trabajo de fin de máster
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Departament de Medicina Preventiva i Salut Pública,
Ciències de
l’Alimentació, Toxicologia i Medicina Legal
Trabajo de fin de Máster
Estudio comparativo de los tratamientos fungicidas de síntesis químicas
autorizados por la Unión Europea para el control post-cosecha de Penicillium
spp. en frutos cítricos
Máster Universitario en Calidad y Seguridad
Alimentaria Edición 2014-2015
Estudiante: Juan Carlos Garrigues Mafé
Tutor/a: Dr. Jordi Mañes i Vinuesa
Agradezco a la Empresa Productos Citrosol S.A,
y especialmente al laboratorio de control de calidad,
por el trato recibido durante el transcurso de las
prácticas y el desarrollo del trabajo de fin de máster.
Así como a la coordinadora del máster de calidad y
seguridad alimentaria, y a el tutor de mi trabajo de
final de máster. Finalmente, también agradezco a
mis padres y a Jessica, por su paciencia y apoyo
moral en estos últimos años.
1
Índice
I. Glosario ...................................................................................................................................................... 2
II. Índice de figuras ........................................................................................................................................ 3
III. Índice de abreviaturas .............................................................................................................................. 3
IV. Abstract ...................................................................................................................................................... 4
V. Objetivos .................................................................................................................................................... 5
1. Introducción ............................................................................................................................................... 6
1.1 Contexto económico ................................................................................................................................... 6
1.2 Indicación Geográfica Protegida: Cítricos valencianos ............................................................................... 7
2. Características de los frutos cítricos ....................................................................................................... 8
3.1 Iniciación de las enfermedades post-cosecha .......................................................................................... 10
3.2 Factores limitantes para el crecimiento de los hongos .............................................................................. 10
4. Clasificación de los Hongos causantes de la podredumbre en cítricos: ............................................. 11
4.1 Infección inactiva ...................................................................................................................................... 12
4.2 Infección inmediata .................................................................................................................................. 13
5. Importancia de las especies Penicillium digitatum y Penicillium italicum en el podrido ................... 14
6. Control químico post-cosecha de P.digitatum y P.italicum .................................................................. 17
6.1 Sodium ortho-phenylphenate (SOPP) ...................................................................................................... 19
6.2Thiabendazole (Benzimidazole) ................................................................................................................ 20
6.3 Imazalil (Imidazol) .................................................................................................................................... 22
6.4 Prochloraz (Triazol) .................................................................................................................................. 25
6.5 Propiconazol (triazol) ................................................................................................................................ 27
6.6 Fosetyl-Aluminium (alcoi-fosfanatos) ........................................................................................................ 28
6.7 Pyrimethanil (anilinopyrimidine) ................................................................................................................ 29
7. Ensayos de resistencias de P.italicum a los fungicidas ....................................................................... 30
8. Tratamientos alternativos al uso de los fungicidas de síntesis química ............................................. 34
8.1 Control biológico ...................................................................................................................................... 37
8.1.1 Pseudomonas syringae .................................................................................................................... 37
8.1.2 Muscodor albus ................................................................................................................................ 38
8.2 Aceites esenciales.................................................................................................................................... 39
8.3 Componentes GRAS ................................................................................................................................ 40
8.4 Conclusiones............................................................................................................................................ 40
9. Conclusión final ....................................................................................................................................... 41
11.REFERENCIAS ............................................................................................................................................. 53
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I. Glosario
Citocromo P450: Se trata de un gran complejo enzimático, que se encuentra en
bacterias, arqueas y eucariotas. Está relacionado en diversas reacciones anabólicas y
catabólicas. (Ghosoph M.J 2006))
EC50: Valor que se obtiene de la concentración de un compuesto químico que ocasiona
una respuesta media entre el máximo posible y el mínimo. (5.5)
Fitotoxicidad: Toxicidad de algún producto químico en las plantas o sus frutos. (4.4)
Incidencia: Número de casos ocurridos. Influencia o repercusión
Conidia: Espora asexual inmóvil de hongos. (4.4)
PCR: Reacción de la cadena de polimerasa. Técnica utilizada en la amplificación de un
fragmento de DNA (tecnología de DNA recombinante). (4.4)
LMR: Límite máximo residual. En el caso de los fungicidas de síntesis química,
corresponde con la concentración máxima que puede ser detectada en los frutos
cítricos, bajo la normativa europea. (5.5)
IDA: (Ingesta diaria admisible) Cantidad de sustancia que una persona puede ingerir,
dependiendo de su peso corporal, a diario y durante toda su vida sin que se produzca
un riesgo detectable para su salud. (5.5)
Fitoalexinas: Metabolitos secundarios de naturaleza química compleja,
principalmente flavonoides de bajo peso molecular, que tienen propiedades
antimicrobianas. Se acumulan en algunas plantas a concentraciones muy altas, cuando
se producen infecciones bacterianas o fúngicas.
Isquemia: Disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo de una parte del
cuerpo, producida por una alteración normal o patológica de la arteria o arterias
aferentes a ella. (4.4)
3
II. Índice de figuras
Imágenes Tablas Gráficos
I-1 (pág 9) T-1 (pág 6) G-1 (pág 11)
I-2 (pág 15) T-2 (pág 18) G-2 (pág 24)
I-3 (pág 16) T-3 (pág 20) G-3 (pág 26)
I-4 (pág 23) T-4 (pág 21) G-4 (pág 31)
I-5 (pág 25) T-5 (pág 22) G-5 (pág 35)
I-6 (pág 26) G-6 (pág 37)
I-7 (pág 30) G-7 (pág 38)
I-8 (pág 31)
I-9 (pág 32)
I-10 (pág 30)
I-11 (pág 34)
I-12 (pág 35)
III. Índice de abreviaturas
Abreviatura Palabra Página
Izq. Izquierda 32
Dcha. Derecha 32
P.italicum Penicillium italicum 14
P.digitatum Penicillium digitatum 14
M.albus Muscodur albus 38
GRAS Generally Recognised as Safe 39
P.leipidophylla Parastrephia lepidophylla 39
P.philicaeformis Parastrephia phylicaeformis 39
4
IV. Abstract
La podredumbre verde (P.digitatum) y azul (P.italicum) son los principales
causantes de las grandes pérdidas que ocasiona el podrido en la industria citrícola. En
la década de los años 70, se desarrollaron los primeros fungicidas de síntesis química
para inhibir el desarrollo de estos hongos. En primer lugar, ortho-phenylphenol y
posteriormente thiabendazole redujeron bastante los casos de podrido. Sin embargo, la
aparición de cepas resistentes frente a estos fungicidas trajo consigo la aparición de
nuevos fungicidas como el imazalil. Este fungicida presentaba una gran eficacia, incluso
frente a las cepas resistentes a otros tratamientos. En la actualidad, existen una gran
variedad de fungicidas, pero se dan problemas de resistencia y se producen continuas
reticencias por parte de los consumidores al uso de fungicidas sintéticos que ha llevado
a cambiar las estrategias en los procesos post-cosecha. La aparición de tratamientos
GRAS o el uso de controles biológicos son una alternativa, pero no presentan la misma
eficacia que los fungicidas tradicionales. Es por ello, que en la actualidad se utilizan una
combinación de varios fungicidas a bajas concentraciones y tratamientos GRAS para el
control de la podredumbre.
Green mold (P.digitatum) and blue mold (P.italicum) are considered the main
cause of the large losses due to rot in the citrus fruit industry. Since the 1970s different
synthetic chemical fungicides have been developed to control the spread of the molds.
Firstly, ortho-phenylphenol and later thiabendazole, they reduced the cases of rot.
However, in a few years later, a large number of resistant strains appeared, this led to
new fungicides, as is the case of Imazalil. It has high effect, even in the control of
resistant strains to other fungicide. Nowadays, there are a variety of synthetic chemical
fungicides but there are some resistant strains moreover there are reluctance by part of
consumers on the use of certain fungicides at certain concentrations because of the
toxicity for humans, for all these reasons, It has led to a change in strategies in the
postharvest procedures. The discovery of GRAS treatments or biological control are an
alternative, unfortunately these new treatments don’t have the same effectiveness as the
traditional treatments. Definitely, today it’s using a combination of several fungicides and
GRAS treatments in order to control the rot.
5
V. Objetivos
Obtener información referente a los hongos del género Penicillium responsables
de más del 80% de los casos de podredumbre en cítricos.
Conocer los diferentes tratamientos fungicidas y los parámetros que inhiben el
crecimiento de los hongos causantes de la podredumbre por hongos del género
Penicillium
Realizar un estudio comparativo sobre los diferentes fungicidas de síntesis, en
referencia a su efectividad frente a Penicillium la toxicidad que provocan en la salud
humana y los límites máximos de residuos aceptados en la UE.
Revisar los tratamientos alternativos para el control de los hongos Penicillium
digitatum y Penicillium italicum en el periodo post-cosecha de frutos cítricos.
6
1. Introducción
1.1 Contexto económico
Los cítricos, son una de las especies arbóreas más cultivadas en el mundo. Las
diferentes especies de cítricos, pertenecen al género Citrus y son originales de las zonas
tropicales y subtropicales de Asia. Se empezaron a cultivar, hace más de 4000 años
( Wardowdki et al. 2006)
En la actualidad existen numerosos países, concretamente aquellos que presentan
una climatología tropical o subtropical, productores de las diferentes variedades de
cítricos en el mundo. Las variedades que se engloban dentro de los frutos cítricos son
las siguientes: naranjas, mandarinas, limones, limas y pomelos. España se sitúa en el
quinto puesto del total de países productores del mundo (T-1), con una producción total
aproximada de 6.000.000 de toneladas anuales de cítricos. (7.1)
A nivel europeo, España, es el país que más exportaciones de cítricos contabiliza al
año.
País Año
2007/2008
Año
2008/2009
Año
2009/2010
Año
2010/2011
Brasil 18966,1 19147,8 17483,2 22704,5
Región Mediterranea 20010,9 20578,6 21112,2 22441,1
Estados Unidos 11645,8 10740,2 9978,7 10445,2
China 18877,0 21397,5 23850,0 22940,0
India 7549,0 7966,7 7966,5 8267,2
México 7481,0 7033,1 6793,0 6744,0
España 5579,4 6614,1 5347,6 6627,0
T-1 Tabla obtenida de la “Organización mundial de las naciones unidas para la alimentación y la
agricultura. Se muestran las toneladas de frutos cítricos producidas por cada país al año. (7.7)
A nivel estatal, la comunidad autónoma que mayor producción citrícola presenta, en
cuanto a hectáreas de cultivo, es la Comunidad Valenciana. Presenta una extensión de
188.650 hectáreas dedicadas a la producción de frutos cítricos. Siendo la producción de
las variedades pertenecientes a mandarinos y naranjos las mayoritarias. En
comparación con el resto del estado español, el 60% del terreno cultivado para la
producción de cítricos se sitúa en la comunidad valenciana, seguido de Andalucía con
un 25% del total.
En la Comunidad Valenciana, más de la mitad del total de las exportaciones de
productos agroalimentarios son de cítricos. En el año 2013, se generaron 2104 millones
7
de euros en la exportación de cítricos en la comunidad valenciana. Esta gran cifra,
supone que el 38% del total de las exportaciones agroalimentarias en la Comunidad
Valenciana, son debido a las exportaciones de frutos cítricos frescos.
1.2 Indicación Geográfica Protegida: Cítricos valencianos
El cultivo de cítricos en la Comunidad Valenciana es una de las tradiciones árabes
más arraigadas que hoy se conserva en nuestra comunidad. Durante el siglo XVI, se
tiene constancia bibliográfica sobre la creación de las primeras plantaciones destinadas
a la producción de cítricos. En la mitad del
siglo XIX, debido a una fuerte crisis en el
sector vinícola, la cual ocupaba una gran
parte del territorio valenciano, fue
desplazada por el cultivo intensivo de
cítricos. En pocos años, el cultivo de
cítricos se consolidó como la principal
fuente económica en la Comunidad
Valenciana. Las condiciones climatológicas, geográficas y edafológicas, así como el
desarrollo de nuevas tecnologías, han hecho de la Comunidad Valenciana, un
importante centro productor de cítricos a nivel mundial. La clave de este gran desarrollo
económico del cultivo de cítricos fueron principalmente su gran rentabilidad y el
desarrollo de importantes vías de transporte para su exportación.
Los cítricos valencianos conllevan la propiedad de Indicación Geográfica Protegida,
designada para un tipo de producto agrícola o alimentación que posee una determinada
región geográfica y que presenta cierta calidad y reputación intrínseca al lugar de origen
donde se producen Reglamento (CE) No 865/2003. El consejo regulador de la Indicación
Geográfica protegida realiza una serie de controles rigurosos para certificar la calidad
del producto, en el campo, almacenes, transporte y puntos de venta. (6.6)
A lo largo del tiempo, se han ido perfeccionando las diferentes técnicas agrícolas,
tanto en el cultivo de cítricos como en los procesos post-cosecha. El principal hándicap,
para el perfeccionamiento de los procesos post-cosecha son las diferentes
enfermedades que afectan a los cítricos, conocidas como “aguado” o “podredumbre de
los cítricos”.
Estas enfermedades que afectan a los cítricos después de su recolección son muy
relevantes para el sector citrícola ( Tuset J.J, 1987), principalmente para las grandes
empresas exportadoras de cítricos. Debido a la delicadeza de este fruto, cuando ha sido
recolectado y también, a las largas distancias que existen entre las zonas productoras
y los mercados consumidores de este producto, hacen indispensable el uso de
8
mecanismos que reduzcan las grandes pérdidas ocasionadas desde el periodo post-
cosecha hasta el momento del consumo. Existen muchos factores que producen las
pérdidas de producción: la variedad del fruto, la edad del árbol, el tiempo en el periodo
post-cosecha, las prácticas en el momento de la recolección, la efectividad del
tratamiento fúngico y las condiciones ambientales tanto en la recolección como en el
periodo post-cosecha. (Wardowski W.F et al., 2006)
Cabe destacar que España y en particular la Comunidad Valenciana, es el país que
exporta más productos cítricos en fresco a nivel mundial, 30% de la producción mundial,
a diferencia de otros países que sus mayores exportaciones de cítricos son en forma de
zumos o en otros formatos a partir de concentrado de zumo de frutas. El gran desarrollo
citrícola en este país, es fundamentalmente por la explotación de este nicho de mercado.
Es por este último dato, por lo que se destinan grandes esfuerzos al desarrollo de
tecnologías post-cosecha que reduzcan las pérdidas provocadas por efecto de la
podredumbre de los cítricos. Ya que, en definitiva, el principal valor que se exporta de
los cítricos valencianos es la calidad del producto final y el principal caballo de batalla
que la industria citrícola tiene que lidiar, en el período post-cosecha, es el efecto de los
hongos, principalmente de Penicillium digitatum y Penicillium italicum. (7.7). El podrido
de los cítricos se estima entre un 6 a un 10 por 100 del producto total de cítricos
recolectados. Este porcentaje se puede disparar si no se tienen las precauciones
pertinentes en el proceso de almacenaje, manipulación y refrigeración del producto. Se
han estimado las pérdidas causadas por la podredumbre en la exportación de cítricos
valencianos, del orden de 126 millones de euros. (Tuset J.J 1987; Palou L., 2014)
2. Características de los frutos cítricos
El fruto cítrico está clasificado, botánicamente, como fruto de bayas hespéridas,
debido a que presenta una superficie externa coriácea e internamente está dividido en
segmentos. Existe una gran variedad de frutos cítricos, muestra de ello, es la gran
variabilidad de tamaños que presentan los frutos, desde apenas 2,5 cm de diámetro,
del caso de citrus madurensis hasta un tamaño mayor de 18 cm (diámetro) de Citrus
grandis. Existe también una gran variabilidad, en respecto al grado de rugosidad de la
superficie del fruto, así como del número y tamaño de las hendiduras presentes
también en la superficie. Por otra parte, también existen diferencias en el número de
gajos que presentan las diferentes variedades de cítricos, desde 3 hasta 18 gajos.
Además, también existe variabilidad en el número de semillas presentes, fluctuando
entre 0 y 50 semillas por fruto. Por último, existe una gran diversidad de variedades de
cítricos que son cosechadas en diferentes épocas del año y que presentan diferentes
9
características morfológicas y organolépticas. (Wardoski W.F et al., 2006; Wardowski
et al., 2006)
Morfología: La capa más externa del cítrico, denominada piel o superficie externa,
incluye el flavedo y el albedo. El flavedo es la parte externa que presenta cierta
coloración. La zona interna, denominada albedo, no presenta coloración. A su vez, el
flavedo está dividido en diversas capas: hipodermis, mesocarpo externo, glándulas
sebáceas y un conjunto de capas de cutícula, cutina y celulosa. Además, también
presenta numerosos estomas. Las glándulas sebáceas, excretan al exterior compuestos
que son fitotoxicos, causando necrosis. Si en el proceso de recolección se producen
golpes o si en la aplicación de tratamientos post-cosecha se produce abrasión en la
superficie del fruto, esto desencadenará una liberación de estos aceites fitotóxicos que
conlleva a una pérdida de calidad del producto, y en consiguiente a la no
comercialización de estos frutos.
La capa interna de la superficie del cítrico, se denomina albedo (I-1). Está formado
por una red fina de células parenquimatosas con un gran número de espacios aéreos
internos. El grosor de esta capa varia, desde apenas 1 mm hasta más de 1 cm, como
es el caso de los pomelos. Esta capa le
otorga al fruto cierta amortiguación frente a
las perturbaciones del exterior. En cambio,
es el perfecto medio de cultivo para la
proliferación de los hongos. Si las esporas
consiguen atravesar el flavedo, será muy
probable que consigan desarrollar el cuerpo
micelar y causar la infección del fruto y por
consiguiente, el decaimiento del fruto.
En cuanto a las estructuras internas del fruto totalmente maduro, destacan el conjunto
de segmentos semilunares donde se encuentran las vesículas de zumo (I-1B), estos
segmentos se encuentran rodeados por la capa del endocarpo, y radialmente presentan
una membrana propia del mesocarpo que se extiende radialmente entre los segmentos.
En el interior de estos segmentos semilunares (gajos) se disponen las diferentes
I-1. (A) Sección transversal, se observan las capas de flavedo y albedo. (B) Sección
longitudinal, se observan 2 segmentos semilunares (gajos) y la semilla en la parte central.
(C) vesículas de zumo. (Wardowski et al., 2006)
10
vesículas de zumo (I-1C), de características organolépticas variables entre las distintas
variedades de cítricos.
3. Desarrollo de enfermedades post-cosecha
3.1 Iniciación de las enfermedades post-cosecha
Después de la cosecha, las frutas maduras y los vegetales son atacadas por varios
tipos de microorganismos que no tienen las capacidades necesarias para atacar a los
frutos en un estado de inmadurez. Existen una gran variedad de microorganismos
patógenos de los frutos y verduras maduras, la mayoría de estos microorganismos son
hongos y bacterias.
Existe una cierta protección de la planta que forma al fruto, que desaparece cuando el
procedimiento de madurez acaba y se separa de la planta. A esto, hay que añadir que
los frutos y las verduras en estado de madurez son muy ricas en nutrientes, razón por
la cual los microorganismos crecerán en estos. Por último, existen una serie de
parámetros que facilitan el crecimiento de determinados microorganismos en las frutas,
como son: deterioro fisiológico de la fruta, la maduración de la fruta o el incremento del
estado de senescencia de los tejidos vegetales. (Timmer L.T et al., 2002; Barkai-Golan
R, 2011)
3.2 Factores limitantes para el crecimiento de los hongos
Tanto la penetración del patógeno en el fruto, como el desarrollo del hongo en el
fruto, es algo que no se debe únicamente a la acción del hongo. Existen una serie de
condiciones que influye en el desarrollo del hongo parásito en el fruto cítrico. Las
condiciones son las siguientes: temperatura, presencia de nutrientes disponibles, pH
determinado y otros condicionantes ambientales:
Temperatura:
La mayoría de las pérdidas ocasionadas en los almacenes de frutas son
debidas al ataque de hongos mesófilos. Esto es debido a que los hongos mesófilos, son
capaces de crecer a temperaturas inferiores a 20ºC, algo que no ocurre con el desarrollo
de la mayoría de bacterias. La germinación de las esporas fúngicas viene marcado por
unos determinados factores ambientales, la temperatura y la humedad relativa. Existen
determinados hongos que a temperaturas realmente bajas pueden llegar a germinar las
esporas y desarrollarse en el fruto.
Existen casos, como el de Alternaria alternata, uno de los hongo patógenos de
los cítricos, que presenta un desarrollo micelar a temperaturas inferiores a los 0ºC.
11
Por otro lado, hongos del género Colleotrichum , que también es patógeno de
los cítricos, pero que no presenta un desarrollo micelar a temperaturas inferiores a los
20ºC, ya que es un hongo característico de climas tropicales. (Tuset J.J, 1987; Barkai-
Golan.R, 2001)
Nutrientes:
Existen ciertos hongos que con una cantidad muy pobre de nutrientes pueden
llegar a desarrollarse. Es el caso de Penicillium digitatum que con una cantidad muy
pobre de nutrientes y agua, se desarrolla
aunque más lentamente. A continuación se
mostrará una gráfica (G-1), en el que se
muestra el aumento del crecimiento de
P. digitatum a diferentes concentraciones de
nutrientes (aceite de la piel de la naranja) con
respecto del tiempo.
Humedad ambiental:
La humedad, es otro de los factores esenciales para el desarrollo de las esporas
fúngicas. Las esporas pueden germinar solo, con agua pura. Es por ello, que la
humedad ambiental influirá mucho con el desarrollo de ciertos hongos.
Las cámaras de refrigeración de los almacenes de frutas y verduras, están adaptadas
para mantener a temperaturas bajas y a humedad relativa constante. Dependiendo del
tipo de fruta o verdura que se almacene, estas cámaras presentaran una humedad
relativa mayor o menor. Estas condiciones van a influir en el crecimiento de los hongos,
ya que en su conjunto, necesitan de una humedad relativa elevada (mayor al 80%) para
el desarrollo de las esporas. (Barkai-Golan R, 2001)
4. Clasificación de los Hongos causantes de la
podredumbre en cítricos:
A continuación se van a nombrar los hongos causantes de podredumbre en los frutos
cítricos que han sido encontrados en la Comunidad Valenciana. Existe una gran
variedad de especies de hongos, aunque en su mayoría pertenecientes al fílum
G-1 Efecto del extracto de aceite de naranja al 1% con agua y agar. Se observa el incremento
de la germinación en Penicillium digitatum (Barkai-Golan R, 2001)
12
Ascomycota. Presentan diferentes formas de infectar, así como distinta apariencia
morfológica en el fruto afectado. Además de esto, requieren de específicas condiciones
ambientales para desarrollar su micelio, siendo en su mayoría, una temperatura cercana
a los 20ª y una humedad relativa elevada. Se clasifican según la rapidez con la que se
desarrolla el hongo en el fruto:
4.1 Infección inactiva: En este caso, aquellos hongos que únicamente se conseguirá
desarrollar la infección cuando se den las condiciones ambientales óptimas. Mientras
tanto, las esporas de estos hongos permanecerán de forma inactiva en el cítrico. (Tuset
J.J, 1987)
Nombre Características principales Condiciones
ambientales
Afectación en
el fruto
Penicillium
digitatum
50-60% de los
casos de podrido
Se desarrolla una coloración verde. Con
el desarrollo de hongo, se llega a la
aparición de una superficie polvorienta y
verde-grisácea
Humedad relativa
superior al 80%.
Temperaturas
superiores a 5ºC.
Penicillium
italicum
20% de los casos
de podrido
Se desarrolla una capa azulada que
cubre la parte externa del cítrico
Es capaz de crecer
a 4ºC.
Humedad relativa
elevada.
Alternaria spp
Afectación entre el
8-10-15 % de los
casos de podrido.
Se produce una decoloración de la piel
que cambia a marrón. Se desarrollan
densas masas de micelio
Humedad: 80-85 %
Temperatura: 17-
18ºC.
Cladosporium spp
Afectación no
superior al 4% de
los casos de
podrido
Podredumbre verde-grisácea. Si se dan
las condiciones idóneas, se producirá
un reblandecimiento de la piel y
posteriores fisuras.
Precisan de una
humedad ambiental
superior al 80%.
Fusarium spp
Afectación no
superior al 4% del
total de los casos
de podrido
A través de heridas. Se origina una
podredumbre blanda y con pérdida de
líquidos. Posteriormente produce una
podredumbre seca de desarrollo lento.
Temperaturas
inferiores a 10ºC y
una humedad
relativa elevada.
13
Rhizopus spp.
1-3% de
afectación del total
de los casos de
podrido
Causa una podredumbre blanca con
pérdida de líquidos. Además, también
se produce un recubrimiento
algodonoso por la parte externa de los
cítricos. La apariencia de los cajones es
de un nido
Humedad relativa
elevada y
temperaturas
mayores a 8ºC.
Sclerotinia
Fuckeliana
Poca afectación
en los cítricos
Conocido como “moho gris”. Produce en
el fruto cítrico una podredumbre blanda
con exudado líquido, además de un
recubrimiento marrón claro que se va
oscureciendo con el tiempo.
Humedad relatva
elevada (80%) y
temperatura
templada (12ºC).
Trichoderma spp.
No sobrepasa el
0,7% del total de
los casos de
podredumbre
Produce una podredumbre no blanda. El
área de corteza afectada por este hongo
aparece de color marrón oscuro y se
presenta consistente al tacto. Se
produce un cambio progresivo de color
de blanco a marrón oscuro
Humedad relativa
mayor del 80%.
Rango de
temperatura entre
los 5 y los 40ºC.
Glomerella spp.
Afectación no
superior a 4%.
Mayor incidencia
en mandarinas.
Afecta principalmente a la zona estilar y
peduncular del fruto.
El origen del desarrollo de la
enfermedad es mediante la aparición de
pequeñas pustulitas en superficie.
Humedad relativa
del 80%
4.2 Infección inmediata: Se produce una rápida germinación de las esporas al
ponerse en contacto con el tejido vegetal del fruto, unas pocas horas. Los factores
ambientales, favorecerán o impedirán que estos hongos se desarrollen. (Tuset J.J,
1987)
Nombre Características principales Condiciones
ambientales
Afectación en
el fruto
Geotrichum spp
2-3% de los casos
de podrido
Causante de la podredumbre amarga o
ácida de consistencia blanda, que se
transforma rápidamente en acuosa y
con un fuerte olor a pútrido
Humedad relativa
del 80% y con
temperaturas
superiores a 10-
12ºC
Phytophtora spp
No supera el 2%
de los casos de
podredumbre
Podredumbre marrón. Se produce una
pérdida de coloración en los cítricos y
aparición de zonas redondeadas de
color gris oscuro
Por debajo de los
10ºC no existe
sintomatología
14
5. Importancia de las especies Penicillium digitatum y
Penicillium italicum en el podrido
Como se ha descrito anteriormente, en
la clasificación de los hongos que
causan la podredumbre en los cítricos,
existen 2 especies de hogos que son los
causantes de la mayoría de los casos de
podredumbre en la industria citrícola a
nivel mundial. Estas 2 especies forman
parte del mismo género: Penicillium
Concretamente, la especie Penicillium
digitatum tiene una incidencia de
entorno al 60% del total de los casos de
podrido.
En segundo lugar, la especie Penicillium italicum es la responsable de más del 15% del
total. En definitiva, el género Penicillium. es el causante de más del 80% del total de los
casos de podredumbre en cítricos. La estimación real de las pérdidas económicas que
supone la infección de este hongo no se conocen, pero se
sabe, que en la actualidad, entre el 5-8 % de la producción
global de frutos cítricos son eliminadas anualmente debido
al aguado que causa este género.
Las enfermedades post-cosecha causadas por P.digitatum
y P.italicum pueden darse en diferentes momentos:
Triangulo de las posibles vías de entrada de la infección por P.digitatum/P.italicum (Palou L,
2014)
Reino Fungi
Fílum Ascomycota
Clase Euascomycetes
Orden Eurotiales
Familia Trichomaceae
Género Penicillium
Incidencia
Penicillium digitatum Penicillium italicum
Alternaria citri Glomerella spp.
Rhizopus spp otros
15
Como se puede ver, existen tres posibles vías de inoculación de los hongos
pertenecientes al género Penicillium. El desarrollo de estos hongos se produce mediante
la inoculación de sus conidios en heridas situadas en la piel del cítrico, por esta razón,
son denominados “hongos de herida”. De tal manera que si no existe una herida por la
que puedan acceder a la capa del albedo, será totalmente imposible que se desarrolle
la infección.
La inoculación del hongo en las heridas de los cítricos, puede darse por diversas
vías de entrada. La primera sería directamente en el campo de cultivo donde madura el
fruto, donde se pueden producir heridas causadas por las inclemencias del tiempo o por
la acción de algún insecto. La segunda vía sería en el proceso de recolección de los
frutos, es posible que se produzcan heridas debido a unas malas prácticas del personal
de recolección. Por último, la tercera posible vía es en los almacenes de cítricos, debido
a una mala manipulación, debido a una mala refrigeración o en el proceso de transporte
también se pueden producir heridas. La inoculación de las esporas, a su vez, puede
darse en el mismo sitio donde se realizan las heridas, o en etapas posteriores. Sin duda,
es en los almacenes de cítricos donde se producirá una diseminación de esporas y
donde la susceptibilidad por ser infectado es mucho mayor. (Wardowski W.F et al.,
2006; Tuset J.J, 1987; Palou L., 2014)
Los primeros síntomas que se experimentan en el fruto son los mismos,
independientemente de la especie. El tejido afectado por estos hongos se vuelve cada
vez más suaves, acuosos y ligeramente decolorados, por esta razón recibe el nombre
de podredumbre. (Palou L., 2014)
Podredumbre causada por P.digitatum: Se trata del hongo que produce la mayoría
de las enfermedades post-cosecha en frutos cítricos de todo el mundo. Si el hongo se
consigue desarrollar completamente, es capaz de producir millones de conidios capaces
de infectar otros frutos. Aparece un micelio blanco sobre la superficie del fruto y cuando
alcanza un diámetro de unos 2.5 cm comienza a producir esporas, y se produce una
coloración verde-oliva, dejando una franja de color blanquecina en el extremo. Durante
el desarrollo del hongo en el fruto, este empieza a encogerse y arrugarse, quedando
finalmente en un aspecto momificado. (Wardowski W.F et al., 2006; López-Pérez et al.,
2014)
16
Identificación: Los conidios de 4-7 x 6-8 µm.
Pueden disponerse en forma de cadena y presentan cierta
variabilidad de forma y tamaño (I-2). Al igual que P.italicum,
cuando son cultivadas en medios de cultivo, presenta la
misma morfología que la observada en el fruto afectado.
I-2 Esporas de Penicillium digitatum. Imagen cedida por la empresa Productos CITROSOL S.A.
Condiciones ambientales: La temperatura óptima de crecimiento es de 24ºC.
Siendo mucho más lento su crecimiento a temperaturas mayores a 30ºC e
inferiores a 10ºC.
Penicillium digitatum es el primer organismo fitopatógeno el cual se pudo secuenciar
completamente el genoma. Como veremos más adelante, esta secuenciación, sirve
para obtener información sobre las mutaciones existentes en las cepas resistentes a los
diferentes controles químicos post-cosecha. Además, también ha permitido detectar
algunos de los genes implicados en factores de virulencia. (Timmer L.T., 2002)
Podredumbre causada por P.italicum: la afectación de este hongo va más despacio
que la sufrida por P.digitatum. Sobre la superficie de la lesión se desarrolla un
crecimiento micelar de color blanco y aspecto pulverulento. Posteriormente se desarrolla
una masa de esporas de color azul, dejando una banda blanca en la periferia.
Identificación al microscopio: Se produce una
cadena de conidias entre cilíndricas y elípticas o ligeramente
ovales, que miden entre 2-3 x -5 µm (I-3). Al cultivarse este
hongo en medio de cultivo, adapta la misma morfología que
en la piel del cítrico, verde-azulada.
Condiciones ambientales: La temperatura óptima de crecimiento es de 24ºC,
sin embargo, este hongo consigue crecer a temperaturas por debajo de los
10ºC. Es por tanto un serio problema en las cámaras de refrigeración de los
almacenes de cítricos, ya que consiguen desarrollarse a temperaturas de
refrigeración. En algunos casos consiguen diseminar sus esporas y re-infectar
otros frutos. (Wardowski W.F et al., 2006)
Existen otros factores ambientales que influencian el desarrollo de una especie u otra,
dependiendo del clima presente en el país de producción. En la Comunidad Valenciana,
en general, la especie Penicillium digitatum suele presentar más afectación en los
I-3 Esporas de Penicillium italicum. Imagen cedida por la empresa Productos CITROSOL S.A.
17
primeros meses de campaña y Penicillium italicum afecta más a las ultimas variedades
de cítricos recolectadas en los últimos meses de campaña. Pero existen excepciones,
cuando se dan determinados factores ambientales. En la Comunidad Valenciana, se ha
podido observar que en aquellos años en los que los meses de Octubre y Noviembre
son especialmente húmedos y los meses posteriores son calurosos, se produce el
mayor desarrollo de la especie Penicillium italicum. Son características que
normalmente no se dan, ya que los meses de Noviembre y Diciembre suelen ser más
fríos y secos, pero el clima mediterráneo se caracteriza por su irregularidad. Por otro
lado, en aquellos meses de Febrero y Marzo, en los que el ambiente sea más húmedo
y fresco de lo que se considera normal, se produce un incremento de los casos de
podrido por causa de Penicillium digitatum en el final de campaña, que sería más propio
de Penicillium italicum. (Barmore R.C et al., 1982; López-Pérez et al, 2014)
6. Control químico post-cosecha de P.digitatum y P.italicum
Como se ha visto anteriormente, existe una gran diversidad de variedades de frutos
cítricos. Presentan distintas características fisiológicas, además existen algunas
variedades en las que la capa de flavedo es más gruesa que en otras, por tanto, será
totalmente diferente la accesibilidad de las esporas de estos hongos patógenos en la
capa del albedo, donde se desarrollará su cuerpo micelar. Por otro lado, existen
variedades de cítricos que su estado de madurez óptimo se produce en los meses
cercanos al periodo estival, donde la temperatura ambiental es mucho mayor que las
variedades más tempranas. Todos estos factores, entre muchos otros, hacen que la
efectividad de un determinado tratamiento, sea muy difícil de extrapolar a la totalidad de
las variantes de cítricos. Sin embargo, existen en el mercado, una serie de sustancias
fungicidas y fungistáticas, que son capaces de reducir el número de los casos de
podredumbre, en las diferentes variedades de cítricos.
Existe un parámetro muy importante a la hora de aplicar los diferentes fungicidas
de síntesis química, el tiempo que transcurre entre la inoculación del conidio en el albedo
hasta que se aplica un determinado fungicida. Este parámetro es propio de cada
fungicida, y garantizará su máxima efectividad. De lo contrario, si no se aplica en el
tiempo óptimo para un determinado fungicida, su efectividad irá disminuyendo con el
tiempo. (de Liñan C., 1997; Holmes G.J et al., 1999; Talibi et al., 2014)
18
En los últimos 50 años, más de 30 compuestos orgánicos han sido utilizados para
el control de la podredumbre en post-cosecha como fungicidas. La elección del fungicida
apropiado depende las siguientes características (Barkai-Golan R, 2001):
Por un lado, la sensibilidad del patógeno al compuesto químico en cuestión.
Además, este fungicida debe tener la habilidad para penetrar en la superficie
del fruto y llegar al origen de la infección.
Por otro lado, la efectividad de un determinado fungicida no puede ocasionar
un posible daño fisiológico (fitotoxicidad), ya que esto sería totalmente
contraproducente. De lo contrario, si produce daños fisiológicos severos
puede llegar a ocasionar que el fruto no sea comercializable y por otro lado,
puede ocasionar la formación de heridas en la superficie y que agrave el
problema de la infección fúngica.
Por último, en los últimos años, se están llevando a cabo diversos estudios
sobre la toxicidad en el ser humano y sobre el medio ambiente de estos
fungicidas. Por ello, se están reemplazando algunos de estos fungicidas por
otros de menor toxicidad y por otro lado, se están reduciendo la concentración
de fungicida utilizada en los diferentes tratamientos.
Reglamento 396/2005: “Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal
en la Unión Europea (UE) están sujetos a un límite máximo de residuos de plaguicidas
(LMR) en su composición, con el fin de proteger la salud humana y animal. El
Reglamento reúne en un solo texto y armoniza los límites aplicables a los diferentes
productos de alimentación humana o animal, y fija un límite máximo aplicable por
defecto.”(3.3)
El establecimiento de los diferentes límites máximos de residuos (LMR) para los
fungicidas utilizados en los cítricos, dentro de la Unión Europea, es un factor importante
para la comercialización del producto entre países de la Unión Europea, y otros países
que han adaptado sus LMR a los establecidos por la Unión Europea. Es un factor a tener
en cuenta, en la aplicación de los diferentes fungicidas de síntesis química a los frutos
cítricos en el proceso post-cosecha. La aplicación correcta de una determinada
concentración de fungicida/s que impida el desarrollo de las especies P.digitatum y
P.italicum sin que se sobrepase la concentración máxima de residuos establecida por la
Unión Europea es el principal hándicap para las industrias destinadas al control de la
podredumbre post-cosecha en cítricos. (9.9)
19
En la tabla adjunta (T-2), se muestran los límites máximos autorizados por la Unión
Europea, Suiza, Estados Unidos y Canadá, sobre los productos fitosanitarios utilizados
en los procesos post-cosecha de la industria citrícola.
A continuación, se van a describir detalladamente algunas de las características
más importantes, tales como los mecanismos de acción y la sensibilidad que presentan
los fungicidas de síntesis químicos autorizados por la Unión Europea. Así pues, se
describen aquellos que son utilizados, principalmente, para combatir el desarrollo de las
especies P.digitatum y P.italicum.
6.1 Sodium ortho-phenylphenate (SOPP)
El primer fungicida de síntesis que fue utilizado para el control del desarrollo de
enfermedades post-cosecha en cítricos (1940). Se trata de un fungicida y desinfectante
con actividad preventiva. Ha sido utilizado durante más de 40 años para controlar las
enfermedades post-cosecha en frutos cítricos. Este fungicida presenta un amplio
espectro de acción biocida, en comparación con el resto de los fungicidas orgánicos
utilizados para combatir las enfermedades post-cosecha. Este fungicida fue usado
extensivamente para controlar las enfermedades post-cosecha de frutos cítricos,
causadas por P.digitatum y P.italicum. (Wardowski W.F, 2006; Talibi I et al., 2014)
Los mecanismos de acción son los siguientes: Por un lado, inactivar las esporas
fúngicas presentes en la superficie del cítrico. Por otro lado, el compuesto es depositado
en aquellas zonas donde se ha producido una herida, evitando consigo la infección de
esporas presentes en el almacén de frutas. Es decir, el mecanismo de acción que
presenta este fungicida, es el de prevención, impedir el desarrollo del hongo.
T-2 Boletín de avisos de la Generalitat Valenciana (Marzo 2015) de los productos fitosanitarios
post-cosecha autorizados en frutos cítricos. (9.9)
20
Este fungicida presenta un grupo fenólico en su estructura que es letal para los
microorganismos, pero también presenta cierta fitotoxicidad para la superficie del fruto.
La fitotoxicidad, además de las implicaciones que presentan en relación a la reducción
de la calidad del producto, que se habló anteriormente, presenta otro problema. Este
problema hace referencia a la inoculación de conidios en las heridas provocadas por la
propia acción corrosiva del fungicida. Por tanto, en algunos casos, si no se toman las
medidas pertinentes en los protocolos de aplicación del fungicida, pueden incluso
agravar la problemática de la incidencia por el género Penicillium.
Se deben de tomar ciertas precauciones, como es la adición de moléculas de sodio,
que permite alcalinizar la solución, consiguiendo que el efecto fitotóxico del fungicida
sea menor para el fruto. En definitiva, que no se produzcan daños en la piel del fruto.
Se debe evitar utilizar el agua del grifo, porque puede alterar este pH, pudiéndolo
acidificar y producir las indeseables reacciones fitotóxicas en la piel del fruto. (Barkai-
Golan R, 2001)
Sin embargo, presenta otra limitación además de su fitotoxicidad, la aparición de
cepas resistentes frente a la acción de este fungicida.
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Sodium ortho-
phenylphenate
Desnaturalización de lípidos y
proteínas de los fosfolípidos de
membrana.
-Presencia de cepas
resistentes.
-Fitotóxico
5 0.02
6.2 Thiabendazole (Benzimidazole)
Los fungicidas que pertenecen a la familia de los compuestos benzimidazole son:
carbendazim, thiabendazole, benomyl y thiophanate. De los cuáles, solo el
thiabendazole está permitido su uso como fungicida en la industria citrícola en la Unión
Europea. El resto de los fungicidas de la familia benzimidazole han sido prohibidos su
uso, debido a las graves implicaciones que presentan en la salud humana. Fue
sintetizado en el 1972 por la compañía Novartis agro como alternativa al uso de
fungicidas como el SOPP. Se trata de un fungicida sistémico de contacto, de amplio
campo de acción y con actividad preventiva y curativa. También se emplea como
antihelmíntico. (de Liñan C., 1997; Paris M, 1970 )
El mecanismo de acción es el siguiente: Se unen a las moléculas de tubulina e
inhiben la formación micro-tubular que ensambla las células fúngicas. Por tanto, este
fungicida tiene su efecto, una vez la espora se ha introducido en las heridas de la piel y
está en proceso de desarrollar el cuerpo micelar. Por otro lado, también presenta otra
21
actividad que recae en la inhibición de la mitosis celular, así como disminución de la
respiración mitocondrial por medio de la inhibición del enzima succinato. (Barkai-Golan
R, 2001)
Hay que destacar que este fungicida no es muy eficaz frente a determinados
hongos causantes de la podredumbre de cítricos, como: Alternaria spp. o Geotrichum
spp. pero sí que lo son frente a Penicillium spp.
Sin embargo, el uso continuado de este fungicida durante varias décadas ha
llevado consigo al incremento del número de cepas resistentes. Muestra de ello, se
observa en la siguiente tabla en la que se compara la efectividad del fungicida
thiabendazole frente al fungicida Imazalil.
T-3. Tabla de datos donde se muestra el porcentaje de resistencias de P.digitatum (290
aislados) y P.italicum (204 aislados) de muestras recogidas en diferentes almacenes y campos
de Marruecos. (Boubaker H. et al., 2009)
En el anterior estudio, se observó la efectividad que presentaba el fungicida
thiabendazole (20µg/ml) y por otro lado Imazalil (0,1µg/ml) (T-3). El tamaño muestral de
este estudio era de 290 aislados diferentes de la especie Penicillium digitatum y de 204
aislados de la especie Penicillium italicum. Las muestras se obtuvieron de 4 almacenes
de cítricos distintos y de un campo de cultivo. Lo que se observa claramente, es el
número tan alto de cepas resistentes al fungicida thiabendazole, en relación con el
fungicida imazalil. Además, se obtiene otro dato interesante que hace referencia a los
aislados del campo de cultivo. Se puede observar que en los aislados del campo de
cultivo, no se detectó ningún caso de cepa resistente frente al thiabendazole. Es decir,
se consigue un efectividad del 100%. Este dato demuestra que el uso continuado del
fungicida thiabendazole en los almacenes de cítricos, ha traído consigo al desarrollo de
cepas resistentes. En cambio, en el campo de cultivo no se aplican fungicidas, por lo
que no se ha podido desarrollar ninguna cepa resistente, por lo que da una efectividad
del 100%. (Barmore R.C et al. 1982; Maldonado C.M et al., 2005; Holmes G.J et al.,
1995 )
22
Nombre Efecto Limitaciones de
uso
LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Thiabendazole -Inhibición de la formación
microtubular
-Inhibición de la mitosis
- Reducción de la actividad
respiratoria mitocondrial
-Presencia de
cepas resistentes
5 0.3
6.3 Imazalil (Imidazol)
Este fungicida de la familia de los imidazoles, fue sintetizado en el 1973 por la compañía
Janssen, con el nombre comercial de fecundal o fungaflor. En la actualidad, es el
fungicida que más se utiliza en la industria citrícola post-cosecha, a nivel mundial.
La actividad de este fungicida sistémico es de prevención y curativa. Impide la
biosíntesis de ergosterol, mediante la inhibición de la actividad del citocromo P450, que
participa en la biosíntesis del ergosterol. El ergosterol es un esterol que se encuentra en
las células de la membrana de hongos y también de protozoos. La funcionalidad es muy
similar a la del colesterol, en los seres humanos, es decir, tiene funcionalidad estructural
ya que forma parte de la membrana de la célula fúngica. Por tanto, la inhibición de este
compuesto es fundamental para inhibir el desarrollo del cuerpo micelar de los hongos
parásitos, como el caso de Penicillium spp. Por otro lado, también inhibe la actividad
esporulante, principalmente contra P.digitatum P.italicum. Por tanto, impedirá que en
aquellos frutos que ya presenten un desarrollo micelar en el fruto, se reduzca el número
de conidios que podrían afectar a otros frutos. La completa efectividad de este fungicida
se da en las 9-21 horas después de la inoculación del hongo problema.
Cabe destacar, que este fungicida es activo frente a cepas resistentes a los fungicidas
bencimidazoles, como se verá a continuación. (Wardowski W.F et al. 2006; Barkai-Golan
R., 2001; de Liñan C., 1997)
CEPAS FUNGICIDAS
Thiabendazole (ppm) SOPP (ppm) Imazalil (ppm)
500 1000 2000 2500 5000 10000 500 1000 2000
P.digitatum R R R MS MS MS S S S
P. italicum R R R MS MS MS S S S
T-4. Estudio de la efectividad de los fungicidas imazalil, thiabendazole y SOPP en el control
del desarrollo de los hongos P.digitatum y P.italicum. R: Resistente, MS: Sensibilidad media,
S: Sensible (Maldonado C.M et al., 2005)
23
Como se puede observar en la anterior tabla (T-4), se realizó un estudio de la efectividad
de los fungicidas thiabendazole, imazalil y SOPP en las 2 especies de hongos,
P.digitatum y P.italicum. En este caso, no se indica el tamaño muestral, pero se observa
la efectividad de los diferentes fungicidas, de una manera cualitativa, a diferentes
concentraciones. Se observa que las cepas utilizadas son resistentes al thiabendazole
en las diferentes concentraciones utilizadas y que son, en cambio, sensibles frente al
imazalil para las diferentes concentraciones. En el caso del fungicida SOPP, la
sensibilidad es media. (Maldonado C.M et al., 2005)
En la década de los 80, el uso de este fungicida se generalizó por la mayoría de los
almacenes de cítricos del mundo, debido a su gran efectividad y por los reducidos casos
de resistencias encontrados. A continuación se muestra un estudio reciente, sobre el
número de cepas resistentes pertenecientes a las especies P.digitatum y P.italicum,
frente a los fungicidas imazalil y thiabendazole. Esta tabla que a continuación se muestra
(T-5), es fruto de un estudio que se realizó en los principales países y regiones
productoras de cítricos a nivel mundial, a excepción de China.
T-5 Tabla que muestra la efectividad de los fungicidas thiabendazole e imazalil de aislados
provenientes de muestras variables de la mayoría de las zonas productoras del mundo. (% de
cepas resistentes) (Wild L. et al., 1994)
Podemos observar, que en términos generales, el porcentaje de cepas resistentes al
fungicida imazalil es sensiblemente menor que al fungicida thiabendazole. Cabe
destacar, que el número de cepas resistentes de P.italicum para el fungicida imazalil es
prácticamente 0. Sin embargo, existen casos como el de España o California, en los
cuales se observa unos resultados diferentes para el control de P.digitatum. En España,
se observa, no solo un número elevado de cepas resistentes frente al imazalil para
P.digitatum, sino que además consigue superar a los resultados obtenidos por el
fungicida thiabendazole. Existe alrededor de un 26% de cepas resistentes frente a una
concentración elevada del fungicida imazalil (10 mg/l). Es indudable que la efectividad
del imazalil frente a la especie P.italicum es significativamente alta, en comparación con
el uso del thiabendazole e incluso del resto de fungicidas. Sin embargo, el número de
24
cepas resistentes frente al imazalil de la especie P.digitatum ha ido aumentando, y
puede llegar a ser un problema, ya que P.digitatum aglutina más del 60% de los casos
de podredumbre en los frutos cítricos.
En este gráfico (I-4), se observa en
detalle, el porcentaje de cepas
resistentes a ambos fungicidas,
thiabendazole e imazalil para
P.digitatum. Cabe destacar, el caso de
las muestras que se obtuvieron en
limones (246 cepas) en Argentina (17)
y España (223), donde existe más del
30% de cepas resistentes al imazalil y
14% al thiabendazole. Es decir, existe
un 14% de cepas resistentes al
thiabendazole y al imazalil. (Wild L. et al.,
1994)
La efectividad del fungicida imazalil contra las especies del género Penicillium está
datado en una concentración de en torno a 0,1µg/ml. En cambio, aquellas cepas que
son resistentes al imazalil, como se ha visto anteriormente, pueden llegar a sobrevivir
en concentraciones superiores a 0.5µg/ml. Hace un par de años, se publicó un estudio
en el cuál se detectó la existencia de una variabilidad genética, asociada a un gen,
similar en aquellas cepas que eran resistentes al imazalil. En concreto, esta similaridad
que presentaban las cepas resistentes, era la mutación de un par de nucleótidos del gen
PdCYP51A. Tras diversos estudios genéticos y proteómicos, se pudo concluir que este
gen, estaba relacionado con la actividad del citocromo p450 del hongo. Al parecer, esta
mutación provoca un cambio estructural de la proteína, otorgando a estas cepas una
mayor resistencia frente a la actividad inhibitoria del fungicida. Esta característica, les
permite a las diferentes cepas poder sobrevivir y aumentar, paulatinamente en el tiempo,
el número de cepas resistentes al imazalil. (Wild L. et al., 1994; Holmes G.J et al., 1995)
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Imazalil Inhibición de la síntesis de
ergosterol mediante la inhibición
de la actividad del citocromo
p450
-Empiezan a darse
casos de cepas
resistentes.
5 0.01
I-4 Representación del porcentaje de cepas
resistentes para P.digitatum a los fungicidas
thiabendazole e imazalil.(Wild L. et al., 1994)
25
6.4 Prochloraz (Triazol)
Fue sintetizada por primera vez, en la década de los 80 por the boots Company.
Este fungicida, de la familia de los triazoles, presenta el mismo mecanismo de acción
que el imazalil, es decir, la inhibición del citocromo p450 que trae consigo la inhibición
de la biosíntesis de ergosterol. Presenta además de esto, actividad preventiva, curativa
y erradicante. También presenta una importante penetrabilidad en el fruto.
Tiene una gran efectividad frente a P.digitatum y P.italicum. Además de esto, también
presenta una importante acción frente a la actividad esporulante de estos hongos. Sin
embargo, al igual que en los anteriores fungicidas descritos, el uso continuado de este
fungicida ha llevado consigo, a la aparición de cepas resistentes. Se ha podido observar,
que al igual que en el fungicida imazalil, existe un gen (CYP51B) que presenta
mutaciones en aquellas cepas que presentan cierta resistencia al prochloraz. Se ha
podido comprobar, de la misma manera que en el fungicida imazalil, que este gen está
relacionado con la actividad del citocromo P450. Como se ha indicado anteriormente, la
actividad del citocromo P450 está relacionada con la síntesis de ergosterol. Por lo que,
esta mutación en el gen CYP51B, le proporciona una mayor actividad enzimática y por
tanto, una mayor resistencia al fungicida que conlleva a la supervivencia de las cepas y
a su expansión en los diferentes almacenes de cítricos. (Wardowski W.F et al., 2006; de
Liñan C., 1997)
En este ensayo se pudo observar, la aparición de estas cepas resistentes al prochloraz
(G-2). Además, se pudo comprobar que existía una variabilidad dentro de estas cepas
resistentes, ya que algunas de ellas presentaban valores de fungicida más altos para la
EC50. Posteriormente, se realizó una PCR (I-5) de una determinada región del genoma
de Penicillium digitatum, y se obtuvo un amplificado, tal y como se muestra en la anterior
imagen. Se utilizaron 10 cepas de P.digitatum, de las cuales ,1 y 2 eran cepas sensibles
G-2 En el gráfico de la izquierda observamos un gráfico sobre la sensibilidad del prochloraz,
25 cepas resistentes de 78 aislados. En la imagen de la derecha (I-5), se observa la imagen
de una electroforesis del amplificado de 7 cepas. 1 y 2 sensibles, el resto resistentes. (Wang
et al., 2014)
26
a una determinada concentración de prochloraz y el resto eran resistentes. Se observa
claramente en la electroforesis, una diferencia del tamaño (pares de bases) del
amplificado entre las cepas resistentes y las sensibles. En estudios posteriores, se
secuenció esta región amplificada y se obtuvieron una serie de secuencias. Finalmente,
mediante estudios de proteómica, se pudo observar los cambios conformacionales de
la proteína, que al parecer, provocan que el fungicida prochloraz no tenga el mismo
efecto que con las cepas sensibles.
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Prochloraz Inhibición de la síntesis de
ergosterol mediante la inhibición
de la actividad del citocromo
p450
-Empiezan a darse
casos de resistencias
10 0.01
Estudios muy recientes, Febrero de 2015, de ingeniería genética sobre P.digitatum,
mostraron el efecto de un factor transcripcional crítico de virulencia (sreA) que está
relacionado con la expresión del gen cyp51, como hemos visto anteriormente, un gen
que está involucrado en los casos de resistencia frente al fungicida prochloraz.
Utilizando la técnica de transformación del material genético de A.tumefaciens. se
consiguió transformar una serie de individuos de una cepa que era resistente al fungicida
prochloraz. Por un lado se transformaba la secuencia del gen sreA, mediante la unión
de un fragmento disruptivo que bloqueaba la transcripción de este gen.
De tal manera que se conseguía tener individuos de la misma cepa resistente con el
factor transcripcional sreA inactivado (AsreA). Por otro lado, se separaban individuos
AsreA (factor transcripcional inhibido) y se modificaba para que se volviera a activar el
factor transcripcional, también mediante transformación genética, por parte de
A.tumefaciens. Estos individuos son denominados cotransformados (COsreaA).
I-6 (A) crecimiento en placa individuos sreA (factor inhibido), CosreA (Cotransformado) y
cepa silvestre (B) diámetro de las colonias bajo diferentes concentraciones de fungicida.(C)
comparación del valor EC50 de la cepa silvestre, AsreA y COsreA (19)
27
Finalmente, se cultivaban en medios fortificados a diferentes concentraciones del
fungicida Prochloraz los individuos del factor transcripcional inactivado (AsreA), los
individuos del factor transcripcional cotransformado (COsreaA) y el control, formado por
individuos no transformados que eran resistentes al Prochloraz. Como se observa en la
imagen anterior (I-6), existe un menor crecimiento de los individuos (AsreA) en relación
con el crecimiento de los individuos de la cepa silvestre y los individuos
cotransformados. Así mismo, los individuos de la cepa silvestre y los individuos
contransfomados (COsreA) presentaban un crecimiento similar. En definitiva, se puede
concluir, que este factor transcripcional está relacionado con la expresión de genes de
virulencia, relacionados con la resistencia al fungicida Prochloraz. (Liu J. et al., 2015)
6.5 Propiconazol (triazol)
Este fungicida de la familia de los triazoles, como el fungicida Prochloraz, fue
sintetizado en la década de los 90 por la compañía Janssen. Al igual que los fungicidas
pertenecientes a la familia triazoles, el mecanismo de acción está relacionado con la
inhibición de la síntesis de ergosterol. Este fungicida también es utilizado en el cultivo
de tomate, debido a su baja toxicidad. Además, es muy efectivo contra otras especies
de hongos como Geotrichum spp. y Galactomyces citru-aurantii.( (Wardowski W.F et al.,
2006; de Liñan C., 1997)
Los mejores resultados se obtienen
cuando se ha desarrollado la
enfermedad, pasados 18-42 horas de la
inoculación del hongo problema,
obteniéndose la máxima eficiencia. Sin
embargo, presenta una cierta
fitotoxcidad.
Estudios recientes, han comprobado
que se está incrementando el número de
cepas resistentes frente al fungicida
propiconazol. Al parecer, este fungicida
que presenta el mismo mecanismo de
acción que el fungicida prochloraz e imazalil, presenta una disminución de su efectividad
frente a aquellas cepas que presentan la mutación en el gen CYP51. Tal y como se
muestra en la gráfica adjunta (G-3), existe un aumento del valor de EC50 del
propiconazol frente a los aislados resistentes al imazalil. Al igual que las cepas
G-3 Estudio de la efectividad (EC50) del
propiconazol, en una muestra de 37
aislados cepas resistentes y sensibles al
imazalil (McKay A.H et al. 2013)
28
resistentes al imazalil, también ejerce cierta resistencia al fungicida propiconazol.
(McKay et al., 2013)
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Propiconazol Inhibición de la síntesis de
ergosterol
-Empiezan a darse
casos de resistencias
-Fitotoxicidad
6 0.04
6.6 Fosetyl-Aluminium (alcoi-fosfanatos)
Este fungicida que pertenece a la familia de los alcoi fosfanatos, fue sintetizado en
la década de los 80 por la compañía Rhône Poulenc Agrochimie. Aunque en un primer
momento, su uso se destinaba únicamente en el control de hongos de la clase
Oomycetes, concretamente contra la especie Phytophtora spp. Posteriormente se
observó su efectividad frente a P.digitatum, aunque no es muy utilizado en la actualidad.
En la actualidad, no se conoce con exactitud cuál es el mecanismo de acción del
fosetyl-aluminium en la inhibición del desarrollo de hongos en los periodos post-cosecha
en frutos cítricos. Sin embargo, se tienen algunas hipótesis de los posibles mecanismos
de acción. Se piensa que presenta dos vías diferentes de acción: Por un lado, afecta a
las dianas bioquímicas encargadas del transporte y penetración en la pared del hongo.
Además, al parecer también reduce la actividad respiratoria mitocondrial en la síntesis
de ATP.
Por otro lado, también participa en la estimulación de las defensas naturales de la planta
que hacen intervenir mecanismos fisiológicos complejos que incrementan los niveles de
fitoalexinas, compuestos con propiedades fungitóxicas.
La mayor efectividad de este fungicida se da a los 2 o 3 días de haberse inoculado el
hongo parásito en el fruto. (Wardowski W.F et al., 2006; de Liñan C., 1997; 2.2)
Cabe destacar su elevado valor de LMR, en relación con el resto de los fungicidas de
síntesis químicos utilizados.
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Fosetyl-
aluminium
No está bien definido -Aparición de cepas
resistentes al uso
continuado de este
fungicida.
75 0.25
29
6.7 Pyrimethanil (anilinopyrimidine)
El último fungicida sintetizado y permitido su uso en la Unión Europea, para el
control del desarrollo de Penicillium spp en la podredumbre de cítricos. Perteneciente a
la familia de los anilinopyrimidine, fue sintetizado en el 1990 por la compañía Agrevo.
Se trata de un fungicida sistémico translaminar, preventivo y curativo. Evita la
germinación de esporas y limita el número de células del tubo germinativo por lo que se
detiene su penetración en las células epidérmicas de la piel de los cítricos. Además,
también inhibe la actividad de algunos enzimas que degradan la superficie del cítrico,
que tienen actividad cutinasa o pectinasa. (Wardowski W.F, 2006; Talibi I et al., 2014)
En la década de los 90, los fungicidas usualmente utilizados, como el
thiabendazole, imazalil o el prochloraz presentaban numerosos casos de resistencias.
Se ha podido comprobar que presenta una gran efectividad contra Penicillium italicum,
e incluso mediante tratamientos térmicos (agua caliente) presenta una efectividad
considerablemente mayor que el fungicida imazalil.
La completa efectividad del pyrimethanil se da a partir de las 21 horas de la inoculación
del hongo.
T-6 Tabla donde se muestra el efecto que presentan 2 tratamientos a diferente temperatura
(20ºC y 50ºC) con 2 fungicidas diferentes: Pyrimethanil e imazalil, sobre aislados de
P.digitatum y P.italicum en diferentes días de incubación (7 y 12). (D’aquino S. et al. 2006)
De la anterior tabla (T-6), se puede observar que el tratamiento con agua caliente de los
2 fungicidas utilizados muestra una mayor efectividad en términos generales, tanto de
tiempo de incubación, concentración de fungicida como de especie de hongo. Se puede
observar la gran efectividad que presentan ambos fungicidas, pasados 7-12 días de
incubación en el tratamiento con calor. Sin embargo, se observa como en el tratamiento
con calor en los primeros 5 días de incubación, se produce una efectividad mayor del
30
fungicida pyrimethanil a las mismas concentraciones que el imazalil para P.italicum. En
cambio, para el control de P.digitatum, en el tratamiento con calor en los primeros 5 días
de incubación, es el imazalil el que presenta mayor efectividad a concentraciones de
fungicida bajo. Por otro lado, también se puede observar que la efectividad del fungicida
pyrimethanil, sin tratamiento con calor, es menos efectiva al transcurso de 5 días de la
inoculación del hongo en el fruto que el imazalil.
Ya que, pasados 7-12 dias de la inoculación, ambos fungicidas presentan una
efectividad similar (sin tratamiento en calor y con tratamiento en calor). (D’aquino S. et al.
2006)
Pese a su reciente utilización, existen estudios que hacen referencia a la aparición de
ciertas cepas resistentes a este fungicida. (Kanetis L. et al., 2008)
Nombre Efecto Limitaciones de uso LMR
(mg/Kg)
IDA
(mg/Kg)
Fosetyl-
aluminium
Impide la extensión del tubo
germinativo de los hongos
Empiezan a aparecer
cepas resistentes
8 0.2
7. Ensayos de resistencias de P.italicum a los fungicidas
A continuación se muestra la realización de ensayos de resistencias para la
especie P.italicum a determinados fungicidas de sintesis química (imazalil y
pyrimethanil) bajo un gradiente de concentración. Estos ensayos fueron realizados por
parte del estudiante en el periodo de las prácticas curriculares en la empresa Productos
Citrosol S.A. Se trata de una empresa que desarrolla la tecnología y los productos
necesarios para solucionar los problemas que se dan en los procesos post-cosecha de
frutas y verduras. El gran desarrollo del cultivo de los cítricos en la Comunidad
Valenciana, hace que se haya especializado en el tratamiento post-cosecha para
cítricos. Hay que destacar, que en esta empresa se da un importante impulso a la
investigación y el desarrollo de nuevos proyectos que den soluciones a los problemas
que se plantean en los procesos post-cosecha de frutas y verduras. En la actualidad,
CITROSOL es la empresa dedicada a la solución de problemas post-cosecha, que más
y mejores recursos destina a la innovación tecnológica, siempre basado en el rigor
científico.
La realización de ensayos de resistencias a los fungicidas, no solo permite conocer
cualitativamente la sensibilidad de una determinada cepa a un fungicida, sino que
permite cuantificar la concentración del fungicida a la que es sensible la cepa resistente.
El procedimiento que se sigue, es muy sencillo:
31
Se debe disponer de unas instalaciones y de unas condiciones de asepsia
óptimas. De lo contrario, se podrían producir contaminaciones cruzadas,
obteniéndose un resultado erróneo. En el laboratorio donde se realizan estos
ensayos se dispone de una cabina de flujo laminar, además de todos los
instrumentos necesarios y debidamente esterilizados.
Etapa 1: Crecimiento previo de la cepa resistente.
Se debe extraer una porción pequeña, de apenas unos
milímetros de la capa de albedo afectada por el hongo. La
extracción se realiza mediante un bisturí esterilizado,
posteriormente se deposita, mediante el uso de pinzas
esterilizadas, en el centro de una placa Petri con medio
SCA (Sabouraud Cloranfenicol Agar). Posteriormente se
envuelve con parafilm y se identifica correctamente. Finalmente se deposita en una
estufa a 20ºC durante unos días (I-7).
Etapa 2: Elaboración de los medios de cultivo fortificados.
La elaboración de los medos de cultivo SCA (Sabouraud-Cloranfenicol-Agar)
fortificados nos permite conocer la sensibilidad que presenta la cepa aislada a
determinados fungicidas.
A continuación se describe el procedimiento de elaboración de medio SCA
fortificado para un determinado fungicida:
Se procede a diluir en 1 litro de agua destilada, la cantidad conocida del fungicida
para obtener la concentración deseada (1ppm, 2ppm o 5ppm). Utilizando un
matraz aforado, se añade la cantidad necesaria del fungicida para obtener una
concentración determinada y se afora con agua destilada hasta obtener 1 litro
de disolución. (I-8A)
Para verificar que se ha seguido bien el proceso y obtenido la dilución deseada,
se procede a la detección mediante el análisis cromatográfico del valor real de
la disolución.
I-7 P.italicum (Citrosol S.A)
32
Una vez verificado el valor real de la disolución, se procede a elaborar los
medios de cultivo. Se adiciona la solución liofilizada del medio SCA al litro de
disolución con el fungicida en una botella, y se agita. Seguidamente, el medio de
cultivo, es introducido en una autoclave para su esterilización.
Se reparte equitativamente en placas petri, el medio de cultivo foritifcado. Para su
enfriamiento y por tanto solidificación del medio, se utilizara una lampara con rayos
ultravioleta, a modo de biocida (I-8B). Las placas de SCA fortificadas, se deben rotular
debidamente, indicando la diferentes concentraciones y fungicidas , así se evitan errores
en las estimaciones finales.
Etapa 3: Inoculación de la cepa problema en los medios fortificados
Con la ayuda de un cilindro de acero de un diametro pequeño (arededor
de 0,5 cm) se realizan una serie de agujeros sobre el medio donde ha
crecido el hongo. De tal manera, que quedan una serie de discos
simétricos en la placa.
Con la ayuda de un asa de siembra de platino, debidamente esterilzada,
se extrae el disco de agar. Una vez se ha conseguido extraer, con sumo
cuidado, se depositará en la placa con el medio SCA fortificado.
Se deposita el disco en la parte central de la placa. Además, se debe
depositar la superfície donde ha crecidoel hongo en contacto directo con
el medio de agar fortificado.
I-8 Imágenes del proceso
de elaboración de medios
de cultivo fortificados.
(A)Elaboración de
diferentes concentraciones
de fungicida
(B) Solidificación de los
medios de cultivo
fortificados en placa
I-9 Imagen que muestra el
procedimiento de inoculación de los
discos de agar con el hongo problema
en un gradiente de concentración de
placas fortificadas.
33
Por último, son debidamente cerradas con parafilm y se guardan en la estufa a 23ºC
para posteriores interpretaciones de los resultados. Una vez han transcurridos unos
días, se procede a la obtenciónde los resultados de estos ensayos. Se debe medir el
halo de crecimiento alrededor de la posición donde se inoculó el disco de agar.
Etapa 4: Obtención de resultados y conclusiones
En la imagen anterior (G-4), se puede observar el resultado final de 2 ensayos de
resistencias. Tanto en el ensayo 1, como en el ensayo 2 se inoculó el hongo problema
en placas fortificadas con el fungicida imazalil a concentraciones variables: 1ppm, 2ppm
y 5ppm. También se inoculó en placas fortificadas con el fungicida pyrimethanil a
concentraciones variables; 1ppm, 2ppm y 5ppm. Además, también se inoculó el hongo
problena en un medio no fortificado, a modo de control (I-10). Se puede observar en los
gráficos (G-4) el resultado de las mediciones de los halos de crecimiento de los hongos
en los distintos medios, siendo el valor de 0,el correspondiente para el medio control
(sin fungicida). Los valores 1, 2 y 5 se corresponden con las concentraciones del
fungicida.
Los resultados que se obtuvieron son los siguientes:
En el primer ensayo, existe claramente la inhibición del crecimiento del hongo
problema a tratamiento con el fungicida Imazalil en todas las concentraciones. En
G-4 Izq.Gráficas con los resultado de los ensayos de resistencias. I-10 Dcha. Imagen del
desarrollo de hongos resistentes en gradiente de concentración de fungicidas.
34
cambio, el hongo es resistente al tratamiento con pyrimethanil , ya que se observa un
crecimiento micelar en la placa fortificada. Además, en la placa de crecimiento de
concentración 5 ppm, se observa un halo de crecimiento menor que el correspondiente
a concentraciones menores. Este menor tamaño del halo, puede indicar que el hongo
es sensible a concentraciones superiores a 5ppm del fungicida utilizado. El hongo
problema, se trata de la especie Penicillium italicum, ya que presenta su coloración tipica
azulada en el momento de la esporulación.
En el segundo ensayo, no se observa una reducción del halo de crecimiento del
hongo en las diferentes concentraciones de los fungicidas. Se puede observar, como
prácticamente el diámetro del halo de crecimiento es similar tanto en el control (placa
de SCA) como en el resto de placas fortificadas de los 2 fungicidas a diferentes
concentraciones. Al igual que en el caso anteriormente descrito, se trata de la especie
Penicillium italicum, ya que presenta la coloración azulada típica del momento de
esporulación. Cabe destacar, que en la placa fortificada con Pyrimethanil de
concentración 5ppm, no existe esporulación. Posiblemente, a esta concentración se
inhibe la esporulación de esta cepa.
8. Tratamientos alternativos al uso de los fungicidas de
síntesis química
Durante más de 40 años, el uso continuado de fungicidas de síntesis química para
contrarrestar el efecto causada por la podredumbre verde y la podredumbre azul, ha
traído consigo la elaboración de estudios sobre la posible toxicidad que pueden ejercer
estos fungicidas en la salud humana, a corto y largo plazo. En primer lugar, cabe
destacar, que la aplicación de los fungicidas se realiza en piel del fruto y los fungicidas
son capaces de migrar hasta la capa del albedo. Por lo tanto, la ingesta de estos
fungicidas, por parte del consumidor, es muy poca. Sin embargo, en el proceso de
elaboración de zumos de cítricos, se utiliza todo el fruto, incluyendo la piel. Es en estos
casos, donde se debe determinar la toxicidad que pueden ocasionar los fungicidas en
la salud humana. (Taliib I. et al., 2014; Wardowski W.F et al., 2006)
Estudio toxicológico sobre la afectación del fungicida imazalil en el hígado de ratones:
En este estudio toxicológico, se utilizaron ratones a los que se les fue administrada una
dosis de 20 mg/Kg del fungicida imazalil durante 28 días. Se pretendía observar, la
35
posible afectación subcrónica de este fungicida en el hígado. Los resultados obtenidos
fueron los siguientes:
En primer lugar, no se observó una pérdida de peso
significativa en el hígado, respecto al peso normal en
ratones.
Por último, no se detectó ninguna alteración
morfológica en el hígado. Sin embargo, en algunos
casos se detectaron procesos isquémicos incipientes,
pero no se detectó ninguna zona de necrosis.
Posteriormente, se realizó un estudio en el cuál se utilizaba la combinación del fungicida
imazalil y otro compuesto. El compuesto tóxico utilizado es el fungicida carbendazim.
Este fungicida, debido a la toxicidad que presenta para la salud humana, es totalmente
prohibido su uso en la Unión Europea. No obstante, existen otros países productores de
cítricos que no tienen restricciones de uso de tal fungicida. A continuación se van a
mostrar los efectos que presentan en el hígado de un ratón, al ingerir la combinación de
los fungicidas imazalil + carbendazim.
Podemos observar (I-12), el desarrollo de una isquemia necrótica que se ha esparcido
en gran parte del tejido hepático del ratón. Al parecer, el efecto sinérgico de estos 2
fungicidas, provocan un aumento de la necrosis hepática. Cabe destacar, que la dosis
que fue administrada a los ratones, era el doble del límite máximo residual permitido
para humanos y además, el consumo fue administrado durante 28 días consecutivos.
(Dikic D. et al., 2011)
Lo que demuestra este último estudio, es el efecto sinérgico en relación a la toxicidad
que ejercen estos dos fungicidas. Es verdad que la dosis
suministrada es bastante elevada, pero el efecto causado es
proporcionalmente mucho mayor que en el tejido hepático
analizado de ratón, al que solo se le había adicionado imazalil
en su dieta.
I-11 Tejido hepático de ratón. (1.A)Control. No expuesto a imazalil Aumento x100(1.B)
Aumento x400 del control (2.A) Expuesto a imazalil (10mg/Kg) Aumento x 100 (2.B) Expuesto
a imazalil. Aumento 400 (Dikic D. et al., 2011)
I-12 (VIA) Imagen del efecto producido en el tejido hepático del ratón, debido a la ingesta de
imazalil+carbendazim. Aumento x100 (VIB) Aumento x400 (Dikic D. et al., 2011)
36
Estudio toxicológico del fungicida Prochloraz a corto y a largo plazo en ratas:
En primer lugar, se realizó un estudio de toxicidad a corto plazo sobre la posible actividad
anti-andrógeno del fungicida Prochloraz. Se observó una reducción del tamaño de las
vesículas seminales en ratas que fueron administradas con una concentración de 250
mg/Kg por vía oral. Sin embargo, el tamaño de los otros órganos no disminuyó
significativamente. Este estudio se realizó comparando ratas castradas con ratas sin
castrar, por lo que se pudo observar que el efecto era mucho mayor en las ratas que no
estaban castradas. Al parecer, el fungicida Prochloraz tiene propiedades anti-
andrógenos, ya que fue comparado su efecto con el de otros compuestos anti-
andrógenos y los efectos eran similares.
En segundo lugar, se realizó un estudio de la toxicidad a largo plazo sobre posibles
alteraciones en el desarrollo de las crías de ratas, mediante la administración de 30
mg/Kg de Prochloraz durante 17 días a través de la leche materna. Como se observó
en la toxicidad a corto plazo, este fungicida presenta propiedades anti-andrógenas. Se
observó que además de una reducción en el tamaño de las vesículas seminales de los
machos, también se desarrollaba un comportamiento “feminizado” en individuos
machos. Sin embargo, las dosis administradas a las ratas en los anteriores estudios
eran mucho mayor que el límite máximo residual permitido en la Unión Europea para el
fungicida Prochloraz. (Vinggaard M.A. et al., 2005)
En los últimos años, han ido aumentando el número de cepas resistentes a los
diferentes fungicidas utilizados. Incluso, en aquellos fungicidas que eran eficaces para
el control de aquellas cepas resistentes para otros fungicidas, también se han
desarrollado cepas resistentes. Por otro lado, los límites máximos residuales, se han
mantenido en los últimos años e incluso en el caso del fungicida pyrimethanil, se ha
bajado (T-6). Se puede observar como los fungicidas más eficaces, como lo es el
fungicida imazalil, que es aun actualmente el fungicida más utilizado en los procesos
post-cosecha en cítricos, presenta un LMR muy bajo, 5mg/Kg el mismo que los
fungicidas SOPP y thiabendazole. Sin embargo, fungicidas como el fosetyl-Al que no
presenta una eficacia tan alta como el resto de fungicidas de síntesis, presenta el valor
de LMR más altos, 75 mg/Kg. Por lo tanto, no se pueden aumentar las concentraciones
de fungicidas utilizados para controlar aquellas cepas que son resistentes. Frente a este
problema, son muchas las investigaciones destinadas al desarrollo de nuevos
tratamientos capaces de inhibir el desarrollo de los hongos causantes de la
podredumbre, no solo en cítricos, si no en cualquier fruta y verdura, ya que este mismo
problema se extiende para el tratamiento de cualquier fruto en el periodo post-cosecha.
(Taliib I. et al., 2014)
37
A continuación se van a describir algunos ejemplos de tratamientos alternativos a los
fungicidas de síntesis.
8.1 Control biológico
La aplicación de microorganismos antagonistas en el control de post-cosecha en
cítricos, ha estado siendo estudiado desde finales de la década de los 80 y sigue siendo,
en la actualidad, una de las principales líneas de investigación en los procesos post-
cosecha de frutas y verduras. Se han ido encontrando algunos microorganismos
capaces de inhibir el desarrollo de los hongos P.digitatum y P.italicum, pero no fue hasta
el 1995, cuando se comercializó el primer fungicida de control biológico que contenía la
bacteria Pseudomonas syringae. Por otro lado, también se desarrolló un control
biológico a partir del hongo Muscador albus en limones. (Taliib I. et al., 2014)
8.1.1 Pseudomonas syringae
A finales del siglo XX, fue estudiado el efecto de esta bacteria en el control del desarrollo
de Penicillium italicum y Penicillium digitatum. Esta bacteria libera unos compuestos
lipopéptidos denominados “syringomicin E” que inhiben el desarrollo de hongos. El
mecanismo de acción, a día de hoy es incierto, pero se vio el siguiente efecto:
Conseguía reducir, en un 99%, la germinación de esporas de P.digitatum, a una
concentración de 5,45 µg/ml.
Fungicidas Reg.CE (2008) (mg/Kg)
Reg.CE(2010) (mg/Kg)
Reg.CE (2014) (mg/Kg)
Ortho-phenylphenate
5 5 5
Thiabendazole 5 5 5
Imazalil 5 5 5
Prochloraz 10 10 10
Propiconazole 0,05 0,05 6
Fosetyl-al 75 75 75
Pyrimethanil 10 10 8
T-6 Tabla que muestra la evolución de los LMR de los fungicidas de síntesis utilizados contra
P.digitatum y P.italicum establecidos en la Unión Europea. (10.1)
38
En la siguiente tabla se muestra el efecto sobre el desarrollo de P.digitatum de la
molécula syringomicin E que se obtuvo de 2
cepas distintas de P.syringae:
En esta gráfica (G-5) se observa el efecto de la
molécula de syrinomicin E de las cepas ESC-
10 (A) y ESC-11 (11) sobre el desarrollo de
P.digitatum. Se observa, particularmente, que
cuando se aplica una concentración x100, que
corresponde a 10.9 µg/ml de la molécula, en
ambas gráficas, se aprecia una disminución
considerable de la incidencia de P.digitatum.
Al parecer, la cepa EC-10 presenta una mayor actividad fungicida, en las
concentraciones más bajas de syringomicin E, pero finalmente, a concentraciones más
altas que corresponde con la mayor actividad fungicida, ambas cepas EC-10 y EC-11
presentan similares efectos. Sin embargo, no se ha realizado estudios sobre la
efectividad de esta molécula para P.italicum. A día de hoy, existe en el mercado un
producto que se comercializa con el nombre de Bio-Save 100 para uso en el control
post-cosecha de cítricos. (Bull C.T te al., 1998)
8.1.2 Muscodor albus
Este hongo que pertenece, al igual que Penicillium spp. al fílum ascomycota, secreta
unos compuestos volátiles que a modo de biofumigación, consiguen inhibir el desarrollo
de hongos y bacterias. En este estudio, se biofumigaron una serie de cajas con limones
que habian sido inoculados con P.digitatum. En la siguiente gráfica se observan los
resultados. Se puede ver que, en aquellas cajas que presentaban una importante
densidad de inóculo del hongo problema, se conseguia reducir considerablemente la
incidencia en el fruto al aumentar, paulatinamente, la cantidad del hongo M.albus
G-5 Gráfica que muestra el efecto de P.syringae sobre limones inoculados con P.digitatum(A)
cepa ESC-10 (experimento 1) y control (experimento 2) (B) cepa ESC-11(exp.1) y control
(exp.2) (Bull C.T te al., 1998)
39
como biofumigante. Llegando incluso, a reducir hasta un 30% la incidencia al aplicar 30
gramos del biofumigante (G-6).
No se consigue reducir hasta el 100% la incidencia de P.digitatum, pero si se consiguiera
combinar este tratamiento biológico con otro tratamiento, como un fungicida de síntesis,
que conllevara la utilización del fungicida a concentraciones más bajas, se conseguiria
un gran avance en los procesos post-cosecha. (Mercier J. et al., 2005)
8.2 Aceites esenciales
Otra de las posibles alternativas que se plantean, es la de introducir aceites esenciales
de algunas plantas que tienen propiedades fungicidas. Existen más de 1340 especies
de plantas conocidas que presentan, alrededor de 10000 metabolitos secundarios con
propiedades antimicrobianas. Es el caso de algunas plantas extremófilas como
P.phyliciformis o P.lepidophylla que presentan aceites que contienen compuestos
fenólicos con propiedades múltiples como: antiinflamatorias, antimicrobianas para
Gram-positivas y Gram-negativas, y también fungicidas. Se cree que el mecanismo de
acción de estos compuestos fenólico, están relacionados con vías de acción preventivas
al desarrollo del hongo en los cítricos. Se estudió el efecto de estos aceites esenciales
sobre medios de cultivo, a modo de placas fortificadas con un gradiente de
concentración de aceites esenciales.
Tal y como se muestra en la figura
adjunta (G-7), se observa el efecto
de dos plantas extremófias que
presentan mayor actividad
fungicida, gracias al efecto de sus
compuestos fenólicos.
Se puede observar, la gran efectividad que presentan los compuestos fenólicos de
ambas especies P.phyliciformis y P.lepidophylla sobre la inhibición del desarrollo de
G-6 Gráfico de la efectividad del
biofumigante M.albus, bajo un gradiente de
concentración, sobre limones inoculados
con P.digitatum, bajo 2 concentraciones de
inóculo, alto y bajo. (Mercier J. et al., 2005)
G-7 (Sayago E.J et al., 2011)Gráfico que se muestra la efectividad de los los compuestos
fenólicos extraídos a partir de aceites esenciales de plantas extremófilas (B) P.phyliciformis
(C) P.lepidophylla sobre P.digitatum
40
P.digitatum. Hay que destacar que a partir de una concentración de 400-500 mg/ml se
consigue llegar a una efectividad cercana al 90%. (Sayago E.J et al., 2011)
8.3 Componentes GRAS
Un compuesto se puede definir como GRAS, si no presenta ningún tipo de toxicidad en
los seres humanos y por tanto, el uso de estos compuestos en frutas y verduras no es
tan restringido como el uso de fungicidas de síntesis química. Estos compuestos son
sales orgánicas e inorgánicas que presentan un amplio espectro de acción contra
bacterias y hongos. El uso del sorbato potásico para el control del desarrollo de la
podredumbre causada por P.digitatum y P.italicum presenta una gran efectividad. Otro
compuesto muy utilizado es el ácido benzoico, también utilizado para el control
P.digitatum y P.italicum. Pese al uso generalizado de estos compuestos en los
diferentes tratamientos post-cosecha, no está aún bien definido el mecanismo de acción
de estas sales. Se piensa que están relacionados con la inhibición de funciones
metabólicas esenciales, disruptores de membrana o alteración de la homeostasis
(cambio de pH). En definitiva, su acción es fungistática, por lo que solo podrán impedir
el desarrollo del hongo durante el tiempo en el que se produzca el efecto, pero pasado
este tiempo, el hongo continuará con su desarrollo normal. Por otro lado, también se
piensa que están relacionados con la activación de las defensas naturales del cítrico.
(Talibi I. et al., 2014)
8.4 Conclusiones
El uso de fungicidas sintéticos han dado buenos resultados en el control post-cosecha
de la podredumbre de los cítricos, desde mediados del siglo XX. En el transcurso de los
años, se han ido desarrollando diversos fungicidas para combatir el desarrollo de las
especies que mayor incidencia presentan en los casos de podredumbre en los cítricos,
Penicillium digitatum y Penicillium italicum. Al mismo tiempo, se ha producido un
aumento en el número de cepas resistentes frente a los fungicidas más utilizados. Por
otro lado, el establecimiento de unas concentraciones máximas permitidas en los
fungicidas, que pueden considerarse como seguros para los consumidores, ha traído
consigo serios problemas de efectividad en los almacenes.
Además, se han desarrollado alternativas a los fungicidas de síntesis, como son los
aceites vegetales, controles biológicos e incluso la adición de compuestos GRAS. Sin
embargo, estas alternativas tienen una efectividad limitada En la actualidad, en los
41
diversos tratamientos post-cosecha se utilizan diversos fungicidas de síntesis en
combinación con los compuestos GRAS y aceites vegetales.
La combinación de diferentes tratamientos tiene que estar basado en 5 objetivos:
1. Que la efectividad del tratamiento combinado sea mayor que el uso individual de
los componentes, es decir, que exista sinergismo.
2. Que exista una complementariedad de los efectos que producen, de tal manera
que el tratamiento combinatorio tenga tanto efectos preventivos como curativos.
3. Bajo número de cepas resistentes al tratamiento.
4. Que controle y sea eficaz frente a las cepas resistentes a los fungicidas
sintéticos.
5. Que se reduzca la cantidad de fungicida de síntesis química utilizado.
La combinación de controles biológicos con otros métodos, sigue siendo hoy en día muy
poco eficaz. Principalmente, esto es debido a que los microorganismos utilizados como
organismos control son susceptibles también a algunos de los mecanismos de acción
propios de los fungicidas.
En la actualidad, tienen bastante éxito el uso combinado de componentes GRAS junto
con fungicidas de síntesis químicas y también el uso de aceites esenciales. Con estos
tratamiento combinados, se consigue reducir el número de cepas resistentes y además,
reducir la concentración de fungicidas de síntesis aplicados. (Talibi I. et al., 2014 Timmer
L.T et al., 2002; Barkai-Golan R, 2011; Wardowski W.F et al., 2006)
9. Conclusión final
Obtener información referente a los hongos del género Penicillium responsables
de más del 80% de los casos de podredumbre en cítricos.
La podredumbre de los cítricos es causada principalmente por los hongos del
género Penicillium spp. Concretamente, existen 2 especies dentro de este género que
son los responsables de este efecto. Se trata de las especies Penicillium digitatum y
Penicillium italicum. La especie Penicillium digitatum tiene una incidencia de más del
60% de los casos de podredumbre en cítricos, en cambio la especie Penicillium
italicum presenta una incidencia del 40%. Estas dos especies presentan los mismos
efectos fisiológicos en el fruto, es decir, ablandamiento y decoloración progresiva de la
epidermis de la superficie.
42
Conocer los diferentes tratamientos fungicidas y los parámetros que inhiben el
crecimiento de los hongos causantes de la podredumbre por hongos del género
Penicillium.
El desarrollo de los hongos causantes de la podredumbre está condicionado
por determinados factores, como la temperatura, humedad y estado de madurez del
fruto. Cabe destacar el uso de cámaras de refrigeración que reducen los casos de
podredumbre en cítricos, durante su almacenaje. Desde la primera mitad del siglo XX,
con el SOPP (sodium ortho-phenylphenate), se han ido desarrollando diversos
fungicidas de síntesis que han sido bastante efectivos en el control de los hongos
causantes de la podredumbre. Sin embargo, en las dos últimas décadas, la
proliferación de cepas resistentes a los tratamientos fungicidas de síntesis, ha llevado
consigo al desarrollo de tratamientos alternativos que reduzcan los efectos de la
podredumbre.
Realizar un estudio comparativo sobre los diferentes fungicidas de síntesis, en
referencia a su efectividad frente a Penicillium spp., la toxicidad que provocan en la
salud humana y los límites máximos de residuos aceptados en la UE.
Existen un total de 7 fungicidas de síntesis que tienen especial efectividad para
el control de los hongos del género Penicillium en cítricos. En primer lugar, el caso del
SOPP y también del thiabendazole, cabe destacar que estos fungicidas han sido
utilizados durante más de 40 años y que presentaban una gran efectividad, sin
embargo, en el transcurso de los años han ido apareciendo cepas resistentes y su
efectividad se ha reducido notablemente. Cabe destacar, que en el caso del SOPP si
no se toman determinadas precauciones en su aplicación, puede llegar a presentar
cierta fitotoxicidad y perjudicar la calidad de los cítricos.
Principalmente, el fungicida de síntesis más utilizado en los últimos 30 años ha sido el
imazalil. Este fungicida presenta una efectividad relativamente alta. Existen regiones
productoras de cítricos, donde actualmente se consigue una efectividad del 100% con
este fungicida. En otras regiones, como España o California han ido apareciendo
algunos casos de cepas resistentes a este fungicida. Otros fungicidas como
Prochloraz, Propiconazol o Pyrimethanil, que presentaban una elevada efectividad,
con el transcurso de los años se fueron desarrollando cepas resistentes que
conseguían desarrollar la infección a dosis elevadas. Las cepas resistentes adquirían
mutaciones genéticas en aquellas secuencias que sintetizaban para proteínas que
eran diana del fungicida. Con todo ello, la limitación de la concentración máxima
residual, es un impedimento para poder hacer frente a estas cepas resistentes. Por lo
43
que se desarrollaron otros fungicidas, con menor efectividad como el Fosetyl-Al, pero
con un límite máximo residual mucho mayor, 75 mg/Kg. Así como tratamientos
alternativos a los fungicidas de síntesis, como los compuestos GRAS, aceites
esenciales y/o controles biológicos.
Revisar los tratamientos alternativos para el control de los hongos Penicillium
digitatum y Penicillium italicum en el periodo post-cosecha de frutos cítricos.
Existen una gran variedad de tratamientos alternativos al uso de fungicidas de
síntesis. Estos tratamientos alternativos, tienen la ventaja de no ser tóxicos para el ser
humano y poder ser usado sin restricción de límites máximos. Sin embargo, no
presentan la efectividad que presentan el uso de los tratamientos tradiciones. Por
tanto, la solución que se ha llegado, es el uso combinatorio de los tratamientos
tradiciones junto a los tratamientos alternativos (controles biológicos, aceites
esenciales y componentes GRAS). De tal manera, se consigue reducir la
concentración final del fungicida de síntesis, para no sobrepasar el límite máximo
establecido y aumentar la efectividad fungicida que se producía al utilizar únicamente
los tratamientos alternativos.
44
10. Resumenes de las fuentes consultadas
Libros consultados:
Barkai-Golan R (2001), Postharvest Diseases of Fruits and Vegetables.
Development and Control Department of Postharvest Science of Fresh Produce,
Institute of Technology and Storage of Agricultural Products, The Volcani
Center, Israel. ELSEVIER. ISBN: 978-0-444-50584-2
Se trata de un libro que detalla mucho el proceso post-cosecha de frutas y
verduras en general. Habla de todos los hongos causantes de las diferentes
podredumbres y de cómo afectan a las diferentes frutas y verduras. Hace especial
referencia al mecanismo de acción de los hongos y de los posibles parámetros físico-
químicos que pueden reducir o incrementar el desarrollo de las enfermedades post-
cosecha. Tiene un capitulo en concreto, donde habla del caso particular de frutos
cítricos.
de Liñan C. (1997). Farmacología vegetal. Ediciones Agrotécnicos. Madrid
Se trata de un libro que presenta un recopilatorio de los compuestos de síntesis
química usados en las diferentes técnicas agroquímicas para frutas y verduras. En este
caso, se utiliza para conocer las características físico-químicas de los fungicidas de
síntesis química utilizados para el control fúngico en frutos cítricos.
Timmer L.T, Garnsey S.M, Graham J.H (2002) Plagas y enfermedades de los
cítricos. Ediciones Mundi—Prensa. The American Phytopathological Society.
Este es un libro que habla de las principales patologías que afectan a los frutos
cítricos, tanto en el desarrollo del fruto en el árbol como en el periodo post-cosecha.
Realiza una descripción detallada de cada una de las enfermedades, e incluso realiza
comentarios e indicaciones de los controles más eficientes que deberían de seguir para
no alterar la calidad final del producto.
Tuset J.J (1987) Podredumbre de los frutos cítricos. Institut valencià
d’investigacions agraries. Generalitat Valenciana. Conselleria d’agricultura i
pesca.
45
Se trata de un libro que habla únicamente de la podredumbre de cítricos, tanto en
los periodos de pre-cosecha como post-cosecha, en la Comunidad Valenciana. Hace
referencia también, a los posibles tratamientos existentes para combatir o evitar que se
desarrolle esta podredumbre. Sin embargo, este libro está editado a finales de la década
de los 80, por lo que muchos de los avances en tratamientos post-cosecha no los
recoge.
Wardowski W.F, Miller W, Hall J.D, Grierson W (2006) Fresh Citrus Fruits. Second
Edition. Florida Sciences Source, Inc. Longboat Key, Florida.
En este libro se encuentra mucha información en referencia a la industria citrícola
en California. Se habla de los principales factores que afectan al desarrollo del fruto
cítrico, partiendo de la floración, hasta la completa maduración del fruto. Seguidamente,
también se habla del proceso de recolección y de los siguientes procesos post-cosecha
que pueden afectar a la calidad de los frutos cítricos para su venta y distribución.
Artículos científicos consultados:
Barmore R.C, Brown E.G. (1982) Spread of Penicillium digitatum and Penicillium
italicum during contact between citrus fruits. Phitopathology 72:116:120
Los principales hongos que causan la podredumbre en los cítricos son
P.digitatum y P.italicum. Pero se ha visto, que la adición del ácido orgánico galacturónico,
que es liberado de las glándulas sebáceas de la propia piel del fruto, aumenta mucho la
probabilidad de que germinen aquellas esporas presentes en heridas de piel. Se ha
comprobado que este acido, se secreta cuando el proceso de lavado de las frutas es
intenso, y se producen daños fisiológicos que rompen las glándulas sebáceas.
Boubaker H, Sandi B and Benaoumar A.A. (2009) Sensitivity of Penicillium
digitatum and P.italicum to Imazalil and Thiabendazole in Moroco. Plant pathology
Journal 8 (4): 152-158. 2009
En este artículo se habla de la importancia que presenta el control del podrido
verde y azul P.digitatum y P.italicum en cítricos cultivados en una región de Marruecos.
Se llega a la conclusión de que la efectividad del imazalil frente a las especies
P.digitatum y P.italicum es mayor que los otros fungicidas utilizados. Además de ello, el
fungicida thiabendazole presenta un gran número de resistencias.
Bull C.T, Wadsworth, Sorensen K.N, Takemoto Y.J, Austin K.R and Smilanick L.J.
46
(1998) Syringomycin E producedby biological control agents controls Green mold
on lemons. Biological control 12, 89-95 (1998)
Las cepas ESC-10 y ESC-11 de la bacteria Pseudomonas syringae inhibe el
desarrollo de hongos causantes de la podredumbre de cítricos, como P.digitatum o
Geotrichum spp. En este artículo, se observó el efecto de la syringomycina E, que es el
biocida sintetizados por la bacteria, que tiene propiedades fungicidas para P.digitatum.
Se trata de un tratamiento alternativo a los fungicidas de síntesis química. Estos
productos han sido comercializados en Estados Unidos, en los que no se detectó efectos
negativos en humanos y tampoco daños en la superfície de limones y naranjas
Bus G.V, Bongers J.A, Risse A.L. (1991) Ocurrence of Penicillium digitatum and
P.italicum resistant to Benomyl, thiabendazole, and imazalil on citrus fruit from
different geographic origins. Plant Dis. 75:1098-1100
En este artículo se realiza un estudio a nivel mundial, de las principales zonas de
producción de cítricos y determinan la eficacia de los fungicidas thiabenazole e imazalil.
Cabe destacar, las zonas productoras de Brasil o Florida, donde el fungicida
thiabendazole no tiene efectividad en ninguno de los aislados de Penicillium italicum, en
cambio presenta 100% de efectividad para el fungicida imazalil. Por otro lado, en el caso
de la especie P.digitatum, existen varias zonas productoras que presentan doble
resistencias (thiabendazole e imazalil). España presentaba un 12% de casos de doble
resistencias, en cambio, no presentaba ninguna doble resistencia para la especie
P.italicum.
D’aquino S, Schirra M, Cabras P and Migheli Q. (2006) Residue levels and
effectiveness of Pyrimethanil vs Imazalil when using heated Postharvest Dip
treatments for control of Penicillium decay on citrus fruit. J.Agric. Food Chem.
2006, 54, 4721-4726
El fungicida pyrimethanil tiene aplicación como fungicida en el control de la
podredumbre de cítricos. Se realizó una comparativa entre la penetrabilidad que
presentaban el imazalil y el pyrimethanil bajo 2 diferentes condiciones de aplicación del
tratamiento:
Por una parte, se realizó la aplicación utilizando agua sin calentar (20C)
Por otro lado, se realizó la aplicación del fungicida utilizando agua calienta (50C).
Se observó que presentaba una mejor penetrabilidad cuando se utilizaba agua caliente.
Además de ello, se observó un mayor efecto fungicida cuando se utilizaba el
pyrimethanil con agua caliente frente al imazalil con agua caliente.
47
Dikic D, Andeka L.I, Rogie D. (2011) Carbendazim impends hepatic necrosis when
combined with imazalil or cypermethrin. Basic & clinical Pharmacology &
toxicology. Nordic Pharmacology society, 2012, 110, 433-440
En este artículo se realiza un estudio toxicológico de diferentes pesticidas
presentes en los alimentos, entre ellos el fungicida imazalil. Se observó el efecto del
fungicida, debido a la ingesta prolongada de una dosis de 10mg/kg, muy superior al LMR
permitido por la Unión Europea. Los resultados no mostraron efectos toxicológicos muy
graves, sin embargo, la combinación de este fungicida con otros pesticidas como el
carbendazim mostraba síntomas de necrosis isquémica en el hígado.
Ghosoph M.J, Schmidt L.A, Margosan D.A, Smilanick J.L. (2006) Imazalil
resistance linked to unique insertion sequence in the PdCYP51 promoter region of
P.digitatum. Postharvest Biology and Technology 44 (2007), 9-18
La efectividad del fungicida imazalil contra Penicillium Spp. está datada en una
concentración efectiva, de alrededor de 0,1 ug/mL. En cambio, en aquellas cepas que
son resistentes a imazalil, se necesitan dosis más elevadas del fungicida para obtener
el mismo efecto. El mecanismo de acción de este fungicida, es el de inhibir la síntesis
de ergosterol. Se ha descubierto recientemente, que existe un gen (CYP51) que se cree
el responsable de la resistencia de determinados biotipos. Esto es debido, a que este
gen, en algunos biotipos, se encuentra sobre-expresado. Este gen está relacionado con
la actividad del citocromo p/450. Al encontrarse sobre-expresad, precisa de una mayor
concentración de fungicida para obtener el mismo efecto e inhibir la síntesis de
ergosterol que es fundamental para el desarrollo de la enfermedad producida por estos
hongos.
Holmes G.J, Eckert W.J (1995) Relative fitness of Imazalil-Resistant and sensitive
biotypesof Penicillium digitatum. The American Phytopathological Society. Plant
disease/Vol.79 No10
La utilización del fungicida imazalil para contrarrestar los efectos de la
podredumbre en cítricos es muy generalizada, debido a su efecto curativo y anti-
esporulante. Sin embargo el uso prolongado de altas concentraciones de imazalil, al
igual que con los fungicidas thiabendazole y SOPP ha traído consigo el desarrollo de
cepas resistentes, que precisan de altas concentraciones del fungicida para ser efectivo.
48
Boubaker H, Sandi B and Benaoumar A.A. (2009) Sensitivity of Penicillium
digitatum and P.italicum to Imazalil and Thiabendazole in Moroco. Plant pathology
Journal 8 (4): 152-158. 2009
P.digitatum y P.italicum son los causantes de las enfermedades post-cosecha
más importantes. Se reproducen en poco tiempo y además pueden llegar a producir
entre 1 y 2 billones de conidios efectivos para colonizar nuevos frutos. En los últimos
años se han utilizado 3 fungicidas principalmente para el control de estas
enfermedades, con distinto resultado post-cosecha. Se llega a la conclusión de que,
recientemente han ido desarrollando numerosos casos de cepas resistencias a los
fungicidas utilizados generalmente.
Kanetis L, Förster H, Jones C.A, Borkovich K.A and Adaskaveg E.J (2008)
Characterization of Genetic and Biochemical Mechanisms of Fluodioxinil and
Pyrimethanil Resistance in Field isolates of Penicillium digitatum. Phitopathology
98:205-214
El fungicida pyrimethanil es un fungicida que pertenece a la família anilinopyrimidine. Ha
sido usado desde la dècada de los 90 para el control de Bortrytis cienerea, pero se ha
podido observar que presenta cierta efectividad para el control de las especies del
genero Penicillium spp. Al parecer, existent ciertas cepas con semejantes mutaciones
genéticas que son resistentes al fungicida pyrimethanil.
Liu J, Yuan Y, Wu Zhi, Li Na, Chen Y, Tingting Q, Geng H, Xiong L. (2015) A novel
sterol Regulatory element-binding potein gene (sreA) Identified in Penicillium
digitatum is required for Prchloraz resistance, full virulence and erg11 (cyp51)
regulation. PLOS ONE DOI:10-1371
En los últimos años, el uso extensivo de fungicidas triazoles, como el
prochloraz, ha desencadenado a la aparición de cepas resistentes. En este artículo se
identificó el genoma de una cepa que era resistente frente al prochloraz, cuyo gen (sreA)
era responsable de esta resistencia. La delección de este gen, de la cepa resistente,
sirvió para aumentar la susceptibilidad frente al fungicida. Se vió, que en estas cepas,
cuando se aplicaba el fungicida prochloraz, se activaban los genes de virulencia
CYP51A y CYP51B, por lo que se concluyó que el gen sreA, es un gen que codifica para
un factor crítico de transcripción, y que cuando se delecciona, inhibe la expresión de los
genes CYP51.
49
López-Pérez., Ballester A, Gonzalez-Candelas L. (2014) Identification and
functional analysis of Penicillium digitatum genes putatively involved invirulence
towards citrus fruit. Mol Plant Pathol. 2015 Apr;16(3):262-75.
Penicillium digitatum es un hongo filamentoso que causa la mayoría de las
perdidas post-cosecha en frutos cítricos. En este artículo se obtuvieron los genes que
se codifican en el momento de infección del hongo en el fruto. Codifican para proteasas/
peptidasas (30% de las secuencias), hidrolasas y enzimas relacionadas con la
detoxificacion y procesos redox. El éxito del proceso de infección depende de la
habilidad de penetración y colonización del huésped a la piel, así como de la habilidad
por degradar y obtener los nutrientes necesarios para su desarrollo.
McKay A.H, Förster H, and Adaskaveg J.E Efficacy and Application Strategies for
Propiconazole as a New Postharvest Fungicide for Managing Sour Rot and Green
Mold of Citrus Fruit. Plant Dis. 96:235-242
La efectividad de los fungicidas tradicionales usados para combatir el desarrollo
de Penicillium spp. ha traído consigo el desarrollo de cepas resistentes. El uso de
nuevos fungicidas de síntesis como el propiconazol, que presenta su mecanismo de
acción en la inhibición del desarrollo de la biosíntesis de ergosterol, como alternativa.
Sin embargo, las cepas resistentes al imazalil o al prochloraz presentan una mutación
en el en CYP51 que también es resistente para porpiconazol, ya que presenta el mismo
mecanismo de acción.
Maldonado C.M, Runco S.R., Navarro. R.A. (2005) Isolation, identification and
antifungal susceptibility of lemon pathogenic and non pathogenic fungi. Instituto
de Biotecnología, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad
Nacional de Tucumán, República Argentina.
El propósito de este trabajo, es aislar en diferentes muestras afectadas por la
infección de diferentes hongos patógenos de cítricos e incubarlos en medios de cultivo
fortificados con diferentes tratamientos fungicidas a diferentes concentraciones, para
determinar la sensibilidad/resistencia de los diferentes fungicidas. En este caso se utilizó
SOPP, Imazalil y Thiabendazole. Observándose, que las especies P.digitatum y
P.italicum son sensibles frente al fungicida imazalil y resistentes al thiabendazole. En
cuanto a SOPP, la sensibilidad era moderada.
50
Mercier J, Smilanick L.J. (2005) Control of Green mold and sour rot of stored lemon
bybiofumigation with Muscodor albus. Biological control 32 (2005) 401-407
En este artículo se observó el efecto inhibitorio del crecimiento para el hongo causante
de la podredumbre verde, P.digitatum mediante el uso de un biofumigante. Este bio-
fumigante está compuesto por compuestos volátiles, a partir, del hongo M.albus. La
efectividad del tratamiento empieza al pasar 24 horas de la aplicación del mismo. La
efectividad es muy variable, pero sí que se observa una proporcionalidad directa entre
la concentración y el efecto fungicida.
Palou L (2014) Penicillium digitatum, Penicillium italicum (Green Mold, Blue Mold).
Laboratori de Patologia, Centre de Tecnología postcollita (CTP), Institut Valencià
d’investigacions agràries (IVIA). Montcada, València, Spain.
En esta revisión, se habla de la importancia que presenta la podredumbre de
los cítricos, debido principalmente a la acción de P.digitatum y P.italicum. Además,
también se habla de la sintomatología que presenta el desarrollo de la enfermedad en
el cítrico y los mecanismos de control más importantes. Por último, hace referencia a
algunos de los controles alternativos que existen, frente al uso general de los fungicidas
en la industria post-cosecha en la actualidad.
Paris M. and Gottlieb D. (1970) Mechanism of action of the Fungicide
Thiabendazole, 2-(4’ Thiazolyl) Benzimidazole. Applied Microbiology, Dec, 1970 p.
919-926
El fungicida thiabendazole perteneciente a la familia benzimidazole , inhibe el
desarrollo de Penicillium spp. a concentraciones de 8 a 10 µg/ml. Su principal
mecanismo de acción es el de la inhbición de la mitosis en el desarrollo de las celulas
fúngicas. Otro mecanismo de acción importante, es el de la inhbición de la respiración
mitocondrial. En este artículo se determina la efectividad de este fungicida en referencia
a la disminución de la actividad del enzima succinato de la mitocondria.
Sayago E.J, Ordoñez M.R, Kovacevich N.L, Torres S. (2011) Antifungal activity of
extracts of extremophile plants from the Argentine Puna to control citrus
postharvest pathogens and Green mold. Postharvest Biologyand Technology 67
(2012) 19-24
En este artículo se estudió el efecto antifúngico de unos compuestos volátiles,
principalmente feólicos, extraídos de unas plantas extremófilas en Argentina. Se estudió
la efectividad de estos aceites esenciales, para el control de P.digitatum en limones.
51
Obteniéndose una efectividad cercana al 90% en las especies P.phyliciformis y
P.lepidophylla.
Talibi I, Boubaker H, Boudyach E.H and Ben Aoumar A.A. (2014) Alternative
methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied
Microbiology 117, 1-17
Las enfermedades post-cosecha son la causa de granes pérdidas durante el
almacenaje y transporte de frutos cítricos. Principalmente, para contrarrestar estas
pérdidas, se han utilizado a lo largo de los anos, la aplicación de fungicidas de síntesis.
Sin embargo, el aumento de enfermedades crónicas y la contaminación ambiental, así
como la aparición de resistencias a los tratamientos han traído consigo un cambio de
las estrategias post-cosecha tomadas por tal de reducir el uso de fungicidas de síntesis.
Existen alternativas efectivas al uso de fungicidas de síntesis como el control biológico
de levaduras y bacterias o la aplicación de sustancias de origen natural, obtenido de las
planta, que impiden el desarrollo de los hongos parásitos causantes de la podredumbre.
Vinggaard M.A, Hass U, Dalgaard M, Andersen R.H, Bonefeld-Jorgensen,
Christiansen S, Laier P and Poulsen E.M (2005) Prochloraz: an imidazole fungicide
with multiple mehanisms of action. Department of toxicology and Risk assesment.
International journal of andrology 29 (2006) 186-192 ISSN 0105-6263
En este artículo se estudió los efectos androgénicos que presentaba el fungicida
prochloraz sobre las ratas a corto y largo plazo. En ambas situaciones se observó una
reducción del tamaño de las vesículas seminales en ratas macho. En el estudio a largo
plazo, se observó además de la reducción del tamaño de las vesículas, un
comportamiento “feminizado” en las crias de rata macho
Wang J, Yu J, Liu J, He M, Liu D. (2014) Novel mutations inCYP51B fro Penicillium
digitatum involved in prochloraz resistance. Journal of Microbiology (2014) Vol.52,
No.9, pp. 762-770
El fungicida prochloraz presenta su principal acción en la inhibición de la síntesis
de ergosterol, caracterisitca común que presentan todos los fungicidas denominados
triazoles. En este artículo se observa, que las cepas que son resistentes a este fungicida
presenta una mutación en el gen CYP51. Mediante diferentes técnicas de bilogía
molecular se detectó que este gen, es uno de los genes que regula la síntesis del
ergosterol. Al parecer, esta mutación le otorga cierta resistencia a la acción inhibitoria
de la síntesis de ergosterol
52
Wild L, Bild. (1994) Differential sensitivity of citrus Green mould isolates
(Penicillium digitatum) to the fungicide Imazalil. Postharvest Group, New South
Wales Agriculture, P.O.ox581, Gosford, NSW, 2250, Australia.
La utilización de imazalil como fungicida para el control de la podredumbre
causada por Penicillium digitatum es generalizada por la totalidad de almacenes que
tratan a los frutos cítricos. La concentración de referencia usada fue de 0,1ug/mL.
Existen cepas que son resistentes a ciertas concentraciones del fungicida. Se utilizó la
técnica de determinación de EC50 mediante medios de cultivo fortificados. Se comprobó
también, que al aumentar la concentración del fungicida utilizado, se conseguía reducir
el número de cepas resistentes, así como el halo de crecimiento.
53
11.REFERENCIAS
Barkai-Golan R (2001), Postharvest Diseases of Fruits and Vegetables.
Development and Control Department of Postharvest Science of Fresh
Produce, Institute of Technology and Storage of Agricultural Products, The
Volcani Center, Israel. ELSEVIER. ISBN: 978-0-444-50584-2
Barmore R.C, Brown E.G. (1982) Spread of Penicillium digitatum and
Penicillium italicum during contact between citrus fruits.Phitopathology
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digitatum and P.italicum to Imazalil and Thiabendazole in Moroco. Plant
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P.italicum to Postharvest Citrus fungicides in California. Phytopathology 89:716-
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sensitive biotypesof Penicillium digitatum. The American Phytopathological
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Pyrimethanil Resistance in Field isolates of Penicillium digitatum.
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novel sterol Regulatory element-binding potein gene (sreA) Identified in
Penicillium digitatum is required for Prchloraz resistance, full virulence and
erg11 (cyp51) regulation. PLOS ONE DOI:10-1371
López-Pérez., Ballester A, Gonzalez-Candelas L. (2014) Identification and
functional analysis of Penicillium digitatum genes putatively involved invirulence
towards citrus fruit. Instituo de Agroquímica y tecnología de alimentos (IATA-
CSIC), Mol Plant Pathol. 2015 Apr;16(3):262-75.
Maldonado C.M, Runco S.R., Navarro. R.A. (2005) Isolation, identification and
antifungal susceptibility of lemon pathogenic and non pathogenic fungi. Instituto
de Biotecnología, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad
Nacional de Tucumán, Tucumán, República Argentina
Mercier J, Smilanick L.J. (2005) Control of Green mold and sour rot of stored
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McKay A.H, Förster H, and Adaskaveg J.E Efficacy and Application Strategies
for Propiconazole as a New Postharvest Fungicide for Managing Sour Rot and
Green Mold of Citrus Fruit. Plant Dis. 96:235-242
McKay A.H, Förster H and Adaskaveg J.E (2011) Toxicity and resistance
potential of selected fungicides to Galatomycs and Penicillium spp.causing
postharvest fruit decays or citrus and other crops. Plant DIs. 96:87-96
Paris M. and Gottlieb D. (1970) Mechanism of action of the Fungicide
Thiabendazole, 2-(4’ Thiazolyl) Benzimidazole. Applied Microbiology, Dec, 1970
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Palou L (2014) Penicillium digitatum, Penicillium italicum (Green Mold, Blue
Mold). Laboratori de Patologia, Centre de Tecnología postcollita (CTP), Institut
Valencià d’investigacions agràries (IVIA). Montcada, València, Spain.
Sayago E.J, Ordoñez M.R, Kovacevich N.L, Torres S. (2011) Antifungal activity
of extracts of extremophile plants from the Argentine Puna to control citrus
postharvest pathogens and Green mold. Postharvest Biologyand Technology 67
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Talibi I, Boubaker H, Boudyach E.H and Ben Aoumar A.A. (2014) Alternative
methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied
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cítricos. Ediciones Mundi—Prensa.The American Phytopathological Society
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d’investigacions agraries. Generalitat Valenciana. Conselleria d’agricultura i
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