transformacion [modo de compatibilidad] - bqexperimental's ... · etapa 1: desarrollo de un...
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Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae
Conclusión: Las células R
“absorbieron” “algo” de las células S
“principio transformante”
El Principio transformanteEl Principio transformanteEl Principio transformanteEl Principio transformante es DNAes DNAes DNAes DNA
TRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNTRANSFORMACIÓNCAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA
INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENOINTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO
Puede ser Puede ser
NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso)
ARTIFICIAL (INDUCIDA)
TRANSFORMACIÓN
¿Para qué tomar DNA exógeno?.... Grandes maquinarias Grandes maquinarias Grandes maquinarias Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformaciónproteícas intervienen en el proceso de transformación
Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..Algunas hipótesis que no son excluyentes…..
I. Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener
resistencia a antibióticos)
II. Para la reparación de DNA
III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono,
nitrógeno y fósforo
SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN TRANSFORMACIÓN vs vs vs vs CONJUGACIÓNCONJUGACIÓNCONJUGACIÓNCONJUGACIÓN
¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en ¿existe DNA libre en todos los ambientes, es todos los ambientes, es todos los ambientes, es todos los ambientes, es
estable?estable?estable?estable?
TRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURALTRANSFORMACIÓN NATURAL, , , , las bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas sonlas bacterias más estudiadas son
GRAM +GRAM +GRAM +GRAM +
Streptococcus pneumoniae
Bacillus subtilis
GRAM GRAM GRAM GRAM ----
Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus influenzae
El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS
ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente
ETAPA 2: Procesamiento del DNAUnión
Importe
Recombinación
El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS
Etapa 1: Desarrollo de un estado competente
¿Qué es una célula competente?Estado fisiológico inducible
Factores que inducen el estado de competencia en la Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural:
Limitación en los nutrientes
Mitomicina C
Alta densidad celular
Temperatura, pH
La transcripción de
los genes com se
inducen durante el
estado de
competencia
Velocidad de transferencia: 90-100 nucleótidos/segundo a 30°C
TRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIALTRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL
El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli
Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generación de organismos transgénicos
TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULARDE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS:VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Medio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAMedio LB + KANAMICINAEscherichia coli
En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria?competente de una bacteria?competente de una bacteria?competente de una bacteria?
1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico1. Tratamiento químico2. Electroporación2. Electroporación2. Electroporación2. Electroporación
Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de E. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli
3 mL medio
E. coli
A= 0.6 A= 0.6 A= 0.6 A= 0.6 –––– 0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm0.8 a 600 nm
3 mL medio Luria
Incubar toda la noche a 37°C
5000 r.p.m. 5 min
3 mL NaCl3 mL NaCl3 mL NaCl3 mL NaCl
Resuspender
5 mL CaCl5 mL CaCl5 mL CaCl5 mL CaCl2222
Resuspender
Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de Preparar células competentes de E. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coliE. coli
5 min 4444°CCCC
Incubar 20 min2500 r.p.m 7 min
CÉLULAS COMPETENTES
Plásmido 1 hr 42°C 70 s
Inmediatamente en hielo
LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICOLA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO
1 mL medio SOC
Incubar a 37°C con
agitación por 45 min
Utilizaremos el plásmido pET-TEM
Sitio múltiple de Sitio múltiple de Sitio múltiple de Sitio múltiple de restricciónrestricciónrestricciónrestricciónGen que confiere Gen que confiere Gen que confiere Gen que confiere
resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasakanamicina fosfotransferasa
Origen de Origen de Origen de Origen de replicaciónreplicaciónreplicaciónreplicación
Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos:La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.generalmente codificadas por plásmidos.
La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1.Adenilación de grupos hidroxilo. 2.Fosforilación de grupos hidroxilo. 3.Acetilación de grupos amino.
ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO:
Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina.
Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina.
Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas,
Sisomicina.
Neomicina, Kanamicina Kanamicina Kanamicina Kanamicina fosfotransferasafosfotransferasafosfotransferasafosfotransferasa
Gentamicina A, Neomicina, KanamicinaKanamicinaKanamicinaKanamicina
ESQUEMA GENERALESQUEMA GENERALESQUEMA GENERALESQUEMA GENERAL
SESIÓN I:SESIÓN I:SESIÓN I:SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 2SESIÓN 2SESIÓN 2SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalina
SESIÓN 3:SESIÓN 3:SESIÓN 3:SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
Lisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalinaLisis alcalina