toxicologia experimental
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Toxicologgia experimental, forma de desarrollar estudios de toxico en animales y otras fuentes, para determinar DL50TRANSCRIPT
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Prof. J. Fernando Torres M. (QF)
Prof. Aleida Kulikoff B. (QF)
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Principios Generales para los estudios de Toxicidad
Año 1967 Consejo de la ComunidadEuropea clasificación y etiquetado de las
sustancias químicas legales
En Europa: existe una uniformidad de criterios en cuanto a la clasificación de las sustancias químicas según su peligrosidad para los seres vivos y los ecosistemas
Y ensayos experimentales que se deben realizar para valorar la peligrosidad de cada sustancia antes de su comercialización
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Los efectos peligrosos para la salud se
han subdividido (1995 / CEE) :1. Efectos letales agudos: luego de 1 sola exposición2. Efectos irreversibles no letales: tras una sola
exposición3. Efectos graves tras exposición repetida o
prolongada4. Efectos corrosivos5. Efectos irritantes6. Efectos sensibilizantes7. Efectos carcinogénicos8. Efectos mutagenicos9. Efectos tóxicos para la Reproducción y Desarrollo
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Una vez clasificada la sustancia, después de los respectivos estudios experimentales, se debe etiquetar:
Etiqueta apropiada
Incluir:•Explicaciones sobre riesgos específicos (frases y símbolos)
•Consejos de prudencia (frases y símbolos)
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Pictogramas
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El conocimiento de la toxicidad de las sustancias seobtiene:
• Previsiones teóricas• Estudios retrospectivos en caso de intoxicación• Ensayos experimentales en animales y plantas• En muy contadas ocasiones en humanos (implicaciones
éticas y legales)
Toxicidad humana estimada, se obtiene de estudiosRetrospectivos sobre intoxicaciones
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La toxicidad es el grado de efectividad de una sustancia
tóxica en humanos, animales, plantas o microorganismos.
Este efecto adverso puede tomar varias formas, como:
enfermedad, deformidad, modificaciones del comportamiento,
cambios en la reproducción, daño genético o muerte.
La toxicidad se evalúa mediante bioensayos que consisten en
Exponer organismos vivos (algas, bacterias, vegetales y fauna
en general) a sustancias tóxicas a diferentes concentraciones
y registrar los efectos sobre los mismos.
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Finalmente, se determina para cada concentración el
número de organismos afectados, dato con el que se
pueden establecer varios parámetros:
CL50 (Concentración letal media). Concentración de tóxico que mata 50% de los organismos ensayados.
CE50 (concentración efectiva media). Concentración de tóxico que produce 50% del efecto tomado como indicador de toxicidad.
Concentración inhibitoria. Concentración de tóxico que inhibe un proceso biológico, tal como la reproducción en un determinado porcentaje.
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Para todos los parámetros definidos anteriormente, cuanto menor sea el valor de CL50 para un determinado producto,
más elevada será su toxicidad
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Los indicadores de contaminación calibran la calidad del
ecosistema a través de información que es recogida en el
agua, en la atmósfera o en el suelo, y permiten identificar,
dentro de un marco de calidad, el nivel de deterioro
ambiental. (Shimkin, 1996)
Los bioindicadores son organismos o sistemas biológicos que
Sirven para evaluar variaciones en la calidad ambiental.
• Bioindicadores: presentan efectos visibles tras ser
expuestos a la contaminación.
• Bioacumuladores: no presentan efectos visibles tras su
exposición, sino que acumulan el contaminante.
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Tipos de bioindicadores
MicroorganismosLíquenes y hongosPlantas
MamíferosAvesAnfibios y ReptilesPecesInvertebrados
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Larvas de rana Daphnia magna
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Estudios Toxicológicos en plantas
Se aplican a:Estudios de productos fitosanitarios
Estudios de fitotoxicidad de productos agrícolas
Estudios del metabolismo, transformación y retención de sustancias toxicas por vegetales de consumo animal y humano (Limite máximo de residuos –LMR-)
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Conocer los efectos fitotóxicos que provoca un compuesto permite valorar y determinar los factores de riesgo
asociados a su exposición, así como el grado de tolerancia o sensibilidad de la planta examinada.
En conjunto, esto puede aportar mayor certeza, aunque no contundente, para vislumbrar el impacto ambiental y poder
también atribuir a una especie el papel de bioindicador ambiental para un contaminante o conjunto de ellos.
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La fitotoxicidad de un contaminante se evalúa por medio del análisis cualitativo y cuantitativo del efecto provocado en uno o más parámetros fisiológicos que se consideran relevantes o representativos.
En este sentido, es común que las pruebas de fitotoxicidad estén orientadas a la valoración de:
1) la mortalidad (toxicidad aguda)2) el índice de germinación3) la elongación radicular4) el crecimiento o producción de biomasa5) el contenido de clorofila6) la tasa fotosintética,
entre otras.
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Ventaja en el uso de plantasLas plantas superiores son ampliamente utilizadas por
ser organismos eucarióticos y por lo tanto más comparables a
la mayoría de las especies de la flora y la fauna superiores
constituyen una eficiente herramienta de trabajo para
medir alarma de peligro ambiental
poseen las siguientes ventajas:Las plantas son más sensibles a estrés ambiental que otros sistemas de
ensayos disponibles. Fácil manipulación y almacenajeBajo costoBuena correlación con otros sistemas de pruebas
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Entre las pruebas a corto plazo con plantas que más se han utilizado para la evaluación toxicológica ambiental se encuentran:
1.- Prueba de toxicidad a corto plazo de la prolongación de la raíz de un vegetal
Justificación para realizar este bioensayo radica en:La importancia de eventos de desarrollo temprano en el crecimiento y
supervivencia de las plantas. La prolongación de la raíz es inhibida a concentraciones más bajas de
Las sustancias tóxicas que para el caso de la germinación de las
Semillas por lo tanto, puede ser un indicador más sensible de efectos biológicos.
Este bioensayo puede ser ejecutado con cualquier número de especies,
las cuales resulten económicamente importantes, sean fácilmente
disponibles, germinen y crezcan rápidamente.
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Se han desarrollado técnicas con plantas de interior y cultivos de algas en placas de agar
Placas de agar
microalgas
Discos de papel impregnados con la sustancia sospechosa
•Presencia de Paraquat: aparición de halos de inhibición en el cultivo•Herbicidas hormonales: estimulan el crecimiento, halos de gran densidad•Herbicidas carbamatos o Triazínicos: estimulan el crecimiento, halos de gran densidad
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Bioensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
Es una prueba estática de toxicidad aguda (120 h de
exposición) en la que se pueden evaluar los efectos
fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas
en el proceso de germinación de las semillas y en el
desarrollo de las plántulas durante los primeros días de
crecimiento.
Punto final para la evaluación de los efectos fitotóxicos, inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo.
Durante el periodo de germinación y los primeros días de desarrollo de la
plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de
una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo
normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a
factores externos adversos
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A diferencia del bioensayo tradicional de germinación de semillas, la
evaluación del efecto en la prolongación de la radícula y del
hipocotilo de las plántulas permite:
Evaluar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en concentraciones tan bajas que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sí pueden retardar o inhibir completamente los procesos de prolongación de la raíz o del hipocotilo, lo que depende del modo y sitio de acción de los contaminantes
Este ensayo evalúa los constituyentes solubles del agua
* aguas superficiales
* aguas subterráneas
* suelos o eluatos de sedimentos
* y lixiviados
teniendo en cuenta para el resultado, la cantidad de semillas
germinadas y la media del crecimiento de la raíz. Se calcula la EC50
que no es más que la concentración que reduce la longitud de la raíz
en un 50 % en relación con el control.
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2.- Bioensayo para la estimación de la toxicidad por la medición de la media del crecimiento de la raíz de cebollas (Allium cepa L)
Este método es una herramienta fácil y sensible para la
medición de la toxicidad total causada por tratamientos de
sustancias químicas.
Los resultados de este ensayo se ajustan bien a una
batería de pruebas compuesta por organismos procariontes
y/o eucariontes.
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Estimación de la toxicidad por la medición de la media del crecimiento de la raíz de cebollas (Allium cepa L)
Es aplicable a los siguientes tipos de muestras:
Aguas naturales (lagos, ríos y pozos).Agua potable (agua de grifo diferentes tuberías)Aguas residuales domésticas e industriales,
incluyendo lodos y lixiviados.Sustancias químicas solubles en agua y con
sustancias químicas insolubles en agua y solventes.
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El ensayo con bulbos de cebolla (Allium cepa L.): es un bioensayo de toxicidad aguda (72 horas) semiestático
(con renovación diaria de la solución de ensayo). Como punto final de evaluación de efectos fitotóxicos se
cuantifica la inhibición promedio en la prolongación de las raíces del bulbo.
El grado de toxicidad de las sustancias químicas de prueba es estimado por la medición de la longitud de cada uno de los bultos de las raíces
10 cebollas son empleadas para cada concentración o menos en dependencia de si sólo están disponibles pequeñas cantidades de muestra
Para el reporte de la prueba, se toma un valor medio del crecimiento para cada una de las series. También se calcula la EC50.
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Con el empleo de esta prueba en el monitoreo de aguas residuales se demuestra también su alta correlación con otros sistemas de ensayo, involucrando la toxicidad general (crecimiento de las raíces) y la genotoxicidad (aberraciones cromosómicas).
Por otra parte, se sugiere el empleo de la prueba como un bioensayo normado para el monitoreo ambiental.
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En el año 2000 se desarrolló el denominado proyecto
WaterTox **
prueba novel que comprendió a instituciones de diferentes
países con el objetivo de desarrollar y evaluar una batería
de bioensayos simples, baratos y prácticos
Con el fin de probar la toxicidad de muestras de agua para
consumo humano
Fueron incorporadas tanto la prueba con Lactuca sativa L.
como con Allium cepa L.
Lo que resultó de gran utilidad como herramienta para su
empleo en la evaluación toxicológica de muestras ambientales
**Promovido por el Centro Internacional para el Desarrollo y la Investigación de Canadá
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Experimentación con Animales:
Fue utilizado por antiguos Farmacólogos y Toxicólogospara establecer principalmente DL50 (1900)
Presión de sociedades protectoras mayor sensibilización disminución en el uso de animales métodos alternativos
1990 aprox.: se han establecido normas éticas y aspectos regulatorios, sin menoscabo del progreso científico
“El toxicólogo tiene el deber moral de diseñar sus experimentos de forma que obtenga la
mayor cantidad de información posible a partir del menor numero de animales”
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Se ha optado por realizar estudios toxicológicos
alternativos y cuando ya se han obtenido un buen numero de datos y alcanzado suficientes conocimientos sobre un
determinado toxico se procede a realizar estudios en animales
esto supone una reducción en el número de estos.
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Los estudios toxicológicos experimentales se basan en 4 aspectos generales:
a) Especie animal a utilizarb) Número total y grupo de animalesc) Vías de administración del tóxicod) Tiempo de duración del estudio
Estos pueden variar dependiendo del estudio que se va a realizar
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a) Especie animal
Por lo general se usan animales pequeñosRatónHamsterRataCobayoConejo Perro
En casos mas concretos:AvesPecesGatosMonos
Los animales transgénicos se usan
para estudios muy particulares
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Para mayor seguridad y fiabilidad de los datos
experimentales:• Utilizar siempre mas de una especie animal
• Si utilizan roedores, repetir los ensayos en otros no roedores
• Utilizar siempre la mitad de los individuos de cada sexo
• Si se usan individuos de un solo sexo, debe quedar consignado en los resultados del estudio
• Animales procedentes siempre de un Bioterio garantizado (asegura el empleo de animales sanos, de una cepa estabilizada, con alimentación apropiada y adecuada higiene)
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Casos especiales:
Usar solo individuos Homocigotos
Usar individuos Consanguíneos (cruce entre hermanos en sucesivas generaciones)
Esterilidad especial se induce el nacimiento de los animales mediante cesárea y son conservados y criados en lugares y con alimentación estéril **
Embarazo programado fetos de tiempo apropiado al estudio (seguimiento al ciclo estral de las hembras: extracción de células vaginales, diariamente, observación microscópica. Aparición de celulas cornificadas apareamiento del animal)
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** Clasificación de los animales de laboratorio según flora bacteriana
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Vía de Administración
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Otros lineamientos generales:
Adquisición de nuevos animales o traslados cuarentena
Una semana ratasUn mes perros
Después de utilizar a los animales en un estudioToxicológico no deben utilizarse en otro
experimento
Obligatorio cumplir con los códigos de las GLP (Good Laboratory Practice)
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* Numero de animales
“En cualquier grupo de experimentación, siempre habráuno que es mas sensible y otro mas resistente a los
efectos del toxico estudiado”
* Por lo general, la frecuencia de animales sensibles sedistribuirá de forma gaussiana en relación al logaritmode la dosis (ver gráfico)
* Para el cálculo del numero de animales se realizanpreviamente estudios estadísticos, pero siempre disminuyendo lo mas posible el número de animales
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* Vía de administración experimental
Se establece dependiendo del tipo de producto
En lo posible se elige la vía de administración por la cual el hombre la absorbe
Oral oral
Cutáneo cutáneo
Parenteral parenteral
Contaminante atmosférico vía inhalatoria y cutánea
H A
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Es importante estudiar la naturaleza del vehículo o medio de dilución empleado
También el estudio de un grupo de “animales control”
A ellos se aplica el vehículo o medio solo, en idénticas condiciones ambientales y alimentarias
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* Tiempo de duración del estudio de toxicidad
1. Una sola administración Toxicidad aguda
2. Tratamientos durante periodos cortos Toxicidad Subcronica o Toxicidad por dosis repetidas
3. Periodos medios o largos Toxicidad Crónica
Siempre tener presente:•La observación a largo plazo•Posible aparición de carcinogénesis y teratogénesis•Modificación de la fertilidad•Expresiones de toxicidad para la fertilidad y el desarrollo
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Estudios de Toxicidad en animales
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Estudios de Toxicidad en animales
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Estudios de Toxicidad en animales
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Carcinogénesis
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Mutagenesis
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“El toxicólogo tiene el deber moral de diseñar sus experimentos de forma que obtenga la
mayor cantidad de información posible a partir del menor numero de animales”