UN ANÁLISIS DE LA BIOLOGÍA DE SISTEMAS DE LOS CAMBIOS EN LA EXPRESIÓN GÉNICA A TRAVÉS DE SILENCIAMIENTO DE HPV-18 E1 EXPRESIÓN EN CÉLULAS HELA:

Abstracto

Estudios previos han informado de la detección de un mRNA E1 truncada genera a partir de

HPV-18 en células HeLa. Aunque no está claro si una proteína E1 truncada podría funcionar

como una helicasa replicativa para la replicación viral, todavía sería retener sitios de unión para

interacciones potenciales con diferentes proteínas de la célula huésped. Además, en este

estudio, encontramos pruebas en apoyo de expresión de larga duración contra el VPH-18 E1

mRNA en células HeLa. Para determinar si las interacciones entre E1 y proteínas celulares

desempeñan un papel importante en los procesos celulares distintas de la replicación viral, los

perfiles de expresión de todo el genoma de las células HeLa positivas HPV-18 se compararon

antes y después de la caída siRNA de expresión E1. Expresión diferencial de genes y el

análisis de enriquecimiento descubrieron cuatro conjuntos relacionados funcionalmente de los

genes implicados en los mecanismos de defensa del huésped contra la infección viral. Estos

incluyen los receptores de, interferón y la apoptosis vías toll-like, junto con el conjunto de genes

antivirales interferón-estimulado. Además, se encontró que los coactivador p300 de unión a

E1A-proteínas transcripcionales (EP300) se downregulated, que es interesante dado que

EP300 se cree que se requieren para la transcripción de genes HPV-18 en células HeLa. Los

cambios observados en la expresión génica producidos a través del silenciamiento de la

expresión de HPV-18 E1 en células HeLa indican que, además de su papel bien conocido en la

replicación viral, la proteína E1 puede también desempeñar un papel importante en la

mitigación de la capacidad del huésped para defenderse contra infección viral.

Palabras clave: virus del papiloma humano, la proteína HPV E1, siRNAs, células HeLa, el

análisis de microarrays, la proteína EP300.

2. Introducción

La Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer ha indicado que no hay pruebas

convincentes de que la infección con el virus del papiloma humano tipo 16 (HPV-16) y el VPH-

18 puede dar lugar a cáncer de cuello uterino, así como en los cánceres de vulva, vagina, pene

y ano [1]. ADN de VPH también se ha encontrado en los cánceres de la cavidad oral,

orofaringe, laringe, esófago y pulmón, y por lo tanto su asociación con cánceres del tracto

aerodigestivo superior también se ha sospechado [2 - cinco]. Además, el ADN de HPV se ha

detectado en líneas celulares derivadas de cánceres de cuello uterino: HPV-16 ADN en las

líneas celulares SiHa y CaSki, y HPV-18 ADN en las células HeLa [6 - nueve]. Debido a la

dificultad de establecer sistemas de cultivo de tejidos, que son susceptibles a la transformación

por el VPH, estas líneas celulares proporcionan sistemas únicos para estudiar la expresión de

HPV-16 y HPV-18 genes en células derivadas de tumores humanos.

En células HeLa, una línea celular de adenocarcinoma derivado de cuello uterino que contiene

múltiples copias de integrar ADN del VPH-18 [10 - 14], el VPH-18 primeros ARNm se

transcriben como ARN policistrónico [10], que dan lugar a tres especies de ARNm

diferencialmente empalmados [ 11, 12]. Estos primeros ARNm contienen información para la

traducción de tres posibles VPH-18 proteínas: E1, E6 y E7.Seedorf et al. [11] detectaron dos

proteínas tempranas-E7 (12 kDa) y una E1 truncada (70 kDa) -en células HeLa, tal como se

evaluó utilizando geles de poliacrilamida, después de selección de híbridos y análisis por

transferencia Western, en el que los tamaños fueron consistentes con los tamaños predichos

de la secuencia de ADN de VPH-18.

Abundante información está disponible en la proteína E7 y su papel tanto en el ciclo de

infección por el virus y la carcinogénesis. El E7 proteína viral puede inducir la inmortalización

de células mediante la unión a la pRb, una proteína supresora de tumores, que se une a e

inactiva el factor de transcripción E2F. E2F se libera de la pRb, lo que resulta en la

transcripción de genes implicados en la replicación del ADN y la división celular [15]. Además,

E1 es una proteína helicasa replicativa, que se une al host ADN polimerasa alfa-

primasa [16], proteína de replicación A [17] y de la topoisomerasa I de realizar la replicación

viral [18].Además, E1 también interactúa con los chaperones moleculares, Hsp40 y

Hsp70 [19], celular de proteínas-WD de repetición 80, que mantiene el genoma viral en los

queratinocitos [20], E / cdk2 complejo ciclina[21], y con las proteínas celulares implicados en

remodelación de la cromatina y la activación co-transcripción, tales como histona H1 [22] y

Ini1 / hSNF5, una subunidad de la cromatina SWI / SNF remodelación complejo [23]. Sin

embargo, todavía no se sabe si estas interacciones juegan un papel en los procesos celulares

distintas de la replicación viral.

Para determinar si estas posibles interacciones juegan un papel importante en los procesos

celulares distintas de la replicación viral, HPV-18 E1 mRNA, que se expresa de forma

endógena en las células HeLa, se silenciar utilizando secuencias de ARN corto de interferencia

(siRNAs). Posteriormente, se examinaron los cambios en la expresión de genes celulares

mediante el análisis de microarrays. Genes expresados diferencialmente se analizaron

mediante el enriquecimiento conjunto de genes con el fin de buscar conjuntos relacionados

funcionalmente de genes que pueden ser cambiados de forma coordinada en la E1 caída

ARNm

Corto secuencias de ARN de interferencia (siRNA) dirigidos contra el VPH-18 E1 mRNA

expresión en células HeLa.

3. Material y métodos

3.1. Líneas celulares

Tanto las células HeLa (ATCC: CCL-2), que son células VPH-18-positivas humanos cervical

adenocarcinoma, y células A549 (ATCC: CCL-185), que son células de adenocarcinoma de

pulmón humano-VPH negativo, se mantuvieron en medio esencial mínimo (MEM de Eagle,

Nissui Pharmaceutical Co., Tokio, Japón), suplementado con L (+) - glutamina (Wako, Japón) y

suero bovino fetal al 10%.

3.2. Cortas secuencias de ARN de interferencia

Seis siRNAs dirigidos contra el VPH-18 E1 ARNm (siE1.1-6) fueron seleccionados mediante un

algoritmo basado en las directrices elaboradas por Ui-Tei et al. [24] y el basado en la web

sistema de software en líneaSIDIRECT [25]. Las secuencias de moléculas de siRNA fueron

diseñados bajo las siguientes condiciones: A / U en el extremo 5 'de la hebra antisentido; G / C

en el extremo 5 'de la cadena con sentido; al menos cinco residuos de A / U en un tercio a

partir del extremo 5 'de la hebra antisentido; y la ausencia de más de nueve alineaciones

GC (tabla1). Estos seis siRNAs y siRNA no director de control (siCONTROL: 5'-UAG CGA CUA

AAC ACA UCA A-3 ') fueron sintetizados por Sigma servicio GenosyssiRNA (Sigma-Aldrich

Japan KK, Tokyo, Japón). 

3.3. La transfección de ARN de interferencia corto

ARN de interferencia corto fue entregado a HeLa o las células A549 utilizando el reactivo de

transfección Oligofectamine (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Brevemente, las células HeLa o A549 se sembraron a 10 4 células por pocillo en una

placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h en un 30-50% de confluencia. Para la

transfección, 4 l de Oligofectamine y 100 nM siRNA se diluyeron en Opti-MEM I medio reducido

de suero (Invitrogen) en un volumen final de 200 microlitros. Las células cultivadas en 0,8 ml de

Opti-MEM I se transfectaron con una solución mixta de siRNA, y 4 h después del cultivo se

suplementó con 0,5 ml de MEM y L (+) - glutamina que contenía suero bovino fetal 30%. Los

niveles de expresión de ARNm se examinaron después de 48 h de la transfección. El estado de

las células se cuantificó mediante tinción con azul de tripano (Gibco BRL) después de 48, 72 y

96 h de la transfección. Las transfecciones siRNA se repitieron después de 72 h con medios

cambiantes. El número de células de cada pocillo se cuantificó tres veces usando un

hemocitómetro (Burker-Turk profundas 1/10 mm; Erma, Tokio, Japón).

3.4. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR

El ARN total se extrajo usando un kit de extracción de ARN Isogen-LS (Nippon Gene, Tokio,

Japón). El ADN genómico fue retirado de preparaciones de ARN utilizando la DNasa I

recombinante libre de RNasa (Roche, Alemania) antes de la RT-PCR. Después de la

cuantificación de ARN utilizando el NanoDrop ND-1000 Espectrofotómetro (NanoDrop

Technologies), RNA de muestras fueron almacenadas a -20 ° C, hasta que se necesite para no

más de 2 días. Single-strand cDNAs fueron sintetizados a partir de los ARNm y se cuantificaron

utilizando el Kit de QuantiTectTM SYBR Green RT-PCR (Qiagen) y ABI Prism 7000 Sequence

Detection System (Applied Biosystems). Deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH gen)

se usó como un control interno para normalizar los niveles de expresión de

ADNc. GAPDH secuencias de los cebadores para avance y retroceso fueron 5'-TGA TGA CAT

CAA GAA GGT GGT GAA G-3 'y 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3 ',

respectivamente. Para cada gen diana, 1 l de cDNA se amplificó en un volumen total de 20 l

que contienen 2 x mezclas de reacción QuantiTect SYBR Green RT-PCR suplementado con

300 nM de cada cebador. Los datos se analizaron utilizando ABI PRISMA 7000 software SDS

(Applied Biosystems). Para todas las muestras, los puntos de cruce (CP) la expresión

normalizada del gen diana frente GAPDH se calcularon para cada muestra de tratamiento o

control [26] utilizando la siguiente fórmula: 2   - (muestra de tratamiento ΔCP - muestra de control ΔCP). Cada muestra

se ensayó tres veces.

3.5. Análisis de ARN-Seq

Datos de ARN-ss de un análisis del transcriptoma de células VPH-18 + HeLa [27] fueron

descargados de la Archivo de nucleótidos Europea (ENA; adhesión ERP000959). Secuencia

lee de este conjunto de datos se asigna a la secuencia de referencia completa del genoma de

HPV-18 (NCBI Refseq adhesión NC_001357) utilizando el programa B   OWTIE 2 [28]. VPH-18

niveles de expresión génica se cuantificaron con registro de10 valores de cobertura de

secuencia transformado los (es decir, número de etiquetas asignadas por posición) y asignan

lecturas se visualizaron lo largo de la secuencia del genoma del VPH-18 utilizando el

Integrativa Genómica Visor [29, 30].

3.6. Análisis de microarrays

Cualidades de ARN fueron examinados por electroforesis capilar utilizando el Agilent 2100

Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), y se confirmaron sus cualidades

(28S / 18S rRNA, E260 / E280 relación> 1,8). Análisis de microarrays (incluido el etiquetado, la

hibridación, la exploración de imagen y condiciones de la muestra) se llevó a cabo por Takara

Bio dragón Genomix Center (Mie, Japón).Brevemente, los ADNc marcados con fluorescencia

se generaron a partir de 200 ng de ARN total en cada reacción usando el kit de marcaje de

Agilent Amp rápida en dos colores. Los ADNc de cianina 5-etiquetados procedentes de las

células HeLa tratadas con siE1.6 se mezclaron con la misma cantidad de ADNc de color

inverso-cianina 3-etiquetados a partir de las células de control no tratadas y después se aplican

a toda una microarray Kit oligonucleótido genoma humano (Agilent Tecnologías), que contenían

41 000 genes humanos y transcripciones únicas. Estas transcripciones todos contenían

anotaciones de dominio público(http://www.chem.agilent.com/CAG/bsp/gene_lists.asp).

Tras la hibridación y lavado, el Agilent de doble láser de microarrays de ADN escáner escanea

los arrays.Los datos fueron extraídos de las imágenes utilizando el Agilent

F EATURE E XTRACTION v. 9.5 software y genes candidatos fueron seleccionados

utilizando GENESPRINGGX software (Agilent Technologies). Una normalización dependen de la

intensidad (LOWESS: regresión ponderada localmente) se aplicó a corregir artefactos

causados por las tasas de incorporación de colorante no lineales, así como las incoherencias

de la intensidad de fluorescencia relativa entre los colorantes rojos y verdes. Genes expresados

diferencialmente se identificaron mediante la comparación del registro 2 relación entre los

niveles de expresión entre las condiciones con las de registro general 2 señales de expresión

(logratio frente Iniciar Procesado de Señal, material complementario electrónico, figura S1).

3.7. Conjunto de genes de enriquecimiento de análisis

El potencial importancia funcional de los genes expresados diferencialmente se analizó

mediante análisis de enriquecimiento conjunto de genes mediante la combinación de la

herramienta ingenio Pathway Análisis(http://www.ingenuity.com/products/ipa) con análisis de

conjuntos de genes personalizados tomados de la literatura (electrónico material

complementario, figura S2) [31]. Para ello, el enriquecimiento de los genes expresados

diferencialmente en las vías, o conjuntos de genes funcionalmente coherentes, se determinó

mediante la prueba exacta de Fisher con el p-valor determinado como:

donde N es el número total de genes en el microarray, n es el número total de genes

expresados diferencialmente, m es el número total de genes en la vía y k es el número total de

genes expresados diferencialmente en la vía.

3.8. Validación de datos de microarrays

La validación de los datos de microarrays se realizó con un tiempo real de ensayo RT-PCR

para EP300 y el inhibidor de quinasa 1A (dependientes de ciclina CDKN1A) ARNm utilizando

tiempo real RT-PCR. El primer secuencias para EP300 adelante y atrás fueron 5'-CTC CAA

CTT TCT GCC ACA ACA-3 'y 5' CCA GAA TCC CTT CCC TTT CG-3 ',

respectivamente. Para CDKN1A, las secuencias de los cebadores directo e inverso fueron 5'-

GGA CCT GGA GAC TCT CA-3 y 5'-CCT CTT GGA GAA GAT CAG-3, respectivamente. El

nivel de transcripción de cada gen se determinó utilizando el Kit QuantiTectTM SYBR Green

RT-PCR (Qiagen) y ABI PRISMA 7000 SDS. GAPDH mRNA también se utilizó como control

interno para normalizar los niveles de expresión de ARNm.

4. Resultados

4.1. Expresión de un larga duración E1 ARNm y proteínas

Informes anteriores han mostrado evidencia que sugiere que los VPH-18 primeros genes E6,

E7 y E1 se transcriben como polycistron que termina dentro de la E1 ORF [10, 12]. Esto ha sido

tomado para indicar la producción de una proteína E1 truncada con atenuada actividad

replicación viral [14]. Sin embargo, el análisis de transferencia Western de HeLa extractos de

proteínas de células reveló una proteína de 70 kDa E1[11], que es coherente con el peso

molecular calculado a partir de la secuencia de la proteína E1 de longitud completa (73,75 kDa)

y sustancialmente mayor que el peso molecular calculado de la proteína correspondiente a la

transcripción E1 más corto (58,55 kDa). Para hacer frente a esta aparente contradicción, nos

re-evaluó el VPH-18 los patrones de expresión de genes a partir de datos de ARN-ss de un

análisis del transcriptoma más recientemente publicado de células HeLa [27]. Estos datos de

ARN-ss apoyan la expresión de una larga duración E1 ARNm transcrito, con la advertencia de

que, efectivamente, puede haber una mayor abundancia E6-E7-E1 polycistron que contiene

una secuencia más corta E1 (material complementario electrónico, figura S3). Esta secuencia

E1 más corto puede ser responsable de la retención de la previamente observada de

cofactores necesarios para iniciar la replicación de HPV-18 en células HeLa[14]. Sin embargo,

a la luz de los nuevos resultados sobre la expresión E1 mRNA y los resultados anteriores sobre

E1 expresión de la proteína [11], llegamos a la conclusión de que las células HeLa son de

hecho capaz de producir de larga duración E1 producto proteico.

Efectos de moléculas de siRNA sobre la expresión endógena HPV18-E1 y el número de células

HeLa. (Un) Seis siRNAs dirigidos a mRNA HPV18-E1 endógena (siE1.1, siE1.2, siE1.3, siE1.4,

siE1.5 y siE1.6) se transfectaron en 100 nM durante 48 h. Los mRNAs fueron sintetizados a

partir de ADNc de una sola hebra y se cuantificaron utilizando el Kit de QuantiTectTM SYBR

Green RT-PCR (Qiagen) y ABI PRISMA 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)

según las instrucciones de los fabricantes. GAPDH se utilizó como control interno para

normalizar los niveles de expresión de ADNc. siRNA siE1.2 y moléculas siE1.6 mostraron

silenciamiento fuerte y específica de la expresión endógena HPV18-E1 en células

HeLa. Además, el siCONTROL no mostró ningún efecto sobre la expresión E1

endógeno. (B) En las células HeLa, el número de células se redujo después de la transfección

de ARNsi siE1.2 y siE1.6 comparación con las células HeLa sin siRNA transfección. (C) En las

células A549-VPH negativo, el número de células no mostraron ningún efecto después de

transfecciones siRNA. Además, la siCONTROL mostró un efecto negativo en el número de

células en ambas líneas celulares. El número de células se cuantificó mediante tinción con azul

de tripano (Gibco BRL) después de 48, 72 y 96 h. El número de células en cada pocillo se

cuantificó tres veces usando un hemocitómetro (Burker-Turk profundas 1/10 mm; Erma, Tokio,

Japón). NTC, los controles sin tratamiento.

4.2. Tanto siE1.2 y siE1.6 moléculas silenciados específicamente el VPH-18 E1 endógeno expresión de mRNA en células HeLa

En primer lugar, HPV-18 E1 expresión de ARNm en células HeLa se cuantificó utilizando en

tiempo real de RT-PCR (Figura   1  una). GAPDH expresión se utilizó como control interno para

normalizar E1 mRNA expresión. A continuación, E1 expresión de ARNm se cuantificó después

de 48 h de transfección para cada siRNA. Como se muestra en la figura 2 una, E1 mRNA

expresión fue fuertemente suprimida por siE1.2 y siE1.6 moléculas, y los efectos de siE1.1,

siE1.3, siE1.4 y siE1.5 moléculas eran moderados en células HeLa. La transfección de la

molécula siCONTROL no afectó a la E1 expresión del ARNm. Además, el número de células

HeLa se redujo después de la transfección de siE1.2 y siE1.6 moléculas en comparación con el

control no tratado (células sin siRNA transfección) (figura   1  b). Por el contrario, el número de

células A549 no se redujo después de la transfección de siE1.2 y moléculas siE1.6

siRNA (figura   1  c). La transfección de la molécula siCONTROL disminuyó el número de células

en ambas líneas celulares.Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la transfección

de ambas moléculas siE1.2 y siE1.6 podría silenciar E1 expresión de ARNm en células HeLa y

disminuir el número de células por una décima parte.

El enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente en cuatro conjuntos de genes

estrechamente relacionados, incluyendo tres vías canónicas y un grupo funcional: la vía de

señalización TLR, vía de señalización IFN, ISG antiviral y la vía de la apoptosis. El número de

genes upregulated y downregulated en células HeLa silenciadas-E1 se muestran en la misma

escala que la ración de upregulated / genes downregulated y-registro normalizado p-valores

para el análisis conjunto de enriquecimiento de genes.

4.3. Análisis de datos de expresión identificado 2669 genes celulares expresados diferencialmente después de silenciar E1 ARNm endógenos en células HeLa

El perfil de expresión génica celular de células HeLa se comparó antes y después siE1.6

transfección mediante el análisis de microarrays Agilent oligonucleótido humana, que contenía

41 000 únicas transcripciones de genes humanos. Los datos de microarrays se normalizaron y

la calidad de los datos se evaluó. A nivel mundial, 2669 genes expresados diferencialmente con

registro de 2 se identificaron ≥ 1, que comprende 1718 genes downregulated upregulated y

951. El potencial importancia biológica de estos genes expresados diferencialmente se evaluó

mediante el análisis conjunto de enriquecimiento de genes. Tras el VPH-18 E1 silenciamiento,

encontramos un enriquecimiento significativo (p <0.05, de la prueba exacta de Fisher) de los

genes expresados diferencialmente en cuatro conjuntos de genes estrechamente relacionados,

incluyendo tres vías canónicas y un grupo funcional: el receptor de tipo Toll (TLR) vía de

señalización , el interferón (IFN) vía de señalización, los genes antivirales de interferón-

estimulado (ISG) y la vía de la apoptosis (figura   2  y tabla2). Además, la mayoría de los genes

en estos conjuntos se upregulated después de silenciamiento E1 (figuras  2 y y3). 

Nuestros resultados también mostraron una supresión significativa de la EP300 expresión

(cambio -2,20 veces). Por otra parte, un conjunto de genes de ciclina, tales

como E2 (CCNE2), A2 (CCNA2) y B2(CCNB2), mostró menor expresión. Otros genes

reprimidos relacionados con el ciclo celular incluyen retinoblastoma 1 (RB1), inhibidor de la

quinasa dependiente de ciclina 1B (CDKN1B), Polo-quinasa 1(Plk1), ciclo de división celular 25

homólogo C (Cdc25C), ciclo de división celular 2 (CDC2 ), miembros de la familia y Smad

2 (SMAD2) y 4 (SMAD4). Por el contrario, la CDKN1A gen mostraron una puntuación más alta

de la sobreexpresión (modificar 2,14 veces). La ciclina D3 (CCND3), proteínas 5-

monooxigenasa-activación de la tirosina 3-monooxigenasa / triptófano, polipéptido beta (ywhab)

y la división celular ciclo de 25 homólogo B (CDC25B) fueron también sobreexpresa. Los

resultados de microarrays de EP300 yCDKN1A expresiones fueron validados utilizando en

tiempo real de RT-PCR. La transfección de moléculas siE1.6 disminuyó EP300 y

aumentó CDKN1A expresión, que fue consistente con los resultados de los análisis de

microarrays (Figura4). Además, se obtuvieron resultados similares usando siE1.2 transfección

molécula. 

5. Discusión

Este estudio reveló que el silenciamiento de los 18 VPH-E1 expresiones de ARNm endógenos

en HeLa por las moléculas de siRNA inducidas cambios en la expresión de genes celulares,

específicamente con alta expresión en tres vías canónicas y un grupo funcional: la vía de

señalización de TLR, el IFN vía de señalización , el ISG antiviral y la vía apoptótica

(figuras  2 y y3).

Targeting la vía de señalización de TLR en la aclaración de los mecanismos celulares y

moleculares de cáncer de cuello uterino se ha ganado una gran importancia [32]. TLR-4 se

sobreexpresa en el cáncer de cuello uterino, y su activación por LPS promueve la proliferación

y anti-apoptosis en células HeLa in vitro[33]. Sin embargo, los miembros del factor regulador de

interferón (IRF) de la familia de factores de transcripción de unión al ADN han jugado un papel

en la regulación del crecimiento, las respuestas antivirales y la inducción transcripcional de

activado-IFN genes tempranos de respuesta [34] y mediadores críticos de la inducción de

principios viral la transcripción y replicación en varios virus del papiloma humano de la mucosa,

que requieren IRF-1 de unión a un elemento de respuesta de interferón

conservadas [35].Infecciones por VPH alteran la expresión de citoquinas y la señalización con

las oncoproteínas E6 y E7, y en particular se dirigen a la vía de IFN de tipo I  [36]. Sin embargo,

el mecanismo exacto en el que los actos complejos IFN sobre los tumores sigue siendo

desconocida, aunque su uso en la práctica clínica ha sido ampliamente recomendado,

especialmente en tumores que son resistentes a los tratamientos convencionales[37]. El TLRs

pertenecen a la familia de receptores de reconocimiento de patrones asociado a patógenos

(PRR). Tras la infección viral, TLRs puede detectar patrones moleculares específicos en los

virus y activar los FIR, lo que resulta en la inducción transcripcional de IFN. Activado por la vía

de señalización de TLR, IFNs señal a través de la vía JAK / STAT para inducir la producción de

ISGs. La activación de la vía de señalización de IFN resulta directamente en la producción de

ISGs. Varios ISGs funcionan para bloquear la replicación del virus, tales como IFIT1. Otros

ISGs upregulated, tales como EIF2AK2, que codifica la dsRNA dependiente de la proteína

quinasa R, pueden iniciar una respuesta antiviral adicional en la célula huésped, que finalmente

resulta en la apoptosis. La muerte celular es un componente esencial de la maquinaria de la

célula huésped inmune. Puede ser inducida por ISGs específicos. Nuestros datos de expresión

indicaron que la vía apoptótica podría ser suprimida antes de silenciamiento de la proteína E1

viral.

¿Cómo puede el VPH-18 E1 expresión afecta a un gran número de genes? Mientras que las

células HeLa son capaces de producir proteínas E1 de longitud completa, el producto

dominante puede ser el observado previamente E6-E7-E1 polycistron que codifica una proteína

truncada E1 (material complementario electrónico, figura S3). Esta proteína más corta HeLa

derivada de células HPV-18 E1 se trunca en el carboxilo terminal, pero todavía conserva

dominios de unión a proteínas terminales carboxilo que puede asociarse con factores celulares

huésped, tales como la ciclina E / CDK2 [14] y Ini1 / hSNF5, una subunidad de la cromatina

SWI / SNF remodelación compleja [23]. El reclutamiento del complejo SWI / SNF por E1 puede

alterar la disposición local de factores de transcripción, factores de replicación y las

histonas. Este reordenamiento puede reprogramar el estado de la transcripción y replicación

del ADN. También se encontró una regulación a la baja de la transcripción y traducción de

EP300 (figura 4),   una histona acetiltransferasa que regula epigenetically remodelación de la

cromatina a través de la acetilación de histonas, que permite el acceso a varios factores de

transcripción, activando con ello la expresión de genes   [38]. Sin embargo, el mecanismo de

regulación de EP300 expresión no se entiende bien. De acuerdo con un informe de Yu et al.

[39], la respuesta de crecimiento temprano 1 (Egr-1), que se une a los elementos ricos en GC

en los promotores, actúa aguas arriba de p300 / CBP. Egr-1, un factor de transcripción de dedo

de zinc, se acumula en el núcleo de la célula tras la estimulación por mitógenos y una variedad

de citoquinas, así como los efectos extracelulares, incluyendo la hipoxia y la 17-β-

estradiol [40, 41]. Recientemente, Saegusa et al. [42] informó de que EP300 la expresión

génica está regulada positivamente por Egr-1 de unión a la región promotora delEP300 de

genes en células de carcinoma de endometrio. Aunque no hubo evidencia de Egr-1 regulación

por proteínas del VPH-codificada, los niveles de mRNA de Egr-1 en el cáncer cervical fueron

significativamente mayor en comparación con el tejido normal [43]. En este estudio, se observó

una disminución de Egr-1 de expresión después de la silenciamiento de HPV-18 E1 ARNm, lo

que sugiere que Egr-1 puede ser estimulada por E1. Sin embargo, el voto negativo de EP300

de Egr-1 de expresión se sugirió [treinta   y nueve - cuarenta y   dos]. Por otra parte,

Bouallaga et al. [44] informó de que EP300 es reclutado por el VPH-18 enhanceosome y se

requiere para la transcripción HPV18 en células HeLa. Además, el techo confluencia celular

durante los experimentos siRNA antes de la recolección fue de al menos 50%, y en los cultivos

de control fue casi 90%. Lo anterior es importante porque demuestra que el cambio en la

expresión de genes del ciclo celular como RB1, Cdc25C, CDC2 y CDKN1A tiene la

consecuencia de que la proliferación celular es detenido.

Una pregunta importante es si el siRNA dirigidos de E1 también afecta a la estabilidad (y por lo

tanto la expresión) de los E1-E6-E7 ARNm policistrónicos. Para hacer frente a este punto, se

realizaron otros dos análisis qPCR. Evaluamos cuidadosamente tanto E6 y E7 expresión de

mRNA después de los tratamientos siRNA en células HeLa, y no encontramos ningún efecto

significativo en la expresión de E6 y E7 después del tratamiento con siRNAs. Nuestra

explicación para estos resultados se basa en el hecho de que el proceso de maduración de E1-

E6-E7 mRNAs policistrónicos se produce en el núcleo, y luego cada una de

ellas (E1,E6 y E7 mRNAs) se exportan al citosol. Por otro lado, muchos estudios han

demostrado que el proceso de la inhibición de siRNA se lleva a cabo principalmente en el

citosol. Por lo tanto, consideramos que haya pocas posibilidades de que el siRNA dirigidos

de E1 puede afectar a la estabilidad y la expresión de los E1-E6-E7ARNm policistrónicos, ya

que pueden estar en diferentes lugares de la célula.

Genes expresados diferencialmente en los cuatro conjuntos de genes enriquecido siguientes E1 silenciamiento. Log 2 veces cambiar los valores de expresión de genes entre las condiciones son de color como se muestra en la tecla.

EP300 regulación a la baja después de silenciamiento del VPH-18 E1. La confirmación de los datos micro-array utilizando en tiempo real RT-PCR. Niveles de transcripción de EP300 y CDKN1Ase cuantificaron utilizando. RT-PCR EP300 y CDKN1A expresiones de genes se vieron afectados después siE1.6 y siE1.2 transfecciones, a 100 nM durante 48 h, pero no después de siCONTROL transfección. Disminución EP300 y el aumento de CDKN1A expresión fueron consistentes con los resultados obtenidos del análisis de microarrays. Las expresiones logarítmicas relativas se normalizaron contra el control sin tratamiento (NTC). GAPDH se utilizó21 como control del gen de referencia.

Esquemática de los mecanismos por los que la proteína E1 viral puede mitigar la capacidad del huésped para defenderse contra la infección viral. E1 expresión de la proteína induce represores transcripcionales que regulan negativamente de forma coordinada la actividad de las vías implicadas tanto en la detección de la infección viral y la iniciación de respuestas

inmunes a la infección, incluyendo la apoptosis. E1 expresión de la proteína induce activadores de la transcripción que participan en la replicación viral.

6. Conclusión

Tomados en conjunto, nuestros datos indican un patrón de supresión consistente en el nivel

transcripcional inducido por el HPV-18 E1 proteína a través de cuatro componentes

intensamente colaboradoras de la maquinaria inmune de la célula huésped (Figura 5), lo que

sugiere que, además de su papel bien entendido en viral replicación, la proteína E1 viral

también puede jugar un papel importante en la mitigación de la capacidad del anfitrión para

defenderse de la infección.