Trabajo Práctico

Observación de vectores.

Estudios Parasitológicos

Floridia Ricardo Ariel

2012

Estudios Parasitológicos

Sensibilidad de métodos

El laboratorio en el diagnóstico de la infección chagásicaDra. Beatriz Basso

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Identificar si se trata de un insecto de la subfamilia Triatominae (posible transmisor de la enfermedad de Chagas – Mazza

Tomar el insecto con la pinza

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Liberar el contenido intestinal.Con dos pinzas

Precauciones. Guardapolvo, guantes, gafas y vidrio protector.

Observar al microscopio a 40x

Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

Xenodiagnóstico

Considerado el método de referencia Sensibilidad: En formas agudas entre 85 al 100%, en las congénitas

80% y en las crónicas entre el 20 al 50%. Las cajas están compuestas por ninfas de 3o a 4o estadio, con algunas

semanas de ayuno (2 a 3) y ávidas de alimentarse. Se colocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca libre, cubierta con gasa; se utilizan 4 de estas cajas sobre la piel de los antebrazos.

Xenodiagnóstico

Observar contenido intestinal a los 30, 60 y 90 días de la succión de sangre.

Se busca tripomastigotes o epimastigotes en el contenido intestinal.

Método Strout

Es el método de preferencia en la etapa aguda (hasta los 40 – 60 días post infección).

Reconocer la movilidad de los parásitos entre los hematíes

Se debe repetir en forma seriada (3 veces)

También se utiliza para control de tratamiento. Para informar un Strout como positivo debemos observar

la movilidad del parásito. IMPORTANTE: observar recorriendo todos los campos

(no menos de 45 minutos) y varios preparados

Sensibilidad 95%

5-10 mL

Tº amb

Coag.

600 rpm 2 min.

2500 rpm 10 min.

Suero

Sedimento

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Micrométodo de Strout

Se utiliza un tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad al que se le agrega una gota de heparina más 0,5 ml de sangre venosa, se mezcla por inversión

Centrifugar durante dos minutos a 3000 rpm. Tomar una gota de la interfase, rica en glóbulos blancos,

y se observa entre porta y cubreobjeto al microscopio con 400 aumentos. Deben observarse como mínimo 4 preparados.

Sensibilidad similar al Strout Reducción de cantidad de sangre a extraer.

Medicina Vol 59 Supl III – 1999De Rissio, AM; Maidana,CG; Martín García, MC y Ruiz, AMINP”Dr. Mario Fatala Chabén” 

Microhematocrito

Para diagnóstico durante la etapa aguda o en los casos congénitos.

Es importante extraer 6 o mas tubos capilares (50 ul c/u)

Sensibilidad semejante a strout Observar varios preparados con las consideraciones

del strout Inconvenientes técnicos.

Bioseguridad

J Clin Microbiol. 1983 August; 18(2): 327-330

H Feilij, L Muller and S M Gonzalez Cappa

Sensibilidad 90 a 95%

45 segundos a 5000 rpm

6 a 9 microhematocrito heparinizado

Cerrar extremo con plastilina

Cortar

BIOSEGURIDAD

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Gota fresca

Método que se puede efectuar en la etapa aguda

De fácil realización De baja sensibilidad Observar movilidad de los parásitos.

Aumentar irrigación

Sensibilidad 50%

100x / 400x

gota de citrato al 2%)

Tripanosoma cruzi

45 minutos

Gota gruesa

Método sencillo Baja sensibilidad Observar morfología del parásito

Sensibilidad 50%

Colocar 1 a 3 gotas

Desfibrinar

1-2min

Dejar secar

Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar

objetivo de 100x aceite

Tripanosoma cruzi

Hemocultivo

Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

Es aplicable a la etapa aguda pero también en la crónica, en la cual disminuye en gran medida la sensibilidad.

Requiere de un tiempo prolongado para obtener resultados.

Se puede realizar una coloración (Giemsa) para visualizar el tripanosoma con mayor definición.

Sensibilidad: Agudo: 80 – 100%Crónico:40 – 60%

Se incuba sangre heparinizada a 28ºC hasta 60 días

PCR para Chagas

No está validad (solo para seguimiento de tratamiento)

Tiene elevada sensibilidad (aún en etapa crónica) Falsos positivos y algunos falsos negativos. Selectivo para T. cruzi y T. rangeli Amplifica un fragmento de 330 pb del ADN k

Mix p/1x30: 30ul

H2O: 12,7 ul Buffer (10x) Taq: 3 ul MgCl2 (25mM): 3,6 ul dNTPs (5mM): 1,5 ul Primer 121 (50pmol/ml): 1,5 ul Primer 122 (50pmol/ml): 1,5 ul Taq (0,8ul/20ul): 1,2 ul TOTAL: 25 ul

(1x25ul)  25ul mix + 5 ul

(muestra)

PCR para Chagas

Temperature Time

4ºC 3 minutos

94 ºC 3 minutes

94 ºC 1 minute

68 ºC 1 minute

72 ºC 1 minute

94 ºC 45 second

64 ºC 45 second

72 ºC 45 second

72 ºC 10 minutes

4 ºC Hold

35 cycles

5 cycles

Bibliografía

Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la Trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas). Serie de Normas Técnicas Nº 00. Lima, 2005

Fortalecimiento en la Enseñanza de la Enfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dra. Beatriz Basso* * Profesora, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología. Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Universidad Nacional de Córdoba

Parasitosis regionales. Un estudio referido a las principales parasitosis de Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Sixto Raúl Costamagna, Elena C. Visciarelli.

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Diciembre, 2009 Aspectos exocoriales de huevos de Triatoma patagonica Del Ponte, 1929 por microscopía electrónica de barrido Elena VisciarelliI; Adriana FerreroII; Sixto

Raúl CostamagnaI. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Bahía Blanca, Prov. de Buenos Aires, Argentina. E-mail: evisciar@criba.edu.ar ICátedra de Parasitología Clínica. IICátedra de Zoología de Invertebrados II

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Alimentación y defecación en triatominos del género Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) alimentados con sangre humana. E. Aldana     E.Lizano     M.Rodríguez     A. Valderrama. Recibido  28-IV-2000.  Corregido  20-XI-2000.  Aceptado   20-XI-2000 

Ecología de la enfermedad de Chagas, y su prevención y control en la Amazonia. Un enfoque de ecosalud. Roberto Bazzani, IDRC/CRDI; Roberto Salvatella, OPS/OMS

La aerotermia como alternativa para el control de Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) resistentes a deltametrina. Alberto G. GentileI; José L. SartiniII; María C. CamposIII; Juan F. SánchezIV. ICoordinación de Gestión Epidemiológica, Ministerio de Salud Pública, Salta, Argentina

Diagnóstico Molecular de la enfermedad de Chagas. Constança Britto. Laboratorio de Biología Molecular y Enfermedades Endémicas, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, 21040-900, Río de Janeiro, RJ, Brasil. Correo electrónico: cbritto@ioc.fiocruz.br

Utilidad de la técnica de PCR. en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Brusés, Bettina L. - Lucero, Horacio - Gorodner, Jorge O. Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.