unidad 1 crecimiento microbiano

5/24/2018 Unidad 1 Crecimiento Microbiano

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MICROBIOLOGIA GENERAL

Presentado por:

Blga. Jessy Patricia Vsquez Chumbe

UNIDAD I

CRECIMIENTO MICROBIANO


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Visin Global del crecimiento

celular

CRECIMIENTOSe define como el incremento del nmero de clulas.

El crecimiento es un componente esencial de lafuncin microbiana, ya que la clula individual tieneun tiempo de vida determinado y la especie semantiene gracias al crecimiento continuo de la

poblacin celular.

Adems del conocimiento del crecimiento microbianoel control del crecimientoresulta til para el diseo demtodos de control de crecimiento microbiano.


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Visin Global del crecimiento

celular

La clula bacteriana es una mquina capaz de duplicarse asmisma. Estos procesos sintticos del crecimiento implican nomenos de 2000 reacciones bioqumicas de varios tipos, como

por ejemplo transformaciones de energa, sntesis de pequeas

molculas (unidades bsicas macromolculas), cofactores,enzimas necesarias para rxs enzimticas.

Sin embargo, las reacciones principales de sntesis celular son lasreacciones de polimerizacin, aquellas por las que se construyen

polmeros (macromolculas) a partir de monmeros. Ejm ADN,

ARN, protenas. Una vez fabricados estos, ocurren los acontecimientos finales

del crecimiento celular: ensamblajes de las macromolculas yformacin de estructuras celulares como pared celular,membrana citoplasmtica, flagelos, ribosomas, cuerpos deinclusin, complejos enzimticos, etc.


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F isin Binar ia

En la mayora de los procariotas, el crecimiento deuna clula individual contina hasta que se divide endos nuevas clulas, proceso denominado fisin

binaria.

EnE. coli, se observa que las clulas se alarganhastaaproximadamente el doble de longitud, desarrollandoun tabique transversal, que eventualmente separa a laclula en dos clulas hijas.

Este tabique se denomina septo y es el resultado delcrecimiento hacia dentro de la membranacitoplasmtica y pared celular desde direccionesopuestas.


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F isin Binar ia

Durante el ciclo del crecimiento, todos los constituyentescelulares incrementan en nmero de tal manera que cadaclula hija recibe un cromosoma completo y copiassuficientes de todas las macromolculas, monmeros e iones

inorgnicos que le permitirn vivir como clulaindependiente.

El tiempo requerido en bacterias para completar un ciclo decrecimiento es muy variable y dependiente de muchos

factores tanto nutricionales como genticos.

Bajo las mejores condiciones Escherichia coli puedecompletar su ciclo en unos 20 minutos; otras pueden hacerloms rpidamente, pero muchas le hacen ms lentamente.


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F isin Binar ia


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Crecimiento de poblaciones

Crecimiento, es el incremento del nmero de clulas enuna poblacin, que tambin puede medirse como unincremento en la masa microbiana.

La velocidad de crecimiento es el cambio de nmero declulas o masa celular por unidad de tiempo. Duranteeste ciclo todos los componentes estructurales de la

clula se duplican.El tiempo requerido para que una clula se divida en dosse denomina tiempo de generacin. Por tanto, es eltiempo que requiere una poblacin de clulas para

duplicarse.


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Ciclo de crecimiento de poblaciones

En un cultivo continuo o en batch, una curva decrecimiento tpica puede dividirse en fases:

FASE DE LATENCIACuando una poblacin se inocula en medio fresco, noocurre crecimiento inmediatamente, sino despus decierto tiempo que se llamafase de latencia.

Si un cultivo en fase exponencial se inocula exactamenteen el mismo medio, no se observa esta fase, sino quesigue creciendo exponencialmente.


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Si el inculo parte de un cultivo viejo, entonces tienelugar una fase de adaptacin, incluso si todas las clulas

presentes en el inculo son viables (capaces dereproducirse). Esto ocurre porque las clulas en estascondiciones, carecen de determinados componentesesenciales y tiene que transcurrir un cierto tiempo paraque proceda a su sntesis.

Tambin se requiere una fase de adaptacin cuando lasclulas han sido daadas mediante tratamientos porcalor, radiaciones, txicos, o cuando se transfieren de un

medio rico a uno pobre, etc.


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FASE EXPONENCIAL

Es la fase en donde una clula se divide en dos, stas en

otras dos y as sucesivamente.La mayora de los microorganismos unicelulares crecenexponencialmente, pero las velocidades de crecimientoexponencial pueden variar, por influencias de factores

ambientales, as como por las caractersticas genticas delmicroorganismo en cuestin.

En general los procariotas crecen ms rpidamente quelos eucariotas, los eucariotas pequeos ms rpido que

los grandes.


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FASE ESTACIONARIA

Es imposible mantener el crecimiento exponencialmente

indefinidamente, lo que habitualmente sucede es que, unnutriente esencialdel medio de cultivo se acaba, o algn

producto de desecho se acumula en el medio hastaalcanzar concentraciones inhibitorias. La poblacin en

estas condiciones alcanza lafase estacionaria.Es esta fase no hay incremento (o decremento) delnmero de clulas. Sin embargo, todava ocurren muchas

funciones celulares, incluyendo el metabolismo

energtico y algunos procesos biosintticos.


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En algunos microorganismos ocurre un crecimiento lentodurante la fase estacionaria, algunas clulas crecen yotras mueren, siendo el balance total ausencia deincremento en el nmero de clulas. Este fenmeno seconoce como crecimiento crptico.

Escherichia coli, tiene genes que son necesarios para lasupervivencia celular durante la fase estacionaria. Estosgenes denominados sur (por survival=supervivencia)tienen funciones an desconocidas, pero mutaciones enestos genes conducen rpidamente a muerte celular amedida que entran en fase estacionaria.


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FASE DE MUERTE

Si la incubacin contina despus que la poblacinalcance la fase estacionaria, las clulas deben permanecervivas y metablicamente activas, pero tambin debenmorir. Si lo ltimo ocurre, se dice que las clulas entranenfase de muerte.

En algunos casos la muerte va acompaada de lisiscelular.

La fase de muerte es tambin una funcin exponencial,pero la velocidad con que sucede es mucho ms lenta que

el crecimiento exponencial.


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Curva de crecimiento tpica para unapoblacin bacteriana.


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Tcnicas de evaluacin de

poblaciones microbianas

El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensinse puede llevar a cabo mediante el recuento celular(microscopa,

nmero de colonias), masa celular (peso seco, turbidimetra) oactividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin altamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dosapartados:

a) Mtodos directos

- Recuento del nmero de clulas en una cmara Thoma- Peso seco celular- Determinacin de nitrgeno o de protenas totales- Determinacin de DNA


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Tcnicas de evaluacin de

poblaciones microbianas

b) Mtodos indirectos:

- Recuento de colonias en placa

- Recuento sobre filtro de membrana- Consumo de oxgeno- Liberacin de dixido de carbono- Concentracin de un enzima constitutivo

- Decoloracin de un colorante- Incorporacin de precursores radiactivos- Medida de la turbidez


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Recuento total de clulas

El nmero de clulas de una poblacin puede medirse directamenteal microscopio.

El recuento en muestras lquidas requieren cmaras especiales derecuento, que tienen en su superficie una rejilla sobre la cul secoloca un volumen conocidode muestra. El nmero de clulas porunidad de rea de la rejilla se cuenta directamente en elmicroscopio, lo que nos da un nmero de clulas por unidad devolumen. Convertir este valor a nmero de clulas por mililitro de

suspensin se hace fcilmente: el valor obtenido por un valor deconversin.

El recuento microscpico directo es una manera rpida de estimarel nmero de clulas microbianas, sin embargo tiene una serie delimitaciones:


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Recuento total de clulas

1. Las clulas muertas no se distinguen de las vivas.2. Las clulas pequeas son difciles de ver al microscopio y

algunas de ellas probablemente no se cuentan.

3. Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisinpor este mtodo.

4. Requiere un microscopio de contraste de fases cuando lamuestra no es teida.

5. Este mtodo no es bueno para una suspensin de clulaspoca densa. En caso de bacterias si la suspensin tienemenos de 106clulas/ml se vern pocas clulas en campodel microscopio. Se puede mejorar el recuentoconcentrando por centrifugacin en un pequeo volumen.


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Recuento microscpicodirecto utilizando lacmara de Petroff-Hauser.


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Recuento en Hemacitmetro,cmara de Neubauer o Retculode Thoma.

El cuadrado central tiene unvolumen de 0.1 mm3. El nmerode clulas del cuadrado centralpor 10 dar el n de clulas en 1,0mm3. Este nmero multiplicadopor 1000 nos dar por 1,0 cm3 o

1,0 ml de cultivo. Si se hancontado solo 5 cuadrados de laparte central, el recuento debemultiplicarse por 5 x 104 paraobtener el recuento por ml.


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Recuento de viables

Se utiliza cuando se quiere contar solo clulas viables. Se define como clula viable, aquella capaz de dividirse para

dar lugar a descendencia. La forma de contarlo, es

determinando el nmero de clulas capaces de generarcolonias sobre la superficie de un medio slido. Por starazn al mtodo se le denomina recuento en placa orecuento de colonias.

Hay dos maneras de llevar a cabo este recuento: por siembra

en superficie o por vertido en placa. Para la siembra ensuperficie se utiliza 0,1 ml de inculo y para el vertido de0,1 a 1,0 ml.

Diluciones. El nmero de colonias por placa no debe sermuy elevado para poder contar y por otra parte no debe sermuy bajo para que el recuento tenga significado estadstico.


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Recuento de viables

FUENTES DE ERROR

El nmero de colonias de un recuento de viables depende deltamao del inculo, del medio de cultivo y la condiciones de

incubacin empleadas. El recuento de viables puede ser fuente de error muy grandes

de modo que hay que tomar con precaucin y replicar lasplacas de las diluciones claves. El resultado se expresa comoUFC en lugar de clulas viables ya que una UFC puede

contener ms de una clula. A pesar de las dificultades asociadas con el recuento, ste

procedimiento arroja la mejor informacin posible y por tantoes ampliamente utilizada. En industria de los alimentos,lecheras, medicina y microbiologa acutica, ste mtodo esempleado rutinariamente.


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Mtodos para realizar un recuento de viables. La muestra debeser previamente diluida.


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Procedimiento para contar viables uti l izando dil uciones ser iadas de

la muestra. El diluyente puede ser simplemente agua, pero una

solucin balanceada de sales puede dar mejores resultados. El

factor de dilucin es el recproco de la dilucin.


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Medidas de masa celular y turbidez

En algunos casos, es necesario estimar la masa de clulaspresente en el cultivo ms que el nmero de clulas.

Debido a que la masa celular es proporcional al nmerosepuede utilizar la determinacin de un parmetro paraestimar el otro.

Se puede medir la masa celular netapor centrifugacin deun volumen conocido y simplemente pesar el precipitado.

El procedimiento habitual es determinar el peso secodespus de secar las muestras durante una noche a 90-110C. La masa seca de las clulas bacterianas esaproximadamente entre el 10 al 20% de la masa hmeda.


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Un mtodo ms rpido y til, para obtener una estimacin del nmerode clulas o biomasa, consiste en la utilizacin de medidas deturbidez.

Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas dispersan laluz que atraviesa la suspensin. Cuntas ms clulas haya ms luz sedispersa y ms turbia aparece la suspensin.

La turbidez puede medirse con unfotmetroo un espectrofotmetro,aparatos que hacen pasar la luz a travs de una suspensin celular y

detectan la cantidad de luz no dispersada.(a)

La mayor diferencia entre estos dos instrumentos es que el fotmetroemplea un filtro simple(normalmente rojo, verde o azul) para generarluz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientrasque el espectrofotmetro emplea un prismao red de difraccin para

generar luz incidente de banda estrecha.


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Sin embargo ambos miden solamente luz no dispersadaexpresando los resultados en unidades fotomtricas. Ejm.Unidades de densidad ptica (DO)para espectrofotmetro.(a).

Para organismos unicelulares, las unidades fotomtricas DOson proporcionales (dentro de ciertos lmites) a la masacelular y tambin al nmero de clulas. Por tanto las medidasde turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otrosmtodos de recuento.

Sin embargo y antes de utilizar la turbidez como mtodo derecuento, hay que realizar una curva estndar que relacionemedidas directas (microscpicas o por recuento en placa) conlas indirectas. Tales curvas contienen datos para nmero declulas y masa celular, permitiendo la estimacin de ambos

parmetros a partir de una sola medida de la turbidez.


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A elevadas concentraciones de clulas, la luz dispersada de launidad detectora puede ser rescatada por otra (apareciendo a lafotoclula como si nunca se hubiese dispersado). Cuando ocurreesto, la correspondencia uno a uno entre nmero de clulas y

turbidez pierde linealidad.(c).

Sin embargo dentro de ciertos lmites, las medidas de turbidezpueden ser razonablemente precisasy adems tienen la virtud deser rpidas y fcilesde tomar.

Adicional a esto, las medidas de turbidez pueden tomarse sindistorsionar mucho las muestras, por sta razn se empleanampliamente para seguir el crecimiento de los cultivosmicrobianos. Se pueden medir repetidamente la misma muestra yconstruir grficos semilogartmicos para calcular tiempos de

generacin. (b).


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Medidas turbidimtr icas del crecimiento microbiano.

Las medidas se realizan en espectrofotmetro o fotmetro. La

fotoclula mide la luz incidente no dispersada por las clulas en

suspensin o da las lecturas en densidad ptica o unidadesfotomtricas.


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b) Curva de crecimiento tpica representada con datos en uni dades Klett para dos

organismos que crecen a velocidades diferentes.

c) Relacin entre el nmero de clulas o peso seco y sus lecturas en turbidimetra.

Ntese que la equi valencia se pierde a valores altos de turbidez.


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CINTICA DEL CRECIMIENTOMICROBIANO


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Generalidades

El objetivo de la biotecnologa es obtener productosmetablicos tiles a partir de materiales biolgicos.

La biotecnologa comprende dos fases distintas:fermentaciny recuperacinde los productos.

Para el cultivo de microorganismos y la produccin demetabolitos y enzimas a partir de los mismos, deben serdesarrolladosprocedimientos de fermentacin.

El procesamiento posterior recupera los productos porextraccin y purificacin, (separacin, destilacin,calentamiento, enfriamiento y desecacin, cromatografa,electroforesis).


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Generalidades

En los procesos de fermentacin la ingeniera es solamente unaayuda en el desarrollo del proceso, el centro de atencin son laregulacin de los procesos biolgicos y los microorganismos.

La manipulacin gentica, regulacin del metabolismo medianteoptimizacin del medio de cultivo y el suministro adecuado deoxgeno en condiciones estriles son solamente formas de dirigirlos procesos hacia el producto deseado.

Cuanto ms precisamente se conocen los procesos durante elcrecimiento y formacin del producto, mayor es la posibilidad deoperar los procesos de fermentacin racionalmente en lugar dehacerlo empricamente.


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Generalidades

Se necesita un entendimiento claro de la cintica delcrecimiento microbiano para predecir como va aevolucionar un cultivo, el consumo de sustrato y la

acumulacin de los productos, cuando se desea manejaradecuadamente un proceso a gran escala.


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Fermentacin discontinua

La fermentacin discontinua (batch) es considerada como unsistemacerrado.

A un tiempo cero t=0, la solucin esterilizada de nutrientes

se inocula con microorganismosy se permite que se lleve acabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin.A lo largo de la fermentacin no se aade nada, exceptooxgeno (aire), agente antiespumantey cidos o bases paracontrolar el pH.

La composicin del medio de cultivo, la concentracin de labiomasa y la concentracin de metabolitos cambiageneralmente en forma continua como resultado delmetabolismo de las clulas. En stas condiciones se observalas cuatro fases tpicas de crecimiento.


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En este tipo de fermentacin despus de la incubacin, seproduce un incremento de la biomasa hasta un valormximo denominado crecimiento total.

En este proceso se observa un crecimiento celularpropiamente dicho y aumento de clulas porautoduplicacin. La biomasa es un catalizador de unareaccin que produce ms biomasa idntica a la de partida.

En la Fig.1, se muestra un experimento de crecimientoexponencial. Cuando esto se representa en ejes de escalaaritmtica, se obtiene una curva caracterstica en la cul seva incrementando progresivamente la pendiente. Sinembargo obtener informacin sobre la velocidad de

crecimiento a partir de este tipo de curva es dficil.


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Tiempo (hr) N total clulas0 1

0.5 21 4

1.5 82 16

2.5 323 64

3.5 1284 256

4.5 5125 1 024

5.5 2 0486 4 096

6.5 8 1927 16 384

7.5 32 7688 65 536

8.5 131 0769 262 144

9.5 524 28810 1 048 576

Fg.1.-Datos representados en escala

aritmtica (izquierda) y en escalalogartmica (derecha).


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En la misma fgura se presenta el nmero de clulas enescala logartmica (base 10) frente al tiempo en escalaaritmtica (grfica semilogartmica) lo que da una lnearecta.

Los grficos semilogartmicos son convenientes y simplesde usar para la estimacin de tiempos de generacin a partirde resultados experimentales. El tiempo de generacin

puede leerse directamente a partir del grfico.

Una de las caractersticas del tiempo exponencial es que lavelocidad de incremento en el nmero de clulas es lentainicialmente, para despus incrementar constantemente enuna autntica explosin del nmero de clulas, como se

puede apreciar en la Fig. 1.


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Una implicacin prctica de todo esto es que cuando a unproducto no estril como la leche, se permite condicionesde crecimiento no controladas, unas pocas horas en fasestempranas de crecimiento exponencial la carga bacteriana

no tiene relevancia, pero ese mismo tiempo en fasestardas, tiene consecuencias desastrosaspara el mismo.


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Clculo de tiempos de generacin

Tiempo de generacin, es el tiempo que tarda un poblacinen duplicarse. Se puede definir tambin como la cantidadde tiempo requerida para completar un ciclo de divisin.

Para muchos propsitos, en microbiologa, es til conocerel tiempo de generacin de una poblacin microbianadurante el crecimiento exponencial, y se puede obtener deun anlisis matemtico de los datos del nmero de clulas,como se indica en la Fig 1 y 2.

Para poder cuantificar el aumento del n de clulas de lapoblacin, es importante limitarnos aqu a microorganismosque se multiplican por fisin binaria, tal como sucede conla mayora de bacterias.


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Tiempo (hr) N total clulas0 1

0.5 21 4

1.5 82 16

2.5 323 64

3.5 1284 256

4.5 5125 1 024

5.5 2 0486 4 096

6.5 8 1927 16 384

7.5 32 7688 65 536

8.5 131 0769 262 144

9.5 524 28810 1 048 576

Fg.1.-Datos representados en escala

aritmtica (izquierda) y en escalalogartmica (derecha).


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Fig. 2.-Mtodos de estimacinde los tiempos degeneracin de 6 y 2horas respectivamente,

a partir de grficossemilogartmicos. Lapendiente de cada lneaes 0,301/g.


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Si consideramos el crecimiento de una nica clula encondiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a sumultiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide deforma binaria, sigue una progresin geomtrica de base 2, es

decir:

20 21 22 23 .2n

Si la poblacin inicial, en vez de estar formada por una clula,

est formada porN0clulas, el nmero final de clulas que habren un momento dado (N1) depender, obviamente, del nmero degeneraciones que hayan tenido lugar (n), y ser:

N1= N0. 2n (1)


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Si tomamos logaritmos:

log N1= log N0+ n . log 2 (2)

Conociendo experimentalmente N0 y N1, el nmero degeneracionesnpuede determinarse por la ecuacin:

log N1 - log N0n= ________________ (3)

log 2

Como el log 2 es igual a 0,301, puede escribirse tambin:

n= 3,32 ( log N1 - log N0) (4)


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Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero degeneraciones que han tenido lugar en una poblacin que haincrementado su nmero de clulas de N0 a N1 . Es importanteresaltar que stas frmulas son vlidas para cualquier organismo

vivo que prolifere por divisin binaria. El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiempo

necesario para que N0 clulas se conviertan en N1. Este factor sique es caracterstico de cada microorganismo y puede variarenormemente de uno a otro. La introduccin del factor tiempo (t)

implica necesariamente la aparicin del concepto de velocidad demultiplicacin (R), o nmero de generaciones por unidad detiempo:

n

R = ------ (5)t


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Si el valor den se obtiene de la ecuacin (4), tenemos:

3,32 (log N1 - log N0)R = ------------------------------- (6)

t

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimientomicrobiano es el llamado tiempo de generacin g, que es eltiempo necesario para que se duplique la poblacin:

g = 1/R

g = t / n (7)


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EJERCICIOS

Calcular el tiempo de generacin con datos de la fgura 1 y 2.


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Velocidad de crecimiento

microbiano

El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modeloterico, que si bien posibilita una aproximacin interesante parala determinacin de una serie de parmetros que caracterizan alcrecimiento microbiano, presenta algunas limitaciones. Por ejm.

Hay que tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo sedividen, por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor degalgo mayor que el calculado a partir de la ecuacin (7).

Una aproximacin matemtica ms precisase basa en considerarel mismo sistema referido anteriormente, es decir, clulas

creciendo en condiciones no restrictivas, como un sistemaautocataltico y analizar los cambios que se producen en labiomasa en intervalos de tiempoen lugar de estudiar el promediode cambios en el nmero de clulas que tienen lugar a lo largo deun perodo de tiempo.


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microbiano

En estas condiciones, el aumento de biomasa a lo largo deltiempo es proporcional a la biomasa exi stente, por lo quesigue una cintica de una reaccin deprimer orden.

En trminos matemticos, esto puede expresarse como:

dN / dt = N ( 8 )

De aqu en adelante, N puede ser cualquier parmetro querefleje la biomasa, como el nmero de clulas, absorbancia(DO), cantidad de protenas, cantidad de cidos nucleicos, etc.Por otro lado, t es el tiempo y es una constante de

proporcionalidad que se denomina constante de la fase decrecimiento o velocidad especficade multiplicacin.


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microbiano

Si integramos la ecuacin (8) entre N0y N1, tenemos:

ln (N1/ N0) = t ( 9 )

Tambin con este planteamiento matemtico puede calcularseel tiempo de generacin, g, a partir de la ecuacin (9).Si gesel tiempo necesario para la duplicacin de la poblacin,tendremos queN1= 2N0 y t= g.Sustituyendo:

ln 2

ln 2= . g g = ------- = 0,693/ (10)


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microbiano

Si comparamos las ecuaciones (7) y (10):

g = 1/R g = 0,693/

Entonces: = 0,693 . R

Otra frmula:( ln N1ln N0)

= -----------------------------

(t - t0)


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microbiano

Con esto se demuestra que existe una correlacininversa entre el valor de la tasa de crecimiento y eltiempo de generacin.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser elnmero de clulas, masa celular, etc. despus de uncierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien

poder calcular la tasa de crecimiento a partir demedidas experimentales del incremento en el nmero

de clulas, biomasa, etc.

V l id d d i i t


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microbiano

EJERCICIOS

1. Calcular la velocidad especfica de crecimiento () con losdatos de la Fg. 1.

2. Calcule y g, con los siguientes datos:

Microorganismo: Escherichia coliMedio de cultivo: TSB

Longitud de onda: 540 nm

Los datos de clculo son las absorciones medidas en unespectrofotmetro, que se observan en la Tabla N1.

V l id d d i i t


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microbiano

Efectuar el clculo del tiempo de generacin y de la velocidad especfica

de crecimiento del microorganismo en el tramo de la fase exponencial.

Tabla N1.- Datos absorbancia Fig. N3.- Curva de crecimientode E. col i.

V l id d d i i t


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microbiano

3. Escherichia coli se desarrolla en un medio de cultivo a 37C,determinndose el peso seco (g/l) a diferentes tiempos comose muestra en la Tabla N2.

Tiempo(min)

Peso seco(g/l)

0 030 0.0160 0.0390 0.09

120 0.12150 0.25180 0.35210 0.45240 0.50300 0.55330 0.56

Calcule la velocidad especfica de

crecimiento y el tiempo de

generacin.

V l id d d i i t


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microbiano

4. Si la concentracin celular al inicio de un cultivo es 104cel/ml y despus de 4 horas se producen 108cel/ml. Calcularla velocidad especfica de crecimiento y el tiempo degeneracin.

5. Una bacteria tiene un tiempo de duplicacin de 3.5 horas. Sise inocula con 2 x 106 cel/ml en un fermentador, Cunto de

biomasa se producir despus de 26 horas de fermentacin?

F t i f l b l


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Factores que inf luyen sobre el

crecimiento microbiano

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

Otra pregunta interesante es si vara con la concentracindel sustrato de crecimiento ( [S] ). Si los valores de

obtenidos con diferentes concentraciones de sustrato serepresenta grficamente, se obtiene:


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En condiciones de sustrato abundante, la concentracin deeste no afecta el valor de , pero cuando el sustrato se hacelimitante, si existe ese efecto. La expresin matemtica querelaciona ambos parmetros se conoce con el nombre deecuacin de Monod.

En sta ecuacin la tasa de crecimiento o velocidad especficade crecimiento , depende de la mxima que puede alcanzarel microorganismo (m), de la concentracin de sustrato (S) yde un valor constante (Ks).

En la prctica, los valores de Kssuelen ser muy bajos, lo queindica que los microorganismos crecen con tasas () muy

prximas a las mximas (m) a concentraciones de sustratobajas y slo cuando estas son extremadamente bajas, lavelocidad de crecimiento se reduce.

Efecto de la concentracin de sustrato


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La curva obtenida es muy parecida a la descrita para lacatlisis enzimtica. Monoddemostr que la ecuacin de estacurva es:

[S]

= m. ------------ (11)Ks + [S]donde m es la velocidad especfica mxima de crecimiento

para valores de [S]no muy alejados de aquellos para los quedeja ser limitante para el crecimiento. Ks es la constante desaturacin, igual a la concentracin de sustrato que reduce la

velocidad especfica de crecimiento a m.

La ecuacin (11) se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-Menten para la cintica de los sistemas enzimticos. De estemodo tambin puede aplicarse el mtodo de Lineweaver-Burk

para la determinacin ms precisa de Ks y m.



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La ecuacin (11) puede expresarse tambin como:

1 Ks+ [S] 1 Ks 1

--- = ------------- = ---- ---- + --- (12) m . [S] [S] m m

Llevando a una grfica los valores de 1/ como ordenadas ylos de 1/ [S] como abscisas, puede calcularse la Ks (fig. 4).



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Fig. 4.- Determinacin de la Kspara un sustrato determinado.


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A la hora de establecer una relacin entre laconcentracin de sustrato y la tasa de crecimiento

bacteriana, es muy importante tener en cuenta que lasbacterias incorporan la mayora de nutrientes por

mecanismos de transporte activo o de translocacin degrupo. Ello implica que incluso cuando un nutrienteest notablemente diluido en el medio, suconcentracin citoplasmtica es mxima. Por ello,

bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya unam.

Si existe un exceso de todos los sustratos, entonces= my el cultivo se mantiene en la fase logartmicaa su velocidad mxima de crecimiento.



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La mde un microorganismo es un parmetro cinticobastante especfico de cada microorganismo, esnecesario su conocimiento e interesante no solo comouna de las pruebas de verificacin de la presencia de

microorganismosinvasoras

en un proceso defermentacin industrial, sino tambin evalua laimportancia de stas levaduras en el proceso. Porejemplo, si la m de sta levadura fuera bajo, sueliminacin del proceso sera ms fcil de aquella conm prximo al microorganismo responsable de la

fermentacin.

Es importante decir que la comparacin entre las mdevarias cepas debe ser realizada en las mismascondiciones de trabajo.



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RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS

Monod tambin demostr experimentalmente que

existe una relacin constante entre el crecimiento deun cultivo y la cantidad de sustrato utilizado:

dN/dt =Y dS/dt (13)

Donde Y es el llamado factor de produccin orendimiento de utilizacin del sustrato. Durante la faseexponencial:

Y=peso de biomasa producida (g) / peso de sustrato consumido (g)


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Rendimiento de cultivos

Es la cantidad de biomasa producida porunidad de substrato consumido (Y).

Es muy variable, desde un 20-50% parabacterias heterotrficas aerobias hasta un 2-4%

para anaerobias (metanobacterias), y refleja laeficiencia con que se genera ATP a partir deun substrato.


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Este grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc) de uncultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuyaconcentracin decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.



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TEMPERATURA

Cada microorganismo tiene una temperatura de

crecimiento adecuada.

Si consideramos la variacin de la velocidad decrecimiento en funcin de la temperatura de cultivo,

podemos observar una temperatura mnimapor debajode la cual no hay crecimiento; temperatura ptima a laque la velocidad es mxima. Por encima de estatemperatura, la velocidad de crecimiento decae

bruscamente y se produce la muerte celular.


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Temperatura

Cada microorganismo tiene una temperatura decrecimiento adecuada.

Si consideramos la variacin de la velocidad decrecimiento en funcin de la temperatura de cultivo,

podemos observar una temperatura mnimapor debajode la cual no hay crecimiento; temperatura ptima a la

que la velocidad es mxima. Por encima de estatemperatura, la velocidad de crecimiento decaebruscamente y se produce la muerte celular.


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Temperatura

El aumento de la velocidad de crecimiento con latemperatura se debe al incremento generalizado de lavelocidad de las reacciones enzimticas con la

temperatura. Lafalta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a

la reduccin de la velocidad de las reaccionesbioqumicas y a la formacin de cristales impidiendo el

funcionamiento de la membrana celular.

La muerte celular a altas temperaturas se debe a ladesnaturalizacin de protenas y a las alteraciones

producidas en las membranas lipdicas a esastemperaturas.


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Temperatura

Es importante tener en cuenta que atemperaturas bajas, el metabolismo celular es

lento y las clulas paran de crecer; aunquesuelen morir. Sin embargo, cuando latemperatura es superior a la ptima, se producela muerte celular rpidamente y las clulas no

pueden recuperar su capacidad de divisin sibaja posteriormente la temperatura.Esto permiteesterilizar por calory no por fro.


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Tipo demicroorganismo Temperaturamnima

Temperaturaptima

Temperaturamxima

Mesfilo 5 - 15 30 - 45 35 47

Psicrfilo -5 + 5 12 - 15 15 20

Psicrtrofo -5 + 5 25 - 30 30 35

Termfilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90


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pH

Es un parmetro crtico en el crecimiento demicroorganismos ya que cada uno de ellos tiene

un rango de pH en el que puede viviradecuadamente.

En general, las bacterias crecen con mayor

rapidez a pH comprendido entre 6,0 y 8,0; laslevaduras entre 4,5 y 6,0 y los hongosfilamentosos entre 3,5 y 4,0.


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pH

La capacidad del pH bajo para limitar el crecimientomicrobiano, ha sido aprovechada deliberadamente desdelos tiempos ms antiguos en la conservacin de alimentos,con la adicin de los cidos acticos y lctico.

En los alimentos con pH menores a 4.0, no se producecrecimiento de microorganismos patgenos o indicadores

de contaminacin fecal tales como, Salmonella spp.,Escherichia, coli, Staphylococcus coagulasa positiva,Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibriocholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, entre

otros.


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pH

Los microorganismos que pueden crecer a pHmenores de 2 se les denomina acidfilosy losque crecen por arriba de 10 alcalfilos.


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Nutrientes

Muchos microorganismos son capaces deutilizar de los alimentos los nutrientes y laenerga que requieren para su desarrollo y en

dependencia de los nutrientes que tenga unalimento en particular, ste se considerar demayor o menor riesgo.

Los nutrientes utilizados son el carbohidrato,nitrgenos, lpidos, factores de crecimiento.

Conclusiones factores que afectan el


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Conclusiones factores que afectan el


Los factores que influyen en el crecimientomicrobiano en los alimentos y por tanto lasasociaciones que se desarrollan, tambin

determinan la naturaleza de una alteracin en ellosy cualquier riesgo para la salud.

La longitud de la fase de latencia de crecimientopuede alargarse, si se controlan estos factores de

crecimiento. Tambin hay que tener en cuenta que para la

conservacin de los alimentos se realiza unacombinacin de factores .


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Potencial Redox

El potencial redox indica las relaciones de oxgenoentre los microorganismos y es utilizado paraespecificar el ambiente en que un microorganismo

es capaz de generar energa y sintetizar nuevasclulas.

Los microorganismos aerobios necesitan para

crecer valores redox positivos (presencia deoxgeno), mientras que los anaerobios requierenvalores redox negativos (ausencia de oxgeno).


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Potencial Redox

La mayora de los microorganismos importantespara la salud pblica en los alimentos, sonfacultativos, pueden crecer en presencia yausencia de oxgeno.

Una forma de reducir el crecimiento microbiano

es controlando la atmsfera de los alimentos,creando condiciones de anaerobiosis.


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Actividad de agua

Es el agua que se encuentra en los alimentos yno est ligada al soluto.

La mayora de los microorganismos yespecialmente las bacterias se desarrollan a Awcercanas a 1 (0.993-0.998).

A valores inferiores de Aw, la velocidad decrecimiento disminuye y la fase de latenciaaumenta, conservndose mejor los alimentos.


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Actividad de agua

Entre las prcticas ms frecuentes que haempleado el hombre para alargar la vida til deun alimento se encuentra la deshidratacin, como

es el proceso de salazonados (utilizando sal comosoluto para eliminar el agua de los alimentos,tales como carnes, pescados).

Tambin se han utilizado azcares para aumentarla presin osmtica del producto, este es el casode los dulces en almbar, las mermeladas, lasconservas de guayabas, mangos, etc.

d d d


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Actividad de agua

Los alimentos se pueden clasifican en funcin de

su Aw enperecederos (tienen una vida til cortay requieren refrigeracin para detener laproliferacin microbiana; semiperecederos,(tienen una vida til un poco ms larga que los

perecederos), y no perecederos (puedenconservarse a temperatura ambiente).

unidad 1 crecimiento microbiano

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