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DISEÑO y ANÁLISIS de INVESTIGACIONES CLÍNICAS: MÓDULO IV

U7– Diseño y análisis de estudios genéticos

U7 – DISEÑO Y ANÁLISIS DE ESTUDIOS GENÉTICOS

Juan Ramón González Ruiz. Doctor en Estadística. Investigador. Centre de Recerca

en Epidemiologia Ambiental (CREAL). Unitat de Bioestadistica. Departament de Salut

Pública. Universitad de Barcelona (UB)

1. INTRODUCCIÓN

La publicación del primer borrador del genoma humano que se llevó a cabo en el año

2001 [ver lecturas recomendadas] ha permitido realizar numerosos estudios genéticos

en los que se han encontrado genes de susceptibilidad para más de 40 enfermedades

complejas (Alzheimer, cáncer, diabetes, …). Tradicionalmente los diseños de los

estudios genéticos se han basado en casos afectos con una mayor predisposición a

desarrollar la enfermedad. Por ejemplo, individuos con una aparición temprana de la

enfermedad o aquellos con varios familiares afectados. En estos casos los estudios se

basan en reclutar individuos relacionados (pedigríes o trios). Actualmente, sin

embargo, los estudios genéticos suelen disponer de un grupo control y son similares a

los que se utilizan epidemiología tradicional como los estudios de casos y controles y

los de cohortes (principalmente los primeros). Una ventaja de utilizar este tipo de

diseños es que se suele disponer de una amplia información recogida en los

cuestionarios, así como de bancos con muestras biológicas que permiten analizar el

ADN de los individuos. No obstante, antes de llevar a cabo un estudio de asociación,

debemos tener evidencias que los factores genéticos juegan algún papel en la

enfermedad que estamos estudiando. Para ello, los diseños tradicionales en genética

basados en estudios con familias resultan cruciales.

En esta unidad se empezará describiendo los marcadores genéticos que actualmente

se utilizan en los estudios de genética, así como las tecnologías existentes para

obtener la información sobre estos marcadores. Después se describirán los principales

diseños, no sólo para establecer asociación si no también para poder determinar la

existencia de algún gen de susceptibilidad para nuestra enfermedad de interés. Más

tarde se ilustrará cómo realizar el análisis estadístico, que incluirá: cómo evaluar

asociación, cómo corregir por estratificación poblacional (es decir, confusión por raza o

etnia) y cómo tener en cuenta las comparaciones múltiples. Estos métodos se



ilustrarán mediante un software libre basado en una aplicación Web que realiza todos

estos análisis de forma sencilla y rápida, utilizando además varios conjuntos de datos

reales.

2. DISEÑO DE ESTUDIOS GENÉTICOS

2.1 VARIABILIDAD GENÉTICA

Empezaremos describiendo los marcadores genéticos que comúnmente se utilizan en

estudios genéticos. Estos marcadores permitirán medir la variabilidad genética entre

individuos, así como poder establecer posibles diferencias entre individuos sanos y

enfermos. De esta forma, se podrán establecer qué regiones del genoma están

involucradas en el desarrollo, susceptibilidad o etiología de una enfermedad. Para

establecer una similitud con otros tipos de estudios, diremos que, estas variantes

genómicas juegan el mismo papel que los factores de riesgo en los estudios de

epidemiología tradicional.

Las variaciones genéticas heredables se llaman polimorfismos, que ocurren cuando el

DNA muta en las células germinales que se transmiten a los descendientes. La

mayoría de estos polimorfismos no tienen un impacto funcional (es decir, no hacen

que aparezca una enfermedad o un rasgo determinado), sólo algunos polimorfismos

tienen algún impacto y normalmente viene determinado por la evolución. Cuando uno

de estas variantes presenta una ventaja para el individuo, el polimorfismo aumenta en

frecuencia en la población.

Existen tres tipos de polimorfismos a nivel genético: Single Nucleotide Polimorphism

(SNP) (pronunciado “esnip”), Variable Number Tandem Repeats (VNTR) y Copy

Number Variations (CNV). Los SNPs son los polimorfismos más frecuentes y son los

más analizados en la actualidad. En este curso estudiaremos este tipo de variantes

genéticas.

Los SNPs son polimorfismos de un cambio en un nucleotido en una posición concreta

del genoma que afecta a una sola base (adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina

(G)). Por ejemplo, en el gen de la apolipoproteína E (ApoE) se han descrito varios

polimorfismos frecuentes que consisten en cambios de una única base. Uno de ellos,

denominado ApoE * -4, resulta en un cambio en el aminoácido C de la posición 112



por una A. Esta variante se asocia con la enfermedad de Alzheimer. El cambio de un

único nucleótido, si ocurre en una zona codificante como en el ejemplo de la ApoE,

puede provocar un cambio de aminoácido en la proteína resultante, y ello puede

resultar en una modificación de su actividad o función. Los cambios también pueden

ocurrir en zonas del promotor de un gen y modificar su expresión. Estas zonas

promotoras modulan el proceso de transcripción del ADN en ARN (la transcripción es

el primer paso de la decodificación de un gen a una proteína). Lo mismo puede ocurrir

si el cambio se produce en un intrón, como el ejemplo de la ataxia de Friedrich.

Aunque los intrones no se traducen a proteína, cambios en su estructura pueden

modular la expresión del gen. Otras veces, probablemente la mayoría, los cambios son

silentes y no tienen repercusiones funcionales. Mientras que sólo estudios moleculares

específicos pueden poner de manifiesto si los polimorfismos son funcionales, los

estudios epidemiológicos son fundamentales para valorar si hay efectos en la salud de

la población. En esta unidad se tratará principalmente cómo evaluar y cuantificar este

efecto. La información genética obtenida a partir de los SNPs (genotipos) se puede

obtener mediante distintas técnicas de genotipado que se describirán en la siguiente

sección.

Los VNTR aparecen con menos frecuencia que los SNPs y consisten en repeticiones

seriadas de una serie de nucleotidos con tamaño variable. Por ejemplo,

ATATATAT=(AT)4, ATATATATATAT=(AT)6. Las repeticiones pueden ser

mononucleotidas (AAAAA), dinucleotidas (AT) o repeticiones más largas. Estos

polimorfismos también se conocen como microsatélites y comúnmente son

multialélicos ya que el número de repeticiones puede variar enormemente. Los VNTRs

pueden tener un impacto funcional si están presentes en regiones codificantes. Un

ejemplo típico es la diabetes tipo I que se ha asociado a VNTR en el gen de la insulina.

Los individuos con un número pequeño de repeticiones (menos de 50) tiene el doble

de riesgo que los sujetos con más de 200 repeticiones.

Los CNVs se han identificado más recientemente como una fuente adicional de

variabilidad genética. La variación en el número de copias de un gen puede ser un

factor de riesgo para algunas enfermedades como por ejemplo osteoporosis o

psoriasis donde individuos con menos copias de los genes UGT2B17 y LCE3C,

respectivamente, presentan una mayor probabilidad de desarrollar dichas

enfermedades.



2.2 TECNOLOGÍAS DE GENOTIPADO

Los genotipos de un SNP, es decir la combinación de sus dos correspondientes alelos

(dos homocigotos AA y BB y un heterocigoto AB o BA, donde A y B puede ser

cualquiera de las 4 bases A,C,G ó T ) se obtienen a partir de las intensidades que se

obtienen de una imagen escaneada de un experimento de microarrays. Para cada uno

de los alelos también se dispone de información de una sonda para las dos

direcciones del DNA (sense y antisense), así finalmente se dispone de 4 valores de

intensidad. Los genotipos se determinan utilizando algoritmos que procesan estas

intensidades y que dependen del número de SNPs que se estén procesando cada vez.

Al inicio de realizarse estudios genéticos los genotipos solían obtenerse mediante

métodos basados en PCR (polymerase chain reaction). Estos métodos permiten

genotipar un número limitado de marcadores en cada ensayo, por lo que se

empezaron a diseñar otros métodos que permitieran obtener información de un

número mayor de SNPs en cada experimento. Estos métodos utilizan arrays de SNPs.

Las primeras tecnologías de SNP arrays eran capaces de determinar unos 1.500

SNPs en un único ensayo. Más adelante aparecieron los arrays 100K (K indica 1,000

por lo que estos arrays eran capaces de genotipar 100,000 SNPs), 300K, 500K,

1,000K y actualmente existen arrays incluso de 4,000K. Actualmente se dispone de

dos plataformas distintas para obtener estos genotipos: Affymetrix e Illumina [ver links

a Illumina y Affymetrix en lecturas recomendadas].

2.3 DISEÑOS DE ESTUDIOS GENÉTICOS

Encontrar genes que se asocien a enfermedades es un largo proceso y necesita

responder a varias preguntas antes de establecer esta relación (Tabla 7.01). Cada

pregunta normalmente requiere llevar a cabo un diseño de estudio específico y medir

la información genética con diferentes niveles de precisión. Sin embargo, actualmente

se puede obtener información para todo el genoma completo de cada individuo de

forma relativamente sencilla y barata, por lo que estos pasos previos no suelen

llevarse a cabo. En este curso nos basaremos en este tipo de estudios que pretenden

evaluar una posible asociación entre los genes y ciertas enfermedades o rasgos. Sin



embargo, es importante conocer en qué escenarios se pueden emplear este tipo de

estudios en relación a otros estudios de genética.

Ante de diseñar un estudio que pretenda establecer asociaciones entre SNPs y cierta

enfermedad, se debe contestar a una pregunta obvia importante: ¿Están los genes

relacionados con la enfermedad que estamos estudiando? Esta pregunta se puede

contestar utilizando información de estudios de casos y controles en el caso que

seamos capaces de demostrar que hay cierta agregación familiar. Un análisis que

incluya una variable que indique si hay familiares diagnosticados con nuestra

enfermedad de interés en los individuos analizados y que demuestre que la proporción

de afectos es superior en casos que en controles, puede ser concluyente. Sin

embargo, este es un mecanismo muy naive ya que puede haber factores que

confundan los resultados debido a exposiciones ambientales que comparten los

familiares. Otra posibilidad de obtener evidencias de la existencia de algún factor

genético es considerar estudios con inmigrantes. Esto ocurriría si las tasas de

enfermedad en las segundas generaciones de inmigrantes es más similar a las tasas

observadas en los países de origen que en los países de residencia. No obstante, los

estudios más concluyentes sobre la existencia de algún gen relacionado con la

enfermedad de estudio, vendría dado por los estudios de gemelos. Estos estudios son

los más potentes para estimar la heredabilidad (la proporción de casos atribuible a

factores genéticos). En estos estudios se trataría de comparar la concordancia entre

los gemelos monocigotos y dicigotos combinada con la información ambiental que

comparten los hermanos [ver artículo de Lichtenstein et al., en lecturas

recomendadas].

Cuando una enfermedad aparece de forma recurrente en algunas familias, se suelen

llevar a cabo estudios de segregación en pedigríes para poder determinar el modo de

herencia de la enfermedad y estimar la penetrancia. Los estudios de ligamiento,

también realizados en familias, nos dan una idea de en qué región del genoma se

encentran estos genes.

Cuando se dispone de suficiente evidencia sobre el hecho que existen factores

genéticos como causa de una enfermedad específica, la siguiente pregunta que se

debe realizar es: ¿qué genes son? Es en este punto donde se ubican los estudios de

asociación que vamos a tratar en esta asignatura. El hecho de que hagamos mayor

énfasis en los estudios de asociación viene dado por la mejora que se ha llevado a



cabo en los últimos años en la tecnología para medir marcadores genéticos. Como se

ha comentado anteriormente, la secuenciación del genoma ha permitido que se pueda

establecer qué regiones del genoma están asociadas a ciertas enfermedades, y en

última instancia cuáles son responsables. Los estudios de asociación utilizan SNPs

como marcadores genéticos y son la aproximación más potente para contestar a esta

pregunta. Los diseños en estudios de asociación son los que normalmente se llevan a

cabo en epidemiología tradicional ya que los investigadores aprovechan la información

de estos estudios y la combinan con la información genética que obtienen a partir de

material biológico que estos estudios suelen disponer. Así los estudios de asociación

genética se basan en diseños de casos y controles y diseños de cohortes. Estos

diseños se han descrito en una unidad anterior (unidad 5 sobre diseño y análisis de

estudios de factores de riesgo), por lo que no entraremos en detalle en ellos.

Los estudios de asociación comparan las frecuencias de los genotipos de una serie de

SNPs entre casos y controles no relacionados de una muestra de una población dada.

La posibilidad de poder incluir casos y controles no relacionados, permite utilizar

tamaños de muestra grandes para aumentar el poder de detección. La estrategia que

suelen llevara a cabo para encontrar genes responsables de una enfermedad

normalmente se basa en seleccionar SNPs pertenecientes a genes candidatos porque

se conozca que estos genes tienen una relación con el mecanismo de acción de la

enfermedad. Por ejemplo, los genes típicos que se estudian en cáncer están

relacionados con el control del ciclo celular, la inflamación, el metabolismo, o la

reparación de DNA.

Actualmente la tecnología es capaz de genotipar millones de SNPs a la vez. De esta

forma, en vez de realizar estudios de asociación con genes candidatos en los que se

incluye unos cientos de SNPs, también se puede llevar a cabo un análisis completo del

genoma en el que se intenta determinar qué SNPs se asocian con la enfermedad, sin

establecer ninguna hipótesis a priori. Estos estudios se conocen como GWAS (del

inglés Genome Wide Association Studies). Un ejemplo ilustrativo de estos estudios, en

los que no se establece ninguna hipótesis previa aparece en cáncer de próstata,

donde se ha identificado una región en la que no hay genes que puedan establecerse

como responsables de esta enfermedad.

El hecho de encontrar un SNP asociado con la enfermedad no quiere decir que sea el

responsable de la misma. Esto puede ocurrir por tres causas, principalmente. La



primera es que realmente sea el SNP causal, la segunda a que este SNP esté en

desequilibrio de ligamiento (LD), es decir, correlacionado con el verdadero SNP

causal, y la tercera a que los resultados estén confundidos por lo que se conoce como

estratificación poblacional (este problema se tratará en la sección de análisis). En

ocasiones, para encontrar el verdadero SNP causal tendremos que volver a re-

secuenciar llevando a cabo un genotipado más detallado (fine-mapping) de la región

de intereses. Finalmente, el SNP causal requerirá de estudios funcionales para

documentar el mecanismo de acción que determina el riesgo.

Para algunos genes, la variación genética no es probablemente suficiente para causar

una enfermedad, a menos que actúe un factor ambiental de forma simultánea. Por

ejemplo, el polimorfismo NAT2 se ha asociado con un riesgo aumentado de cáncer de

vejiga en los fumadores y este riesgo no se ha observado en fumadores [ver artículo

de García-Closas et al. en lecturas recomendadas]. Este es un ejemplo de interacción

gen-ambiente. Ignorar el factor ambiental puede hacer que no encontremos un riesgo

para ciertos genes puesto que éste se puede atenuar cuando incluimos individuos que

están expuestos a un factor ambiental (promediar el efecto en fumadores y no

fumadores). De la misma forma, también es probable que las interacciones gen-gen

puedan existir y que sólo los individuos portadores de múltiples variantes presente un

riesgo aumentado para ciertas enfermedades. Ambos tipos de interacciones pueden

estudiarse en estudios de asociación donde la dificultad radica en el hecho de que, sin

hipótesis a priori, el número de interacciones que podemos estudiar es muy grande,

requiriendo además un tamaño de muestra muy elevado.

2.4 ESTUDIOS DE ASOCIACIÖN COMPLETOS DEL GENOMA (GWAS)

La continua mejora llevada a cabo en la tecnología de genotipado y sobre todo su

abaratamiento, ha hecho posible que actualmente se lleven a cabo numerosos

estudios de asociación en los que se interroga el genoma completo. Los GWAS

utilizan tecnologías de genotipado a gran escala (en inglés high-throughput) para

analizar cientos de miles de SNPs y relacionarlos con variables clínicas, rasgos

cuantitativos o enfermedades. Una de las principales ventajas de los GWAS es que no

presuponen ninguna hipótesis a priori con respecto a una posible relación entre un gen

y la enfermedad de estudio, permitiendo así encontrar nuevos genes de



susceptibilidad para enfermedades comunes como por ejemplo Alzheimer, cáncer,

esquizofrenia, diabetes, Parkinson o esclerosis múltiple entre otras [ver WTCC en

lecturas recomendadas]. Por otro lado, uno de los principales problemas inherentes a

los GWAS es que pueden darse un número muy elevado de falsos positivos puesto

que se están llevando a cabo cientos de miles de tests estadísticos, haciéndose

necesario adoptar correcciones estadísticas o llevar a cabo estudios suplementarios

para replicar los resultados obtenidos. El tema de cómo tener en cuenta las

comparaciones múltiples se estudiará más adelante en la sección de análisis.

El diseño más empleado en los GWAS ha sido hasta ahora el de casos y controles.

Como se ha comentado anteriormente, la razón principal es que ya existen estudios

epidemiológicos que además disponen almacenado material biológico del que se

puede extraer información genética. Estos estudios, además, son menos costosos que

los estudios de cohortes, donde se requiere décadas de seguimiento para alcanzar el

número de casos requerido para detectar efectos genéticos moderados, y de ahí su

adopción en este tipo de estudios.

La mayoría de GWAS adoptan diseños multi-estado para reducir el número de falsos

positivos minimizando el coste de genotipado y manteniendo el poder estadístico [ver

Hirschhorn and Daly en lecturas recomendadas]. En la práctica, los GWAS se llevan a

cabo en 2 (o a veces más) pasos. En el primer paso se genotipan todos los SNPs

(dependiendo de la plataforma entre 300,000 y 1,000,000 de SNPs o más) en un

grupo inicial de casos y controles. Después, en el paso 2, sólo los marcadores más

“prometedores” (es decir, los SNPs que muestran una significación estadística más

importante) son re-genotipados en otro grupo de casos y controles. El número de

SNPs e individuos incluido en ambos pasos puede variar dependiendo del coste. Uno

de los principales problemas en estos diseños es establecer el punto de corte que

determine qué SNPs vale la pena re-genotipar. En la sección de análisis indicaremos

algunas aproximaciones que se están adoptando actualmente para tratar este

problema.



3. ANÁLISIS DE ESTUDIOS GENÉTICOS

Los análisis estadísticos que se llevan a cabo en los estudios de asociación en

genética no son complicados, pues principalmente se basan en analizar modelos de

regresión logística que son los que normalmente se usan en estudios de casos y

controles. El principal problema que aparece en este tipo de estudios es el coste

computacional, ya que además de evaluar la asociación entre la enfermedad y cada

SNP (recordemos que pueden ser cientos de miles) también se suelen probar

diferentes modelos de herencia como veremos más adelante. Afortunadamente,

existen varios programas estadísticos y aplicaciones web que permiten realizar estos

análisis de forma sencilla y rápida. En esta unidad ilustraremos cómo analizar los

estudios de asociación mediante el programa estadístico SNPstats [ver material

suplementario] que es muy útil cuando se dispone de un número moderado de SNPs

(decenas). En esta unidad mostraremos cómo interpretar los resultados que se

obtienen de SNPstats para cada tipo de análisis que debemos realizar en un estudio

de asociación. En el caso de disponer de una cantidad mayor de SNPs (miles) es

recomendable usar otros programas disponibles en R como por ejemplo SNPassoc

(González et al., Bioinformatics, 2008) que también tiene una implementación en Web

[ver material suplementario].

Para ilustrar cómo realizar un análisis de asociación usaremos unos datos reales que

están disponibles en la Web de SNPstats (para acceder a ellos, ir a

http://bioinfo.iconcologia.net/index.php?module=Snpstats, botón “Run SNPStats” y

enlace “Dataset 1”). Los datos corresponden a un estudio de casos y controles para

cáncer colorectal, donde se dispone de información genética y ambiental. La figura 1

ilustra cómo importar los datos a SNPstats. Como se puede observar, el formato

requerido es un archivo de texto (ASCII) donde se puede incluir información tanto de

los SNPs (cada alelo separado por “/”) como variables ambientales. El manual

suplementario describe cómo realizar el pre-proceso de los datos donde se indica

nuestra variable dependiente (caso-control o rasgo cuantitativo) así como otras

posibles variables confusoras.



3.1 EQUILIBRIO DE HARDY-WEINBERG

Antes de analizar la asociación entre un SNP y la enfermedad, debemos comprobar

que dado un SNP y su frecuencia alélica para una población específica se cumpe el

equilibrio de Hardy-Weimberg (HWE en inglés). Este principio determina qué

frecuencias genotípicas deberíamos observar, asumiendo que los alelos se transmiten

de forma independiente entre generaciones y siempre que no haya selección sobre

ellos. Así, si tenemos un SNP con dos alelos, A y B, con una frecuencia en la

población p y q = 1-p respectivamente, las probabilidades esperadas, f, para cada

genotipo vienen dadas por:

fAA=p2

fAB=2.p.q

fBB=q2

Para comprobar que un SNP cumple el HWE se suele utilizar una prueba de bondad

de ajuste de χ2. La hipótesis nula es que el SNP cumple con el HWE, por lo que

necesitamos obtener p-valores mayores a 0.05. Sin embargo, la prueba de ji-cuadrado

puede tener problemas cuando analizamos un SNP con valores pequeños para un

genotipo, en ese caso se suele utilizar un test exacto de Fisher.

Las razones para que un SNP no cumpla HWE pueden ser varias:

• Tener un tamaño de muestra pequeño

• Fallo en el genotipado

• El SNP está mapando varias regiones genómicas

• Haya habido una selección positiva de ciertos alelos (es decir, que un alelo se

asocie a una mayor longevidad)

En el contexto de un estudio de casos y controles, debemos tener en cuenta que HWE

sólo debe ser evaluado en la población control, que es donde debería cumplirse

este principio, ya que esperamos que en los casos algunas de las frecuencias

genotípicas observadas sean distintas a las esperadas ya que ese polimorfismo puede



ser responsable, en cierta forma, de la aparición de la enfermedad. Si no tenemos

claro el porqué un SNP no cumple HWE debemos excluirlo del análisis.

La figura 2 muestra los resultados de la prueba de HWE (junto con una descriptiva de

las frecuencias alélicas y genotípicas) para nuestro ejemplo sobre cáncer colorectal.

Se observa que para este SNP el p-valor es de 0.9 en los controles, por lo que no

tendríamos evidencias para rechazar la hipótesis nula. En otras palabras, podemos

aceptar que las frecuencias genotípicas observadas para este SNP son compatibles

con HWE.

3.2 ANÁLISIS SIMPLE DE SNPs: ASOCIACIÓN ENTRE UN SNP Y UN RASGO

El análisis simple de SNPs es el primer análisis que se lleva a cabo tras realizar un

control de calidad en nuestros datos (test de HWE). Esencialmente, el análisis consiste

en evaluar asociación entre los genotipos de un SNP y una variable respuesta. Este

análisis es sencillo y computacionalmente fácil de realizar en estudios de asociación

[ver Corden and Clayton en lecturas recomendadas]. Notemos sin embargo que, en el

contexto de un GWAS, éste tipo de análisis presenta algunas dificultades tanto desde

el punto de vista estadístico como bioinformático, especialmente para aquellos

estudios de asociación con grandes tamaños de muestra. La gran cantidad de datos

que generan estos estudios (miles de casos y controles y cientos de miles de SNPs)

demanda tener ciertas habilidades computacionales como estadísticas, así como una

infraestructura potente para llevar a cabo los análisis estadísticos. A continuación

detallamos cómo evaluar asociación entre un SNP y un rasgo específico. Dividiremos

los diferentes tipos de análisis dependiendo del tipo de variable respuesta que

tengamos: binaria o cuantitativa.

Rasgos binarios: El escenario con una variable respuesta categórica (binaria

generalmente) suele ser el más usual y suele encontrarse en estudios de asociación

poblacionales (casos y controles). En estos estudios se dispone de información de

individuos afectos (casos) y no afectos (controles). La manera de evaluar asociación

entre el SNP y la enfermedad se realiza mediante la tabla de contingencia 3x2 (tabla

2). Para testar la hipótesis nula de no asociación entre genotipos y la variable

respuesta, podemos llevar a cabo un test de χ2 con 2 grados de libertad. Cuando



tenemos unas frecuencias genotípicas pequeñas (menor de 5) en una o más de una

celda, es recomendable realizar un test exacto de Fisher.

El modelo que tiene en cuenta la tabla completa de los tres genotipos se conoce como

codominante o de 2 grados de libertad. Básicamente el modelo asume que puede

haber un riesgo distinto de los individuos heterocigotos y homocigotos variantes

respecto a los homocigotos normales. Para algunas enfermedades complejas se

puede asumir que el efecto para los individuos heterocigotos (AB) es la mitad que para

los homocigotos variantes (BB). Este modelo se conoce como modelo additivo y se

puede testar mediante un test de tendencia lineal (por ejemplo el de Mantel-Haenszel

que se utiliza en epidemiología tradicional) que se conoce en genética como test de

Cochran-Armitage. La hipótesis nula en este caso es que la pendiente para la recta

que relaciona el riesgo y los tres genotipos es cero. Este modelo también se conoce

como modelo multiplicativo ya que modela los efectos en la escala de odds. Una

ventaja importante de este modelo es que no necesita que se cumpla HWE, así que

puede ser una opción cuando esta hipótesis no se puede validar en nuestra población.

Sin embargo, algunas veces se espera que nuestro SNP siga otros patrones de

herencia como el dominante o el recesivo. En otras palabras, a veces se asume que

basta con tener un alelo variante para conferir riesgo (modelo dominante) o que es

necesario tener las 2 copias del alelo variante (modelo recesivo) para presentar la

enfermedad. Así pues, para llevar a cabo el análisis de asociación bajo esos modelos,

basta con reorganizar la tabla de contingencia 3x2 en una tabla 2x2 tal y como

podemos ver en las tablas 3 y 4, respectivamente. Cabe decir que también se suele

testar un modelo en el que se comparan los dos genotipos homocigotos contra el

heterocigoto. Este modelo se conoce con varios nombres, entre ellos sobredominante

(overdominant en inglés) o de heterocigosidad, aunque no suele usarse demasiado en

la práctica dado que desde un punto de vista biológico resulta difícil explicar este tipo

de efectos. El análisis de las tablas 3 y 4 puede realizarse de la misma forma con un

test de χ2 (con 1 grado de libertad) o con un test exacto de Fisher, dependiendo del

número de individuos en cada celda.

Puesto que normalmente los investigadores están interesados en analizar

enfermedades que no sólo están afectadas por factores genéticos si no que también

existen factores ambientales conocidos, muchas veces interesa realizar los análisis de

asociación entre el SNP y la enfermedad, ajustados por esos factores ambientales,



bien para tener más posibilidad de encontrar una asociación positiva entre el factor

genético y la enfermedad o bien para poder evitar algún tipo de confusión debido a

estos factores. En este caso, los modelos de regresión logística ofrecen una

posibilidad más flexible para evaluar asociación entre un SNP y el rasgo binario. Para

muestras de tamaño grandes, le test de razón de verosimilitud para el modelo logístico

contra la hipótesis nula βAA = βAB = βBB es equivalente al test de χ2 con 2 grados de

libertad (modelo codominante). La ventaja es que el modelo de regresión logística

permite ajustar por variables ambientales, así como evaluar interacciones gen-gen y

gen-ambiente. Es por ello que este modelo se usa para testar la asociación entre

SNPs y el rasgo binario de forma más general.

Para especificar los modelos de herencia en un modelo de regresión logística, tan sólo

necesitamos restringir los valores de los coeficientes β. Así, forzando que βAB = βBB o

βAA = βAB testaríamos el efecto dominante o recesivo, respectivamente. Si restringimos

que βAB sea la mitad entre βAA y βBB entonces el modelo logístico es equivalente al test

de Cochran-Armitage (tendencia lineal o modelo aditivo).

Rasgos cuantitativos: Un ejemplo típico de estudio de asociación entre un rasgo

cuantitativo es aquél en el que queremos testar si la expresión de un gen se ve

afectado por el genotipo de un SNP específico (que puede estar o no en el mismo

gen). Este tipo de asociación suele ser interesante en enfermedades con una base

genética importante como puede ser el cáncer. Otro ejemplo puede darse en estudios

en los que se quiera determinar si la inteligencia viene determinada o no por los

genes. En ese caso podríamos medir el cociente intelectual (variable continua) y

preguntarnos si este índice es mayor o menor en individuos que tengan ciertas

variantes genéticas.

Una primera aproximación para evaluar el grado de asociación entre un SNP y el

rasgo cuantitativo, podría ser mediante la categorización del la respuesta continua en

dos clases (por ejemplo “valores normales” vs “valores altos o anormales”) y luego

utilizar las aproximaciones que se han mencionado anteriormente. Sin embargo este

análisis no sería óptimo pues perderíamos mucho poder para detectar diferencias

estadísticamente significativas entre grupos. De esta forma, en vez de usar esta

aproximación, una forma más natural para testar la asociación en presencia de un

rasgo cuantitativo es usar un test como el ANOVA o un modelo de regresión lineal.



Mientras que un modelo ANOVA (para los tres genotipos) es equivalente a un test de

χ2 con 2 grados de libertad, la regresión lineal asume linealidad entre los genotipos y

las medias de la respuesta, por lo que los grados de libertad se reducen a 1. Además,

ambos tests necesitan que el rasgo se distribuya según una distribución normal y que

tengan una variabilidad similar en los tres genotipos. Estos problemas pueden

resolverse mediante trasformaciones de la variable respuesta tal y como se enseña en

los cursos de introducción a la estadística.

Al igual que se ha explicado para los rasgos binarios, los modelos de herencia también

se pueden especificar en este caso, colapsando los genotipos de forma adecuada

para generar un modelo dominante, recesivo o aditivo que contemple diferentes

patrones genéticos.

Otros tipos de rasgos: En estudios de cohortes, o en los que se estudian factores

pronóstico la variable analizada suele ser el tiempo hasta que se observa un evento de

interés. Desde un punto de vista estadístico, el estimador de Kaplan-Meier o el modelo

de Cox pueden usarse para estimar tanto las curvas de supervivencia o el riesgo en

función del genotipo. En otras ocasiones, el rasgo cuantitativo no es binario (por

ejemplo casos y controles donde los casos presentan diferentes sub-fenotipos). En

este caso otros modelos como la regresión multinomial pueden emplearse de la misma

forma que los modelos de regresión logística. En ambos casos, también se puede

forzar a que el SNP siga un patrón de herencia especificado.

La figura 3 muestra los resultados donde se lleva a cabo un test para evaluar la

asociación entre el SNP1 y el cáncer colorectal. Para nuestro ejemplo, como se puede

leer en la figura, este análisis se ha realizado ajustado por edad y sexo, lo que supone

que el p-valor de asociación corresponde a un test de razón de verosimilitud donde se

ha comparado un modelo que incluye las variables edad y sexo como independientes,

con el modelo que incluye la edad, el sexo y el SNP como variables explicativas.

Observamos que ninguno de los p-valores es inferior a 0.05, por lo que no podemos

rechazar la hipótesis nula de igualdad de efectos. Las columnas AIC (Akaike

Information Criteria) y BIC (Bayesian Information Criteria) sirven para determinar qué

modelo de herencia es el que se ajusta mejor a los datos. En este caso el menor AIC y

BIC serían los correspondientes al modelo sobredominante indicando que ése es el

que mejor se ajusta. Notemos que también corresponde al modelo de herencia con un

p-valor menor, cosa que ocurren en la mayoría de ocasiones.



A modo de ilustración, y para aprender a interpretar los resultados, diríamos que, por

ejemplo, asumiendo un modelo de herencia recesivo, el riesgo de desarrollar cáncer

colorectal para los individuos homocigotos variantes (es decir, para los GG) es un 16%

superior que para los individuos que son homocigotos normales o heterocigotos

(CC+CG). El OR para el modelo dominante lo interpretaríamos como: los individuos

con el alelo variante, G, tienen un 15% menos de probabilidad de desarrollar la

enfermedad que los portadores del alelo normal. Notemos que ninguno de estos

resultados es estadísticamente significativo puesto que el p-valor no es menor que el

p-valor nominal del 5%. Sólo se pretende mostrar cómo se interpretan los resultados.

En cuanto a los análisis para un rasgo cuantitativo, las tablas son similares a las que

se obtienen de un estudio de casos y controles, pero en vez de mostrar OR se

presentan diferencias de medias de la variable respuesta para cada genotipo.

3.3 ANÁLISIS DE MULTIPLES SNPs

Los estudios de asociación raramente se restringen al análisis simple de un marcador.

Aunque son una buena estrategia para detectar posibles asociaciones con el rasgo, el

análisis simple de SNPs se han mostrado bastante ineficientes ya que no integran

información sobre marcadores que estén cercanos. Puesto que es bastante

improbable que se haya genotipado el verdadero SNP causal, el análisis de múltiples

SNPs puede proporcionar una ventaja adicional al análisis puntual de un único SNP.

Existen dos aproximaciones principales para evaluar asociación para múltiples

marcadores: los modelos de regresión y el análisis de haplotipos. Los modelos de

regresión se basan en la regresión logística o los modelos lineales (dependiendo del

tipo de respuesta que tengamos). Sin embargo, como el número de SNPs que se

suelen analizar es muy elevado, los modelos de regresión tradicionales suelen ser

ineficientes para el análisis de multiples SNPs. Es por ello que se han probado otros

modelos más complejos (árboles de regresión y de clasificación, redes neuronales,

random forest, boosting, regresión lógica, …) para intentar abordar este problema.

Estos modelos requieren un conocimiento avanzado tanto de métodos estadísticos

como de computación y quedarían emplazados para cursos más avanzados en



estudios genéticos. Esto hace que nos centremos en los métodos basados en

haplotipos ya que constituyen una alternativa muy atractiva. A continuación

introduciremos los conceptos básicos de la teoría de haplotipos y revisaremos los

métodos de asociación basados en ellos.

Un haplotipo es una combinación de alelos de múltiples loci polimórficos a lo largo de

un cromosoma. Aunque un cromosoma entero puede verse como un haplotipo,

normalmente sólo se consideran regiones no mayores a 100Kbp (100 pares de

kilobases) con polimorfismos altamente ligados (es decir, relacionados). Así, para un

conjunto de marcadores dado, cada persona tiene dos haplotipos, uno heredado del

padre y otro de la madre. Se puede calcular de forma sencilla que un conjunto de n

SNPs bialélicos generan 2n haplotipos potenciales. Sin embargo, las tasas de

recombinación hacen que el número de haplotipos que suelan generarse sean mucho

más pequeños que ese número máximo teórico.

Un problema serio que tiene los análisis que requieren información haplotípica es que

los estudios de genotipos normalmente generan datos sin conocer la fase. Es decir,

para un sujeto no conocemos realmente qué alelo proviene de cada uno de los

progenitores. Las técnicas de laboratorio que permiten conocer esta información son

muy caras y consumen mucho tiempo de análisis. Para resolver esta falta de

información se necesitan aproximaciones estadísticas que nos permita inferir los

haplotipos a para un conjunto de muestras no relacionadas y varios marcadores

genéticos. La inferencia de estos haplotipos y su asociación con un rasgo se basa en

métodos estadísticos muy complejos (basados en el algoritmo EM y máxima

verosimilitud) pero que afortunadamente están implementados en varios programas

informáticos. La figura 4 muestra los resultados del análisis de haplotipos que

obtendríamos con SNPstats. La primera tabla muestra una descriptiva de los

haplotipos estimados mediante el algoritmo EM. Las celdas en rojo significa que son

haplotipos con una frecuencia menor al 1% (esto es un parámetro del programa) por lo

que para el análisis de asociación, todos estos haplotipos se considerarán como una

categoría única llamada “rare” (haplotipos raros). También observamos que el

haplotipo más frecuente tanto en casos como en controles es el haplotipo CTCGG que

está presente en casi el 60% de la población. En la segunda tabla observamos, por

ejemplo, que los individuos que tienen el haplotipo CCAGG tienen casi 2.5 veces más

probabilidad de desarrollar cáncer colorectal que aquellos individuos con el haplotipo



más frecuente. Siendo esta OR estadísticamente significativa, con un nivel de

significación del 5% (p-valor 0.03).

3.4 ANÁLISIS GEN-GEN Y GEN-AMBIENTE

Existe evidencia empírica que sostiene la idea que tanto los factores genéticos como

ambientales afectan las enfermedades comunes. Es por ello que muchos estudios

genéticos, tras demostrar la relación de un gen con la enfermedad, suelen preguntase

si este efecto es el mismo entre subgrupos de pacientes definidos por alguna

característica clínica o que están expuestos a diferentes riesgos ambientales

(interacción gen-ambiente) o si existe otro gen que modifique el efecto de éste

(interacción gen-gen que se conoce en los estudios genéticos como epistasis). La

forma más sencilla de estudiar estas interacciones es mediante modelos estadísticos.

Al igual que en el caso del análisis de un SNP, se utilizan modelos de regresión

logística o modelos lineales dependiendo de la naturaleza de los datos. En este caso,

el test de razón de verosimilitud viene dado por la comparación de los modelos (nótese

que para el análisis de un rasgo cuantitativo es idéntico)

logit(p)=α+β·Gen+δ·Amb

logit(p)=α+β·Gen+δ·Amb+γ·Gen*Amb

donde p corresponde a la probabilidad de ser caso, Gen indica gen y Amb ambiente.

Este tipo de análisis también puede llevarse a cabo mediante SNPstats. La figura 5

muestra el resultado correspondiente a un análisis de interacción entre el SNP1 y el

sexo. La primera tabla muestra las ORs para la interacción entre el SNP y el sexo.

Como referencia se toma el genotipo homocigoto que tiene el alelo más frecuente y la

categoría de referencia para la variable sexo (en este caso las mujeres). En ocasiones,

para ayudar a interpretar una interacción, resulta útil presentar el análisis estratificado.

Las siguientes dos tablas muestran el análisis de asociación estratificado por el SNP y

luego por la variable sexo, respectivamente.

3.5 MÉTODOS DE ESTADÍSITICOS EN GWAS

Los GWAS utilizan tecnologías de genotipado a gran escala (Illumina o Affymetrix)

para evaluar la asociación de cientos de miles de SNPs con variables clínicas o



cualquier otro tipo de rasgos. Como ya hemos mencionado anteriormente, el principal

inconveniente de este tipo de estudios es que debemos realizar un número muy

grande de test estadísticos (tantos como SNPs hallamos genotipado). Esto puede

llevar a encontrar un número de falsos positivos no deseado, por lo que necesitamos

adoptar algún método de corrección por comparaciones múltiples o realizar algún tipo

de réplica de nuestros hallazgos.

El análisis estadístico para evaluar asociación entre un SNP y nuestro rasgo de interés

es el mismo que se ha descrito para el análisis simple de un SNP. El diseño más

utilizado es el de casos y controles, por lo que las limitaciones de este tipo de análisis

son las mismas que aparecen en este tipo de estudios. El sesgo de recuerdo aparece

cuando los casos reportan su historia de exposición de forma distinta que los

controles. Sin embargo en los estudios genéticos esto no es un problema ya que los

genotipos (que juega el papel de factor de exposición) se miden de forma exacta

utilizando el DNA de los individuos. Sin embargo, en algunas ocasiones este sesgo

puede aparecer si el DNA se recoge de forma distinta entre casos y controles. Por otro

lado, el sesgo de selección aparece cuando los controles no provienen de la misma

población que los casos. En este caso, la carga genética o ambiental puede diferir

como resultado del diseño del estudio y no por diferencias genéticas reales.

Finalmente, el sesgo por confusión aparece cuando un factor de riesgo también se

asocia con el marcador. En estudios genéticos este problema se conoce por

estratificación poblacional y aparece de forma más marcada en el contexto de GWAS

ya que estos estudios requieren de un número de muestra muy grande (miles de

casos y controles) y suelen llevarse a cabo en distintos países. Esta situación se

observa cuando tanto la enfermedad como la frecuencia alélica se correlacionan

mediante la etnia. En otras palabras, este problema puede aparecer cuando los casos

y controles de nuestra muestra provienen de poblaciones (razas) distintas. Este

problema se puede resolver en la fase de diseño si apareamos los casos y controles

por raza o seleccionamos a los controles de la misma familia que los casos (diseño

apareado). Sin embargo, puesto que los estudios de asociación genéticos suelen

utilizar individuos de estudios existentes, no podemos adoptar esta solución y

debemos tener en cuenta que los GWAS suelen incorporar individuos de varios países

para obtener un número elevado de casos y controles que les permita detectar efectos

pequeños (a menudo ORs de entre 1.1 y 1.6). De esta forma, sólo podemos controlar

esta confusión mediante métodos estadísticos. Existen varias aproximaciones, pero la



más usada en el contexto de los GWAS es un método conocido como EIGENSTRAT.

Básicamente este método realiza un análisis de componentes principales con los

genotipos (previa normalización) y usa los valores de la primera y segunda

componente principal para ajustar la asociación. En la figura 6 podemos ver un

análisis de este tipo para una muestra de 270 individuos europeos (CEU), africanos

(Yoruba, YRI) y chinos mas japoneses (CHB+JPT). En ella se puede ver como las dos

primeras componentes principales discriminan perfectamente a los individuos de cada

población. El eje 1 separa a los africanos de los asiáticos y europeos y la segunda

componente separa a los europeos de los asiáticos.

Una vez se dispone de esta información la asociación entre la enfermedad y el SNP se

realiza mediante el siguiente modelo de regresión logística:

logit(p)=α+β1·SNP+ β2·e1+ β3·e2

donde e1 y e2 son los valores que observamos en el eje X e Y de la figura 1 que

corresponde con los valores de la 1ª y 2ª componente principal y p es la probabilidad

de ser caso. Como se puede observar, este modelo no es más que un modelo de

asociación ajustado por una variable que tiene en cuenta las diferencias entre

poblaciones y que es un modelo similar al que se utiliza en epidemiología tradicional

para tener en cuenta la confusión cuando se evalúa la asociación entre un factor de

riesgo y la enfermedad.

Un punto crítico de los GWAS es el de comparaciones múltiples. Este problema

aparece porque testamos de forma simultánea un número muy elevado de hipótesis

(una para cada SNP). La corrección por comparaciones múltiples se realiza para

controlar el conjunto de hipótesis y para proteger al investigador a la hora de encontrar

falsas asociaciones que pudieran atribuirse al azar. En nuestro caso, la corrección por

comparaciones múltiples supondrá lo mismo que determinar un threshold para el cual

un p-valor se considere estadísticamente significativo y que garantice un error de tipo I

global igual a nuestro nivel nominal que suele ser del 5%.

La idea más simple se basa en corregir la tasa de error que se define como el hecho

de cometer al menos un error del tipo I. La forma más sencilla y conocida de realizar

esta corrección es mediante el método de Bonferroni. Este método requiere p-valores

inferiores a α/Μ donde α es el nivel de significación nominal (normalmente 0.05) y M

es el número de SNPs analizados. Utilizando esta corrección, en un GWAS que



incluya 1,000,000 SNPs tendríamos un valor de significación corregido de 5.0x10-8.

Sin embargo hay estudios que dicen que este valor es demasiado conservador y

sugieren otros valores menos extremos. También se suele utilizar otro método de

corrección que se conoce como false discovery rate (FDR) o métodos basados en

permutaciones que son capaces de estimar el verdadero número de hipótesis que se

testan en un GWAS [ver Dudbridge and Gustano en lecturas recomendadas].

Otra aproximación muy usada para proteger al investigador ante los falsos positivos

minimizando el coste del estudio y manteniendo el poder estadístico consiste en

adoptar un diseño multi-etapa (Figura 7). En la práctica los GWAS se llevan a cabo en

2-3 (o a veces más) etapas. En la primera etapa, se genotipa todo el conjunto de

marcadores (dado por la plataforma de análisis: Illumina, Affymetrix, …) en una

muestra inicial de individuos. En la segunda etapa, los marcadores más significativos

son re-genotipados en otro grupo de individuos utilizando una matriz de SNPs más

pequeña. El número de SNPs y de individuos suele depender del presupuesto del

investigador. De esta forma, se seleccionan aquellos SNPs que han mostrado una

asociación con la enfermedad con un significación estadística dada. En el primer paso,

no se suele ser muy restrictivo y se puede considerar un p-valor más liberal (es decir,

sin tener en cuenta las comparaciones múltiples). En la segunda etapa, si que se

consideran aquellos SNPs que pasan un p-valor más restrictivo que está corregido por

comparaciones múltiples. Finalmente, en la tercera etapa, aquel conjunto de SNPs que

muestran una asociación estadísticamente significativa tras corregir por

comparaciones múltiples, es validado en una muestra independiente, que

generalmente suele ser de otro pais o varios países [ver Hirschhorn and Daly en

lecturas recomendadas].

El Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCC) [ver lecturas recomendadas]

publicó uno de los primeros GWAS en los que se analizaron siete enfermedades

comunes. En este artículo se discuten los temas mencionados anteriormente, entre

ellos el problema de estratificación poblacional, el de comparaciones múltiples y el

diseño multi-etapa.

En cuanto al software para analizar GWAS, podemos decir que existen varios

programas (PLINK, SNPTEST, snpMatrix, SNPassco,…) pero que ninguno de ellos

está implementado en una aplicación tan amigable como SNPstats. Además estos

programas requieren un conocimiento avanzado de programación en programas



compilados (C, C++, …) o en R. Existe un proyecto para usar SNPassoc (que está

implementado en R) en un entorno Web, que puede utilizarse en estos casos [ver

material suplementario].

4. LECTURAS RECOMENDABLES

• International human genome sequencing consortium. Initial sequencing and

analysis of the human genome. Nature, 2001, 409:860-921

• Venter, J.C. et al. The sequence of the human genome. Science, 2001, 291:1304-

1351.

Primer artículo (ambos se publicaron a la vez) en el que se describe la secuencia

del genoma humano. Útil para conocer cómo se obtuvo la información genética en

humanos.

• Información de cómo se obtienen los genotipos según las dos plataformas que

actualmente se utilizan en estudios de asociación, sobre todo en el caso de GWAS

o Illumina: www.illumina.com

o Affymetrix: www.affymetrix.com

• P. Lichtenstein, et al. Environmental and heritable factors in the causation of

cancer-analysis of cohorts of twins from Sweden, Denmark and Finland. N Engl J

Med, 2003;43:78-85.

Artículo donde se muestra cómo el cáncer puede estar debido a factores genéticos

basado en un estudio de gemelos

• M. García-Closas, et al. NAT2 slow acetylation, GSTM1 null genotype, and risk of

bladder cancer: results from the Spanish bladder cancer study and meta-analysis.

Lancet, 2005;366:649-659.

Estudio donde se muestra cómo el cáncer de vejiga puede estar debido a una

interacción gen-ambiente.



• H. J. Cordell and D. Clayton. Genetic Epidemiology 3: Genetic association studies.

Lancet, 2005;366:1121-1131.

• J. N. Hirschhorn and M. J. Daly. Genome-wide association studies for common

diseases and complex traits. Nature Revision Genetic, 2005;6:95:108

Estos dos artículos son dos buenas revisiones donde se discuten los métodos

estadísticos en estudios de asociación genética y los diseños en GWAS.

• The Wellcome Trust Case Control Consortium (WTCC). Genome-wide association

study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.

Nature, 2007;447:661-678.

Artículo en el que se lleva a cabo un GWAS para 14.000 casos de siete

enfermedades comunes y 3,000 controles. En este estudio se muestran todos los

problemas que aparecen en estudios de asociación (comparaciones múltiples,

estratificación, …) así como los diseños empleados en estudios completos del

genoma.



5. RESUMEN

En esta unidad se ha descrito los principales diseños y métodos estadísticos que se

utilizan en estudios genéticos. Los métodos estadísticos incluyen cómo evaluar

asociación entre un SNP y un rasgo (ya sea binario o cuantitativo), cómo evaluar

interacciones entre factores genéticos y ambientales, cómo analizar varios SNPs

utilizando haplotipos y cómo tener en cuenta las comparaciones múltiples. Este último

punto es uno de los principales problemas que se presentan en este tipo de estudios

puesto que se suelen analizar cientos de miles de SNPs. Esta metodología se ha

ilustrado con ejemplos pertenecientes a datos reales utilizando un software de libre

disposición que permite analizar los datos que se generan en este tipo de

investigaciones de forma sencilla y rápida.



6. EJERCICIOS

EJERCICIO 1

La base de datos “pulmon.txt” corresponde a un estudio de casos y controles, donde

los casos son pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón, para los que se han

obtenido información genética para 8 SNPs. Además se dispone de información sobre

edad, sexo y hábito tabáquico (0:no fuma + exfumador, 1:fuma). Realiza los siguientes

análisis y contesta a las siguientes preguntas:

1. Realiza un análisis descriptivo de los genotipos para cada SNP

2. ¿Están todos los SNPs en HWE? ¿cómo lo has comprobado?

3. Evalúa la asociación entre la variable grupo (0: control, 1:caso) y cada SNP

ajustando por edad y sexo

a. ¿existe alguna asociación estadísticamente significativa? ¿bajo qué

modelo de herencia? ¿cómo interpretarías los resultados?

b. ¿es esta asociación estadísticamente significativa tras tener en cuenta

las comparaciones múltiples?

4. Realiza un análisis de interacción entre el SNP d9850 y el hábito tabáquico e

interpreta los resultados

Nota: Para ver y contestar la pregunta de este caso, debe acceder a la versión on line

del curso, que encontrará en el Campus del CEC.



EJERCICIO 2

Se conoce que el tratamiento con fármacos antidepresivos es la mejor opción para

tratar los episodios psicóticos que aparecen durante la evolución de los trastornos de

ánimo. Sin embargo, un tercio de los pacientes que reciben estos tratamientos no

muestran una buena respuesta. Existen varios factores que pueden contribuir a una

mala respuesta como por ejemplo: el sexo, la edad, el número de episodios previos, el

tipo de depresión (unipolar o bipolar) o la severidad de la enfermedad entre otros.

También se conoce que existen algunos factores genéticos que pueden influenciar en

una mejor repuesta al tratamiento. Algunos estudios han mostrado que la reducción de

los niveles de BDNF (grain-derived neurotrophic factor) pueden aumentar la

vulnerabilidad a sufrir depresión y es por ello que algunos autores se han planteado la

pregunta científica sobre si los genes del BDNF pueden asociarse o no a una mejor

respuesta al tratamiento farmacológico (ver artículo Gratacós et al. The

Pharmacogenomics Journal, 2008;8:110-112).

Para este ejercicio se dispone de la información contenida en la base de datos

“BDNF.txt” sobre 374 casos diagnosticados con algún trastorno del estado de ánimo

donde se tiene información sobre variables clínicas y genéticas (8 SNPs). Esta base

de datos corresponde a la información publicada en el artículo anteriormente citado.

Contesta a las siguientes preguntas.

1. Realiza un análisis descriptivo de los genotipos para cada SNP

2. ¿Están todos los SNPs en HWE? ¿existe algún problema en este caso?

3. Evalúa la asociación entre la respuesta al tratamiento y cada SNP

a. ¿existe alguna asociación estadísticamente significativa? ¿bajo qué

modelo de herencia? ¿cómo interpretarías los resultados?

b. ¿es esta asociación estadísticamente significativa tras tener en cuenta

las comparaciones múltiples?



4. Realiza un análisis de asociación entre los haplotipos formados por los SNPs

rs12273363 , rs908867, y rs1491850 y la respuesta al tratamiento ¿cómo

interpretarías los resultados?

5. Realiza un análisis de interacción entre el SNP rs12273363 y el estado

piscótico e interpreta los resultados

Nota: Para ver y contestar la pregunta de este caso, debe acceder a la versión on line

del curso, que encontrará en el Campus del CEC.



FIGURAS

F 7·1 Entrada de datos para el análisis de asociación en estudios genéticos mediante SNPstats



F 7·2 en estudios genéticos mediante SNPstats



F 7·3 Resultados del análisis de asociación en estudios genéticos mediante SNPstats



F 7·4 Resultados del análisis de haplotipos en estudios genéticos mediante SNPstats



F 7·5 Resultados del análisis de interacción en estudios genéticos mediante SNPstats



F 7·6 Análisis de componentes principales usando el método EIGENSTRAT para detectar estratificación poblacional en la muestra.



F 7·7 Diseño multi-etapa para un estudio completo del genoma (GWAS)



F 7·8 Definición de variables para el ejercicio 1



F 7·9 Solución a la pregunta 1 del ejercicio 1




F 7·11 Solución a la pregunta 3 a) del ejercicio 1




F 7·13 Definición de variables para el ejercicio 2



F 7·17 Definición de variables para la pregunta 4 del ejercicio 2



TABLAS

T 7·1 Preguntas relevantes y diseños de estudios en epidemiología genética

Pregunta Diseño de estudio

¿Están los genes relacionados con la enfermedad?

Agregación familiar, estudios con gemelos

¿Cuál es el modo de herencia? Segregación

¿Dónde están los genes? Ligamiento

¿Qué genes son? Asociación

¿Cuál es la variante causal? Fine-mapping

¿Cuál es el mecanismo? Estudios funcionales

Interacciones Asociación Gen-Gen y Gen-Ambiente

T 7·2 Tabla de contingencia con el número de individuos para cada genotipo en casos y controles

Genotipo Controles Casos

AA nAAco nAAca

AB nABco nABca

BB nBBco nBBca



T 7·3 Tabla de contingencia para el modelo dominante donde el alelo B es el alelo de riesgo.

En este caso se espera que los individuos heterocigotos tengan el mismo riesgo que los individuos homocigotos BB, por ello ambas categorías se colapsan.


AA nAAco nAAca

AB + BB nABco + nBBco nABca + nBBca

T 7·4 Tabla de contingencia para el modelo recesivo donde el alelo B es el alelo de riesgo

En este caso se espera que los individuos heterocigotos BB tenga riesgo para desarrollar la enfermedad, por ello los individuos

con un alelo A se colapsan en una misma categoría.


AA + AB nABco + nAAco nABca + nAAca

BB nBBco nBBca

u7 – diseÑo y anÁlisis de estudios genÉticos · herencia de la enfermedad y estimar la...

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