Una visión práctica del tipaje Rh(D)

en pacientes, donantes y gestantes

Prof. Dr. Carlos Cotorruelo

Laboratorio de Inmunohematología

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas

Universidad Nacional de Rosario

IDICER - CONICET

++++

+++

++

+

+/-

-

D Variante

TCI+

Reactividad del antígeno D con anti-D

D+ con alo anti-D

D Variante

D Variante

Variación cuantitativa

del Ag D

D Débil

Variación cualitativa

(cuantitativa) del Ag D

D Parcial D Débil D Parcial

D Débil D Parcial

D Débil D Parcial

D Parcial

D Débil

¿se sensibilizan al antígeno D?

D Variante

Variación cuantitativa

del Ag D

D Débil

Variación cualitativa

(cuantitativa) del Ag D

D Parcial D Débil D Parcial

D Débil D Parcial

D Débil D Parcial

D Parcial

D Débil

Variación cuantitativa del Ag D Variación cualitativa

(cuantitativa) del Ag D

.

. .

.

.

. .

EpD1 EpD6/7

EpD3 EpD4

EpD5 EpD8

EpD9

EpD2

Proteína RhD Ag D = conjunto de Epitopes D

D Débil D Parcial

D Positivo

. .

EpD3

EpD9

. EpD4 . .

. .

.

. .

EpD1 EpD6/7

EpD3 EpD4

EpD5 EpD8

EpD9

EpD2

.

. .

.

.

. .

D Negativo D Parcial

D Positivo D Débil

.

. .

.

.

. .

anti-D policlonal

D Negativo D Parcial

D Positivo D Débil

.

. .

.

.

. .

EpD6/7

anti-D policlonal

D Negativo D Parcial

D Positivo D Débil

.

. .

.

.

. .

Sin respuesta inmune

anti-D policlonal

D Negativo D Parcial

D Positivo D Débil

EpD 1-9 Anticuerpo Monoclonal

EpD1 LHM 169/81, LHM 70/45, LHM 174/102, BRAD-7

EpD2 P3x249, BS227, LOR12-E2, LORE

EpD3 H41, LHM 76/55, P3x290, LHM 76/59, LOR11-2D9, LOR29-F7

EpD4 LOR17-6C7, ESD1

EpD5 P3x241, P3x35, BS229, BS231, CLAS1-126, C205-29, AUB-2F7/FISS

EpD6/7

LOR17-8D3, P3AF6, MS201, P3x61, RUM-1, TH-28, LOR28-21D3, F5s, D89/47, LDM1, LHM 169/80,

HM16, HM10, LDM3, LHM 50/2b, 175-2; BS226; BS232; LHM57/17; BS221; BS228, H2D5D2F5, BRAD3,

17010C9, D10, NOI, BIRMA-D56, D90/7, L87.1G7, SAL20-12D5, BIRMA-DG3, SAL17-4E8, BTSN4, D-

90-17, B9A4B2, NaTH28-3C11, HM-92, HG/92, RAB.B15, HIRO-2, D90/12

EpD8 P3x21211F1, LHM 76/58, LHM 59/19, HIMA-36

EpD9 BIRMA-D6, P3G6, HIRO-4, HIRO-7, HIRO-8, LHM 77/64, MS26, ESD1M, P3x21223B10

EpD1

EpD6/7

EpD4

EpD9

EpD3

Ingeniería Genética

anti-D monoclonales

EpD II III IVa IVb Va DBT VI VII DFR

EpD1 + + - - - - - + -

EpD2 + + - - + - - + -

EpD3 + + - - + - + + +

EpD4 - + + - + - + + +

EpD5 + + + + - - - + -

EpD6/7 + + + + + + - + -

EpD8 + + + + + + - - -

EpD9 - + - - + - + + +

D Parcial Epitopes D

.

. .

.

.

. .

EpD1 EpD6/7

EpD3 EpD4

EpD5 EpD8

EpD9

EpD2

Detectan la variante DVI (DVI+)

No detectan la variante DVI (DVI-)

Donantes Pacientes - Embarazadas

DVI- y DVI+

D Negativo

D Positivo

D Variante

Reactivos

anti-D

Limitaciones

Diferenciar D Débil y D parcial

Identificar el fenotipo DEL

Detectar D parcial en individuos D+

D Variante

Donante

RN de madre D-

Paciente (receptor)

Embarazada

D positivo

D negativo

Expresiones débiles del Ag D

Discrepancias

Protección contra la aloinmunización anti-D

Recomendaciones

• Los profesionales implicados en el programa de profilaxis antenatal deben informar a la embarazada o a su médico tratante que es portadora de un grupo RhD negativo y, como tal, candidata al tratamiento con IgG anti-D de acuerdo con el calendario previsto.

• Si la aglutinación obtenida no se corresponde con la que habitualmente presentan las muestras RhD positivas, se recomienda catalogar la muestra de forma provisional como RhD negativa, hasta que un laboratorio de referencia determine definitivamente su carácter RhD positivo o RhD negativo.

Caracterización molecular del fenotipo D variante

La Biología Molecular permite resolver las limitaciones planteadas por la serología

RhD- E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

Organización genética del locus RH

RhD+ E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

gen RHD gen RHCE

E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

Locus RH

2 genes

cromosoma 1

en tándem

homólogos 92%

10 exones

Cajas Rhesus

enfrentados por sus extremos 3’

Proteína RhCE C/c y E/e . .

Proteína RhD Ag D

Epitopes D

.

. .

.

.

. .

Proteína RhD

RhD+

Ag D RhD-

Variantes D

Más de 400 alelos descriptos para el gen RHD

Fenotipo D negativo

Fenotipo D variante

gen RHD E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

.

. .

.

.

. .

EpD1 EpD6/7

EpD3 EpD4

EpD5 EpD8

EpD9

EpD2

Fenotipo D positivo

alelo D débil

alelo D parcial

alelo nulo

alelo DEL

alelo D parcial

Conjunto de alelos

Polimorfismo molecular

DELECIÓN GÉNICA: completa

SNPs: sustitución, deleción o inserción de uno o varios nucleótidos

CONVERSIÓN GÉNICA: transferencia de segmentos de ADN entre genes homólogos

Mecanismos

El conocimiento del evento genético responsable de cada

alelo permite su determinación por Biología Molecular

DUPLICACIONES: de varios nucleótidos o exones

Diferentes Alelos Cambio de AAs en la Proteína RhD Fenotipo D negativo

Fenotipo D variante

Fenotipo D positivo

otras

Algunas variantes D definidas por Biología Molecular

DII DHMi weak D type 1 weak D type 16

DIII DHMii weak D type 2 weak D type 17

DIV DHO weak D type 3 weak D type 18

DV DHQ weak D type 4 weak D type 19

DVI DHR weak D type 5 weak D type 20

DVII DUR weak D type 6 weak D type 21

DAR DMI weak D type 7 weak D type 22

DAR-E DNAK weak D type 8 weak D type 23

DAU DMH weak D type 9 weak D type 24

DBS DNB weak D type 10 weak D type 25

DCS DNS weak D type 11 weak D type 26

DBU DNT weak D type 12 weak D type 27

DB DNU weak D type 13 weak D type 28

DFR DOL weak D type 14 weak D type 29

DHAR DTO weak D type 15 weak D type 30

D débil tipo 1

D débil tipo 2

D débil tipo 3

ayuda a decidir la conducta transfusional u obstétrica Receptor

Gestante

Otros alelos RHD pueden ser susceptibles de aloinmunización

Evidencias clínicas

no son susceptibles de aloinmunización

Frecuencias de variantes D

70%

30% Otras

Poblacional: 0,8 %

D débil tipo 1

D débil tipo 2

D débil tipo 3

Estudio molecular del fenotipo D variante

Paciente embarazada cuyos GR reaccionan

débilmente con anti-D en medio salino. Con

la prueba de la antiglobulina indirecta se

observa una aglutinación de +++.

Paciente:

Determinación: Fenotipo Rh

Metodología: Hemaglutinación

Resultado: - expresión débil del antígeno D (fenotipo D variante)

- C(+), c(-), E(-), e(+)

Estudio molecular del fenotipo D variante

E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

D débil tipo 2

E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

D débil tipo 1

E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

D débil tipo 3

E1 E2 E4 E3 E7 E5 E6 E10 E9 E8

D débil tipo 4

Desarrollos “in house”

Equipos comerciales PCR alelo específica

D débil tipo 1

D débil tipo 2

D débil tipo 3

D débil tipo 4

. . . .

. . .

D débil tipo

1 2 3 4

Paciente:

Determinación: Fenotipo Rh

Metodología: Hemaglutinación

Resultado: - expresión débil del antígeno D (fenotipo D variante)

- C(+), c(-), E(-), e(+)

Determinación: Genotipificación RHD

Metodología: PCR alelo específica

Resultado: D débil tipo 1

Nota: no administrar inmunoprofilaxis anti-D (Transfusion 2015; 55:680-689).

Estudios de Biología Molecular Estudios serológicos

D variante

Genotipificación RHD

D débil tipo 1 D débil tipo 2 D débil tipo 3

Otros alelos RHD

No requiere inmunoprofilaxis Transfundir D positivo

Administrar inmunoprofilaxis Transfundir D negativo

Tipificación RhD

D Positivo D negativo

Protocolo para la tipificación RhD en pacientes y gestantes Sandler et al. Transfusion 2015; 55(3): 680-689.

D positivo

D débil tipo 1

D débil tipo 1

D débil

tipo 2

D débil tipo 2

D débil tipo 93

D débil tipo 2

DVI

D débil

tipo 2

D débil

tipo 4 DV

D débil

tipo 59

D débil

tipo 1

DVII

D débil

tipo 1

D débil

tipo 3

D débil

tipo 4

D débil tipo 93

D débil tipo 1

DVII

D débil

tipo 4

D débil

tipo 2

D Variante

Los estudios serológicos permiten identificar el fenotipo D variante

Los estudios moleculares son útiles para determinar la importancia clínica

de las variantes D

La caracterización molecular del fenotipo D variante permite implementar:

- una administración racional de la inmunoprofilaxis en las mujeres

embarazadas

- un uso adecuado de las unidades de sangre D negativas en los

Bancos de Sangre

Para recordar

muchas gracias