transferencia de genes mediada por espermatozoides para la producción de embriones transgénicos
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TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES PARA LA
PRODUCCIÓN DE EMBRIONES TRANSGÉNICOS
M.C. Graciela Calderón Mendoza
Centro Multidisciplinario de Estudios en BiotecnologíaFacultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
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Animales transgénicos
Microinyección pronuclear
Transferencia nuclear
Integración genética ratones 30-50%
animales de granja 3%
Eficiencia
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Transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT)
FIV
Cultivo de embriones transgénicos
PASO 4
IncubaciónEspermatozoides/ADN
PASO 1
PASO 2
ADN EXÓGENO
IncubaciónEspermatozoides transfectados con ovocitos
ICSI
Implantación de embriones
transgénicos viables
Descendencia transgénicaIntegración genética
PASO 3
•liposomas•electroporación•REMI•vectores retrovirales•anticuerpos monoclonales•detergentes•crioprotectores•congelación•RecA Tn5
Métodos Transfecciónespermatozoides
* Brackett et al. (1971)
* Lavitrano et al. (1989)
*Perry A. (1999) 94% expresión genética
Inseminación artificial
Ratones, Conejos, Peces, Aves, Monkey Rhesus, macaques, Cabras, Ovinos, Cerdos, Bovinos, Felinos y Equinos
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Interacción e integración de ADN exógeno en el espermatozoide
SMGT
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Interacción de moléculas de ADN exógenas en el núcleo espermático
Spadafora, 1998
MP
Núcleo
MN
Protaminas
ADN cromosomal
IF-1
DP
B CD4
ADN exógeno
MHC II
DPB: binding proteinsIF-1: Factor inhibidor
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Integración
ADN exógeno
Protaminas
ADN cromosomal
Integración del ADN exógeno en el ADN cromosómico del espermatozoide
Topoisomerasa II
Elementos nucleares tipo I
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Spadafora, 2008
Transferencia de genes “inversa” mediada por espermatozoides (SMRGT)
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SMGT94% EXPRESION GENETICA
R A T O N
Animales granja baja eficiencia: B O V I N O S
Incubación ADN/espermatozoides
LiposomasElectroporación
I.A FIV
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SMGT EN BOVINOS
Castro et al., 1990: incubación ADN 0.3% espermatozoides (EGFP)
Gagné et al., 1991: electroporación 12% embriones FIV (pRGH527)
Rieth et al., 2000: electroporación 27% espermatozoides (Pst1 -actin GFP)
Francolini et al.,1993: incubación de ADN 15-22% espermatozoides (GFP)
Schellander et al. 1995: incubación ADN 2.4% embriones I.A (pSV2-cat)
Sperandio et al., 1996: incubación ADN 0.4% embriones FIV (PALu)
Shemesh et al., 2000: REMI 13% espermatozoides (pEGFP)
Alderson et al.,2006: incubación ADN 10.2% embriones (pCX-EGFP- protaminas) FIV
Hoelker et al., 2007: liposomas 3.6% embriones (CMV-INF-t-IRES-EGFP) FIV
Pereyra et al., 2008: incubación ADN 24% embriones (pCX-EGFP) FIV
Crioprotectores en congelación y/o detergentes - Transfección espermatozoides (pCMV-GFP) (UPII-GFP) – Embriones transgénicos ICSI
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Lavitrano et al. (1992)Incubación ADN exógeno
autorradiografía 80% periferia del núcleo entre MP y MN
20% internaba núcleo ratón
Francolini et al. (1993)Incubación ADN exógeno
autorradiografía 6-30% internado núcleo ratón
Sperandio et al. (1996) Incubación ADN exógeno
autorradiografía 50-80% región postacrosomal , toro y
cerdo
Huguet and Esponda (1998) Incubación ADN exógeno
microscopia electrónica 34% núcleo y 7.5% MP y acrosoma ratón
Lavitrano et al. (1997)Incubación ADN exógeno
inmunofluorescencia segmento posacrosomal cerdos
Anzar and Buhr (2006)Incubación ADN exógeno
microscopia fluorescencia región acrosomal 49% bovinos
Localización de ADN exógeno en espermatozoides
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Estado funcional del espermatozoideEspermatozoide no capacitado
Espermatozoide exocitósis acrosomal
Espermatozoide reacción acrosomalNo Capacitado Capacitado Reacción acrosomal
ADN exógeno
Anzar and Buhr (2006)
Harrison, 1997: capacitation like
Perry, 1999: transfección de espermatozoides congelados de ratón
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• Disuleve proteínas
• Elimina la MP
•Elimina membrana acrosomal
• Elimina acrosoma
•Ingresa ADN exógeno
• Acrosoma interfiere en descondensación de la cromatina espermática
• Expuesto núcleo espermático
núcleo
acrosoma
membrana plasmática
núcleo
ADN exógeno
cabeza
parte intermedia
flagelo
membranaacrosomal
Desestabilización de la MP del espermatozoide con detergentes
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núcleo
núcleo
• Crioprotectores
• Protege al espermatozoide en congelamiento
• Almacenamiento • Daños en membrana plasmática
• Formación de cristales de agua en espacio extracelular e intracelular
• Muerte celular
Espermatozoide con crioprotector
Espermatozoide sin crioprotector
Desestabilización de la MP del espermatozoide con crioprotectores
• Bajas concentraciones crioprotectores
• Ingresa ADN exógeno
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Espermatozoides de bovino transfectados
crioprotector
ADN exógeno
espermatozoides
Congelación -80°C
Espermatozoides transgénicos
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APLICACION DE ESPERMATOZOIDES DE BOVINO TRANSFECTADOS
Espermatozoides MP desestabilizada con
detergentes y crioprotectores permiten la transfección
Producción de animales
transgénicos“BIORREACTOR
ES”
Producción de
embriones bovinos
transgénicos
Transferencia de embriones
Producción de proteínas terapéuticas
(UROPLAQUINA) en orina
ICSI Aumenta la captura ADN exógeno
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ANIMALES BIORRECTORES DE UROPLAQUINA EN ORINA
Kerry et al. (1998)
ratones UPII
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Espermatozoide Gen UPII
Promotor para tejido específico (urotelio)
Transferenciaembriones
Cultivo embrionario
ICSI
Vaca transgénicaBiorreactor Orina
Vaca adulta 30 litros/día
Aislamiento y purificación de
UPII
Urotelio-Vejiga expresando la UPII
Producto finalUPII
Marcador de cáncer urotelial en
humanos
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