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Efecto del inhibidor selectivo de COX-2celecoxib sobre el crecimiento del tejidoendometrial eutópico en endometriosis.Bases experimentales que sustentan labúsqueda de nuevas alternativas terapéuticas para la endometriosis

Resumen

La búsqueda de nuevas alternativasterapéuticas para tratar la endometriosises constante. Basándonos en trabajos pre-vios que advierten sobre los efectos anti-angiogénicos, anti-proliferativos y pro-apoptóticos de celecoxib en célulastumorales, propusimos estudiar su efectosobre el crecimiento endometrial in-vitro. Partiendo de biopsias de endome-trio eutópico de 14 pacientes con endo-metriosis y 10 controles se realizaroncultivos de células epiteliales endome-triales (CEE) y luego de 48 hs, se agrega-ron distintas dosis de celecoxib. Se eva-luó apoptosis por el método de naranjade acridina - bromuro de etidio y el por-centaje de proliferación celular con res-pecto al basal por incorporación de 3H-timidina. Se evaluaron los niveles delfactor de crecimiento de endotelio vascu-lar (VEGF) en los sobrenadantes de CEE

por ELISA y la expresión de COX-2 porwestern blot e inmunocitoquímica. Elcelecoxib a dosis de 10, 20, 25 y 40 ÌM noprodujo efecto significativo sobre el por-centaje de proliferación celular ni sobrela apoptosis en CEE de pacientes conendometriosis y controles. Concentraciones más elevadas de celeco-xib inhibieron el porcentaje de prolifera-ción celular en CEE provenientes de con-troles: 58±5, 43±11, 36±8 y de pacientes:55±4, 37±4, 34±3 (para 50, 75 y 100 ÌM,p< 0.05, p<0.01, p<0.001 respect. vsbasal). Asimismo celecoxib 50, 75 y 100ÌM incrementó la apoptosis tanto en CEEde controles: 2.5±0.4, 2.7±0.3, 3.1±0.5como de pacientes con endometriosis:2.8±0.4, 3.3±0.6, 3.1±0.8 (expresadocomo veces de aumento p<0.05, p<0.001,p<0.01 respect. vs basal). Nuestros resul-tados preliminares muestran una induc-ción de la expresión de COX-2 por parte

Autores: Gabriela Meresman1, Carla Olivares1, Mariela Bilotas1, Ricardo Buquet2, Carlos Sueldo3,Marta Tesone1 .

1 Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET), Buenos Aires, Argentina.2 Serv. de Ginecología, Hospital de Clínicas, Buenos Aires, Argentina.3 Centro de Ginecología y Reproducción, CEGYR, Buenos Aires, Argentina.

Trabajo Original

de celecoxib que podría explicarse comouna inhibición del proceso de retroali-mentación negativo que regula la expre-sión de la enzima. Asimismo celecoxibindujo una disminución de la produc-ción de VEGF por parte de CEE, hechoque se relacionaría con la inhibición dela angiogénesis. Estos datos sugieren quecelecoxib favorecería la regresión de lalesión endometriósica inhibiendo la pro-liferación celular, induciendo la apopto-sis y disminuyendo la angiogénesis yavalan a esta droga para continuar siendoevaluada como alternativa terapéuticapara la endometriosis.

Introducción

La endometriosis se define como lapresencia de focos de tejido endometrialfuera de la cavidad uterina. Es la enfer-medad ginecológica benigna más fre-cuente, afectando a un 2-22 % de lasmujeres en edad reproductiva. Por otrolado, un 40-60% de las pacientes que sesometen a laparoscopias por dolor pélvi-co- presentan esta patología (1).

La endometriosis ha sido identificadacomo una patología dependiente deestrógenos (2). En ese sentido, uno de losúltimos hallazgos más relevantes ha sidola detección de aromatasa P450, enzimaresponsable de la conversión de testoste-rona a estradiol, en tejido endometrialeutópico y ectópico de pacientes conendometriosis y la ausencia de expresiónen el endometrio de mujeres sanas (3;4).Se ha propuesto además, que la produc-ción de estradiol en el tejido endometrió-sico estaría induciendo un proceso deretro-alimentación positivo hacia lainducción de transcripción de ciclo-oxi-genasa 2 (COX-2), síntesis de prostaglan-dina E2 (PGE2) y expresión de aromatasaP450 (5-8). Este proceso favorecería laacumulación de estrógenos y potenciaríala inflamación (ver esquema 1).

La síntesis de prostaglandinas es con-trolada por dos enzimas ciclooxigenasa(COX): COX-1 y COX-2. Mientras queCOX-1 se expresa en forma constitutiva en

células humanas, COX-2 es una enzimainducible que se sobre-expresa en condi-ciones patológicas tales como cáncer oprocesos inflamatorios (9).Coincidentemente, se ha hallado sobre-expresión de COX-2 (10) y aromatasa P450(6) en tejido endometriósico y niveles ele-vados de PGE2, entre otras moléculas pro-inflamatorias, en el líquido peritoneal depacientes con endometriosis (11).

El factor de crecimiento de endoteliovascular (VEGF) es una familia de prote-ínas que están implicadas tanto en laangiogénesis fisiológica como así tam-bién en varias condiciones patológicasque se caracterizan por una excesiva vas-cularización (12-14). Recientementetanto nosotros como otros autores hemospublicado evidencias que sugieren que elVEGF podría estar involucrado en la etio-logía y mantenimiento de la endometrio-sis actuando como factor angiogénico einhibitorio de la apoptosis (15;16). ElVEGF es producido por células endome-triósicas y macrófagos peritoneales ysería uno de los factores decisivos en elorigen y desarrollo de esta patología.Además se ha demostrado que una seriede citoquinas, cuyos niveles se hallanaumentados en el líquido peritoneal depacientes con endometriosis, especial-mente la IL-1, incrementan la produc-ción de VEGF en las células endometrió-sicas y en otros tejidos (17;18). Se haobservado además que el VEGF participadel crecimiento endometriósico no sólo através de la inducción de la angiogénesissino también, estimulando la expresiónde COX-2 (19). Siendo así la inhibiciónde la actividad de aromatasa y/o de COX-2 constituye una estrategia novedosa yatrayente para intentar desarrollar nue-vas alternativas terapéuticas para el con-trol de la endometriosis (Esquema 1).

En los últimos años, el estudio delendometrio eutópico de las pacientes conendometriosis ha cobrado real importan-cia. Diferentes autores han detectado anor-malidades en el tejido endometrial eutópi-co de las pacientes (20-22). En ese sentido,nuestros datos han demostrado que las

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pacientes con endometriosis poseen unaactividad proliferativa aumentada e índi-ces de apoptosis disminuidos en el tejidoendometrial eutópico, hechos que favore-cerían su crecimiento y supervivencia enun sitio ectópico (23-25).

Por otro lado, es sabido que la terapéu-tica que se les propone actualmente a laspacientes con endometriosis no es del todoefectiva ya que la infertilidad asociada a lapatología no siempre es revertida y ade-más, son habituales los casos de recidivasluego de la medicación supresora o de laterapia quirúrgica (26). Dada esta situación,la búsqueda de nuevas estrategias terapéu-ticas más eficientes, y que acarreen menosefectos colaterales, es constante.

Los inhibidores de aromatasa anastra-zole y letrozole son utilizados con éxitoen la terapéutica del cáncer de mama(27). Además del efecto supresor de lasíntesis de estrógenos, se conocen efectosinductores de la apoptosis y antiprolife-rativos directos de estos compuestossobre algunos tipos celulares (28). En unestudio reciente hemos observado quetanto anastrozole como letrozole dismi-

nuyen la proliferación celular e incre-mentan la apoptosis en las células epite-liales endometriales de pacientes conendometriosis (29).

Los anti-inflamatorios no estroideos(AINEs) como la Aspirina® o elIbuprofeno® inhiben la actividad de COX.Celecoxib pertenece a una nueva genera-ción de AINEs que inhiben selectivamenteCOX-2 sin inhibir COX-1. Asimismo, estecompuesto está siendo últimamente eva-luado por sus efectos inhibitorios de laprogresión tumoral. Específicamente, hansido descriptos efectos anti-angiogénicos,anti-proliferativos y pro-apoptóticos tantoin-vitro, in-vivo, como en ensayos clínicosactualmente en curso (30-32). Más aún, enestudios recientes se ha demostrado quecelecoxib inhibe el crecimiento tumoralinduciendo la apoptosis de manera inde-pendiente de su capacidad para bloquearla COX-2 (31;33). Se ha propuesto ademásque celecoxib actuaría en forma sinérgicacon inhibidores de aromatasa en el trata-miento del cáncer de mama, efecto quetambién se está evaluando a través de unestudio clínico actualmente en curso (27).

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Trabajo Original

Esquema 1:

Proceso de retroalimentación positivo inductor del crecimiento celular, vascularización e inflamación en la lesión endometriósica

Las nuevas estrategias propuestas para el tratamiento de la endometriosis apuntan a la inhibición de la enzima aromatasa P450 y/o de COX-2.

VEGF: factor de crecimiento de endotelio vascular, AA: ácido araquidónico, PGE2: prostaglandina E2, COX-2: ciclo-oxigenasa 2, E1: estrona, E2:

estradiol

A pesar de que celecoxib es utilizadocomo potente anti-inflamatorio en algunaspacientes con endometriosis, ningún estu-dio ha evaluado hasta el momento su efec-to sobre el crecimiento y la apoptosis deltejido endometrial eutópico o ectópico.Por todo lo expuesto, consideramos desuma importancia evaluar los efectos deeste fármaco en un modelo de cultivo decélulas epiteliales endometriales depacientes con endometriosis y controles,sobre la apoptosis, proliferación celular,expresión de COX-2 y niveles de VEGF.Este trabajo tiene como finalidad el estu-dio experimental de nuevas alternativasterapéuticas que están últimamente siendopropuestas para tratar la endometriosis.

Materiales y Métodos

Pacientes

Se evaluaron un total de 24 mujeres enedad reproductiva con ciclos ovulatoriosregulares que no recibieron ningún tipo detratamiento médico para la endometriosisen los 12 meses previos al estudio.

Catorce pacientes fueron diagnostica-das laparoscópicamente con endometrio-sis I y II y confirmadas histológicamente.La clasificación de la endometriosis se rea-lizó siguiendo la clasificación revisadapropuesta por la Sociedad Americana deMedicina Reproductiva (34). El grupo con-trol consistió en 10 mujeres que se some-tieron a laparoscopias diagnósticas pordolor abdominal, obstrucción de trompaso esterilidad sin causa aparente y que nopadecían endometriosis u otra patologíade origen infeccioso o tumoral que pudie-ra alterar la población celular a evaluar.

A todas las mujeres se les tomó biop-sias de endometrio con cureta de Novak(Bioteque America Inc. Longhorne PA)durante la fase proliferativa de acuerdo alo descrito anteriormente (25).

Las muestras se depositaron en condi-ciones de esterilidad, en medio de culti-vo DMEM-F12 (Gibco, Paisley GranBretaña) con 100 UI/ml de penicilina,100 μg/ml de estreptomicina y 25 μg/ml

de anfotericina B (Gibco) y se trasladaroninmediatamente al laboratorio donde serealizó el estudio experimental de culti-vo celular in-vitro.

Este trabajo fue aprobado por elComité de Ética e Investigación delInstituto de Biología y MedicinaExperimental (IBYME) y todas laspacientes que participaron firmaron unconsentimiento informado.

Aislamiento y Cultivo de CélulasEpiteliales de endometrio humano

Se siguió la técnica descrita anterior-mente (25). Brevemente, luego de la dis-gregación se colocó la muestra en mediode cultivo con 1 mg/ml de colagenasa(Gibco, tipo I) y se incubó durante doshoras en estufa gaseada a 37ºC y 5% CO2.Transcurrida la colagenización se centrifu-gó la suspensión de células 5 minutos a100xg, se descartó el sobrenadante, seresuspendió el sedimento con medio decultivo y se centrifugó por otros 5 minutosa 100xg. Para asegurarnos de la pureza delsedimento, se sembró en placas de cultivoplásticas durante 30 minutos para hacerun pegado selectivo de fibroblastos conta-minantes. El grado de pureza fue evaluadopor la presencia de citoqueratina, proteínatípica de la fracción epitelial, por técnicasde inmunocitoquímica (25).

Evaluación de la proliferación celular

Luego de purificar las células epitelia-les endometriales, se sembraron 50.000cél/pocillo en placas plásticas de 96pocillos y se incubaron con medio decultivo con 10% SBF. Luego de 48 horas,las células se lavaron y se agregó el cele-coxib en dosis de 10, 20, 25, 40, 50, 75 y100 μM al medio de cultivo suplementa-do con 2.5% SBF. Las células fueronincubadas por otras 48 horas.

Veinticuatro horas antes de la cosechase agregó 1μCi de 3H-timidina (Nen,Dupont, Boston, MA) a cada pocillo y seevaluó la síntesis de ADN mediante elmétodo de incorporación de 3H-timidinautilizando un contador de centelleolíquido automático (35).

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Evaluación de la apoptosis

Luego de cultivar durante 48 horas lascélulas epiteliales en condiciones basales,se cambió el medio de cultivo a DMEM-F-12 con 2,5% de SBF y se agregó celecoxib(10, 20, 25, 40, 50, 75 y 100 μM). Luego de48 horas de incubación se evaluaron losniveles de apoptosis utilizando la técnicade naranja de acridina y bromuro de eti-dio. La naranja de acridina es un colorantevital que es excluido de las células viablesy específico para la muerte celular porapoptosis (36;37). Luego de agregar la mez-cla de naranja de acridina (1 mg/l) - bro-muro de etidio (250 mg/l), las células fue-ron observadas y contadas bajo microsco-pio de fluorescencia. Se contaron un totalde 300 células por pocillo y se expresaronlos datos en porcentaje de células que pre-sentaban núcleo teñido de anaranjado(apoptóticas tempranas + tardías) sobrenúmero total de células.

Evaluación de la expresión de COX-2

Se estudió la expresión de la enzimaCOX-2 por western blot e inmunocitoquí-mica en cultivos de células epitelialesendometriales provenientes de 14 pacien-tes con endometriosis. Para la realizaciónde la técnica de western blot nos basamosen metodologías anteriormente descritas(30). Luego de 24 horas de incubación seretiró el medio de cultivo y se levantaronlas células raspándolas con un rastrillo enbuffer lisis a 4ºC. Se extrajeron las proteí-nas y se cuantificaron usando el método deBradford (38). Se solubilizaron alícuotas delos extractos proteicos conteniendo 20 μgde proteínas en buffer loading. Las alícuo-tas se sometieron a una electroforesis enun gel 10% de poliacrilamida con SDS ylas bandas proteicas resultantes se trans-firieron a una membrana de nitrocelulo-sa. Las productos proteicos se visualiza-ron con un anticuerpo policlonal anti-COX-2 hecho en conejo (Santa Cruz, sc-1747) mediante procedimientos estándarde western bloting. Asimismo se evaluóla expresión de ‚- actina en cada calleincubando con el anticuerpo anti-‚ actina(mouse monoclonal anti-human ‚ actin,Abcam, Cambridge, UK). Se trató la

membrana con una solución de lechedescremada 5% para bloquear el pegadoinespecífico y se incubó con el primeranticuerpo a 4ºC durante toda la noche.Luego se incubó con el segundo anticuer-po anti-IgG de conejo o de ratón conjuga-do a peroxidasa. La visualización de lasbandas se realizó por quimioluminiscen-cia utilizando el kit Western LightningChemiluminescense Reagent Plus(Perkin Elmer Life Sciences, Inc) y lacuantificación se realizó por análisisdensitométrico de las bandas normaliza-das con la expresión de ‚-actina corres-pondiente a cada calle.

Asimismo se realizó la técnica deinmunocitoquímica (10) sobre las mis-mas células tratadas con idénticos estí-mulos. Brevemente, se sembraron150.000 células epiteliales endometrialespor pocillo en lab-tek (Nalge NuncInternational, USA) y se cultivaron encondiciones basales durante 48 horas. Secambió el medio de cultivo a DMEM F-12 con 2,5% de SBF y se agregó celeco-xib (25, 40, 50, 75 y 100 μM). Luego de 24horas de incubación se retiró el medio decultivo, se lavó con PBS y se dejó secaren estufa a 37ºC durante 2 horas. Ladetección de las proteínas se realizó uti-lizando el mismo anticuerpo que para elwestern blot. Se fijaron las células con 4%de formaldehído y se permeabilizaron con0,2% Triton X-100. Se inactivó la peroxi-dasa endógena con 3% de H2O2 y se eli-minó el pegado inespecífico bloqueandocon 2% de sero-albúmina bovina (BSA). Acontinuación se incubó con el primer anti-cuerpo 1 hora a temperatura ambiente y sereveló mediante el cromógeno 3,3-diami-nobenzidina tetraclorhidrato (DAB) utili-zando el kit LSAB+ (Dako Ltd.).Finalmente se realizó una tinción de con-traste con hematoxilina. Los controlesnegativos se obtuvieron sometiendo culti-vos a tratamiento inmunocitoquímicoidéntico a las muestras a evaluar pero sinel agregado del primer anticuerpo, asimis-mo se realizaron controles de isotipo. Eneste caso, se evaluó la expresión de la pro-teína en forma cualitativa.

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Trabajo Original

*p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs. basal (sin celecoxib)

*p<0.05, ** p<0.01 vs. basal (sin celecoxib)

Evaluación de los niveles de VEGF

Se evaluaron los niveles de VEGF en lossobrenadantes de los cultivos de célulasepiteliales endometriales de pacientes conendometriosis tratados con celecoxibmediante la técnica de ELISA siguiendoprocedimientos anteriormente descritos(39) y utilizando un kit comercial (Cytelisa,Human VEGF kit, EL-V, Cytimmune).

Cálculos estadísticos

El análisis estadístico de los resultadosse realizó mediante el test de múltiplecomparación de Dunn. Los resultados seexpresaron como media * SEM. Se consi-deró estadísticamente significativo sola-mente aquellos valores cuyo p * 0.05. Lavarianza se analizó mediante el método de

ANOVA. En todos los casos se utilizaronprocedimientos de doble ciego.

Resultados

Efecto del inhibidor selectivo de COX-2 celecoxib sobre la proliferación celularde células epiteliales endometriales depacientes con endometriosis y controles

En la Figura 1 y en la Figura 2 se pue-den observar los efectos de diferentesconcentraciones de celecoxib sobre laproliferación celular epitelial endome-trial. Hemos observado que el celecoxib aconcentraciones bajas no posee efectosobre la síntesis de ADN basal. Por otrolado, concentraciones de 50, 75 y 100 μMde celecoxib inhibieron significativamente

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la proliferación celular. Este patrón deinhibición de la proliferación celular seobservó tanto en cultivos de pacientes conendometriosis como en controles. Losdatos numéricos se expresan en la tabla I.

Efecto del inhibidor selectivo de COX-2celecoxib sobre la apoptosis de célulasepiteliales endometriales de pacientescon endometriosis y controles

En la Figura 3 y en la Figura 4 se pue-den observar los efectos de diferentes

concentraciones de celecoxib sobre laapoptosis en cultivos de células epitelia-les endometriales de mujeres controles yde pacientes con endometriosis. Hemosobservado que en ambos casos el celeco-xib 50, 75 y 100 μM incrementa significa-tivamente los niveles de apoptosis encultivos de pacientes con EDT y contro-les. Por otro lado el Celecoxib en concen-traciones 10, 20, 25 y 40 μM no produjoefecto sobre la apoptosis basal en los cul-tivos evaluados. Los datos numéricos seexpresan en la tabla I.

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*p<0.05, *** p<0.001 vs. basal (sin celecoxib)

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*p<0.001, ** p<0.05 vs. Basal (sin celecoxib

Efecto del inhibidor selectivo de COX-2celecoxib sobre la secreción de VEGFpor parte de las células epiteliales endo-metriales de pacientes con endometrio-sis y controles

En la Figura 5 se puede observar elefecto inhibitorio que produjo el celeco-xib en todas las concentraciones evalua-

das sobre la secreción de VEGF por partede las células epiteliales endometrialesde pacientes con endometriosis. El agre-gado de celecoxib 25, 50 y 100 μM indu-jo una inhibición de los niveles de VEGFcon respecto al basal: 54 ± 7, 75 ± 12 y 55± 9 % (p<0.001, 0.05 y 0.001 vs. basalrespectivamente).

Efecto del celecoxib sobre la expresiónde COX-2 en las células epiteliales endo-metriales de pacientes con endometrio-sis y controles

Nuestros estudios preliminares advier-ten sobre una tendencia hacia la inducciónde la expresión de COX-2 por parte de

celecoxib que sería dosis dependiente(Figura 6). Si bien nuestros resultados noposeen aún significancia estadística, losdatos muestran una tendencia hacia lainducción de la expresión de la proteínaque acuerda con datos similares reporta-dos en otros sistemas (30).

** p<0.01, *** p<0.001 vs. basal (sin celecoxib)

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Asimismo los estudios de inmunoci-toquímica demostraron la expresión deCOX-2 en los cultivos tratados con dis-tintas dosis de celecoxib. Hemos obser-

vado expresión de la enzima en el cito-plasma tanto de las células tratadas con25, 40, 50, 75 y 100 μM de celecoxibcomo en las basales.

A: Fotografía representativa de western blot para identificación de COX-2 y ß-actina en extractos proteicos extraídos de cultivos de células epi-

teliales endometriales de pacientes con endometriosis estimulados con celecoxib.

B: Análisis densitométrico de la expresión de COX-2 normalizada con ‚-actina en cultivos de células epiteliales endometriales de pacientes con

endometriosis estimulados con celecoxib.

C: Fotografías representativas de la evaluación de la expresión de COX-2 por la técnica de inmunocitoquímica en cultivos de células epiteliales endome-

triales de una paciente con endometriosis estimulado con celecoxib 50ÌM (panel de la izquierda) comparado al control negativo (panel de la derecha).

DiscusiónAvances en los conocimientos sobre la

fisiopatología de la endometriosis hanpermitido que los investigadores piensenen nuevos mecanismos para tratar estaenfermedad, no solamente con el propó-sito de ofrecer simples alternativas tera-péuticas, sino además medicamentos queactúen en forma más directa sobre losimplantes en sí, que inhiban los mecanis-mos involucrados en el desarrollo de laenfermedad, y que potencialmente seanmás eficaces en su acción de erradicar laslesiones endometriósicas (26;40).

Los cultivos de células epiteliales deendometrio eutópico fueron usadoscomo modelo para estudiar el impactodel inhibidor de ciclo-oxigenasa-2, cele-coxib, sobre la proliferación celular yapoptosis. Aunque las células utilizadasno eran directamente obtenidas de lesio-nes endometriósicas y su respuesta in-vitro puede no ser idéntica, el propósitode usar células endometriales en cultivosa corto plazo como modelo para las lesio-nes endometriósicas ha sido descrito pre-viamente en la literatura (41) y es acepta-do que este modelo permite establecer uncorrecto paralelismo con las lesionesendometriósicas.

En el presente estudio hemos observa-do que el celecoxib fue capaz de inhibirsignificativamente la proliferación celu-lar e inducir la apoptosis de las célulasendometriales tanto de pacientes comode controles. Dado que COX-2 se sobre-expresa en las lesiones endometriósicas,es posible especular que el efecto de cele-coxib resultaría eficiente en el control delcrecimiento endometriósico.

Si bien estos resultados son inéditosen endometriosis, nuestros datos acuer-dan con los reportados por otros autoresque utilizaron inhibidores de COX-2 ylograron inhibir el crecimiento tumoral.Los inhibidores específicos de COX-2han mostrado poseer la habilidad deinhibir el crecimiento celular e inducirapoptosis y arresto del ciclo celular endistintos modelos in-vivo y líneas celula-res tumorales (42-44). Asimismo en unmodelo de endometriosis en rata se

demostró que el inhibidor selectivo deCOX-2 previene el desarrollo de losimplantes ectópicos e inhibe el creci-miento del tejido endometriósico de laslesiones ya establecidas (32).

Los resultados obtenidos en nuestromodelo in-vitro acuerdan con los datosde Basu y col. y de Jendrossek y col.quienes observaron que celecoxib induceapoptosis en células humanas de cáncerde mama y en la línea celular Jurkat delinfocitos T (30;31).

Asimismo nuestros resultados prelimi-nares muestran una tendencia hacia lainducción de la expresión de COX-2 porparte de celecoxib. En este momento nosencontramos terminando algunos experi-mentos de western blot para optimizar elanálisis estadístico. No obstante, el fenó-meno que estamos hallando se ha observa-do también en líneas celulares de cáncerde mama donde el celecoxib a dosis de 60ÌM indujo la expresión de la proteínaCOX-2 (30). Este fenómeno se podríaexplicar por una inhibición del proceso deretro-alimentación negativo: la acumula-ción del producto de la enzima inhibe laexpresión de COX-2. Cuando se inactiva laenzima, dejaría de acumularse PGE2 y seinduciría la expresión de COX-2. Por otrolado, hay reportes en otros sistemas celula-res que indican que celecoxib inhibe elcrecimiento tumoral de manera indepen-diente de la expresión de COX-2 (33;44).

Asimismo los estudios de inmunocito-química demostraron la expresión deCOX-2 en los cultivos tratados con distin-tas dosis de celecoxib. Hemos observadoexpresión de la enzima en el citoplasmatanto de las células tratadas con celecoxibcomo en las basales. En evaluaciones pre-vias realizadas en cortes histológicos detejido endometrial de pacientes con endo-metriosis hemos hallado también expre-sión de COX-2, especialmente en las glán-dulas epiteliales (datos no mostrados).

En nuestro estudio hemos observadoque celecoxib indujo una disminuciónde la producción de VEGF por parte delas células epiteliales endometriales,hecho que se relacionaría con la inhibi-ción de la angiogénesis. La angiogénesis

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es un proceso fundamental implicado enla vascularización y por lo tanto en eldesarrollo de la lesión endometriósica(16;45). Se han hallado altos niveles deVEGF, principalmente producido por lascélulas endometriósicas y por los macró-fagos peritoneales, en el fluido peritone-al de pacientes con endometriosis (46).Se ha propuesto al VEGF como unos delos factores responsables del estableci-miento de la lesión y de la angiogénesispatológica en endometriosis. Siendo así,la importancia de hallar una droga queademás de inhibir el crecimiento endo-metrial reduzca los niveles de este factorangiogénico es primordial.

En trabajos previos ha sido reportadoque el celecoxib inhibe la angiogénesis einduce la apoptosis de células endotelia-les tanto in-vivo como in-vitro (19;47).Acordando con nuestros resultados se haobservado también que este compuestodisminuye los niveles de VEGF en distin-tos sistemas celulares (19;30;48).

Si bien celecoxib fue aprobado parael tratamiento de osteoartritis y comoterapia complementaria para el trata-miento del cáncer colorectal (19) no hasido probado aún para el tratamiento deendometriosis, a pesar de que algunosinvestigadores están empezando a pen-sar en esta opción como posible tera-péutica futura (26;49).

Nuestros datos sugieren que celeco-xib favorecería la regresión de la lesiónendometriósica, inhibiendo la prolifera-ción celular, induciendo la apoptosis ydisminuyendo la angiogénesis y avalana esta droga para continuar siendo eva-luada como alternativa terapéutica parala endometriosis.

Bibliografía

1. Murphy AA. Clinical aspects of endo-metriosis. Ann N Y Acad Sci 2002;955:1-10.2. Kitawaki J, Kado N, Ishihara H, KoshibaH, Kitaoka Y, Honjo H. Endometriosis: thepathophysiology as an estrogen-depen-dent disease. J Steroid Biochem Mol Biol2002; 83(1-5):149-155.

3. Kitawaki J, Noguchi T, Amatsu T et al.Expression of aromatase cytochrome P450protein and messenger ribonucleic acid inhuman endometriotic and adenomyotictissues but not in normal endometrium.Biol Reprod 1997; 57(3):514-519.4. Bulun SE, Fang Z, Imir G et al.Aromatase and endometriosis. SeminReprod Med 2004; 22(1):45-50.5. Bulun SE, Gurates B, Fang Z et al.Mechanisms of excessive estrogen forma-tion in endometriosis. J Reprod Immunol2002; 55(1-2):21-33.6. Bulun SE, Imir G, Utsunomiya H et al.Aromatase in endometriosis and uterineleiomyomata. J Steroid Biochem MolBiol 2005; 95(1-5):57-62.7. Attar E, Bulun SE. Aromatase andother steroidogenic genes in endometrio-sis: translational aspects. Hum ReprodUpdate 2006; 12(1):49-56.8. Jabbour HN, Sales KJ, Smith OP,Battersby S, Boddy SC. Prostaglandinreceptors are mediators of vascular func-tion in endometrial pathologies. Mol CellEndocrinol 2006; 252(1-2):191-200.9. Wu T, Leng J, Han C, Demetris AJ. Thecyclooxygenase-2 inhibitor celecoxibblocks phosphorylation of Akt and indu-ces apoptosis in human cholangiocarci-noma cells. Mol Cancer Ther 2004;3(3):299-307.10. Ota H, Igarashi S, Sasaki M, Tanaka T.Distribution of cyclooxygenase-2 in euto-pic and ectopic endometrium in endo-metriosis and adenomyosis. Hum Reprod2001; 16(3):561-566.11. Gazvani R, Templeton A. Peritonealenvironment, cytokines and angiogenesisin the pathophysiology of endometriosis.Reproduction 2002; 123(2):217-226.12. Liu W, Ahmad SA, Reinmuth N et al.Endothelial cell survival and apoptosisin the tumor vasculature. Apoptosis2000; 5(4):323-328.13. Collins TS, Hurwitz HI. Targeting vas-cular endothelial growth factor and angio-genesis for the treatment of colorectal can-cer. Semin Oncol 2005; 32(1):61-68.14. Sugino N, Kashida S, Karube-HaradaA, Takiguchi S, Kato H. Expression ofvascular endothelial growth factor

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(VEGF) and its receptors in human endo-metrium throughout the menstrual cycleand in early pregnancy. Reproduction2002; 123(3):379-387.15. Meresman GF, Bilotas MA, Lombardi E,Tesone M, Sueldo C, Baranao RI. Effect ofGnRH analogues on apoptosis and releaseof interleukin-1beta and vascular endothe-lial growth factor in endometrial cell cultu-res from patients with endometriosis. HumReprod 2003; 18(9):1767-1771.16. Groothuis PG, Nap AW, WinterhagerE, Grummer R. Vascular development inendometriosis. Angiogenesis 2005;8(2):147-156.17. Jung YD, Liu W, Reinmuth N et al.Vascular endothelial growth factor is upre-gulated by interleukin-1 beta in humanvascular smooth muscle cells via the P38mitogen-activated protein kinase pathway.Angiogenesis 2001; 4(2):155-162.18. Lebovic DI, Bentzien F, Chao VA,Garrett EN, Meng YG, Taylor RN.Induction of an angiogenic phenotype inendometriotic stromal cell cultures byinterleukin-1beta. Mol Hum Reprod2000; 6(3):269-275.19. Gately S, Li WW. Multiple roles ofCOX-2 in tumor angiogenesis: a target forantiangiogenic therapy. Semin Oncol2004; 31(2 Suppl 7):2-11.20. Johnson MC, Torres M, Alves A et al.Augmented cell survival in eutopicendometrium from women with endo-metriosis: expression of c-myc, TGF-beta1 and bax genes. Reprod BiolEndocrinol 2005; 3:45.21. Dmowski WP, Gebel H, Braun DP.Decreased apoptosis and sensitivity tomacrophage mediated cytolysis of endo-metrial cells in endometriosis. HumReprod Update 1998; 4(5):696-701.22. Sharpe-Timms KL. Endometrial ano-malies in women with endometriosis.Ann N Y Acad Sci 2001; 943:131-147.23. Meresman GF, Vighi S, Buquet RA,Contreras-Ortiz O, Tesone M, Rumi LS.Apoptosis and expression of Bcl-2 andBax in eutopic endometrium fromwomen with endometriosis. Fertil Steril2000; 74(4):760-766.

24. Meresman GF, Auge L, Baranao RI,Lombardi E, Tesone M, Sueldo C. Oralcontraceptives suppress cell prolifera-tion and enhance apoptosis of eutopicendometrial tissue from patients withendometriosis. Fertil Steril 2002;77(6):1141-1147.25. Meresman GF, Bilotas M, Buquet RA,Baranao RI, Sueldo C, Tesone M.Gonadotropin-releasing hormone agonistinduces apoptosis and reduces cell proli-feration in eutopic endometrial culturesfrom women with endometriosis. FertilSteril 2003; 80 Suppl 2:702-707.26. Ferrero S, Abbamonte LH, Anserini P,Remorgida V, Ragni N. Future perspectivesin the medical treatment of endometriosis.Obstet Gynecol Surv 2005; 60(12):817-826.27. Goss PE. Breast cancer prevention--clinical trials strategies involving aroma-tase inhibitors. J Steroid Biochem MolBiol 2003; 86(3-5):487-493.28. Thiantanawat A, Long BJ, Brodie AM.Signaling pathways of apoptosis activatedby aromatase inhibitors and antiestrogens.Cancer Res 2003; 63(22):8037-8050.29. Meresman GF, Bilotas M, Abello V,Buquet R, Tesone M, Sueldo C. Effects ofaromatase inhibitors on proliferation andapoptosis in eutopic endometrial cellcultures from patients with endometrio-sis. Fertil Steril 2005; 84(2):459-463.30. Basu GD, Pathangey LB, Tinder TL,Gendler SJ, Mukherjee P. Mechanismsunderlying the growth inhibitory effectsof the cyclo-oxygenase-2 inhibitor cele-coxib in human breast cancer cells.Breast Cancer Res 2005; 7(4):R422-R435.31. Jendrossek V, Handrick R, Belka C.Celecoxib activates a novel mitochon-drial apoptosis signaling pathway.FASEB J 2003; 17(11):1547-1549.32. Matsuzaki S, Canis M, Darcha C,Dallel R, Okamura K, Mage G.Cyclooxygenase-2 selective inhibitorprevents implantation of eutopic endo-metrium to ectopic sites in rats. FertilSteril 2004; 82(6):1609-1615.33. Lai GH, Zhang Z, Sirica AE.Celecoxib acts in a cyclooxygenase-2-independent manner and in synergy with

66

emodin to suppress rat cholangiocarcino-ma growth in vitro through a mechanisminvolving enhanced Akt inactivation andincreased activation of caspases-9 and -3.Mol Cancer Ther 2003; 2(3):265-271.34. ASRM. Revised American Society forReproductive Medicine classification ofendometriosis: 1996. Fertil Steril 1997;67(5):817-821.35. Meresman GF, Baranao RI, TenenbaumA, Singla JJ, Neuspiller NR, Rumi LS. Effectof peritoneal fluid from patients with mildand severe endometriosis on endometrialstromal cell proliferation. Arch GynecolObstet 1997; 259(3):109-115.36. Abrams JM, White K, Fessler LI,Steller H. Programmed cell death duringDrosophila embryogenesis. Development1993; 117(1):29-43.37. Ribble D, Goldstein NB, Norris DA,Shellman YG. A simple technique forquantifying apoptosis in 96-well plates.BMC Biotechnol 2005; 5:12.38. Bradford MM. A rapid and sensitivemethod for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding. AnalBiochem 1976; 72:248-254.39. Abbas MM, Evans JJ, Sykes PH,Benny PS. Modulation of vascular endot-helial growth factor and thymidinephosphorylase in normal human endo-metrial stromal cells. Fertil Steril 2004;82 Suppl 3:1048-1053.40. Crosignani P, Olive D, Bergqvist A,Luciano A. Advances in the managementof endometriosis: an update for clinicians.Hum Reprod Update 2006; 12(2):179-189.41. Fleming H. Structure and function ofcultured endometrial epithelial cells. SeminReprod Endocrinol 1999; 17(1):93-106.42. Kazanov D, Dvory-Sobol H, Pick M etal. Celecoxib but not rofecoxib inhibits

the growth of transformed cells in vitro.Clin Cancer Res 2004; 10(1 Pt 1):267-271.43. Connolly EM, Harmey JH, O'Grady Tet al. Cyclo-oxygenase inhibition reducestumour growth and metastasis in an ort-hotopic model of breast cancer. Br JCancer 2002; 87(2):231-237.44. Chun KS, Surh YJ. Signal transduc-tion pathways regulating cyclooxyge-nase-2 expression: potential moleculartargets for chemoprevention. BiochemPharmacol 2004; 68(6):1089-1100.45. Gazvani R, Templeton A.Peritoneal environment, cytokines andangiogenesis in the pathophysiology ofendometriosis. Reproduction 2002;123(2):217-226.46. McLaren J. Vascular endothelial growthfactor and endometriotic angiogenesis.Hum Reprod Update 2000; 6(1):45-55.47. Leahy KM, Ornberg RL, Wang Y,Zweifel BS, Koki AT, Masferrer JL.Cyclooxygenase-2 inhibition by celeco-xib reduces proliferation and inducesapoptosis in angiogenic endothelial cellsin vivo. Cancer Res 2002; 62(3):625-631.48. Wei D, Wang L, He Y, Xiong HQ,Abbruzzese JL, Xie K. Celecoxib inhibitsvascular endothelial growth factor expres-sion in and reduces angiogenesis andmetastasis of human pancreatic cancer viasuppression of Sp1 transcription factoractivity. Cancer Res 2004; 64(6):2030-2038.49. Ebert AD, Bartley J, David M.Aromatase inhibitors and cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors in endometriosis: newquestions--old answers? Eur J ObstetGynecol Reprod Biol 2005; 122(2):144-150.

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Director: Dr. Claudio Ruhlmann

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