uab barcelonabiologia.uab.es/genetica/guions/guiopractiques2007_200… · web viewel floquet de...

1

Curs 2007-08Pràctiques

deGenètica

Departament de Genètica i

de Microbiologia

ÍNDEX

Objectius generals.......................................................................................3

Programa de pràctiques..............................................................................4

Calendari, laboratoris i professors...............................................................5

Pràctica 1. Introducció a la biologia i a la morfologia de Drosophila...........7

Pràctica 2. Anàlisi d’un mutant i assignació al seu grup de lligament.......19

Pràctica 3. Elaboració d’un mapa genètic de tres marcadors...................26

Pràctica 4. Anàlisi de DNA amb electroforesi en gel d’agarosa.................34

Pràctica 5. Observació de cromosomes humans.......................................42

Pràctica 6. Preparació dels cromosomes politènics de Drosophila buzzatii. Mapes citològics i observació d’inversions paracèntriques.....50

Pràctica 7. Aplicacions de la bioinformàtica a la Genètica........................60

2

OBJECTIUS GENERALS

Aquest programa de pràctiques, paral·lel a la docència teòrica i als seminaris del curs de Genètica, pretén aconseguir un objectiu doble:

1) Familiaritzar l’alumne amb un ventall tan ampli com sigui possible de les tècniques i metodologies utilitzades en l’experimentació genètica

2) Reforçar el cos de coneixements teòrics que s’han adquirit en l’assignatura.

És impossible abastar, en un temps de pràctiques tan limitat, la totalitat dels temes inclosos en el programa de Genètica. Malgrat aquest fet, s’han intentat desenvolupar unes pràctiques prou variades.

3

PROGRAMA DE PRÀCTIQUES

Es duran a terme set pràctiques diferents, que es desenvoluparan en un total de nou sessions (unes 22,5 hores).

Les tres primeres pràctiques formen un bloc de Genètica Mendeliana. En la primera d’elles, ens familiaritzarem amb un dels organismes més utilitzats tradicionalment en Genètica, l’espècie Drosophila melanogaster. En les següents, es mostraran experimentalment els tipus d’encreuaments que són necessaris per assignar un mutant a un grup de lligament, així com la lògica construcció dels mapes genètics. Aquestes pràctiques són el reflex al laboratori de les classes teòriques de Genètica Mendeliana i constitueixen una introducció insubstituïble als procediments d’estudi de la nostra ciència.

Les quatre pràctiques restants mostren matèries avançades que, si bé reflecteixen aspectes que es desenvoluparan en les classes teòriques, es mereixen un estudi més detallat en el laboratori. En la quarta pràctica ens introduirem en un camp diferent, on s’utilitzen procediments moleculars. Es treballarà amb DNAs de diferent origen per introduir l’alumne en el món de la genètica molecular. Mitjançant la interpretació d’una electroforesi en gel d’agarosa, es podrà identificar una bona digestió, una bona extracció genòmica, un marcador de pes molecular i diferents aspectes relacionats amb una de les tècniques més habituals als laboratoris actuals.

La cinquena pràctica permet observar el cariotip humà i detectar algunes alteracions estructurals que es poden induir en els cromosomes, així com veure l’aspecte de les cromàtides quan s’utilitza la tècnica de tinció diferencial i la demostració de què es poden donar encreuaments entre les cromàtides germanes (SCE, sister-chromatid exchanges) i que la seva freqüència s’incrementa amb l’exposició a mutagens.

4

La sisena pràctica utilitza una segona espècie del gènere Drosophila (D. buzzatii) com a material d’experimentació per a l’obtenció de preparacions de cromosomes politènics de les glàndules salivals larvàries. L’estudi citogenètic d’aquests cromosomes, que és ajudat en alguns casos amb tècniques moleculars tals com la hibridació in situ, permet reconèixer-los individualment i, fins i tot establir amb gran precisió la localització dels gens del seu interior. Un segon aspecte important és que els cromosomes politènics permeten visualitzar amb una gran facilitat alteracions cromosòmiques i, particularment, permeten determinar els polimorfismes cromosòmics existents en les poblacions naturals.

La setena i última pràctica consisteix en una introducció a l’ús d’internet des del punt de vista de l’investigador en Genètica, conèixer les possibilitats que s’ofereixen en aquest camp i saber utilitzar-les.

PROFESSORS DE PRÀCTIQUES

Pràctica Professores Correu electrònicLaboratori

Sessions 1-3

Fernando Prada Antonio BarbadillaMounaim AkdiErico Carmona

[email protected]@[email protected]@hotmail.com

C3-213C3-131C3-213C3-115

Sessions 4-6

Emma GuillametDanae Liviac

[email protected]@uab.es

C3-241C3-241

5

mailto:[email protected]



Mounaim AkdiM Luz Betancourt

[email protected]

Sessions 7-8

Emma GuillametFernando PradaPau Castillo

[email protected]@[email protected]

C3-241C3-115C3-213

Sessió 9Marta PuigRaquel Egea

[email protected]@uab.es

C3-109C3-131

6


CALENDARI DE GENÈTICA 07/08 PRACT 1 PRACT 2 PRACT 3 PRACT 4 PRACT 5 PRACT 6 PRACT 7 PRACT 8 PRACT 9

G- 1 18-oct 30-oct 12-nov 14-nov 15-nov 16-nov 11-dic 18-dic 08-ene






G -7 19-oct 31-oct 13-nov 29-nov 30-nov 03-dic 05-dic 12-dic 11-ene




HORARI: DEL G- 8 AL G- 10, MATINS DE 10:30 A 13HG- 1, G- 3, G- 5, G- 7 TARDES DE 15 A 17:30H G- 2, G- 4, G- 6 TARDES DE 17:30 A 20H

P 1, 2, 3............LUPESP 5, 6................MICROSP 7 i 8...............LUPES I MICROS

7

PRÀCTICA 1.INTRODUCCIÓ A LA BIOLOGIA I MORFOLOGIA DE DROSOPHILA.

Objectiu

L’objectiu principal d’aquesta primera pràctica és el de familiaritzar-se amb el cicle vital i la morfologia de les diferents fases del desenvolupament de Drosophila. Els coneixements adquirits en aquesta pràctica són fonamentals per al desenvolupament de la resta de pràctiques on s’utilitza aquest material biològic.

Introducció

En aquesta pràctica s’utilitzaran individus que pertanyen a l’espècie Drosophila melanogaster; s’estudiarà el seu cicle vital i la seva morfologia, i les característiques fenotípiques de soques mutants diferents.

El cicle vital de les espècies del gènere Drosophila

Drosophila melanogaster, coneguda vulgarment com la mosca del vinagre o de la fruita, és un material excel·lent de laboratori i, per això, ha jugat un paper molt important en el desenvolupament de la Genètica. Entre els múltiples avantatges que ofereix, en destaquen el seu manteniment senzill i econòmic, que permet conservar un gran nombre de soques interessants per les seves característiques genètiques d’una forma rutinària, la capacitat de produir un nombre de descendents molt elevat en una sola generació i la gran varietat de mutants fenotípics que se’n coneixen. A més a més, les larves de Drosophila, com les d’altres dípters, tenen en les seves glàndules salivals cromosomes politènics. Aquests cromosomes gegants permeten realitzar estudis citogenètics molt precisos.

8

Figura 1. Cicle vital de Drosophila

10

Les drosòfiles són dípters holometàbols que durant el seu desenvolupament passen per les fases d’ou, larva, pupa i, finalment, insecte adult (Figura 1). La durada del seu cicle de vida depèn de diversos factors ambientals, tals com la temperatura i la humitat. A una temperatura de 25 C i a una humitat relativa del 60%, el cicle de D. melanogaster des d’ou a adult és d’uns 9 dies; mentre que a 20 C és d’uns 15 dies. La taula 1 mostra una cronologia aproximada del desenvolupament de D. melanogaster a 25 C, que ens servirà per entendre la planificació dels nostres experiments amb aquesta espècie.

Taula 1. Cronologia del desenvolupament de D. melanogaster a 25 C.

Hores Dies Estadi del desenvolupament0 0 fecundació: embrió22 1 eclosió: primer estadi larvari47 2 primera muda: segon estadi70 3 segona muda: tercer estadi118 5 formació del puparium

119 5 puparium groc120 5 puparium pigmentat122 5 muda prepupal130 5,5 formació del cap, ales i potes167 7 pigmentació dels ulls184 7,5 pigmentació de les quetes

214 9emergència: adult amb les ales plegades

Després de l’aparellament, la fecundació dels ous té lloc dins l’úter. A continuació es produeix la posta dels ous (o ovoposició) i l’ou és dipositat a l’exterior. Al cap d’unes hores, en les quals té lloc una gran proliferació i reorganització cel·lulars, de l’ou n’eclosiona una larva petita i blanca, molt activa i voraç. El creixement ràpid de la larva li produeix dues

11

mudes successives, al final de les quals s’obtenen les anomenades larves de tercer estadi. Aquestes larves perden mobilitat de forma progressiva i, finalment, es fixen al substrat i comencen a transformar-se en insectes adults: és la pupació. Les pupes es distingeixen perquè la coberta externa de la larva es va endurint i enfosquint progressivament, fins a adquirir una tonalitat groguenca o ataronjada. Un cop ha acabat la metamorfosi, que requereix la degradació i reabsorció dels teixits de la larva i la producció de nous òrgans a partir d’unes agrupacions cel·lulars larvàries anomenades discs imaginals, l’insecte adult trenca la coberta de la pupa i n’emergeix. Immediatament després de l’emergència, els insectes adults es reconeixen fàcilment perquè no estan completament pigmentats i les seves ales encara no s’han desplegat.

Característiques de l’insecte adult. Identificació dels sexes.

Per poder realitzar encreuaments en condicions controlades s’han de reconèixer inequívocament els sexes i conèixer el temps a partir del qual els individus emergits són capaços d’aparellar-se. Les drosòfiles poden pertànyer a dos sexes: mascles i femelles (encara que es coneixen intersexes produïts, en general, per alteracions de la proporció autosomes/cromosomes sexuals, però que són molt poc freqüents i estèrils) (Figura 2). Els adults poden aparellar-se al cap de poques hores de l’eclosió i les femelles comencen a posar ous poc després. La capacitat reproductora es conserva al llarg de tota la vida, si bé la taxa d’ovoposició descendeix a partir del desè dia. La longevitat depèn en gran part de la disponibilitat d’aliment i de la temperatura, i poden arribar a assolir fins als tres mesos de vida.

Es poden assenyalar diferents característiques morfològiques que permeten distingir fàcilment els mascles de les femelles de l’espècie D. melanogaster (com veurem després algunes d’aquestes característiques no són comunes a totes les espècies del gènere). El sexe dels adults és

12

més fàcil de distingir en aquesta espècie (Figura 2). Des de la fase larvària, els mascles es poden distingir perquè els seus testicles són més grans que els ovaris de les femelles. A través de la coberta de les pupes tardanes es pot observar també, utilitzant la lupa, una característica que presentaran els mascles d’aquesta espècie, però no les femelles, són les anomenades pintes sexuals, unes especialitzacions epidèrmiques presents en els tarsos del parell de potes anterior (Figura 2).

13

Figura 2. Dimorfisme sexual de Drosophila melanogaster. Visió dorsal d’insectes adults dels dos sexes. Fixeu-vos en les diferències de l’extrem de l’abdomen. Pota anterior. Els mascles presenten la pinta sexual. Visió ventral de l’abdomen. Diferències en les estructures genitals i anals.

14

Per distingir els dos sexes cal tenir en compte diferents característiques. En primer lloc, en els mascles s’hi observaran les pintes sexuals. En segon lloc, la pigmentació de la zona dorsal de l’extrem de l’abdomen és diferent en mascles i femelles: en els mascles forma una taca negra contínua sobre els segments terminals de l’abdomen (d’aquí li ve el nom de "melanogaster": extrem de l’abdomen fosc). A més a més, l’abdomen dels mascles és arrodonit, mentre que el de les femelles és més punxegut. Finalment, els mascles són una mica més petits. Emprant el binocular, s’observen d’altres característiques: si col·loquem els individus sobre el seu dors, apareixen els aparells genitals. En les femelles hi podem veure una placa genital de color clar, mentre que els mascles tenen una estructura fosca anomenada arc genital.

Després d’haver practicat la identificació dels sexes en els individus adults, el reconeixement és molt fàcil i es pot realitzar a ull nu. Només en cas de dubte és necessari utilitzar el binocular (per exemple, els individus que acaben d’emergir poden ser més difícils de reconèixer).

Manipulació dels adults

Per a sexar els individus i realitzar els encreuaments experimentals és necessari anestesiar-los. Per fer-ho es traspassen els adults a una ampolla sense medi que es tapa amb un cotó impregnat en èter etílic.

Per tal d’evitar que les mosques s’escapin, abans de destapar l’ampolla on es troben, és convenient donar-li uns copets secs mantenint l’ampolla en posició vertical. Després, es traspassen les mosques a una ampolla sense medi de cultiu, encarant les boques d’ambdues ampolles. Tot seguit, es fan caure les mosques dins la nova ampolla amb cops suaus agafant les dues ampolles encarades pel coll. Si la transferència es realitza des d’una ampolla en la qual hi ha aliment, s’ha d’evitar que els moviments i els cops siguin bruscs perquè no caigui medi en la nova

15

ampolla. Per esmorteir els cops s’utilitzaran plaques de suro.

És important regular la quantitat d’èter i el temps a què s’exposa les mosques a l’anestèsic. Una exposició perllongada produeix la seva mort. En aquest moment les ales se separen del cos i es col·loquen dretes rígidament sobre el dors. És convenient esperar només fins al moment en el qual les mosques perden mobilitat i eteritzar una altra vegada si es desperten.

Un cop anestesiades, les mosques es col·loquen sobre una cartolina blanca i ja poden observar-se i classificar-se. Per a la manipulació s’utilitza un petit pinzell. Si s’han de transferir individus anestesiats a una ampolla de cultiu, no s’han de dipositar directament sobre el medi, doncs la humitat farà que s’hi enganxin i es morin. És convenient permetre que es despertin en un tub net i sec i després transferir-les a l’ampolla amb el medi o, alternativament, col·locar-les en un petit cucurutxo de paper que s’introduirà directament en l’ampolla. Aquells individus que es descartin s’eliminaran tot introduint-los en una ampolla amb alcohol al 70%.

Obtenció de femelles verges

Cal evitar que les femelles que s’han d’utilitzar per a un experiment siguin fecundades per mascles no desitjats. El procediment més comú per aconseguir-ho és eliminar amb molt de compte els adults presents a l’ampolla de cultiu cada cert temps (per a D. melanogaster, cada sis hores) de forma que puguem estar segurs que tots els individus nascuts en l’ampolla després de l’última eliminació siguin verges. Després de classificar-los, els individus es mantindran separats per sexes. Malgrat que no s’hagi pres aquesta precaució, es poden seleccionar alguns individus verges si només es recullen aquells que veiem que acaben d’emergir (ales sense desplegar, cos poc pigmentat, etc.). Aleshores, el problema és que és més difícil sexar individus massa joves.

16

Dotació cromosòmica

D. melanogaster té quatre parells de cromosomes (2n=8): un parell d’heterocromosomes o cromosomes sexuals (XX en les femelles i XY en els mascles) i tres parells d’autosomes (II, III i IV). D’aquesta forma, existeixen quatre grups de lligament. El cromosoma IV és molt petit ("dot" o cromosoma puntiforme).

Mutants fenotípics

En Drosophila melanogaster es disposa de mutants fenotípics de tipus molt diferents que afecten la morfologia de l’ala, el color del cos, la mida, forma o color dels ulls o de les quetes, etc. En aquestes pràctiques s’utilitzaran mutants d’identificació senzilla.

17

Desenvolupament de la Pràctica 1.

1. A partir de diferents ampolles de cultiu, observeu els distints estadis del desenvolupament de Drosophila. Fixeu-vos en les larves de mides diferents, pupes i adults. Descriviu amb l’ajut de dibuixos la morfologia externa de les larves i les pupes. Establiu les possibles diferències morfològiques entre les larves de mida diferent que s’observin.

2. Descriviu la morfologia externa de les pupes. En algunes d’elles, les més properes a l’emergència, s’hi poden observar estructures de l’insecte adult. Si les observeu, describiu-les també. Poden relacionar-se les morfologies de larves i pupes? Establiu-ne relacions, si existeixen.

18

3. Observeu i descriviu la morfologia externa dels adults (color del cos i ulls, morfologia de les ales i halteris, forma i mida de les quetes, etc).

Cos

Ulls

Ales

Halteris

Quetes

Altres caràcters

19

4. Determineu el sexe d’un mínim de deu individus i reconeixeu-ne les diferents característiques que s’han explicat anteriorment. Anoteu el nombre de mascles i femelles que heu trobat en sexar. Es detecten diferències morfològiques en els individus que acaben d’emergir? Si és així, descriviu-les.

Número

Característiques

Mascles

Femelles

5. Seleccioneu 10 mascles per fer l’encreuament de l’apartat 2 de la Pràctica 3 (pàg. 27). Poseu-los en un flascó petit buit.

6. Determineu les mutacions existents en la soca de letals equilibrats i en la soca problema, per comparació amb la soca de fenotip salvatge. Anoteu-les a l’apartat 1 de la Pràctica 2 (pàg. 21).

7. Determineu les mutacions de la soca 3 mutant (3M). També les heu de comparar amb els individus salvatges. Anoteu-les a l’apartat 1 de la

20

Pràctica 3 (pàg. 28).

Qüestions

1. Què és una soca de laboratori? Distingiu entre soca i espècie.2. Diferències entre mutació i individu mutant. Què és un individu salvatge?3. Expliqueu per què moltes vegades un mutant fenotípic només es detecta en un estadi del desenvolupament determinat.

Bibliografia

DEMEREC, M. ed. 1965. The biology of Drosophila. Hafner Publishing Co. New York.ASHBURNER, M. 1989. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

21

PRÀCTICA 2.ANÀLISI D’UN MUTANT I ASSIGNACIÓ AL SEU GRUP DE LLIGAMENT.

Objectiu

L’objectiu de la pràctica és assignar una mutació problema al seu corresponent grup de lligament utilitzat una soca de letals equilibrats. Alhora, s’analitzarà la naturalesa de la mutació (recessivitat o dominància) i el seu tipus d’herència (autosòmica o lligada al sexe).

Introducció

El lligament dels gens, que és degut a la seva localització en un mateix cromosoma, constitueix una excepció important a la segona Llei de Mendel (Llei de la segregació independent). Els gens que tendeixen a ser transmesos en grup es diu que estan lligats, i cada parell de cromosomes homòlegs constitueix un grup de lligament. Com ja s’ha indicat abans, D. melanogaster presenta un parell de cromosomes sexuals (I) i tres parells d’autosomes (II, III i IV) que constitueixen quatre grups de lligament.

Quan es presenta una mutació en una soca, la detecció del grup de lligament de la mutació requereix diferents mètodes. Una tècnica comuna per aconseguir aquest propòsit en D. melanogaster consisteix en utilitzar una soca portadora d’un sistema de letals equilibrats amb marcadors dominants.

En els sistemes de letals equilibrats, cada cromosoma homòleg conté un factor letal recessiu, de forma que s’autoperpetua com una soca heterozigòtica. En alguns casos, els dos letals recessius presenten l’avantatge de trobar-se associats a un efecte fenotípic dominant, tal com els mutants Curly (Cy) i Plum (Pm) del cromosoma II, on el primer afecta a la forma de les ales i el segon al color dels ulls. A causa de la letalitat de

22

qualsevol mosca Cy/Cy o Pm/Pm, aquesta soca s’autoperpetua. Per fer-ho més senzill, generalment s’omet la notació dels al·lels + (salvatge), però se sobreentén que hi són presents; és a dir:

Cy/Pm = Cy +/+ PmEn resum:

Cy +/+ Pm x Cy +/+ Pm

Cy + / Cy + Cy + / + Pm + Pm / Cy ++ Pm / + Pm moren viables viables moren

Una soca pot presentar sistemes de letals equilibrats en més d’un parell de cromosomes homòlegs. D’aquesta manera, la soca que s’utilitzarà en aquesta pràctica conté, a més a més de les mutacions Cy i Pm en el cromosoma II, uns altres dos marcadors morfològics dominants associats a letals recessius en el cromosoma III: Stubble (Sb) i Ultrabithorax (Ubx). Es dóna per suposat que la soca Cy/Pm Sb/Ubx també s’autoperpetua i només produeix heterozigots per a ambdós conjunts de gens.

Es requereixen, per tant, dues condicions per al manteniment d’un sistema de letals equilibrats:

i) que cada un dels membres d’un parell de cromosomes homòlegs porti un letal recessiu no al·lèlic diferent, i

ii) que cada un dels dos letals recessius diferents romangui sempre en cromosomes homòlegs separats. El segon punt es compleix quan s’evita la recombinació amb inversions.

23

Desenvolupament de la Pràctica 2

Per a la realització de la pràctica s’utilitzarà la soca de letals equilibrats Cy/Pm Sb/Ubx i una soca problema. Durant el temps de durada de la pràctica es disposarà de femelles verges amb la mutació problema per realitzar els encreuaments que siguin necessaris.

SESSIÓ 1

1. Descriviu els fenotips observats en les soques de letals equilibrats i de la soca mutant problema, tot comparant-los amb el de la soca salvatge. Degut a la variabilitat en l’expressió que presenten algunes mutacions, convé observar individus d’ambdós sexes i de diferents edats.Soca Ulls Ales Quetes Halteris

Salvatge

LetalsEquilibrats

Mutacions

Problema

Mutacions

24

2. Seleccioneu 5 mascles de la soca de letals equilibrats.

3. Realitzeu el primer encreuament, utilitzant 10 femelles verges de la soca problema i 5 mascles de la soca de letals equilibrats.

25

SESSIÓ 2

4. Esquematitzeu l’encreuament de l’apartat 3 i indiqueu el resultat que esperem en la descendència tant pel que fa a la mutació sepia com per a les mutacions letals.

sepia

Mutacions letals

5. Classifiqueu i compteu els descendents de l’encreuament efectuat el primer dia:Classes fenotípiques Mascles Femelles

26

6. Seleccioneu 10 mascles de fenotip Cy Sb per fer el següent encreuament.

7. A partir dels resultats obtinguts, determineu la naturalesa de la mutació i el tipus d’herència.

8. Realitzeu el següent encreuament utilitzant 10 femelles verges de la soca problema i 10 mascles mutants Cy Sb.

9. Per què hem escollit els mascles Cy Sb per a fer el creuament enlloc de mascles amb altres combinacions de mutacions?

27

SESSIÓ 3

10. Esquematitzeu l’encreuament de l’apartat 8, tot indicant els possibles resultats en funció del cromosoma en el qual es troba la mutació problema

CROMOSOMA II

CROMOSOMA III

CROMOSOMA IV

29

11. Analitzeu la descendència, tot classificant-la per sexe i fenotip.Classes fenotípiques Mascles Femelles

12. Basant-vos en els resultats obtinguts, justifiqueu en quin cromosoma es troba la mutació problema.

Qüestions

1. Què és una soca de letals equilibrats?2. Quins altres mètodes existeixen per assignar una mutació a un grup de lligament?3. Quina proporció de la descendència és viable en una soca de Drosophila que presenta letals equilibrats en el segon i en el tercer grup de lligament?

Bibliografia

STANSFIELD, W.D. 1992. Genética. McGraw-Hill Interamericana, Mèxic.GRIFFITHS, A.J.F., J.H. MILLER, D.T. SUZUKI, R.C. LEWONTIN & W.M.

30

GELBART (2002). Genética (traducció de la 7ª edició anglesa). McGraw-Hill/Interamericana, Madrid.

31

PRÀCTICA 3.ELABORACIÓ D’UN MAPA GENÈTIC DE TRES MARCADORS.

Objectiu

A partir d’una soca problema s’hauran d’establir les relacions de lligament i les distàncies genètiques de les mutacions que presenti.

Introducció

Cada cromosoma conté un grup de gens que tendeixen a ser transmesos en bloc, tot constituint un grup de lligament. La formació de quiasmes entre cromosomes homòlegs durant la meiosi dóna lloc a l’aparició de combinacions de gens que són diferents a les parentals. Aquestes combinacions noves s’anomenen recombinants. La proporció de recombinants en el total de la progènie permet la construcció de mapes genètics. La freqüència de recombinació (RF) expressada en percentatge indica la distància relativa entre dos loci. La distància entre dos loci es mesura en unitats de mapa o centimorgans (1 unitat de mapa = RF 1%).

El millor mètode per estimar la distància genètica entre tres gens recessius a, b i c, consisteix en realitzar l’encreuament prova de la F1 triple heterozigòtica. Tenint en compte la recombinació patida pels gàmetes dels individus heterozigots, els vuit fenotips descendents es poden classificar en quatre grups: (i) tipus parentals, sense recombinació, que són els més abundants; (ii) recombinants senzills entre a i b (regió I); (iii) recombinants senzills entre b i c (regió II); i (iv) recombinants dobles, que són els menys freqüents.

a b c

RI RII

32

D’aquesta manera la distància entre els dos loci serà:

recombinants RI + dobles recombinantsDistància a-b = x 100

progènie total


SESSIÓ 1

1. Descriviu els fenotips observats en la soca salvatge i la soca 3 mutant (3M). Com en la pràctica anterior és convenient que observeu els individus d’ambdós sexes.

Soca Ulls Ales Quetes

Salvatge

3 mutant

Mutacions

2. Realitzeu l’encreuament de 10 femelles 3 mutants (3M) amb 10 mascles de tipus salvatge.

34

SESSIÓ 2

3. Descriviu els fenotips observats en la descendència de l’encreuament efectuat el primer dia.

Sexe Fenotip

Mascles

Ulls

Ales

Quetes

Femelles

Ulls

Ales

Quetes

4. A partir dels resultats obtinguts, determineu la naturalesa de la mutació i el tipus d’herència.

35

5. Donat tres gens recessius lligats al sexe, esquematitzeu els dos possibles encreuaments entre la soca mutant i la soca salvatge.♀♀ mutant x ♂♂ salvatge

F1

F2

♀♀ salvatge x ♂♂ mutant

F1

F2

Indiqueu quin encreuament és el més avantatjós per detectar la distància genètica que existeix per a aquells loci que estiguin lligats i per què.

6. Realitzeu l’encreuament de 10 femelles de la F1 per 10 mascles de la F1.

36

SESSIÓ 3

7. Analitzeu tots els descendents de l’encreuament efectuat el dia anterior, classificant-los per sexe i fenotip, tot indicant el nombre d’individus de cada grup. Anoteu els valors globals obtinguts de tot el grup de pràctiques.Fenotip Mascles Femelles Total

parcial total parcial totalsalvatge

a

b

c

a-b

a-c

b-c

triple mutant

8. A partir dels parentals i dobles recombinants, determineu l’ordre de lligament.

Regió I Regió II

9. Un cop ja saps l’ordre dels marcadors omple la taula següent amb els diferents gàmetes generats en la femella de l’encreuament prova i determina com s’ha generat cadascun d’ells:

A. Anota els gàmetes que s’han heredat de la mare, que en aquest cas

37

són els que determinen el fenotip de la descendència.B. Distingeix els gàmetes parentals dels recombinants.

C. Determina en quina regió ha tingut lloc la recombinació en els gàmetes recombinants.

D. Indiqueu quines relacions d’acoblament i/o repulsió existeixen entre els diferents al·lels dels progenitors

A. Gàmetes ♀ B. Parentals / Recombinants

C. Regió recombinació

D. Acoblament / Repulsió

10. Calculeu les freqüències de recombinació:a-b

b-c

a-c

38

11. Comproveu si coincideixen les distàncies entre els loci extrems i la suma d’ambdues regions. En el cas que no coincideixin, explica perquè es produeix aquesta discrepància.

12. Estimeu el coeficient de coincidència i el coeficient d’interferència.C.C.

C.I.

39

Qüestions:

1. Quins són els avantatges de fer mapes de gens lligats al sexe?2. Per què el lligament és una excepció a la segona llei de Mendel?3. Per què no es poden detectar freqüències de recombinació superiors a 50%?4. Per què el mapa genètic d’un cromosoma pot mesurar més de 50 unitats de mapa?5. Quin és el significat de la interferència?6. Coincideixen les distàncies obtingudes en aquesta pràctica amb els valors que trobem en la bibliografia? Com s’expliquen les desviacions dels valors obtinguts?

Bibliografia

LINDSLEY, D.L. i GRELL, E.H. 1968. Genetic Variations of Drosophila melanogaster. Carneg. Inst. Publ. Núm. 627. Washington, D.C.LINDSLEY, D.L. i ZIMM, G.G. 1992. The genome of Drosophila melanogster. Academic Press, Inc. San Diego. California.GRIFFITHS, A.J.F., J.H. MILLER, D.T. SUZUKI, R.C. LEWONTIN & W.M. GELBART (2002). Genética (traducció de la 7ª edició anglesa). McGraw-Hill/Interamericana, Madrid.

40

PRÀCTICA 4.

ANÀLISI DE DNA EN ELECTROFORESI EN GEL D’AGAROSA

4.1 Objectiu

L'objectiu principal d'aquesta pràctica és adquirir coneixements sobre una de les tècniques més utilitzades en genètica molecular. La manipulació i la identificació de diferents DNAs ens permetran interpretar un gel d’electroforesi i obtenir informació sobre la mostra analitzada.

4.2 Introducció

L’electroforesi en gel d’agarosa és una eina molt important en biologia molecular ja que ens permet estudiar el DNA.

Es poden utilitzar diferents tipus d’electroforesi per: determinar la seqüència de bases, la mida d’una deleció/inserció o la presència de mutacions puntuals. També ens pot permetre distingir entre al.lels de diferent mida en un únic locus, determinar la qualitat i quantitat de DNA present en una mostra, i utilitzar-la en enginyeria genètica.

Bàsicament, l’electroforesi en gel, és un mètode de separació de components químics i molècules, per la seva càrrega i la seva mida. Les substàncies a separar es col·loquen dins de pouets en el gel i es sotmeten a un camp elèctric. D’aquesta manera, les molècules amb una determinada càrrega es mouen cap al pol de càrrega oposada. Les molècules grans i/o llargues es mouen a través del gel amb més dificultat, ja que queden atrapades a la matriu del gel. En canvi, les molècules més curtes o més petites, migren més ràpidament a través del gel d’agarosa. Els fragments d’una mida similar migren més o menys a la mateixa velocitat i formaran una banda gruixuda visible quan es tenyeixi el gel.

El gel

41

Es poden utilitzar diferents tipus i concentracions de medis per fer el gel. Aquests factors determinen la mida del porus del gel i, per tant, la seva capacitat per separar fragments de mida similar.

Per preparar el gel utilitzarem l’agarosa, un derivat de l’agar (polímer d’origen natural que s’extrau de determinades algues vermelles). Aquest polisacàrid forma gels termoreversibles en aigua o en solucions salines i té una consistència notable, fins i tot, a molt baixes concentracions del polímer (p.ex., al 0,4%). El procés de gelificació ocorre a temperatures més baixes que el de fusió del gel. En aquesta pràctica utilitzarem l’agarosa en forma de pols, insoluble a temperatura ambient, però que es dissol bé a temperatures properes a l’ebullició. Quan es refreda, gelifica. Els polímers de sucre formen una mena de “xarxes” a l’encreuar-se entre ells. Aquest entramat forma porus que permeten el pas de diferents molècules, entre elles el DNA. La mida del porus és inversament proporcional a la concentració d’agarosa. Depenent del tipus d’agarosa que s’utilitzi i de la seva concentració, podrem separar fragments de DNA que difereixin en centenars o milers de parells de bases. Per tant, si el porus és molt petit, farem que el DNA es desplaça més a poc a poc i es dificulta la mobilitat dels fragments grans. Si el porus és molt gran, el DNA es desplaça ràpidament.

Una altra substància per fer els gels és la poliacrilamida, que ens permet separar fragments de DNA que difereixen en un únic parell de bases.

Enzims de restricció

Els enzims de restricció són proteïnes que tallen la doble cadena de DNA en llocs de reconeixement específic. Actuen com tisores, tallant el material genètic i donant lloc a diferents fragments de DNA. Existeixen diferents enzims de restricció i cadascun reconeix i talla una petita seqüència específica (4-6 bp) en el DNA. Quan es talla el DNA amb enzims de restricció, la mida dels fragments que s’originen, correspon a la

42

distància (en parells de bases) entre les dianes de restricció.

La digestió, temps que triga un enzim de restricció en tallar el DNA, requereix unes condicions molt específiques per a la seva màxima activitat. La composició del tampó (sobretot la seva força iònica) i la temperatura són els punts clau.

L’electroforesi

El tampó d’electroforesi conté ions que condueixen l’electricitat. Les càrregues viatgen a través del gel perquè aquest també té ions (ja que es prepara amb el mateix tampó).

EL DNA està carregat negativament, de manera que migra cap al pol positiu o ànode. La velocitat a la qual el DNA es mou depèn de la mida del fragment i del voltatge. Si emprem un voltatge molt gran, el DNA migra molt ràpid; en canvi, si el voltatge és petit, el DNA migra més a poc a poc però hi ha més resolució entre les diferents bandes.

4.3 Desenvolupament de la pràctica

4.3.1 Primera sessió

4.3.1.1. Preparació dels DNAs

La pràctica es farà amb diferents DNAs (obtinguts prèviament): - DNA eucariota: DNA de Drosophila melanogaster- DNA plasmídic: pBluescript SK (pBSK) i pCR-TOPO- DNA víric: fag DNA BstE II

43

Amb part del DNA de Drosophila i del DNA plasmídic farem una digestió amb un enzim de restricció (EcoRI). Tots aquests DNAs tenen dianes de restricció per a l’enzim EcoRI.

Digestió de DNA amb enzims de restricció

1. Prepararem la barreja de reacció en un tub eppendorf estèril:

2 L del DNA corresponent (Drosophila, pBSK o pCR-TOPO)1 L del tampó de l’enzim de restricció1 L de l’enzim de restricció: EcoRI

6 L d’aigua destil·lada

2. Agitem la barreja (picant el fons del tub).

3. Centrifuguem (un pols) per fer baixar les gotes. Repetir barrejar/centrifugar.

4. Incubem a 37 ºC durant tota la nit.

5. Guardem a 4ºC.

S’ha de tenir en compte que:És molt important fer bé la barreja del punt 2. La solució de l’enzim

és molt densa i viscosa i és fàcil que la gota caigui al fons del tub i no hi hagi difusió. S’ha d’agitar bé per tal d’aconseguir una barreja homogènia.

L’enzim de restricció i el seu tampó s’han de conservar a –20ºC.El volum d’enzim ha de ser inferior al 10% del total, ja que el glicerol

present en el tampó pot inhibir l’enzim.L’enzim de restricció és l’últim que s’ha d’afegir a la reacció i cal

mantenir el vial en fred. El tindrem el mínim temps possible fora del congelador (només el traurem per repartir-lo pipetejant amb una punta estèril).

4.3.1.2 Preparació dels gels

Per a la preparació del gel s’usarà agarosa a una concentració del

44

0,6 % (70 mL tampó TAE i 0,42 g agarosa, veure Annex). Aquesta solució s’escalfarà en un matràs fins que l’agarosa estigui totalment dissolta, però evitant la seva ebullició. Un cop ben dissolta, esperem uns minuts que es refredi una mica i afegim 70 L BrEt (0,5 g/mL). Remenar bé per fer una barreja homogènia.

El bromur d’etidi (BrEt) és un agent intercalant que emet fluorescència quan s’exposa a una font de llum UV de 300 nm.

Atenció: el BrEt és un mutagen i s’ha de manipular amb les màximes precaucions.

A continuació, el contingut s’abocarà sobre una placa de metacrilat que prèviament s’ha de segellar, per evitar que es perdi el gel, i que ha de tenir col·locada una pinta amb els pouets corresponents que serviran per carregar les mostres.

Un cop el gel estigui solidificat, es pot treure la pinta i es pot col·locar dins de la cubeta d’electroforesi. Es cobreix amb una solució tampó (TAE) i es carreguen les mostres. Si el gel no es carrega en el moment, un cop solidificat es pot guardar a la nevera.

4.3.2. Segona sessió

4.3.2.1. Càrrega de les mostres

Abans de carregar les mostres en el gel, el DNA s’ha de barrejar amb tampó de càrrega (veure Annex) a una concentració final 1X. Aquest tampó de càrrega té dues funcions:

- Incrementar la densitat del DNA, fent que aquest s’enfonsi en els pouets.

- Donar una marca visual de com va migrant el DNA (ja que aquest no es veu).

45

Les barreges es faran en eppendorfs estèrils i utilitzant puntes estèrils; sent el DNA l’últim que s’hi afegeixi, just abans de carregar el gel.

Cada mostra de DNA es carrega en un carril diferent.

S’ha d’anar en compte de no enfonsar la punta de la micropipeta fins al fons del gel ja que el trencaria.

4.3.2.2. Electroforesi en gel d’agarosa

Un cop carregades totes les mostres es connectaran els elèctrodes en el sentit adequat i es posarà en marxa la font d’electroforesi. Deixarem córrer el gel durant 1h a 100V.

Important : Comproveu que està passant corrent, mirant les bombolles que surten dels elèctrodes.

Un cop s’ha acabat l’electroforesi, el gel es retira de la cubeta.

A continuació es procedeix a fer la fotografia digital del gel (Kodak Digital Science). Quan en fer la fotografia el gel sigui exposat a la llum UV, els diferents fragments de DNA emetran fluorescència donant un patró de bandes.

4.4. Resultats4.4.a) Feu un esquema dels resultats

46

Qüestions

1. Per què s’utilitza el fag lambda?

2. Què hagués passat si l’electroforesi s’hagués fet a 50V? I a 200V?

3. Quines diferències conformacionals hi ha entre un DNA genòmic i un DNA plasmídic?

4. Si observeu una taca fosca en un carril, què ens està indicant?

5. Si no observeu cap banda, a què pot ser degut?

BibliografiaSAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. Molecular Cloning. A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

48

ANNEX

TAE (1X) 20 mL TAE 50X + 980 mL H2O

TAE (Tris acetate) 50X (1L)242 g Tris-base57,1 mL àcid acètic glacial100 mL 0,5 M EDTA pH 8400 mL aiguaDissoldre i enrasar fins a 1L. No autoclavar. Guardar a TA.

EDTA 0.5M pH 8

Afegir 186,1 g d’àcid disodic etilendiaminotetraacètic. 2 H2O a 800mL d’aigua.

Agitar força amb la mosca magnètica. Ajustar el pH a 8 amb NaOH (aproximadament 20g de llenties de NaOH) i enrasar a 1L. Distribuir en alíquotes i autoclavar. L’EDTA no es dissoldrà fins que el pH no estigui al voltant de 8.

Tampó de càrrega

100 L TAE 50X300 L glicerol600 L H2O destil.ladaBromofenol (color blau)

Patró per a la determinació de la longitud del DNA (bp) -DNA BstEII

Nº bp 0 14.141 8.452 7.243 6.374 5.695 4.826 4.327 3.678 2.329 1.9310 1.3711 1.6412 70213 22414 117

49

PRÀCTICA 5. OBSERVACIÓ DE CROMOSOMES HUMANS.

5.1 Objectius

1) Observar preparacions de limfòcits de sang perifèrica humana amb la finalitat de familiaritzar-se amb el cariotip humà.

2) Observar canvis estructurals dels cromosomes.3) Observar cromosomes metafàsics amb tinció diferencial

(cromosomes "arlequinats").

5.2 Introducció

L'extracció i cultiu de teixit somàtic humà (generalment limfòcits de sang perifèrica) ofereix l'oportunitat d'observar cèl.lules mitòtiques amb el complement sencer de 23 parells de cromosomes (2n=46). En la mitosi, cada cromosoma s'ha duplicat per formar dues cromàtides que queden unides al centròmer fins a l'anafase (cromàtides germanes) per la qual cosa l'observació d'aquestes cèl.lules durant la metafase revela la presència de cromosomes en forma d'X (metacèntrics: centròmer equidistant d'ambdós extrems), i en forma de V (acrocèntrics: el centròmer es troba a prop d'un dels dos extrems). Segons la mida i la disposició del centròmer, els 46 cromosomes s'han dividit en set grups (A-G), segons la Figura 1. La distinció precisa de cada cromosoma es realitza en base a dades morfològiques (constriccions, satèl.lits) i amb l'observació del model únic de bandes que apareix quan es tenyeixen els cromosomes amb Giemsa o colorants de quinacrina.

Els canvis en el material genètic poden originar-se per: (1) mutació gènica o puntual (canvis en la seqüència de nucleòtids), (2) mutació

50

genòmica (canvis en el nombre de cromosomes) i (3) mutació cromosòmica (canvis estructurals). La finalitat de la pràctica és l'observació de cromosomes humans i les possibles modificacions estructurals que poden patir.

Figura 1. Cariotip humà

5.3 Desenvolupament de la pràctica

Per al desenvolupament de la pràctica l'alumne disposarà de tres preparacions de limfòcits de sang perifèrica humana. Cada una de les preparacions s'utilitzarà per a cada un dels tres objectius de la pràctica. A causa de la impossibilitat, en el temps i en l'espai, que l'alumne realitzi el procés complet fins a l'obtenció de les preparacions, aquest s'indica breument abans de cada apartat.

51

5.3.1 Observació d'un cariotip normal

S'obté una mostra de sang a través d'una punció venosa. S'estableix el cultiu amb l'addició en tub estèril dels components següents: medi de cultiu RPMI 1640, sèrum fetal de vedella, fitohemaglutinina, L-glutamina, antibiòtics (penicilina/estreptomicina) i sang perifèrica.

Els cultius s'incuben a 37C, durant 48 hores. Dues hores abans de finalitzar la incubació (a les 46 hores) s'hi afegeix un antimitòtic (colquicina o colcemid).

Posteriorment, les cèl.lules es centrifuguen a 1000 rpm durant 10 minuts i es resuspenen en clorur potàssic, tot mantenint els tubs a 37 C. La solució hipotònica permet la ruptura de les cèl.lules i la dilució del citoplasma.

Al cap de 20 minuts es realitza una altra centrifugació i es procedeix al rentat i fixació del cultiu. Aquest procés consisteix en resuspendre el botó cel.lular en metanol/àcid acètic (3/1), centrifugar i eliminar el sobrenedant. La fixació es repeteix unes tres vegades, fins obtenir el sobrenedant net. El metanol permet la precipitació de la cromatina i l'àcid acètic, la ruptura de les membranes i estructures citoplasmàtiques.

Les extensions es realitzen amb un goteig de dues o tres gotes del botó cel.lular net sobre un portaobjectes. Un cop els portaobjectes estan secs, es tenyeixen amb tinció homogènia (Giemsa en tampó fosfat), s'esbandeixen amb aigua i es munten permanentment en DPX.

5.3.1a) Observeu la preparació número 1 a 100 augments. Dibuixeu i indiqueu els diferents tipus de nuclis.

52

5.3.1.b) Observeu una metafase a 1000 augments. Dibuixeu-la i indiqueu el nombre de cromosomes.

2N=

5.3.1.c) Característiques més importants dels 7 grups de cromosomes:

Grups

Característiques

A

B

C

D

53

E

F

G

5.3.1d) A partir de l' observació, indiqueu i justifiqueu el sexe de l'individu analitzat.

5.3.2 Observació d'alteracions estructurals

L'exposició dels individus a determinats agents pot originar la inducció d'alteracions cromosòmiques que es poden observar fàcilment. Un efecte equivalent es pot provocar amb tractaments in vitro. Per fer-ho, després de 24 hores d'haver començat el cultiu, s'hi afegeix un volum adequat d'un mutagen (mitomicina C, ciclofosfamida, ). El procés de cultiu continua tal i com s'ha indicat en l'apartat anterior.

Segons el nombre de ruptures, de la seva localització i del patró segons el qual s'uneixin els extrems trencats, resulta una varietat extensa de

54

canvis estructurals: delecions o deficiències, inversions, translocacions, anells, dicèntrics, tri- i tetraradials.

5.3.2.a) Observeu les diferents metafases de la preparació número 2. Obteniu dues metafases en les quals s'hi observin reorganitzacions cromosòmiques, indiqueu esquemàticament els punts de ruptura i unió dels cromosomes involucrats en l'alteració.

5.3.3 Observació d'intercanvis entre cromàtides germanes (SCE)

Els intercanvis entre cromàtides germanes ("Sister Chromatid Exchanges", SCE) són intercanvis entre els loci homòlegs de cromàtides germanes, sense alterar la polaritat ni l'estructura de la doble hèlix, ni tampoc la morfologia del cromosoma, i que es poden visualitzar amb tinció diferencial d'ambdues cromàtides.

La diferència respecte a l'apartat anterior consisteix en que per a l'observació d'SCE s'hi ha d'afegir 5-brom-2-deoxiuridina, després de 24 hores d'haver començat el cultiu, i s'ha de perllongar fins a un total de 72 hores.

Les cèl.lules cultivades en presència de BrdU incorporen aquest anàleg en lloc de la timidina en el DNA sintetitzat i, després de dos cicles cel.lulars (72 hores), la diferència en el contingut de BrdU entre les dues cromàtides germanes es pot detectar amb tinció diferencial (tècnica de fluorescència més Giemsa).

55

5.3.3a) Observeu diferents metafases de la preparació. Indiqueu les característiques a nivell de tinció, dels cromosomes presents en una metafase de primera (M1), segona (M2) i tercera (M3) divisió i dibuixeu dos cromosomes tipus de cada una d'elles.

Metafase

Dibuix Característiques

M1

M2

M3

5.3.3b) Feu un esquema en el que s’indiqui la incorporació de BrdU durant 2 cicles de replicació.

56

5.3.3c) Seleccioneu una metafase M2. Realitzeu el recompte de cromosomes i d'intercanvis entre cromàtides germanes, i indiqueu-los gràficament.

5.4. Qüestions

1.Quina és la finalitat d'afegir mitogen en el cultiu?2. Quin efecte té l'addició de l'antimitòtic en l'observació de cromosomes?3. Per què l'observació de cromosomes es realitza generalment en metafase?4. Les aberracions estructurals, poden considerar-se mutacions?5. Per què la replicació semiconservativa del DNA permet l’observació de SCE?

57

5.5 Bibliografia

SUZUKI, D.T., GRIFFITHS, A.J., MILLER, J.H. i LEWONTIN, R.C. 1992. Introducción al análisis genético. Interamericana/Mcgraw-Hill, Madrid.

58

PRÀCTICA 6.PREPARACIÓ DELS CROMOSOMES POLITÈNICS DE DROSOPHILA BUZZATII. MAPES CITOLÒGICS I OBSERVACIÓ D’INVERSIONS PARACÈNTRIQUES.

Objectius

1) Obtenir preparacions de cromosomes politènics amb la finalitat de determinar els diferents elements del cariotip.

2) Reconèixer les ordenacions diferents presents en poblacions de D. buzzatii a partir d’homocariotips i heterocariotips. Per fer-ho, es procedirà a comparar els individus amb ordenacions diferents i determinar els punts de trencament.

Introducció

La majoria d’estudis citogenètics es realitzen sobre cromosomes altament compactats, particularment en la metafase mitòtica. Malgrat això, en molts dípters existeixen cromosomes gegants en les glàndules salivals larvàries que són especialment apropiats per a estudis genètics i evolutius. Aquests cromosomes estan formats per nombroses fibres de DNA disposades en paral·lel produïdes per duplicacions successives del material genètic sense divisió cel·lular. Es coneixen amb el nom de politènics. Degut a què són cromosomes interfàsics, estan molt descompactats. Per altra banda, la precisió de l’aparellament de les diferents fibres produeix una topografia característica que es pot manifestar amb més claredat utilitzant alguns colorants. Aleshores s’observen zones fosques i primes, a les quals se les ha anomenat bandes, que estan separades per unes zones menys tenyides, o interbandes. A més a més, s’observen engruiximents i constriccions que faciliten el reconeixement de les diferents zones del cromosoma. Finalment, els extrems terminals dels cromosomes presenten també morfologies

59

característiques que permeten el reconeixement senzill dels diferents cromosomes.

Els cromosomes politènics s’han utilitzat amb propòsits molt diversos. Se’n poden destacar en particular tres:

- Localització de gens: existeixen diverses tècniques clàssiques per tal de localitzar amb precisió funcions gèniques que es poden detectar fenotípicament. Malgrat això, el procediment més utilitzat actualment es fonamenta en la tècnica d’hibridació DNA-DNA. Un fragment clonat de DNA (que s’anomena sonda) es marca amb triti radioactiu o bé incorporant-li molècules (biotina, digoxigenina) contra les quals es tenen anticossos específics. Aquest DNA sonda marcat s’hibrida sobre els cromosomes politènics (hibridació in situ) i es procedeix a continuació a la seva detecció amb l’autoradiografia (si la sonda és radioactiva) o bé amb una reacció enzimàtica molt particular (utilitzant un anticòs que s’uneix a les molècules que s’han incorporat a la sonda i que, alhora, està unit a un enzim, com per exemple la fosfatasa alcalina). D’aquesta manera, es poden detectar les regions, una o més, en les quals es troba una seqüència determinada amb una precisió que es pot estimar com a menor de 100 kb en els casos que són més favorables.

- Activitat transcripcional: algunes de les zones dels cromosomes politènics es descondensen molt sota condicions ambientals determinades (com els xocs tèrmics) o bé aplicant certes substàncies químiques. Aquestes zones s’han anomenat "puffs". Actualment, se sap que aquesta desespiralització està relacionada amb l’augment de l’activitat transcripcional.

- Polimorfisme cromosòmic i reconeixement de variacions estructurals en els cromosomes: moltes espècies de Drosophila presenten polimorfisme cromosòmic, és a dir, que diferents organismes presenten variacions en la forma en la qual els seus gens estan ordenats en un cromosoma determinat. Aquestes ordenacions diferents es poden detectar amb molta més facilitat en els cromosomes politènics que en els mitòtics,

60

donada la seva major grandària. L’alteració estructural més freqüent en Drosophila és la inversió d’un segment cromosòmic.

En encreuar-se organismes amb diferents ordenacions produiran individus heterocariotípics, és a dir, portadors en els seus cromosomes homòlegs d’ordenacions diferenciades per una o més inversions. Degut a què, en els cromosomes politènics, els homòlegs es troben aparellats banda a banda al llarg de tota la seva longitud (sinapsi), es produeixen figures peculiars, anomenades bucles o nanses d’inversió, per poder acomodar les diferents ordenacions. En la Figura 1 es mostra un bucle senzill, que és el que es produeix en un heterocariotip on les dues ordenacions es diferencien en una sola inversió. Quan les diferències entre dues ordenacions són més complexes, els bucles també són més complicats i difícils d’interpretar.

L’aparició d’una nova ordenació cromosòmica és deguda a una mutació que requereix que es produeixin dues o més ruptures cromosòmiques que es reparen erròniament. A més a més, perquè actualment ens trobem una determinada ordenació cromosòmica en condicions naturals cal que no sigui deletèria per als organismes que la porten. Algunes d’aquestes ordenacions han existit en poblacions naturals durant milions d’anys. D’aquesta manera, podem suposar que la probabilitat que una determinada ordenació s’hagi produït dues o més vegades i que, a més a més, en diverses ocasions s’hagi mantingut en condicions naturals, és molt baixa. Aquesta suposició ha estat utilitzada com a fonament per a l’elaboració de filogènies cromosòmiques, és a dir, per establir les relacions existents entre diferents organismes a partir de la semblança de les seves ordenacions cromosòmiques: dos organismes que comparteixin una ordenació procediran d’un tronc comú.

Peculiaritats de D. buzzatii

61

És obvi que existeixen certes diferències entre les diferents espècies del gènere Drosophila. D. buzzatii, l’espècie que utilitzem en aquesta pràctica, pertany a un grup d’espècies (grup repleta) que està molt allunyat de D. melanogaster. De fet, ambdues espècies pertanyen a subgèneres diferents. D’aquesta forma, es comprèn que existeixin diferències morfològiques importants entre elles, que s’observaran en aquesta pràctica.

El cicle biològic de D. buzzatii és una mica més llarg que el de D. melanogaster; dura uns 15 dies a 25 C. Les femelles maduren sexualment a les 24 hores de la seva emergència i els mascles ho fan a les 48 hores aproximadament. D’aquesta forma, es poden allargar els períodes de temps entre les separacions de mascles i femelles verge, usualment fins a 24 hores,

sense por que les femelles hagin estat inseminades.

Figura 1. Cromosomes de larves de Drosophila pseudoobscura heterozigòtiques per a les ordenacions Arrowhead i Standard del tercer cromosoma. El bucle que es forma s’esquematitza a l’esquerra.

62

Una altra diferència interessant amb D. melanogaster és que, mentre que aquesta espècie té quatre parells de cromosomes, D. buzzatii en té sis (2n=12). Els cromosomes politènics de D. buzzatii han estat profundament estudiats, i se sap que dos d’ells (anomenats 2 i 4) presenten polimorfisme en poblacions naturals. Les diferents ordenacions cromosòmiques es diferencien entre si per inversions paracèntriques.

L’observació d’aquest polimorfisme d’inversions es pot realitzar amb l’obtenció de cromosomes politènics a partir de la dissecció de glàndules salivals de les larves de tercer estadi.

La Figura 2 mostra un tall longitudinal d’una larva de tercer estadi de Drosophila. Les glàndules salivals estan situades en la part anterior de la larva.

Figura 2. Estructures internes de la larva de Drosophila.

63


La pràctica es desenvoluparà en dues sessions (5h). En la primera sessió es procedirà a obtenir preparacions de diferents individus, homo i heterocariotips. En la segona, s’observaran aquestes preparacions al microscopi.

SESSIÓ 1

a) Obteniu un mínim de sis preparacions de cromosomes politènics de larves de D. buzzatii, homo i heterocariotípiques, segons el protocol de dissecció següent de les glàndules salivals i obtenció de cromosomes politènics de larves de D. buzzatii.

Per poder reconèixer i separar les glàndules salivals larvàries cal utilitzar una lupa de dissecció. Se seleccionen les larves més grans i amb els espiracles anteriors ataronjats. Aquestes larves s’introdueixen en una càpsula de Petri amb alcohol acètic (3 parts d’etanol per una part d’àcid acètic 60%) i se subjecten tot col·locant una agulla emmanegada al principi del terç posterior de la larva. Immediatament, es col·loca la segona agulla emmanegada sobre les mandíbules. Aquesta última agulla es mou aleshores amb suavitat cap a fora, de forma que la part anterior se separi de la resta del cos. Aleshores, es podran reconèixer les glàndules salivals i altres estructures internes de la larva.

Amb ajuda de les agulles es poden netejar les glàndules dels cossos grassos que les envolten i transferir-les a un portaobjectes amb una gota d’orceïna acètico-làctica, un colorant amb una gran afinitat per a la cromatina. Després de tenyir durant 30 minuts es procedeix a col·locar un cobreobjectes i aixafar la preparació entre fulls de paper de filtre per

64

estendre els cromosomes i enretirar l’excés de colorant. L’observació es realitza a 100 i 400 augments, en un microscopi convencional.

65

SESSIÓ 2

b) Establiu les diferències morfològiques existents entre els diferents cromosomes d’aquesta espècie. Per fer-ho, s’han de comparar els cromosomes observats amb els esquemes de la Figura 3.

Cromosoma

Característiques morfològiques diferencials

X

Y

2

3

4

5

6

c) Esquematitzeu un nucli complet, mostrant les principals característiques dels cromosomes (bandes i interbandes, engruiximents i constriccions, centròmers i telòmers, etc).

66

Figura 3. Cromosomes politènics de Drosophila buzzatii.

67

d) Determineu l’existència de bucles d’inversió. Si apareixen, dibuixeu-los i afegiu un esquema que els interpreti.

e) Determineu els punts de ruptura que expliquen les diferents ordenacions cromosòmiques.

68

Qüestions.

1.Diferències entre poliploïdia i politènia.2. Per què certes cèl·lules de la larva tenen cromosomes politènics i d’altres no?3. Sabent que es poden produir fins a 10 duplicacions sense divisió cel·lular, calculeu el nombre final de cromàtides en una cèl·lula de la glàndula salival.4. Quines diferències existeixen entre els cromosomes politènics i els metafàsics? A què són degudes les diferències en compactació entre els dos tipus de cromosomes?5. Si en una població existeixen tres ordenacions diferents per a un cromosoma determinat, quants genotips diferents s’hi podran trobar? 6. Deduïu la morfologia dels diferents bucles que es produirien en un heterocariotip per a ordenacions diferenciades en dues inversions. Heu de tenir en compte que existeixen 4 casos:

a) que les inversions siguin independents (es produeixen en zones diferents del cromosoma)

b) que siguin adjacents (un punt de trencament comú, les dues en tàndem, una al costat de l’altra)

c) que siguin imbricades (un fragment cromosòmic ha estat inclòs en les dues inversions, solapen parcialment)

d) que una estigui inclosa en l’altra.7. Indiqueu quina informació ens proporciona un estudi citogenètic si volem determinar la relació filogenètica existent entre dues espècies.

Bibliografia

ALBERTS, B. et al. 1989, Molecular biology of the cell. (Segona edició), pp.502-514.DOBZHANSKY, T. 1970, Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press, pp.129-164.

69

HILL, R.J. i RUDKIN, G.T. 1987, Polytene chromosomes: the status of the band-interband question. BioEssays, 7: 35-40.MIKLOS, G.L. i COTSELL, J.N. 1990, Chromosome structure at interfaces between major chromatin types: alpha- and beta- heterochromatin. BioEssays, 12: 1-6.

70

PRÀCTICA 7APLICACIÓ DE LA BIOINFORMÀTICA A LA GENÈTICA

Objectius

L’objectiu d’aquesta pràctica és introduir l’alumne a l’ús de la xarxa internet des del punt de vista de l’investigador en genètica, conèixer les possibilitats que s’ofereixen en aquest camp i saber utilitzar-les.

Introducció

Els avanços en les tècniques de biologia molecular han permès obtenir en els darrers anys gran quantitat d'informació genètica. Així, tècniques com el mapatge de gens i la seqüenciació de genomes complets, com ara la dels anomenats organismes models (Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Escherichia coli, Saccaromyces cerevisiae...) i també del genoma humà han generat una enorme quantitat de

dades tant moleculars com de literatura científica. Alguns exemples il·lustren aquest augment espectacular en la generació de quantitat d’informació:

Des de l’any 1995 fins l’actualitat s’han completat i publicat 303 genomes complets, des d’organismes procariotes com el Mycoplama genitalium amb un genoma petit de només 580 Kb fins al complex genoma humà de 3.200 Mb.

L’any 1.974 es va publicar The handbook of nucleic acid sequences (Barrell i Clark), que contenia totes les seqüències de DNA i de RNA conegudes en aquell moment; això és, 51 seqüències de tRNA, 11 de 5S rRNA, algunes de virus i de mRNAs, i 9 seqüències de DNA la més llarga de les quals era de 89 nucleòtids. En conjunt això representava un total de 10.000 nucleòtids. Actualment a la base de dades del GenBank hi ha 51.674.486.881 parells de bases en 46.947.388 seqüències. Només entre el mes de juny i agost del 2005 es van introduir 1.711.137 noves seqüències, que suposen un total

71

de 2.275.634.759 pb.

La base de dades de publicacions anomenada Medline, produïda per la U.S. National Library of Medicine (NLM) accessible a través del PubMed, actualment conté informació sobre 15.000.000 articles científics en revistes biomèdiques.

Un dels reptes més importants de la Biologia del segle XXI és com recollir, classificar i manipular aquesta enorme quantitat d’informació. Sortosament, avui disposem d’una eina clau per accedir a ella i gestionar-la: és internet. S’han desenvolupat diverses bases de dades per tal d’emmagatzemar aquest tipus d’informació i gestionar-la, i internet ofereix la possibilitat de consultar-ho fàcilment des del propi lloc de treball i des de qualsevol lloc del món, amb una simple connexió. Inicialment, internet s’utilitzava en aquest camp per a obtenir software o arxius de bases de dades, i per a comunicar els centres de recerca entre ells. Actualment, és no només factible sinó bàsic, dur a terme recerques interactives en aquestes bases de dades. De fet, podem afirmar que avui, pràcticament, és difícil fer investigació biològica sense utilitzar els recursos d’internet.

El desenvolupament de la bioinformàtica ha generat tècniques d’anàlisi de seqüències d’àcids nucleics i proteïnes amb múltiples objectius: determinació d’homologies, alineament de seqüències homòlogues, predicció d’estructures, filogènies, evolució molecular, disseny de fàrmacs, etc Algunes d’aquestes tècniques han donat lloc a productes comercials i altres a eines d’ús públic lliurement disponibles a internet.

A la pràctica veurem algunes d’aquestes bases de dades públiques, tant de seqüències com bibliogràfiques, i aprendrem a utilitzar-les. A més d’accedir a les bases de dades, aprendrem a fer anàlisis de comparació de seqüències de DNA i a interpretar-les.

72


La pràctica es durà a terme a l’aula d’informàtica i es farà seguint un tutorial d’una pàgina web creada a aquest efecte:

http://bioinformatica.uab.es/genetica/pr7

Els principals punts que tractarem en aquesta pràctica són:

1) Cerca d’informació genètica a la xarxa: les bases de dades2) Programes d’anàlisi de seqüències

Els diferents llocs que anirem visitant en aquesta pràctica estan tots lligats a dos grans organismes: el NCBI (National Centre for Biotechnology Information) d’Estats Units i el EBI (European Bioinformatics Institute). En tots dos casos, a través de les respectives pàgines web, aquestes institucions ens donen accés a les principals bases de dades i programes d’anàlisi. En molts casos, comparteixen informació, de manera que el que podem trobar en un d’aquests llocs també està en l’altre. En aquesta pràctica anirem a veure principalment les bases de dades i alguns programes d’anàlisi del NCBI, però també utilitzarem alguns recursos de l’EBI, així com altres bases de dades diferents.

Bases de dades

Com hem comentat anteriorment, en els darrers anys s’està generant una gran quantitat d’informació en forma de seqüències de DNA i tota la informació associada que això implica (proteïnes, mapes, literatura científica,...). Aquesta informació s’emmagatzema en bases de dades internacionals a les quals els investigadors envien les seqüències i informació adjunta. L’ús de bases de dades és bàsic per a manipular tota aquesta informació i fer-la accessible a la comunitat científica. Un gran avantatge que facilita la cerca d’informació és la interconnexió que hi ha entre els diferents tipus d’informació, de manera que quan busquem informació en una base de dades concreta, sovint obtindrem, a més,

73

http://bioinformatica.uab.es/genetica/pr7

enllaços directes cap a la informació relacionada que es troba en altres bases de dades.

GenBank – seqüènciesEl GenBank és la base de dades de les seqüències de DNA i RNA, una recopilació de totes les seqüències disponibles públicament. GenBank és part del International Nucleotide Sequence Database Collaboration, que comprèn el DNA DataBank of Japan (DDBJ), el European Molecular Biology Laboratory (EMBL), i el GenBank del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Aquestes organitzacions intercanvien dades diàriament, de manera que el que anomenem habitualment GenBank conté també la informació introduïda en els altres llocs. Per tant, estem accedint a la mateixa base de dades i a la mateixa informació independentment del lloc per on entrem. Les seqüències del GenBank són d’accés lliure per tal que tots els científics del món les puguin utilitzar. De fet, perquè un treball sigui acceptat per a ser publicat en una revista científica cal que les noves seqüències hagin estat enviades al GenBank per a fer-les disponibles per a tota la comunitat científica.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar

PubMed – articles científicsPer a un científic és fonamental estar al dia dels articles científics que la recerca genera en el seu camp d’investigació. Els articles científics són la manera de donar a conèixer els descobriments que es fan constantment en la recerca genètica. Donat que el volum de publicacions està augmentant a un ritme vertiginós resulta de gran utilitat poder fer la recerca bibliogràfica des del propi ordinador. La base bibliogràfica més utilitzada en l’àrea de biologia i medicina, i per tant en genètica, és el PubMed. El PubMed va ser dissenyat per donar accés a cites de tots els articles i publicacions biomèdiques. La recerca en el PubMed es pot fer per autor, per any, per revista científica i per paraules clau, entre d’altres formes, i permet accedir a un resum o abstract dels articles. A més, en molts casos també proporciona enllaços a les pàgines web de les revistes científiques

74

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar

que ens permeten anar directament a veure el text complet dels articles que ens interessen. També proporciona enllaços amb totes les altres bases de dades, de manera que podem accedir directament a les seqüències esmentades en un article determinat, a les malalties que s’hi descriuen, etc.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed

OMIM – malalties genètiquesL’OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) és la base de dades de les malalties humanes hereditàries o d’origen genètic. En aquesta base de dades trobarem informació sobre gens humans i els desordres genètics que poden causar. Aquesta base de dades conté descripcions d’aquests desordres, així com enllaços a les diferents bases de dades de bibliografia, seqüències i molts altres recursos disponibles. Aquest catàleg de gens i malalties humanes associades és creat i mantingut per científics de la Johns Hopkins University amb el suport del NCBI.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

Entrez Gene – gensL’Entrez Gene és una base de dades del NCBI basada en gens. És a dir, que centralitza tota la informació sobre un gen que d’una altra manera només podríem trobar consultant moltes bases de dades diferents. No inclou tots els gens coneguts o predits, sinó que Entrez Gene es centra en els genomes que han estat completament seqüenciats o que tenen una comunitat de recerca activa que contribueix amb molta informació específica sobre gens. El contingut de Entrez Gene representa la integració de diverses bases de dades. Per a cada gen podem trobar informació com la localització cromosòmica, els trànscrits i proteïnes que produeix, el fenotip que genera, així com enllaços a les seqüències, articles, variacions, dades d’expressió, gens homòlegs en altres espècies, dominis proteics... Aquesta informació és actualitzada cada cop que n’hi ha de nova.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene

75

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed

FlyBase – DrosophilaEl FlyBase és una base de dades d’informació genètica i molecular de Drosophila melanogaster. El FlyBase és mantingut per un consorci d’investigadors que inclou biòlegs que treballen en Drosophila i bioinformàtics de la Harvard University, la University of Cambridge (Regne Unit), l’Indiana University, la University of California, Berkeley, així com l’European Bioinformatics Institute. En el FlyBase podem trobar tot tipus d’informació sobre gens i al·lels mutants, expressió gènica, funcions de les proteïnes, mapes genètics, aberracions cromosòmiques, soques... i molts altres tipus d’informació, sempre referent a Drosophila. Tota aquesta informació del FlyBase també té els seus corresponents enllaços amb les respectives bases de dades (el GenBank per les seqüències, el PubMed per a la bibliografia...).http://FlyBase.org

Uniprot – proteïnesUniProt (Universal Protein Resource) és la principal base de dades de proteïnes. És el magatzem central de seqüències de proteïnes i les seves funcions, ja que va ser creat unint la informació continguda en altres bases de seqüències proteiques: Swiss-Prot, TrEMBL, i PIR. En aquesta base de dades, per a cada seqüència proteica podem trobar informació com la descripció de la seva funció, la seva estructura i dominis, les modificacions post-transcripcionals, les seves variants, etc.http://www.ebi.uniprot.org/index.shtml

Programes d’anàlisi de seqüències

Quan els científics i investigadors obtenen noves seqüències, el primer pas és tractar de trobar què hi ha “amagat” en aquestes seqüències. Per exemple, pot ser que una seqüència contingui un gen, però hem de ser capaços de trobar-lo dins la nostra seqüència i delimitar-ne la regió codificant. Per això necessitem els programes d’anàlisi de seqüències. Aquests programes ens permeten buscar seqüències similars

76

http://www.ebi.uniprot.org/index.shtml

http://flybase.org/

a la nostra a les bases de dades o comparar la nostra seqüència amb d’altres de semblants per trobar les parts que s’assemblen, o els canvis que les diferencien. Avui utilitzarem dos dels principals programes d’anàlisi: el BLAST del NCBI i el ClustalW de l’EBI.

BLAST – Cerca per similitud de seqüènciesLa semblança de dues seqüències pot estar indicant que aquestes seqüències tenen funcions similars o que tenen un mateix origen. Per tant, el fet de trobar seqüències similars a una de nova és una manera d’obtenir informació sobre la nova seqüència. El problema és que actualment, donat el gran volum de seqüències, resulta impossible poder fer una comparació manual d’una seqüència determinada per l’investigador amb tota la base de dades de les seqüències per a trobar-ne altres de similars. Per això la consulta a un servidor de seqüències biològiques es fa a través d’algoritmes de comparació, els més utilitzats dels quals són BLAST (del NCBI) i FASTA (de l’EMBL), que realitzen recerques de similitud de seqüències (sequence similarity searches).El BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)és un programa capaç de trobar regions amb similaritat al comparar seqüències. Aquest algoritme compara una seqüència de nucleòtids o proteïnes que nosaltres li proporcionem amb tota la base de dades de seqüències i calcula la significació estadística de les possibles seqüències similars que troba. Per tant, el BLAST pot ser utilitzat per inferir relacions funcionals i evolutives entre seqüències.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

ClustalW – Alineament múltiple de seqüènciesEl ClustalW és un programa d’alineament múltiple de seqüències de DNA o proteïna. Aquest programa calcula la semblança entre les seqüències d’un conjunt que nosaltres li proporcionem i les alinea de manera que es puguin veure clarament les identitats, similaritats i diferències entre les seqüències. Això ens permet la fàcil detecció de canvis entre diferents seqüències relacionades, així com l’establiment de relacions evolutives entre les seqüències.http://www.ebi.ac.uk/clustalw/

77

http://www.ebi.ac.uk/clustalw/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

EXERCICI 1BUSCAR INFORMACIÓ SOBRE UNA SEQÜÈNCIA DESCONEGUDA

Estàs treballant en un laboratori i has clonat i seqüenciat un fragment de DNA de 420 bp. Primer de tot vols esbrinar si aquest fragment ja ha estat seqüenciat prèviament, ja que en aquest cas potser la seqüència ja ha estat caracteritzada per altres investigadors i pots trobar informació sobre ella en les bases de dades corresponents. Per fer això cal utilitzar un programa anomenat BLASTn que permet buscar seqüències semblants a una que nosaltres tenim. Copia la teva seqüència i enganxa-la al formulari del BLASTn. Les preguntes que vols respondre són:

a) A quina espècie pertany la seqüència?

b) Correspon aquesta seqüència a un gen o a una regió no codificant del genoma? Si és un gen, de quin es tracta?

c) Hi ha seqüències homòlogues en altres espècies properes? En quines espècies? Anomena cinc espècies.

Un cop ja saps de quin gen es tracta, vols veure què es coneix sobre aquest gen i la seva funció. Per cercar informació sobre un gen aniràs a una base de dades de gens que s’anomena Entrez-gene. Aquí pots introduir el nom del gen que t’interessa i obtindràs una pàgina amb un munt d’informació sobre aquest gen i enllaços a diferents bases de dades on es donen encara més detalls sobre determinats aspectes. Contesta les següents preguntes:

d) En quin cromosoma es troba aquest gen?

79

e) Quins gens té al seu costat?

f) Quins efectes fenotípics té la mutació d’aquest gen? Causa alguna malaltia?

g) En quins processos cel·lulars està implicada la proteïna codificada per aquest gen?

REFERÈNCIES

Lai, C.S., Fisher, S.E., Hurst, J.A., Vargha-Khadem, F. i Monaco, A.P. (2001) A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature 413: 519-523.

EXERCICI 2L’ESTRUCTURA D’UN GEN

Has estat cercant a les bases de dades la seqüència del gen vermilion de Drosophila melanogaster, i has trobat dues seqüències diferents que corresponen a aquest gen. Alinea aquestes dues seqüències utilitzant el programa ClustalW i contesta les següents preguntes:

a) Hi ha alguna diferència entre les dues seqüències? Quin tipus de diferència és?

80

b) Quins són els dos nucleòtids dels extrems en cadascun dels forats? Corresponen a algun tipus de senyal?

81

c) A què corresponen aquests forats?

d) Què diries que és cadascuna de les dues seqüències?

e) Per què la seqüència 2 no comença amb els nucleòtids ATG que codifiquen per a l’aminoàcid d’iniciació Metionina? Per què no acaba amb un codó stop?

Alguns organismes com Drosophila melanogaster tenen una base de dades pròpia, que en aquest cas s’anomena FlyBase. Vés al FlyBase i entra, dins l’apartat de Genes de la pàgina inicial, on posa Search Genes. Busca el gen vermilion en aquesta base de dades per veure tota la informació que hi ha disponible sobre aquest gen. Contesta aquestes preguntes:

f) En quin cromosoma es troba aquest gen?

g) Quants exons té? Quants introns té?

h) Quina és la funció molecular de la proteïna que codifica aquest gen?

i) En quin procés biològic està implicada aquesta proteïna?

82

EXERCICI 3L’ALBINISME DEL FLOQUET DE NEU

El Floquet de Neu va ser capturat l’any 1966 a Guinea Equatorial quan només era un petit goril·la d’aproximadament 2 anys d’edat. El seu cabell era blanc, la seva pell rosada i sense pigues i tenia els ulls blaus. Quan va arribar al Zoo de Barcelona se li va fer un examen dermatològic i biòpsies de la seva pell, que es va trobar que presentava les característiques pròpies de l’albinisme oculocutani tipus I (OCA1). Vés a la base de dades de les malalties genètiques (OMIM) i busca aquesta malaltia (albinism en anglès).

a) Quin és el gen responsable d’aquesta malaltia?

b) En quin cromosoma es troba?

c) És l’albinisme un tret recessiu o dominant? És d’herència autosòmica o lligada al sexe?

Un grup de recerca de Barcelona va seqüenciar fa uns anys la regió codificant del gen causant

de l’albinisme del Floquet de Neu. Fes l’alineament de l’al·lel normal de goril·la, que

correspon a un goril·la negre anomenat Ndengue, amb la seqüència nucleotídica del Floquet

de Neu, que no presenta activitat d’aquest enzim. Utilitza el ClustalW per fer l’alineament.

Tingues en compte que algunes d’aquestes seqüències nucleotídiques inclouen símbols diferents dels 4 nucleòtids. A l’annex trobaràs una taula amb el significat d’aquestes lletres.

83

d) Quants canvis de nucleòtids hi ha entre els dos goril·les?

Per últim, obre una altra finestra amb el ClustalW i fes també l’alineament de les proteïnes

del goril·la normal i del Floquet. Amb ajut dels dos alineaments, contesta les preguntes:

e) Quants canvis d’aminoàcids hi ha entre els dos goril·les?

f) Per què hi ha sempre menys canvis d’aminoàcid que de nucleòtids?

g) El Floquet té alguna mutació en la regió codificant d’aquest gen que expliqui perquè l’enzim no és actiu en la seva pell?

h) Com expliques que el Floquet de Neu sigui albí, doncs?

REFERÈNCIES

MARTÍNEZ-ARIAS, R., COMAS, D., ANDRÉS, A., ABELLÓ, M.T., DOMINGO-ROURA, X. i BERTRANPETIT, J. (2000) The tyrosinase gene in gorillas and the albinism of 'Snowflake'. Pigment Cell Research 13: 467-470

EXERCICI 4MUTACIONS EN UN GEN HUMÀ

Estem estudiant un dels gens de la cadena pesada de la miosina anomenat MYH16 en el genoma del ximpanzé. Hem seqüenciat diversos

84

exons d’aquest gen i volem comprovar el nivell de conservació de la seqüència d’aquests exons en diferents espècies. No hem seqüenciat tot el gen complet (incloent els introns) perquè es tracta un gen molt gran que ocupa unes 68 Mb en total i a nosaltres no ens interessen els introns, que són la major part de la seqüència, sinó els exons que codifiquen per la proteïna. Avui acabem de seqüenciar l’exó 18 (de 42 exons que té el gen) i hem de buscar les seqüències homòlogues en altres espècies. Per fer-ho utilitzem el BLASTn. Copia i enganxa la seqüència de l’exó 18 del ximpanzé al formulari del BLAST. Quan tinguis el resultat, contesta les següents preguntes (en aquest BLAST mirarem només dins dels 10 primers resultats de la llista):

a) A quines espècies pertanyen els millors resultats del BLAST? Hi ha seqüències similars en humans? A quin grup d’organismes pertanyen aquestes espècies?

b) Mira els alineaments de la seqüència del ximpanzé amb la de dos o tres espècies diferents més. Hi ha alguna diferència entre les seqüències de ximpanzé i les de les altres espècies?

c) Ara vés a veure els alineaments de la seqüència del ximpanzé amb la d’humans. Hi ha alguna diferència important entre les seqüències d’humans i ximpanzés?

d) Si tenim en compte que la nostra seqüència és un exó d’un gen, és a dir, que codifica per part d’una proteïna, creus que la seqüència de la proteïna es pot veure afectada per aquesta diferència?

85

Per veure si la seqüència proteica d’aquest gen està afectada per la presència d’aquest canvi, farem la traducció a proteïna d’aquest exó en ximpanzés i humans utilitzant un programa anomenat Transeq. Copia i enganxa les seqüències de l’exó 18 d’humans i ximpanzés (les dues alhora i en format FASTA). El resultat que obtindrem és la traducció a proteïna d’aquest exó en cadascuna de les espècies. Els aminoàcids us són donats amb el codi d’una sola lletra, no en el codi de tres lletres. A l’annex trobaràs una taula amb l’aminoàcid que correspon a cada lletra. Contesta les següents preguntes:

e) Quants aminoàcids hi ha iguals als dos fragments de proteïna?

f) Quin canvi hi ha hagut la seqüència de la proteïna? Tenint en compte que aquest gen té 42 exons, i que aquest és només l’exó 18, què creus que ha passat amb aquesta proteïna en l’espècie humana? Serà més curta, més llarga o igual que la de ximpanzé? Creus que serà activa?

g) Ara que saps que hi ha hagut un canvi molt important en la proteïna, i després de veure com és aquesta seqüència en les altres espècies de primats, que creus que ha passat amb aquests nucleòtids de diferència? S’han inserit en humans o han estat eliminats de la seqüència del ximpanzé?

REFERÈNCIES

STEDMAN, H.H., KOZYAK, B.W., NELSON, A., THESIER, D.M., SU, L.T., LOW, D.W., BRIDGES, C.R., SHRAGER, J.B., MINUGH-PURVIS, N. i MITCHELL, M.A. (2004) Myosin gene mutation correlates with anatomical changes in the

86

human lineage. Nature 428: 415-418.

EXERCICI 5EL COLOR DELS MAMUTS

El producte del gen Mc1r (Melanocortin type 1 receptor) és una proteïna clau en la determinació del color dels cabells tant en humans com en altres animals. L’activitat reduïda d’aquest gen resulta en cabells vermells en humans i vaques i en cabell vermell o ros en ratolins, cavalls i gossos. Recentment, s’han seqüenciat 1236 pb d’aquest gen a partir de DNA obtingut d’un os de mamut de Sibèria que tenia 43.000 anys d’antiguitat.

87

a) Cerca les seqüències nucleotídiques del gen Mc1r de l’espècie Mammuthus primigenius a la base de dades del GenBank. Quantes seqüències has obtingut?

b) Com expliques que s’hagi obtingut més d’una seqüència pel mateix gen a partir del DNA d’un sol os de mamut?

Copia les seqüències en format FASTA en un document de text. Per facilitar treballar amb elles, canvia la primera línia pel nom de l’espècie i els números 1,2,3... (Sense espais).

c) Compara les diferents seqüències de mamut mitjançant el programa ClustalW i digues quants canvis nucleotídics hi ha entre elles.

d) Ara, busca les seqüències proteiques codificades pel gen Mc1r de l’espècie Mammuthus primigenius a la base de dades de proteïnes del NCBI i compara-les mitjançant el programa ClustalW. Quants dels canvis observats a les seqüències nucleotídiques donen lloc a canvis aminoacídics?

Busca a Genbank la seqüència nucleotídica del gen Mc1r de l’elefant (Elephas maximus) i alinea-la amb les seqüències nucleotídiques de mamut utilitzant el programa ClustalW.

e) Quants canvis nucleotídics observes que siguin propis de l’elefant?

88

f) Tenint en compte la seqüència de l’elefant, digues quin dels al·lels del mamut és l’al·lel derivat i quin és l’al·lel primitiu.

g) En mostres recollides del permafrost s’han trobat pèls de mamut foscos i clars. Sabent que el pèl dels elefants és fosc, quin al·lel devien tenir en el gen Mc1r els mamuts rossos?

REFERÈNCIES

ROMPLER H, ROHLAND N, LALUEZA-FOX C, WILLERSLEV E, KUZNETSOVA T, RABEDER G, BERTRANPETIT J, SCHONEBERG T, i HOFREITER M. (2006) Nuclear gene indicates coat-color polymorphism in mammoths. Science 313: 62.

EXERCICI 6BUSCAR INFORMACIÓ SOBRE UNA SEQÜÈNCIA DESCONEGUDA

Hem sequenciat un fragment de DNA d’una regió del cromosoma 21 humà que estem estudiant. Volem saber si la nostra seqüència és part d’algun gen o és una regió no codificant. Per saber-ho fem un BLASTn que ens permetrà detectar si la nostra seqüència és similar a algun gen o no.Copia i enganxa la teva seqüència en el formulari del BLAST. Un cop tinguis el resultat del BLAST, contesta les següents preguntes:

a) A quina espècie pertanyen les seqüències que s’assemblen a la nostra?

89

b) Són totes les seqüencies diferents versions de la mateixa (en diferents individus seqüenciats, per exemple) o pertanyen a diferents cromosomes d’una mateixa espècie?

c) Diries que aquesta seqüència correspon a algun gen?

d) Si la nostra seqüència es troba a la vegada en diferents cromosomes d’una mateixa espècie, què podria ser aquesta seqüència?

ANNEX

CODI DELS AMINOÀCIDSCodi (1 lletra)

Codi (3 lletres)

Aminoàcid

A Ala AlaninaR Arg ArgininaN Asn AsparaginaD Asp AspartatC Cys CisteínaQ Gln GlutaminaE Glu Àcid glutàmicG Gly GlicinaH His HistidinaI Ile IsoleucinaL Leu LeucinaK Lys LisinaM Met MetioninaF Phe FenilalaninaP Pro ProlinaS Ser SerinaT Thr TreoninaW Trp Triptòfan

90

Y Tyr TirosinaV Val Valina* * STOP

91

LLETRES MÉS COMUNS UTILITZADES A LES SEQÜÈNCIES DE DNA

Codi (1 lletra)

Nucleòtid Categoria

A Adenina PurinaC Citosina PirimidinaG Guanina PurinaT Timina PirimidinaN Qualsevol

nucleòtid/

R A ó G PurinesY C ó T Pirimidine

sS C ó G Enllaç fort- Cap (Forat o

gap)/

CODI GENÈTIC

92

uab barcelonabiologia.uab.es/genetica/guions/guiopractiques2007_200… · web viewel floquet de...

Documents