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Práctica de laboratorio Nro. 5

I. INTRODUCCIÓN:

El transporte activo a través de una membrana semipermeable consiste en el transporte de sustancias en contra de un gradiente de concentración, para lo cual se requiere un gasto energético. En la mayor parte de los casos este transporte activo se realiza a expensas de un gradiente de H+ (potencial electroquímico de protones) previamente creado a ambos lados de la membrana, por procesos de respiración y fotosíntesis; por hidrólisis de ATP mediante ATP hidrolasas de membrana. El transporte activo varía la concentración intracelular y ello da lugar un nuevo movimiento osmótico de rebalanceo por hidratación. Los sistemas de trasporte activo están basados en permeasas específicas e inducibles. El modo en que se acopla la energía metabólica con el transporte del soluto aún no está dilucidado, pero en general se maneja la hipótesis de que las permeasas, una vez captado el sustrato con gran afinidad, experimentan un cambio conformacional dependiente de energía que les hace perder dicha afinidad, lo que supone la liberación de la sustancia al interior celular.El transporte activo de moléculas a través de la membrana celular se realiza en dirección ascendente o en contra de un gradiente de concentración (Gradiente químico) o en contra de un gradiente eléctrico de presión (Gradiente electroquímico), es decir, es el paso de sustancias desde un medio poco concentrado a un medio muy concentrado. Para desplazar estas sustancias contra corriente es necesario el aporte de energía procedente del ATP (Adenosin Tri Fosfato) para formar ADP (dos fosfatos) o AMP (un fosfato) con liberación de energía de los enlaces de alta energía.

II. OBJETIVOS:

Afianzar el concepto de transporte activo. Evaluar el transporte de glucosa por el epitelio intestinal.

III. MATERIALES:

Rattus norvegicus en ayunas (24 h) Tabla y equipo de disección Pabilo y ligas Alcohol yodado y algodón Papel toalla Soluciones

Ringer Locke

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Locke-glucosa Alatal

Hipodérmicas de 10ml y agujas Nro. 21

Balanza Cronómetro Tubos de centrífuga Probeta 10 o 50ml Centrífuga Baño de agua regulado a 30 °C

IV. FUNDAMENTO:

Transporte celular activo

Mecanismo que permite a la célula transportar sustancias disueltas a través de su membrana desde regiones de menor concentración a otras de mayor concentración. Es un proceso que requiere de energía,llamado también producto activo debido al movimiento absorbente de partículas es un proceso el energía-requerir que mueve el material a través de una membrana de la célula y sube el gradiente de la concentración. La célula utiliza transporte activo en tres situaciones: cuando una partícula va de punto bajo a la alta concentración, cuando las partículas necesitan la ayuda que entra en la membrana porque son selectivamente impermeables, y cuando las partículas muy grandes incorporan y salen de la célula.

En la mayor parte de los casos este transporte activo se realiza a expensas de un gradiente de H+ (potencial electroquímico de protones) previamente creado a ambos lados de la membrana, por procesos de respiración y fotosíntesis; por hidrólisis de ATP mediante ATP hidrolasas de membrana . El transporte activo varía la concentración intracelular y ello da lugar un nuevo movimiento osmótico de rebalanceo por hidratación. Los sistemas de transporte activo son los más abundantes entre las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en sus medios naturales la mayoría de los procariotas se encuentran de forma permanente o transitoria con una baja concentración de nutrientes.

Los sistemas de transporte activo están basados en permeasas específicas e inducibles. El modo en que se acopla la energía metabólica con el transporte del soluto aún no está dilucidado, pero en general se maneja la hipótesis de que las permeasas, una vez captado el sustrato con gran afinidad, experimentan un cambio conformacional dependiente de energía que les hace perder dicha afinidad, lo que supone la liberación de la sustancia al interior celular.

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El transporte activo de moléculas a través de la membrana celular se realiza en dirección ascendente o en contra de un gradiente de concentración (Gradiente químico) o en contra un gradiente eléctrico de presión (gradiente electroquímico), es decir, es el paso de sustancias desde un medio poco concentrado a un medio muy concentrado. Para desplazar estas sustancias contra corriente es necesario el aporte de energía procedente del ATP. Las proteínas portadoras del transporte activo poseen actividad ATPasa, que significa que pueden escindir el ATP (Adenosin Tri Fosfato) para formar ADP (dos Fosfatos) o AMP (un Fosfato) con liberación de energía de los enlaces fosfato de alta energía. Comúnmente se observan tres tipos de transportadores:

Uniportadores: son proteínas que transportan una molécula en un solo sentido a través de la membrana.

Antiportadores: incluyen proteínas que transportan una sustancia en un sentido mientras que simultáneamente transportan otra en sentido opuesto.

Simportadores: son proteínas que transportan una sustancia junto con otra, frecuentemente un protón (H+).

Transporte activo primario: Bomba de sodio y potasio

Se encuentra en todas las células del miadismo, encargada de transportar los iones potasio que logran entrar a las células hacia el interior de éstas, dando una carga interior negativa y al mismo tiempo bombea iones sodio desde el interior hacia el exterior de la célula (axoplasma), sin embargo el número de iones Na + (con carga positiva) no sobrepasa al de iones con carga negativa dando por resultado una carga interna negativa. En caso particular de las neuronas en estado de reposo esta diferencia de cargas a ambos lados de la membrana se llama potencial de membrana o de reposo-descanso.

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Transporte activo secundario o cotransporte

Es el transporte de sustancias que normalmente no atraviesan la membrana celular tales como los aminoácidos y la glucosa, cuya energía requerida para el transporte deriva del gradiente de concentración de los iones sodio de la membrana celular (Bomba Glucosa/Sodio ATPasa).

Bomba de calcio: Es una proteína de la membrana celular de todas las células eucariotas. Su función consiste en transportar calcio iónico (Ca2+) hacia el exterior de la célula, gracias a la energía proporcionada por la hidrólisis de ATP, con la finalidad de mantener la baja concentración de Ca2+ en el citoplasma que es unas diez mil veces menor que en el medio externo, necesaria para el normal funcionamiento celular. Se sabe que las variaciones en la concentración intracelular del Ca2+ (segundo mensajero) se producen como respuesta a diversos estímulos y están involucradas en procesos como la contracción muscular, la expresión genética, la diferenciación celular, la secreción, y varias funciones de las neuronas. Dada la variedad de procesos metabólicos regulados por el Ca2+, un aumento de la concentración de Ca2+ en el citoplasma puede provocar un funcionamiento anormal de los mismos. Si el aumento de la concentración de Ca2+ en la fase acuosa del citoplasma se aproxima a un décimo de la del medio externo, el trastorno metabólico producido conduce a la muerte celular. El calcio es el elemento más abundante del organismo, además de cumplir múltiples funciones.

El transporte activo requiere un gasto de energía para transportar la molécula de un lado al otro de la membrana, pero el transporte activo es el único que puede transportar moléculas contra un gradiente de concentración, al igual que la difusión facilitada el transporte activo esta limitado por el numero de proteínas transportadoras presentes.

Son de interés dos grandes categorías de transporte activo, primario y secundario. El transporte activo primario usa energía (generalmente obtenida de la hidrólisis de ATP), a nivel de la misma proteína de membrana produciendo un cambio conformacional que resulta en el transporte de una molécula a través de la proteína.

El ejemplo mas conocido es la bomba de Na+/K+. La bomba de Na+/K+ realiza un contratransporte("antyport") transporta K+ al interior de la célula y Na+ al exterior de la misma, al mismo tiempo, gastando en el proceso ATP.

El transporte activo secundario utiliza la energía para establecer un gradiente a través de la membrana celular, y luego utiliza ese gradiente para transportar una molécula de interés contra su gradiente de concentración.

Un ejemplo de ese mecanismo es el siguiente: Escherichia coli establece un gradiente de protones (H+) entre ambos lados de la membrana utilizando energía para bombear protones hacia afuera de la célula. Luego estos protones se acoplan a la lactosa (un azúcar que sirve de nutriente al microorganismo) a nivel de la lactosa-permeasa (otra proteína de transmembrana), la lactosa

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permeasa usa la energía del protón moviéndose a favor de su gradiente de concentración para transportar la lactosa dentro de la célula.

Este transporte acoplado en la misma dirección a través de la membrana celular se denomina cotransporte ("symport"). Escherichia coli utiliza este tipo de mecanismo para transportar otros azucares tales como ribosa y arabinosa, como así también numerosos aminoácidos.

 

El mecanismo de transporte secundario Na+-glucosa

Otro sistema de transporte secundario usa la bomba de Sodio/Potasio en una primera etapa, genera así un fuerte gradiente de Sodio a través de la membrana. Luego la proteína "simport" para el sistema Sodio-Glucosa usa la energía del gradiente de Sodio para transportar Glucosa al interior de la célula.

Este sistema se usa de manera original en las células epiteliales del intestino. Estas células toman glucosa y sodio del intestino y lo transportan al torrente sanguíneo utilizando la acción concertada de los "simport" para Sodio/Glucosa, la glucosa permeasa (una proteína de difusión facilitada para la glucosa) y las bombas de Sodio/Potasio.

Se debe hacer notar que las células del intestino se encuentran unidas entre si por "uniones estrechas"(tight junctions) que impiden que nada proveniente del intestino pase al torrente sanguíneo sin ser primero filtradas por las células epiteliales.

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Fuente de energía de la célula proveniente de los azúcares

Los azúcares más sencillos –los monosacáridos- son componentes que tienen la fórmula general (CH2O)n, donde n habitualmente es 3, 4, 5, 6 o 7. Los azúcares, y las moléculas que se forman a partir de ellos, también se denominan carbohidratos debido a su sencilla fórmula. Por ejemplo la glucosa C6H12O6. Sin embargo, la fórmula no define completamente a la molécula; un mismo conjunto de carbonos, hidrógenos y oxígenos se puede unir entre sí mediante enlaces covalentes, de diversas maneras, dando lugar a estructuras de formas diferentes. La glucosa, por ejemplo, puede transformarse en un azúcar diferente –la manosa o la galctosa- solamente cambiando la orientación de algunos grupos OH respecto al resto de la molécula. Además, cada uno de estos azúcares puede existir en dos formas, llamadas formas D y L, que son imágenes especulares una de la otra. Las moléculas que tienen la misma fórmula química pero diferente estructura se, se denominan isómeros ópticos. Muchas moléculas orgánicas presentan isómeros, los cuales juegan un papel importante en la generación de la enorme variedad de azúcares existentes en la célula.Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante enlaces covalentes formando carbohidratos más grande. Dos monosacáridos unidos entre sí forman un disacárido, como la sacarosa, formada por unidad de glucosa y otra de fructuosa. Los azúcares poliméricos más grandes van desde los oligosacáridos (trisacáridos, tetrasacáridos, etc.) hasta los enormes polisacáridos, que pueden estar formados por miles de unidades de monosacáridos.La manera en que los azúcares se unen entre sí ilustra algunas características comunes de la formación de enlaces bioquímicos. Un enlace se forma entre un grupo –OH de un azúcar y un grupo –OH de otro azúcar, mediante una reacción de condensación, en la que la formación de enlace

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supone la liberación de una molécula de agua. En otros polímeros biológicos como los ácidos nucleicos y proteínas, las subunidades tambiñen se unen entre si mediante reacciones de condensación en las que libera agua. Los enlaces generados por todas estas reacciones de condensación pueden romperse a través del proceso inverso de la hidrólisis, en la que consume una molécula de agua.Cada monosacárido tiene muchos grupos hidroxilo libres pueden formar uniones con otros monosacáridos, por lo que los polímeros de azúcares pueden ser ramificados. Por esta razón determinar la disposición de los azúcares en un polisacárido es una tarea mucho más compleja que determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula DNA, en la que todas las unidades se unen a sus vecinas exactamente igual.El monosacárido glucosa juega un papel central como fuente de energía para las células. A través de una serie de reacciones, la glucosa se rompe en moléculas más pequeñas, liberando energía de la cual puede disponer la célula para realizar trabajo útil. Como reserva de energía a largo plazo, las células utilizan polisacáridos sencillos formados únicamente por unidades de glucosa –principalmente el glucógeno- en animales.Sin embargo, los azúcares no sólo se utilizan para la producción y el almacenamiento de energía, también se utilizan como soporte mecánico.

El ATP es la molécula más ampliamente utilizada como transporte activado

Es el más importante y versátil de los transportadores activados de las células es el ATP (adenosina 5´- trifosfato). En las células el ATP se utiliza como depósito, o moneda, de energía, adecuado y versátil para dirigir para dirigir una gran variedad de reacciones química. El ATP es sintetizado a través de una reacción de fosforilación energéticamente desfavorable en la que un grupo fosfato se añade al ADP. Cuando se requiere, el ATp se hidroliza hasta ADP a través de una reacción energéticamente favorable, liberando un paquete de energía representado por una molécula de fosfato inorgánico. El ADP regenerado está disponible para ser utilizado en una reacción de fosforilación que forme ATP.

El ATP es el transportador energético activado más abundante en las células. Se utiliza por ejemplo, para suministrar energía a muchas de las bombas que transportan sustancias entre el interior y el exterior de la célula; también proporciona energía a los motores moleculares que facilitan la contracción de las células musculares y que permiten a las células nerviosas transportar materiales de un extremo a otro de sus largos axones.

El transporte activo desplaza los solutos en contra de sus gradientes electroquímicos

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Las células no pueden depender únicamente del transporte pasivo. El transporte activo de los solutos en contra de su gradiente electroquímico es esencial para el mantenimiento de la composición iónica intracelular de las células y para importar los solutos que están presentes a menor concentración en el exterior de la célula con respecto al interior. Existen tres formas principales por las que las células realizan el transporte activo:1. Los transportadores acoplados que acoplan el transporte de un soluto a

través de la membrana en contra de gradiente al transporte de otro soluto a favor del gradiente.

2. Las bombas impulsadas por ATP que acoplan el transporte en contra del gradiente de la hidrólisis del ATP.

3. Las bombas impulsadas por la luz, que se encuentran principalmente en las células bacterianas y que acoplan el transporte en contra de gradiente a la llegada de la energía luminosa.

Puesto que una sustancia tiene que ser transportada en contra de gradiente antes de que pueda fluir a favor de gradiente, las diferentes formas de transporte activo están necesariamente relacionadas. Así, en la membrana plasmática de la célula animal, una bomba impulsada por ATP transporta el Na+ hacia afuera de la célula en contra de su gradiente electroquímico. Puesto que fluye a través de los transportadores acoplados con Na+, la entrada de Na+ impulsa el desplazamiento activo de otras sustancias hacia el interior de la célula en contra de sus gradientes electroquímicos. Si la bomba de Na+ se pararía. Por lo tanto, la bomba de Na+ impulsada por ATP es vital en el transporte a través de membranas en las células animales. En las células vegetales, en los hongos y en las algunas bacterias, las bombas impulsadas por ATP desempeñan un papel similar a éste, generando un gradiente electroquímico de iones de H+ (protones) al bombear los H+ hacia afuera de la célula.

El uso de la célula de la difusión facilitada o transporte activo, depende de las necesidades específicas de la célula. Por ejemplo, la glucosa es transportada por transporte activo de los intestinos a las células epiteliales del mismo, pero por difusión a través de la membrana a los glóbulos rojos. ¿Por qué? Hay que considerar los tipos de medios que son.

Las células epiteliales que revisten el intestino, necesitan traer la glucosa aprovechable de la digestión dentro del cuerpo y deben prevenir el flujo inverso de la glucosa del cuerpo al intestino. Se necesita un mecanismo que asegure que la glucosa también fluya dentro de las células intestinales y obtener el transporte dentro de la corriente sanguínea, no importa cual sea la concentración de glucosa en el intestino. Si esto no sucediera y las células intestinales usaran los portadores de difusión facilitada para la glucosa, inmediatamente después de comer dulces u otro alimento rico en azúcar, la concentración de glucosa en los intestinos sería muy alta, y la glucosa fluiría cuesta abajo del intestino al resto del cuerpo. Pero una hora después, cuando los intestinos se vaciaran y la concentración de glucosa fuera más

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baja que la de la sangre y los tejidos, los portadores de difusión facilitada permitirían a la glucosa en la sangre y tejidos fluir cuesta abajo dentro del intestino. Esto rápidamente agotaría en poco tiempo las reservas de energía. Debido a que esta situación sería biológicamente un despilfarro y probablemente letal, es que vale la pena el costo de energía adicional del transporte activo, para asegurar el transporte de la glucosa en un proceso de un solo sentido.

Por contraste, los eritrocitos (glóbulos rojos) y la mayoría de los tejidos del cuerpo humano mueven la glucosa por portadores de difusión y no por transporte activo. La difusión facilitada tiene sentid en este contexto, debido a que el medio es diferente para los glóbulos rojos y el intestino. Mientras que los intestinos experimentan una constante fluctuación de la concentración de glucosa, la cual puede ser alta o baja que la concentración de glucosa dentro de las células intestinales; la concentración en la sangre es cuidadosamente regulada, por lo que es normalmente alta en las concentraciones intercelulares. La glucosa es transportada a través de la membrana de los eritrocitos por un uniportador, un tipo de proteína de difusión facilitada. Tan pronto como la glucosa ingresa en la célula, se convierte en otras sustancias necesarias para la producción de energía de la célula o biosíntesis, por lo que la concentración intracelular de glucosa permanece más bajo que el nivel de glucosa de 5 mM que mantiene la sangre. En esta situación, la difusión sola asegura el constante flujo de glucosa dentro del eritrocito, por lo que sería un desperdicio e innecesario para los eritrocitos, el uso de trasporte activo para la glucosa.

TRANSPORTE DE GLUCOSA Y AMINOACIDOS EN EL EPITELIO DE ABSORCIÓN DE ANIMALES VERTEBRADOS

Glucosa

En el intestino (duodeno, yeyuno, íleon) de vertebrados superiores, los productos de la digestión de carbohidratos dietarios, D-glucosa y D-galactosa, son absorbidos por enterocitos maduros en el tercio superior de los vellos vía SGLTs y GLUTs, que son proteínas transportadoras o permeasas (Hediger 1994).

El mecanismo de absorción en los túbulos renales es realizado de la misma manera que en el epitelio intestinal de absorción. La glucosa se toma de la orina mediante un sistema de transporte activo secundario Na+-acoplado y pasa a las células del túbulo proximal. Subsecuentemente pasa a la sangre vía sistema de transporte facilitado, por intermedio de un gradiente de concentración descendente. Existen dos transportadores renales para la glucosa: Uno de baja capacidad y alta afinidad compartido para glucosa y

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galactosa denominado SGLT-1 y otro de alta capacidad y baja afinidad denominado SGLT-2 (Hediger, 1994).

Los nutrientes para ser absorbidos al torrente sanguíneo, atraviesan como primera medida la membrana borde de cepillo y posteriormente la membrana basolateral de las células del epitelio. Los azúcares, como se mencionó anteriormente y algunos aminoácidos pueden ser transportados por una familia de proteínas denominada SGLTs (Hediger 1994) que también tiene un sitio de enlace para el Na+, ejerciendo un efecto alostérico favorable (Figura 8). Esta unión sucede en la membrana borde de cepillo (luminal) de la célula de la mucosa intestinal, para ser liberado el Na+ y el azúcar o aminoácido en la cara interna de esta membrana (Sernka y Jacobson, 1982).

Figura 8. Modelo estructural del -hélices transmembranares. Tomado decotransportador SGLT-1, mostrando sus 12 Hediger (1994).

La célula utiliza la energía almacenada en el gradiente trasmembranario de iones Na+. El movimiento de un ion Na+ ("ion cotransportado") a través de la membrana, a favor de su gradiente de concentración, está acoplado obligatoriamente al movimiento de la molécula "transportada" en contra de su gradiente de concentración.

La glucosa del interior celular al torrente sanguíneo, atraviesa la membrana basolateral por medio de la proteína GLUTs por el mecanismo de difusión facilitada, independiente del transporte de Na+. Por la carencia de una carga neta, al igual que los aminoácidos zwiteriónicos, el transporte no se ve influenciado por el potencial de membrana y depende únicamente del gradiente de concentración (Kakuda y MacLeod, 1994). El Na+, atraviesa esta membrana por un mecanismo de transporte en el cual interviene la Na+-K+-ATPasa.

La familia de Na+/cotransportadores se ha denominado, SGLTs; que actúan en contra del gradiente de substrato y a favor de un gradiente de Na+. Es una proteína de membrana hidrofóbica, de 75 kDa (Crane et al, 1961 citado

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por Hediguer, 1994). Hirayama et al (1991) la describen como un cotransportador tanto de la membrana, como de los túbulos renales; es una proteína de 68-77 kDa, de masa molecular que representa un 0.1% del total de la proteína de la membrana, con un punto isoeléctrico aparente entre 5 y 6. Los substratos sobre los que actúa pueden ser azúcares, aminoácidos, vitaminas y osmolitos, tanto en bacterias como en distintos animales. Esta familia de cotransportadores son proteínas conteniendo de 482 a 718 residuos de aminoácidos y 12 alfa-hélices transmembranares (Wright, 1994). Se conserva su estructura primaria bastante similar por lo menos en los mamíferos, rata, ratón, gato y perro (Hirayama et al, 1991).

Wright, et al, (1994) encontraron bajo condiciones experimentales para las SGLTs lo siguiente: a) el transporte de azúcar, solo sucede en presencia de Na+, b) el coeficiente de acoplamiento entre el Na+ y el azúcar es 2, c) la dirección del transporte de azúcar es reversada, si el gradiente del Na+ es reversado, d) Al incrementar la concentración de Na+ intracelular, inhibe el transporte de azúcar Trans-inhibición, e) el transporte de azúcar es incrementado por un potencial de membrana negativo.

El portador SGLT-1, que pertenece al intestino delgado y a los túbulos proximales del riñón, es de alta afinidad, baja capacidad y de estequiometría 2 Na+/1 D-glucosa. El otro portador de baja afinidad y alta capacidad de transporte presente en mamíferos (SGTL-2, Hediger, 1994), posee una relación estequiométrica 1 Na+/1 D-glucosa, identificado cinéticamente en los túbulos proximales del riñón, despliega un valor de Kt hasta 10 veces mayor que el de SGTL-1. Presenta similares características de dependencia al Na+ en el transporte de la D-glucosa, pero este portador no reacciona significativamente a los anticuerpos policlonales producidos a partir de SGLT-1. Lo que quiere decir, que son productos de genes distintos. Para Hediger (1994) es claro que el SGLT-2 sólo se localiza en el riñón de mamíferos y mantiene una homología con el transportador presente en el intestino del 60%. La SGLT-1 de mamíferos en condiciones experimentales responde a un gradiente de H+ para el transporte de azúcares, con una relación estequiométrica de 2H+:1glucosa, pero mostrando mayor eficiencia el co-transporte con Na+.

Algunos resultados experimentales con relación al transporte de glucosa en conejos, nos muestran lo siguiente (Kessler, 1978):

En la presencia de Na+, pero en la ausencia de un gradiente de Na+ en el tiempo 0, la captura de D-glucosa es acelerada. No se presenta fenómeno de acumulación transitorio "overshoot". En la presencia de un gradiente de NaCl (Na+ externo > Na+ interno) se presenta el fenómeno de acumulación transitorio de D-glucosa, en contra de su propio gradiente de concentración. En la presencia de un gradiente de NaSCN (tiocianato) también se presenta el fenómeno de "overshoot". El tiocianato que es mas liposoluble que el cloruro, probablemente produce un mayor potencial de membrana (interior de la vesícula negativo), lo que incrementa la fuerza de conducción para el flujo de Na+ y D-glucosa al interior de la vesícula.

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Los trabajos hechos con L-glucosa en iguales condiciones a las descritas en los tres puntos anteriores no presentan fenómeno de "overshoot".

Estas características corresponden a un mecanismo de cotransporte paralelo (Symport) (Kessler, 1978).

V. PROCEDIMIENTO:

1. Pesar la rata y anestesiarla con Alatal. Usar 1ml por cada 2.5 Kg. de peso.

2. Fijar el animal a la tabla de disección en posición dorsal. Hacer una incisión media abdominal y localizar la región pilórica duodenal.

3. Perforar el mesenterio en esa zona y pasar por debajo del intestino un pedazo de pabilo aproximadamente 15 cm. Anudar.

4. Con una de las hipodérmicas inyectar solución de Locke glucosa a 38ºC y suavemente hacerla discurrir para lavar esta sección del intestino

5. Medir a partir de esta zona 15 – 20 cm, de asa duodenal y cerrar con pabilo como se hizo anteriormente.

6. Con otra hipodérmica, inyectar solución de Locke glucosa a 38ºC y tratar de que el segmento se llene de forma homogénea y que sus paredes no queden demasiado distendidas por un exceso de volumen de solución patrón. Anotar el volumen inoculado.

7. Colocar las vísceras de nuevo en el interior del animal y bañarle frecuentemente con solución Ringer a 38ºC durante 30 minutos.

8. Extraer el segmento intestinal, secarlo en un papel filtro y vaciar su contenido en una probeta graduada. Medir el volumen recuperado.

9. Transferir a un tubo de centrífuga y centrifugar a 5000 rpm durante de 5 minutos.

10.Con la glucocinta, determinar la concentración de glucosa en el sobrenadante y en la solución Locke glucosa original.

VI. CÁLCULOS Y RESULTADOS:

Para adormecer a la rata se toma la equivalencia de volumen de 1ml de alatal por un peso de 2500 g.El peso de la rata pesada en la balanza comercial fue de 170g aproximadamente entonces:

1ml 2500gXml 170 g

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X = 0,068 ml de alatal

Se toma a la rata experimental para poder inyectarle los 0,068 ml de alatal en la parte superior del abdomen a dos dedos por debajo de la base del esternón, estirando un poco la piel para una mejor comodidad, la aguja de la hipodérmica entro en el periostio, la anestesia que se le colocó fue intraperitoneal. La rata una vez adormecida se procedió a colocarla en la tabla de disección en donde con un bisturí se empezó a cortar el abdomen de manera vertical cuidando que no se pasara hasta las viseras, se tomó una sección del duodeno cerca al estómago, y con el manejo de una pinza quirúrgica se hizo los dos amarres separados por una distancia de 15 cm.

Con una hipodérmica que contenía una solución de Locke - glucosa a 38 grados centígrados (preparados en un tubo de ensayo a baño María en la cocina eléctrica) se inyectó en la sección del duodeno, luego se esperó 30min roseando continuamente a las viseras visibles con solución de Ringer.

Luego se cortó la sección del duodeno y se filtró en papel filtro para separar las sustancias sólidas del interior del intestino, después de filtrar se llevó a centrifugar a 5000 rpm para luego quedarnos con el sobrenadante y verificar el transporte activo, le colocamos un indicador de glucosa el licor de Fehling A (de color verde) aprox. 5ml + 5ml de Fehling B ( CuSO4 ) + 1ml de Locke - glucosa dando azul, esta muestra se comparó con un patrón, mostrando que para la misma concentración de solución de Locke - glucosa presenta un azul menos intenso, de esta manera se pudo comprobar el transporte activo a través del epitelio intestinal en la rata de la glucosa, se verificó que hubo difusión del exterior al interior de la célula, por lo que en la muestra no había presencia de glucosa.

Para la preparación de Locke glucosa se hizo una disolución al 50 % usando 5 ml de Locke y 5 ml de glucosa al 2% está solución fue utilizada en el duodeno y la misma concentración para el patrón que se evaluó media hora después de que actúe las células del epitelio sobre la solución Locke glucosa.

Para el indicador se utilizo 5 ml de licor de Fehling A y 5ml de CuSO4. ( Fehling B).

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Gráficos:

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Solución patrón de Locke-glucosa Solución de glucosa en el sobrenadante

El color rojo ladrillo determina para la muestra preparada que si hay presencia de glucosa; es decir, que si hubo difusión en el epitelio intestinal de la rata.

La intensidad del color azul es proporcional a la cantidad de glucosa que este presente en el intestino delgado; es decir, si el color azul es de baja intensidad quiere decir que hubo difusión en el epitelio intestinal de la rata.

VII. CONCLUSIONES:

El transporte activo es el movimiento de un metabolito o un ion inorgánico, a través de una membrana en contra de un gradiente de concentración y con inversión de energía (ATP). Los sistemas de transporte activo son unidireccionales en su funcionamiento y dependientes de la energía.

El transporte de glucosa hacia el interior celular, en contra de su gradiente de concentración, es óptimo cuando existe un gradiente de Na+ a favor, que supere la fuerza antagónica que genera el gradiente de la hexosa.Estas células toman glucosa y sodio del intestino y lo transportan al torrente sanguíneo utilizando la acción concertada de los "simport" para Sodio/Glucosa, la glucosa permeasa (una proteína de difusión facilitada para la glucosa) y las bombas de Sodio/Potasio.

Finalmente para evaluar el transporte activo de las células epiteliales debemos saber que la glucosa es un sacárido de seis carbonos que utiliza la célula para sintetizar moléculas de ATP que sirven para proporcionar la energía que necesita la célula para las respectivas actividades funcionales, las células epiteliales deben absorben la mayor cantidad posible de glucosa del intestino, se da entonces un transporte de glucosa del exterior de la célula al nivel intracelular dicho transporte es activo debido a que para realizar la operación necesita moléculas de ATP que proporciona la energía guardada en sus enlaces fosfato, no puede darse la difusión simple porque la glucosa en la sangre debe de ser constante.

VIII. BIBLIOGRAFÍA:

http://www.maph49.galeon.com/memb1/glucose.html

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http://www.ucm.es/info/secivema/docs%20anestesia%20pdf/GUIAS-ANESTESIA-PDF/26-guias-anestesia-anim-experimentacion-NR.pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Transporte_celular http://www.oc.lm.ehu.es/Fundamentos/Doctorado/cursos/CirExp/015.pdf http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/membranas/transpor.htm http://www.ucla.edu.ve/dmedicin/DEPARTAMENTOS/fisiologia/Material

%20Tiskow/Tema4.pps http://es.wikipedia.org/wiki/Transporte_celular http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/06membrana.htm http://www.uam.es/personal_pdi/medicina/algvilla//guiones/guiones.pdf

1. ¿Por qué realizamos esta experiencia en el intestino y no en una bolsa de celofán?

Porqué el transporte sería facilitado por gradiente de concentración en los compartimientos interno y externo, por difusión simple. Para realizar de manera activa se necesita un aporte energético que se enfrente al gradiente de concentración además que se necesitaría de una membrana capacitada que tenga los medios necesarios que en la célula lo aporta su estructura. Si bien es cierto la bolsa de celofán actúa como una membrana semipermeable, se utiliza en algunos experimentos para determinar experimentalmente la ósmosis pero en la práctica se necesitaba evidenciar el transporte activo a través del epitelio intestinal

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de la rata lo cual no se hubiera dado de la misma forma en la bolsa de celofán.

2. ¿Por qué anestesiamos al animal de experimentación en esta práctica?

Porque en la presente práctica se está comprobando el transporte activo en el epitelio intestinal de una rata, para ello se hizo uso de la anestesia para adormecer al animal y no muera durante la experimentación.

3. Determine la velocidad de flujo del transporte de glucosa en la práctica.

La velocidad de flujo de la glucosa al interior de las células epiteliales del intestino es la velocidad que adquiere la glucosa con dirección intracelular, la velocidad se obtiene calculando la cantidad de glucosa que atraviesa la membrana por unidad de tiempo, la cantidad de glucosa en la práctica se puede calcular con respecto a la intensidad de azul evaluado al patrón preparado anteriormente.