trabajo prÁctico n°1 cromatografÍa - …quimica.aeok.org/archivos/material/cromato3.pdf ·...

Eduardo R. Santiago Trabajos Prácticos de Química Analítica Cualitativa

Escuela Técnica Nº1 “Ing. Otto Krause” Página -1-

TRABAJO PRÁCTICO N°1 CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA, PAPEL, COLUMNA, GASEOSA Y LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN INTRODUCCIÓN Todas las técnicas de cromatografía se basan en el mismo principio. Comprenden un sistema móvil, líquido o gaseoso, que está en equilibrio con una fase estacionaria. La mezcla a separar se distribuye entre las dos fases, produciéndose la fijación selectiva de algunos de los componentes y el desplazamiento de otros, con lo cual se logra la separación. Cromatografía de adsorción: se tiene una fase estacionaria sólida y la intersección que se produce entre ésta y la mezcla a separar es una adsorción. Este tipo de cromatografía involucra en general una fase móvil relativamente poco polar y una fase estacionaria, la sustancia adsorbente, finamente dividida. Adsorbentes utilizados: las sustancias más utilizadas en orden decreciente de poder adsorbente son: Carbón activado Hidróxido de calcio Silicato de magnesio carbonato de calcio Óxido de aluminio (alúmina) talco Sílica gel almidón Hidróxido de aluminio Existen dos técnicas principales de cromatografía de adsorción: en CAPA DELGADA y en COLUMNA. Para la cromatografía en capa se extiende uniformemente una capa del adsorbente de aproximadamente 0.25 mm de espesor (cromatografía analítica en capa delgada) o mayor de hasta 2 mm (cromatografía preparativa), sobre una placa de vidrio. El adsorbente, en este caso se puede utilizar mezclando al mismo con un ligante (e.g. SO4Ca) para permitir una buena adherencia al vidrio. La cromatografía en columna es en todos los casos preparativa. Desarrollo del cromatograma: se llama desarrollo del cromatograma al pasaje de un solvente a través de la fase estacionaria depositada sobre una placa de vidrio, o a través de papel, según veremos más adelante. Elución de un cromatograma: este término se utiliza cuando se intenta remover una sustancia adsorbida. Se efectúa generalmente en columna. Los solventes utilizados para desarrollo y elución de cromatografía en orden creciente de polaridad son:



1. éter de petróleo 4.cloroformo 7.acetona 10.agua2. ciclohexano 5.éter etílico 8.etanol 3. benceno 6.acetato de etilo 9.metanol

CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN

Se basa en la diferencia de los coeficientes de partición de los componentes de una mezcla cuando se distribuyen entre dos fases líquidas. La fase líquida estacionaria se fija sobre un sólido que actúa como soporte. Tenemos una cromatografía de partición si en lugar de emplear un adsorbente activo se deposita sobre la placa de vidrio, una capa de celulosa especialmente tratada. También pueden hacerse columnas de celulosa. Esta actúa como soporte de la fase estacionaria, agua. Uno de los agentes de desarrollo más utilizados son los alcoholes de bajo peso molecular, principalmente butanoles, utilizados especialmente en cromatografía de sustancias polares como aminoácidos, azúcares, y alcaloides. La cromatografía en papel es también de partición. Relación de frente (Rf): se llama relación de frente o Rf a la relación entre el camino recorrido por la muestra y el camino recorrido por el solvente:

Rf = solventeelporrecorridadistanciasubstancialaporrecorridadistancia

El Rf depende de la sustancia y del sistema utilizado en la cromatografía en cuestión. No obstante en un sistema dado dos sustancias pueden tener el mismo Rf. Teoricamente es posible encontrar un sistema que permita separar dos sustancias que corran igual en varios sistemas. El hecho de encontrar dos manchas que posean el mismo Rf en un sistema dado no nos permite afirmar que se trata de la misma sustancia, pero sí podemos asegurar que no lo es cuando es distinto el Rf. Además del Rf deben tenerse en cuenta: forma de la mancha, color producido por el revelador usado, etc., comparando siempre que sea posible con un testigo.

TECNICA DE LA CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA La cromatografía en capa delgada permite establecer rápidamente (en aproximadamente 40 min.) si una muestra está constituida por uno o más componentes y efectuar la selección del adsorbente y del eluyente adecuados para una futura separación en columna o en placa preparativa. Sembrado de la placa: la placa utilizada tiene generalmente dimensiones de 10 x 20 cm. Sobre ella se extiende una capa uniforme



y fina (0,2-0,3 mm de espesor) de un adsorbente: generalmente se usa alúmina o sílica gel. La muestra se disuelve en un solvente volátil con una concentración de por lo menos 10 mg/ml (10 microgramos/microlitros). Para efectuar la siembra de la mezcla sobre la placa, se depositan pequeñas alícuotas que abarquen, al extenderse sobre la placa, zonas de 2-3 mm de diámetro, mediante un capilar de a lo sumo 0,5 mm de diámetro o mediante una micropipeta, a una distancia de 1,5 cm del borde de la placa, la distancia entre los sitios sembrados debe ser de por lo menos 1 cm. Las alícuotas se colocan sobre un mismo punto para cada sustancia esperando que se evapore el solvente de la siembra anterior para depositar la siguiente. Se debe sembrar un volumen tal que la cantidad de muestra sembrada varía entre 10-20 microgramos, (dos siembras de 3 mm de diámetro equivalen aproximadamente a 1 microlitro). Sobre una misma placa se pueden cromatografiar varias muestras, conservando los puntos de la siembre sobre una línea recta, paralela al borde inferior de la placa. Desarrollo del cromatograma: la placa ya sembrada se introduce en una cámara de vidrio con tapa, que contiene una cierta cantidad del solvente elegido, de modo que su nivel esté en contacto con la capa adsorbente y pueda ascender por capilaridad, pero cuidando que la superficie del solvente quede debajo de la superficie de siembra. Antes de introducir la placa, la cámara debe estar saturada con vapores del eluyente, para conseguirlo rápidamente se aconseja forrar parte de sus paredes internas con papel de filtro embebido en el eluyente. Cuando el solvente de desarrollo alcanza una línea superior marcada previamente, se retira la placa de la cámara y se deja evaporar el solvente. Una vez que la placa se ha secado, se revela. Revelado del cromatograma: el revelado del cromatograma se puede efectuar pulverizando la placa con reactivos generales o específicos que permiten ubicar la sustancia mediante reacciones de coloración. Reveladores generales: a.- IODO: es un reactivo muy utilizado. Para revelar se introduce la placa seca en una cámara saturada de vapores de este reactivo o se lo pulveriza con una solución al 1% en etanol. b.- ÁCIDO SULFÚRICO CONCENTRADO c.- ANISALDEHIDO-ÁCIDO ACÉTICO-ACIDO SULFÚRICO CONCENTRADO En el caso b y c se debe calentar de 2 a 3 minutos, a 120ºC-150°C en estufa, después de pulverizar la placa. En el caso de sustancias cuya estructura lo permita puede revelarse el cromatograma con U.V.



CROMATOGRAFIA EN PAPEL La cromatografía en papel es un método de partición que utiliza como soporte de la fase fija, una hoja de papel de filtro especial (Whatman o Schleicher & Schull). La técnica de siembra de la muestra sobre papel, así como la cantidad de sustancia a cromatografiar es análoga a la indicada para cromatografía en capa delgada. Una vez sembrada la muestra, la hoja de papel se coloca dentro de la cámara cerrada que está saturada con los vapores de la mezcla de solventes que se van a emplear para desarrollar el cromatograma. Se deja en esas condiciones durante un período variable que se llama "período de equilibrado", durante el cual el papel se satura sin entrar directamente en contacto con el solvente. Luego se sumerge el borde inferior del papel en el solvente conteniendo en el fondo de la vasija (cromatografía ascendente) o se agrega el solvente a una cubeta de la cual cuelga el papel sostenido por su parte superior, la que queda sumergida en el solvente agregado (cromatografía descendente). La partición se lleva a cabo entre el agua (fase fija) retenida por la celulosa del papel y el solvente de desarrollo (fase móvil) no miscible con el agua; por ejemplo, butanol saturado con agua. Es decir que a medida que el solvente se desplaza sobre el papel se verifica una distribución del soluto a cromatografiar entre el solvente orgánico y el agua retenida, lográndose así la separación de los componentes de una mezcla según sus respectivos coeficientes de partición. Como consecuencia de éste (del coeficiente de partición) los componentes se moveran con diferentes velocidades. Cuando el frente del solvente llega a una adecuada distancia, se retira el cromatograma, se seca y se revela (por pulverización o por inmersión) empleando reactivos que convengan a cada tipo de sustancias, apareciendo así los componentes de la muestra sembrada, a diferentes alturas y en forma de manchas circulares. Se mide entonces la relación de frente (Rf) para cada componente, midiendo las distancias desde el centro de la mancha y desde la línea del frente hasta el punto donde se aplicó la siembra. Los Rf son siempre menores que la unidad, como surge de la definición y dependen, entre otras cosas, de la temperatura, de la composición del solvente usado para el desarrollo, del tipo de papel de la técnica usada para el desarrollo (ascendente o descendente), etc. Actualmente se prefiere utilizar como referencia alguna sustancia de estructura similar a la que se desea correr, en lugar del frente del solvente. Así, cuando se cromatografían hidratos de carbono se suele usar glucosa como patrón standard y se mide el Rg.

aglulaporrecorridadistanciasustancialaporrecorridadistanciaRg

cos=

La sustancia de referencia se corre en el mismo papel que la de estudio.



La cromatografía en papel no solo permite hacer un análisis cualitativo de mezclas sino también puede ser cuantitativo, para lo cual la aplicación de muestras en el origen se hace con pipetas calibradas con las que se puede medir hasta 0,2 microlitros. Después del revelado se dosan colorimétricamente las sustancias separadas. Descripta de la manera antedicha, la cromatografía en papel se denomina unidimensional. Si una vez corrida en una dirección, el papel se gira en 90' y se corre en la nueva dirección, se tiene una cromatografía bidimensional. Este tipo de cromatografía puede ser útil en el caso de hidrolizados de proteínas, debido a la complejidad de la mezcla obtenida en esos casos.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA La cromatografía en columna puede ser de adsorción o de partición. Cromatografía de adsorción en columna: Esta cromatografía se lleva a cabo igual que la de partición en tubos de vidrio verticales que se llenan con el adsorbente adecuado, al cual se adhiere la mezcla de sustancias a separar, debido a las fuerzas de Van der Waals. La mezcla a analizar o resolver se siembra sobre la parte superior del adsorbente contenido en la columna, disuelta en la menor cantidad posible de un solvente poco polar. Otro modo de cargar la columna consiste en preparar una suspensión del adsorbente utilizado en una solución de la muestra a cromatografiar. Por evaporación del solvente se obtiene un polvo que contiene la muestra adsorbida. Este se coloca sobre la parte superior del adsorbente en la columna. Se eluye con el solvente adecuado. La efectividad de la cromatografía dependerá de la naturaleza de la mezcla a separar, del adsorbente y del solvente. Las sustancias a separar quedan retenidas de acuerdo con su estructura química, siendo las más adsorbidas las más polares. El orden de elución, generalmente es el siguiente: 1.alcanos 3.Hidrocarburos aromáticos 5.ésteres 7.alcoholes 2.alquenos 4.éteres 6.cetonas 8.ácidos Para efectuar separaciones reproducibles es importante emplear un adsorbente con propiedades invariables en lo que respecta al tamaño de partícula y actividad (contenido en agua). El tamaño de partícula se normaliza haciendo pasar el adsorbente previamente por tamices de malla fina (100 a 200 mallas/cm2). El empleo de determinado adsorbente depende de la naturaleza de las sustancias que se desea separar; para sustancias de baja polaridad (hidrocarburos, éteres, etc.) se suele emplear alúmina, sílica gel; para sustancias polares se suele emplear carbón o cromatografía de partición con columna de celulosa. La actividad de la alúmina se regula por calentamiento al rojo sombra en crisol de hierro (0% de humedad = actividad 1) y a partir de esta alúmina se preparan los demás tipos por adición de 3% de agua (actividad 2), 4% (actividad 3), 9,5% (actividad 4) y 15%



(actividad 5). Dado el carácter anfótero de la alúmina, la de actividad 1 puede ser básica (pH=9,5), neutra (pH=7) o ácida (pH=4,5). Los solventes utilizados para eluir la sustancia adsorbida en la parte superior de la columna son los mismos que se han mencionado para cromatografía en capa delgada. Cuando se trata de mezclas de sustancias de naturaleza desconocida se comienza con el menos polar. Pueden usarse mezclas de solventes. Otra técnica que puede emplearse es la de extrusión. Para ello, se saca el contenido de la columna, aplicando suave presión por la parte inferior y cuidando de no destruir el cromatograma. Luego se localiza la banda que interesa y se separa cortando con un cuchillo o espátula.

CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía gaseosa es un método para separar componentes de mezclas de compuestos volátiles. En la mayoría de sus aplicaciones las separaciones de hacen para identificar y determinar la cantidad de cada componente de una mezcla. En otras aplicaciones, las separaciones se hacen con fines preparativos. Las cantidades de sustancia requerida para fines analíticos, varía entre 0,1 y l0 microlitros. Un proceso cromatográfico muy simple consiste en tomar un tubo que puede ser cilíndrico, de vidrio o bien metálico en espiral; colocar dentro un sólido finamente dividido (fase estacionaria, adsorbente) y hacer pasar a través de él la mezcla a separar. El solvente (carrier, fase móvil, o eluyente) puede variar a lo largo del proceso. El término cromatografía gaseosa se aplica a los procesos en los cuales la fase móvil es un gas y en los que la distribución de los componentes de una mezcla se logra mediante cualquiera de los procesos cromatográficos de adsorción selectiva o partición. Si el principal mecanismo que produce la distribución es la adsorción en un sustrato sólido, el método se denomina "cromatografía gas-sólido". Si el mecanismo principal involucra la partición entre la fase gaseosa y una fina película de un líquido depositado sobre un sólido inerte, el método es una cromatografía de partición "gas-líquido". Mediante esta técnica se pueden separar docenas de constituyentes empleando muestras de menos de un microgramo. También se emplean aparatos en escala preparativa. Se aplica a un amplio rango de sustancias para lo cual se puede variar la fase fija y la temperatura que puede llegar a los 500°C para la separación de sustancias de alto peso molecular. Los aparatos que se emplean en la cromatografía gas-sólido y en la cromatografía gas-líquido son básicamente iguales en su construcción. Difieren en la naturaleza del material de relleno a través del cual pasa la muestra. La naturaleza de la columna es fundamental en la realización de una cromatografía gaseosa. Actualmente se conocen dos clases de columnas: a) columna con carga, b) columna capilar (Golay).



Una columna con carga consiste en un tubo en forma de U, o en espiral que llena uniformemente con un polvo bien empacado que actúa como adsorbente. También la carga puede ser un sólido inerte (perlas de vidrio) conteniendo una película en la cual se va a efectuar la partición de la sustancia arrastrada por el gas. Una columna Golay consiste en una espiral de 0,25-0,50 mm de diámetro interno, que puede tener una longitud de tubería de 30 a 100 m. Las paredes internas de este capilar están cubiertas con una fina capa líquida no volátil con la cual se va a producir la partición de la sustancia arrastrada por el gas. En la técnica más común de cromatografía gaseosa (técnica de elusión) una corriente de gas inerte (gas portador), recorre continuamente la columna, y la mezcla a separar se introduce en el comienzo de la columna instantáneamente. Esta puede ser una muestra de gas, líquido volátil ó sólido en solución. En estos últimos casos la muestra debe vaporizarse antes de entrar en la columna. Si el método elegido es Cromatografía de adsorción al llegar a la columna, la muestra vaporizada se adsorbe en el material de relleno, y al mismo tiempo se establece un equilibrio entre ese material y el gas en los intersticios de la columna, de manera que una parte de la muestra permanece siempre en la fase gaseosa. Esta porción, sigue avanzando a lo largo de la columna, en la corriente de gas portador, donde de nuevo se equilibra con el adsorbente. Al mismo tiempo, el material ya adsorbido en la columna, vuelve a la fase gaseosa, de manera de restablecer el equilibrio con el gas portador puro, que empuja la zona de vapor. La velocidad a la cual se mueve la sustancia, depende en principio de dos factores: a.- la velocidad de flujo del gas portador, y b.- la medida en que el vapor es adsorbido. A mayor flujo de gas portador, la zona se mueve más rápido; cuanto más fuertemente sea adsorbido el vapor en el material que rellena la columna, más lentamente se moverá la zona. Cuando dos o más componentes están presentes en la muestra, cada uno se comporta independientemente de los otros, de manera que para un dado flujo de gas portador, la velocidad de la zona de cada componente, depende de la medida en la cual ésta es adsorbida. Dado que distintas sustancias difieren respectivamente en sus poderes le adsorción (afinidad con el material de relleno), ellas pueden ser separadas haciendo uso de las distintas velocidades de avance a través de la columna. El modo característico de interacción entre una determinada carga de columna y los componentes que se cromatografían, se expresa en términos de "tiempo de retención" que es el tiempo que transcurre entre el instante en que la mezcla se introduce en la columna y el momento en que se detecta su aparición. Cuanto mayor sea la interacción entre el constituyente y la columna, mayor será el tiempo de retención. Si se usa una columna de condiciones normalizadas, el tiempo de retención es un parámetro reproducible que puede servir para caracterizar a la sustancia. Como el tiempo de retención puede verse afectado por la velocidad de flujo de gas portador, se prefiere emplear el "volumen de retención" que es el volumen de gas empleado en transportar el constituyente en cuestión a través de la columna.



Queda por especificar ahora, la naturaleza del adsorbente. En más del 90% de las aplicaciones, el relleno de la columna, es un líquido (líquido estacionario), mantenido dentro de la misma, por estar soportado en un material sólido inerte. Esta cromatografía gaseosa se llama cromatografía gas-líquido (c.g.l.). El método es una extensión directa de la cromatografía de partición liquido-líquido usada para separar solutos con mezclas de solventes, ya que el vapor en el gas portador es exactamente análogo al líquido eluyente. Resumiendo y de acuerdo al principio en que se basa se distinguen los siguientes tipos de cromatografía:

MÉTODO F A S E S

Estacionaria móvil Cromatografía gaseosa de adsorción sólida gaseosa Cromatografía gaseosa de partición líquida gaseosa Cromatografía de partición líquida líquida Cromatografía en papel. Líquida líquida Cromatografía de adsorción sólida líquida Instrumental: el equipo básico para cromatografía gaseosa consta de (ver esquema): a.- Una fuente de gas comprimido (He, N2, H2, Ar y CO2) que proporciona el gas portador. b.- Un regulador de presión o flujo del gas portador. c.- Inyector: permite la introducción de la muestra en la corriente de gas portador. Normalmente se trata de un inyector de líquidos, que puede ser utilizado para sólidos (en disolución) y gases. Se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada independientemente de ésta a temperatura superior al punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. Suele tener una membrana de caucho a través de la cual se introduce la muestra con una microjeringa. d. Columna cromatográfica: Es un tubo de vídrio o metal (acero inoxidable, cobre, aluminio, etc.), de longitud que oscila entre 1 y 200 m cuyo diámetro interior puede ser desde 0,1 a 50 mm, según el tipo de columna. e.- El horno, en cuyo interior se sitúa la columna, que debe poseer una buena regulación térmica.



f.- El detector: Este es un dispositivo que permite medir de manera continua una propiedad física del gas portador, que se modifique sensiblemente con la presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar (conductividad térmica, corriente de ionización, afinidad electrónica, etc.) y que dé por registro gráfico una curva que sea una función simple de la concentración. Está situado a la salida de la columna. g.- Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por el detector. h.- Registrador con el cual se gráfica la variación de la propiedad medida en función del tiempo. El área cubierta por el pico de cada sustancia en el gráfico que se obtiene en el aparato, da una medida de la proporción en que la misma se encuentra en la mezcla.

Fig. 1. Esquema de un cromatógrafo de gases

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (o eficacia).

Se llama así a una técnica desarrollada a partir de la cromatografía en columna. La presión es un factor negativo siendo necesaria sólo para lograr un flujo razonable y por lo tanto una velocidad aceptable en la corrida cromatográfica. Por eso se la prefiere llamar



cromatografía líquida de alta resolución (en inglés HPLC, high performance líquid chromatography), y no de alta presión. Los principios de separación son los mismos que en cromatografía líquida en columna clásica, y dependiendo del relleno utilizado puede, realizarse cromatografía de adsorción partición, intercambio iónico o filtración molecular. Las principales diferencias con respecto a la cromatografía líquida clásica son: 1) Las partículas de los rellenos en HPLC son muy pequeñas (5-15 µm.), de tamaño uniforme, con lo cual se logra un buen empaquetamiento que reditúa en una muy pequeña altura de plato teórica (HETP) y poca di fusión lográndose por lo tanto gran resolución, mayor que en cualquier otro tipo de cromatografía. 2) Las columnas son en general de acero de pequeño diámetro (2 a 5 mm.) y longuitud (50 a 250 mm.). Para lograr un flujo de 0,5 a 2 ml/min. se trabaja bombeando el solvente a 50-300 atm. de presión. Esto permite corridas muy rápidas (l0 a 60 min.) y de larga duración. La cromatografía gaseosa había introducido las ventajas de la automatización, reproducibilidad y velocidad. A estos atributos la HPLC agregó la posibilidad de separar muestras no volátiles o térmicamente inestables, teniendo un parámetro más de ajuste, la fase móvil que se puede variar, al contrario de la cromatografía gaseosa que utiliza un gas inerte único. Gráfico

La figura muestra las partes fundamentales de un cromatógrafo líquido. a) Reservorios de los solventes a utilizarse como fase móvil b) Sistema de bombeo a alta presión



Fundamentalmente existen dos tipos de bombas según provean un flujo contínuo o pulsante. Los aspectos más importantes del sistema de bombeo son: 1) Presión máxima de operación (suele estar entre 300atm y 400atm.). 2) Características del flujo que produce (continuo o pulsado). 3) Reproducibilidad y constancia de flujo. El sistema más utilizado es el de bomba con 2 pistones alternantes. Cuando uno toma solvente el otro lo envía a la línea y por lo tanto se compensan los pulsos lográndose un flujo estable. c) Programador de gradiente Controla el flujo de cada bomba pudiendo variarse en forma continua o discontinua a lo largo de la corrida cromatográfica. d) Medidores de presión e) Inyectores El sistema de inyección puede ser mediante un diafragma y una jeringa similar a como se realiza en cromatografía gaseosa; pero este sistema sólo se puede utilizar cuando se trabaja a menos de 70 atm. Como normalmente se trabaja a mayor presión se utilizan válvulas especiales que inyectan un volumen determinado de muestra, o el sistema de “Bucle” mediante el cual se introduce la muestra en un desvío de la línea que luego se conecta a ella. El volumen inyectado es de 5 a 200 ul. f) Columnas Longitud: 15 a 25 cm Diámetro: 2 a 5 mm En estas columnas se pueden cromatografiar en general hasta 2 mg de muestra. Para separar cantidades mayores existen columnas semí-preparativas de 9 mm y preparativas de hasta 50 mm de diámetro y 50 cm de largo, pudiéndose separar cantidades mayores al gramo. En caso de muy pequeñas cantidades y volúmenes se pueden utilizar microcolumnas de 5 cm o menos y 1 mm de diámetro. Las partículas de tamaño uniforme pueden ser de 3 tipos: a) de 40 a 60 µm porosas. b) de 40 a 60 µm, sólidas con una película exterior porosa. c) de 5 a 10 µm, porosa.



Como se ve en la figura, con las partículas más pequeñas se logra mucha mejor resolución, pues el empaquetamiento en la columna es mejor, hay menos intersticios y por lo tanto la difusión de distintas moléculas es más uniforme. En el caso de microcolumnas se llega a usar partículas de hasta 2-3 µm de diámetro; para partículas menores el empaquetamiento es tan grande que se deberían aplicar presiones demasiado grandes para fines prácticos. g) Detectores Los detectores más usados son: el espectrofotómetro, el refractómetro diferencia] y el fluorómetro. De los tres, el primero es el más ampliamente difundido por ser muy sensible y estable. Puede ser de longitud de onda fija (en general a 254 nm) o variable, 190 a 800 m. las celdas (de flujo) son pequeñas, 5 a 10 µl de capacidad. El refractómetro diferencial mide diferencias entre los índices de refracción del solvente puro y de la solución de la sustancia en ese solvente a la salida de la solución de la sustancia en ese solvente a la salida de la columna. Es menos sensible que el primero y requiere condiciones de flujo, composición de la fase móvil y especialmente temperaturas constantes para obtener una línea de base satisfactoria. Pero permite detectar sustancias que no tienen buena absorción en U.V. El fluórometro es el más sensible de todos, y se usa para compuestos que tengan fluorescencia propia o a los que se acopló una sustancia fluorescente. Ninguno de los 3 es destructivo. h) Amplificador y Registrador La señal recibida del detector es aumentada y graficada en función del tiempo. Como en cromatografía gaseosa, el área debajo de cada pico es proporcional a la cantidad de sustancia que lo originó. i) Colector La colección de fracciones se realiza con mucha mayor facilidad que en cromatografía gaseosa ya que ninguno de los detectores usados es destructivo y la muestra se encuentra en solución y a temperatura ambiente a la salida del detector. PARÁMETROS Flujo: HETP: equivalent theoretical plate



O AEPT: equivalente a un plato teórico

Como se ve en el gráfico existe un óptimo de velocidad de flujo para una máxima eficacia de separación. A velocidades altas, no hay gran disminución de eficacia al aumentar el flujo, por lo tanto se prefiere trabajar a flujos altos pues se gana en rapidez en la corrida. El límite esta dado por la contrapresión que se desarrolla. Velocidades de flujo normales son entre 0,5 y 2 ml./min.

FASE MÓVIL: Dependiendo de si sustancias a separar tienen comportamiento similar o muy diferente se utiliza una elución isocrática o en gradiente, respectivamente. Existen tablas de fuerza disolvente ( o ) de distintos solventes.

FASE ESTACIONARIA:Primeramente se usaban fases estacionarias absorbidas al

soporte pero estas eran lavadas a lo largo de las corridas obteniéndose resultados no reproducibles. Actualmente se utilizan fases estacionarias unidas



covalentemente a la matriz de sílice de la columna generalemnte corno capas monomoleculares.

TEMPERATURA: Se trabaja normalmente a temperatura ambiente. Sin

embargo, especialmente al trabajar con solventes viscosos, la viscosidad disminuye con la temperatura y por lo tanto aumenta la eficacia. En muchas ocasiones se trabaja con una columna termostatizada o por ej. 30 °C pues así se obtienen resultados más reproducibles que cromatografiando siempre a temperaturas diferentes. También se puede trabajar a temperaturas bajas (4ºC-5°C) en el caso de separar compuestos inestables con actividad biológica, como en la purificación de enzimas.

ANÁLISIS DE DATOS En la Figura vemos un típico cromatograma de HPLC (high performance liquid chomatography) o CLAR (cromatografía líquida de alta resolución)

Podemos determinar: T0 o tm= tiempo de retención de la fase móvil. tR(a)= tiempo de retención de la sustancia A. tR(b)= tiempo de retención de la sustancia B.



t'R(a)= tiempo de retención relativo de la sustancia A (con respecto a una sustancia no retenida).

t'R(b)= tiempo de retención relativo de la sustancia B (con respecto a una sustancia no retenida).

W(a)= ancho del pico en la base de la sustancia A. W(b)= ancho del pico en la base de la sustancia B. ANÁLISIS CUALITATIVO Se mide t'R de la sustancia comparándolo con el de patrones. ANÁLISIS CUANTITATIVO La concentración relativa de la sustancia es proporcional al área debajo del pico. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA Aunque son varios los efectos que influyen en una determinada separación, generalmente existe un mecanismo preponderante: ADSORCIÓN: Se utiliza sílice o alúmina. Pueden estar activadas o

desactivadas (con proporciones determinadas de agua). Se usa generalmente para separar mezclas solubles en solventes orgánicos.

PARTICIÓN: Puede ser de fase "normal", en la que la fase móvil es

menos polar que la estacionaria y de fase "reversa" o "invertida" cuando la fase móvil es más polar. En fase reversa la fase estacionaria está formada por sustituyentes alquilo de 2 a 18 carbonos. En fase reversa se pueden cromatografiar también sustancias cargadas, por el método de "pares iónicos” en el que se agrega un contraión a la fase móvil que neutraliza la carga de la muestra permitiendo su partición con la fase estacionaria.

INTERCAMBIO

IÓNICO:Puede ser catiónica en la que se utilizan como fase estacionaria sustituyentes alquilo ligados covalentemente a la sílice y con un grupo -SO3=2. La aniónica utiliza en general sustituyentes alquilo con amonios cuaternarios -NR3+. La elución se realiza normalmente con un gradiente de molaridad creciente de un buffer salino.

EXCLUSIÓN: Pueden utilizarse columnas con polímeros orgánicos por ej.

Divinilbenceno, para muestras solubles en solventes orgánicos o DVB sulfonado para solventes acuosos o partículas de sílice de poro controlado (100 Å a 500 Å). La elución es por peso molecular eluyendo primero los compuestos con mayor PM.

VENTAJAS DE LA HPLC



a) Velocidad Son usuales, tiempos de análisis de 10 min. a 1 hora. b) Alta resolución Mayor aún que en cromatografía gaseosa. c) Sensibilidad Con el detector más usado (U.V.) el orden es 10-9 g. d) Resultados cuantitativos e) Columnas reutilizables En contraste con cromatografía líquida clásica, tienen una velocidad de degradación muy lenta y por lo tanto se pueden utilizar por largos períodos sin problemas. f) Versatilidad Se pueden cromatografiar especies no polares, muy polares, iónicas o de alto peso molecular eligiendo adecuadamente el relleno de la columna. Las sustancias pueden ser volátiles o no. Por estas ventajas la HPLC, está reemplazando actualmente a todos los demás métodos cromatográficos.

BIBLIOGRAFIA

• Bobbitt, J.M.: "Thin-layer Cromatography", Reinhold Publ. Corp.,

N.Y.1963. • Lederer, E y Lederer, M.: "Cromatografía", Ed.Lib. E1 ateneo,

1960, Bs.As. • Savidan P.L.: "La Cromatografía", Eudeba, Bs.As. • Heftmann, E.: "Chromatography", Reinhold Publ. Corp., N.Y. 1961. • Nachod, F.C. y Schubert (Ed). "A Manual of Physical Methods in

Organic Chemistry". Butterwesth, London, 1966. • Pusey, B.F.G.: "Thin-layer Chromatography and the Organic Chemist"

Chemistry in Britain, 5, 408 (1969). • Strain, H.H. y Sherma, J.: "Modifications of solution

Chromatography illustrated with Ch1oroplast Pigments'' J. Chem. Ed. 46 (9). 606, (1969).

• Gaucher, G.M.: "An Introduction to Cromatogrphy", J. Chem. Ed. 46

(11), 220 (1969). • Davis, M.J. Chem. Ed. 45 (3) 192 (1968). • Jordan., D.J. Chem. Ed. 45(8) 510 (1968).



• Peifer, J.J. Mikocem. Acta, 529 (1962). • Feigl, F. ''Spot Tests in Organic Analysis", Elsevier Publ. Co.,

Amsterdam, 1960. • Block, R.J. Durrum, B.L. y Zweig., G.: "A Manual of Paper

Chromatography and Paper Electrophoresis" Academic Press, Inc. N.Y. 1958.

• Storch, J.M.:"Fundamentos de cromatografía de gases" Ed. Alhambra (1968 • Dabrio, I. M. V.: "Cromatografía de gases", Ed. Alhambra (1971 y

1973). y bibliografía citada en el último texto. • Galagovsky Kurman, L.:”Química Orgánica” Fundamentos teóricos-

prácticos para el laboratorio, Ed. EUDEBA. • Dominguez Xorge A.: “Cromatografía en papel y en capa delgada”,

monografía N°16 OEA. • McNair H., Benjamín Esquivel H.: “Cromatografía líquida de alta

presión”, monografía N°10 OEA. • McNair H.: “Cromatografía de gases”, monografía N°23 OEA.

trabajo prÁctico n°1 cromatografÍa - …quimica.aeok.org/archivos/material/cromato3.pdf ·...

Documents