TOXICOLOGIA DEL OZONO

Ricardo González AlvarezSilvia A. Menéndez Cepera

En los últimos años, el ozono es reconocido en frecuentes publicaciones,como un importante contaminante del aire ambiental con potente poder oxi-dante, capaz de producir efectos adversos para la salud cuando se pone encontacto con las vías aéreas, tanto de humanos como de animales.u A con-tinuación, se refieren los efectos del ozono, por vía inhalatoria, en diferentesórganos.

2.1. EFECTOS DEL OZONO EN EL APARATO RESPIRATORIO

Las alteraciones en la morfología del pulmón constituyen un signo muy tem-prano de los efectos tóxicos del O3 cuando se administra por vía inhalatoria,aunque las dosis requeridas para producir tales alteraciones varían entre lasdiferentes especies. Un objetivo importante ha sido esclarecer si los resulta-dos en animales pueden correlacionarse con los efectos en humanos.

Muchos estudios se han realizado en roedores, los cuales son muy sen-sibles a los efectos dañinos del O3 en las vías aéreas distales (bronquiolos) yen los alveolos pulmonares.3

Cuando monos Macaca Rhesus fueron expuestos 8 h diarias al O3

(300 jig/m3), durante 6 a 90 d, se produjeron lesiones en el epitelio nasal connecrosis de las células ciliadas, disminución de los cilios e hiperplasia de lascélulas Clara.4 También se observó hiperplasia e hipertrofia de las célulasepiteliales cuboidales no ciliadas de los bronquiolos,5 donde también se pro-dujo acumulación de macrófagos en el lumen, efectos estos que no se obser-varon en el grupo de monos utilizados como controles no tratados.

Ratas adultas expuestas al O3 (500 pg/m3) por 12 h diarias durante seissemanas mostraron lesiones localizadas en los alvéolos caracterizadas por elincremento en número y tamaño de las células epiteliales tipo I. También seincrementó el número de células tipo II, así como los macrófagos alveolaresy tisulares, un signo típico de inflamación.6 Otras ratas fueron también ex-puestas a una dosis, de O3 de 240 jig/m3 y mostraron cambios significativos

en el número y tamaño de las células alveolares tipo I en este nivel de exposi-ción. Los anteriores resultados son coherentes con un incremento delrecambio de las células alveolares de forma dosis-dependiente, lo quedemuestra que el efecto ya ocurre a la dosis menor de 240 |ig/m3.

Cuando las ratas fueron expuestas a una concentración mayor de O3

(800 |ug/m3) de forma continua durante 14 d, se produjo un incremento de laactividad del citocromo P450 2B1 pulmonar. Por otro lado, también se ob-servó hipertrofia de las células Clara y de las cuboidales no ciliadas de losforonquiolos terminales como resultado del estudio histológico.7

Los anteriores hallazgos sugieren que la exposición al O3 puede activarel metabolismo de los xenobióticos en las células epiteliales pulmonares y quela exposición al O3 por vía inhalatoria provoca la metaplasia de las célulasalveolares, con la aparición de un tipo celular que muestra característicasintermedias entre las células alveolares tipo I y tipo II.

Algunos autores han dividido los eventos asociados al daño tisular pro-vocado por el O3 en el epitelio de las vías aéreas en tres fases: inmediata,temprana y tardía.8

La fase inmediata está dada por los efectos del O3 durante las dosprimeras horas de exposición y se caracteriza por las reacciones del gascon los aminoácidos, las proteínas y los ácidos grasos insaturados. La reac-ción con estos últimos produce agua, aldehidos, ozónidos, ácidos orgánicos,hidroxihidroperóxidos con cadenas de longitud variable, los cuales inician laliberación de eicosanoides por las células epiteliales de las vías aéreas delhumano.9 Está demostrado que los productos de la ozonólisis pueden activarsistemas enzimáticos tan importantes como las fosfolipasas de las membranas,así como también, la ciclooxigenasa (COX) a nivel citoplasmático.10 Las fos-folipasas son las responsables de la liberación del ácido araquidónico y suulterior metabolismo por la COX y las lipoxigenasas (LOX) que producenías prostaglandinas y los leucotrienos, importantes mediadores de la infla-mación.

La fase temprana ocurre en el período entre 2 y 24 h posteriores a laexposición al O3 por inhalación y se caracteriza por infiltración de leucocitospolimorfonucleares. Las células epiteliales junto con otras células presentespueden sintetizar y liberar factores quimiotácticos que inducen la activacióny migración de los neutrófílos11 con la concomitante liberación de eicosanoi-des como el leucotrieno B4y la prostaglandína PGF2ct. También se elevan lasconcentraciones de citocinas como consecuencia de la respuesta inflamato-ria al 03, entre ellas, la IL-1 y el TNF-cc que a su vez activan a otras como laIL-6, la FL-8, así como laproteína-2 inflamatoria del macrófago.12

Finalmente, durante este período la elastasa y la catepsina G tambiénson liberadas. Ha sido demostrado que la elastasa del neutrófílo está elevadaen los lavados bronquioalveolares de personas expuestas al O3.13 La elastasa

es un potente inductor de la secreción de mucus14 y de la formación de- -quimiocinas (IL-8).

La fase tardía se caracteriza por la infiltración de eosinófilos (importan-tes en el asma) y monocitos (importantes en la bronquitis). En esta fase, seproducen alteraciones evidentes en la transcripción del IL-6, la IL-8, en lasconcentraciones de ARNm y en la síntesis de proteínas. También se liberaneicosanoides, citocinas, el factor transformante del crecimiento-P y el factorestimulante de colonia de granulocitos macrófagos.15 También se incrementala síntesis de proteínas estructurales tales como la fibronectina y el colágenoque conducen al desarrollo de la fibrosis pulmonar, así como de antiproteasasimportantes en la reparación del tejido.16

A lo anterior, se suma en esta fase la activación en el pulmón de lasenzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y gluta-tión reductasa y per.oxidasa que en cierta medida, contrarrestan los efectosdañinos de los anteriores mediadores por su carácter citoprotector.17

Las alteraciones morfológicas que se producen en el pulmón comoconsecuencia de la respuesta a la exposición al O3 por vía inhalatoria,repercuten en la función respiratoria tanto de los animales como del hu-mano y se caracterizan por las manifestaciones siguientes:3"8 1) disminu-ción del volumen expiratorio forzado, 2) incremento de la hiperreactividadbronquial (un evento característico del asma), 3) inflamación de las víasaéreas, 4) incremento de la tos y opresión torácica, 5) alteración del acla-ramiento mucociliar con la subsiguiente acumulación de mucus en lasvías aéreas, 6) incremento de la permeabilidad del epitelio pulmonar. Portodo lo anterior es que se debe evitar la exposición al ozono por vía respi-ratoria.

2.2. EFECTOS DEL OZONO EN EL SISTEMA INMUNE

El efecto de exposiciones al 03 por vía inhalatoria durante períodos cortosfue investigado con relación a la producción de anticuerpos y sus efectossobre el timo.18 Los ratones fueron expuestos de forma continua a concen-traciones de O3 de 800 y 1 600 )j,g/m3 durante 1, 3, 7 y 14 d . Ya desde elprimer día y a lo largo de la exposición, ambas concentraciones causaron unincremento relativo en el peso del pulmón con relación al peso corporal ydesde el tercer día hubo un decremento significativo en el peso del timo y enel del bazo. La capacidad para desarrollar una respuesta de anticuerpos porlos eritrocitos de carnero fue también reducida por la concentración de 03

más elevada y desde el primer día de exposición. Por lo tanto, se observó unefecto inmunosupresor del O3 que se correspondió con la inducción de unarespuesta inflamatoria (edema e incremento del peso de los pulmones), loque hizo concluir a los autores que esos efectos eran debidos a una alteración

funcional de la respuesta de las células T por el O3, ya que la respuesta aotros antígenos no dependientes de las células T fue normal.

Ratones hembras (CD-1) fueron expuestos a 1 400 jig de O3/m3 duran-te 20 h diarias desde uno hasta 28 d, produciéndose atrofia del timo mientraslos nodulos linfáticos del mediastino mostraron una respuesta hiperplásiea.La atrofia del timo se evitó cuando las glándulas suprarrenales fueron extir-padas antes de la exposición al Or Este hallazgo sugiere que las hormonasesteroideas, o algún factor proveniente de las glándulas suprarrenales, estáninvolucrados en el efecto depresor del O3 sobre el timo.19

Un estudio utilizando concentraciones relativamente bajas de 03 fuerealizado en ratones con el objetivo de esclarecer si el O3 tiene capacidad deprovocar sensibilización ante la acción alergénica de la ovalbúmina. Los ra-tones fueron expuestos continuamente durante 4 d a aire filtrado o a concen-traciones de 03 de 200,260,320 y 480 p.g/m3respectivamente. Al cuarto día,los animales recibieron por inhalación ovalbúmina y entonces permanecieronen atmósfera con aire durante una semana. Posteriormente, las exposicionesal 03 y al alérgeno se repitieron durante cuatro períodos de 4 d cada uno.20

Los animales expuestos al O3 mostraron un significativo incremento enla frecuencia del choque anafiláctico cuando se les inyectó por vía intraveno-sa la albúmina de huevo una semana después de los cuatro períodos de expo-sición y se les comparó con los controles expuestos al aire y al alérgenosolamente.

También se ha observado un aumento de la sensibilidad a la histamina yal fármaco colinomimético carbacol en varias especies de animales expues-tos al 03 inhalado.

Bastón y Murphy21 demostraron que la dosis letal de la histamina en loscobayos fue mucho menor en los animales expuestos a concentracionesbajas de O3 (0,5 ó 1 ppm durante 2 h). La resistencia pulmonar también seincrementó por la inyección subcutánea de histamina en cobayos expuestosa 0,8 ppm de O3 durante 1 h ,22 De modo similar, perros expuestos a 0,7 ppmcíe O3 durante 2 h tuvieron mayores incrementos en la resistencia pulmonarinducida por inhalación de un aerosol de histamina, que los obtenidos en elgrupo tratado con esta solamente.23

Ovejas expuestas a 0,5 ppm de 03 durante 2 h también mostraronmayores incrementos de la resistencia pulmonar que los controles tratadossolo con carbacol.24

Gershwin y col.23 expusieron ratones al O3 (1 000 ug/m3) previamente a[a administración de ovalbúmina por inhalación y observaron un incrementosaarcado de la IgE, lo que se acompañó de un aumento del efecto del alérgeno.

Ozawa y col.-5 demostraron que la sensibilización incrementada a losaíergenos causada por la inhalación de (X puede acompañarse de la activación¿e mecanismos regiüscoies as ía inmunidad que modifican la respuesta. Ellos

sometieron ratones al O3 (1 600 ug/m3) durante 1,2 63 semanas y entonces,les aplicaron una inhalación de albúmina seguida por una inmunización intrape-ritonial con ella una semana después. La respuesta de la IgE provocada por lainhalación de albúmina fue suprimida en los ratones expuestos al O3 La supre-sión de la IgE se debió al efecto que ejerció sobre el sistema inmune la inyec-ción intraperitonial de albúmina dada una semana después.

Más recientemente, Zamora y col.27 evaluaron el suero de ratones sen-sibilizados con ovoalbúmina y tratados con O3 no por vía inhalatoria, sino porinsuflación rectal durante 20 d, mediante el método de anafílaxia cutáneapasiva en%atas. Se encontró que los sueros de los ratones tratados con O3

produjeron una disminución significativa de la reacción anafíláctica en la pielde la rata con respecto a la de los controles no tratados, por lo que los autoressugirieron que el O3 pudiera interferir la producción de IgE.

Rojas y col.28 evaluaron también el efecto del O3 administrado por insufla-ción rectal en los modelos de choque anafíláctico agudo y retardado inducidosen los cobayos sensibilizados por ovalbúmina. Se encontró que en el primero, elO3 es inefectivo, pero en el segundo, se observó un incremento significativo enel número de animales sobrevivientes con respecto a los cobayos controlessolo tratados con ovalbúmina. Esto demuestra que en esta especie, el O3 admi-nistrado por insuflación rectal, también ejerce efecto antianafíláctico.

En investigaciones más recientes29 se evaluó el efecto del ozono en unmodelo de hipersensibilidad bronquial en cobayos. En este trabajo, se estudió lapresión intrabronquial (PUS), la inmunoglobulina G (IgG) y la mieloperoxidasa(MPO). Después de la aplicación del esquema de hipersensibilidad bronquialcon ovoalbúmina, los animales se dividieron en diferentes grupos experimen-tales: dos tratados con sendas dosis diferentes de O3 por vía rectal (0,2 y1,2 mg/kg), 10 sesiones (una diaria); uno con 02 (7 mL) por vía rectal, 10 sesiones(control) y otro tratado solo con ovoalbúmina (control). La PIB y la MPO enel tejido pulmonar mostraron una disminución significativa en los grupos tra-tados con 03 con respecto a los controles. Además, se obtuvo una disminu-ción beneficiosa de la IgG con la dosis menor de 03. Por microscopía ópticase observó infiltrado inflamatorio de eosinófilos en el grupo sensibilizado queno recibió tratamiento con ozono y en el tratado con Or

Sin embargo, efectos de hipersensibilidad e hiperreactividad a los alér-genos se han observado en humanos expuestos al 03 por vía inhalatoria yespecialmente, aquellos que padecen asma alérgica.13'30-31

Podemos señalar que el O3 inhalado provoca en las vías respiratoriasde los animales un incremento en la reactividad a los alérgenos y otros agen-tes broncoconstrictores aspirados. Este efecto está bien comprobado en va-rias especies, incluida la humana y se caracteriza por una disminución de ladosis requerida del alérgeno, así como por un incremento en la broncocons-tricción y en las reacciones anafilácticas o en la piel inducida por él.

Aunque se han obtenido resultados satisfactorios al aplicar el ozono porotras vías diferentes a la iniíalatoria, más estudios preclínicos son necesariosadministrando el O3 por otras vías alternativas para esclarecer si el O3 mantieneo no su capacidad de incrementar la Hpersensibilidad alérgica y la hiperreactivi-dad bronquial inducida por los alérgenos y si estas ocurren en más personas de ungrupo expuesto al O3 que en un grupo control expuesto solo al alérgeno.

2,3. EFECTO DEL OZONO EN EL SISTEMA NERVIOSOCENTRAL Y SOBRE EL COMPORTAMIENTO

Aunque en su mayoría los efectos tóxicos del O3 inhalado han sido identifica-dos y descritos en el aparato respiratorio, otros estudios han reportado cefa-lea, vértigo, somnolencia y fatiga en humanos expuestos al gas.32 Ratas yratones expuestos a bajas concentraciones de O3 (0,5 ppm) han mostradoana actividad motora disminuida.33 Hiutron-Resendiz y col.34 han descritoalteraciones en el sueño asociados con cambios en la serotonina cerebral enraías expuestas a concentraciones de ozono de 0,2 a 1,2 ppm, mientras otrosautores35 demostraron que una alteración de las catecolaminas cerebralesestá también involucrada en esos efectos.

2A ESTUDIOS SOBRE TERATOGENICIDAD DEL OZONOY SUS EFECTOS SOBRE LA REPRODUCCIÓN

Los estudios realizados sobre este tópico han sido limitados y se han circunscri-to a ratones y ratas. Los estudios en ratones evidenciaron que la exposiciónperinatal a 0,2 ppm de O3 redujo la sobrevivencia de los recién nacidos.36 Enel ratón también se han reportado efectos embriotóxicos por exposición cró-nica de la pareja al Or37

Kavlock y col.38 expusieron ratas gestantes a 1,49 ppm de O3 y detecta-ron una disminución significativa de las implantaciones, un aumento notable defas reabsorciones embrionarias, una elevada incidencia de abortos espontá-neos y una descendencia con bajo peso al nacer y retardo en el crecimiento.39

Trastornos del sueño se han demostrado en la cría de ratas hembrasque fueron expuestas a 1 ppm de O3 inhalado 12 h diarias durante lagestación.40

Recientemente, Rivas-Manzano y Paz41 informaron estudios histológi-cos que revelan la inducción de lesiones en el cerebelo de la cría de ratasbembras que fueron expuestas a 1 ppm de 03 12 h diarias durante todo elperíodo de la gestación.

Sin embargo, RooVíguez y col.42 tras administrar la mezcla de ozono-oxígeno f 1 mi.} por insuflación rectal a ratas Wistar gestantes, desde el

sexto hasta el decimoquinto día de la preñez, a una dosis de O3 de 1,2 mg/kg(dosis terapéutica) y 3 mg/kg y realizar el sacrificio de los animales aldecimonoveno día, los autores no observaron efectos tóxicos en las rataspreñadas sometidas al tratamiento. La ganancia en peso materno no mos-tró diferencias significativas con respecto al control no tratado con 03.Tampoco hubo diferencias significativas con relación al número de cuer-pos lúteos, implantaciones, fetos vivos y muertos y las reabsorciones em-brionarias. En cuanto a la morfología de los fetos, no se apreciaronmalformaciones externas, esqueléticas ni viscerales. El peso y la longitudcráneo-caudal de los fetos no mostraron diferencias significativas conrespecto a los controles.

Rodríguez y col.43 también evaluaron la capacidad del O3 para provo-car alteraciones en la morfogénesis, embrioletalidad y retardo del crecimien-to en un sistema de cultivo de embriones que expusieron a concentracionesde O3 Se 40 y 80 ug/mL en suero, utilizando este como medio de cultivo. Losembriones tratados con 03 crecieron y se desarrollaron normalmente. No sedetectaron malformaciones en los controles ni en los tratados con O3. Elestudio por microscopía electrónica demostró que la ultraestructura de lascélulas del saco vitelino era normal.

2.5. ESTUDIOS SOBRE LA GENOTOXICIDADY CARCINOGENICIDAD DEL OZONO

Efectos genotóxicos producidos por la administracióndel ozono in vitro e in vivo

El primer experimento sobre la genotoxicidad del ozono administrado porvía inhalatoria fue realizado por Zelac y col.44 Estos autores utilizaron ha-msters chinos hembras que fueron expuestos al ozono (0,48 y 0,60 mg/m3)durante 5 h . Los resultados fueron comparados con un grupo control notratado. Se observó que la frecuencia de aberraciones cromosómicas enlos linfocitos periféricos de los grupos tratados con 03 eran significa-tivamente mayores con respecto al grupo control inmediatamente despuésde la exposición al O3y 15 d después del tratamiento. Sin embargo, Ticey col.45 expusieron a los hamsters chinos a una dosis mayor de O3

(0,8 mg/m3) durante 5 h y no detectaron aberraciones cromosómicas enlos linfocitos ni en las células de la médula ósea de los animales. Tampo-co hubo incremento en la frecuencia de intercambio de cromátidas her-manas (ICH) en los linfocitos de los hamsters chinos ni en las células dela médula ósea de ratones C57B16 expuestos a 4 mg de O3/m3 durante6 h al ser examinados inmediatamente y 1, 2 y 3 semanas después de laexposición al gas.

Gooch y col.46 no detectaron inducción de aberraciones cromosómicasy cromatídicas en linfocitos de hamsters chinos y ratones C3H expuestos alO, (2 mg/m3) durante 2 h . Estos autores tampoco observaron translocacio-¡nes recíprocas en los espermatozoides de los animales tratados con Or

Coincidentemente con los resultados anteriores, Zhurkov y col.47

tampoco observaron aberraciones cromosómicas y cromatídicas en lascélulas de médula ósea de ratas expuestas a 0,15 mg de O3/m3 durante 8 hdiarias por 7 d o a 5,6 mg/m3 por 5 d . Bajo estas últimas condicionesexperimentales, la actividad mitótica en la médula ósea se redujo signifi-cativamente.

En Cuba, en concordancia con los resultados de los estudios ante-riores, Fernández y col.48 evaluaron la actividad citotóxica y clastogénicaen la médula ósea de ratones tratados con O3 por las vías intraperitoneal•: ¡p.) e intramuscular (im.), a las dosis de 460, 930, 1 400 y 2 300 ^ig/kg depeso corporal, tras 15 aplicaciones de cada una de ellas. El O3 resultócitotóxico solo a la dosis de 2 300 jig/kg por vía ip.; además, presentó unaactividad clastogénica débil a esta dosis y a la de 1 400 fig/kg . Estas dosisñieron 10 y 7 veces mayores respectivamente, que la máxima dosis tera-péutica de O3 empleada para la autohemoterapia en humanos.

En los animales que recibieron el tratamiento con O3 por vía intra-muscular, se detectó un efecto citotóxico a partir de la dosis de 930 )Lig/kg,que es 66 veces superior que la máxima utilizada en humanos. La dosisinferior (460 j^g/kg) no indujo incrementos significativos de aberraciones en.os cromosomas de las células con respecto a los controles no tratados.

En otra investigación llevada a cabo por Fernández y col.,49 se eva-l'dó el efecto del 03 sobre la espermatogénesis en ratones. El O3 se admi-nistró en una mezcla con O2, por vía intratesticular en dosis de 35/50 y"O JJ-g/kg. Se comprobó la no ocurrencia de afectación en la relación pesodel testículo/peso corporal en los animales tratados con O3 a ninguna delas dosis evaluadas. Sin embargo, se detectó disminución en el conteo¿e espermatozoides y alteraciones morfológicas con todas las dosis de O3

en la segunda semana posterior al tratamiento, efectos que desaparecieronsu las semanas subsiguientes. El ensayo de síntesis no programada de ADNrealizado utilizando timidina tritiada tuvo un resultado negativo.49

Más recientemente, Remigio y col.50 evaluaron la actividad citotóxi-ca y clastogénica en roedores tratados con O3 por insuflación rectal, através del análisis citogenético de la médula ósea en ratones CENP:NMRIatediante el ensayo de micronúcleos y en ratas CENPiSPRD mediante elanálisis de las aberraciones cromosómicas, utilizando las dosis de O3 de9.5 y 7,5 mg "kg. Em todos les casos, se realizó una aplicación diaria de O,¿nrame W¿ ccrsecrriYes- En este experimento también se utilizaron con-troles zjezsrvcs v ̂ srzvcs. XD se observaron evidencias de efectos cito ge-

néticos en la médula ósea de los animales tratados con la mezcla ozono-oxígeno por vía rectal una vez finalizado el tratamiento.

En los estudios de genotoxicidad del O3 realizados en suspensiones demicroorganismos (E. coli y Salmonella) a los que se les burbujeó el gas, losresultados han sido contradictorios.

Hamelin y Chung51 burbujearon suspensiones de E. coli con O3 en unintervalo de concentraciones entre 0,1 y 100 mg/m3 por períodos que oscila-ron entre 15 y 60 min y observaron la inducción de mutaciones hacia delantey reversas en sus genomas respectivos, así como roturas en la cadena delADN.

En contraste con lo anterior, en el ensayo de Ames en el que una mez-cla de ozono-aire se pasó sobre placas de agar contenidas en una cámara deexposición e inoculadas con Salmonella, durante 20 h, no se detectaronefectos mutagénicos a concentraciones de O3 desde 1 hasta 4 mg/m3 con osin la utilización de activación metabólica (S9) en el ensayo.52Las concentra-ciones de O3 mayores de 4 mg/m3 resultaron tóxicas para la bacteria en esteestudio. Sin embargo, en otro estudio Dillon y col.53 reportaron mutagenici-dad del O3 en otra cepa de Salmonella.

Con relación a la evaluación de la genotoxicidad del O3 en insectos, sedestaca el estudio realizado por Erdman y Hernández54 en el cual se expusie-ron moscas Drosophila viridis machos a una concentración de O3 de 60 mg/m3 durante 3 h . Períodos de tiempo de exposición al O3 mayores fueronletales para las moscas. En este estudio, el O3 indujp mutaciones del tipodominante letales en la descendencia, calculada por la proporción de huevosque fallaron en evolucionar a pupas.

En estudios citogenéticos realizados en cultivos de células, Fetner55 fueel primero que demostró que el CX produce daño en los cromosomas (aberra-ciones en cromátidas) utilizando líneas de células KB humanas que expuso ala concentración de 16 mg/m3 durante 5010 min .

Gooch y col.46 estudiaron el efecto del burbujeo de O3 a través de unasuspensión de linfocitos humanos. Cuando las células fueron tratadas en faseS, la frecuencia en la pérdida de cromátidas se incrementó, pero no se detec-taron aberraciones en los cromosomas.

Resultados similares obtuvieron Guerrero y col.56 al exponer cultivosde 24 h de células de pulmón fetal humano (WI-38) a diferentes concentra-ciones de O3 (0,5; 1; 1,5 y 2 mg/m3) durante una hora. En este estudio, seobservó un aumento en la pérdida de cromátidas solo a la mayor dosis de O3

empleada (2 mg/m3). Sin embargo, se produjo un incremento dependiente dela concentración de O3 en el ICH, pero no se observó mayor número deaberraciones cromosómicas.

Shiraishi y Bandow57 expusieron células de hamsters chinos V79 aconcentraciones de O3 entre 0,26 a 2 mg/m3 durante 2 h . Bajo estas condi-

ciones, el O3 indujo ICH y produjo una inhibición dependiente de la concen-tración en el crecimiento celular.

Hsueh y Xiang58 reportaron que el O3 induce ICH en los linfocitoshumanos a concentraciones entre 0,3 y 1,5 mg/m3.

Díaz-Llera y González59 realizaron un estudio en pacientes tratados con03 por vía intra-rectal y endovenosa (autohemoterapia) y determinaron la fre-cuencia de micronúcleos enreticulocitos de sangre periférica mediante su com-paración con otro grupo de pacientes portadores de linfoma de Hodgkin tratadoscon el citostático bleomicina, con efecto genotóxico reconocido. Los resultadosde este estudio demostraron que la ozonoterapia (15 sesiones con una concen-tración de ozono de 50 jug/mL y un volumen de 100 mL) no incrementa lafrecuencia de los reticulocitos micronucleados en los pacientes tratados, lo cualconfirmó los resultados obtenidos en otros estudios en cuanto a que el 03 ni susintermediarios tienen efecto clastogénico aparente.

Merz y col.60 estudiaron las aberraciones cromosómicas en linfocitosperiféricos de seis personas expuestas al O3 a una concentración de 1 mg/m3

durante 6 y 10 h . Los sujetos sirvieron como sus propios controles, para locual fueron tomadas muestras de sangre antes y después del tratamiento. Nose observaron aberraciones en los cromosomas de ninguno de los sujetos.Sin embargo, la mayoría de ellos mostró pérdida de cromátidas después de laexposición.

McKenzíe y col.61 también realizaron estudios citogenéticos en 26 su-jetos jóvenes saludables del sexo masculino no fumadores expuestos a0,8 mg/m3 de O3 durante 4 h. Las muestras de sangre fueron tomadas inme-diatamente antes y después de la exposición, así como 3 d, 2 y 4 semanasdespués, no se observó incremento significativo en el número de linfocitoscon aberraciones cromosómicas ni en las cromátidas como consecuencia dek exposición al O3.

En cuanto a los efectos del O3 sobre el ADN, Rasmussen62 expuso célu-las de hámster chino V79 al O3 (2 a 20 mg/m3) durante una hora y observó quela replicación del ADN, evaluada por la incorporación de timidina tritiada, seredujo en dependencia de la concentración del gas utilizada. Las concentracio-nes superiores a 4 mg/m3 fueron citotóxicas. El autor concluyó que el 03 inte-ractúa con el ADN provocando la inhibición de la replicación.

Borek y col.63 expusieron una línea de células epidérmicas humanasRHEK a la acción del 03 (10 mg/m3) durante 10 min . Se evaluó la rotura deEa cadena de ADN por la técnica de elusión alcalina y centrifugación engradiente de sacarosa alcalina. En este estudio, no se pudo detectar un au-mento significativo en la rotura de la cadena de ADN inducida por el O3

Kozumbo y Agarwal^realizaron experimentos con una disolución es-íabilizadora ozonizada. Ellos utilizaron fibroblastos de pulmón humano CCD-18 y células A549 epiteliales íipo n transformadas, también de pulmón. La

disolución estabilizadora que había sido pretratada con O3 (2 mg/m3), noindujo rotura en la cadena de ADN de estos tipos celulares.

Recientemente, Díaz-Llera y col.65 estudiaron mediante el ensayo Co-meta el efecto genotóxico del O3 y del H2O2 en leucocitos de sangre perifé-rica extraída de seis voluntarios saludables, no fumadores y con edadescomprendidas entre 22 y 48 años. Las concentraciones de O3 utilizadas estu-vieron entre 0,875 y 5,25 mmol/L con un período de incubación de las muestrasde 1 h a 37 °C . Controles positivos expuestos al H2O2 (4 a 40 mmol/L)fueron también incluidos en el estudio. Se observaron incrementos en losporcentajes de células dañadas tanto por el O3 como por el H2O2, los cualesfueron dependientes de la concentración de ambos agentes, así como en lasmediciones de la migración del ADN (longitud del Cometa). La preincuba-ción de las células con catalasa durante 15 min disminuyó significativamentelos porcentajes de células dañadas y la longitud del Cometa, lo que sugirióque el H2O2 es el principal mediador de esos efectos y que la catalasa ejerceun efecto protector eficiente. Los autores demostraron que el O3 inducedaño en el ADN en leucocitos humanos de sangre periférica in vitro y que eldaño fundamental ocurre por rotura de la cadena del ADN mediada por laformación de H2O2, pero es reversible debido al importante papel que des-empeñan los mecanismos de reparación. Sin embargo, este resultado obteni-do en leucocitos de sangre periférica humana y que detecta un daño endichas células por la exposición al ozono in vitro, pudiera ser la consecuenciade la presencia de un suero con capacidad antioxidante baja, ya que comohan señalado Larini y Bocci,66 la toxicidad in vitro del ozono puede producir-se cuando las células son incubadas en medios de cultivo carentes o con unapresencia muy reducida de sustancias antioxidantes. Por el contrario, estosautores67'68 han demostrado que no se produce ningún daño a la células san-guíneas utilizando cientos de muestras de sangre humana expuestas a con-centraciones de ozono entre 20 ,ug/mL (0,42 mmol/L) y 60 ug/mL (1,26 mmol/L)durante 5 min . Por otra parte, han encontrado que el estado antioxidantetotal que normalmente se encuentra entre 1,3 y 1,8 mmol/L, disminuye nomás del 20 %, los primeros 5 min de exposición al ozono y retorna a su valororiginal después de 30 min, demostrando que la exposición al ozono solocausa una disminución parcial y reversible de los antioxidantes presentes.

En resumen, los estudios citogenéticos realizados in vivo en animalesde laboratorio a los que se les administró O3 por las vías inhalatoria, intramus-cular, intraperitoneal, intratesticular e intrarrectal en su mayoría han mostra-do resultados negativos. Se han detectado en los hamsters chinos expuestosal O3 aberraciones cromosómicas y en las cromátidas de los linfocitos desangre periférica, pero no se han observado en los ratones y las ratas. Tam-poco se han reportado efectos citogenéticos del O3 en las células de la médu-la ósea ni en espermatozoides de los animales tratados.

Se ha demostrado que el O3 es genotóxico in vitro. Mutaciones y roturaen la cadena del ADN ocurren en bacterias, principalmente en experimentosen los cuales el O3 es burbujeado a través de suspensiones de microorganis-mos en cultivo, en cuyo caso también se forman radicales hidroxilo (OH*) yH2O2. En los cultivos de células animales y humanas tratadas con 03 se handetectado aberraciones en las cromátidas, e intercambio de cromátidas her-manas. Este último efecto puede producirse a concentraciones que oscilanentre 0,3 y 2 mg/m3.

Sin embargo, se han aportado evidencias de que el daño inducido por elO3 en el ADN (rotura de la cadena) en leucocitos humanos de sangre perifé-rica es un efecto reversible, lo que indica que las células se recuperan rápida-mente del efecto genotóxico inducido por el tratamiento con el gas. Esteefecto genotóxico no se manifiesta cuando hay una concentración adecuadade antioxidantes en el medio circundante.

Estudios sobre inducción de tumoresy carcinogenicidad del ozono por vía inhalatorio

Algunos estudios realizados en ratones han evidenciado la inducción de ade-nomas pulmonares en animales expuestos al O3 por vía inhalatoria a concen-traciones que oscilaron entre 1 y 2 mg/m3 durante 6 y 18 semanasrespectivamente.69 Los ratones utilizados A/J son particularmente sensiblesal desarrollo de adenomas pulmonares.

Ichinose y Sagai70 expusieron ratas Wistar machos a concentracionesde 03 de 0,1 mg/m3, 10 h diarias durante 13 meses y posteriormente, lasmantuvieron en atmósfera con aire por otros 11 meses antes de ser sacrifica-das. Al concluir el estudio, no sé encontraron tumores pulmonares en lasratas tratadas con O3.

Los resultados de un estudio sobre carcinogenicidad del O3 administra-do por inhalación a ratas F344/N de ambos sexos durante su tiempo de vidafue publicado.71 Las ratas fueron expuestas a concentraciones de O3 de0,24; 1,0 y 2,0 mg/m3, 6 h diarias durante 5 d de la semana en 104 semanas.No hubo evidencias de carcinogénesis en el estudio. En otro experimentorealizado, las ratas machos fueron inyectadas con nitrosamina tres veces porsemana durante las primeras 20 semanas y expuestas a una concentraciónde O3 de 1,0 mg/m3 durante 6 h diarias, 5 d por semana durante 105 sema-nas. El O3 no incrementó significativamente la incidencia de tumores pulmo-nares en los animales.71

Resultados similares obtuvieron Witschi y col.72 después de tratar ha-msters sirios machos con inyecciones subcutáneas de J\-nitrosodietiláminados veces a la semana durante 6 meses en que los animales fueron expues-tos continuamente al O, (1,6 mg/m3) 23 h diarias, 7 d por semana. No se

encontraron diferencias significativas en la incidencia de tumores pulmona-res entre el grupo tratado con O3 y el control expuesto al aire.

Herbert y col.73 expusieron ratones B6C3F1 a concentraciones de O3

de 0,12; 0,5 y 1,0 ppm 6 h diarias, 5 d por semana durante períodos de 24y 30 meses los que compararon con los correspondientes grupos controles.En los ratones hembras la frecuencia de adenomas broncoalveolares se in-crementó significativamente solo en el grupo que recibió la dosis más eleva-da de O3. En los ratones machos el incremento no fue estadísticamentesignificativo. En este estudio, no se detectó carcinogenicidad en los ratones.

Mustafa y col.74 expusieron ratones hembras de la línea A/J sensiblesal desarrollo de adenomas pulmonares al O3 (0,62 mg/m3) de forma intermi-tente durante 103 h, en semanas alternas a lo largo de 6 meses. Los animalesfueron sacrificados 3 meses después de la exposición final al O3. No seencontraron diferencias significativas en la inducción de adenomas pulmona-res entre el grupo expuesto al O3 y los controles no tratados.

Más recientemente, Witschi y col.75 expusieron ratones A/J hembras alas mismas condiciones experimentales del estudio anterior, pero durante 9 me-ses y tampoco encontraron evidencias de carcinogenicidad del O3 en estaespecie.

Un resultado similar se obtuvo con ratones C57 BL/6 y X pa, de loscuales, los últimos presentaron deficiencias en la reparación del ADN. Aestos, se les. administró benzopireno (BP) por vía oral en la dieta, con elobjetivó de inducir tumores gástricos, esofágicos y pulmonares, y tambiénfueron expuestos al O3 por inhalación (0,08 ppm) durante 6 meses. Se com-probó que el tratamiento combinado con ambos agentes (BP y O3) no ejerceinfluencia en la formación y el desarrollo de los tumores malignos inducidospor el BP en los ratones.76

En Cuba, se realizó un estudio en ratones de las líneas B6D2F1 y NMRI,los cuales fueron inyectados diariamente con O3 por vía rectal o intratumoral,en dosis de 6, 12 y 49 mg . Estos animales, divididos en grupos de acuerdocon las dosis recibidas, fueron inoculados con células de diferentes tumoresmurinos: ascítico de Ehrlich (TAE), pulmonar RL-67, leucemia L1210 y leu-cemia L-P388. Los resultados mostraron que el 03, empleado por vía rectalo intratumoral, según el esquema de tratamiento utilizado, no favoreció elcrecimiento tumoral. Inclusive el O3 por vía rectal disminuyó significativa-mente el número de colonias de células tumorales presentes en los pulmonesde los animales transplantados con el TAE con respecto al control sin trata-miento, con un mejor efecto cuando se aplicó la mayor concentración deozono.77

En resumen, los estudios sobre la inducción de tumores y la carcinoge-nicidad del O3 administrado por vía inhalatoria han demostrado la inducciónde adenomas pulmonares solo en ratones. Sin embargo, no se ha comproba-

do inducción de carcinogenicidad en ratones, ratas y hamsters en los estudiosrealizados. En seres humanos la carcinogenicidad del O3 tampoco ha sidodemostrada. Más investigaciones sobre este tópico utilizando otras vías deadministración del O3 son necesarias.

2.6. CONSIDERACIONES FINALES

La mayor parte de los estudios toxicológicos preclínicos realizados al O3 hanutilizado como vía de administración la inhalatoria, los cuales han demostradoconvincentemente sus efectos tóxicos, en primer lugar, en el aparato respira-torio, especialmente, en los pulmones y bronquios, aunque también en menorgrado en el sistema inmune, la inducción de genotoxicidad, efectos nocivossobre la reproducción y en el sistema nervioso central, así como en el com-portamiento en los animales tratados con el gas por vía respiratoria.

Estos efectos tóxicos se han producido en su gran mayoría utilizandoconcentraciones relativamente elevadas del O3, es decir, como está estable-cido en los protocolos y metodologías de los estudios toxicológicos agudos,subcrónicos, crónicos y en los de toxicología especial, que se realizan comogarantía de la seguridad relativa de cualquier sustancia a la que potencial-mente se expone el ser humano.

Sin embargo, han sido pocos e insuficientes los estudios toxicológicosen animales en que el O3 ha sido administrado por otras vías de administra-ción diferentes a la inhalatoria.

' En el caso de la autohemoterapia, numerosos estudios realizados conrigor científico por el Profesor Bocci y col.68'78 entre otros, han demostradono solo la utilidad de este procedimiento para el tratamiento de diversasenfermedades, sino también, su adecuado margen de seguridad y la fre-cuencia muy baja de reacciones adversas en los pacientes tratados consangre ozonizada por vía endovenosa. En uno.de esos estudios,78 se haceun análisis profundo del porqué el ozono por vía inhalatoria puede producirdaño, mientras que utilizando otras vías y a dosis controladas, este gaspuede resultar ser muy útil en el tratamiento de diferentes enfermedades.El ozono en contacto con el agua presente en el organismo no cumple conla Ley de Henry. A pesar de ser la solubilidad de este gas en agua 10 vecesmayor que la del oxígeno, no se transfiere a los capilares de los alvéolos,sino que reacciona inmediatamente con las biomoléculas presentes en elfluido de la capa epitelial de estos alvéolos, formando las especies reacti-vas del ozono, como el peróxido de hidrógeno y una mezcla de productosde oxidación lipídica, implicados en la toxicidad pulmonar. Además, es im-portante tener en cuenta que la capacidad antioxidante del fluido de la capaepiltelial es muy bajo en comparación con la cantidad de antioxidantes pre-sentes en la sangre (capítulo 3).

Merece destacarse que mientras los estudios de genotoxicidad ysobre la reproducción han demostrado que el O3 por vía inhalatoria produceefectos genotóxicos, embriotóxicos y fetotóxicos en los animales de experi-mentación. En aquellos estudios similares en que el O3 se ha administradopor vía intrarrectal, intramuscular e intraperitonial se ha demostrado la au-sencia de esos efectos nocivos.

Todo lo anterior apoya y sugiere la necesidad de realizar los estudiostoxicológicos preclínicos requeridos para establecer si el O3 administrado porotras vías de administración diferentes a la inhalatoria, induce menos toxici-dad a los .animales en los aparatos y sistemas antes mencionados.

La realización de estas investigaciones toxicológicas constituye sinduda una fase fundamental y decisiva para impulsar la introducción y exten-sión del uso de la ozonoterapia en el tratamiento de numerosas enfermeda-des que afectan al ser humano.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. VICTORIN K. Review of genotoxicity ofozone. Mutat Res 1992;277:221-38.2. McBRiDE DE, KOENIG JQ. Inflammatory effects ofozone in the upper airways ofsubjects

with asthma. Am J Respir Crit Care Med 1994;149:1192-97.3. HYDE DM, BOLENDER RP, HARKEMA JR, PLOPPER CG Morphometric approaches for eva-

luating pulmonary toxicity in mammals: implications for risk assessment. Risk Anal1994;14:293-302.

4. HARKEMA JR, PLOPPER CG, HYDE DM, ST George JA. Response of the macaque nasalepithelium to ambient levéis of ozone: a morphologic and morphometric study of thetransitional and respiratory epithelium. Am J Pathol 19 87; 128:29-44.

5. HARKEMA JR, PLOPPER CG, HYDE DM, ST GEORGE JA. Response of macaque bronchiolarepithelium to ambient concentration ofozone. Am J Pathol 1993;143:857-66.

6. BARRY BE, MILLER FJ, CRAPO JD. Effects of inhalation ofO.12 and 0.25 ppm ozone on theproximal alveolar región ofjuvenile and adult rats. Lab Invest 1985;53:692-704.

7. TAKAHASHI Y, ATOA S, SUZUKI E, ITO Y, MIURA T, KIMULA Y. Cytochrome P450 2B1 inmuno-reactivity in bronchiolar and alveolar epithelial cells qfter exposure of rats to ozone.Toxicol Appl Pharmacol 1994;128:207-15.

8. LEIKAUF GD, SIMPSON LG, SANTROCK J, ZHAO Q. Airway epithelial cell responses to ozoneinjury. Environ Health Persp 1995;103 Suppl 2:91-5.

9. LEIKAUF GD, ZHAO Q, ZHOU S, SANTROCK J. Ozonolysisproducís ofmembranefatty aciasactivóte eicosanoic metabolism in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell MolBiol 1993;9:594-602.

10. WRIGHT DT, ADLER KB, AKLEY NJ, DAILEY LA, FRIEDMAN M. Ozone stimulates reléase ofplatelet activating factor and activates phospholipases in guinea pig tracheal epithelialcells inprimary culture. Toxicol Appl Pharmacol 1994;127:27-36.

11. KOYAMA S, RENNARD SI, LEIKAUF GD, SHOJI S, VON ESSEN S. Endotoxin stimulates bron-chial epithelial cells to reléase chemotactic factors for neutrophils. J Immunol1991; 147:4293-301.

12. DRISCOLL KE, SIMPSON LG, CÁRTER J, HASSENBREIN D, LEIKAUF GD. Ozone inhalation stimu-lates expression of the neutrophil chemotactic peptide MIP-2. Toxicol Appl Pharmacol1993;! 19:306-9.