanco o benéficos que atacan a D. citri en su estadio ninfal,
utilizando los aislados y/o cepas de hongos entomopatógenos que mostraron
mayor patogenicidad sobre adultos y/o ninfas de D. citri, además de evaluar
su producción en sustrato sólido (Oryza sativa L.)
52
Tabla II. Hongos entomopatógenos aislados en suelo donde se cultivan cítricos en diferentes estados de México.
Clave Localidad de colecta Especie
HIB-1 Guasave, Sinaloa B. bassiana
HIB-2 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-3 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-4 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-5 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-6 Guasave, Sinaloa B. bassiana HIB-7 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-8 Tamazunchale, San Luis Potosí B. bassiana HIB-9 Tanquián, San Luis Potosí I. fumosorosea
HIB-10 Allende, Nuevo León B. bassiana HIB-11 Hualahuises, Nuevo León M. anisopliae HIB-12 Allende, Nuevo León M. anisopliae HIB-13 Tamaulipas B. bassiana HIB-14 Hidalgo, Tamaulipas B. bassiana HIB-15 Hidalgo, Tamaulipas B. bassiana HIB-16 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-17 Ahome, Sinaloa B. bassiana HIB-18 Padilla, Tamaulipas B. bassiana HIB-19 Linares, Nuevo León I. fumosorosea HIB-20 Hualahuises, Nuevo León I. fumosorosea HIB-21 Tikinmul, Campeche I. fumosorosea HIB-22 Montemorelos, Nuevo León I. fumosorosea HIB-23 Montemorelos, Nuevo León I. fumosorosea HIB-24 Montemorelos, Nuevo León B. bassiana HIB-25 Montemorelos, Nuevo León B. bassiana HIB-26 Hampolol, Campeche I. fumosorosea HIB-27 Hermosillo, Sonora I. fumosorosea HIB-28 Montemorelos, Nuevo León I. fumosorosea HIB-29 Montemorelos, Nuevo León I. fumosorosea HIB-30 Montemorelos, Nuevo León I. fumosorosea HIB-31 Chencolli, Campeche I. fumosorosea HIB-32 Padilla, Tamaulipas I. fumosorosea HIB-33 Pocyaxum, Campeche I. fumosorosea
53
5.4 Selección de medios de cultivo para la producción de conidios en
placa
Con el objetivo de seleccionar la composición de nutrientes más
favorable en la producción y crecimiento radial de los conidios de los
diferentes hongos entomopatógenos (Tabla II), se probaron cinco medios de
cultivo (Tabla III) en placas Petri.
Tabla III. Composición de los medios de producción de conidios en placa
Medio de cultivo Composición
Medio A
Agar papa dextrosa (PDA): 15 g de agar bacteriológico, 20 g de glucosa, 4 g de infusión de papa
Medio B
Agar papa dextrosa (PDA) suplementado con 0.5 % de peptona de caseína
Medio C
Agar papa-dextrosa (PDA) suplementado con 0.5 % de extracto de levadura
Medio D
Agar dextrosa - levadura (ADY): 4 % de glucosa anhidra, 1 % de extracto de levadura y 1.5 % de agar bacteriológico
Medio E
Agar dextrosa - Sabouraud (ADS): 40 g de glucosa, 10 g de peptona especial, 15 g de agar bacteriológico
Todos los medios fueron preparados de acuerdo a su propiedad nutritiva adicionando 1 L de agua bidestilada por cada medio, esterilizando a 15 lbs. de presión por 15 minutos.
5.4.1 Activación de las cepas
Para la producción de conidios en placa se seleccionaron los
aislados HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, HIB-6, HIB-7, HIB-8, HIB-9, HIB-
10, HIB-11, HIB-12, HIB-13, HIB-14, HIB-15, HIB-16, HIB-17, HIB-18, HIB-20,
HIB-21, HIB-26, HIB-29, HIB-30, HIB-32, HIB-33 y las cepas GHA, Met y
54
Pfr-612, los cuales se descongelaron a temperatura ambiente en un tiempo
aproximado de 30-60 minutos; posteriormente fueron inoculados en forma
de estría en medio agar papa dextrosa ( PDA) y se dejaron incubar a una
temperatura de 28ºC por 14 a 21 días.
5.4.2 Inoculación e incubación de medios de producción
Para la inoculación de cada uno de los medios de cultivo (Tabla V) se
cortaron cuadros de tamaño uniforme de cada uno de los aislados y se
colocaron en el centro de cajas petri de 100 x 15 mm. Se incubaron a 25±2°C
por 14 días. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se
repitieron al menos en dos ocasiones. Transcurrido el tiempo de incubación
se determinó la producción de conidios y crecimiento micelial.
5.4.2.1 Evaluación de la producción de conidios
A cada cepa se le agregaron 10 mL de solución Tween 80 al 0.1 %
(v/v) y con ayuda de una asa se realizó un raspado superficial en cada una
de las placas con crecimiento abundante para desprender los conidios
aéreos y obtener una solución concentrada. Después se realizaron diluciones
para determinar la producción de conidios mL-1 en una cámara de Neubauer.
5.4.2.2 Evaluación del crecimiento micelial
Transcurridos los 14 días de incubación se midió el diámetro de las
colonias en centímetros (cm) utilizando un vernier.
55
5.4.3 Análisis Estadístico
Se realizó un ANOVA y una prueba de separación de medias de
Scheffé (α=0.05) utilizando el programa estadístico IBM® SPSS® v.19 Inc.,
N.Y., EE.UU.
5.5 Producción de conidios para bioensayos
Para cada uno de los bioensayos con adultos o ninfas de D. citri se
seleccionaron al azar los aislados correspondientes de acuerdo a la Tabla
IV, los cuales fueron inoculados en forma de estría en medio agar papa
dextrosa (PDA) y se dejaron incubar a una temperatura de 28ºC por un
tiempo de 14 a 21 días. Transcurrido el tiempo de incubación, a cada cepa
se le agregaron 10 mL de solución Tween 80 al 0.1 % (v/v) y se ajustó la
concentración a 1 x 108 conidios mL-1.
5.5.1 Viabilidad
La viabilidad se determinó en cajas petri de 100 x 15 mm que
contenían PDA. De cada una de las suspensiones de conidios de las cepas
utilizadas se depositó 1 mL y se incubaron a 25 ºC durante 18 h. La
germinación de los conidios se detuvo al adicionar tres gotas separadas de
azul algodón lacto fenol en tres áreas diferentes de la placa. La proporción
de células viables se determinó mediante la observación de 100 conidios en
cada uno de los tres diferentes campos de visión a 40 x con un microscopio
compuesto. El criterio para tomar en cuenta una espora germinada fue
cuando se formó un tubo germinativo, tan largo como la mitad del diámetro
de la espora. La viabilidad se expresó en porciento de germinación (Goettel e
Inglis, 1997).
56
5.6 Cría de Diaphorina citri
La cría fue proporcionada por el Laboratorio de Investigación en
Control Biológico del Campo Experimental General Terán, del Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), con
sede en General Terán, Nuevo León, México (Latitud Norte 24º 44’ 30.5”;
Longitud Oeste 24º 44’ 30.5”; 662 msnm).
Para el establecimiento de la cría de D. citri se colectaron adultos que
se posaban sobre brotes tiernos u hojas maduras de plantas de naranjo
agrio, Citrus aurantium L., y de naranjo trifoliado, Poncirus trifoliata (L.)
establecidos en camas de germinación. Para la colecta se utilizó una
aspiradora bucal. Los insectos colectados se depositaban en recipientes de
plástico trasparente en grupos de 10 insectos; posteriormente se liberaban
en partes iguales en cajas de reproducción de dimensiones 48 x 48 x 60 y 60
x 65x 160 cm. Estas se mantuvieron en un cuarto con condiciones
controladas, a una temperatura de 26ºC, 16:8 horas de luz: oscuridad (L:
O).Cada caja contenía dos plantas de limón Volkameriana (Citrus
volkameriana V. Ten. & Pasq.), las cuales contaban con brotes vegetativos
tiernos para que los adultos se alimentaran y reprodujeran. Cuando los
brotes maduraron, los insectos fueron recolectados para introducir plantas
con nueva brotación.
5.7 Bioensayos con adultos de D. citri
Para cada uno de los bioensayos con adultos de D. citri se
seleccionaron al azar los aislados HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-6, HIB-7,
HIB-8, HIB-10, HIB-19, HIB-20, HIB-21, HIB-22, HIB-11, HIB-12, HIB-13, HIB-
14, HIB-23 y las cepas GHA y Pfr-612.
57
5.7.1 Bioensayos preliminares con adultos de D. citri
Para evaluar la patogenicidad de las cepas de hongos
entomopatógenos sobre adultos de D. citri se utilizó una serie de cámaras
especiales diseñadas para este propósito. Cada una de estas cámaras
consistió de contenedores plásticos de dos litros de capacidad con cierre
hermético.
A cada uno de estos recipientes se les realizó una ventana en un
costado de 9 cm de ancho y 22.5 cm de largo. Esta ventana fue cubierta con
malla anti-áfidos para impedir que escaparan los insectos.
Para la evaluación de las diferentes cepas de hongos
entomopatógenos se utilizaron dos métodos; aspersión directa a la plántula y
aspersión directa a los insectos. Para ambos métodos se colectaron adultos
de D. citri y se formaron grupos de 10 individuos depositados en botes de
plástico con capacidad de 250 mL.
5.7.1.1 Aspersión directa a la plántula
Se utilizaron plántulas de mandarina Cleopatra (Citrus reshni Hort)
creciendo sobre el sustrato Sunshine Peat Moss® en pequeñas macetas de
unicel. Cada una de las macetas fue cubierta con papel estraza para evitar el
contacto entre los insectos y el suelo. Cada una de las plántulas fue
asperjada directamente con las soluciones de conidios y posteriormente se
colocó una plántula por cámara de bioensayo. Finalmente se agregaron 10
insectos adultos de D. citri en cada una de las cámaras, y se cerraron
herméticamente.
58
5.7.1.2 Aspersión directa a los insectos
Para el segundo método se asperjó directamente a los insectos; para
facilitar la aplicación de las suspensiones, los adultos se mantuvieron en
refrigeración y congelación durante 10 minutos. Después de este tiempo
recibieron la aspersión de las suspensiones de conidios y posteriormente se
colocaron en las cámaras de bioensayo que ya contenían una plántula de
mandarina Cleopatra (Citrus reshni Hort) en su interior. Una vez colocados
los insectos los recipientes fueron cerrados herméticamente.
En ambos métodos las condiciones de incubación, fueron de 96 horas
a una temperatura de 24ºC, 52% de humedad relativa (H.R.) y 16:8 horas (h)
luz: oscuridad (L:O).
5.7.2 Ensayos de supervivencia con adultos de D. citri
Debido a la ocurrencia de mortalidad alta en los testigos, se planteó un
experimento que consistió en introducir las plántulas utilizadas en la arena
experimental dentro de las cámaras de reproducción para que los adultos de
D. citri se posaran sobre la misma y así evitar la manipulación de los
insectos. Para este ensayo se utilizaron cinco cámaras de reproducción
donde se colocaron cada una las plántulas, las cuales posteriormente fueron
seleccionadas en base al mayor número de adultos en alimentación activa.
Se formaron 5 grupos de 40 insectos, los cuales se introdujeron en sus
respectivos recipientes y se colocaron en la cámara bioclimática a 26±2ºC,
H.R. de 60±5% y fotoperiodo de 16:8 h L:O. La revisión de la supervivencia
se registró después de 72 horas.
59
5.7.2.1 Aspersión directa a la plántula
Para el método de aspersión directa a la plántula, cada una de las
plántulas fue colocada durante 72 horas en las cajas de reproducción para
inducir una infestación natural. Una vez transcurrido este tiempo se
seleccionaron las plántulas con un mínimo de 10 insectos adultos en
alimentación activa. Las plántulas infestadas fueron colocadas en las
cámaras de bioensayo, y una vez colocadas fueron cerradas herméticamente
y a través de la ventana de la cámara la plántula fue asperjada con un
atomizador manual tipo Nalgene© en 3 ocasiones.
5.7.2.2 Aspersión directa a los insectos
Respecto al método de aspersión directa a los insectos, los adultos de
D. citri fueron colectados en posición de reposo de las cámaras de
reproducción utilizando una aspiradora bucal. Posteriormente se formaron
grupos de 10 individuos que fueron colocados en recipientes de plástico con
capacidad de 250 mL. Para facilitar la aplicación de las suspensiones de
conidios, los adultos fueron mantenidos en refrigeración y congelación
durante 10 minutos, una vez transcurrido este tiempo los insectos fueron
asperjados directamente con un atomizador manual tipo Nalgene© en 3
ocasiones (únicamente los insectos que sobrevivieron al tratamiento con frío
fueron utilizados para los bioensayos).Una vez asperjados los insectos,
fueron colocados en las cámaras de bioensayo que ya contenían en su
interior plántulas de mandarina Cleopatra (Citrus reshni Hort).
Todas las cámaras de bioensayo fueron incubadas en una cámara
bioclimática a 26±2ºC, 60±5 % H.R y un fotoperiodo de 16:8 h L:O. La
mortalidad de los insectos fue evaluada a los siete días posteriores a la
aplicación de los tratamientos.
60
Se contaron los insectos muertos y se colocaron en cámara húmeda para
favorecer la esporulación. Una vez transcurridos siete días en la cámara
húmeda, fueron contados los insectos micosados. Todos los experimentos
fueron realizados por triplicado y repetidos por lo menos en dos ocasiones
bajo las mismas condiciones.
5.7.2.3 Análisis Estadístico
Las tasas de mortalidad fueron corregidas mediante la fórmula de
Schneider-Orelli (Ciba-Geigy, 1981). Posteriormente los porcentajes de
mortalidad previa transformación angular se sometieron a un análisis de
varianza (ANOVA) (α= 0.01) y una prueba de comparación de medias
mediante la prueba de Schefeé, utilizando el programa estadístico IBM ®
SPSS ® v.19 Inc., NY., EE.UU.
5.7.3 Bioensayo por contacto con adultos de D. citri
Para los bioensayos de inoculación por contacto se seleccionaron las
cepas Asdel 139, A-48, Met, HIB-15, Pfr-612, GHA, Hirsutella citriformis
(INIFAP-Hir-1), Pfr-114 y A-44. Para integrar la arena experimental se
utilizaron plántulas de mandarina Cleopatra (Citrus reshni Hort) sembradas
en vasos de unicel, con el uso del sustrato Sunshine Peat Moos®. Al ras del
vaso se cubrió con papel estraza para evitar que existiera contacto entre el
insecto y el suelo. Posteriormente se colectaron adultos de D. citri de las
cámaras de reproducción con ayuda de una aspiradora bucal y se formaron
grupos de 10 individuos depositados en botes de plástico con capacidad de
250 mL. Los tratamientos se realizaron por contacto directo de los insectos
con esporas de cada una de las cepas.
61
Los insectos adultos en grupos de diez se mantuvieron en
refrigeración y congelación durante 10 minutos; una vez adormecidos los
insectos se pusieron en contacto durante 60 segundos con las conidias
aéreas de cada una de las cepas cultivadas en el medio agar papa dextrosa.
Una vez transcurrido el tiempo de inoculación se colocaron en las
cámaras de bioensayo anteriormente descritas, las cuales adicionalmente se
colocaron en una bolsa plástica con un trozo de papel absorbente
impregnado con agua destilada. Cada tratamiento incluyó cinco repeticiones
por cepa, incluyéndose un testigo absoluto no tratado. Los experimentos se
repitieron en al menos dos ocasiones. Las arenas experimentales se
mantuvieron por 96 horas a una temperatura constante de 26±2ºC, H.R. de
52% y 16:8 h L:O.
5.8 Bioensayos con ninfas de D. citri
Para los bioensayos preliminares con ninfas de D. citri se
seleccionaron al azar los aislados HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, HIB-6,
HIB-7, HIB-8, HIB-9, HIB-12, HIB-13, HIB-14, HIB-26, HIB-28, HIB-30, HIB-
32, HIB-33 y las cepas Pfr-612 y Met.
5.8.1 Bioensayos preliminares con ninfas de D. citri
Para integrar la arena experimental se utilizaron brotes tiernos de
naranjo agrio (Citrus aurantium L.) que fueron infestados con ninfas de D.
citri del segundo al quinto instar, a los cuales se les colocó en el extremo un
algodón previamente humedecido en agua destilada para mantener la
turgencia del brote. Posteriormente cada brote se colocó en una caja Petri de
100 x 15 mm y se asperjó cada uno de los tratamientos realizándose 10
repeticiones por cada uno, incluyéndose un testigo con solución Tween 80 al
62
0.1 % (v/v) y un testigo no tratado. La metodología para la activación de las
cepas, preparación de la suspensión de conidios y viabilidad fue la
anteriormente descrita. Las cajas, una vez cerradas, se colocaron en una
cámara bioclimática con temperatura constante a 26±2ºC, H.R de 60± 5 % y
un fotoperiodo de 16:8 (L:O) durante 72 horas.
5.8.2 Bioensayos por aspersión con ninfas de D. citri
Debido a la ocurrencia de alta mortalidad en los testigos, se planteó
efectuar una serie de modificaciones a la metodología inicialmente descrita.
Las variaciones consistieron en modificar las condiciones de colecta e
incubación. Para integrar la arena experimental se seleccionaron los brotes
en base a las condiciones físicas de los mismos, seleccionando solo aquellos
que presentaran las mejores condiciones (turgencia, coloración y tamaño).
Además solo se utilizaron brotes que estuvieran naturalmente infestados con
ninfas de D. citri del segundo al quinto instar, a los cuales se les colocó en el
extremo un algodón previamente humedecido en agua destilada para
mantener la turgencia del brote. Posteriormente cada brote se colocó en una
caja Petri de 100 x 15 mm y se asperjó con cada una de las suspensiones de
conidios mediante el empleo de un aspersor manual tipo Nalgene©, con el
cual se efectuaron 10 repeticiones por cada uno de los tratamientos,
incluyendo un testigo con solución Tween 80 al 0.1 % (v/v) y un control no
tratado.
Las cajas, una vez cerradas, se colocaron en una bolsa plástica con
un trozo de papel absorbente impregnado con 1 mL de agua bidestilada para
mejorar las condiciones de humedad. Todos los tratamientos fueron
incubados en una cámara bioclimática con temperatura constante a 26±2ºC,
H.R de 60± 5 % y un fotoperiodo de 16:8 h (L:O).
63
La mortalidad de los insectos fue evaluada a los siete días después de
la aplicación, se contaron los insectos muertos y micosados. Todos los
experimentos fueron repetidos en al menos dos ocasiones bajo las mismas
condiciones.
5.8.2.1 Análisis estadístico
Las tasas de mortalidad fueron corregidas mediante la fórmula de
Schneider-Orelli (Ciba-Geigy 1981). Posteriormente los porcentajes de
mortalidad previa transformación angular se sometieron a un análisis de
varianza (ANOVA) (α= 0.01) y una prueba de separación de medias
mediante la prueba de Schefeé, utilizando el programa estadístico IBM®
SPSS® v.19 Inc., NY., EE.UU.
5.8.3 Bioensayos por método sumergido con ninfas de D. citri
Para integrar la arena experimental se seleccionaron brotes tiernos de
naranjo agrio (Citrus aurantium L.) en buenas condiciones (turgencia,
coloración y tamaño) infestados con ninfas de D. citri del segundo al quinto
instar, a los cuales se les colocó en el extremo un algodón previamente
humedecido en agua destilada para mantener la turgencia del brote.
Posteriormente cada brote se sumergió en cada una de las
suspensiones de conidios de las cepas HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5 a
una concentración de 1 x 108 conidios mL-1 durante 30 segundos y luego se
colocaron en una caja Petri de 100 x 15 mm las cuales se cerraron
herméticamente.
64
Se efectuaron 5 repeticiones por cada uno de los tratamientos,
incluyendo un testigo con solución Tween 20 al 0.1 % (v/v) y un control no
tratado. Las cajas, una vez cerradas, se colocaron en una bolsa plástica con
un trozo de papel absorbente impregnado con 1 mL de agua bidestilada para
mejorar las condiciones de humedad. Los experimentos se repitieron en al
menos dos ocasiones.
Todos los tratamientos fueron incubados en una cámara bioclimática
con temperatura constante a 26±2ºC, H.R de 60±5 % y un fotoperiodo de
16:8 h (L: O). La mortalidad de los insectos fue evaluada a los cinco días
después de la aplicación, se contaron los insectos muertos y micosados.
5.9 Actividad enzimática en placa
Se determinó la actividad de las siguientes enzimas proteasa,
quitinasa y lipasa, en placa en tres diferentes medios sólidos: Medio hidrólisis
de caseína, medio quitinasas y medio Tween 20, respectivamente.
5.9.1 Preparación de la suspensión de conidios
Para los ensayos para detectar actividad enzimática se seleccionaron
los aislados HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, HIB-6, HIB-7, HIB-8, HIB-9,
HIB-10, HIB-11, HIB-12, HIB-13, HIB-14, HIB-16, HIB-17, HIB-18, HIB-19,
HIB-21, HIB-22, HIB-24 ,HIB-25, HIB-26, HIB-27, HIB-29, HIB-30, HIB-31,
HIB-32, HIB-33 y las cepas GHA, Met, Pfr-612, Pfr-114, Asdel 139, Hir-1, A-
44 y A-48 los cuales se descongelaron a temperatura ambiente en un
tiempo aproximado de 30-60 minutos; posteriormente fueron inoculados en
forma de estría en medio agar papa dextrosa (PDA) y se dejaron incubar a
28ºC por un tiempo de 14 a 21 días.
65
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, a cada cepa se le
agregaron 10 mL de solución Tween 80 al 0.1 % (v/v) y se ajustó la
concentración a 1 x 106 conidios mL-1.
5.9.2 Composición de los medios de cultivo
5.9.2.1 Medio hidrólisis de caseína
Contiene 0.1 % KH2PO4, 0.05 % KCl, 0.02 % MgSO4.7H2O, 0.01 %
CaCl2.H2O, 1.0 % glucosa, 1.2 % de agar bacteriológico por litro de agua
bidestilada, posteriormente se agregaron 15 % de agar leche descremada
resuspendido en 25 mL de agua bidestillada (adaptado de Mata-Villegas,
2008).
5.9.2.2 Medio quitinasas
Contiene 0.13 % NH4H2PO4, 0.02 % KCl, 0.02 % MgSO4.7H2O, 0.02 %
CaCl2, 1.6 % de agar bacteriológico por 750 mL de agua bidestilada,
posteriormente se agregó 20 % de quitina coloidal resuspendida en 250 mL
de agua bidestilada (adaptado de Chul-Kang et al., 1999 y Mata-Villegas,
2008).
5.9.2.3 Medio tween 20
De la siguiente composición; 3.9 % de PDA, 0.5 % NaCl, 0.01 %
CaCl2, 1.5 % de agar bacteriológico por litro de agua bidestilada,
posteriormente se agregó 10 % de Tween 20 resuspendido en 90 mL de
agua bidestilada (adaptado de Mata-Villegas, 2008).
66
5.9.3 Inoculación e incubación de medios
Para la inoculación de las cajas petri conteniendo cada uno de los
medios para la actividad enzimática se colocó un pequeño círculo de papel
filtro estéril en la parte central de cada una de las cajas ; luego se agregó 1
µl de suspensión fúngica por caja de cada tratamiento y se incubó a 25±2 º
C. Cada tratamiento se realizo por triplicado y todos los experimentos fueron
repetidos en al menos dos ocasiones.
5.9.4 Medición de la actividad enzimática
La medición de la actividad se realizó a las 120 h de incubación.
Utilizando un vernier se midió el diámetro de la colonia y el de los halos en
milímetros formados alrededor del tratamiento.
5.9.5 Interpretación de la actividad enzimática en medios sólidos
Para la interpretación de las reacciones enzimáticas en medios sólidos
(presencia de halos alrededor de la colonia) se utilizó un criterio que
relaciona la velocidad de crecimiento y la actividad enzimática utilizando el
valor del índice enzimático el cual es igual a : diámetro total de la colonia +
halo dividido entre el diámetro de la colonia. Valores de índice enzimático
>1.0 indican actividad enzimática (Mustafa and Kaur, 2010).
5.9.6 Análisis Estadístico
Los resultados se analizaron mediante un ANOVA con comparación
de medias de Tukey (α= 0.05). Los resultados que no se ajustaron al criterio
de normalidad mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov fueron analizados
67
utilizando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Para verificar la
relación de la mortalidad de D. citri con la producción de enzimas se realizó
un análisis de regresión múltiple. Los datos fueron analizados mediante el
programa IBM® SPSS® v.19 Inc. NY., EE.UU.
5.10 Producción de conidios en sustrato sólido
5.10.1 Preparación del precultivo
Para los ensayos se seleccionaron los aislados HIB-2, HIB-3, HIB-4,
HIB-5, HIB-6, Pfr-612 y Pfr-114. Todos los aislados fueron cultivados en agar
papa dextrosa durante 14 a 21 días a 25±2ºC. Después se prepararon
suspensiones de 106 conidias mL-1 con agua destilada estéril para inocular
1000 µL en matraces erlenmeyer bafleados de 250 mL conteniendo 100 mL
de caldo dextrosa Sabouraud. Se incubaron por 72 h, a 28°C y 300 rpm en
un incubador shaker rotatorio (adaptado de Jackson y Payne, 2007). Todos
los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos en dos
ocasiones.
5.10.2 Preparación e inoculación del sustrato
Se utilizaron bolsas de plástico de alta densidad de 1 kg. En cada
bolsa se colocaron 50 g de arroz (Oryza sativa L.) y 60% de agua bidestilada,
se esterilizaron a 121 °C, 15 libras de presión por 15 minutos. Todas las
bolsas se inocularon con 1000 µL de cada una de las suspensiones del
precultivo tratando de esparcirlas de manera uniforme sobre el sustrato y
selladas herméticamente.
Todas las bolsas se incubaron a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) por
14 días expuestos a la luz blanca de las lámparas del laboratorio.
68
Las bolsas fueron agitadas cada tercer día para esparcir las esporas
homogéneamente sobre el sustrato. Al final del tiempo de crecimiento se
determinó la concentración de conidias y el porcentaje de viabilidad.Todos
los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos en dos
ocasiones (adaptado de Sandoval-Coronado et al., 2010).
5.10.2.1 Medición de la productividad del sustrato
A los 14 días de incubación se determinó la concentración de conidias
por gramo de arroz de cada una de las bolsas, se realizaron las diluciones
apropiadas (diluciones 10-6 - 10-9) en solución Tween 80 al 0.1% (v/v) y se
midió microscópicamente utilizando una cámara de Neubauer.
5.10.2.2 Pruebas de sobrevivencia
Se determinó de acuerdo a la viabilidad de los conidios. Se tomó 1 g
de arroz y se adicionó a 50 mL de caldo papa dextrosa. Este cultivo se
mantuvo en agitación rotatoria durante 6 h a 300 rpm. Al finalizar el tiempo
de incubación se realizaron frescos directos de los cultivos y se procedió a
contar 100 esporas (germinadas y no germinadas), y así determinar la
proporción de esporas viables. El criterio para tomar en cuenta una espora
germinada es cuando se forma un tubo germinativo, tan largo como la mitad
del diámetro de la espora. La viabilidad se expresó en porciento de
germinación.
5.10.3 Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como valores promedios ± DE. Para
verificar la normalidad de los datos se realizó la prueba de Kolmogorov-
Smirnov, previa conversión de los resultados a su logaritmo (log10) para
69
introducirlos en el programa estadístico, y en caso de cumplir con este
parámetro se realizó un análisis de varianza (ANOVA) y una prueba de
Tukey (p≤0.05) para las medias. Los datos fueron analizados mediante el
programa IBM® SPSS ® v.19 Inc., NY., EE.UU.
5.11 Ensayos con insectos benéficos
5.11.1 Cría de insectos depredadores
La cría fue proporcionada por el Laboratorio de Investigación en
Control Biológico del Campo Experimental General Terán, del Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), con
sede en General Terán, Nuevo León, México (Latitud Norte 24o 44’ 30.5”;
Longitud Oeste 24o 44’ 30.5”; 662 msnm). Para los bioensayos se utilizaron
los depredadores Ceraeochrysa valida (Banks) y Eremochrysa punctinervis
(MacLachlan) (Neuroptera: Chrysopidae) e Hippodamia convergens
(Coleoptera: Coccinellidae). Especímenes de las diferentes especies fueron
reproducidos bajo condiciones controladas en el laboratorio.
Los adultos de Hippodamia convergens fueron alimentados con una dieta a
base de azúcar estándar, levadura de cerveza, polen, alga spirulina, ácido
sórbico, miel de abeja, agua y huevo congelado de Sitotroga cerealella
Olivier, se incluyó además una esponja de 1 cm3 saturada con miel de abeja
diluida en agua al 80%.
Los adultos de C. valida y E. punctinervis fueron alimentados con una
dieta a base de proteína y carbohidratos (mezcla volumétrica en partes
iguales de: levadura de cerveza, leche en polvo, azúcar y miel); el agua fue
proporcionada en un vial. Los huevos depositados por las tres especies
fueron incubados a 28±1°C con un fotoperíodo de 12:12 h L: O.
70
5.11.2 Preparación de la suspensión de conidios
Para los bioensayos con insectos benéficos se seleccionaron las
cepas que obtuvieron los mejores porcentajes de mortalidad en los ensayos
sobre D. citri (HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, Pfr-612 y Pfr-114), los cuales se
descongelaron a temperatura ambiente en un tiempo aproximado de 30-60
minutos; posteriormente fueron inoculados en forma de estría en medio agar
papa dextrosa ( PDA) y se dejaron incubar a una temperatura de 28ºC por
un tiempo de 14 a 21 días. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se
ajustó la concentración a 1 x 108 conidios mL-1. Además se realizaron
pruebas de viabilidad de acuerdo a la metodología descrita anteriormente.
5.11.3 Bioensayos con Hippodamia convergens
Para evaluar la patogenicidad de las cepas de hongos entomopatógenos
sobre adultos de D. citri se utilizaron adultos de H. convergens, los cuales
antes de ser tratados se colocaron en refrigeración durante 5 - 10 minutos
para facilitar la aplicación de las suspensiones de conidios de hongos
entomopatógenos. Una vez adormecidos por la acción del frío, los insectos
fueron asperjados con suspensiones de conidios a una concentración de 1 x
108 de cada una de los aislados y/o cepas evaluados.
Se utilizaron cinco insectos por tratamiento con cuatro repeticiones por
cada uno, además de dos testigos o controles, uno con Tween 80 al 0.1 %
(v/v) y uno sin tratar. Todos los tratamientos fueron incubados a temperatura
constante de 28± 1ºC, y un fotoperiodo de 12:12 h L: O. La mortalidad de los
insectos fue evaluada a los 26 días después de la aplicación.
71
5.11.4 Bioensayos con Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis
Para evaluar la patogenicidad de las cepas de hongos
entomopatógenos sobre larvas de C. valida de primer y segundo instar y de
E. punctinervis de tercer instar, los insectos fueron asperjados con
suspensiones de conidios a una concentración de 1 x 108 de cada una de
los aislados y/o cepas evaluados y se colocaron por separado en cajas petri
de 10 x 15 mm.
Se utilizaron catorce insectos por tratamiento, además de dos testigos,
uno con Tween 80 al 0.1 % (v/v) y uno sin tratar. Todos los tratamientos
fueron incubados a temperatura constante de 28±1ºC, y un fotoperiodo de
12:12 h (L: O). La mortalidad de los insectos fue evaluada durante 28 días.
72
6. RESULTADOS
6.1 Evaluación de la producción de conidios
6.1.1 Producción de conidios por efecto del medio de cultivo
La producción promedio de conidios obtenida entre los diferentes
medios de cultivo fue de 6.7 x 106 a 5.8 x 109 conidios mL-1, siendo el mínimo
el obtenido para el aislado HIB-3 en el medio A (PDA) y el máximo para el
aislado HIB-4 en el medio D (ADY). Sin embargo, de acuerdo a los
resultados del ANOVA no existió diferencia significativa (F = 0.817; p=
0.517) entre los cinco medios evaluados para la producción de conidios por
mililitro entre los diferentes aislados y cepas evaluados (Tabla IV).
6.1.2 Producción de conidios entre los aislados y cepas
La producción promedio de conidios obtenida entre los diferentes
aislados fue de 1.85 x 107 a 4.85 x 109 conidios mL-1, reportándose el
mínimo para el aislado HIB-3 y el máximo para el aislado HIB-4. El análisis
estadístico para la producción de conidios entre las diferentes cepas mostró
alta diferencia significativa entre ellas (F = 8.727; p ≤ 0.0001); por lo tanto se
realizó una prueba de comparación de medias de Scheffé (α= 0.05)
reportándose que el aislado HIB-4 presentó la mayor producción con 4.85 x
109 conidios mL-1, mientras que los aislados HIB-2, HIB-3 y HIB-29
presentaron la más baja producción de conidios con 4.70 x 107, 1.85 x 107 y
1.95 x 107 (Tabla V).
73
6.2 Evaluación del crecimiento micelial
6.2.1 Crecimiento micelial por efecto del medio de cultivo
El crecimiento micelial obtenido en los diferentes medios de cultivo fue
de 3.13 a 8.50 centímetros, reportándose el mínimo para el aislado HIB-18
en el medio B (PDA suplementado con 0.5 % de peptona de caseína) y el
máximo para la cepa Met en los medios D y E (ADY y ADS). Sin embargo, de
acuerdo a los resultados del ANOVA no existió diferencia significativa (F =
1.087; p = 0.366) entre los cinco medios evaluados para el crecimiento
micelial entre los diferentes aislados (Tabla VI).
6.2.2 Crecimiento micelial entre los aislados y cepas
El crecimiento micelial promedio entre las diferentes cepas fue de 3.62
a 8.06 cm, reportándose el mínimo para el aislado HIB-18 y el máximo para
la cepa Met. De acuerdo a los resultados del análisis estadístico el
crecimiento micelial entre los diferentes aislados mostró alta diferencia
significativa entre ellos (F = 24,498; p ≤ 0,0001) por lo tanto se realizó una
prueba de comparación de medias de Scheffé (α= 0.05) reportándose que la
cepa Met presentó el más alto crecimiento micelial con 8.06 cm, mientras
que el aislado HIB-18 el más bajo con 3.62 cm (Tabla VII).
74
Tabla IV. Producción promedio de conidios por efecto de los diferentes medios de cultivo a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2° C).
Aislados y/o cepas
Medios de cultivo ( conidios mL-1)
A B C D E
HIB-1 2.6 x 108 2.7 x 108 2.1 x 108 3.3 x 108 5.8 x 108 HIB-2 3 x 107 2.8 x 107 5.9 x 107 1.8 x 108 2.8 x 107 HIB-3 6.7 x 106 8.8 x 106 8.8 x 106 5.0 x 108 8.2 x 106 HIB-4 4.1 x 109 8.6 x 109 3.2 x 109 9.3 x 109 2.8 x 109 HIB-5 3.2 x 108 3.2 x 107 3.4 x 108 3.4 x 108 3.5 x 108 HIB-6 1.6 x 109 2.0 x 109 4.8 x 109 5.8 x 109 5.2 x 109 HIB-7 2.0 x 108 2.7 x 108 2.0 x 107 2.0 x 108 2.0 x 108 HIB-8 2.2 x 107 3.5 x 107 2.4 x 107 1.5 x 108 2.3 x 108 HIB-9 2.3 x 108 2.2 x 108 4.5 x 108 4.6 x 108 6.1 x 108 HIB-10 3.4 x 108 3.3 x 108 3.6 x 108 3.9 x 108 2.9 x 109 HIB-11 1.2 x 109 4.2 x 109 1.2 x 109 1.1 x 108 1.6 x 108 HIB-12 2.6 x 109 2.1 x 109 3.2 x 109 1.4 x 108 1.2 x 108 HIB-13 4.4 x 107 3.0 x 107 5.5 x 107 2.5 x 108 1.3 x 108 HIB-14 6.0 x 108 4.9 x 107 6.5 x 107 2.8 x 108 2.3 x 108 HIB-15 3.2 x 108 4.2 x 107 3.2 x 108 2.8 x 108 1.8 x 109 HIB-16 6.5 x 107 4.4 x 107 3.7 x 107 3.3 x 108 4.0 x 107 HIB-17 3.1 x 108 5.8 x 107 6.0 x 108 3.9 x 108 3.9 x 108 HIB-18 4.5 x 107 5.7 x 107 5.1 x 108 5.4 x 107 2.6 x 108 HIB-20 6.8 x 108 6.3 x 108 4.0 x 108 2.9 x 108 4.5 x 108 HIB-21 2.5 x 108 1.4 x 108 2.9 x 108 3.9 x 108 1.7 x 108 HIB-26 1.8 x 107 6.8 x 107 2.7 x 108 5.3 x 107 2.1 x 108 HIB-29 1.8 x 107 1.7 x 107 2.9 x 108 2.2 x 107 1.5 x 107 HIB-30 2.4 x 107 1.0 x 107 2.8 x 108 7.7 x 107 2.0 x 108 HIB-32 2.3 x 108 3.5 x 108 4.0 x 108 1.4 x 108 4.1 x 108 HIB-33 5.0 x 107 6.3 x 107 3.3 x 107 2.9 x 107 2.6 x 108 GHA 2.6 x 108 2.0 x 108 3.4 x 108 5.5 x 108 1.6 x 108 Pfr-612 1.05x108 1.0x108 1.82x108 1.66x108 2.0x108
Met 6.4 x 108 3.4 x 108 1.8 x 108 1.8 x 108 1.3 x 108 Promedio ± DE 1.65 x
108 ±.72 1.42 x
108±.76 2.05 x
108±.68 2.80 x
108±.59 2.35 x
108±.63
75
Tabla V. Producción promedio de conidios por aislado y/o cepa a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2°C).
Aislados y/o cepas *Conidios mL-1
HIB-1 3.10 x 108 abc HIB-2 4.70 x 107 a HIB-3 1.85 x 107 a HIB-4 4.85 x 109 c HIB-5 2.10 x 108 abc HIB-6 3.45 x 109 bc HIB-7 1.38 x 108 abc HIB-8 5.77 x 107 ab HIB-9 3.70 x 108 abc HIB-10 8.70 x 108 abc HIB-11 6.40 x 108 abc HIB-12 7.80 x 108 abc HIB-13 7.55 x 107 ab HIB-14 1.65 x 108 abc HIB-15 2.89 x 108 abc HIB-16 6.70 x 107 ab HIB-17 4.40 x 108 abc HIB-18 1.14 x 108 abc HIB-20 4.68 x 108 abc HIB-21 2.30 x 108 abc HIB-26 8.20 x 107 abc HIB-29 1.95 x 107 a HIB-30 1.00 x 108 abc HIB-32 2.85 x 108 abc HIB-33 6.00 x 107 ab GHA 2.80 x 108 abc Pfr-612 1.45 x 108 abc Met 2.50 x 108 abc Promedio± DE 2.00 x 108 ± .56 *Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Scheffé (p ≤ 0.05).
76
Tabla VI. Evaluación del crecimiento micelial promedio por efecto de los diferentes medios de cultivo a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2 °C).
Aislados y/o cepas
Medio de cultivo (cm)
A B C D E
HIB-1 4.21 3.40 3.86 3.85 4.08
HIB-2 3.76 4.51 4.15 3.68 3.85 HIB-3 4.78 4.21 4.13 4.21 3.66 HIB-4 4.53 5.03 4.11 5.76 4.83 HIB-5 4.21 4.25 4.23 3.56 4.26 HIB-6 4.25 5.33 5.08 6.45 4.83 HIB-7 4.76 4.48 3.88 4.18 4.76 HIB-8 5.90 5.36 5.01 6.11 5.41 HIB-9 7.33 7.56 7.33 7.76 7.48
HIB-10 3.48 4.65 5.68 5.10 5.41 HIB-11 5.78 5.10 5.71 5.91 5.75 HIB-12 5.70 5.75 5.83 6.73 6.20 HIB-13 4.18 5.35 5.28 5.36 5.25 HIB-14 4.66 4.16 4.86 5.01 4.11 HIB-15 5.21 6.28 6.46 5.71 5.48 HIB-16 4.28 4.25 4.75 4.53 4.98 HIB-17 5.08 5.03 4.90 4.31 5.03 HIB-18 3.18 3.13 4.11 3.43 4.23 HIB-20 7.36 7.26 8.03 7.46 6.81 HIB-21 7.48 7.00 7.18 7.91 7.66 HIB-26 6.20 7.28 7.00 6.53 6.63 HIB-29 6.16 6.46 7.13 7.76 7.66 HIB-30 4.93 6.23 5.78 7.06 7.73 HIB-32 5.81 6.31 6.66 7.21 6.98 HIB-33 6.08 7.23 7.55 7.83 7.83 GHA 4.51 5.70 5.75 6.71 5.53
Pfr-612 4.08 5.73 7.08 6.75 5.95 Met 7.81 7.70 7.80 8.50 8.50 Promedio ±
DE 5.20±1.24 5.52±1.26 5.69±1.32 5.90±1.52 5.74±1.38
77
Tabla VII. Evaluación de crecimiento micelial promedio por aislado y/o cepa a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio (25 ± 2 °C).
Aislados y/o cepas
Crecimiento micelial (cm)
HIB-1 3.88 ab HIB-2 3.99 abc HIB-3 4.20 abc
HIB-4 4.85 abcde
HIB-5 4.10 abc
HIB-6 5.19 abcdefg HIB-7 4.41 abcd
HIB-8 5.56 abcdefg
HIB-9 7.49 gh
HIB-10 4.86 abcde
HIB-11 5.65 abcdefg HIB-12 6.04 bcdefgh
HIB-13 5.08 abcdef
HIB-14 4.56 abcd
HIB-15 5.83 abcdefgh HIB-16 4.56 abcd
HIB-17 4.87 abcde
HIB-18 3.62 a
HIB-20 7.38 fgh
HIB-21 7.45 fgh HIB-26 6.71 defgh
HIB-29 7.03 efgh
HIB-30 6.35 cdefgh
HIB-32 6.59 defgh
HIB-33 7.30 fgh GHA 5.64 abcdefg
Pfr-612 5.92 abcdefgh
Met 8.06 h
Promedio± DE
5.61±1.2
*Tratamientos con diferente letra son significativamente
diferentes de acuerdo a la prueba de Scheffé (p ≤ 0.05).
78
Debido a que no existió diferencia significativa entre los medios
evaluados para la producción de conidios entre los hongos entomopatógenos
utilizados se seleccionó el agar papa dextrosa como medio base para la
obtención de inoculo para todos los experimentos.
6.3 Viabilidad
Para tomar una espora como germinada se debe considerar cuando
se forma un tubo germinativo, tan largo como la mitad del diámetro de la
espora. Con respecto a este parámetro la viabilidad de los conidios utilizados
para los bioensayos con ninfas y adultos de D. citri fue de 91.66± 6.74 %,
mientras que para los ensayos con insectos benéficos (H. convergens, C.
valida y E. punctinervis) la viabilidad fue de 95 ± 5 %.
6.4 Bioensayos con adultos de Diaphorina citri
6.4.1 Bioensayos preliminares con adultos de D. citri
En los ensayos preliminares, los tratamientos evaluados causaron una
mortalidad promedio de D. citri en el rango de 12-88%.
6.4.1.1 Aspersión directa a la plántula
Para el método de aspersión directa a la plántula el valor mínimo de
mortalidad se registró para el aislado HIB-12 de M. anisopliae (20 %) y el
máximo para el aislado HIB-19 de I. fumosorosea (88 %) (Figura 5).
79
6.4.1.2 Aspersión directa a los insectos
Para el método de asperjado directo al insecto el valor mínimo se
registró para el aislado HIB-13 de B. bassiana (12 %) y los máximos para los
aislados HIB-1 y HIB-4 de B. bassiana (75 %) (Figura 6). Sin embargo para
los métodos anteriormente mencionados, los controles utilizados (control
Tween 80 y absoluto o no tratado) registraron mortalidades superiores al 50
y 60 %, respectivamente (Figuras 5 y 6).
Figura 5. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a la plántula (HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-6, HIB-7, HIB-8, HIB-10, HIB-11, HIB-12, HIB-13, HIB-14, GHA, HIB-19, HIB-20, HIB-21, HIB-22, HIB-23 y Pfr-612) bajo condiciones de laboratorio, 24ºC; 52% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar.
80
Figura 6. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I .fumosorosea mediante el método de aspersión directa a los insectos (HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-6, HIB-7, HIB-8, HIB-10, HIB-11, HIB-12, HIB-13, HIB-14, GHA, HIB-19, HIB-20, HIB-21, HIB-22, HIB-23 y Pfr-612) bajo condiciones de laboratorio, 24ºC; 52% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar.
Debido a estos niveles de alta mortalidad en los controles o testigos
obtenidos en los experimentos preliminares para la evaluación de los
aislamientos nativos y cepas de colección sobre adultos de D. citri fue
necesario realizar modificaciones y ajustes en la metodología empleada en
los experimentos preliminares.
6.4.2 Ensayos de supervivencia con adultos de D. citri
En el ensayo de supervivencia en ausencia de los hongos
entomopatógenos, la mortalidad mínima fue de 20% y la máxima de 37%
(Figura 7).
81
Figura 7. Porcentaje de supervivencia de D. citri en arenas experimentales sin manipulación del insecto, bajo condiciones de laboratorio, 26±1ºC; 60±5% H.R; 16:8 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar.
6.4.2.1 Aspersión directa a la plántula
Las tasas de mortalidad de adultos de D. citri fueron de 33.21 a 62.02
%. Con base en el análisis estadístico se determinó que existió alta
diferencia significativa entre los tratamientos (F = 10.364; p ≤ 0.0001) y la
prueba de comparación de medias de Scheffé determinó que el aislado HIB-
19 de I. fumosorosea fue el más efectivo en inducir la mortalidad sobre D.
citri mediante el método de aspersión directa a la plántula (Figura 8),
mientras que el aislado HIB-31 causó la mortalidad más baja (Tabla VIII).
82
6.4.2.2 Aspersión directa a los insectos
Para este método las tasas de mortalidad de D. citri fueron de 34.44 a
60.66 % y con base en el análisis estadístico se determinó que existió alta
diferencia significativa entre los tratamientos (F = 31.721; p ≤ 0.0001) y la
prueba de comparación de medias de Scheffé determinó que los aislados
HIB-24 y HIB-32 de B. bassiana e I. fumosorosea, respectivamente, fueron
los más efectivos en inducir la mortalidad sobre D. citri mediante el método
de asperjado directo al insecto (Figura 8), mientras que el aislado HIB-22 de
I. fumosorosea presentó la mortalidad más baja. Las mortalidades promedio
registradas para ambos métodos fueron muy similares (Tabla VIII).
Figura 8. Mortalidad de D. citri por dos diferentes métodos de inoculación. A) Adultos de D. citri micosados por el aislado HIB-19 de I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a la plántula y B) Adultos de D. citri micosados por el aislado HIB-32 de I. fumosorosea mediante el método de aspersión directa a los insectos.
83
Tabla VIII. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de hongos entomopatógenos por dos métodos diferentes de inoculación bajo condiciones de laboratorio (26±2ºC; 60±5 % H.R; 16:8 h L: O).
Aislados y/o cepas
*Métodos de asperjado directo
plántula insectos
HIB-1 37.46 abc 51.35 cdefg
HIB-2 40.97 abc 43.28 abcde
HIB-3 49.02 abc 47.29 abcdefg
HIB-4 44.42 abc 51.35 cdefg
HIB-6 43.28 abc 49.02 abcdefg
HIB-7 38.64 abc 47.86 abcdefg
HIB-8 41.55 abc 42.70 abcde
HIB-10 49.60 abc 40.97 abcd
HIB-11 37.46 abc 35.66 ab
HIB-14 34.44 ab 35.06 ab
HIB-15 49.07 abc 48.45 abcdefg
HIB-17 50.76 abc 43.28 abcde
HIB-19 62.02 c 43.28 abcde
HIB-20 46.71 abc 45.00 abcdef
HIB-21 38.05 abc 43.28 abcde
HIB-22 58.05 abc 34.44 a
HIB-23 44.69 abc 40.58 abcd
HIB-24 51.94 abc 60.66 g
HIB-25 41.55 abc 46.14 abcdefg
HIB-26 56.78 abc 56.78 efg
HIB-27 45.00 abc 42.70 abcde
HIB-28 42.70 abc 50.76 cdefg
HIB-29 50.18 abc 49.60 bcdefg
HIB-30 48.47 abc 45.28 abcdef
HIB-31 33.21 a 36.86 abc
HIB-32 54.33 abc 60.66 g
HIB-33 60.66 bc 54.33 defg
GHA 46.16 abc 45.86 abcdef
Pfr-612 52.53 abc 58.05 fg
Met 45.00 abc 49.02 abcdefg
Promedio ± DE 46.49 ± 7.43 46.65 ± 7.00
* Mortalidad expresada en porcentaje (%) Tween 80 control. Promedio ± DE: 22.64 ± 2.85.
Control no tratado.Promedio ± DE: 23.55 ± 2.64.
Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Scheffé (p ≤ 0.01).
84
6.4.3 Bioensayo por contacto con adultos de D. citri
En el bioensayo por contacto con adultos de D. citri, los tratamientos
evaluados causaron una mortalidad promedio en un rango de 24-100%, con
el valor mínimo registrado para la cepa Met de M. anisopliae y el máximo
para la cepa Pfr-114 de I. fumosorosea. Respecto a las cepas y/o aislados
de B. bassiana, la cepa GHA mostró un índice de mortalidad del 44 %,
mientras que la cepa A-48 obtuvo un 89 %. Para la cepa Pfr-612 se reportó
una mortalidad del 90 %, mientras que para la cepa Hir-1 la mortalidad
obtenida fue del 50 % (Figura 9).
Figura 9. Mortalidad de D. citri por aislados y/o cepas de B. bassiana (A-44, A-48, Asdel 139, HIB-15, GHA), I. fumosorosea (Pfr-612, Pfr-114), M. anisopliae (Met) e H. citriformis (INIFAP-Hir 1) bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC; 52% H.R; 16 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar.
85
6.5 Bioensayos con ninfas de D. citri
6.5.1 Bioensayos preliminares con ninfas de D. citri
En los ensayos preliminares, los tratamientos evaluados causaron una
mortalidad promedio de D. citri en el rango de 39-99%, con el valor mínimo
registrado para el aislado HIB-26 de I. fumosorosea y el máximo para la cepa
Pfr-612 de I. fumosorosea, sin embargo, los controles utilizados (control
Tween 80 y absoluto o no tratado) registraron mortalidades superiores al 48
y 54 %, respectivamente (Figura 10).
Figura 10. Mortalidad de ninfas de D. citri causada por aislados y/o cepas de B. bassiana, M. anisopliae e I. fumosorosea (HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, HIB-6, HIB-7, HIB-8, HIB-9, HIB-12, HIB-13, HIB-14, HIB-26, HIB-28, HIB-30, HIB-32, HIB-33, Met y Pfr-612 ) bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC;60±5% H.R;16:8 h L:O. Líneas en las barras indican el error estándar.
86
Debido a estos niveles de alta mortalidad en los controles o testigos
obtenidos en los experimentos preliminares para la evaluación de los
aislamientos nativos y cepas de colección sobre ninfas de D. citri fue
necesario realizar modificaciones y ajustes en la metodología empleada en
los experimentos preliminares.
6.5.2 Bioensayos por aspersión con ninfas de Diaphorina citri
Los resultados muestran que la mortalidad varió de 42.70 a 84.26 % y
de acuerdo al análisis estadístico existió alta diferencia significativa entre los
tratamientos (p ≤ 0.0001). La cepa Pfr-612 de I. fumosorosea mostró el
mayor porcentaje de mortalidad, mientras que las cepas HIB-5 y HIB-25
presentaron el porcentaje más bajo. Respecto a la capacidad de las cepas
para inducir micosis, los resultados indican que la cepa HIB-14 de B.
bassiana fue la que logró inducir micosis con mayor efectividad sobre las
ninfas de D. citri (Tabla IX).
6.5.3 Bioensayos por método sumergido con ninfas de D. citri
En bioensayo con ninfas por sumergido, la mortalidad promedio
producida por los diferentes tratamientos evaluados se presentó en el rango
de 64 - 100%; los valores mínimos se registraron en los testigos (control=
13%; Tween 20= 13%); los valores máximos de mortalidad (100%) fueron
causados por los aislados HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5 (Figuras 11 y 12).
87
Tabla IX. Efecto de conidios de aislados nativos y cepas de colección de hongos entomopatógenos sobre ninfas de Diaphorina citri bajo condiciones de laboratorio (26±2ºC, 60±5 % H.R., 16:8 h L: O.)
Aislados y/o cepas Mortalidad * Micosis*
HIB-1 48.44 ab 19.36 bcde HIB-2 81.86 hi 39.81f HIB-3 71.56 fgh 38.05 f HIB-4 51.35 abc 12.92 b HIB-5 43.03 a 15.34 bcd HIB-6 67.21 efg 25.10 cde HIB-7 60.66 cdef 18.43 bcde HIB-8 56.16 bcd 19.36 bcde HIB-9 64.89 defg 21.97 bcde HIB-12 49.60 ab 14.57 bc HIB-13 64.15 defg 46.14 f HIB-14 70.63 fg 56.78 g HIB-23 62.02 cdef 25.84 de HIB-24 49.02 ab 21.13 bcde HIB-25 42.70 a 16.42 bcd HIB-28 56.78 bcde 14.17 b Pfr-612 84.26 i 25.10 cde
GHA 46.01 ab 27.40 e Met 74.65 ghi 0.00 a
Media±DE 60.26±12.51 24.09±13.05 * Mortalidad y micosis expresada en porcentaje (%) Control Tween 80. Promedio ± DE: 24.05 ± 2.17. Control no tratado. Promedio ± DE: 22.48 ± 3.22. Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Scheffé (p ≤ 0.01).
88
Figura 11. Mortalidad de ninfas de D. citri causada por aislados de B. bassiana (HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) bajo condiciones de laboratorio, 26±2ºC; 60±5% H.R; 16:8 h L: O.
Figura 12. Ninfas de D. citri micosadas por B. bassiana. A) HIB-2, B) HIB-3, C) HIB-4 y D) HIB-5 mediante el método de sumergido.
89
6.6 Actividad enzimática en placa
Para la actividad proteasa y lipasa los resultados no siguieron una
curva normal (Z = 2.24, p = 0.000) y (Z = 3.95, p = 0.000) respectivamente,
por lo tanto se realizó una prueba de Kruskal-Wallis. De acuerdo con los
resultados de esta prueba para la actividad proteasa y lipasa por lo menos
uno de los aislados es diferente respecto a su índice enzimático (proteasa:
χ2 = 72.25, p = 0.000; lipasa: χ2 = 56.79, p = 0.015). Respecto a la actividad
quitinasa los resultados se ajustaron a una curva normal (Z = 0.90, p = 0.40)
y de acuerdo con los resultados del análisis estadístico existió alta diferencia
significativa en la actividad quitinolítica de los aislados y cepas evaluadas (F
= 3.04; p ≤ 0.0001). La actividad quitinasa se registró en un rango de 1.10-
1.50; y de acuerdo con la prueba de comparación de medias de Tukey
(α=0.05) el aislado HIB-19 mostró el mayor índice enzimático, seguido por el
aislado HIB-1 (Tabla X).
6.6.1 Relación de la mortalidad de D. citri con la actividad enzimática
Para verificar la relación de la mortalidad de los adultos y ninfas de D.
citri con la producción de enzimas se realizó un análisis de regresión lineal
múltiple.
Para el método de aspersión directa a plántula el coeficiente de
correlación (R) fue igual a 0.198, mientras que el coeficiente de
determinación (R2) fue de .039, lo que nos indica solo un 3.9 % de asociación
dada en la siguiente ecuación:
Mortalidad = 29.90 + 9.69 (lipasa) – 9.24 (quitinasa) + 17.13 (proteasa)
Con una significancia de la ecuación de F= 0.312; p = 0.817. Estos
resultados indican que ninguna de las enzimas evaluadas estima
90
significativamente la mortalidad de D. citri por el método de aspersión directa
a la plántula.
Para el método de aspersión directa al insecto el coeficiente de
correlación (R) fue igual a 0.348, mientras que el coeficiente de
determinación (R2) fue de .121, lo que nos indica un 12.1 % de asociación
dada en la siguiente ecuación:
Mortalidad = 113.97 + 1.22 (lipasa) – 17.61 (quitinasa) - 43.77 (proteasa)
Con una significancia de la ecuación de F= 1.053; p = 0.388. Estos
resultados indican que ninguna de las enzimas evaluadas estima
significativamente la mortalidad de D. citri por el método de aspersión directa
al insecto.
Para el bioensayo por contacto con adultos el coeficiente de
correlación (R) fue igual a 0.645, mientras que el coeficiente de
determinación (R2) fue de .416, lo que nos indica un 41.6 % de asociación
dada en la siguiente ecuación:
Mortalidad = -196.54 + 61.09 (lipasa) + 60.55 (proteasa) + 108.04 (quitinasa)
Con una significancia de la ecuación de F= 0.712; p = 0.607. Estos
resultados indican que ninguna de las enzimas evaluadas estima
significativamente la mortalidad de D. citri para el bioensayo por contacto con
adultos.
Para los bioensayos con ninfas de D. citri mediante el método de
aspersion el coeficiente de correlación (R) fue igual a 0.717, mientras que el
coeficiente de determinación (R2) fue de .514, lo que nos indica un 51.4 % de
asociación dada en la siguiente ecuación:
91
Mortalidad = 325.47 – 53.74 (lipasa) + 37.76 (quitinasa) – 245.94 (proteasa)
Con una significancia de la ecuación de F= 4.590; p = 0.021. Estos
resultados indican que ninguna de las enzimas evaluadas estima
significativamente la mortalidad de D. citri por el método de aspersión directa
al insecto.
Mientras que para el método de sumergido el coeficiente de
correlación (R) fue igual a 0.915, mientras que el coeficiente de
determinación (R2) fue de .838, lo que nos indica un 83.8 % de asociación
dada en la siguiente ecuación:
Mortalidad = 780.09 – 81.45 (lipasa) – 548.74 (proteasa) – 23.60 (quitinasa)
Con una significancia de la ecuación de F= 1.719; p = 0.499. Estos
resultados indican que ninguna de las enzimas evaluadas estima
significativamente la mortalidad de D. citri por el método de sumergido de
ninfas.
92
Tabla X. Índice enzimático entre los diferentes aislados y cepas de hongos entomopatógenos a las 120 h de incubación bajo condiciones de laboratorio ,25 ± 2 º C
Aislados y/o cepas
Enzimas
Lipasa Proteasa Quitinasa*
HIB-1 1.24 1.05 1.45 bc HIB-2 1.00 1.02 1.41 bc HIB-3 1.20 1.02 1.36 bc HIB-4 1.25 1.00 1.12 ab HIB-5 1.00 1.04 1.35 bc HIB-6 1.00 1.05 1.30 abc HIB-7 1.13 1.02 1.38 bc HIB-8 1.09 1.05 1.33 abc HIB-9 1.00 1.06 1.34 abc HIB-10 1.56 1.04 1.29 abc HIB-11 1.00 1.03 1.26 abc HIB-12 1.00 1.03 1.20 abc HIB-13 1.12 1.04 1.36 bc HIB-14 1.04 1.04 1.33 abc HIB-15 1.13 1.03 1.33 abc HIB-16 1.37 1.02 1.21 abc HIB-17 1.13 1.06 1.26 abc HIB-18 1.00 1.05 1.43 bc HIB-19 1.23 1.01 1.50 c HIB-21 1.00 1.04 1.31 abc HIB-22 1.00 1.14 1.20 abc HIB-24 1.36 1.02 1.18 abc HIB-25 1.14 1.05 1.16 abc HIB-26 1.00 1.13 1.37 bc HIB-27 1.06 1.08 1.28 abc HIB-29 1.14 1.01 1.34 abc HIB-30 1.11 1.00 1.20 abc HIB-31 1.00 1.14 1.25 abc HIB-32 1.00 1.05 1.16 abc HIB-33 1.00 1.07 1.24 abc GHA 1.06 1.13 1.27 abc Met 1.02 1.01 1.10 ab Pfr-612 1.00 1.00 1.38 bc Pfr-114 1.00 1.14 1.38 bc
Asdel 139 1.23 1.03 1.32 abc
Hir-1 1.00 1.14 1.00 a
A-44 1.22 1.00 1.41bc
A-48 1.22 1.02 1.15 ab
Promedio ± DE 1.10 ± 0.19 1.04 ± 0.05 1.28 ± 0.13
*Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey (p ≤ 0.05).
93
Figura 13. Actividad enzimática en placa. A) Actividad lipolítica en medio Tween 20 del aislado HIB-10 de B. bassiana, B y C) Actividad quitinolítica en medio quitinasas de los aislados HIB-1 y HIB-19 de B. bassiana e I. fumosorosea y D) Actividad proteolítica en medio hidrólisis de caseína del aislado HIB-6 de B. bassiana. Nótese el halo de inhibición característico en medios de cultivo sólido.
6.7 Producción de conidios en sustrato sólido
La producción de conidios en grano de arroz (Oryza sativa L.) se
presentó entre 108 a 109 a conidios g-1 y se encontraron diferencias estadísti-
camente significativas (p≤0.05) entre los aislados de B. bassiana y las cepas
de I. fumosorosea. El valor mínimo de 4.80 x 108 conidios g-1 se registró para
el aislado HIB-3 y el máximo de 1.77x109 conidios g-1 para el aislado HIB-4;
los aislados HIB-2 y HIB-5 presentaron una producción promedio de 1.00 x
109, y la cepa Pfr-612 de I. fumosorosea 5.02 x 108 conidios g-1 (Figura 14).
94
Figura 14. Producción de conidios entre los diferentes aislados de B.bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) e I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114) a los 14 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 25±2ºC. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencia significativa según la prueba de Scheffé (p≤ 0.05). Promedio ± DE= (9.50 x 108±0.24 conidios g-1 de arroz). Líneas en las barras indican el error estándar.
6.7.1 Pruebas de sobrevivencia
En las pruebas de sobrevivencia los valores de germinación (Figura
15) en promedio fueron superiores al 90 % a las cuatro semanas de
almacenamiento (Tabla XI).
95
Tabla XI. Estabilidad de los conidios de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) e I. fumosorosea (Pfr-114 y Pfr-612) almacenados a 4 ± 2 ºC durante doce semanas. Aislados y/o cepas
Germinación (%)
*Día 0
Semanas Mes
1 2 3 4 1 2
HIB-2 100 100 100 97 97 90 2
HIB-3 100 100 98 90 80 80 70
HIB-4 100 100 100 100 98 98 95
HIB-5 100 100 100 98 95 90 88
Pfr-114 100 100 100 100 98 95 98
Pfr-612 100 100 100 100 97 94 92 Promedio ±DE
100 100 99.66 ±.81
97.50 ±3.88
94.16 ± 7.02
91.16 ±6.27
87.50 ±10.23
Conidios producidos en bolsas de arroz como sustrato sólido a 25± 2 ºC. * Corresponde a la sobrevivencia de las conidias a los 14 d de incubación bajo condiciones de laboratorio (25±2ºC).
Figura 15. Conidios germinados del aislado HIB-4 de B. bassiana. Nótese la formación del tubo germinativo, tan largo como la mitad del diámetro de la espora característico de una espora germinada.
96
6.8 Ensayos con insectos benéficos
6.8.1 Bioensayos con Hippodamia convergens
En el bioensayo, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad
promedio de H. convergens en un rango de 6.25-25%, con el valor mínimo
registrado para la cepa Pfr-114 y el máximo para el aislado HIB-4, mientras
que los controles registraron valores de 3.75 % (Tween 80) y 10 % (control),
mientras que los aislados HIB-2, HIB-3 y HIB-5 registraron mortalidades de
17.5, 21.25 y 10 %, respectivamente y para la cepa Pfr-612 se registró un
8.75 % de mortalidad (Figura 16).
Figura 16. Mortalidad de H. convergens por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114) a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O. Líneas en las barras indican el error estándar.
97
6.8.2 Bioensayos con Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis
6.8.2.1 Bioensayos con larvas de tercer estadio de Eremochrysa
punctinervis
En el bioensayo, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad
promedio de larvas de tercer estadio de E. punctinervis de 0 - 10 %, en
pupas de 0-100%, registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-5 y el
máximo para el aislado HIB-3. Respecto a los adultos las mortalidades por
causa de los tratamientos fueron de 10 - 50 % (Tabla XII).
* Mortalidad es expresada en porcentaje (%)
Tabla XII. Mortalidad promedio de Eremochrysa punctinervis por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114) a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O.
Tratamiento
* Mortalidad X (IC a 95 %)
Larva 3 Pupa Adulto
HIB-2 10 (7.63-12.37) 70 (66.36-73.64) 10 (7.63-12.37) HIB-3 0 100 0 HIB-4 0 50 (46.04-53.96) 40 (36.12-43.88) HIB-5 10 (7.63-12.37) 0 20 (16.84-23.16) Pfr-612 10 (7.63-12.37) 20 (16.84-23.16) 30 (26.37-33.63) Pfr-114 0 20 (16.84-23.16) 50 (46.04-53.96) Testigo Tween 80
10 (7.63-12.37) 10 (7.63-12.37) 40 (36.12-43.88)
Testigo absoluto
10 (7.63-12.37) 20 (16.84-23.16) 50 (46.04-53.96)
98
6.8.2.2 Bioensayos con larvas de primer estadio de Ceraeochrysa valida
En el bioensayo, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad
promedio de larvas de primer estadio de C. valida de 14.28 - 35.70 %
registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-4 y el máximo para el
aislado HIB-3, en pupas de 0-14.28%. Respecto a los adultos las
mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 % (Tabla
XIII).
6.8.2.3 Bioensayos con larvas de segundo estadio de Ceraeochrysa
valida
En el bioensayo, los tratamientos evaluados causaron una mortalidad
promedio de larvas de segundo estadio de C. valida de 0 - 35.70 %
registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-5 y el máximo para el
aislado HIB-3, en pupas de 0 - 7.14%. Respecto a los adultos las
mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 % (Tabla
XIV).
Tabla XIII. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114) a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L: O.
Tratamiento
* Mortalidad X (IC a 95 %)
Larva 1 Pupa Adulto
HIB-2 28.56 (26.49-30.63) 0 42.84 (40.57-45.11) HIB-3 35.70 (33.50-37.90) 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) HIB-4 0 0 42.84 (40.57-45.11) HIB-5 21.42 (19.54-23.00) 7.14 (5.97-8.31) 35.70 (33.50-37.90)
Pfr-612 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) 14.28 (12.68-15.88) Pfr-114 14.28 (12.68-15.88) 0 49.98 (47.69-52.27)
Testigo Tween 80 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 28.56 (26.49-30.63) Testigo absoluto 14.28 (12.68-15.88) 0 35.70 (33.50-37.90)
* Mortalidad es expresada en porcentaje (%)
99
Tabla XIV. Mortalidad promedio de Ceraeochrysa valida por aislados de B. bassiana (HIB-2, HIB-3, HIB-4 y HIB-5) y cepas de I. fumosorosea (Pfr-612 y Pfr-114) a los 26 días de incubación bajo condiciones de laboratorio, 28±1ºC; 12:12 h L:O.
Tratamiento
* Mortalidad X (IC a 95 %)
Larva 2 Pupa Adulto
HIB-2 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 49.98 (47.69-52.27) HIB-3 35.70 (33.50-37.90) 0 35.70 (33.50-37.90) HIB-4 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 28.56 (26.49-30.63) HIB-5 0 0 42.84 (40.57-45.11)
Pfr-612 21.42 (19.54-23.00) 7.14 (5.97-8.31) 14.28 (12.68-15.88) Pfr-114 7.14 (5.97-8.31) 7.14 (5.97-8.31) 28.56 (26.49-30.63)
Testigo Tween 80 0 7.14 (5.97-8.31) 71.40 (69.33-73.47) Testigo absoluto 0 7.14 (5.97-8.31) 28.56 (26.49-30.63)
* Mortalidad es expresada en porcentaje (%)
100
7. DISCUSIÓN
Un factor clave en la selección de nuevos aislados como potenciales
agentes de control biológico, específicamente en hongos entomopatógenos,
es la capacidad de la cepa para ser producida en grandes cantidades (altas
tasas de esporulación), tener un rápido crecimiento y no perder su viabilidad
e infectividad. La gran mayoría de las especies de hongos pueden producirse
fácilmente en medios sólidos, donde el hongo crece en forma de micelio
superficial y produce conidios en hifas aéreas; sustratos naturales
constituyen medios de cultivo adecuados como el arroz o el salvado de trigo
(Goettle and Roberts, 1992; Feng, et al., 1994).
En el presente trabajo se evaluó la producción y crecimiento micelial
de aislados nativos de hongos entomopatógenos en diferentes medios de
cultivo ampliamente utilizados en el laboratorio para inducir el crecimiento y
la esporulación de diversos tipos de hongos, tomando como base el agar
papa-dextrosa y el agar dextrosa-Sabouraud los cuales incluyen glucosa
como fuente de carbono en diferentes proporciones y tres modificaciones de
los mismos por la adición de peptona de caseína y/o extracto de levadura
como fuentes de nitrógeno. Los resultados obtenidos mostraron que no
existió diferencia significativa entre los medios evaluados para la producción
de conidios y crecimiento micelial. Existen, sin embargo, varios factores
relacionados con las fuentes de nitrógeno que pudieron tener influencia en
los resultados.
Por ejemplo, la peptona de caseína es un digerido pancreático que
contiene todos los aminoácidos encontrados en la caseína, además de
largas fracciones pépticas, y algunos minerales como calcio, magnesio,
potasio y sodio en cantidades mínimas, sin embrago carece de un contenido
101
definido de vitaminas en su composición, lo cual puede tener efecto en el
desarrollo de la esporulación y la formación de estructuras reproductivas las
cuales requieren de ciertas concentraciones de vitaminas o minerales
(Griffin, 1996).
El extracto de levadura ha demostrado ser una fuente de nitrógeno
más eficaz en la promoción del crecimiento micelial y la esporulación, sin
embargo, también se ha reportado como un factor limitante para el
crecimiento y la esporulación dependiendo de la concentración utilizada. A
bajas concentraciones de levadura (0.25 a 0.50%) el crecimiento del micelio
es inferior al óptimo y la esporulación es baja, mientras que a mayores
concentraciones de levadura (1.75 a 2.0%) el crecimiento del micelio es alto
y esto inhibe la esporulación (Vimala-Devi, 1994). La falta o la deficiencia de
ciertos factores de crecimiento, tales como vitaminas o minerales, o la
concentración de extracto de levadura utilizada en este estudio que fue de
0.5 a 1.0% pudo haber tenido un impacto significativo para la producción de
conidios y el crecimiento del micelio.
Moore (1996) menciona que los hongos pueden diferir en su
capacidad para utilizar diferentes fuentes de carbono y nitrógeno para la
reproducción, ya que el crecimiento del micelio y la producción de conidios
puede ser favorecida por monosacáridos tales como glucosa o fructosa, sin
embargo algunas fuentes de nitrógeno que permiten un buen crecimiento del
micelio no favorecen la esporulación, tales como asparagina y los
compuestos de amonio que inhiben el crecimiento micelial y la esporulación,
debido a la acumulación de amoniaco durante el crecimiento somático, por
alcalinización del medio inhibiendo este proceso.
En cuanto a la producción de conidios y el crecimiento del micelio
entre las diferentes cepas se encontraron diferencias altamente significativas
en su capacidad de utilizar diferentes medios de cultivo.
102
De acuerdo con los resultados reportados, una cepa de B. bassiana
mostró la mayor producción de conidios entre las cepas analizadas, mientras
que otras dos cepas de la misma especie mostraron los niveles más bajos de
lo que es consistente con lo reportado por James (2001) que observaron un
aumento en la eficiencia de germinación de B. bassiana y P. fumosoroseus
con la adición de peptona y extracto de levadura. Smith y Grula (1981)
informaron que B. bassiana requiere fuentes exógenas de carbono para la
germinación y de nitrógeno durante las etapas iniciales del crecimiento de las
hifas y mantenimiento. Wrona y Gleason (2005) concluyeron que una fuente
de carbono puede activar la germinación en algunos microorganismos, pero
una fuente de nitrógeno es esencial para la elongación del tubo germinativo y
el crecimiento de las hifas. Algunos de los aminoácidos de dichas fuentes
nutricionales pueden inducir la expresión de genes que controlan la
esporulación, ya que este proceso requiere la activación de más de 80 genes
(Roncal y Ugalde, 2003).
Los eventos relacionados con el crecimiento micelial de los hongos,
que comienza con la aparición de tubo germinal y finaliza con hifas en
crecimiento y su ramificación para formar finalmente un micelio joven,
también están relacionados con la genética molecular y la regulación que
determina la expresión o represión de las características morfológicas
(Papagianni, 2004). Algunos microorganismos no requieren fuentes de
nitrógeno para germinar. James (2001) reportó que algunas cepas de M.
anisopliae germinaron muy bien cuando se utilizó la glucosa como única
fuente de nutrición.
Del mismo modo Li y Holdom (1995) observaron que la germinación
de los conidios de M. anisopliae fueron los mismos en agar con una fuente
de nitrógeno (aminoácidos individuales) y agar con glucosa sin ninguna
103
fuente de nitrógeno orgánico, e incluso reportaron un buen crecimiento
micelial de M. anisopliae en almidón soluble para la producción masiva, lo
que indica que la respuesta de cada microorganismo es diferente a las
distintas fuentes de nutrientes. Estos resultados coinciden con los reportados
por la cepa Met de M. anisopliae, que tuvo el mayor crecimiento micelial
entre las distintas cepas y/o aislados analizados en este estudio.
Varios experimentos se han dedicado a dilucidar la influencia de la
nutrición para el crecimiento del micelio y la producción de esporas a fin de
elegir los componentes y concentraciones óptimas para aumentar la
producción a gran escala. Gao y Liu (2010) examinaron los efectos sobre el
crecimiento y la esporulación en medio líquido y sólido para P. lilacinus y M.
anisopliae utilizando distintas combinaciones de fuentes de carbono y
nitrógeno diferentes, ellos concluyeron que los resultados fueron muy
variables entre las cepas y cada cepa presentó ciertos requisitos de nutrición
para el desarrollo del crecimiento micelial y la esporulación. Safavi et al.
(2007), estudiaron el efecto de la nutrición en la virulencia de tres
aislamientos de B. bassiana y uno de M. anisopliae cultivándolos en siete
medios de cultivo con diferentes proporciones de carbono / nitrógeno (C / N).
Ellos reportaron que el crecimiento micelial y la producción de conidios
mostró diferencias entre diferentes especies y cepas. Liu y Chen (2002)
encontraron que algunas fuentes de carbono y nitrógeno eran buenas para el
crecimiento en líquido y sólido de Hirsutella rhossiliensis, mientras que
algunos no podrían ser utilizados ya sea en forma líquida o sólida.
En el presente estudio se evaluó la producción de conidios de los
aislados de B. bassiana y cepas de I. fumosorosea que indujeron mayor
104
mortalidad contra ninfas y/o adultos de D. citri, mediante el uso de un cultivo
bifásico que consistió en un medio líquido para la fase sumergida y grano de
arroz (Oryza sativa L.) como la fase sólida.
Una gran parte de los hongos entomopatógenos desarrollados sobre
grano de arroz como sustrato en bolsas plásticas bajo un sistema de
producción artesanal han alcanzado rendimientos del orden de 1010 conidios
por gramo aunque con frecuencia en la mayoría de las especies los valores
reportados son del orden de 109 conidios por gramo (Wraight et al., 2001;
Sahayaraj y Karthick, 2008). Por otro lado, Méndez et al., 2009 reportaron el
uso de un cultivo bifásico, en la fase líquida a base de melazas y extracto de
lavadura y en la fase sólida grano de arroz como sustrato para la producción
de conidios de Nomuraea rileyi (Farlow) obteniendo rangos de 1.05 x 109 a
1.68 x 1010 conidios g-1. Rajanikanth et al. (2011) usaron grano de sorgo y
arroz y obtuvieron valores promedio de 2 x1010 conidios mL-1.
Los resultados obtenidos en este estudio se mantuvieron en el orden
de 108 a 109 conidios g-1, lo cual coincide con lo reportado por Posada-
Flórez, 2008 quien reporta valores menores a 1x1010 conidios g-1 de arroz
para B. bassiana en un medio de cultivo bifásico y una germinación a las 24
y 48 h del 80 y 75 %; mientras que en el presente estudio los valores de
germinación en promedio fueron superiores al 90 % a las cuatro semanas de
almacenamiento.
Estos rendimientos coinciden también con los reportados por Carneiro
and Kulcznski (1993) quienes registraron de 1x108 a 1x1010 conidios g-1 de
arroz a los 12 días de incubación para aislados de Paecilomyces spp. Sin
embargo, Monzón (2001) menciona que el rendimiento de esporas por gramo
de sustrato está determinado por la cepa y por el estado de la misma y
puede variar desde 5x103 hasta 2.5x1011 conidios g-1 de sustrato.
105
El presente estudio y las investigaciones anteriores han tratado de
ayudar a dilucidar el efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno y la
relación entre estos elementos como factores de alto impacto en el
crecimiento y la esporulación de hongos entomopatógenos y puedan ayudar
en la selección de las mejores cepas y/o aislados de hongos
entomopatógenos que pueden tener potencial como agentes de control
biológico.
De acuerdo a los resultados de los ensayos preliminares
anteriormente descritos, tanto para ninfas como adultos los resultados
obtenidos muestran que D. citri fue afectada por los factores de manejo
implementados en la evaluación de los hongos entomopatógenos, ya que la
alimentación y condiciones físicas (temperatura y fotoperiodo) provistas se
encuentran dentro de los rangos indicados en la literatura (Tsai y Liu, 2000;
Tsai et al., 2002). Respecto a los insectos adultos, el ensayo de
sobrevivencia ayudó a reducir la mortalidad de los testigos o controles
cuando prácticamente la manipulación del insecto fue mínima al propiciar
una infestación natural de las plántulas utilizadas en las arenas
experimentales, mientras que para las ninfas el seleccionar brotes
naturalmente infestados con ninfas en alimentación activa, así como
seleccionar los mejores brotes de acuerdo a sus características de
coloración, turgencia y tamaño redujo notablemente la mortalidad en los
testigos o controles pues de acuerdo a Padulla y Alves (2009) la etapa de
transferencia de las ninfas de una planta al brote puede originar daños en el
aparato bucal lo que ocasiona que sean incapaces de alimentarse y ser un
factor de muerte importante, y al evitar este proceso se reducen las
posibilidades de muerte temprana del insecto por esta causa.
Respecto a los bioensayos con adultos de D.citri los resultados
muestran que D. citri fue susceptible a la infección por los aislados de
hongos entomopatógenos evaluados. Uno de los objetivos del presente
106
trabajo fue establecer una metodología uniforme para la selección de hongos
entomopatógenos de especies diferentes como agentes de control de D. citri
mediante el empleo de dos métodos de aplicación diferentes, asperjado
directo a plántulas y asperjado directo a los insectos adultos. El método de
asperjado directo a plántulas fue diseñado con la finalidad de observar su
capacidad para infectar a los insectos evaluados aun y cuando la aplicación
de los tratamientos haya sido indirectamente a ellos.
Avery et al., 2009 evaluaron la infectividad y transmisión horizontal de
una cepa de I. fumosorosea asperjando secciones de hojas de cítricos y
etiquetas plásticas de color amarillo (atrayente artificial) con una suspensión
de 1.2 - 1.7 x 103 blastoesporas por milímetro cuadrado (mm2) reportando
mortalidades del psílido a los 4.9 ± 0.21 y 6.1 ± 0.37 días, respectivamente,
después de la exposición al patógeno. Bajo altas condiciones de humedad (>
80%), las blastoesporas de I. fumosorosea fácilmente produjeron hifas en la
superficie de las hojas, y en las cámaras donde sola una sección de la hoja
fue tratada, los adultos al estar en contacto con las blastoesporas fueron
capaces de diseminarlas a las hojas no tratadas y el mismo fenómeno
ocurrió al usar la etiquetas amarillas. En el presente estudio la humedad
relativa fluctúo alrededor del 60 - 65 % y se utilizaron conidios como unidad
infectiva los cuales pudieron ser factores claves para que no se haya
presentado este fenómeno de auto diseminación.
En un estudio reciente Stauderman et al., 2012 mencionan que en
pruebas en invernaderos en condiciones de alta humedad se vieron
obstaculizados por la difusión natural de I. fumosorosea a psílidos no
tratados, lo que sugiere que el hongo es propagado por el movimiento del
aire y puede ser altamente eficaz en condiciones muy húmedas.
107
Respecto al método de asperjado directo a los insectos al igual que
para el asperjado de plántulas todos los tratamientos presentaron una
mortalidad inferior al 70 %, lo cual coincide con lo reportado por Subandiyah
et al, (2000) quienes condujeron un ensayo utilizando tres diferentes
concentraciones de conidios de I. fumosorosea reportando valores a los 6
días de hasta 55.6 % de mortalidad a una concentración de 108 conidios
mL-1.
En otro estudio Mellín-Rosas et al., 2009 evaluaron cuatro cepas de
hongos entomopatógenos a una concentración de 1 x107 conidios mL-1
encontrando a los 10 días de incubación para dos cepas de I. fumosorosea
mortalidades de 62.71% y 77.38 %. En los bioensayos descritos sobre los
estadios ninfales de D. citri los resultados obtenidos muestran que es
susceptible a la infección por hongos entomopatógenos, lo cual coincide con
lo reportado por Padulla y Alves (2009), quienes realizaron bioensayos a
nivel laboratorio con tres cepas de B. bassiana, provenientes de insectos
infectados, a una concentración de 5 x 107 conidios mL-1 y obtuvieron
mortalidades en el rango del 54-72 % a los siete días de aplicación. En otro
estudio Mellín-Rosas et al., 2009 evaluaron cepas de I. fumosorosea, M.
anisopliae y B. bassiana aisladas de Bemisia sp y Aenolamia sp. a una
concentración de 1 x 107 conidios mL-1 obteniendo mortalidades de 80.79 a
90.00 % para cepas de I. fumosorosea, de 76.09 a 79.49 % para cepas de
M. anisopliae, y para B. bassiana las mortalidades oscilaron entre 16.44 y
30.40 %. Respecto a la variación en la mortalidad y desarrollo de micosis
entre los aislados puede deberse a diversos factores, uno de ellos puede
atribuirse al efecto inhibidor de Cladosporium spp. (Mellín-Rosas et al.,
2011), sin embrago, en bioensayos para la selección de cepas esta variación
en la patogenicidad se ha observado en algunos casos y puede estar
asociada con la virulencia, especificidad y la tolerancia del huésped como
consecuencia de la variabilidad genética de cada uno de estos aislados
(Vestergaard et al., 1995; Alves 1998).
108
Aunque la mayoría de los estudios desarrollados a nivel laboratorio
para evaluar la efectividad de diferentes aislados y/o cepas de hongos
entomopatogenos sobre D. citri difieren notablemente entre sí (Subandiyah
et al., 2000; Avery et al., 2009; Mellín-Rosas et al., 2009; Hoy et al., 2010),
solo realizan una evaluación cualitativa (Meyer et al., 2007) o están dirigidos
a efectuar una descripción morfológica o molecular (Meyer et al., 2007, 2008;
Reyes-Rosas et al., 2009; Subandiyah et al., 2000), coinciden con el
presente trabajo en que la mayoría de los aislados y/o cepas que han
mostrado actividad contra D. citri son de I. fumosorosea indicando que el
insecto es susceptible a la infección causada por este hongo en particular.
En el caso de I. fumosorosea la gran mayoría de los experimentos
sobre sus efectos secundarios en organismos benéficos se realiza
principalmente en relación con el uso de este hongo como agente de control
biológico, y en general las cepas de este entomopatógeno resultaron ser
compatibles con diversos organismos beneficiosos (Zimmermann , 2008).
Sin embargo, en el caso particular de D. citri es importante realizar
pruebas de bioseguridad e inocuidad a insectos no blanco, ya que como lo
mencionan Quereshi and Stansly (2007) depredadores como Olla v-nigrum,
Cycloneda sanguínea y Chrysoperla spp y el mismo T. radiata juegan un
papel importante como factores de mortalidad natural del psílido. Por lo tanto
en el presente trabajo las cepas y/o aislados de B. bassiana e I. fumosorosea
que indujeron mayor mortalidad contra ninfas y/o adultos de D. citri se
evaluaron sobre adultos de Hippodamia convergens, y larvas de
Ceraeochrysa valida y Eremochrysa punctinervis para determinar su efecto
sobre estos depredadores utilizados en el control de D. citri.
109
En contraste con B. bassiana y M. anisopliae (Zimmermann 2007 a,b)
existen pocas investigaciones de los efectos de las diferentes especies de
Isaria sobre organismos benéficos no- blanco. Goettel et al (1990) publicaron
una lista de hospederos no blanco para Isaria farinosa, sin embargo I.
fumosorosea no fue enlistada.
Por otro lado, la mayoría de los experimentos sobre los efectos
secundarios de I. fumosorosea sobre organismos benéficos no-blanco están
elaborados en conexión con el uso de este entomopatógeno como agente de
control biológico y en general resultó compatible con varios organismos
benéficos asociados a las plagas en las que fue evaluado este hongo
(Zimmermann, 2008)
El aislado Apopka 97 usado a nivel de invernadero para el control de
moscas blancas fue inocuo para insectos benéficos, y pudo ser utilizado en
combinación con Encarsia formosa (Hymenoptera:Aphelinidae) y
Macrolophus caliginosus (Hemiptera: Miridae) (Copping, 2004).
Adicionalmente, esta cepa también fue encontrada inocua para Bombus
terrestris (Hymenoptera: Apidae), Phytoseiulus persimilis (Phytoseiidae,
Acari) y Orius laevigatus (Hemiptera: Anthocoridae) (Sterk et al, 2002). I.
fumosorosea también es compatible con Eretmocerus sp.
(Hymenoptera:Aphelinidae), un parasitoide común de B. tabaci, y con
Delphastus pusillus (Coleoptera: Coccinellidae), un depredador de varias
moscas blancas en la región de Florida (Osborne and Landa, 1992). Los
estudios sobre las interacciones entre el depredador generalista Dicyphus
hesperus (Hemiptera: Miridae) e I. fumosorosea Apopka-97 revelaron que la
densidad de los adultos de D. hesperus no era afectada por las múltiples
aplicaciones del hongo (Alma et al., 2007).
110
Sin embargo, Chrysoperla carnea y Chrysoperla sinica (Neuroptera:
Chrysopidae) dos importantes depredadores generalistas fueron enlistados
por Smith (1993) como insectos hospederos de I. fumosorosea. Estos
resultados coinciden con los obtenidos en el presente trabajo con
Eremochrysa punctinervis donde se registraron valores de hasta 70 % de
mortalidad y de 64.26 % para larvas de primer estadio de Ceraeochrysa
valida.
En un estudio con ensayos de laboratorio hasta un 22 % de adultos de
Hippodamia convergens fueron infectados cuando los insectos estuvieron
bajo condiciones de estrés (Pell and Vandenberg, 2002). Se observó que los
coccinélidos consumieron mas áfidos no infectados en lugar de áfidos
infectados, incluso nunca consumieron cadáveres de áfidos con visible
crecimiento fúngico.
Los predadores contaminados fueron capaces de transferir conidios a
Diuraphis noxia (Hemiptera: Aphididae) sanos. En el presente estudio los
ensayos con adultos de H. convergens mostraron que las cepas de I.
fumosorosea evaluadas (Pfr-612 = 8.75 % y Pfr-114 = 6.25 %) registraron los
valores mínimos de mortalidad, mostrando la baja susceptibilidad a ser
infectados por cepas de I. fumosorosea.
Las investigaciones sobre la prevalencia natural de B. bassiana han
demostrado que este hongo se encuentra ampliamente distribuido en el
suelo, así como entre los insectos en el ambiente aéreo. Esto significa que
existe una larga y duradera coexistencia evolutiva con otros microorganismos
que incluye distintos tipos de interacciones. Desde el punto de vista de
seguridad, la principal preocupación es que los microorganismos aplicados
en el control biológico puedan potencialmente desplazar a otros organismos
no-blanco, ya que después de la aplicación en plantas o suelo, los agentes
de biocontrol deben ser capaces de sobrevivir y mantenerse por si mismos
111
para llevar a cabo la actividad biocontroladora, pero sin interferir con la
microbiota residente (Zimmermann, 2007a).
Es bien conocido que B. bassiana tiene un amplio rango de
hospederos lo cual se traduce en varios cientos de especies de artrópodos;
sin embargo, la especificidad del hospedador es realmente una característica
específica de una cepa (Zimmermann, 2007a). Por ejemplo, aislados de B.
bassiana procedentes de Olla v-nigrum (Coleoptera: Coccinellidae) fueron
patogénicos hacia adultos de esta especie, pero no hacia adultos de
Harmonia axyridis (Coleoptera: Coccinellidae) (Cottrell and Shapiro-Ilan,
2003).
Por otro lado, la cepa GHA de B. bassiana no fue significativamente
patogénica hacia O. v-nigrum o H. axyridis. En contraste, B. brongniartii
tiene un rango más estrecho de hospederos en su mayoría restringido a los
miembros de la familia de coleópteros Scarabaeidae. En los ensayos
realizados en el presente estudio con adultos de Hippodamia convergens los
aislados de B. bassiana causaron los mayores niveles de mortalidad (HIB-2 =
17.5 %, HIB-3 = 21.25 % y HIB-4 = 25 %), lo cual coincide con lo reportado
por Berlanga-Padilla y López-Arroyo (2006) quienes reportan mortalidades
de 24.4 % por la inoculación de una cepa de B. bassiana sobre adultos de
Olla v-nigrum y de 25.6 % sobre Harmonia axyridis.
Generalmente, existe una diferencia entre el rango fisiológico de
hospederos y el rango ecológico de hospederos (Hajek and Butler, 2000). El
rango fisiológico de hospederos demuestra el rango de especies de insectos
que pueden ser infectados en el laboratorio, mientras el rango ecológico de
hospederos muestra que insectos pueden ser infectados en la naturaleza o
bajo condiciones de campo.
112
Insectos no-blanco pueden ser infectados bajo condiciones de
laboratorio pero no necesariamente puede ser infectado en la naturaleza.
Este tema fue ampliamente discutido y detallado por Hajek and Goettel
(2000) y Jaronski et al., 2003.
Existen numerosos estudios del efecto de B. bassiana sobre
organismos benéficos no-blanco, la mayoría de los estudios han sido
realizados en laboratorio y pocos bajo condiciones de campo, por ejemplo
Donegan and Lighthart (1989) reportaron que la aplicación a nivel laboratorio
de B. bassiana sobre Chrysoperla carnea aunado a condiciones estresantes
de temperatura y nutrición afectaron significativamente la susceptibilidad al
hongo, siendo el estrés nutricional principalmente, aunado a la presencia del
entomopatógeno los factores determinantes para aumentar la mortalidad en
larvas y adultos. Respecto a los ensayos con E. punctinervis se registraron
valores de 90-100 % de mortalidad, mientras que en larvas de primer y
segundo estadio de C. valida se obtuvieron mortalidades de hasta 71.40 %,
estos resultados difieren notablemente con los reportados por Berlanga-
Padilla y López-Arroyo (2006) quienes no reportaron mortalidad de larvas de
segundo estadio de C. valida a una concentración de 1x 107 conidios mL-1,
sin embargo, Butt et al. (1994) y James y Lighthart (1994) indican que la
mortalidad depende de la concentración del hongo.
Goettel et al (1997, 2001) y Vestergaard et al (2003) concluyen que a
pesar de la amplia gama de hospederos de B. bassiana, la evidencia hasta la
fecha sugiere que B. bassiana se puede utilizar con un impacto mínimo en
organismos no-blanco especialmente cuando se tienen en consideración
factores espacio-temporales en la selección de cepas.
113
Un factor esencial para el éxito de la patogénesis radica en la
capacidad de los hongos entomopatógenos para romper el integumento de
los insectos por eventos inespecíficos y específicos entre las unidades
infectivas (conidios, blastoesporas) y la cutícula del insecto (Jeffs 1997,
1999), entomopatógenos como Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana
e Isaria fumosorosea producen múltiples enzimas extracelulares (St. Leger et
al., 1993; Ali et al., 2009; Dias et al., 2008; Chul-Kang et al., 1999). La
mayoría de los aislados y cepas evaluados en este estudio produjeron un
considerable espectro de enzimas proteolíticas, lipolíticas y principalmente
quitinolíticas.
In vivo la secuencia en la secreción de enzimas corresponde a la
composición de polímeros presentes en la cutícula. La desintegración de los
componentes de la cutícula es considerada un fenómeno interactivo en el
cual los hongos patógenos de insectos podrían haber evolucionado a través
de adaptaciones en sus enzimas extracelulares hidrolíticas (St. Leger et al,
1986,1996 a).
En estudios in vitro en placa, la producción de enzimas es típicamente
indicada por la formación de zonas claras alrededor de la colonia en
crecimiento, estas zonas se denominan halos de inhibición aunque también
se puede observar la formación de productos coloreados (Mustafa and Kaur,
2010). La entomopatogénesis implica la participación de proteasas, lipasas y
quitinasas (Clarkson and Charnley, 1996). La comprensión actual de los
eventos iníciales de la entomopatogénesis por hongos refleja que el sistema
enzimático de la hongos entomopatógenos es único y es de gran interés
como un posible criterio en la selección y mejora de micoinsecticidas
(Mustafa and Kaur, 2010).
114
En el presente estudio el grado de variabilidad en la secreción de
enzimas entre los diferentes aislados y cepas fue significativo. Por ejemplo,
la producción de lipasa puede ser influenciada por el tipo y la concentración
de las fuentes de carbono y nitrógeno. Estudios previos en la producción de
lipasas muestran que los mecanismos que regulan su producción varían
ampliamente entre diferentes microorganismos (Sharma et al., 2001).
Por otro lado, diversos estudios mencionan el rol clave que juegan
diversos factores en la producción de proteasas extracelulares,
principalmente las proteasas Pr1 y Pr2, por ejemplo Bidochka and
Khachatourians (1988) reportaron que la presencia de glucosa, glicerol,
trehalosa o manitol y amonio combinados en un medio que contenía gelatina
reprimió la producción de la serin proteasa Pr1. Esto puede explicar el
porqué en algunos de los aislados y cepas evaluadas no se detectó actividad
proteasa debido a que el medio utilizado para la detección contenía glucosa
que pudo haber actuado como represor.
Por su parte, para las quitinasas se ha considerado que tienen un
papel de menor importancia en la patogénesis, especialmente en
comparación con la proteasa de M. anisopliae (St. Leger et al., 1996 b). La
expresión de genes de quitinasas en los microorganismos es controlado por
medio de un sistema inductor/represor en el cual la degradación de la quitina
o de sus productos actúan como inductores. En levaduras se ha observado
que la glucosa y otras fuentes de carbono actúan como represores del
sistema (Felse and Panda, 1999).
115
8. CONCLUSIONES
Para la producción de conidios y crecimiento micelial entre los
diferentes aislados y cepas no se registró diferencia significativa entre los
cinco medios de cultivo evaluados.
La producción promedio de conidios y el crecimiento micelial
mostraron alta diferencia significativa entre los aislados y cepas evaluadas,
siendo el aislado HIB-4 el que presentó la mayor producción (4.85 x 109
conidios mL-1) mientras que los aislados HIB-2, HIB-3 y HIB-29 presentaron
la más baja producción de conidios (4.70 x 107, 1.85 x 107 y 1.95 x 107).
Respecto al crecimiento micelial la cepa Met presentó el mayor crecimiento
(8.06 cm) y el menor se registró para el aislado HIB-18 (3.62 cm).
En los bioensayos con adultos de D. citri mediante el método de
aspersión directa a la plántula el aislado HIB-19 de I. fumosorosea fue el más
efectivo en inducir la mortalidad sobre D. citri (62.02 %) y para el método de
aspersión directa a los insectos los aislados HIB-24 y HIB-32 de B. bassiana
e I. fumosorosea, respectivamente, fueron los más efectivos en inducir la
mortalidad sobre D. citri (60.66 %).
En el bioensayo por contacto con adultos de D. citri los tratamientos
evaluados causaron una mortalidad promedio en un rango de 24-100%, con
el valor mínimo registrado para la cepa Met de M. anisopliae y el máximo
para la cepa Pfr-114 de I. fumosorosea.
116
En los bioensayos por aspersión con ninfas de D. citri la cepa Pfr-612
de I. fumosorosea mostró el mayor porcentaje de mortalidad (84.26 %).
Respecto a la capacidad de las cepas para inducir micosis, los resultados
indican que la cepa HIB-14 de B. bassiana fue la que logró inducir micosis
con mayor efectividad sobre las ninfas de D. citri (56.78 %).
En el bioensayo con ninfas por sumergido, los valores máximos de
mortalidad (100%) fueron causados por los aislados HIB-2, HIB-3, HIB-4 y
HIB-5.
Para la actividad proteasa y lipasa por lo menos uno de los aislados es
diferente respecto a su índice enzimático. Respecto a la actividad quitinasa
existió alta diferencia significativa entre los aislados y cepas evaluadas
siendo el aislado HIB-19 el que mostró el mayor índice enzimático (1.50),
seguido por el aislado HIB-1 (1.45); mientras que no existió relación entre la
mortalidad de ninfas y adultos de D. citri y la actividad enzimática.
Para la producción de conidios en grano de arroz (Oryza sativa L.) el
valor mínimo se registró para el aislado HIB-3 (4.80 x 108 conidios g-1) y el
máximo para el aislado HIB-4 (1.77x109 conidios g-1).
En el bioensayo con H. convergens el valor mínimo de mortalidad se
registró para la cepa Pfr-114 (6.25 %) y el máximo para el aislado HIB-4 (25
%).
En el bioensayo con larvas de tercer estadio de E. punctinervis los
tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 0-10 %,
mientras que para pupas el valor mínimo (0 %) se registró para el aislado
HIB-5 y el máximo para el aislado HIB-3 (100 %). Respecto a los adultos las
mortalidades por causa de los tratamientos fueron de 10 - 50 %, con el
mínimo registrado para el aislado HIB-2 y el máximo para la cepa Pfr-114.
117
En el bioensayo con larvas de primer estadio de C. valida los
tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 14.28 - 35.70
% registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-4 y el máximo para el
aislado HIB-3, mientras que para pupas el valor mínimo (0 %) se registró
para los aislados HIB-2, HIB-4 y la cepa Pfr-114 y el valor máximo (14.28%)
para la cepa Pfr-612. Respecto a los adultos las mortalidades por causa de
los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 %, con el mínimo registrado para el
aislado HIB-3 y la cepa Pfr-612 y el máximo para la cepa Pfr-114.
En el bioensayo con larvas de segundo estadio de C. valida los
tratamientos evaluados causaron una mortalidad promedio de 0 - 35.70 %
registrándose el valor mínimo para el aislado HIB-5 y el máximo para el
aislado HIB-3, mientras que para pupas el valor mínimo (0 %) se registró
para los aislados HIB-3 y HIB-5. Respecto a los adultos las mortalidades por
causa de los tratamientos fueron de 14.28 - 49.98 %, con el mínimo
registrado para la cepa Pfr-612 y el máximo para el aislado HIB-2.
118
RECOMENDACIONES
Realizar bioensayos de inocuidad con otros insectos no blanco que
atacan a Diaphorina citri bajo condiciones de campo y laboratorio.
Realizar bioensayos a nivel de campo con los aislados y/o cepas más
promisorias para el control de D. citri.
Evaluar otros sustratos sólidos (maíz, trigo, avena, entre otros) para
mejorar la producción de conidios.
119
APENDICE A BIOLOGIA DE Diaphorina citri
I II I. Diaphorina citri. A) Adulto de Diaphorina citri, B) estadíos juveniles con túbulos cerosos y C) huevecillos. (Fotos:
R.H. Brlansky y M.E. Rogers, University of Florida).
II. Estadios ninfales de Diaphorina citri. A) 1º instar, B) 2º instar, C) 3º instar, D) 4º instar y E) 5º instar. (Tomado: http://ipmworld. umn.edu).
120
APENDICE B
DISTRIBUCIÓN de Diaphorina citri
I. Distribución mundial de Diaphorina citri (Tomado: SINAVIMO, http://www.sinavimo.gov.ar).
121
II. Distribución y situación fitosanitaria de Diaphorina citri y el Huanglongbing en México (Tomado: adaptado de http://www.senasica.gob.mx).
122
APENDICE C
DAÑO DIRECTO CAUSADO POR Diaphorina citri
I II
I. Daño directo causado por Diaphorina citri. A) Túbulos cerosos característicos de los estadios juveniles de D. citri y B) Aspecto característico de la fumagina en las hojas de cítricos. (Fotos: M. Rogers).
II. Daño en hoja de limón persa variedad Córcega causado por Diaphorina citri (Tomado: http://www.frutal-
es.com).
123
APENDICE D
DAÑO INDIRECTO CAUSADO POR Diaphorina citri
I II
I. Candidatus Liberibacter asiaticus, agente causal del Huanglongbing (Foto: M. Garnier). II. Huanglongbing (HLB). A) Síntomas del HLB, B) Follaje de naranja con el moteado asimétrico del HLB, C)
Coloración asimétricas de frutos y D) Engrosamiento y deformación de la columnela media. (Fotos: UC Statewide IPM Program).
124
APENDICE E DISTRIBUCION MUNDIAL DEL HUANGLONGBING
I. Distribución mundial del HLB (Tomado: SINAVIMO, http://www.sinavimo.gov.ar).
125
APENDICE F
Insecticidas y otros productos de origen químico seleccionados por causar alta mortalidad de Diaphorina citri. Experimentos regionales en la citricultura de México en el año 2010*.
Grupo Químico Modo de acción Ingrediente activo Nombre Comercial OC-Ciclodienos Antagonista de los
canales de cloro neuronales
endosulfán Endosulfán
Organofosforado Inhibidor de la acetilcolinesterasa
clorpirifos Clorpirifos
dimetoato Dimetoato metamidofos Metamidofos monocrotofos Monocrotofos ometoato Ometoato acefato Orthene fosmet Imidan
OP-Cx malathion Malathion 1000*
Piretroide tipo II Modulador de los canales de sodio
bifentrina Bifentrina
Bifentrina+abamectina
Talstar Xtra
fenpropatrin Herald
Neonicotenoide
Agonista de los receptores de acetilcolina
imidacloprid Confidor
126
imidacloprid Imidacloprid imidacloprid Imidacloprid (suelo-
cuello)
thiametoxam Actara dinotefuran Venom thiacloprid Thiacloprid
Neonicotenoide + piretroide
Agonista de los receptores de acetilcolina
y modulador de los canales de sodio
imidacloprid + beta ciflutrina
Muralla Max
imidacloprid + ciflutrina
Leverage
thiametoxam + lambdacihalotrina
Engeo
Acido tetrámico o tetrónico
Inhibidor de la acetilcoenzima A
carboxilasa
spirotetramat Movento
Spinosines - spinetoram Palgus
Aceite Hipoxia aceite mineral Citrolina 1% aceite mineral Pure Spray 1% geraniol Bemistop
Botánico - azadiractina (neem) Nimicide tricarboxilos BioDie
127
Mímico de la hormona juvenil
Inhibidor de la alimentación/ Regulador
del crecimiento
pyriproxyfen Knack
METI acaricidas/insecticidas
Inhibidor del transporte de electrones de la
mitocondria complejo i
fenazaquin Magister
Sales potásicas de ácidos grasos
Rompimiento de ácidos grasos cuticulares
sales de potasio Impide
ácidos grasos de especies vegetales
Agro Soap
Detergente Detergente Ariel Roma Salvo
Triazapentadienos amitraz Mitac Mineral
óxido de cal Cal hidratada
* Adaptado de López-Arroyo et al (2010)
128
APENDICE G
DEPREDADORES DE Diaphorina citri
I
I. Coccinélidos depredadores de Diaphorina citri. A) Harmonia axyridis, B) Olla v-nigrum, C) Curinus coeruleus, D) Cheilomenes sexmaculata, E) Cycloneda sanguínea y F) Coccinella septempunctata (Tomado: http://www.discoverlife.org).
129
II II. Depredadores que atacan a Diaphorina citri. A) Hibana velox (=Aysha velox) (Arachnida: Anyphaenidae), B) Allograpta obliqua (Diptera:Syrphidae), C) Zelus renardii (Hemiptera: Reduvidae), D) Zelus longipes (Hemiptera: Reduvidae) (Tomado: http://www.austinbug.com/reduviidae.html), E) Chrysoperla rufilabris y F) Chrysoperla carnea (Tomado: http://www.portalflorystyczny.pl).
130
APENDICE H PARASITOIDES DE Diaphorina citri
I. Parasitoides de Diaphorina citri. A) Tamarixia radiata, B) hoyos de emergencia de adultos de T. radiata a partir de ninfas momificadas de D. citri (Tomado: http://www.forestryimages.org),C) Diaphorencyrtus aligarhensis y D) Ninfa de D. citri momificada con un hoyo de emergencia en la región abdominal característico de D. aligarhensis (Tomado: http://entnemdept.ufl.edu).
131
APENDICE I HONGOS ENTOMOPATOGENOS QUE INFECTAN A Diaphorina citri
I. Hongos entomopatógenos que infectan a Diaphorina citri. A) Hirsutella citriformis, B) Beuaveria bassiana, C) Isaria fumosorosea. (Fotos: R. Rodríguez-Guerra, F.L. Gandarilla-Pacheco) y D) Verticillium lecanii (Tomado:http://www.naro.affrc.go.jp).
132
APENDICE J
MORFOLOGIA DE Beauveria bassiana
I. Beauveria bassiana. A y B) grupos de conidióforos de B. bassiana mostrando su arreglo típico, C) conidióforo con esporas en la parte superior, D) conidios (tomado de H. L. Barnett y B. Hunter, 1998), E y F) morfología colonial de B. bassiana y G) Microcultivo de B. bassiana observado a 100 x (Fotos: F.L. Gandarilla-Pacheco).
133
APENDICE K
MORFOLOGIA DE Isaria fumosorosea
I. Isaria fumosorosea. A) Esquema de I. fumosorosea que muestra su típico arreglo de conidios en cadena (Tomado: H. L. Barnett y B. Hunter, 1998), B y C) Morfología colonial de I. fumosorosea y D) Microcultivo de I. fumosorosea observado a 100 x (Fotos: F.L. Gandarilla-Pacheco).
134
APENDICE L
MORFOLOGIA DE Metarhizium anisopliae
I. Metarhizium anisopliae. Esquema de M. anisopliae que muestra su morfología típica. A y C) conidióforos y B) conidios. (Tomado: H. L. Barnett y B. Hunter, 1998), D y E) morfología colonial de M. anisopliae (Tomado: http://www.naro.affrc.go.jp) y F) conidios de M. anisopliae observados a 100 x (Foto: F.L. Gandarilla-Pacheco).
135
LITERATURA CITADA
Alean-Carreño I. 2003. Evaluación de la patogenicidad de diferentes
hongos entomopatógenos para el control de la mosca blanca de la yuca Aleurotrachelus sociales Bondar (Homóptera: Aleyrodidae) bajo condiciones de invernadero. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Básicas. Microbiología Agrícola y Veterinaria. Bogotá, D.C. Colombia. Trabajo de grado. pp.33-52.
Ali S, Huang Z, Xiang Ren S. 2009. Production and extraction of
extracellular lipase from the entomopathogenic fungus Isaria fumosoroseus (Cordycipitaceae: Hypocreales). Biocontrol Sci. and Technol. 19(1):81-89.
Alemán J, Baños H, Ravelo J. 2007. Diaphorina citri y la enfermedad
huanglongbing: una combinación destructiva para la producción citrícola. Rev. Protección Veg. 22 (3): 154-165.
Alma CR, Goettel MS, Roitberg BD, Gillespie DR. 2007. Combined
Effects of the entomopathogenic fungus, Paecilomyces fumosoroseus Apopka-97, and the generalist predator, Dicyphus hesperus, on whitefly populations. BioControl 52: 669-681.
Alves, S. 1998. Fungos entomopatogénicos, pp. 289-381. In: S. B. Alves
(ed.), Controle Microbiano de Insectos. 2nd ed. Fundaçao de Estudos Agráios Luiz de Queiroz (FEALQ). Piracicaba, San Paulo, Brazil, pp.1163
Aubert B. 1987. Trioza erytreae del Guercio and Diaphorina citri
Kuwayama (Homoptera: Psylloidea), the two vectors of citrus greening disease: Biological aspects and possible control strategies. Fruits 42: 149-162.
Avery PB, Hunter WB, Hall DG, Jackson MA, Powell A, Rogers M. 2009.
Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) infection and dissemination of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea (Hypocreales: Cordycipitaceae) under laboratory conditions. Florida Entomologist 92(4):608-618.
Barnes SE, Moore D. 1997. The effect of fatty, organic or phenolic acids
on the germination of conidia of Metarhizium flavoviride. Mycol. Res. 101: 662-666.
Berlanga-Padilla AM, López-Arroyo JI. 2006. Efecto de hongos
entomopatógenos en depredadores del pulgón café de los cítricos (Homóptera: Aphididae) pp. 384-388. In: Memorias del XXIX Congreso Nacional de Control Biológico. Manzanillo, Colima, México.
Bischoff JF, Rehner SA, Humber RA. 2009. A multilocus phylogeny of the
Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia 101(4): 512–530.
136
Bidochka MJ, Khachatourians GG.1988. Regulation of extracellular protease in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Exp. Mycol. 12:161-168.
Bidochka M, Low N, Khachatourians G. 1990. Carbohydrate storage in
the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Appl. Environ. Microbiol 56: 3186-3190.
Bidochka, MJ, St. Leger, RJ, and Roberts DW. 1997. Mechanisms of
deuteromycete fungal infections in grasshoppers and locusta: an overview. Memoirs of the Entomologal Society of Canada. 171: 213-224.
Blâchere H, Calvez J, Ferron P, Corrieu G, Peringer P. 1973. Etude de la
formulation et de la conservation d'une préparation entomopathogéne a base de blastospores de Beauveria tenella. Ann. Zool.Ecol.anim. 5(1): 69-79.
Butt TM, Ibrahim L, Ball BV, Clark SJ. 1994. Pathogenicity of the
entomogenous fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against crucifer pests and the honey bee. Biocontrol Sci. Technol. 4 : 207-214
Bustillo A. 2001. Hongos en insectos y posibilidades de uso en el control
biológico de plagas en Colombia. En: seminario Uso de entomopatógenos en Colombia. Sociedad Colombiana de entomología. Bogotá. pp. 30-53
Carneiro R, Kulcznski S. 1993. Metodología de la producao de conidios
para diferentes isolados de Paecilomyces sp. em arroz. Nematologia Brasilera. 17 (1): 98-101.
Carrera J. 2003. Production and application of industrial enzymes.
Revista Facultad de Ciencias Agropecuarias (1)1: 10-15. Cattling HD. 1970. Distribution of the psyllid vectors of citrus greening
disease, with notes on the biology and bionomics of Diaphorina citri. FAO Plant Protection Bulletin 18: 8-15.
Cermeli M, Morales P, Godoy F. 2000. Presencia del psílido asiático de
los cítricos Diaphorina citri Kuwayama (Hemíptera: Psyllidae) en Venezuela. Boletín Entomología Venezolana 15: 235-243.
Ciba–Geigy SW. 1981. Manual para ensayos de campo en protección
vegetal. Suiza, Wener Puntener. pp.597 Clarkson JM, Charnley AK.1996. New insights into the mechanisms of
fungal pathogenesis in insects. Trends Microbiol.4:197-204.
137
Copping LG. 2004. The Manual of Biocontrol Agents. British Crop Protection. Alton, UK pp. 105-106.
Coronado BJ, Ruíz CE. 2004. Registro del psílido asiático de los cítricos
Diaphorina citri Kuwayama (Homoptera: Psyllidae) para México. Folia Entomol. Mex. 43(1):165-166.
Cortez-Mondaca E, López-Arroyo JI, Rodríguez-Ruíz L, Partida-
Valenzuela MP, Pérez-Márquez J, González-Calderón VM. 2011. Capacidad de depredación de especies de Chrysopidae asociadas a Diaphorina citri Kuwayama en los cítricos de Sinaloa, México pp.323-333. En: López Arroyo JI, González Lauck VW (Comp). Memoria 2do Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Montecillo, Edo. de México, México. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán.CD-ROM.
Cotes-Prado AM. 1997. Producción masiva y formulación de
microorganismos biocontroladores de fitopatógenos. En: Memorias del Seminario Internacional de Control biológico de fitopatógenos. Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA), Santafé de Bogotá, Colombia. pp: 18 – 23.
Cottrell TE, Shapiro-Ilan DI. 2003. Susceptibility of native and an exotic
lady beetle (Coleoptera: Coccinellidae) to Beauveria bassiana . Journal of Invertebrate Pathology 84:137-144.
Champlin FR, Cheung PYK, Pekrul S, Smith RJ, Buton RL, Grula EA.
1981. Virulence of Beauveria bassiana mutants for the pecan weevil. Journal of Economic Entomology. 74: 617-621.
Charnley A. 1984. Physiological aspects of destructive pathogenesis in
insects by fungi: A speculative review. In: Invertebrate microbial interactions. Anderson J, Rayner A, Walton D. Cambridge University Press. Cambridge. pp 229-270.
Chien CC. 1995. The role of parasitoids in the pest management of citrus
psyllid. In: Proceedings of the Symposium on Research and Development of Citrus in Taiwan, Taichung, Taiwan, pp. 245-261.
Chien CC, Chu YI. 1996. Biological control of citrus psyllid, Diaphorina
citri in Taiwan. Inter. J. Pest Mgt. 34: 93-105. Chul-Kang S, Park S, Gyu Lee D .1999. Purification and characterization
of a novel chitinase from the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology 73:276–281.
138
da Graça JV. 1991. Citrus greening disease. Annu. Rev. Phytopathology 29: 109-136.
Dalla SHS, Dalla SOR, Brand D, De Souza VLP, Soccol CR. 2005. Spore
production of Beauveria bassiana from agroindustrial residues. Brazilian archives of Biology and Technology an International Journal. 48: 51.
Derakhshan A, Rabindra RJ, Ramanujam B, Rahimi M. 2008. Evaluation
of different media and methods of cultivation on the production and viability of entomopathogenicfungi Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas. Pakistan Journal of Biological Sciences. 11 (11):1506-1509.
Deshpande MV .1999. Mycopesticide production by fermentation:
potential and challenges. Crit. Rev. Microbiol. 25: 229-243. Dias BA, Neves PMOJ, Furlaneto-Maia L, Furlaneto MC. 2008. Cuticle-
degrading proteases produced by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in the presence of coffee berry borer cuticle. Brazilian Journal of Microbiology 39:301-306.
Donegan K, Lighthart B. 1989. Effect of several stress factors on the
susceptibility of the predatory insect, Chrysoperla carnea (Neuroptera: Chrysopidae), to the fungal pathogen Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate Pathology 54:79-84. Blackwell Publishing, Ltd.
European and Mediterranean Plant Protection Organization/Organisation
Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes (OEPP/EPPO) .2005. EPPO Standards PM 7/52. Diagnostic protocol for Diaphorina citri. OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 35, pp: 331–333.
España-Luna MP. 2000. Caracterización enzimática de aislados de
Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes), y su virulencia sobre Epilachna varivestis (Coleóptera: Coccinellidae). Tesis (Maestria). Universidad de Colima.
Étienne J, Burckhardt D, Grapin C. 1998. Diaphorina citri (Kuwayama) en
Guadeloupe, premier signalement pour les Caraïbes (Hem., Psyllidae). Bulletin de la Société Entomologique de France 103:32.
Étienne J, Quilici S, Marival D, Franck A. 2001. Biological control of
Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in Guadeloupe by imported Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae). Fruits 56: 307-315.
Fernández M, Miranda I. 2005. Comportamiento de Diaphorina citri
Kuwayama (Hemíptera: Psyllidae) Parte I: características morfológicas, incidencia y enemigos naturales asociados. Rev. Protección Veg. 20 (1): 27-31.
139
French JV, Kahlke CJ, Da Graça JV. 2001. First record of the Asian citrus psylla, Diaphorina citri Kuwayama (Homoptera: Psyllidae) in Texas. Subtropical Plant Science. 53: 14-15.
Ferron P. 1981. Pest Control by the fungi Beauveria and Metarhizium. In:
Burges H (ed). Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980. p.465-482. Academic Press, New York.
Ferron P. 1978. Biological control of insect pest by entomopathogenous
fungi. In: Annual review of entomology 23: 409-442. Fargues J, Smits N, Vidal C, Vey A, Veja F, Mercadier G, Quimby P.
2002. Effect of liquid culture media on morphology, growth, propagule production, and pathogenic activity of the Hyphomycete Metarhizium flavoviride. Mycopathologia 154(3): 127-138.
Fernández C, Juncosa R. 2002. Biopesticidas: ¿La Agricultura del
Futuro? Phytoma.141:14-19. Felse PA, Panda T. 1999. Regulation and cloning of microbial chitinases
genes. Appl. Microbial Biotechnology 51:141-151. Feng MT, Poprawski G, Khachatourians G. 1994. Production, formulation
and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Biocontrol Sci. and Technol. 4:3-34.
Figueroa LM, Varela A, Corredor D. 2007. Evaluación de sustratos
naturales para la propagación masiva del hongo entomopatógeno Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromicotina:Hyphomycetes). Revista de Investigación, Universidad La Salle Bogotá, Colombia 7(1):127-131.
Gao L, Liu X. 2010. Nutritional requirements of mycelial growth and
sporulation of several biocontrol fungi in submerged and on solid culture. Microbiol. 79(5):612–619.
Gillespie A. 1988. Use of fungi to control pest of agricultural importance.
In: Burge M (Ed). Fungi in biological control systems. Manchester University Press, Manchester, England. pp.269
Gillespie AT, Claydon N. 1989. The use of entomogenous fungi for pest
control and the role of toxins in pathogenesis. Pesticide Sci. 27: 203-215. Goettle MS, Roberts DW. 1992. Mass production, formulation and field
application of entomopathogenic fungi. In: Lomer CJ, Prior C (Eds). Biological control of locusts and grasshoppers. CABI International, Wallingford, U.K.pp:230-238.
140
Goettel MS, Inglis GD. 1997. Fungi: Hyphomycetes. In: Lacey L.A. (Ed). Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic Press, Inc., San Diego, pp. 213–249.
Goettel MS, Hajek AE, Siegel JP, Evans HC. 2001. Safety of fungal
biocontrol agents. In: Butt TM, Jackson C, Magan N, editors. Fungi as biocontrol agents: progress, problems and potential. Wallingford: CAB International. pp. 347-376.
Griffin DH. 1981. Fungal physiology. A while-Interscience publication,
USA. New York. pp. 102-127, 260-279. Griffin DH. 1996. Fungal physiology. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey,
USA. pp.102-127, 260-279. Guadix A, Guadix E, Páez-Dueñas M, González-Tello P, Camacho F.
2000. Procesos tecnológicos y métodos de control en la hidrólisis de proteínas. Arspharmaceutica (41)1: 79-89.
Gupta SC, Leathers TD, El-Sayed GN, Ignoffo CM. 1994. Relationship
among enzyme activities and virulence parameters in Beauveria bassiana infections of Galleria mellonella and Trichoplusia ni. Journal of Invertebrate Pathology 64:13-17.
Hajek AE, St. Leger RJ. 1994. Interactions between fungal pathogens
and insect host. Annual Review of Entomology, 39 293 - 322. Hajek AE, Goettel MS. 2000. Guidelines for evaluating effects of
entomopathogens on nontarget organisms. In: Lacey LA, Kaya HK (eds). Manual of field techniques in insect pathology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. pp 847-868.
Halbert SE, Manjunath KL. 2004. Asian citrus psyllid (Sternorrhyncha:
Psyllidae) and assessment of risk in Florida. Florida Entomologist 87(3): 330-349.
Halbert SE, Nunez CA. 2004. Distribution of the Asian citrus psyllid
Diaphorina citri Kuwayama (Sternorrhyncha: Psyllidae) in the Caribbean basin. Florida Entomologist 87:401-402.
Halbert SE, Niblett CL, Manjunath KL, Lee RF, Brown LG. 2002.
Establishment of two new vectors of citrus pathogens in Florida. Proc. International Soc. Citriculture IX Congress, ASHS Press, Alexandria, VA. pp. 1016-1017.
Hall DG. 2008. Biological Control of Diaphorina citri. En: Resúmenes del I
Taller Internacional sobre Huanglongbing de los cítricos (Candidatus
141
Liberibacter spp.) y el psílido asiático de los cítricos (Diaphorina citri). Servicio Nacional De Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria-SAGARPA y Organización Norteamericana de Protección a las Plantas. Mayo 2008, Hermosillo, Son. Méx.
Hall DG, Hentz MG, Meyer JM, Kriss AB, Gottwald TR, Boucias DG.
2012. Observations on the entomopathogenic fungus Hirsutella citriformis attacking adult Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in a managed citrus grove. BioControl 57(5):663-675.
Hegedus D, Bidochka M, Khachatourians G. 1990. Beauveria bassiana
submerged conidia production in a defined medium containing chitin, two hexosamines or glucose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 641-647.
Hegedus DD, Khachatourians GG. 1995. The impact of biotechnology on
hyphomycetous fungal insect biocontrol agentes. Review Biotechnology Advances 13(3): 455-490.
Hollis D. 1987. A new citrus-feeding psyllid from the Comoro Islands, with
a review of the Diaphorina amoena species group (Homoptera). Systematic Entomology 12:47–61.
Hoy MA, Singh R, Rogers M. 2010. Evaluation of a novel isolate of Isaria
fumosorosea for control of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Florida Entomologist 93(1): 24-32.
Huang CH, Tsai MY, Wang CL. 1984. Transmission of citrus likubin by a
psyllid, Diaphorina citri. J. Agric. Res. China. 33(1): 15-72. Humber RA, Hansen K.S. 2005. USDA-ARS Collection of
entomopathogenic fungal cultures (ARSEF), ARSEF-Catalog: Host by Fungus. http://arsef.fpsnl.cornell.edu.
Hunter DM, Milner RJ, Spurgin PA. 2001. Aerial treatment of the
Australian plague locust, Chortiocetes terminifera (Orthoptera: Acrididae), with Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) in Australia. Bull. Entomol. Res. 91:93-99.
Husain MA, Nath LD. 1927. The citrus psylla (Diaphorina citri Kuw.)
(Psyllidae: Homoptera). Memoirs of the Department of Agriculture in India, Entomological Series 10(2):1–27.
Inglis PW, Tigano MS. 2006. Identification and taxonomy of some
entomopathogenic Paecilomyces spp. (Ascomycota) Isolates Using rDNA-ITS Sequences, Genetics and Molecular Biology 29: 132-136.
142
Jackson MA, Payne AR. 2007. Evaluation of the desiccation tolerance of blastospores of Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) using a lab-scale, air-drying chamber with controlled relative humidity. Biocontrol Sci. and Technol. 17(7):709 - 719
James RR, Lighthart B. 1994. Susceptibility of the convergent lady beetle
(Coleoptera: Coccinellidae) to four entomogenous fungi. Environ. Entomol. 23(1):190-192
Jaronski ST, Goettel MS, Lomer CJ. 2003. Regulatory requirements for
ecotoxicological assessments of microbial insecticides how relevant are they? pp. 237-260. In: Hokkanen HMT and Hajek AE (eds.). Environmental impacts of microbial insecticides. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
James R. 2001. Effects of exogenous nutrients on conidial germination
and virulence against the Silverleaf Whitefly for two hyphomycetes. J. Invertebrate Pathol. 77:99-107.
Jasso-Argumedo J, Lozano-Contreras M, Barroso-Aké H, López-Arroyo
JI. 2010. Abundancia estacional de Diaphorina citri (Hemiptera:Psyllidae) y sus enemigos naturales en huertas de limón persa en Yucatán,México.pp:311-318. En: López-Arroyo JI, González-Lauck VW. (Comp.). Memoria:1er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Monterrey, N.L., México del 8 y 9 de diciembre, 2010. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite.
Jeffs LB, Xavier IJ, Matai RE, Khachatourians GG. 1997. Relationships
between fungal spore morphologies and surface properties for entomopathogenic members of the genera Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Tolypocladium, and Verticillium. Can. J. Microbiol. 45: 936-948.
Jeffs LB, Xavier IJ, Mathai R, Khachatourians GG. 1999. Relationships
between fungal spore morphologies and surface property of the genera Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Tolypocladium and Verticillium. Can. J. Microbiol. 45:936-948.
Jenkins N, Heviefo G, Jürgen L. 1998. Deveploment of mass production
technology for aerial conidia for use as mycopesticides. Biocontrol News Inf. 19(1): 21-31.
Khachatourians GG. 1996. Biochemistry and molecular biology of
entomopathogenic fungi. In: Howard DH, Miller JD (Eds). The Mycota VI. Human and animal relationship. Springer. Berlin, Alemania. pp. 331-364.
143
Khachatourians GG. 1991. Physiology and genetics of entomopathogenic fungi. In: Arora DK, Ajello L, Mukerji KG (Eds). Handbook of Applied Mycology Vol. 2: Humans, animals and insects. Dakker, Nueva York, EE.UU. pp. 613-661.
Lacey LA, Frutos R, Kaya HK, Vail P. 2001. Insect Pathogens as
Biological Control Agents: Do They Have a Future? Biol. Control 21:230-248. Leathers TD, Gupta SC. 1993. Susceptibility of the eastern tent caterpillar
(Malacosoma americanum) to the entomogenous fungus Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate Pathology, 61: 217-219.
Lezama-Gutiérrez R, Molina-Ochoa J, Chávez-Flores O, Ángel-Sahagún
CA, Skoda SR, Reyes-Martínez G, Barba-Reynoso M, Rebolledo-Domínguez O, Ruíz-Aguilar GML, Foster JE. 2012. Use of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae, Cordyceps bassiana and Isaria fumosorosea to control Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in Persian lime under field conditions. International Journal of Tropical Insect Science 32 (1):39-44.
Li DP, Holdom DG .1995. Effects of nutrients on colony Formation,
growth, and sporulation of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). J. Invert. Pathol. 65(3):253-260.
Li ZZ. 1988. List on the insect hosts of Beauveria bassiana . In: Study
and application of entomogenous fungi in China, Vol. 1. Beijing: Academic Periodical Press. pp 241-255.
Liu YH, Tsai H. 2000. Effect of the temperature on biology and life table
parameters of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri Kuwayama (Homoptera: Psyllidae). Ann. Appl. Biol. 137: 201-216.
Liu XZ, Chen SY .2002. Nutritional requirement of the nematophagous
fungus Hirsutella rhossiliensis. Biocontrol Sci. Technol. 12:381-393. Lecuona R, Loc CJ, Riba G, Joulie C, Juárez P. 1997. Spore germination
and hyphal growth of Beauveria sp. on insect lipids. Joumal of Economic Entomology 90(1): 119-123.
Lomer CJ, Bateman RP, Johnson DL, Langewald J, Thomas M. 2001.
Biological control of locusts and grasshoppers. Ann. Rev. Entomol. 46:667–702. López-Arroyo JI, Loera Gallardo J, Miranda Salcedo MA, Reyes Rosas
MA, Rocha Peña MA. 2004. Manejo integrado de plagas de cítricos. In: Memorias del Simposio Internacional Manejo Fitosanitario del Cultivo de los Cítricos. Sociedad Mexicana de Fitopatología. Julio de 2004. Veracruz, Ver.
López-Arroyo JI, Jasso J, Reyes MA, Loera-Gallardo J, Cortez-Mondaca
E, Miranda MA. 2009. Perspectives for biological control of Diaphorina citri
144
(Hemíptera: Psyllidae) in Mexico, pp. 329-330. In: Gottwald TR, Graham JH. Proceedings of the International Research Conference on Huanglongbing. Dec. 1-5, 2008. Orlando, Florida.
López-Arroyo JI, Díaz-Zorrilla U, Hernández-Fuentes LM, Cortez-
Mondaca E, Robles-González MM, Villanueva-Jiménez JA, Cabrera-Mireles H, Loera-Gallardo J, Fú-Castillo A, Varela-Fuentes S, Jasso-Argumedo J, Curti-Díaz S. 2010. Control químico del psílido asiático de los cítricos en México: selección de insecticidas y épocas de aplicación. pp. 449-461. En: López-Arroyo JI, González-LauckVW (Comp). Memoria:1er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Monterrey, N.L., México del 8 y 9 de diciembre, 2010. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite.
Luangsa-ard JJ, Hywel-Jones NL, Manoch L, Samson RA. 2005. On the
Relationships of Paecilomyces sect. Isarioidea species. Mycological Research 109: 581-589.
Mata-Villegas T. 2008. Evaluación de matrices de esporulación y
formulación de un bioinsecticida a base de esporas del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana.Tesis (Maestría), Instituto Politécnico Nacional. Tlaxcala, México.
McFarland CD, Hoy MA. 2001. Survival of Diaphorina citri (Homoptera:
Psyllidae) and its two parasitoids, Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) and Diaphorencyrtus aligarhensis (Hymenoptera: Encyrtidae), under different relative humidities and temperature regimes. Fla. Entomol. 84: 227-233.
Mellín-Rosas MA, Sánchez-González JA, Fabela-Rojas G, Cruz-Ávalos
AM, Arredondo-Bernal HC. 2009. Selección de cepas de hongos entomopatógenos como agentes de control microbiano de ninfas y adultos de Diaphorina citri (Hemiptera:Psyllidae), pp. 410-415. En: Zapata-Mata R, Contreras-Sánchez WM, Granados-Berber AA, Arriaga- Weiss SL (Eds). Memoria XXXII Congreso Nacional de Control Biológico. Villahermosa, Tabasco, México. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco.
Mellín-Rosas MA, Hernández-Betancourt I, Núñez-Camargo M,
Arredondo-Bernal HC. 2011. Efectividad de hongos entomopatógenos en el control del psílido de los cítricos Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) en Colima, pp: 367-372.En: López Arroyo JI, González-Lauck VW. (Comp). Memoria 2do Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Montecillo, Edo. de México, México. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM.
145
Méndez A, del Pozo E, García I. 2009. Producción masiva de Nomuraea rileyi (Farlow) Samson mediante una alternativa de cultivo bifásico. Rev. Protección Veg. 24(3):156-161.
Meyer JM, Hoy MA, Boucias DG. 2007. Morphological and molecular
characterization of a Hirsutella species infecting the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) in Florida. J. Invert. Pathol. 95: 101-109.
Meyer JM, Hoy MA, Boucias DG. 2008. Isolation and characterization of
an Isaria fumosorosea isolate infecting the Asian citrus psyllid in Florida. J. Invertebrate Pathology 99:96-102.
Michaud JP. 2001. Numerical response of Olla v-nigrum (Coleóptera:
Coccinellidae) to infestations of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) in Florida. Florida Entomol. 84: 608-612.
Michaud JP. 2002. Biological control of Asian citrus psyllid, Diaphorina
citri (Hemiptera: Psyllidae) in Florida: a preliminary report. Entomol. News. 113 (3): 2169-223.
Michaud JP. 2004. Natural mortality of Asian citrus psyllid (Homoptera:
Psyllidae) in central Florida. Biological Control 29: 260-269. Michaud JP, Olsen LE. 2004. Suitability of Asian citrus psyllid, Diaphorina
citri, as prey for ladybeetles. BioControl 49: 417-431. Milner RJ, Pereire RM. 2000. Microbial control of urban pest
cockroaches, ants and termites. In: Lacey LA, Kaya HK( eds). Field manual of techniques in invertebrate pathology. Kluwer Academic Publishers, Boston, pp: 721-740.
Monzón A. 2001. Producción, uso y control de calidad de hongos
entomopatógenos en Nicaragua. Manejo Integrado de Plagas. Costa Rica. 63: 95-103.
Moore E .1996. Fundamentals of the fungi. Prentice Hall, New Jersey,
USA. pp. 574. Mustafa U, Kaur G. 2010. Studies on extracellular enzyme production in
Beuaveria bassiana isolates. International Journal of Biotechnology and Biochemistry 6 (5): 701-713.
Obornik M, Jirku M, Dolezel D. 2001. Phylogeny of Mitosporic
Entomopathogenic Fungi: Is the Genus Paecilomyces polyphyletic? Canadian Journal of Microbiology 47:813-819.
146
Osborne LS, Landa Z. 1992. Biological control of whiteflies with entomopathogenic fungi. Florida Entomologist 75:456-471.
Padulla LFL, Alves SB. 2009. Suscetibilidad de ninfas de Diaphorina citri
a fungos entomopatogenicos. Arq. Inst. Biol., São Paulo 76(2):297-302. Papagianni M. 2004. Fungal morphology and metabolite production in
submerged mycelial processes. Biotechnol. Adv. 22:189-259. Pell JK, Vandenberg JD. 2002. Interactions Among the Aphid Diuraphis
noxia, the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus and the coccinellid Hippodamia convergens. Biocontrol Sci. and Technol. 12:217-224.
Pérez L, Ramírez C. 2000. Efecto de las variables, condiciones de la
fermentación y del sustrato en la producción de Trichoderma harzianum. Bogotá. Trabajo de grado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Carrera de Microbiología Industrial.
Pokorny D, Friedrich J, Cimermam A. 1994. Effect of nutritional factors on
lipase biosynthesis by Aspergillus niger. Biotech Lett. 16(363), 6. Posada-Flórez FJ. 2008. Production of Beauveria bassiana fungal spores
on rice to control the coffee berry borer, Hypothenemus hampei in Colombia. J. Insect Sci. 8(41):1-13.
Pruthi HS, Mani MS. 1945. Our knowledge of the insect and mite pests of
citrus in India and their control. Imperial Council of Agricultural Research, Scientific Monograph No. 16. Calcutta: Government of India Press. pp 1-42.
Quereshi JA, Stansly PA. 2007. Integrated approaches for managing the
Asian Citrus Psyllid Diaphorina citri (Homoptera: Psyllidae) in Florida. Proc. Florida State Hort. Soc. 120: 110-115.
Rajanikanth P, Subbaratnam GV, Rahaman SJ. 2011. Evaluation of
pathogenicity to Spodoptera litura Fabricius of different Beauveria bassiana Vuillemin isolates mass multiplied on economically viable substrates. International Journal of Bio-resource and Stress Management 2(3):293-297.
Reyes-Rosas MA, López-Arroyo JI, Loera-Gallardo J. 2010. Fluctuación
del hongo entomopatógeno Hirsutella citriformis en poblaciones del psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, en Río Bravo, Tamaulipas, México. pp: 302-310. En: López-Arroyo JI, González-Lauck VW. (Comp). Memoria:1er Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Monterrey, N.L., México del 8 y 9 de diciembre, 2010. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán.CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite.
147
Rivero-Aragón A, Grillo-Ravelo H. 2000. Natural enemies of Diaphorina citri Kuwayama (Homoptera: Psyllidae) in the central region of Cuba. Centro-Agrícola 27 (3): 87–88.
Rodríguez LA, Arredondo HC. 2007. Teoría y aplicación del control
biológico. Sociedad Mexicana de Control Biológico. México, D.F. pp. 303 Roncal T, Ugalde U. 2003. Conidiation induction in Penicillium. Res.
Microbiol. 154:539-546. Safavi SA, Shah FA, Pakdel AK, Reza-Rasoulian G, Bandani AR, Butt
TM. 2007. Effect of nutrition on growth ad virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. FEMS Microbiol. Lett. 270:116–123.
Samson RA. 1974. Paecilomyces and some allied Hyphomycetes. Stud.
Mycol. 6: 1-119. Samsináková A, Misiková S, Leopold J. 1971. Action of enzymatic
systems of Beauveria bassiana on the cuticle of the greater wax moth larvae (Galleria mellonella). Journal of Invertebrate Pathology 18: 322-330.
Samson R, Evans H, Latgé J. 1988. Atlas of Entomopathogenic Fungi.
Springer-Verlag, Berlin. 300 p. Sánchez-González JA, Sánchez-Borja M, Arredondo-Bernal HC. 2011.
Cría masiva, liberación y evaluación en campo de Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) pp.339-344. En: López-Arroyo JI, González-Lauck VW. (Comp). Memoria 2do Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Montecillo, Edo. de México, México. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán.CD-ROM.
Sánchez-González JA, Arredondo-Bernal HC. 2009. Entomófagos
asociados al psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri Kuwayama en el estado de Colima. pp. 364-368. En: Zapata MR, W.M. Contreras S., A.A. Granados B. y S. L. Arriaga W. (eds.), Memorias del XXXII Congreso Nacional de Control Biológico. 4 al 6 de noviembre de 2009. Villahermosa, Tabasco, México,
Sandoval-Coronado CF, Quintero-Zapata I, Maldonado-Blanco MG,
Elías-Santos M, Galán-Wong LJ. 2010. Producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en un medio de cultivo líquido a base de glucosa y peptona de colágena. pp:416-419. En: Coria-Ávalos VM, Lara-Chávez MBN, Orozco-Gutiérrez G, Muñoz-Flores HJ, Sánchez–Martínez R (Eds). Memoria XXXIII Congreso Nacional de Control Biológico. Michoacán, México, INIFAP-CIRPAC.
148
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA). 2011. http://www.senasica.gob.mx [Revisado el 11 de Octubre de 2011].
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASICA). 2012. http://www.senasica.gob.mx [Revisado el 9 de Enero de 2012].
Sahayaraj K, Karthick S. 2008. Mass production of entomopathogenic
fungi using agricultural products and byproducts. Afr .J. Biotechnol. 7(12):1907-1910.
Sharma R, Chisti Y, Banerjee U. 2001. Production, purification,
characterization, and applications of lipases. Biotechnol. Adv. 19:627-662. Skelley LH, Hoy MA. 2004. A synchronous rearing method for the Asian
citrus psyllid and its parasitoids in quarantine. Biol. Control 29: 14-23. Smith R, Grula J. 1981. Nutritional requirements for conidial germination
and hyphal growth of Beauveria bassiana. J. Invertebrate Pathol. 37:222-230. Smith P. 1993. Control of Bemisia tabaci and the potential of
Paecilomyces fumosoroseus as a biopesticide. Biocontrol News and Information 14:71-78.
Sparks TC, Pavloff AM, Rose RL, Clower DF. 1983. Temperature-toxicity
relationships of pyrethroids on Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) and Anthonomus grandis Boheman (Coleóptera: Curculionidae). J. Econ. Entomol. 76: 243-246.
Srinivasan R, Hoy MA, Singh R, Rogers ME. 2008. Laboratory and field
evaluations of silwet L-77 and kinetic alone and in combination with imidacloprid and abamectin for the management of the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Fla. Entomol. 91: 87-100.
St. Leger RJ, Charnley AK, Cooper RM. 1986. Cuticle-degrading
enzymes of entomopathogenic fungi: Mechanisms of interaction between pathogen and insect cuticle. J. Invertebr. Pathol.47: 295-302.
St. Leger RJ, Staples RC, Roberts DW. 1993. Entomopathogenic isolates
of Metarhizium anisopliae, Beauveria bassaiana and Aspergillus flavus produce multiple extracellular chitinase isoenzimes. J. Invertebr. Pathol. 61: 81–84.
St. Leger RJ, Joshi L, Bidochka MJ, Rizzo NW, Roberts D. 1996a.
Biochemical characterization and ultrastructural localization of two extracellular trypsins produced by Metarhizium anisopliae in infected insect cuticles. Appl. Environ. Microbiol. 62:1257-1264.
149
St. Leger RJ, Joshi L, Bidochka MJ and Roberts DW. 1996b. Characterization and ultrastructural localization of Metarhizium anisopliae, M. flavoviride and Beauveria bassiana during fungal invasion of host (Manduca sexta) cuticle. Appl. Environ. Microbiol. 62: 907-912.
St. Leger RJ, Roberts DW. 1997. Engineering improved
mycoinsecticides. Trends Biotechnol. 15: 83-87. Stauderman K, Avery P, Aristizábal L, Arthurs S. 2012. Evaluation of
Isaria fumosorosea (Hypocreales: Cordycipitaceae) for control of the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). Biocontrol Science and Technology 22 (7):747-761.
Sterk G, Heuts F, Merck N, Bock J. 2002. Sensitivity of non-target
arthropods and beneficial fungal species to chemical and biological plant protection products: Results of laboratory and semi-field trials. Proceedings first International Symposium on Biological Control of Arthropods, Honolulu, Hawaii, USA, January 14-18, pp. 306-313.
Subandiyah S, Nikoh N, Sato H, Wagiman F, Tsuyumyu S, Fukatsu T.
2000. Isolation and characterization of two entomopathogenic fungi attacking Diaphorina citri (Homóptera:Psylloidea) in Indonesia. Mycoscience 41: 509–513.
Tanada Y, Kaya H. 1993. Insect Pathology. Academic Press. San Diego,
California. (USA). 666 p. Téllez-Jurado A, Cruz-Ramírez MG, Mercado-Flores Y, Asaff-Torres A,
Arana-Cuenca A. 2009. Mecanismos de acción y respuesta en relación de hongos entomopatogenos e insectos. Revista Mexicana de Micología 30: 73-80.
Thomas DB. 2002. Trip report: Status of the brown citrus aphid in the
Mexican state of Campeche: April 2002. USDA-ARS. Kika de la Garza Subtropical Agriculture Research Center. Weslaco, Texas. pp.9.
Tsai JH, Liu YH. 2000. Biology of Diaphorina citri (Homóptera: Psyllidae)
on four host plants. J. Econ. Entomology 93: 1721-1725. Tsai JH, Wang JJ, Liu YH. 2002. Seasonal abundance of the Asian citrus
psyllid, Diaphorina citri (Homoptera: Psyllidae) in southern Florida. Fla. Entomologist 85: 446-451.
Toth SJ, Sparks TC. 1990. Effect of temperature on toxicity and
knockdown activity of cis-permethrin, esfenvalerate, and λ-cyhalothrin in the cabbage looper (Lepidoptera: Noctuidae). J. Econ. Entomol. 83: 342-346.
United States Department of Agriculture (USDA). 2012. http://
www.usda.gov [Revisado el 5 de Noviembre de 2012].
150
Vestergaard S, Gillespie AT, Butt TM, Schreiter G, Eilenberg J. 1995. Pathogenicity of the Hyphomycete fungi Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliae to the western thrips, Frankliniella occidentalis. Biocontrol Sci. Techn.5:185-192.
Vestergaard S, Cherry A, Keller S, Goettel M. 2003. Safety of
hyphomycete fungi as microbial control agents. In: Hokkanen HMT, Hajek AE. (eds). Environmental impacts of microbial insecticides. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. pp 35-62.
Vimala-Devi PS. 1994.Conidia production of the entomopathogenic
fungus, Nomuraea rileyi and its evaluation for control of Spodoptera litura (Fab.) on Ricinus communis. J. Invertebr. Pathol. 63 (2):145-150.
Volcy C, Pardo V. 1994. Principios de Micología. Centro de
Publicaciones, Universidad Nacional de Colombia. Sede Medellín. 141 p. Wessels JGH. 1999. Fungi in their own right. Fungal Genet. Biol. 27: 134-
145. Wraight S, Jackson M, Kock S. 2001. Production, stabilization and
formulation of fungal biocontrol agents. In: Butt TM, Jackson C, Magan N. (eds). Fungi as Biological Control Agent: Progress, Problems and Potencial. CABI Publishing Series. Wallingford, U.K. pp.253-280.
Wrona B, Gleason M. 2005. Effect of surface aminoacids on the growth of
Peltaster fructicola fungus associated with sooty blotch complex. J. Plant Protect. Res. 45:273-278.
Xie PH, Su C, Lin ZG. 1988. A preliminary study on an entomogenous
fungus Verticillium lecanii of Diaphorina citri Kuwayama (Hom.: Psyllidae). Chin. J. Biol. Control. 4 (2): 92.
Yang YM, Huang G, Andrew C, Beattie Y, Xia G, Ouyang, Xiong J. 2006.
Distribution, biology, ecology and control of the psyllid Diaphorina citri Kuwayama, a major pest of citrus: A status report for China. International Journal of Pest Management 52 (4): 343-352.
Zimmermann G. 2007a. Review on safety of the entomopathogenic fungi
Beauveria bassiana and Beauveria brongniartii. Biocontrol Sci. Techn. 17: 553-596.
Zimmermann G. 2007 b. Review on Safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Sci. Techn. 17:879-920.
Zimmermann G. 2008. The entomopathogenic fungi Isaria farinosa
(formerly Paecilomyces farinosus) and the Isaria fumosorosea species complex (formerly Paecilomyces fumosoroseus): biology, ecology and use in biological control Biocontrol Sci. Techn. 18 (9):865-901.
151
RESUMEN BIOGRÁFICO
Q.B.P Fátima Lizeth Gandarilla Pacheco
Candidato para el Grado de Doctor en Ciencias con Especialidad en Biotecnología
Tesis: Evaluación de aislados nativos de hongos entomopatógenos de zonas citrícolas sobre Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Campo de Estudio: Biotecnología y Calidad Alimentaria. Datos Personales: Nacido en Monterrey Nuevo León, el 15 de Septiembre de 1984, hija del Sr. Alberto Gandarilla Ramírez y la Sra. Ma. Isabel Pacheco Fernández. Educación: Egresado de la Facultad de Ciencias Biológicas, de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Grado obtenido: Químico Bacteriólogo Parasitólogo 2001-2007.
Experiencia Profesional:
Participación en el Proyecto: Análisis de la variabilidad genética de hongos entomopatógenos aislados de zonas citrícolas de México (Área VI, No. 46198). SEP-CONACYT 2004-01. 30 de junio de 2005 – 30 junio de 2009. Realizacion de tesis Doctoral: Evaluación de aislados nativos de hongos entomopatógenos de zonas citrícolas sobre Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Publicaciones
F.L. Gandarilla-Pacheco, H.D. Nava- González, Katiushka Arévalo-Niño, Luis Jesús
Galán Wong, Myriam Elías-Santos and Isela Quintero-Zapata. 2012. Evaluation of
native strains of Isaria fumosorosea (Wize) against Anastrepha ludens (Loew)
(Diptera: Tephritidae). Journal of Life Sciences 6(8): 957-960.
F.L. Gandarilla-Pacheco, K. Arévalo-Niño, L.J. Galán-Wong, C.F. Sandoval-Coronado, I. Quintero-Zapata. 2012. Evaluation of conidia production and mycelial growth in solid culture media from native strains of entomopathogenic fungi isolated from citrus- growing areas of Mexico. African Journal of Biotechnology 11(79): 14453-14460.
152
F.L.Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, L.J. Galán-Wong I. Quintero-Zapata. 2012. Patogenicidad de hongos entomopatógenos nativos de la zona citrícola de México sobre ninfas de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera:Psyllidae). Southwestern Entomologist. Aceptado.
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, L.J. Galán–Wong, R. Rodríguez-Guerra, I. Quintero-Zapata. 2012. Optimization of pathogenicity tests for selection of native strains of entomopathogenic fungi isolated from citrus-growing areas of México on adults of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Florida Entomologist. Enviado.
Memorias en Extenso
Gandarilla-Pacheco, F., Larralde-Corona, C.P., López-Arroyo, J.I., Lezama-Gutiérrez, R., Galán-Franco, L.A., Sandoval-Coronado, C. y Quintero-Zapata, I. 2006. Presencia de hongos entomopatógenos en suelos cultivados con citricos en el estado de Nuevo León. pp: 512-514. En: XXIX Congreso Nacional de Control Biológico. 9-10 de noviembre del 2006. Manzanillo, Colima. Sociedad Mexicana de Control Biológico. ISBN 978-968-5384-07-0 Gandarilla-Pacheco, F., Elías-Santos, M., Morales-Ramos, L.H., Morales-Loredo, A., Sandoval-Coronado, C.F., Quintero Zapta, I. y Galán Wong, L.J. 2006. Patogenicidad de cepas nativas de hongos entomopatógenos en larvas neonatas de Trichoplusia ni. pp: 515-517. En: XXIX Congreso Nacional de Control Biológico. 9-10 de noviembre del 2006. Manzanillo, Colima. Sociedad Mexicana de Control Biológico. ISBN 978-968-5384-07-0 F. Gandarilla-Pacheco, A. Morales-Loredo, L. Galán-Franco, C. Sandoval-Coronado, I. Quintero-Zapata. 2007. Actividad de cepas nativas de hongos entomopatógenos contra Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). 6(1):513-516. En: E.G. Estrada Venegas, A. Equihua Martínez, C. Luna León y J.L. Rosas Acevedo (eds). Entomología Mexicana 2007. VII Congreso Latinoamericano de Entomología. XLII Congreso Nacional de la SME. Acapulco, Guerrero, México. 17-21 de Junio de 2007. Soc. Mex. de Entomología A.C. ISBN 968839517-X. F. Gandarilla-Pacheco, I. Quintero-Zapata, L. Morales-Ramos, M. Elías-Santos, K. Arévalo-Niño. 2010. Aislamiento y evaluación de diferentes cepas nativas de Beauveria spp. en medios de cultivo líquido. pp:87-90. En: V.M. Coria Avalos, M.B. Lara Chávez, G. Orozco Gutiérrez, H.J. Muñoz Flores y R. Sánchez Martínez (eds). Memoria: XXXIII Congreso Nacional de Control Biológico. Uruapan, Michoacán, México. 10-12 noviembre 2010. ISBN 978-607-425-490-7. Gandarilla-Pacheco F.L., López-Arroyo J.I., Quintero-Zapata I., Rodríguez-Guerra R., Sandoval-Coronado C.F. 2010. Desarrollo de un método de bioensayo para la evaluación de hongos entomopatógenos contra adultos de Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae). pp:419-424. En: V.M. Coria Avalos, M.B. Lara Chávez, G. Orozco Gutiérrez, H.J. Muñoz Flores y R. Sánchez Martínez (eds). Memoria: XXXIII Congreso Nacional de Control Biológico. Uruapan, Michoacán, México. 10-12 noviembre 2010. ISBN 978-607-425-490-7.
153
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, I. Quintero-Zapata, R. Rodríguez–Guerra, C.F. Sandoval-Coronado. 2010. Bioensayos para la evaluación de hongos entomopatógenos contra ninfas de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). pp:327-332. En: López Arroyo, J.I., González Lauck, V.W. (Comp.). Memorias: 1er Simposio Nacional sobre investigación para el manejo del Psilido Asiático de los Cítricos y el Huanglobing en México. Monterrey, N.L. México. 8-9 de diciembre de 2010. ISBN en trámite. 479p.
F.L. Gandarilla Pacheco, I. Quintero Zapata, C.F. Sandoval Coronado, M. Elías Santos, L.J. Galán Wong. 2011. Selección de cepas nativas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin con actividad proteolítica y lipolitica en medios de cultivo sólido. Pp: 5-7. En: Javier Rivera De la Rosa y Mónica M. Alcalá Rodríguez (Ed). Congreso Internacional de Ingeniería Química 2011, Congreso de Innovación y Desarrollo de la Ingeniería Química 2011. Monterrey, N.L. México. 2-4 de noviembre de 2011. ISBN: 978-607-433-754-9.
F.L. Gandarilla Pacheco, I. Quintero Zapata, M. Elías Santos, M.S. Flores González, K. Arévalo Niño. 2011. Evaluación preliminar de la actividad enzimática de cepas nativas de Isaria fumosorosea Wize y su producción en medios de cultivo sólidos. Pp:8-10. En: Javier Rivera De la Rosa y Mónica M. Alcalá Rodríguez (Ed). Congreso Internacional de Ingeniería Química 2011, Congreso de Innovación y Desarrollo de la Ingeniería Química 2011. Monterrey, N.L. México. 2-4 de noviembre de 2011. ISBN: 978-607-433-754-9.
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, I. Quintero-Zapata, R. Rodríguez–Guerra, C.F. Sandoval-Coronado. 2011. Bioensayos para la evaluación de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin contra ninfas de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Pp: 135-140. En: Elías Santos M., Arévalo Niño K., Quintero Zapata I., Solis Rojas C., Sandoval Coronado C.F., Luna Olvera H.A., Pereyra Alférez B., Morales Ramos L.H., Maldonado Blanco M G. (Editores). En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico, Monterrey, N.L., México del 6-11 de noviembre de 2011. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN 978-607-433-800-3.
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, I. Quintero-Zapata, R. Rodríguez–Guerra, M. Elías Santos. 2011. Bioensayos para la evaluación de hongos entomopatógenos contra adultos de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Pp: 141-146. En: Elías Santos M., Arévalo Niño K., Quintero Zapata I., Solis Rojas C., Sandoval Coronado C.F., Luna Olvera H.A., Pereyra Alférez B., Morales Ramos L.H., Maldonado Blanco M G. (Editores). En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico, Monterrey, N.L., México del 6-11 de noviembre de 2011. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN 978-607-433-800-3. F.L. Gandarilla-Pacheco, I. Quintero-Zapata, L.J. Galán-Wong, M. Elías-Santos, M. del S. Flores-González. 2011. Producción de conidias de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin en diferentes medios de cultivo sólido. Pp: 147-151. En: Elías Santos M., Arévalo Niño K., Quintero Zapata I., Solis Rojas C., Sandoval Coronado C.F., Luna Olvera H.A., Pereyra Alférez B., Morales Ramos L.H., Maldonado Blanco M G. (Editores). En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico,
154
Monterrey, N.L., México del 6-11 de noviembre de 2011. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN 978-607-433-800-3.
R. Pérez-Rodríguez, I. Quintero-Zapata, F.L.Gandarilla-Pacheco, C.F. Sandoval-Coronado, C.B. López-Alvarado. 2011. Evaluación de grano de arroz como sustrato para la producción de conidias de cepas nativas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin. Pp: 152-156. En: Elías Santos M., Arévalo Niño K., Quintero Zapata I., Solis Rojas C., Sandoval Coronado C.F., Luna Olvera H.A., Pereyra Alférez B., Morales Ramos L.H., Maldonado Blanco M G. (Editores). En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico, Monterrey, N.L., México del 6-11 de noviembre de 2011. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN 978-607-433-800-3..
H.D. Nava- González, I. Quintero-Zapata, F.L. Gandarilla-Pacheco, K. Arévalo-Niño, L.H. Morales-Ramos. 2011. Evaluación de cepas nativas de Isaria fumosorosea contra Anastrepha ludens (loew) (Diptera: Tephritidae). Pp: 175-179. En: Elías Santos M., Arévalo Niño K., Quintero Zapata I., Solis Rojas C., Sandoval Coronado C.F., Luna Olvera H.A., Pereyra Alférez B., Morales Ramos L.H., Maldonado Blanco M G. (Editores). En: Memorias XXXIV Congreso Nacional de Control Biológico, Monterrey, N.L., México del 6-11 de noviembre de 2011. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN 978-607-433-800-3.
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, R. Rodríguez–Guerra, M. Elías-Santos, I. Quintero-Zapata. 2011. Evaluación de hongos entomopatógenos contra Diaphorina citri kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) en México. Pp: 373-383. In: López Arroyo, J. I., González Lauck, V.W. (Comp.). Memoria: 2.do Simposio Nacional sobre Investigación para el Manejo del Psílido Asiático de los Cítricos y el Huanglongbing en México, Montecillo, Edo. De México, México del 5 y 6 de diciembre, 2011. Centro Regional de Investigación del Noreste (CIRNE), Campo Experimental General Terán. CD-ROM. Memoria Científica. ISBN en trámite. 424p.
F.L. Gandarilla-Pacheco, K. Arévalo-Niño, C.F. Sandoval-Coronado, L.H. Morales-Ramos, I. Quintero-Zapata. 2012. Producción de conidias de Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith y Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales: Cordycipitaceae) mediante una alternativa de cultivo bifasico. Pp:490-493. En: Sansinenea-Royano E., Zumaquero-Rios L., Del Rincon Castro M.C. (Editores). En: Memorias XXXV Congreso Nacional de Control Biologico, Puebla, Pue., Mexico del 7-9 de noviembre de 2012. ISBN en trámite. F.L. Gandarilla-Pacheco, M.S Flores-Gonzalez, L.J. Galán-Wong, M.Elias-Santos, I. Quintero-Zapata. 2012. Evaluacion preliminar de la produccion de quitinasas de cepas nativas de Beuaveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales: Cordycipitaceae) en un medio de cultivo solido. Pp:494-497. En: Sansinenea-Royano E., Zumaquero-Rios L., Del Rincon Castro M.C. (Editores). En: Memorias XXXV Congreso Nacional de Control Biologico, Puebla, Pue., Mexico del 7-9 de noviembre de 2012. ISBN en trámite.
155
Abstracts
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, R. Rodríguez–Guerra, C.F. Sandoval-Coronado, I. Quintero-Zapata. Evaluation of entomopathogenic fungi isolates against Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in Mexico. 2nd. Annual Citrus Health Research Forum. Denver, Co. October, 4-6, 2011. Pp:18
F.L. Gandarilla-Pacheco, J.I. López-Arroyo, R. Rodríguez–Guerra, C.F. Sandoval-Coronado, I. Quintero-Zapata. Evaluation of entomopathogenic fungi isolated against Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) in Mexico. First Conference in Subtropical Biology. University of Texas-Pan American. Edinburg, Texas. Friday January 13th 2012. Pp: 36
H.D. Nava- González, F.L. Gandarilla-Pacheco, K. Arévalo-Niño, M. Elías-Santos, I. Quintero-Zapata. Evaluation of native strains of Isaria fumosorosea against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae) in Mexico. First Conference in Subtropical Biology. University of Texas-Pan American. Edinburg, Texas. Friday January 13th 2012. Pp: 36
F.L. Gandarilla-Pacheco, H.D. Nava- González, K. Arévalo-Niño, M.G. Maldonado-Blanco, I. Quintero -Zapata. Evaluation of native strains of Isaria fumosorosea (Wize) against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae) in Mexico. International Congress on Invertebrate Pathology and Microbial Control 45th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology August 5-9, 2012. Pp: 67 Asesoría de Tesis
Nombre del alumno: Héctor Daniel Nava González Carrera o Especialidad: Biólogo Titulo de la Tesis: Actividad de cepas nativas de Isaria fumosorosea Wize sobre Anastrepha ludens (Loew) (Diptera:Tephritidae) Fecha de titulación: Noviembre de 2012
Nombre del alumno: Ricardo Pérez Rodríguez Carrera o Especialidad: Químico Bacteriólogo Parasitólogo Titulo de la Tesis: Producción de conidias de cepas nativas de Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin en grano de arroz como sustrato Fecha de titulación: en desarrollo
African Journal of Biotechnology Vol. 11(79), pp. 14453-14460, 2 October, 2012 Available online at http://www.academicjournals.org/AJB DOI: 10.5897/AJB12.1658 ISSN 1684-5315 ©2012 Academic Journals
Full Length Research Paper
Evaluation of conidia production and mycelial growth in solid culture media from native strains of
entomopathogenic fungi isolated from citrus-growing areas of México
Fátima Lizeth Gandarilla-Pacheco, Katiushka Arévalo-Niño, Luis J. Galán-Wong, Carlos F. Sandoval Coronado and Isela Quintero-Zapata*
Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, Av. Manuel L.
Barragán Esq. Pedro de Alba S/N, Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N. L. México C. P. 66450.
Accepted 29 August, 2012
It is important to know the ability of native strains to carry out the process of sporulation and growth in different conditions and to determine their possible potential as biological control of pests of agricultural importance, mainly in citrus areas. The objective of this study was to evaluate five different solid culture media for the determination of the production of conidia and mycelial growth of twenty-five native isolates from the Mexican states of Sinaloa, San Luis Potosí, Nuevo León and Tamaulipas, and three collection strains using five different solid culture media. The results showed no statistical significant difference between the five media tested for the production of conidia per milliliter and mycelial growth among different isolates. However between isolates a significant difference was found. For conidia per milliliter, the isolate with the highest production of conidia was HIB-4 with an average of 4.85 x 10
9 (spores/ml). With respect to mycelial growth strain Ma presented the highest value with 8.06
cm on average. Key words: Entomopathogenic fungi, esporulation, conidia, mycelial growth.
INTRODUCTION Entomopathogenic fungi were defined as obligate or facultative parasites of insects with a high capacity for sporulation and survival, and its greatest advantages are handling, adaptation to different environments, specificity and ability to direct penetration through the integument (Allendes and López, 2007). Almost all insects are susceptible to some diseases caused by these fungi (Alean-Carreño, 2003; Rodríguez et al., 2006). Approxi-mately 100 genera and 700 known species of entomo-pathogenic fungi have been described, the most important may be mentioned genera Beauveria, Metarhizium, Paecilomyces, Lecanicillium, Hirsutella, Aschersonia, Erynia, Entomophthora, (Monzón, 2001; Asaff et al., 2002). Currently, worldwide, the most studied *Corresponding autor. E-mail: [email protected].
species of entomopathogenic fungi are Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae due to its efficiency and ease of propagation in different substrates (Allendes and López, 2007; Scholte et al., 2004).
A commercial level has developed a wide variety of agar formulations to induce sporulation and the growth of fungi; among the culture media commonly used we can found the Sabaroud dextrose agar (SDA), Malt extract agar (MEA) Nutrient agar (NA) Corn meal agar (CMA) Yeast peptone dextrose agar (YPDA), Potato dextrose agar (PDA), to name a few (Kamp and Bidochka, 2002). Most of these present a media composition based on source of carbon and one nitrogen which generally vary between them and in the proportions in which they are presented as well as in its origin which may be organic or inorganic.
While we have studied the production of spores in liquid culture media of different species of
14454 Afr. J. Biotechnol. entomopathogenic (Jackson et al., 1997; Derakhshan et al., 2008) and natural substrates such as rice, barley, oats, wheat and soybeans, among others (Figueroa et al., 2007; Posada-Flórez, 2008), the initial stages of isolation and morphological characterization of new isolates is still of vital importance for the use of plate assays because the understanding of essential aspects of fungal growth entomopathogenic can be very useful in projects for finding this microorganisms such as potential agents for managing of insect pests.
This detailed knowledge of the nutritional demands for growth and sporulation which are key elements in the stages of mass production and marketing will contribute in high proportion to the selection and continuous improvement of culture media and propagation methods suitable for large scale production of infective spores. In order to determine the ability of five different culture media commonly used in the laboratory to induce spo-rulation and mycelial growth in the present study we evaluated 25 native strains of three species of entomopathogenic fungi isolated from citrus-growing areas of México.
MATERIALS AND METHODS
Microorganisms
The native isolates of entomopathogenic fungi were obtained from citrus growing areas of México. The method used for isolation and characterization of the different species of entomopathogenic fungi were described by Galán-Franco et al. (2011). For this study were selected twenty-five isolates from the states of Sinaloa (B. bassiana: HIB-1, HIB-2, HIB-3, HIB-4, HIB-5, HIB-6, HIB-7, HIB-16, HIB-17,); San Luis Potosi (B. bassiana: HIB-8, Isaria fumosorosea: HIB-9); Nuevo León (B. bassiana: HIB-10; M. anisopliae: HIB-11, HIB-12; I. fumosorosea: HIB-20, HIB-21, HIB-26, HIB-29, HIB-30, HIB-33) and Tamaulipas (B. bassiana: HIB-13, HIB-14, HIB-15, HIB-18; I. fumosorosea: HIB-32), and three strains from to the collection of the Institute of Biotechnology, FCB-UANL (B. bassiana: GHA), (I. fumosorosea: Pfr-612), (M. anisopliae: Ma).
Preparation of inoculum
For each of the assessments we used the strains described before which were stored in cryogenic state (10% glycerol at -80°C) in the laboratory L-6 from the collection of the Institute of Biotechnology, FCB-UANL. Strains were thawed at room temperature in approximately 30 to 60 minutes, then were inoculated as streak in the potato dextrose- agar medium and allowed to incubate at 25 ± 2°C for a period of 14 days.
Culture medium
Medium A
Potato dextrose agar (PDA) DIBICO® formulates grams per liter of bidistilled water: agar 15.0, dextrose 20.0, potato infusion 4.0, pH 5.6 ± 0.2.
Medium B
Potato dextrose agar (PDA) DIBICO® formulates grams per liter of bidistilled water: agar 15.0, dextrose 20.0, potato infusion 4.0, pH 5.6 ± 0.2, supplemented with 0.5% casein peptone BIOXON®.
Medium C
Potato dextrose agar (PDA) DIBICO® formulates grams per liter of bidistilled water: agar 15.0, dextrose 20.0, potato infusion 4.0, pH 5.6 ± 0.2, supplemented with 0.5% yeast extract DIBICO®.
Medium D
Yeast dextrose agar: composed of anhydrous dextrose (4%) Jalmek®, yeast extract DIBICO® (1%) and bacteriological agar DIBICO® (1.5%).
Medium E
Sabouraud dextrose agar DIBICO® formulates grams per liter of bidistilled water: agar 15.0, dextrose 40.0, special peptone 10, pH 5.6 ± 0.2.
All solid media were prepared according to nutritive property adding 1000 ml of bidistilled water to each, sterilized at 121°C to 15 lbs. pressure for 15 min.
Inoculation media
For inoculation in each of the mediums described earlier were obtained uniform sizing each of the strains and placed in the center of 100 x 15 mm Petri dishes. We incubated at 25 ± 2°C for 14 days. Each of the culture media was assessed for triplicate.
Evaluating production of conidia
After 14 days of incubation in each culture medium, each strain was added 10 ml of bidistilled water with 0.1% Tween 80 and a bacteriological loop surface scraping was performed to obtain a concentrated solution of conidia. To determine its concentration, the total counts in a Neubauer chamber using dilutions from the concentrated solution was utilized.
Evaluating mycelial growth
After 14 days of incubation, the diameter of the colonies in centimeters using a vernier was measured.
Statistical analysis
The results were analyzed using IBM® SPSS ® v.19. Kolmogorov-Smirnov test was initially performed to verify the normality of the data. We performed a one-way analysis of variance (ANOVA) and a comparison of Scheffé means at the 0.05 significance level.
RESULTS
Conidial production and mycelial growth by effect of culture medium
The average production of conidia obtained in different culture media ranged from 6.7 x 10
6 to 5.8 x 10
9 spores/
ml, corresponding to the minimum being isolated HIB-3 in medium A (PDA) and the maximum for the HIB-4 isolated in the medium D (ADY). But according to the results of
the ANOVA, no significant difference (F = 0.817, df= 4 P = 0.517) exists between the five media tested for the production of conidia per milliliter between the different isolates (Table 1).
The average mycelial growth obtained in different culture media ranged from 3.13 to 8.50 centimeters, the minimum for the isolated HIB-18 in medium B (PDA supplemented with 0.5% peptone from casein) and the maximum strain in Ma media D and E (ADY, ADS). But according to the results of the ANOVA no significant
difference was found (F=1,087, df= 4, P= 0.366) between the five media evaluated for mycelial growth among different isolates (Table 2). Production of conidia and mycelial growth among isolates The average production of conidia obtained between isolates ranged from 1.85 x 10
7 to 4.85 x 10
9 spores/ml,
corresponding to the minimum being isolated HIB-3 and the maximum for the HIB-4 isolated. The comparison of conidia production of the different strains showed highly significant statistical differences between strains
(F=8,727; df=27, P≤0.0001). A test was performed for comparison of Scheffé means at 0.05 significance (Table 3) and it was found that HIB-4 strain had the highest conidia production between the strains tested with 4.85x10
9 spores / ml, while strains HIB-2, HIB-3 and HIB-
29 had the lowest production of conidia with 4.70x107,
1.85x107 and 1.95x10
7, respectively.
The average mycelial growth between strains ranged from 3.62 to 8.06 centimeters, the minimum for the isolated HIB-18 and the maximum strain Ma. The com-parison of mycelial growth among different isolates showed highly significant statistical difference between
strains (F=24,498; df=27, P≤0.0001). A test was per-formed for comparison of Scheffé means at 0.05 significance (Table 4), which showed that the Ma strain present the greatest mycelial growth with 8.06 cm while the HIB-18 strain had the lowest with 3.62 cm. DISCUSSION Sporulation is a process that involves the development of sexual or asexual spores and associated structures. It is considered that this mechanism of reproduction is controlled by genetic, hormonal, nutritional and environmental factors. The survival of fungal species depends in part on its ability to produce large quantities of viable conidia under different environmental conditions and even physical and nutritional requirements are more stringent than those required for mycelial growth (Moore,
Gandarilla-Pacheco et al. 14455 1996). For the development of sporulation there are two major nutrient requirements that are a source of carbon and nitrogen source which is required for synthesizing amino acids, proteins, and nucleic acids necessary for the construction of protoplasm (Pérez and Ramírez, 2000). Glucose is the carbon source most widely used by the fungi followed by fructose, mannose, galactose, sucrose, lactose, maltose and polysaccharides such as starch, cellulose, pectin (Griffin, 1996), chitin (Hegedus et al., 1990), trehalose, sorbitol and mannitol (Bidochka et al., 1990). The most nitrogen preferred sources by fungi are organic nitrogen as urea and casein hydrolyzate (Griffin, 1996), peptone (Humphreys et al., 1989), yeast (Hegedus et al., 1990) corn soaking liquid (Blachere et al., 1973) and casamino acids (Jackson et al., 1997). But it also mentions the use of inorganic sources of nitrogen (Bidochka et al., 1990).
In this study we evaluated the production of conidia and mycelial growth from 25 native strains of entomo-pathogenic fungi as a result of different culture media widely used in the laboratory to induce growth and sporulation of various types of fungi, potato dextrose agar and Sabouraud dextrose agar which include glucose as carbon source in different proportions and three modifications by the addition of casein peptone and yeast extract as nitrogen sources. In the results no significant difference in the production of conidia and mycelial growth among growth media were evaluated. There are several factors related to the nitrogen sources that might have influenced these results. For example, casein peptone is a pancreatic digest containing all the amino acids found in the casein; moreover of fractions peptic long, and some minerals such as calcium, magnesium, potassium and sodium in small quantities, however lacks a defined content of vitamins in composition, which may have some effect on the development of sporulation and the formation of reproductive structures that requires certain concentrations of minerals or vitamins (Griffin, 1996).
The yeast extract has proven to be a source of nitrogen more efficient in promoting the mycelial growth and sporulation, however, also been reported as a limiting factor for growth and sporulation depending on the concentration used. At low concentrations of yeast (0.25 to 0.50%) the mycelial growth is below the optimum and the sporulation is low while at very high concentrations of yeast (1.75 to 2%) the mycelial growth is high and this inhibits sporulation (Vimala-Devi, 1994). The lack or deficiency of certain growth factors such as vitamins or minerals, or the concentration of yeast extract used in this study that was 0.5 to 1% could have a significant impact for the production of conidia and mycelial growth.
In addition, Moore (1996) also mentioned that fungi may differ in their ability to use various sources of carbon and nitrogen for reproduction, since the mycelial growth and conidial production may be favored by mono-saccharides such as glucose or fructose, however some
14456 Afr. J. Biotechnol.
Table 1. Average production of conidia by the effect of different culture media tested at 14 days of incubation under laboratory conditions (25±2°C).
Strain code Culture medium (conidia/ml)
A B C D E
HIB-1 2.6x108 2.7x10
8 2.1x10
8 3.3x10
8 5.8x10
8
HIB-2 3x107 2.8x10
7 5.9x10
7 1.8x10
8 2.8x10
7
HIB-3 6.7x106 8.8x10
6 8.8x10
6 5x10
8 8.2x10
6
HIB-4 4.1x109 8.6x10
9 3.2x10
9 9.3x10
9 2.8x10
9
HIB-5 3.2x108 3.2x10
7 3.4x10
8 3.4x10
8 3.5x10
8
HIB-6 1.6x109 2.0x10
9 4.8x10
9 5.8x10
9 5.2x10
9
HIB-7 2.0x108 2.7x10
8 2.0x10
7 2.0x10
8 2.0x10
8
HIB-8 2.2x107 3.5x10
7 2.4x10
7 1.5x10
8 2.3x10
8
HIB-9 2.3x108 2.2x10
8 4.5x10
8 4.6x10
8 6.1x10
8
HIB-10 3.4x108 3.3x10
8 3.6x10
8 3.9x10
8 2.9x10
9
HIB-11 1.2x109 4.2x10
9 1.2x10
9 1.1x10
8 1.6x10
8
HIB-12 2.6x109 2.1x10
9 3.2x10
9 1.4x10
8 1.2x10
8
HIB-13 4.4x107 3.0x10
7 5.5x10
7 2.5x10
8 1.3x10
8
HIB-14 6.0x108 4.9x10
7 6.5x10
7 2.8x10
8 2.3x10
8
HIB-15 3.2x108 4.2x10
7 3.2x10
8 2.8x10
8 1.8x10
9
HIB-16 6.5x107 4.4x10
7 3.7x10
7 3.3x10
8 4.0x10
7
HIB-17 3.1x108 5.8x10
7 6.0x10
8 3.9x10
8 3.9x10
8
HIB-18 4.5x107 5.7x10
7 5.1x10
8 5.4x10
7 2.6x10
8
HIB-20 6.8x108 6.3x10
8 4.0x10
8 2.9x10
8 4.5x10
8
HIB-21 2.5x108 1.4x10
8 2.9x10
8 3.9x10
8 1.7x10
8
HIB-26 1.8x107 6.8x10
7 2.7x10
8 5.3x10
7 2.1x10
8
HIB-29 1.8x107 1.7x10
7 2.9x10
8 2.2x10
7 1.5x10
7
HIB-30 2.4x107 1.0x10
7 2.8x10
8 7.7x10
7 2.0x10
8
HIB-32 2.3x108 3.5x10
8 4.0x10
8 1.4x10
8 4.1x10
8
HIB-33 5.0x107 6.3x10
7 3.3x10
7 2.9x10
7 2.6x10
8
GHA 2.6x108 2.0x10
8 3.4x10
8 5.5x10
8 1.6x10
8
Pfr-612 1.05x108 1.0x10
8 1.82x10
8 1.66x10
8 2.0x10
8
Ma 6.4x108 3.4x10
8 1.8x10
8 1.8x10
8 1.3x10
8
Mean±SD 1.65x108±0.72 1.42x10
8±0.76 2.05x10
8±0.68 2.80x10
8±0.59 2.35x10
8±0.63
of the nitrogen sources which allow good mycelial growth do not favor sporulation, such as asparagine and the ammonium compounds that inhibit the mycelial growth and sporulation due to the accumulation of ammonia during the somatic growth, which alkalinized the medium inhibits this process.
Regarding the production of conidia and mycelial growth among different strains were found high significant differences in their ability to use different culture media. According to the results reported in this study, a strain of B. bassiana showed the highest conidia production between the strains tested, while two other strains of the same species showed the lowest levels which is consistent with that reported by James (2001) who observed an increase germination efficiency of B. bassiana and P. fumosoroseus with the addition of peptone and yeast extract. Smith and Grula (1981)
reported that B. bassiana requires exogenous carbon sources for germination and exogenous sources of nitrogen for the initial stages of hyphal growth and maintenance. Wrona and Gleason (2005) concluded that a carbon source can activate germination in some microorganisms, but a source of nitrogen is essential for germ tube elongation and hyphal growth. Some of the amino acids of said nutritional sources can induce the expression of genes which control the sporulation, as this process requires the activation of over 80 genes (Roncal and Ugalde, 2003).
The events related to fungal mycelial growth, that begins with the emergence of germ tube and end with the growing hyphae and branching to finally form a young mycelium, are also related to genetics and molecular regulation that determines the expression or repression of morphological features (Papagianni, 2004). Som
Gandarilla-Pacheco et al. 14457
Table 2. Average mycelial growth effect of different culture media tested at 14 days of incubation under laboratory conditions (25±2°C).
Strain code Culture medium (cm)
A B C D E
HIB-1 4.21 3.40 3.86 3.85 4.08
HIB-2 3.76 4.51 4.15 3.68 3.85
HIB-3 4.78 4.21 4.13
4.21 3.66
HIB-4 4.53 5.03 4.11 5.76 4.83
HIB-5 4.21 4.25 4.23 3.56 4.26
HIB-6 4.25 5.33 5.08 6.45 4.83
HIB-7 4.76 4.48 3.88 4.18 4.76
HIB-8 5.90 5.36 5.01 6.11 5.41
HIB-9 7.33 7.56 7.33 7.76 7.48
HIB-10 3.48 4.65 5.68 5.10 5.41
HIB-11 5.78 5.10 5.71 5.91 5.75
HIB-12 5.70 5.75 5.83 6.73 6.20
HIB-13 4.18 5.35 5.28 5.36 5.25
HIB-14 4.66 4.16 4.86 5.01 4.11
HIB-15 5.21 6.28 6.46 5.71 5.48
HIB-16 4.28 4.25 4.75 4.53 4.98
HIB-17 5.08 5.03 4.90 4.31 5.03
HIB-18 3.18 3.13 4.11 3.43 4.23
HIB-20 7.36 7.26 8.03 7.46 6.81
HIB-21 7.48 7.00 7.18 7.91 7.66
HIB-26 6.20 7.28 7.00 6.53 6.63
HIB-29 6.16 6.46 7.13 7.76 7.66
HIB-30 4.93 6.23 5.78 7.06 7.73
HIB-32 5.81 6.31 6.66 7.21 6.98
HIB-33 6.08 7.23 7.55 7.83 7.83
GHA 4.51 5.70 5.75 6.71 5.53
Pfr-612 4.08 5.73 7.08 6.75 5.95
Ma 7.81 7.70 7.80 8.50 8.50
Mean±SD 5.20±1.24 5.52±1.26 5.69±1.32 5.90±1.52 5.74±1.38
microorganisms do not require nitrogen sources to germinate. James (2001) reported that some isolates of M. anisopliae germinated very well when using glucose as the sole source of nutrition. Similarly Li and Holdom (1995) observed that M. anisopliae conidia germination were the same in both agar with a nitrogen source (individual amino acids) and glucose agar without any source of organic nitrogen, and even reported a good mycelial growth M. anisopliae on soluble starch for mass production, indicating that the response of each microorganism nutrient sources is different. These results coincides with the reported for the strain Ma of M. anisopliae which had the highest mycelial growth among different strains tested in this studied.
Several experiments have been devoted to elucidate the influence of nutrition on mycelial growth and spore production in order to choose the components and concentrations optimal to increase production on a large
scale. Gao and Liu (2010) examined the effects on growth and sporulation in liquid medium and solid for P. lilacinus and M. anisopliae using various combinations of carbon and nitrogen sources different, they concluded that the results were highly variable between strains and each strain present certain nutrition requirements for the development of mycelial growth and sporulation. Safavi et al. (2007), studied the effect of nutrition on the virulence of three isolates of B. bassiana and one of M. anisopliae culturing in seven culture media with different proportions of carbon/nitrogen (C / N). They reported that the mycelial growth and the production of conidia showed differences between different species and strains. Liu and Chen (2002) they found that some carbon and nitrogen sources were good for growth in liquid and solid for Hirsutella rhossiliensis, while some could not be utilized either in liquid or solid.
The present study and the above investigations have
14458 Afr. J. Biotechnol.
Table 3. Average yield of conidia per strain at 14 days of incubation under laboratory conditions (25±2°C).
Strains code Average yield of conidia per strain (conidia/ml)
HIB-1 3.10x108abc
HIB-2 4.70x107a
HIB-3 1.85x07a
HIB-4 4.85x109c
HIB-5 2.10x108abc
HIB-6 3.45x109bc
HIB-7 1.38x108abc
HIB-8 5.77x107ab
HIB-9 3.70x108abc
HIB-10 8.70x108abc
HIB-11 6.40x108abc
HIB-12 7.80x108abc
HIB-13 7.55x107ab
HIB-14 1.65x108abc
HIB-15 2.89x108abc
HIB-16 6.70x107ab
HIB-17 4.40x108abc
HIB-18 1.14x108abc
HIB-20 4.68x108abc
HIB-21 2.30x108abc
HIB-26 8.20x107abc
HIB-29 1.95x107a
HIB-30 1.00x108 abc
HIB-32 2.85x108abc
HIB-33 6.00x107ab
GHA 2.80x108abc
Pfr-612 1.45x108abc
Ma 2.50x108abc
Mean±SD 2.00x108±0.56
*Different letters represent significant differences in the Scheffé Multiple Range test (P≤0.05).
Table 4. Average radial growth per strain at 14 days of incubation under laboratory conditions (25 ± 2°C).
Strains code Average radial growth per strain (cm)
HIB-1 3.88ab
HIB-2 3.99abc
HIB-3 4.20abc
HIB-4 4.85abcde
HIB-5 4.10abc
HIB-6 5.19abcdefg
HIB-7 4.41abcd
HIB-8 5.56abcdefg
HIB-9 7.49gh
HIB-10 4.86abcde
HIB-11 5.65abcdefg
HIB-12 6.04bcdefgh
HIB-13 5.08abcdef
Gandarilla-Pacheco et al. 14459
Table 4 Contd.
HIB-14 4.56abcd
HIB-15 5.83abcdefgh
HIB-16 4.56abcd
HIB-17 4.87abcde
HIB-18 3.62a
HIB-20 7.38fgh
HIB-21 7.45fgh
HIB-26 6.71defgh
HIB-29 7.03efgh
HIB-30 6.35cdefgh
HIB-32 6.59defgh
HIB-33 7.30fgh
GHA 5.64abcdefg
Pfr-612 5.92abcdefgh
Ma 8.06h
Mean±SD 5.61±1.27
*Different letters represent significant differences in the Scheffé Multiple Range test (P≤0.05). sought help to elucidate the effect of different sources of carbon and nitrogen and the relationship between these elements as high factors impact on growth and sporulation of entomopathogenic fungal and aided the selection of the best strains that may have potential as biological control agents. ACKNOWLEDGEMENTS This research was supported with funds provided by the Project PAICYT GCN041-10 and PROMEP /103.5/09/1306, P/CA: UANL-CA- 11. REFERENCES Alean-Carreño I (2003). Evaluation of the pathogenicity of different
entomopathogenic fungi for control of the cassava whitefly Aleurotrachelus socialis Bondar (Homoptera:Aleyrodidae) under greenhouse. PhD dissertation, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia. pp. 33-52.
Allendes LG, Lopez EL (2007). Evaluation of eight native strains of Metarhizium anisopliae var. anisopliae (Metsch.) Sorokin for control of Aleurothrixus floccosus Maskell.. PhD dissertation, Pontifica Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. p. 40.
Asaff TA, Reyes VY, López EV, De la Torre M (2002). War between insects and microorganisms: a natural strategy for pest control. Avance yPerspectiva. 21:291-295.
Bidochka M, Low N, Khachatourians G (1990). Carbohydrate storage in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Appl. Environ. Microbiol. 56:3186-3190.
Blachère H, Calvez J, Ferron P, Corrieu G, Peringer P (1973). Etude de la formulation et de la conservation d'une preparation entomopathogime a base de blastospores de Beauveria tenella (Delacr. Siemaszko). Annales de Zoologie Ecologie Animale 5(1):69- 79.
Derakhshan A, Rabindra RJ, Ramanujam B, Rahimi M (2008). Evaluation of different media and methods of cultivation on the
production and viability of entomopathogenic fungi Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas. Pak. J. Biol. Sci. 11(11):1506-1509.
Figueroa LM, Varela A, Corredor D (2007). Evaluation of natural substrates for mass propagation of the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Revista de Investigación. 7(1):127-131.
Galán-Franco LA, Morales-Loredo A, Álvarez-Ojeda G, López-Arroyo JI, Arévalo-Niño K, Sandoval-Coronado C, Quintero-Zapata I (2011). Isolation and characterization of entomopathogenic fungi obtained from citrus-growing areas of Mexico. Southwestern Entomol. 36(4):443-449.
Hegedus D, Bidochka M, Khachatourians G (1990). Beauveria bassiana submerged conidia production in a defined medium containing chitin, two hexosamines or glucose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:641-647.
Humphreys AM, Matewele P, Trinci AP, Gillespie AT (1989). Effects of water activity on morphology, growth, and blastospore production of Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, and Paecilomyces farinosus in batch and fed batch culture. Mycol. Res. 92(3):257-264.
James R (2001). Effects of exogenous nutrients on conidial germination and virulence against the Silverleaf Whitefly for two hyphomycetes. J. Invertebrate Pathol. 77:99-107.
Jackson MA, McGuire MR, Lacey LA, Wraight SP (1997). Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus. Mycol. Res. 101(1):35-41.
Kamp AM, Bidochka MJ (2002). Conidium production by insect pathogenic fungi on commercially available agars. Lett. Appl. Microbiol. 35:74-77
Gao L, Liu X (2010). Nutritional requirements of mycelial growth and sporulation of several biocontrol fungi in submerged and on solid culture. Microbiol. 79(5):612–619.
Griffin DH (1996). Fungal physiology. John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, USA. pp.102-127, 260-279.
Monzón A (2001). Production, use and quality control of entomopathogenic fungi in Nicaragua. Manejo Integrado de Plagas. 63:95-103.
Moore E (1996). Fundamentals of the fungi. Prentice Hall, New Jersey, USA. pp. 574
Li DP, Holdom DG (1995). Effects of nutrients on colony Formation, growth, and sporulation of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). J. Invert. Pathol. 65(3):253-260.
Liu XZ, Chen SY (2002). Nutritional requirement of the nematophagous
fungus Hirsutella rhossiliensis. Biocontrol Sci. Technol. 12:381⎯393.
14460 Afr. J. Biotechnol. Papagianni M (2004). Fungal morphology and metabolite production in
submerged mycelial processes. Biotechnol. Adv. 22:189-259. Posada-Flórez FJ (2008). Production of Beauveria bassiana fungal
spores on rice to control the coffee berry borer Hypothenemus hampei in Colombia. J. Insect Sci. 8(41):1-13.
Pérez L, Ramírez C (2000). Effect of the variables, conditions of fermentation and the substrate in the production of Trichoderma harzianum. PhD dissertation, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia. p. 153.
Rodríguez MS, Gerding M, France A (2006). Selection of isolates of entomopathogenic fungi for control of eggs of the tomato moth, Tuta absoluta Meyrick (Lepidóptera: Gelechiidae). AgriculturaTécnica. 66(2):151-158.
Roncal T, Ugalde U (2003). Conidiation induction in Penicillium. Res. Microbiol. 154:539-546.
Safavi SA, Shah FA, Pakdel AK, Reza-Rasoulian G, Bandani AR, Butt TM (2007). Effect of nutrition on growth ad virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. FEMS Microbiol. Lett. 270:116–123.
Scholte EJ, Knols BGJ, Samson RA, Takken W (2004). Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review. J. Insect Sci. 4(19):24.
Smith R, Grula J (1981). Nutritional requirements for conidial
germination and hyphal growth of Beauveria bassiana. J. Invertebrate Pathol. 37:222-230.
Vimala-Devi PS (1994). Conidia production of the entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi and its evaluation for control of Spodoptera litura (Fab.) on Ricinus communis. J. Invert. Pathol. 63(2):145-150.
Wrona B, Gleason M (2005). Effect of surface aminoacids on the growth of Peltaster fructicola fungus associated with sooty blotch complex. J. Plant Protect. Res. 45:273-278.
Journal of Life Sciences 6 (2012) 957-960
Evaluation of Native Strains of Isaria fumosorosea (Wize)
Against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae)
Fátima Lizeth Gandarilla-Pacheco, Héctor Daniel Nava-González, Katiushka Arévalo-Niño, Luis Jesús
Galán-Wong, Myriam Elías-Santos and Isela Quintero-Zapata
Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza,
N.L. 66450, México
Received: March 15, 2012 / Accepted: April 27, 2012 / Published: August 30, 2012.
Abstract: We evaluated the pathogenicity of six strains I. fumosorosea to determine their potential as biological control agents of A. ludens by performing bioassays under laboratory conditions (25 ± 2 °C, 60 ± 5% R.H and 12:12 h L: D) exposing larvae and pupae to a concentration of 1 × 108 conidia per milliliter using three different methods: direct spraying, spray of soil and submerged for both instars. The results showed that direct spraying method Pfr-612 strain showed the highest mortality (47%) in pupae while for larvae was strain HIB-27 to 46%. Regarding spray of soil Pfr-612 strain showed the highest percentage of mortality for pupae and larvae with 45 and 57% mortality, respectively. Finally, for the submerged method in pupae HIB-27 strain showed 62% mortality whereas in larvae HIB-32 strain showed 46%. These results indicate that A. ludens is susceptible in at least two instars to I. fumosorosea and make this fungus a promising agent for control of the Mexican fruit fly. Key words: A. ludens, biological control, entomopathogenic fungi, I. fumosorosea.
1. Introduction
The Mexican fruit fly Anastrepha ludens (Loew)
(Diptera: Tephritidae) is a pest that seriously affect
fruit production in Mexico and other countries
Neotropical. This insect is considered one of the main
pests that affect fruit crops worldwide [1]. EI damage
is caused by larvae feeding on the pulp are
deteriorating galleries fruit and allowing the invasion
of other organisms such as fungi and bacteria that
increase the damage by rot, which causes premature
decline and loss of fruit. In Mexico, A. ludens is
distributed mainly in the production areas of mango,
orange, guava, apple and peach, covering 49.75% of
the country [2].
A. ludens is capable of causing direct damage
estimated at 30% loss in production, marketing and
Corresponding author: Isela Quintero-Zapata, Ph.D.,
professor, research field: agricultural biotechnology with accentuation in biological control with entomopathogenic fungi. E-mail: [email protected].
hinder due to the imposition of strict quarantine
barrier [3]. The battle of the fruit flies in Mexico is
conducted through various methods with a trend
toward integrated pest management, with the primary
methods of pest control are the legal, mechanical,
cultural, insect technique sterile, chemical and
biological [4]. Chemical control is based on the use of
bait insecticides to control adults and land application
of insecticides to kill larvae and newly emerged adults,
but this type of control causes high pollution and
mortality of beneficial insects [5-7].
Furthermore, the use of biological control offers
alternatives to avoid side effects by use of chemical
agents. Biological control of tephritid pest has been
primarily through mass releases of parasitoids
Diachasmimorpha longicaudata (Ashmead)
(Hymenoptera: Braconidae) and D. tryoni (Cameron)
(Hymenoptera: Braconidae) [8, 9]. So far, the
documentation of the activity of entomopathogenic
fungi against A. ludens in Mexico, little being reduced
Evaluation of Native Strains of Isaria fumosorosea (Wize) Against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae)
958
to the evaluation of Metharizium anisopliae strains
(Metschnikoff) Sorokin [10, 11], however, there are
no reports documenting the implementation of
methods to assess the pathogenicity of isolates of
other genera and/or species of entomopathogenic
fungi against the different stages of A. ludens in the
laboratory, therefore the objective of this study was to
determine the toxic activity of native strains of I.
fumosorosea in two stages of A. ludens.
2. Materials and Methods
Obtaining insects: The Mexican fruit fly,
Anastrepha ludens, used for these bioassays was
originated from our colony maintained in insect
breeding area at the Institute of Biotechnology of the
UANL, in Nuevo León, Mexico on artificial diet
under laboratory Conditions at 25 ± 2 °C, 60 ± 5%
R.H and 12:12 h L:D.
Activation of the strains: We used native strains of I.
fumosorosea isolated from citrus-growing areas in
Mexico (HIB-27, HIB-28, HIB-29, HIB and
HIB-30-32) and Pfr-612 from the collection of the
Institute of Biotechnology, FCB-UANL, stored in
cryogenic state (10% glycerol at – 80 °C). The strains
were thawed at room temperature were then
inoculated as a striated in potato dextrose agar (PDA)
and incubated at 28 °C for 14-21 days. Preparation of conidial suspension: After incubation
time for each strain was added 10 mL of bidistilled
water with 0.01% Tween-80 and adjusted to a
concentration of 1 × 108 conidia/mL in a Neubauer
chamber.
Preparing the soil: Different soil samples were
sieved and sterilized, placing 200 g in plastic
containers of 1,000 mL with 75% humidity.
Bioassays: Three methods were used for the
treatment of larvae and pupae:
Direct spray: We sprayed directly the pupae and
larvae with the conidia solution (1 × 108)
corresponding to each strain then larvae placed in
containers with sterile soil.
Submerged: Consisted of immersing larvae and
pupae for 30-35 seconds in the solution of conidia (1
× 108) then filtering the suspension with a thick paper
towel, then placed in containers with sterile soil.
Spray of soil: Sterilized soil was sprayed with the
conidia solution (1 × 108) corresponding to each strain.
Then add larvae and pupae of A. ludens to each
container with soil.
Incubation of bioassays: There were 15 repetitions
for each of the treatments included a control with
0.01% Tween 80 and an absolute control. All
containers, once covered were reversed, and
remained at 25 ± 2 °C for three days [12] to allow A.
ludens become infected with fungi [13, 14]. After
this time, larvae and pupae were extracted and placed
in Petri dishes (60 × 15 mm) in a chamber at
26-28 °C and a relative humidity of 60-65% for 7
days to encourage the development of mycosis and
check the mortality due to fungus. Reported the final
mortality rate in percentage for each of the
entomopathogenic fungi.
3. Results and Discussion
3.1 Bioassay with Pupae
For mortality of pupae of A. ludens strain that
produced the highest mortality was strain HIB-27
(62%) by the method of submerged, whereas the
remaining strains obtained values ranging between
22% and 47%. For soil spraying method, the strain
was highest death rate was the Pfr-612 strain (45%),
while the other strains yielded rates below 50%. For
the method of direct spray the strain obtained pupae
increased mortality rate was Pfr-612 (47%), while the
other strains ranged between 24% and 34% (Table 1).
The minimum values for bioassays with pupae of A.
ludens were recorded in controls (absolute = 0%,
Tween 80 = 15%).
3.2 Bioassay with Larvae
In the bioassay by the method of spraying soil
treatments evaluated caused an average mortality of
20-57% for larvae of A. ludens while Pfr-612 strain
Evaluation of Native Strains of Isaria fumosorosea (Wize) Against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae)
959
Table 1 Mortality of pupae of Anastrepha ludens caused by strains of Isaria fumosorosea under laboratory conditions (25 ± 2 °C, 60 ± 5% R.H and 12:12 h L:D).
Strain code Methods (percentage of final mortality)
Direct spray Spray of soil Submerged
HIB-27 34 44 62
HIB-28 30 32 31
HIB-29 29 35 33
HIB-30 24 34 22
HIB-32 30 26 22
Pfr-612 47 45 41
Absolute control 0 0 0
Tween 80 control 0 0 0
produced the highest mortality (57%). On the other
hand in the bioassay with the direct spray method
larvae HIB-27 strain caused higher mortality (46%),
whereas the remaining strains showed lower values
from 40 to 42%. Finally in the bioassay method of
submerged larvae, HIB-32 strain showed higher
mortality (46%) while the average mortality caused by
the different treatments evaluated are presented in the
range of 27-40% (Table 2). The minimum values for
larval bioassays were recorded in controls (absolute =
0%, Tween 80 = 0%).
In the bioassays described in this paper the results
show that A. ludens is susceptible in its larval stage to
I. fumosorosea. A study reports that in evaluating
seven different strains of entomopathogenic fungi on
Ceratitis capitata Wiedemann (Mediterranean fruit fly)
found that M. anisopliae and Paecilomyces
fumosoroseus (= I. fumosorosea) were the most
pathogenic fungi with LD50 values of 5.1 and 6.1× 103
Table 2 Mortality of larvae of Anastrepha ludens caused by strains of Isaria fumosorosea under laboratory conditions (25 ± 2 °C, 60 ± 5% R.H and 12:12 h L: D).
Strain code Methods (percentage of final mortality)
Direct spray Spray of soil Submerged
HIB-27 46 42 33
HIB-28 27 38 33
HIB-29 42 34 37
HIB-30 42 20 27
HIB-32 40 38 46
Pfr-612 41 57 40
Absolute control 0 0 0
Tween 80 control 0 0 0
conidia/fly, respectively [15]. Also to evaluate extracts
was reported that M. anisopliae was more toxic, with
a 90% mortality at a concentration of 25 mg of diet
and also fertility was reduced to 94 and 53%
respectively. Furthermore in other study evaluated the
susceptibility of A. ludens to Beauveria bassiana,
Metarhizium spp. and P. fumosoroseus with conidial
suspensions at a concentration of 1 × 108, finding that
Metarhizum spp. 100% of the pupae subjected to
bioassay showed invasion of the fungus, while in the
adult stage bioassays was observed in individuals
infected by hyphal growth of the fungus on the cuticle
of the same [16] consistent with other similar studies
who reported that at a concentration of 108 CFU/mL
showed a cumulative mortality of larvae and pupae of
A. ludens in a range of 37.5-98.75% [11].
4. Conclusions
According to the results need to be continued at
laboratory bioassays to determine the appropriate
concentration that causes mortality of larvae and
pupae of A. ludens, and the method of bioassay and
the use of native isolates of entomopathogenic fungi
for control of flies Mexican fruit.
Acknowledgments
The authors thank Mr. Feliciano Molina who
assisted with various aspects of this research.
References
[1] V. Hernández-Ortiz, M. Aluja, Listado de especies del
género neotropical Anastrepha (Díptera: Tephritidae) con
notas sobre su distribución y plantas hospederas, Folia
Entomológica Mexicana 88 (1993) 89-105.
[2] Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria (SENASICA) Home page, http://
www.senasica.gob.mx/?id=1002 (Accesed Jan. 9, 2012)
[3] J.I. López-Arroyo, M. Cruz-Fernández, J. Loera-Gallardo,
Reporte Anual de Investigación e Innovación
Tecnológica, Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales, Agrícolas y Pecuarias(INIFAP), 2007.
[4] M. Aluja, Bionomics and management of Anastrepha,
Annual Review of Entomology 39(1994) 155-178.
[5] D. Penrose, The 1989/1990 Mediterranean fruit fly
Evaluation of Native Strains of Isaria fumosorosea (Wize) Against Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae)
960
eradication program in California, in: M. Aluja, P. Liedo (Eds.), Fruit Flies: Biology and Management, Springer-Verlog, New York, 1993, pp. 441-446.
[6] N.E. Gary, E.C. Mussen, Impact of Mediterranean fruit fly malathion bait spray on honey bees, Environmental Entomology 13 (3) (1984) 711-717.
[7] R.H. Messing, Status and needs of biological control researcher for tephritid flies, in: B.A. McPheron, G.J. Steck(Eds.), Fruit Fly Pest: A World Assessment of Their Biology and Management, Lucie Press, Florida, USA, 1996, pp. 365-369.
[8] M.L. Martínez, H. Bravo, J. López, J.L. Leyva, J. Trujillo, Supervivencia y fecundidad de Diachasmimorpha longicaudata (Hymenóptera: Braconidae) parasitoide de la mosca de la fruta (Díptera: Tephritidae), Agrociencia 3 (1992) 53-67.
[9] P. Montoya, J. Cancino, Control Biológico por aumento en moscas de la fruta (Díptera: Tephritidae), Folia Entomológica Mexicana 43 (2004) 257-270.
[10] A.T.E. García, C.L. Messias, H.M.L. de Souza, A.E Piedrabuena, Patogenicidade de Metharizium anisopliae var. anisopliae a Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera:Tephritidae), Revista Brasileira de Entomología 28(1984) 421-424.
[11] R. Lezama-Gutiérrez, A. Trujillo-de la Luz, J. Molina-Ochoa, O. Rebolledo-Domínguez, A.R. Pescador, M. López-Edwards, et al., Virulence of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) on
Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae): Laboratory and Field Trials, Journal of Economic Entomology 93(4) (2000)1080-1084.
[12] S.P. Stock, B.M. Pryor|, H.K. Kaya, Distribution of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) in natural habitats in California, USA, Biodiv. Conserv. 8(1999) 535-549.
[13] J.L. Woodring, H.K. Kaya, Steinernematid and heterorhabditid nematodes: A handbook of techniques, Arkansas Agricultural Experiment Station, Fayatteville, Arkansas, USA, 1988.
[14] X. Fan, W.M. Hominick, Efficiency of the Galleria (wax moth) baiting technique for recovering infective stages of entomopathogenic rhabditids (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from sand and soil, Revue de Nématologie 14 (1991) 381-387.
[15] M.A. Castillo, P. Moya, E. Hernández, E. Primo-Yúfera, Susceptibility of Ceratitis capitata Wiedemann (Diptera: Tephritidae) to entomopathogenic fungi and their extract, Biological Control 19 (2000) 274-282.
[16] K. Arévalo-Niño, M.G. Rojas-Verde, A. Saucedo-Casados, L. Morales-Ramos, E. Huerta-Alemán, C. Solís-Rojas, Susceptibilidad de la mosca mexicana de la fruta Anastrepha ludens (Loew) (Díptera: Tephritidae) a hongos entomopatógenos: Beauveria bassiana, Metarhizium spp. y Paecilomyces fumosoroseus, en laboratorio, Entomología Mexicana 6(1) (2007)508-512.
Estimada Dra. Isela Quintero-Zapata: me es grato comunicarle que su
manuscrito ‘Patogenicidad de hongos entomopatógenos nativos de la zona citrícola
de México sobre ninfas de Diaphorina citri Kuwayama (Hemíptera: Psyllidae)’ de
los autores Fátima Lizeth Gandarilla-Pacheco, José I. López-Arroyo, Luis J. Galán-
Wong, e Isela Quintero-Zapata, ha sido aceptado para publicarse en la revista
Southwestern Entomologist, después de haber atendido las sugerencias hechas por
un par e revisores. Espero poder leer su nueva versión del manuscrito SWE#2276
pronto.
Sin más por el momento reciba un afectuosos saludo y le agradecemos
su interés de publicar su interesante trabajo en nuestra revista.
Atentamente,
Carlos A. Blanco, Editor asociado
[email protected] / [email protected]
Cc. Dr. Bonnie Pendleton, Editor-in-Chief