TRABAJO PRACTICO Nº 3

ENZIMOINMUNOANALISIS

“ELISA”

Docentes encargados:Bioq. Natalia GuiñazúBioq. Maria Sol RennaBiol. Virginia AndreaniBioq. Mauricio FigueredoBioq. Vanina GarridoBioq. Laura Dulgerian

Interacción Antígeno-Anticuerpo

Naturaleza de la interacciónNo covalente

Reversible

Específica

Podemos diferenciar 3 etapasPrimaria

Secundaria

Terciaria

Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac

No visible

Rápida

Poco influenciada por Tº, electrolitos

Etapas de la interacción Ag-Ac

Ac

T. cruzi

Secundaria:Interacción de los complejos Ag-Ac

Visibles

Influenciados por Tº, electrolitos,viscosidad

Terciaria: Sólo ocurren in vivo

Fenómenos biológicos (Reacción de Arthus, efectos vasógenos)

AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN

Trabajos prácticos Nº 1-2

Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac

No visible

Rápida

Poco influenciada por Tº, electrolitos

Etapas de la interacción Ag-Ac

Ac

T. cruziELISA

Trabajo práctico Nº 3

Inmunofluorescencia

Trabajo Práctico Nº4

Objetivo Trabajo Práctico Nº3

Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola

Determinar la concentración de IgG purificada

Determinar la composición de la IgG purificada por Western blot. Detección de cadena pesada γy µ.

¿Qué estrategias permiten detectar la reacción primaria Ag-Ac in vitro?

Como en el medio reaccionan antígenos y anticuerpos entonces puedo detectar la reacción marcando el antígeno o

el anticuerpo?????

Yuhu!!!!!!!!

El Ag o el Ac se marcan covalentementecon distintas sustancias

Radioactivas Radioinmunoanálisis

Enzimas Enzimoinmunoanálisis

Fluorocromos Inmunofluorescencia

Medición de radioactividad

Medición de color

Medición de fluorescencia

ELISA

Fundamento: Un anticuerpo conjugado con una enzima reacciona con un sustra-to sin color produciendo un producto coloreado

Permite la detección de Ag o Ac

Cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo

Sensible y específico

Diferentes ELISA

Detección de anticuerpos específicos:

ELISA indirectoELISA doble sandwich

Detección de antígenos:

ELISA directo competitivoELISA sandwich

IgG especifica para el virus Rubeola

IgG totalcitoquinas

ELISA

Tres etapas comunes:

Sensibilización de la placa de ELISA

Incubación con la muestra problema

Revelado de la reacción Ag-Ac, mediante reacciones enzimáticas

Objetivo Trabajo Práctico Nº3

Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola

ELISA indirectoELISA indirecto

Determinar la concentración de IgG purificada

ELISA ELISA sandwichsandwich

ELISA indirectoELISA indirectoCómo determinamos la presencia de Acs

específicos?

Antígeno: Bordetella pertussis:

Homogeneizado del microorganismoProteínas purificadasProteínas recombinantes

1º paso inmovilización del antígeno a la fase sólida

Fase sólida:

Placas de ELISA (poliestireno o cloruro de polivinilo-PVC)

Alta capacidad de uniónBaja desorciónAlta transparencia

Tipos de unión:Covalente, tratamiento previo de la placa

No covalente interacción carga del antígeno

LAVADOS

Siempre entre paso y paso, debemos lavar la placa de ELISA para eliminar las moléculas que no interaccionan lo suficientemente fuerte.

Soluciones salinas tamponadas, como PBS mas detergente como Tween 20, se utilizan para lavar.

2º paso bloquear los sitios libres de unión

En la placa pueden quedar sitios libres que son ocupados por las proteínas presentes en la solución de bloqueo.

Solución de bloqueo, bufffer salino con proteínas que no reaccionan o interfieren en el sistema Ag-Ac.

Proteínas: Leche en polvoAlbúmina

3º paso incubación con la muestra problema y controles

Se diluyen las muestras en el líquido de bloqueo y se permite la interacción por un tiempo determinado.

OCURRE LA INTERACCIÓN PRIMARIA Ag-Ac

4º paso incubación con el conjugado enzimático

Ha ocurrido la interacción específica Ag-Ac que queremos detectar, pero no es visible.

Agrego un anticuerpo marcado con una enzima para detectar al anticuerpo (muestra problema) que está reaccionando.

5º paso revelado de la reacción

Revelamos la presencia de la reacción Ag-Ac mediante el empleo del sustrato de la enzima y un cromógeno que permita visualizar la reacción.

Esquema

Paso 1, sensibilización y lavado

Antígenos de Bordetella

Paso 2, bloqueoLavado

Paso 3, incubación con la muestra

IgG purificada por columna de afinidad

Alguno de estos anticuerpos reconoce específicamente a la Bordetella?

Paso 3 incubación con la muestra y lavado

Paso 4, incubación con el conjugado y lavado

Conjugado anticuerpos anti-IgGmarcados con una enzima

Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato

Determino la reacción por la medición de la densidad óptica

ELISA cuantitativos

ELISA sandwichELISA competitivo

¿Cómo logramos medir concentración?

Utilizando testigos de concentración conocida

En el práctico como determinamos la concentración de IgG......el testigo es una muestra con IgG de concentración conocida

.......si quisiera determinar concentración de TNFα ¿podría usar el mismo testigo que para IgG?

Práctico Nº3 Objetivo: “Medición de la concentración de

IgG purificada”

ELISA Sandwich

1º Sensibilización de la placa con anticuerpo anti-IgG y lavado

2º Bloqueo y lavado3º Incubación con la muestra problema y lavado4º Incubación con anti-IgG marcada con una enzima y

lavado5º Revelado

Esquema

Paso 1, sensibilización y lavado

Anticuerpos específicos anti-IgG

Paso 2, bloqueoLavado

Paso 3, incubación con la muestra

IgG purificada por columna de afinidad

Que concentración de IgG obtuve??

Paso 3 incubación con la muestra y lavado

Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato

Determino la reacción por la medición de la densidad óptica

Paso 4, incubación con el conjugado y lavado

Conjugado anticuerpos anti-IgGmarcados con una enzima

¿Que controles se incluyen en el ELISA?

Controles NEGATIVOS de matriz similar a la matriz muestra problema que no reaccionan en el sistema

Controles POSITIVOS que contienen Ag o Ac a detectar

Blancos de reacción

SIEMPRE DA REACCIÓN SIEMPRE DA REACCIÓN NEGATIVANEGATIVA

SIEMPRE DA REACCIÓN SIEMPRE DA REACCIÓN POSITIVAPOSITIVA

Curva del testigo o standard

Solución de concentración conocida de IgG

Se realizan diluciones seriadas de conc. conocida

Se obtiene una curva de calibración dosis respuesta

Densidad Optica

Concentración de IgG

Por extrapolación de la DO obtenida en el problema se determina la concentración

DO MPDO MP

500 mg %

Cuales son las características de un testigo?

De concentración conocida

Estable en el tiempo

Reaccione específicamente en el sistema

Matriz similar a la muestra problema

Sistemas de detección más utilizadosEnzimas

PeroxidasaFosfatasa alcalina

Sitemas avidina-biotina/estreptavidina-peroxidasa

AglutinaciónAglutinación Precipitación Precipitación ELISAELISA RIARIA

Límite de Límite de detección (detección (ugug//mlml)) 0,3 10-50 0,01-0,0001 0,006-0,0006

CostoCosto + + +++ +++++

Complejidad del Complejidad del laboratoriolaboratorio - - ++ +++++

Descrita porDescrita por 1950Coombs

(hemagluti-nacion)

1897 R.Kraus1946 Oudin1947 Oucht.1965 Mancini

1960S.A. Berson

R. Yalow(Premio Nobel)

Para pensar en casa

¿Qué ocurre si no bloqueamos la placa de ELISA?

¿Cómo serian las densidades ópticas si no lavamos antes

de revelar la reacción?

¿Que podemos medir con un ELISA sandwich....Ag o Ac?

¿Cómo seria un ELISA para determinar concentración de

la hormona TSH?