tolerancia al ph en embriones y renacuajos de...
TRANSCRIPT
1
TOLERANCIA AL pH EN EMBRIONES Y RENACUAJOS DE CUATRO
ESPECIES DE ANUROS DEL TOLIMA
LILIANA MARCELA HENAO MUÑOZ
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA IBAGUE-TOLIMA
2010
2
TOLERANCIA AL pH EN EMBRIONES Y RENACUAJOS DE CUATRO ESPECIES DE
ANUROS DEL TOLIMA
LILIANA MARCELA HENAO MUÑOZ Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Profesional en Biología
Director:
MANUEL HERNANDO BERNAL BAUTISTA
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA IBAGUE-TOLIMA
2010
3
ADVERTENCIA
“La Facultad de Ciencias, el Jurado calificador y el Director del trabajo, no
serán responsables por las ideas contenidas en él”
Articulo 16 – Acuerdo 032 de 1976 – Consejo Directivo de la Universidad del Tolima, reglamento de los trabajos dirigidos de grado.
4
La autora LILIANA MARCELA HENAO MUÑOZ, autoriza a la Universidad del Tolima la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de reconocimiento de la autoría y cede a la misma Universidad de los derechos patrimoniales con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrados en el artículo 72 de la Ley 23 de 1982 y las normas que lo constituyan o modifiquen (Acuerdo 0066 de 2003, 14 de Octubre de 2003. “Por el cual se adoptan normas relacionadas con la presentación de tesis y trabajos de grado” CONSEJO ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA)
LILIANA MARCELA HENAO MUÑOZ
C.C 1.110.458.603 de Ibagué Autora
5
Nota de aceptación ---------------------------------------
---------------------------------------
---------------------------------------
---------------------------------------
--------------------------------------- Presidente del Jurado --------------------------------------- Jurado
--------------------------------------- Jurado
Ibagué, 2010
6
DEDICATORIA
“A mis padres Luz Ángela y Edgar, a mis hermanos Ángela y Fernando, por su apoyo y amor incondicional; y a Jorge Luis por llenar de amor cada día de mi vida”.
Marcela Henao
7
AGRADECIMIENTOS
La Autora de esta investigación desea expresar sus más sinceros agradecimientos a las siguientes personas: Al profesor Manuel Hernando Bernal B, de la Universidad del Tolima, por su dirección y asesoría constante durante todo el proceso investigativo. A Ana María Leiva Sandoval por sus valiosos aportes y colaboración durante la ejecución de este trabajo. Por su apoyo financiero: Al Laboratorio de Investigación en Herpetología, Eco-Fisiología & Etología de la Universidad del Tolima.
8
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN
16
1. OBJETIVOS 18 1.1 OBJETIVO GENERAL 18 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 18
2. ZONAS DE MUESTREO 19
2.1VEREDA POTRERILLO, MUNICIPIO DE COELLO 19 2.2 PAYANDÉ, MUNICIPIO DE SAN LUIS 20 2.3 INSTALACIONES DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA, MUNICIPIO DE IBAGUÉ
21
3. ESPECIES DE ESTUDIO 23
3.1 Rhinella marina 23 3.2 Rhinella granulosa 24 3.3 Hypsiboas crepitans 25 3.4 Engystomops pustulosus 26
4. ESTADO DEL ARTE 27
4.1 LOS ANUROS 27 4.2 HÁBITAT 28 4.3 CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE LA CONTAMINACIÓN DE LAS AGUAS
28
4.3.1 Toxicidad 29 4.3.2 Contaminantes físicos y químicos 29
4.4 INDICADORES BIOLÓGICOS 30 4.4.1 Los anfibios como bio-indicadores 30
5. METODOLOGÍA 32
5.1 METODOLOGÍA DE CAMPO 32 5.1.1 Identificación de posturas según la especie 32
5.2 METODOLOGÍA DE LABORATORIO 33 5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 34
6. RESULTADOS 35
6.1 CONDICIONES FÍSICO – QUÍMICAS DURANTE LA EXPERIMENTACIÓN
35
6.2 LC50 DE LAS ESPECIES OBJETO DE ESTUDIO 35 6.2.1 LC50 de Hypsiboas crepitans 35 6.2.2 LC50 de Rhinella granulosa 38
9
6.2.3 LC50 de Rhinella marina 40 6.2.4 LC50 de Engystomops pustulosus 43
6.3 COMPARACIÓN INTERESPECIFICA DE LAS ESPECIES FRENTE A LA TOLERANCIA A DIFERENTES SUSTANCIAS
45
6.3.1 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al acido acético (CH3-COOH)
45
6.3.2 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al acido Clorhídrico (HCL)
47
6.3.3 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al hidróxido de sodio (NaOH)
48
6.3.4 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al hidróxido de amonio (NH4OH)
50
6.4 OBSERVACIÓNES DE LOS EFECTOS EN LAS CUATRO ESPECIES DE ANUROS FRENTE A CAMBIOS DE pH 6.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
51
52
CONCLUSIONES
56
RECOMENDACIONES
58
BIBLIOGRAFÍA
59
ANEXOS 61 .
10
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Temperatura y pH de las zonas de muestreo.
32
Tabla 2. Modos reproductivos de las cuatro especies de Anuros a estudiar según Duellman y Trueb (1986).
33
Tabla 3. Datos promedios de las condiciones físico – químicas tomadas durante las 48 horas del experimento con las diferentes especies. Potencial de hidrógeno (pH); Temperatura (ºC); Oxígeno disuelto (O2); Conductividad (e-); Controles (*).
35
Tabla 4. LC50 de Hypsiboas crepitans en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
36
Tabla 5. LC50 de Hypsiboas crepitans en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
36
Tabla 6. LC50 de Rhinella granulosa en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
38
Tabla 7. LC50 de Rhinella granulosa en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
39
Tabla 8. LC50 de Rhinella marina en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
41
Tabla 9. LC50 de Rhinella marina en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
41
11
Tabla 10. LC50 de Engystomops pustulosus en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
43
Tabla 11. LC50 de Engystomops pustulosus en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
44
Tabla 12. Valores LC50 de las especies expuestas al ácido acético en dos estadíos de desarrollo (10 y 25).
46
Tabla 13. Valores LC50 de las especies expuestas al ácido clorhídrico en dos estadíos de desarrollo (10 y 25).
47
Tabla 14. Valores LC50 de las especies expuestas al hidróxido de sodio en dos estadíos de desarrollo (10 y 25).
49
Tabla 15. Valores LC50 de las especies expuestas al hidróxido de amonio en dos estadíos de desarrollo (10 y 25).
50
12
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Ubicación geográfica del municipio de Coello en el Tolima.
20
Figura 2. Ubicación geográfica del municipio de San Luis en el departamento del Tolima
21
Figura 3: Ubicación geográfica del municipio de Ibagué en el departamento del Tolima.
22
Figura 4. LC50 para la tolerancia al pH en H. crepitans en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
37
Figura 5. LC50 para la tolerancia al pH en H. crepitans en estadío 10 y 25 frente a pH básicos
37
Figura 6. LC50 para la tolerancia al pH en R. granulosa en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
39
Figura 7. LC50 para la tolerancia al pH en R. granulosa en estadío 10 y 25 frente a pH básicos
40
Figura 8. LC50 para la tolerancia al pH en R. marina en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
42
Figura 9. LC50 para la tolerancia al pH en R. marina en estadío 10 y 25 frente a pH básicos.
42
Figura 10. LC50 para la tolerancia al pH en E. pustulosus en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
44
Figura 11. LC50 para la tolerancia al pH en E. pustulosus en estadío 10 y 25 frente a pH básicos.
45
Figura 12. LC50 de las especies estudiadas expuestas al ácido acético (CH3-COOH).
46
Figura 13. LC50 de las especies estudiadas expuestas al ácido clorhídrico (HCl).
48
13
Figura 14. LC50 de las especies estudiadas expuestas al hidróxido de sodio (NaOH).
49
Figura 15. LC50 de las especies estudiadas expuestas al hidróxido de amonio (NH4OH).
51
14
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Listado de modos reproductivos en anuros referenciados por Duellman y Trueb (1896).
61
Anexo B. Montaje de laboratorio.
62
Anexo C. Fichas técnicas de referencia de las especies de anuros objeto de estudio.
63
15
RESUMEN
El presente trabajo pretende determinar la tolerancia al pH en embriones y renacuajos de cuatro especies de anuros distribuidos en el departamento del Tolima, con el propósito de evaluar su sensibilidad ante cambios bruscos del pH del agua y su posible relación con el declive actual de las especies y poblaciones de anfibios en el departamento. Para desarrollar este trabajo se colectan entre dos o tres posturas por especie, de las cuales se utilizan 240 embriones y 240 renacuajos para la realización de las pruebas en el laboratorio. Los ejemplares son divididos en cuatro grupos de 120 individuos y sometidos a varios rangos de pH utilizando 4 sustancias diferentes; para el pH ácido: se emplean ácido acético y ácido clorhidrico; y para el pH alcalino: hidróxido de sodio e hidróxido de amonio. Estas pruebas se efectúan durante 48 horas, con recambio de agua y ajuste de pH cada 12 horas, pasadas las 48 horas se establece la dosis media letal (LC50). De las especies estudiadas Hypsiboas crepitans e Engystomops pustulosus muestran mayor sensibilidad en estadío 10 en comparación con estadío 25 para todas las sustancias (ácidas y básicas), mientras Rhinella granulosa y Rhinella marina resultan ser más tolerantes a cambios de pH en estadío embrionario 10 que en estadío larvario 25. Engystomops pustulosus es la especie más sensible a cambios de pH del agua en ambos estadios de desarrollo (10 y 25) tanto para sustancia básicas como ácidas, Rhinella marina es la especie más resistente en los experimentos frente a sustancias ácidas y Rhinella granulosa fue la más resistente frente a sustancias básicas.
Los individuos de las diferentes especies presentaron mayor tolerancia al hidróxido de sodio que al hidróxido de amonio en los dos estadíos de desarrollo objeto de estudio (10 y 25) a un mismo pH y presentaron mayor tolerancia al ácido clorhídrico que al ácido acético en los dos estadíos de desarrollo (10 y 25) a un mismo pH.
Palabras Clave: pH, Ácido acético, Ácido clorhídrico, Hidróxido de sodio, Hidróxido de amonio, DL50.
16
INTRODUCCIÓN
Actualmente el declive de las poblaciones de anfibios es un fenómeno bien conocido y ampliamente estudiado, no solo por sus múltiples causas sino por sus implicaciones en el medio ambiente. Las investigaciones en torno a la salud de las poblaciones de anfibios han explorado los efectos de múltiples factores estresantes, como la radiación ultravioleta (UV-β), la alteración del hábitat, la contaminación y la aparición de enfermedades infecciosas; siendo esta ultima considerada como una de las causas más importantes en la disminución mundial de las poblaciones de anfibios según Green y Peloquin1, en donde los cambios de pH en el medio acuático ha sido considerado como un posible factor contribuyente a esta situación2. La contaminación de los cuerpos de agua altera el pH drásticamente poniendo en peligro a todos los organismos acuáticos, y los anfibios son una de las especies más vulnerables frente a estos cambios al presentar un ciclo de vida estrechamente relacionado con el medio acuático3, en la mayoría de las especies de anfibios los cuerpos de agua resultan ser la zona de desove y el medio en el que van a vivir en su etapa larvaria por lo que resultan ser organismos muy sensibles a la calidad del agua, sobre todo en las primeras etapas de ontogenia3. Existen varias publicaciones en donde estudian la tolerancia de los anfibios frente a cambios de pH en las primeras etapa de ontogenia como los realizados por Griys-Kyle4, Karasov5 y McKenzie6. -------------------------------- 1
GREEN, Linda y PELOQUIN, Jennifer. 2008. Acute toxicity of acidity in larvae and adults of four stream salamander species (plethodontidae). En: Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 27, No. 11, pp. 2361–2367. 2 BRODKIN, Vatnick et al. 2003. Effects of Acid Stress in Adult Rana pipiens. En: Journal of
experimental zoology. 298A:16–22. 3 FOMINYKH, A. S. 2008. An Experimental Study on the Effect of Alkaline Water pH on the
Dynamics of Amphibian Larval Development. En: Russian Journal of Ecology. 2008, Vol. 39, No. 2, pp. 145–147. 4 GRIYS-KYLE, Kerry L y RITCHIE, Mark E. 2007. Amphibian survival, growth and development in
response to mineral nitrogen exposure and predator cues in the Weld: an experimental approach. En: Revista Ecologia. 152:633–642. 5 KARASOV, Jofre. 1999. Direct effect of ammonia on three species of north american anuran
amphibians. En: Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 18, No. 8, pp. 1806–1812.
6 McKENZIE, Picker. 1993. Embryonic Tolerance of Xenopus (Anura) to Acidic Blackwater. En:
American Society of Ichthyologists and Herpetologists. Vol. 1993, No. 4, pp. 1072-1081.
17
Según Griys-Kyle7 el impacto de cambio de pH en el agua por contaminación sobre los anfibios incluye tanto efectos letales como subletales, en los que incluye el retraso en el desarrollo embrionario y la aparición de una mayor proporción de crías con deformidades. Otros autores atribuyen aun más efectos subletales, como Brodkin8 quien determina que estos cambios dan lugar a la colonización del bazo por bacterias; investigadores como Brady y Griffiths9 afirman que: “Cambios de pH causan alteraciones de los comportamientos reproductivos, que puede reducir el éxito reproductivo y en última instancia afectar la población” ; Juha10 considera que estos cambios podrían disminuir la capacidad de la población para responder a la selección a largo plazo, mediante la reducción en el tamaño de la población; Green y Peloquin11 consideran que muchos organismos acuáticos al ser expuestos a cambios drásticos de pH pueden presentar movimientos de letargo, nado errático y disminución de la velocidad de natación. En este contexto de múltiples efectos, es de gran interés estudiar los rangos de tolerancia al pH en los cuales los anfibios pueden sobrevivir de manera que no sufran ningún tipo de deficiencia (retraso en el desarrollo, nado errático, entre otras) especialmente en las primeras etapas de ontogenia.
Por lo tanto, el presente trabajo pretende determinar la tolerancia al pH en embriones y renacuajos de cuatro especies de anuros (Hypsiboas crepitans, Engystomops pustulosus, Rhinella marina, Rhinella granulosa) distribuidos en el departamento del Tolima. Para lo cual se colectan entre dos o tres posturas por especie, de las cuales se utilizarán 240 embriones y 240 renacuajos para la realización de las pruebas en el laboratorio. Los ejemplares fueron divididos en cuatro grupos de 120 individuos y sometidos a varios rangos de pH empleando 4 sustancias diferentes; para el pH ácido: ácido acético y ácido clorhidrico; y para el pH alcalino: hidroxido de sodio e hidroxido de amonio. Estas pruebas se efectuan durante cuarenta y ocho horas y la mortalidad se mide a través del indice de la dosis media letal (LC50), se realizarán ajustes de pH y recambio de agua cada doce horas.
7 GRIYS-KYLE. Op. cit. p. 3.
8 BRODKIN, Op. cit. p. 2.
9 BRADY, L.D y GRIFFITHS, R.A. 1995. Effects of pH and aluminium on the growth and
feeding behaviour of smooth and palmate newt larvae. En: Ecotoxicology, 4, 299-306. 10
JUHA, Merila et al. 2004. Local adaptation and genetics of acid-stress tolerance in the moor frog, Rana arvalis. En: Conservation Genetics 5: 513–527. 11
GREEN. Op.cit. p. 2
18
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la tolerancia al pH en embriones y renacuajos de cuatro especies de anuros del departamento del Tolima.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a. Comparar el grado de tolerancia al pH en las especies de estudio de acuerdo con su estadío ontogénico: embriones y renacuajos.
b. Comparar la tolerancia al pH en las especies de anuros en estadío 10 y 25
en relación con cuatro reactivos de estudio: ácido clorhídrico, ácido acético, hidróxido de amonio e hidróxido de sodio.
19
2. ZONAS DE MUESTREO
Las especies estudiadas fueron: Hypsiboas crepitans, Engystomops pustulosus, Rhinella marina y Rhinella granulosa. Los embriones de cada una de las especies mencionadas se colectaron en diferentes puntos del departamento del Tolima. Hypsiboas crepitans y Engystomops pustulosus, en la vereda potrerillo del municipio de Coello; Rhinella marina, en Payandé municipio de San Luis y la especie Rhinella granulosa, en las instalaciones de la Universidad del Tolima, en el municipio de Ibagué. Los embriones de estas especies se colectaron en estadíos tempranos de su desarrollo.
2.1 VEREDA POTRERILLO, MUNICIPIO DE COELLO
El municipio de Coello está situado en el centro del Departamento del Tolima, en límites con el Departamento de Cundinamarca: Su cabecera se encuentra localizada sobre los 4º 17´ de latitud Norte y los 74º 54´ de longitud al Oeste de Greenwich (Figura 1).
El municipio de Coello se caracterizada por presentar un clima semiarido con una temperatura promedio de 27.5°C a 29.1°C, la precipitación anual oscila entre 1350 a 1450 mm distribuidas de forma bimodal, con dos periodos secos y dos lluviosos. El primer periodo seco va de diciembre a mayo y el segundo de junio a Agosto. Los periodos lluviosos van de abril a mayo y de septiembre a noviembre12. En este municipio se colectaron las especies Hypsiboas crepitans e Engystomops pustulosus.
----------------------------------------
12 Cortolima. 2002. Municipio de Coello. Plan de ordenamiento territorial, Caracterización, libro 1
20
Figura 1: Ubicación geográfica del municipio de Coello en el Tolima.
2.2 PAYANDÉ, MUNICIPIO DE SAN LUIS El Municipio de San Luis se encuentra al Centro del Departamento del Tolima, su cabecera está localizada sobre los 4° 8' de latitud Norte y los 75° 6' de longitud al Oeste de Greenwich (Figura 2). Se caracteriza por presentar un clima semiárido. La temperatura promedio es 25.4°C con un rango de 21°C hasta 28°C la precipitación anual oscila entre 1400 hasta 1900 mm con un promedio anual de 1551.78 mm. El régimen pluviométrico del municipio es bimodal, presentándose dos épocas de invierno y dos de verano durante el transcurso del año. En este municipio se colectó la especie Rhinella marina.
21
Figura 2: Ubicación geográfica del municipio de San Luis en el departamento del Tolima.
Fuente: Corporación Autónoma Regional del Tolima – CORTOLIMA
2.3 UNIVERSIDAD DEL TOLIMA, EN EL MUNICIPIO DE IBAGUÉ
Ibagué, es la capital del Departamento del Tolima, su cabecera está localizada sobre los 04º 26' 20" N de latitud Norte y los 075º 13' 55" O de longitud al Oeste
22
de Greenwich (Figura 3). Posee una temperatura promedio de 21°C y está ubicada a un altitud de 1.285 m.s.n.m.
En este municipio se colecto la especie Rhinella granulosa.
Figura 3: Ubicación geográfica del municipio de Ibagué en el departamento del Tolima.
23
3. ESPECIES DE ESTUDIO
3.1 Rhinella marina
El sapo de caña (Rhinella marina), también conocido como sapo neotropical gigante o sapo marino, es grande y terrestre, nativo de Centroamérica y Sudamérica (Anexo C).
El sapo de caña es un reproductor prolífico; las hembras depositan en un solo grupo desovando un gran número de huevos. Su éxito reproductor es en parte debido al tipo de alimentación, ya que su dieta puede variar entre materia viva y muerta. Los adultos tienen una longitud promedio de 10 a 15 cm; el espécimen más grande registrado pesó 2,65 kg y alcanzó 30 cm desde el hocico hasta la cloaca.
Los huevos de esta especie son pequeños de color negro y son colocados en grandes posturas en forma de cadena en charcos o ríos (Foto 1).
Foto 1. Postura R. marina
24
3.2 Rhinella granulosa
Es una especie que se encuentra en Argentina, Bolivia, Brasil, Colombia, Guyana Francesa, Guyana, Panamá, Paraguay, Surinam y Venezuela. Su hábitat natural incluye bosques secos tropicales o subtropicales, bosques húmedos tropicales o subtropicales a baja altitud, sabanas secas y húmedas, zonas de arbustos tropicales o subtropicales y secos, praderas a baja altitud, ríos, pantanos, marismas de agua dulce, tierra arable, zonas de pastos, plantaciones, jardines rurales, áreas urbanas y zonas previamente boscosas ahora muy degradadas
Los adultos de esta especie alcanzan una longitud corporal entre 38 y 50mm. Está distribuida ampliamente en Colombia, principalmente en las tierras bajas del Caribe y Orinoco, hasta las zonas bajas de la cordillera andina. Se caracteriza por reproducirse en charcos o ríos en áreas abiertas donde deposita sus pequeños huevos en largas posturas a manera de cadena (Foto 2) (Anexo C).
Foto 2. Postura de R. granulosa
25
3.3 Hypsiboas crepitans
La rana blanca, rana cantora, rana capina, o rana platanera (Hypsiboas crepitans) es una especie de anfibios de la familia Hylidae (Anexo c).
Habita en Brasil, Colombia, Guayana Francesa, Guayana, Panamá, Surinam, Trinidad y Tobago y Venezuela.
Sus hábitats naturales incluyen bosques tropicales o subtropicales secos, sabanas secas y húmedas, ríos, corrientes intermitentes de agua, lagos de agua dulce, marismas de agua dulce, manantiales, deltas fluviales, tierra arable, pastos, plantaciones, jardines rurales, áreas urbanas, zonas previamente boscosas ahora muy degradadas, zonas de almacenamiento de agua como estanques y depósitos de acuicultura, tierras de irrigación y zonas agrícolas inundadas.
Esta es una especie cuyos individuos adultos tienen un tamaño entre 49 y 57 mm. Los huevos de esta especie son pequeños de color negro y son puestos en un gel de gran tamaño a manera de película sobre la superficie de aguas estancadas (Foto 3).
Foto 3. Postura H. crepitans
26
3.4 Engystomops pustulosus
Los machos son de aproximadamente 30 mm de largo y las hembras son ligeramente más grandes. Habitan en países como Colombia, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicaragua, Trinidad y Tobago, Panamá y Venezuela.
Engystomops pustulosus pone sus huevos en nidos de espuma, los cuales evitan la desecación de huevos durante breves períodos sin lluvia (Foto 4). En esta especie la longitud de los adultos puede oscilar entre 23.3 y 26.2 mm. En Colombia esta reportada en la región Caribe, Orinoquía y los valles interandinos desde los 50 hasta los 1400 m. Los huevos tienen un color blanco o crema, y las posturas son nidos de espuma blancos puestos en charcos temporales de zonas abiertas (Anexo C).
Foto 4. Postura E. pustulosus
27
4. ESTADO DEL ARTE
Para la elaboración del este trabajo tuvimos en cuenta referentes teóricos relacionados con la caracterización general del Orden, hábitat y modos reproductivos, además conceptos básicos sobre contaminación de las aguas, toxicidad y contaminantes físicos y químicos. Se hace especial énfasis en indicadores biológicos y en los anfibios como bio-indicadores.
4.1 LOS ANUROS
Los anuros (Anura, gr. a(n), "no" y ourá, "cola") son un clado de anfibios conocidos vulgarmente como ranas y sapos. Se caracterizan por carecer de cola, por presentar un cuerpo corto y muy ensanchado, y por tener las patas posteriores más desarrolladas y adaptadas para el salto. Los anuros son el grupo más numeroso de anfibios; se estima que existen más de 5.000 especies, repartidas en 48 familias. La mayoría pasan su vida dentro o cerca del agua. Su tamaño puede variar desde un par de milímetros, como es el caso de las especies del género Eleutherodactylus, hasta tallas que superan los 30 centímetros, destacando la rana goliat, el anuro más grande del mundo el cual mide en promedio 30 cm (sin patas extendidas)13.
Los anuros presentan una boca muy ancha, con dientes diminutos o sin ellos, dependiendo de las especies, y con una lengua protráctil. Los ojos están provistos de párpados y los oídos no tienen pabellones externos, diferenciándose únicamente una membrana timpánica superficial. Los dos pares de patas son muy diferentes entre sí, adquiriendo un mayor desarrollo y robustez el par posterior, que, además, se encuentra adaptado al salto. Las patas anteriores terminan en cuatro dedos, mientras que las posteriores lo hacen en cinco. Otra característica que favorece el salto es la presencia de una columna vertebral reducida y rígida llamada urostilo. Los renacuajos (fase larvaria) llevan una vida acuática, mientras que los adultos son terrestres y únicamente vuelven al agua en el momento de la reproducción.
Una de las características más particulares de los anuros está en la piel, ya que es bastante permeable al agua y es un sitio importante para el intercambio de gases
--------------------------------------
13 DUELLMAN y TRUEB. 1986. Biology of Amphibians. P.9.
28
entre el animal y el ambiente. También, es importante por la presencia de una gran cantidad de glándulas cutáneas localizadas principalmente en la región dorsal del cuerpo y secretoras de una sustancia mucosa que cumple la función de lubricar la piel para evitar la excesiva perdida de líquidos corporales14.
Los anuros también presentan adaptaciones en sus manos y patas, las cuales se pueden relacionar con su hábitat y modo de vida. Así, las especies acuáticas presentan patas con grandes membranas interdigitales que les ayudan a dar mayor capacidad de desplazamiento en su medio. También hay especies que además de las membranas entre los dedos de las patas presentan membranas en los dedos de las manos y discos y ventosas en la punta de los dedos, los cuales les ayudan a tener una mayor superficie de contacto con el sustrato aumentado la adherencia a los troncos y hojas15. 4.2 HÁBITAT Encontramos a los anfibios en prácticamente todo el mundo. Solo se ausentan en las regiones árticas y en los desiertos más áridos. Algunas especies viven la mayor parte de su vida adulta en el agua, mientras que otras son estrictamente terrestres, y dentro de estos pueden estar presentes en pequeños subsectores denominados microhábitat16. Muchos anfibios han adaptado su comportamiento y la estructura de la superficie de su piel a vivir en una sorprendente variedad de hábitat: en charcas y árboles, en los desiertos, en galerías y ``enquistándose´´. 4.3 CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CONTAMINACIÓN DE LAS AGUAS Los contaminantes de las aguas son cualquier forma de materia o energía cuya presencia, evacuación o liberación pueda causar daños a la biota. De este modo, la evacuación de efluentes con temperatura elevada o con alto grado de salinidad puede ser tanta o más perjudicial a las comunidades acuáticas como la evacuación de substancias tóxicas. Residuos sólidos dispuestos en forma inadecuada sobre el suelo son también una fuente de contaminación de las aguas superficiales o subterráneas, mientras que contaminantes del aire como el dióxido 14
DUELLMAN. Op. cit. p. 36 15
POUGH, F.H, et al. 1998. Herpetology. Prentice Hall. New Jersey. 16
HEYER, R. W, et al. 1994. Measuring and monitoring biological diversity, standard methods for amphibians. Smithsonian Institution United States of America. p. 53
29
de azufre puede también constituirse en contaminantes del agua, en este caso a través de su precipitación en forma de lluvia ácida. La aplicación de agrotóxicos y de fertilizantes es otra importante fuente de contaminación de las aguas, conocida como una fuente difusa. Las fuentes de contaminación de las aguas pueden ser puntuales o difusas (término que es aquí empleado en el sentido de cualquier fuente no puntual), continuas o intermitentes. Este último caso es particularmente importante tratándose de contaminación de las aguas, visto que durante las lluvias los cursos de agua reciben una carga adicional de contaminantes provenientes del «lavado» del suelo y de la atmósfera. En las zonas urbanas, por ejemplo, las aguas de lluvia transportan gran cantidad de residuos sólidos, aceites, grasas y sedimentos que se encuentran en las calles, y deben ser consideradas como aguas contaminadas17. 4.3.1 Toxicidad El hecho que una substancia sea biodegradable no significa que ella no sea dañina para el medio ambiente, así muchos contaminantes presentan efectos de alguna manera proporcionales a su concentración en el medio. 4.3.2 Contaminantes físicos y químicos Un cuerpo de agua contaminado presenta concentraciones de substancias químicas o partículas sólidas suficientemente diferentes de las naturales para provocar una modificación de las condiciones del hábitat, haciéndolo dañino para los seres vivos o perjudiciales para la salud del hombre. Además de la contaminación, otra forma de degradación de las aguas de superficie es la sedimentación a lo largo del canal del río o en el fondo de un lago. La sedimentación origina una serie de modificaciones del hábitat con consecuencias dañinas para la biota acuática, soterrando las comunidades bentónicas, o sea, los organismos que viven en el fondo de los cuerpos de agua. A medida que las partículas sólidas se sedimentan, arrastran consigo el fito y el zooplancton para el fondo del cuerpo de agua. La presencia de partículas en suspensión afecta también la calidad del agua disminuyendo la cantidad de luz que atraviesa el cuerpo de agua y en consecuencia interfiriendo en el proceso de fotosíntesis. También aceites y grasas son dañinos para la biota por formar una película alrededor de los organismos e interfieren, por ejemplo, con la respiración ----------------------------------------------- 17
SÁNCHEZ, Luis Enrique. 1995. Control de la contaminación de las aguas. En: “Aspectos Geológicos de Protección Ambiental”, Volumen I, UNESCO.
30
de los peces. Estos contaminantes también tienen un efecto estético indeseable, una vez que su presencia en la superficie de los cuerpos de agua es fácilmente visible a simple vista. La presencia excesiva de fósforo es la principal responsable por el fenómeno de eutrofización, o sea, una gran proliferación de algas y plantas acuáticas, producto del exceso de nutrientes18. 4.4 INDICADORES BIOLÓGICOS Un grupo importante de indicadores de calidad del agua es el de los indicadores biológicos, en donde la presencia o ausencia de determinados grupos de organismos sirve como indicador de contaminación. Determinadas especies sólo sobreviven en aguas muy limpias, mientras que otras, son extremadamente resistentes a la contaminación. El estudio de las biocenosis acuáticas y en particular de las comunidades que tienen poca movilidad hace posible la detección de alteraciones ocasionadas por diversas fuentes. Los organismos que viven en contacto directo con el substrato (bentos) o adheridos a objetos fijos, inclusive plantas (perifíton), muestran bien la calidad del agua. En condiciones de ausencia de contaminación las comunidades bentónicas se caracterizan por una alta diversidad o sea, la presencia de gran número de especies y reducido número de individuos de cada especie. La mayoría de las formas de contaminación reduce la complejidad del ecosistema, eliminando las especies más sensibles. 4.4.1 Los anfibios como bio-indicadores Los anfibios son organismos importantes para la estabilidad de los ecosistemas, al ser un gran componente de la biomasa de los vertebrados y ser elementos claves en la cadena alimenticia19.Los anfibios se caracterizan por su dependencia a los cuerpos de agua y humedad, por tener un ciclo de vida complejo, y por poseer una gran sensibilidad fisiológica a condiciones ambientales por medio de su piel altamente permeable, todas estas condiciones indican que los anfibios serían uno de los primeros grupos a ser afectados por alteraciones ambientales20, de manera que pueden servir como indicadores de la salud ambiental21. Sin embargo, diferentes anfibios parecen ser más sensibles a ciertas alteraciones ambientales que otros, y existe una variación entre especies y tóxicos22. Por lo tanto, su efectividad como bioindicadores depende de la situación y la especie bajo ------------------------------------------ 18 SÁNCHEZ. Op. Cit. p. 3. 19
BLAUSTEIN, A.R y WAKE, D.B. 1990. Declining amphibian populations: A global phenomenon. Trends Ecol. Evol. 5: 203-204. 20
WAKE, D.B. 1991. Declining amphibian populations. Sci. 253-860. 21 BLAUSTEIN. Op. Cit. p. 206 22
PECHMANN, J.H. y WILBUR, H.M. 1994. Putting declining amphibian populations in perspective natural fluctuations and human impact. Herpetol. 50(1): 85-97
31
estudio23. De ser bioindicadores efectivos ante el estrés ambiental se reflejaría en aspectos como: mayores tasas de mortalidad, disminución de la población, anormalidades genéticas, de comportamiento, morfológicas y fisiológicas.
--------------------------------------------------------------
23 Blaustein. Op. Cit. p .208
32
5. METODOLOGÍA
5.1 METODOLOGÍA DE CAMPO
Durante las salidas de campo se colectaron entre dos y tres posturas por cada especie propuesta, las cuales fueron transportadas al laboratorio de Herpetología de la Universidad del Tolima para el desarrollo de los experimentos. En cada una de las zonas muestreadas se registró la temperatura y el pH con un medidor portátil de pH y temperatura (Ref. PH83140) de las charcas en donde se colectaron las posturas (Tabla 1). Tabla 1. Temperatura y pH de las zonas de muestreo.
ZONAS DE MUESTREO
TEMPERATURA
ºC
pH
Vereda Potrerillo, Municipio de Coello
27.7
6.75
Payandé, Municipio de San Luis
23.0
6.88
Instalaciones de la Universidad del Tolima, Ibagué
26.5
6.62
5.1.1 Identificación de las especies de estudio. Para la identificación de las especies de estudio se tuvo en cuenta el tipo de postura presentada por cada una de ellas (Tabla 2) realizando una previa revisión teórica del modelo propuesto por Duellman y Trueb24 (Anexo A). ---------------------------------------------- 24
DUELLMAN. Op. cit. p. 9
33
Tabla 2. Modos reproductivos de las cuatro especies de anuros a estudiar según Duellman y Trueb (1986).
Hábitat de
ovoposición
Tipo de
ovoposición
Características
Modo N°
Especie
Huevos Acuáticos
Huevos depositados
en agua
Huevos y larvas desarrollados en aguas lenticas.
1
Hypsiboas crepitans
Huevos y
primeros estadios larvales en
filtraciones o depresiones inundadas.
5
Rhinella granulosa
Huevos y larvas desarrollados en
aguas lóticas.
2
Rhinella marina
Huevos en nidos de espuma
Nido de espuma en estanques.
8
Engystomops
pustulosus
5.2 METODOLOGÍA DE LABORATORIO Las posturas colectadas fueron llevadas al Laboratorio de Herpetología, Eco-fisiología y Etología de la Universidad del Tolima donde con la ayuda del estereoscopio (Ref. 50200162) se observó el estadío de los embriones, para realizar los experimentos con embriones en estadío 10 y renacuajos en estadío 25, según la clasificación hecha por Gosner25. ------------------------------------------- 25
GOSNER, K y BLACK, I. 1957. The effects of acidity on the development and hatching of New Jersey frogs. Ecol. 38: 256-262.
34
Para las pruebas de tolerancia al pH, cada una de las cuatro especies fue expuesta a un rango de pH ácidos y básicos ajustados con cuatro sustancias diferentes durante un periodo de 48 horas. Para lo cual se utilizarán 240 embriones y 240 renacuajos para la realización de las pruebas en el laboratorio. Los ejemplares fueron divididos en cuatro grupos de 120 individuos y sometidos a varios rangos de pH empleando 4 sustancias diferentes. A las 48 horas se determinó la tolerancia al pH a través del índice de la dosis medial letal (LC50). Los tratamientos con el pH ácido fueron de 3.5, 4.5, 5.5 y 6.5 ajustado con ácido clorhídrico (HCl) y ácido acético (CH3COOH); y para el pH básico fueron de 8.5, 9.5, 10.5 y 11.5, ajustados con hidróxido de sodio (NaOH) e hidróxido de amonio (NH4OH). Los embriones y renacuajos objeto de estudio fueron expuestos por duplicado (4 tratamientos más 1 control) a cada pH en recipientes de vidrio con un litro de agua declorada. Durante este tiempo los individuos no fueron alimentados. El agua fue renovada cada doce horas ajustando el pH y registrando la temperatura (mediante un medidor portátil de pH y °C, Ref. PH83140), la conductividad especifica (mediante un conductímetro marca Hanna, Ref. 8633) y el oxigeno disuelto (mediante un oxímetro marca Hanna, Ref. 8043) en cada tratamiento. Las observaciones de los individuos se llevaron a cabo a las 2, 12, 24, 36 y 48 horas una vez iniciado el test y durante estas observaciones los individuos muertos fueron retirados del experimento (Anexo B). Al finalizar la fase experimental se realizaron observaciones para determinar los efectos que causan en los individuos de estudio la exposición a diferentes niveles de pH, estableciendo aspectos como desprendimiento de las membranas y separación de los polos en los embriones y nado errático y letargo en el crecimiento en larvas.
5.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos se utilizó el programa estadístico Probit (Versión 1.5 SAS Institute), mediante el cual se obtuvo la dosis media letal (LC50); la cual es la dosis única de una sustancia de la que se espera produzca la muerte del 50% de los animales a los que se haya administrado.
De igual forma se utilizó el programa estadístico Infostat para medir el (Teórico) el cual fue comparado con los valores LC50 hallados, de manera que nos indica si
la estimación de los es confiable o nó y si la distribución es homogénea. El mismo paquete estadístico fue utilizado para realizar la prueba T para muestras independientes (estadío 10, estadío 25) para realizar las comparaciones interespecíficas frente a la tolerancia de cada sustancia estableciendo si existen o nó diferencias significativas entre ellas.
35
6. RESULTADOS
6.1 CONDICIONES FÍSICO – QUÍMICAS DURANTE LA EXPERIMENTACIÓN.
Tabla 3. Datos promedios de las condiciones físico – químicas tomadas durante las 48 horas del experimento de todas las especies. Potencial de hidrógeno (pH); Temperatura (ºC); Oxígeno disuelto (mg/L); Conductividad (µS/cm); Controles (*).
pH Temperatura
ºC Oxigeno disuelto (mg/L)
Conductividad
(µS/cm)
pH Temperatura
ºC Oxigeno disuelto (mg/L)
Conductividad
(µS/cm)
Á. ac
éti
co
*7.2 24.7 7.20 310
H. d
e S
od
io *7.2 25.0 7.65 321
3.5 23.9 7.35 1212 8.5 24.7 7.68 330
4.5 24.5 6.99 564 9.5 23.4 6.96 385
5.5 23.5 7.56 456 10.5 25.4 6.87 510
6.5 24.0 7.45 325 11.5 23.6 7.17 1450
Á.c
lorh
ídrico
o.
cC
lorh
ídri
co
*7.0 23.7 7.36 299 H
. d
e A
mo
nio
*6.9 24.5 7.46 322
3.5 24.1 7.58 1311 8.5 23.9 7.59 327
4.5 24.2 7.50 584 9.5 24.3 7.42 389
5.5 23.6 7.63 431 10.5 25.1 7.45 512
6.5 25.3 7.54 341 11.5 23.8 6.88 1454
6.2 LC50 DE LAS ESPECIES OBJETO DE ESTUDIO.
6.2.1 LC50 de Hypsiboas crepitans.
(Teórico)=7,815 para la especie Hypsiboas crepitans para sustancias ácidas.
La prueba nos indica si la estimación de los es la adecuada, si comparamos estos valores observados con el valor teórico podemos observar que
el único valor mayor es el de el en estadío 10 para ácido acético por lo tanto los datos no tienen una distribución homogénea, lo cual ocasiona que la
estimación del no sea confiable y no se pueda hacer un intervalo de confianza en este caso (Tabla 4).
Las diferencias entre los encontrados es bastante pequeña, en ambos estadíos el ácido acético muestra un nivel de muy similar, mientras que para el ácido clorhídrico en estadío 10 muestra un menor que el estadío 25, quienes a su vez son menores que los del ácido acético mostrando una mayor sensibilidad por parte de ambos estadíos de desarrollo a las concentraciones más bajas de pH para el ácido acético que a las concentraciones de ácido clorhídrico (Figura 5).
36
(Teórico)=7,815 en la especie Hypsiboas crepitans para sustancias básicas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados (Tabla 5). Podemos observar que de la misma manera las diferencias entre estos valores es mínima, pero en esta especie es más sensible a las concentraciones más bajas de pH aplicando hidróxido de amonio en estadío 10, por lo tanto podemos decir que son más resistentes los embriones en estadío 25. Además en estadío 25 la tasa de mortalidad del 50% está alrededor de la misma concentración para ambas sustancias (Figura 5).
Tabla 4. LC50 de Hypsiboas crepitans en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
SUSTANCIA
ESTADÍO
ÁCIDO ACÉTICO
( -COOH)
ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl)
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
5,272 9,230 4,506 4,009 4,009 4,873
ESTADÍO 25
5,625 5,042 5,334 1.929 4,922 4,306 4,620 2,876
Tabla 5. LC50 de Hypsiboas crepitans en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
SUSTANCIA ESTADÍO
HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)
HIDRÓXIDO DE AMONIO
( )
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
9,163 9,903 9,557 2,596 8,670 9,291 9,007 0,937
ESTADÍO 25
9,558 10,131 9,849 2,888 9,376 9,893 9,640 6,389
37
Figura 4: LC50 para la tolerancia al pH en H. Crepitans en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
Figura 5: LC50 para la tolerancia al pH en H. crepitans en estadíos 10 y 25 frente a pH básicos
5,272 5,334
4,2664,62
0
1
2
3
4
5
6
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
A. Acético
A. Clorhídrico
8,4
8,6
8,8
9
9,2
9,4
9,6
9,8
10
EST 10 EST 25
pH
ESTADIO DE DESARROLLO
H. de sodio
H. de amonio
38
6.2.2 LC50 de Rhinella granulosa.
(teórico)=7,815 en la especie Rhinella granulosa para sustancias ácidas
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. Para ambos tipos de ácidos podemos observar que en el estadío 10 tiene una resistencia mayor a niveles más bajos de pH que el estadío 25 y una mayor resistencia de los embriones a los niveles de pH más bajos en presencia de ácido clorhídrico (Tabla 6 y Figura 6).
(teórico)=7,815 en la especie Rhinella granulosa para sustancias básicas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. Para esta especie la presencia en el ambiente de hidróxido de amonio es mucho más letal que la presencia de hidróxido de sodio. Pero tenemos para este caso particular que los embriones en estadío 10 son más sensibles a concentraciones más altas de pH que el estadío 25 en presencia de hidróxido de sodio, pero resistentes en presencia de hidróxido de amonio (Tabla 7 y Figura 7).
Tabla 6. LC50 de Rhinella granulosa en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
SUSTANCIA ESTADÍO
ÁCIDO ACÉTICO
( -COOH)
ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl)
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
4,706 4,166 4,444 2,728 4,506 4,009 4,265 4,870
ESTADÍO 25
4,932 4,4 4,676 0,333 4,827 4,317 4,585 0,185
39
Tabla 7. LC50 de Rhinella granulosa en estadìo 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de Sodio (NaOH) e Hidróxido de Amonio (NH4OH).
SUSTANCIA ESTADÍO
HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)
HIDRÓXIDO DE AMONIO
( )
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
9,777 10,287 10,034 0,124 9,376 9,911 9,648 0,772
ESTADÍO 25
9,519 10,245 9,883 3,269 9,388 10,027 9,714 1,416
Figura 6: LC50 para la tolerancia al pH en R. granulosa en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
4
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
A. Acético
A. Clorhídrico
40
Figura 7: LC50 para la tolerancia al pH en R. granulosa en estadío 10 y 25 frente a pH básicos.
6.2.3 LC50 de Rhinella marina.
(teórico)=7,815 en la especie Rhinella marina para sustancias ácidas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. Los embriones en estadío 10 son más resistentes a niveles bajos de pH que los que están en estadío 25 en presencia de cualquiera de los dos tipos de ácidos. También se observa que los embriones en un ambiente con presencia de ácido clorhídrico son más resistentes los que están en un ambiente con presencia de ácido acético (y Figura 8).
(teórico)=7,815 en la especie Rhinella marina para sustancias básicas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. En la figura 9 podemos observar que los embriones en estadío 10 son más resistentes a los niveles más altos de pH en presencia de cualquiera de los dos hidróxidos que las larvas de estadío 25. Pero son más resistentes a la presencia de hidróxido de sodio en el ambiente que a la presencia de hidróxido de amonio (Tabla 9).
9,4
9,5
9,6
9,7
9,8
9,9
10
10,1
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
H. de sodio
H. de amonio
41
Tabla 8. LC50 de Rhinella marina en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
SUSTANCIA ESTADÍO
ÁCIDO ACÉTICO
( -COOH)
ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl)
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
5,151 4,426 4,791 4,223 4,827 4,203 4,524 4,745
ESTADÍO 25
5,562 5,058 5,317 3,547 5,086 4,521 4,812 0,878
Tabla 9. LC50 de Rhinella marina en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
SUSTANCIA
ESTADÍO
HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)
HIDRÓXIDO DE AMONIO
( )
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
10,043 10,583 10,315 1.268 9,833 10,4 10,119 1,213
ESTADÍO 25
9,658 10,2 9,932 0,384 9,333 9,938 9,641 2,683
42
Figura 8: LC50 para la tolerancia al pH en R. marina en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
Figura 9: LC50 para la tolerancia al pH en R. marina en estadío 10 y 25 frente a pH básicos.
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
5,2
5,4
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
A. Acético
A. Clorhídrico
9,2
9,4
9,6
9,8
10
10,2
10,4
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
H. de sodio
H. de amonio
43
6.2.4 LC50 de Engystomops pustulosus.
(teórico)=7,815 en la especie Engystomops pustulosus para sustancias ácidas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. La diferencia de la tasa media de mortalidad entre los dos estadios de referencia en presencia de ácido clorhídrico es realmente mínima, y podría considerarse nula. Mientras que en presencia de ácido acético el estadío 10 es menos resistente a niveles bajos de pH que el estadío 25 (Tabla 10 y Figura 10).
(teórico)=7,815 en la especie Engystomops pustulosus para sustancias básicas.
En todos los casos el valor observado es menor al valor teórico por lo tanto los modelos de estimación son los adecuados. Para ambos tipos de hidróxido los embriones en estadío 10 son más resistentes a niveles altos de pH que las larvas de estadío 25, además los individuos en un ambiente en presencia de hidróxido de sodio son más resistentes a los que están en un ambiente en presencia de hidróxido de amonio (Tabla 11 y Figura 11).
Tabla 10. LC50 de Engystomops pustulosus en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia ácidas a diferentes pH: Ácido acético (CH3-COOH) y Ácido clorhídrico (HCl).
SUSTANCIA ESTADÍO
ÁCIDO ACÉTICO
( -COOH)
ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCl)
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
6,165 5,608 5,88 0,062 5,606 4,986 5,295 0,577
ESTADÍO 25
5,563 4,92 5,42 1,037 5,515 4,883 5,195 0,525
44
Tabla 11. LC50 de Engystomops pustulosus en estadío 10 y 25 expuestos a dos sustancia básicas a diferentes pH: Hidróxido de sodio (NaOH) e Hidróxido de amonio (NH4OH).
SUSTANCIA ESTADÍO
HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)
HIDRÓXIDO DE AMONIO
( )
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
INTERVALO
DE CONFIANZA
MEDIA
ESTADÍO 10
9,124 9,736 9,44 2,604 8,69 9,238 8,976 0,182
ESTADÍO 25
9,573 10,177 9,878 2,855 9,136 9,838 9,505 2,888
Figura 10: LC50 para la tolerancia al pH en E. pustulosus en estadío 10 y 25 frente a pH ácidos.
4,8
5
5,2
5,4
5,6
5,8
6
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
A. Acético
A. Clorhídrico
45
Figura 11: LC50 para la tolerancia al pH en E. pustulosus en estadío 10 y 25 frente a pH básicos.
6.3 COMPARACIÓN INTERESPECÍFICA FRENTE A LA TOLERANCIA A DIFERENTES SUSTANCIAS. 6.3.1 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al ácido acético (CH3-COOH).
En base a los LC50 obtenidos (Tabla 12) se establece mediante una prueba T para muestras independientes (estadio 10, estadio 25) una media para el estadío 10 de 5,1 y para estadío 25 de 5,19, dándonos un valor P=0,8087; para un valor objetivo de 0,025 se acepta la hipótesis de que las medias son iguales, por lo tanto no existen diferencias significativas entre estadío 10 y estadío 25 de desarrollo. De la misma forma podemos ver en la gráfica que los estadíos de desarrollo tienden a tener los mismos valores y muestran una tendencia lineal entre las especies, lo que indica que al aplicar ácido acético en el ambiente no existen diferencias significativas ni entre los estadíos de desarrollo ni entre las diferentes especies (Figura 12).
9,2
9,4
9,6
9,8
10
10,2
10,4
EST 10 EST 25
pH
ESTADIOS DE DESARROLLO
H. de sodio
H. de amonio
46
Tabla 12. Valores LC50 de las especies expuestas al ácido acético en dos estadíos de desarrollo (10 y 25)
Estadíos Especies
Estadío 10
Estadío 25
Hypsiboas crepitans 5.272 5.334
Rhinella granulosa 4.444 4.676
Rhinella marina 4.791 5.317
Engystomops pustulosus 5.880 5.420
Figura 12: LC50 para la tolerancia al pH en las especies estudiadas expuestas al ácido acético (CH3-COOH).
0
1
2
3
4
5
6
7
HC RG RM EP
pH
ESPECIES
EST(10)
EST(25)
47
6.3.2 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al ácido clorhídrico (HCl).
En base a los LC50 obtenidos (Tabla 13) se establece mediante una prueba T para muestras independientes (estadio 10, estadio 25) una media para el estadío 10 de 4,59 y una media para el estadío 25 de 4,8, dándonos un valor P=0,4720, para un valor objetivo de 0,025 por lo que se acepta la hipótesis de que las medias son iguales, por lo tanto no existen diferencias significativas entre estadío 10 y estadío 25 de desarrollo. En la figura 13 se tiene una tendencia lineal entre las especies y unos valores entre estadíos de desarrollo muy cercanos, por lo que al aplicar acido clorhídrico al ambiente no tendremos diferencias significativas en cuanto a mortalidad entre los estadíos de desarrollo y entre las especies.
Tabla 13. Valores LC50 de las especies expuestas al ácido clorhídrico en dos estadíos de desarrollo (10 y 25).
Estadíos Especies
Estadío 10
Estadío 25
Hypsiboas crepitans 4.266 4.620
Rhinella granulosa 4.265 4.585
Rhinella marina 4.524 4.812
Engystomops pustulosus 5.295 5.195
48
Figura 13: LC50 para la tolerancia al pH en las especies estudiadas expuestas al ácido clorhídrico (HCl).
6.3.3 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al hidróxido de sodio (NaOH).
En base a los LC50 obtenidos (Tabla 14) se establece mediante una prueba T para muestras independientes (estadio 10, estadio 25) una media para el estadío 10 de 9,84 y una media para el estadío 25 de 9,89, dándonos un valor P=0,8269, para un valor objetivo de 0,025 se acepta la hipótesis de que las medias son iguales, por lo tanto no existen diferencias significativas entre estadío 10 y estadío 25 de desarrollo. Aunque la prueba T nos indica que no existen diferencias significativas entre los estadíos de desarrollo, podemos observar que para el caso de estadio 25, según la especie existen diferencias realmente grandes, de lo cual podemos afirmar que las especies Hypsiboas crepitans y Engystomops pustulosus tienen menor resistencia a las concentraciones más altas de pH, mientras que la especie Rhinella marina es la que tiene mayor resistencia (Figura 14).
0
1
2
3
4
5
6
HC RG RM EP
pH
ESPECIES
EST(10)
EST(25)
49
Tabla 14. Valores LC50 de las especies expuestas al hidróxido de sodio en dos estadíos de desarrollo (10 y 25)
Estadíos Especies
Estadío 10
Estadío 25
Hypsiboas crepitans 9.557 9.849
Rhinella granulosa 10.034 9.883
Rhinella marina 10.315 9.932
Engystomops pustulosus 9.440 9.878
Figura 14: LC50 para la tolerancia al pH en las especies estudiadas expuestas al hidróxido de sodio (NaOH).
6.3.4 Comparación interespecífica frente a la tolerancia al hidróxido de amonio (NH4OH).
En base a los LC50 obtenidos (Tabla 15) se establece mediante una prueba T para muestras independientes (estadio 10, estadio 25) una media para el estadío 10 de 9,44 y una media para el estadío 25 de 9,63, dándonos un valor P=0,5488 para un valor objetivo de 0,025 se acepta la hipótesis de que las medias son iguales,
9
9,2
9,4
9,6
9,8
10
10,2
10,4
HC RG RM EP
pH
ESPECIES
H. DE SODIO EST(10)
H. DE SODIO EST(25)
50
por lo tanto no existen diferencias significativas entre estadío 10 y estadío 25 de desarrollo. La figura 15 nos muestra que en estadío 25 existen diferencias entre las especies, lo cual nos muestra que las especies Hypsiboas crepitans y Engystomops pustulosus tienen menor resistencia a las concentraciones más altas de pH, mientras que la especie Rhinella marina es la especie que presenta mayor resistencia.
Tabla 15. Valores LC50 de las especies expuestas al hidróxido de amonio en dos estadíos de desarrollo (10 y 25)
Estadíos Especies
Estadío 10
Estadío 25
Hypsiboas crepitans 9.007 9.640
Rhinella granulosa 9.648 9.714
Rhinella marina 10.119 9.641
Engystomops pustulosus 8.976 9.505
51
Figura 15: LC50 para la tolerancia en las especies estudiadas expuestas al hidróxido de amonio (NH4OH).
6.4 OBSERVACIÓNES DE LOS EFECTOS EN LAS CUATRO ESPECIES DE ANUROS FRENTE A CAMBIOS DE pH
En niveles de pH muy lejanos a la neutralidad como 3.5 y 11.5 los embriones de todas las especies objeto de estudio presentaron desprendimiento de las membranas y separación de los polos, afectando la eclosión. Se observó en las larvas de las cuatro especies expuestas a variaciones de pH letargo en el crecimiento al ser comparados con los controles.
8,4
8,6
8,8
9
9,2
9,4
9,6
9,8
10
10,2
10,4
HC RG RM EP
pH
ESPECIES
EST(10)
EST(25)
52
6.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Los anfibios se caracterizan por su dependencia a los cuerpos de agua y humedad, por tener un ciclo de vida complejo, y por poseer una gran sensibilidad fisiológica a condiciones ambientales por medio de su piel altamente permeable. Todas estas condiciones indican que los anfibios son uno de los primeros grupos en ser afectados por alteraciones ambientales26, de manera que sirven como indicadores de la salud ambiental27; lo cual se ve reflejado en aspectos como: mayores tasas de mortalidad, disminución de la población, anormalidades de comportamiento, morfológicas y fisiológicas ante condiciones cambiantes. En la fauna asociada a los cuerpos de agua los anfibios en sus primeros estadíos de desarrollo son uno de los componentes más vulnerables, ya que estos se encuentran estrechamente relacionados con las zonas de desove y sus larvas son muy sensibles a la calidad del agua28. En esta investigación se comprueba que la sensibilidad al pH del agua en los primeros estadíos de desarrollo es clave para la supervivencia de la especie, puesto que es en los primeros estadios ontogénicos (huevo- larva) cuando mas son afectados por cambios de pH del agua por su estrecha dependencia a este medio. En estadío 10 pH lejanos a la neutralidad afectó la gastrulación del embrión al presentar desprendimiento de las membranas y separación de los polos, afectó la eclosión y causó altas mortalidades; y en estadío 25 afectó el comportamiento de las larvas provocando nado errático y altas mortalidades29. Trabajos previos sobre el impacto de la contaminación de comunidades fluviales indican que los anuros son organismos que en los primeros estadios de desarrollo (embrionario) muestran mayor sensibilidad a cambios de pH del agua circundante que en una etapa tardía o larvaria30, lo cual concuerda con los resultados aquí obtenidos para las especies Hypsiboas crepitans e Engystomops pustulosus. Sin embargo, resulta contradictorio para las especies Rhinella granulosa y Rhinella marina, las cuales resultan ser más tolerantes a cambios de pH en estadío embrionario 10 que en estadio larvario 25. De esta manera en este estudio no se encontró una tendencia clara en cuanto a tolerancia a cambios de pH según su estadío de desarrollo. ------------------------------------------------- 26
WAKE. Op.Cit. 7 27
BLAUSTEIN, A.R. y WAKE, D.B. 1995. The puzzle of declining amphibian populations. Sci. Am. 272(4): 56-61. 28
FOMINYKH. Op. Cit. p 6 29
GREEN. Op. Cit. p. 4 30
GREEN. Op. Cit. p. 5
53
Räsänen31 afirma que los diferentes rangos de tolerancia ante cambios de pH entre especies se puede explicar por la diferencia existente entre las membranas extraembrionarias. Dice que la tolerancia de los embriones ante variaciones de pH depende de la estructura y composición de las cápsulas de los huevos, afirmando que entre más gruesa sea la cápsula, mayor es su nivel de tolerancia frente al pH y mayor supervivencia embrionaria habrá. Esto concuerda con los resultados en los que especies como Rhinella marina y Rhinella granulosa tienen mayor cantidad de vitelo y por ende mayor tolerancia que especies tales como Hypsiboas crepitans y Engystomops pustulosus. De acuerdo a nuestros resultados todas las especies estudiadas mostraron diferentes valores LC50 en los diferentes estadíos. Al comparar los rangos de tolerancia la especie más sensible a cambios de pH en el agua fue Engystomops pustulosus en ambos estadíos de desarrollo (10 y 25) tanto para sustancia básicas como ácidas, mientras que la especie más resistente en los experimentos frente a sustancias ácidas fue Rhinella marina y para las sustancias básicas fue Rhinella granulosa. Reportes realizados por Lehtinen y Skinner32 atribuyen las diferencias intraespecíficas a la capacidad de la especie en cada estadío ontogénico de regular la pérdida de iones a través de la membrana celular; de manera que dependiendo del estadío en el cual se encuentre el anfibio y la especie a la cual pertenezca tendrá mayor o menor capacidad de regulación iónica. De manera que se cree que la especie Engystomops pustulosus en estadío 10 es la especie que mas difícilmente puede regularse iónicamente puesto que muestra valores LC50 cercanos a la neutralidad. Las larvas de las cuatro especies estudiadas expuestas a diferentes rangos de pH que lograron sobrevivir mostraron un correcto desarrollo según lo observado 15 días después de la experimentación. Estudios previos en anfibios muestran que los renacuajos expuestos a pH ácidos presentan un proceso de metamorfosis normal, lo que indica que aparentemente el pH no tiene efectos sobre el proceso de metamorfosis33. Aunque para los embriones, estudios anteriores como los --------------------------------------------------- 31
RÄSÄNEN, Katja, et al. 2003. Geographic Variation in Acid Stress Tolerance of the Moor Frog, Rana arvalis. Source: Evolution, Vol. 57, No. 2 (Feb., 2003), pp. 352-362 Published by: Society for the Study of Evolution 32
LEHTINEN, Richard y SKINNER, Allen. 2006. The Enigmatic Decline of Blanchard’s Cricket Frog (Acris crepitans blanchardi): A Test of the Habitat Acidification Hypothesis. En: Copeia, 2006(2), pp. 159–167 33
GRANT, Karen y LICHT, Lawrence. 1993. Acid Tolerance of Anuran Embryos and Larvae from Central Ontario. En: Journal of Herpetology, Vol. 27, No. 1, pp. 1-6, 1993 Copyright 1993 Society for the Study of Amphibians and Reptiles
54
de Brady y Griffiths34 demostraron que Triturus helveticus y Triturus vulgaris (Clase: Anfibios) incubados en condiciones de acidez (pH 5.5) mostraron un desarrollo más lento en comparación con los controles, tal y como se observó en este estudio. Estudios anteriores de Frisbie y Wyman35 indican que los efectos tóxicos de pH en larvas y renacuajos resultan en perdida de calcio Ca+ de los sitios de unión del epitelio respiratorio y aumento de la permeabilidad de las membranas lo que provoca perdida excesiva de iones de sodio y cloro. En salamandras se ha observado mortalidades con pérdida del 50 a 62% del contenido total de sodio del cuerpo36. Los anfibios en estadío 25 que murieron durante la experimentación presentaron desprendimiento de las membranas lo que se cree sea causa de la perdida de contenido de sodio del cuerpo y al aumento de la permeabilidad de las membranas.
En este estudio se utilizaron cuatro sustancias, dos básicas y dos ácidas. Para las sustancias básicas se empleo hidróxido de sodio correspondiente a una base fuerte, ampliamente utilizada para la elaboración de jabones, crayones, papel, explosivos, pinturas y productos de petróleo; también se usa en el procesamiento de textiles de algodón, lavandería y blanqueado, revestimiento de óxidos, galvanoplastia y extracción electrolítica. Por su parte, el hidróxido de amonio, una base débil, se encuentra en múltiples productos y limpiadores industriales como removedores de revestimientos de pisos, limpiadores de ladrillos y cementos. Durante la experimentación realizada con estas sustancias básicas se encontró que los individuos de las diferentes especies expuestos a varias concentraciones de ambas bases presentaron mayor tolerancia al hidróxido de sodio que al hidróxido de amonio en los dos estadios de desarrollo objeto de estudio (10 y 25), por lo que su procedencia química en cuanto si es una base fuerte o una base débil no incide en la tolerancia a estas. Múltiples estudios indican que los productos amoniacales pueden causar efectos letales en los anfibios; por ejemplo, Ortiz37
observo que el impacto potencial de la contaminación del agua con sustancias amoniacales en el campo puede incluir no sólo los efectos directos sobre la supervivencia de embriones y larvas, sino también la alteración de los comportamientos de reproducción, que pueden reducir el éxito reproductivo y en última instancia afectar la condición de la población.
----------------------------------------------------------- 34
BRADY. Op. Cit. p. 4 35
FRISBIE, MP y WYMAN, RL. 2004 The effect of environmental pH on sodium balance in the red-spotted newt, Notophthalmus viridescens. En: Archives of Environmental Contamination and Toxicology 36
FRISBIE. Op. Cit. p. 3 37
ORTIZ-SANTALIESTRAA, Manuel, et al. 2007. Effects of ammonium nitrate exposure and water acidification on the dwarf newt: The protective effect of oviposition behaviour on embryonic survival. En: Aquatic Toxicology Volume 85, Issue 4, 30. Pages 251-257
55
Para la experimentación con sustancias ácidas se empleo ácido acético y ácido clorhídrico. El ácido acético corresponde a un ácido débil cuyas aplicaciones en la industria química van muy ligadas a sus esteres, como son el acetato de vinilo ó el acetato de celulosa base para la fabricación de lalo, rayón y celofán, adicionalmente existen reportes del uso del ácido acético en apicultura para el control de larvas y huevos de polilla de la cera. El ácido clorhídrico es un ácido fuerte que se disocia completamente en disolución acuosa empleado como desincrustante para eliminar residuos de caliza (carbonato cálcico: CaCO3). Durante la experimentación realizada con estas sustancias ácidas se encontró que los individuos de las diferentes especies expuestos a varias concentraciones de ambos ácidos presentaron mayor tolerancia al ácido clorhídrico que al ácido acético en los dos estadíos de desarrollo objeto de estudio (10 y 25), por lo que su procedencia química en cuanto si es un ácido fuerte o un ácido débil no incide en la tolerancia a estas, puesto que se esperaría que el ácido clorhídrico al ser un ácido fuerte causara mayor mortalidad que el ácido acético correspondiente al ácido débil, lo que nos indica que el efecto de mortalidad de los individuos está estrechamente ligado con el nivel de pH empleado, pero también depende de la naturaleza química de las sustancias que generan los pH, ya que en este trabajo se encontró que las bases y ácidos débiles fueron más letales que los ácidos y bases fuertes aun mismo pH.
56
CONCLUSIONES
El establecimiento de rangos de tolerancia a diferentes niveles de pH en anfibios en sus primeros estadíos es un aspecto importante en la conservación de las especies, puesto que nos indica el nivel de pH que cada especie de anfibio en estadío embrionario y larval puede tolerar en caso de vertimientos de sustancias que alteren el pH de los cuerpos de agua, de manera que se pueda calcular o predecir el impacto que va a generar la variación del pH en la población que habita en el cuerpo de agua afectado.
Hypsiboas crepitans e Engystomops pustulosus muestran mayor sensibilidad en estadío 10 en comparación con estadío 25 para todas las sustancias (ácidas y básicas)
Rhinella granulosa y Rhinella marina, son más tolerantes a cambios de pH en estadío embrionario 10 que en estadío larvario 25.
Engystomops pustulosus es la especie más sensible a cambios de pH del agua en ambos estadíos de desarrollo (10 y 25) tanto para sustancia básicas como ácidas.
Rhinella marina es la especie más resistente en los experimentos frente a sustancias ácidas y Rhinella granulosa fue la más resistente frente a sustancias básicas.
Durante la experimentación realizada con dos sustancias básicas se encontró que los individuos de las diferentes especies presentaron mayor tolerancia al hidróxido de sodio que al hidróxido de amonio en los dos estadíos de desarrollo objeto de estudio (10 y 25) a un mismo pH.
Las cuatro especies objeto de estudio presentaron mayor tolerancia al ácido clorhídrico que al ácido acético en los dos estadios de desarrollo (10 y 25). a un mismo pH.
57
Mediante la experimentación se pudo comprobar que cambios abruptos del pH del agua causa rápidamente altas mortalidades, demostrando así que el vertimiento de sustancias que alteran el pH como los agro-químicos son letales para la fauna asociada a los cuerpos de agua, tales como los anfibios.
El pH encontrado en los lugares de muestreo tienden a ser neutros (Potrerillo: 6.75, Payandé: 6.88 y Universidad del Tolima: 6.62), por lo que en los valores de pH más cercanos a la neutralidad (6.5 y 8.5) la mortalidad fue baja o nula.
Los anfibios sirven como bio-indicadores de la salud ambiental, puesto que ante cambios de pH del agua se incrementa la tasa de mortalidad de la población.
58
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar estudios tanto ex-situ como in-situ de los múltiples efectos subletales en los anfibios frente al cambio bruscos de pH en los cuerpos de agua.
Se aconseja realizar estudios posteriores acerca del mecanismo de respuestas fisiológicas de los anfibios ante diferentes rangos de pH.
Se recomienda realizar estudios posteriores que indiquen si la mortalidad de los anfibios depende del nivel de pH empleado o depende de la procedencia química de la sustancia empleada.
59
BIBLIOGRAFÍA
BLAUSTEIN, A.R y WAKE, D.B. 1990. Declining amphibian populations: A global phenomenon. Trends Ecol. Evol. 5: 203-204. BLAUSTEIN, A.R y WAKE, D.B. 1995. The puzzle of declining amphibian populations. Sci. Am. 272(4): 56-61. BRADY, L.D y GRIFFITHS, R.A. 1995. Effects of pH and aluminium on the growth and feeding behaviour of smooth and palmate newt larvae. En: Ecotoxicology, 4, 299-306 BRODKIN, et Al. 2003. Effects of Acid Stress in Adult Rana pipiens. En: Journal of experimental zoology. 298A:16–22.
CORTOLIMA. 2002. Municipio de Coello. Esquema de ordenamiento territorial, Caracterización, libro 1
DUELLMAN y TRUEB. 1986. Biology of Amphibians. P.9. FOMINYKH, A. S. 2008. An Experimental Study on the Effect of Alkaline Water pH on the Dynamics of Amphibian Larval Development. En: Russian Journal of Ecology. 2008, Vol. 39, No. 2, pp. 145–147. FRISBIE, MP y WYMAN, RL. 2004 The effect of environmental pH on sodium balance in the red-spotted newt, Notophthalmus viridescens. En: Archives of Environmental Contamination and Toxicology GOSNER, K y BLACK, I. 1957. The effects of acidity on the development and hatching of New Jersey frogs. Ecol. 38: 256-262. GRANT, Karen y LICHT, Lawrence. 1993. Acid Tolerance of Anuran Embryos and Larvae from Central Ontario. En: Journal of Herpetology, Vol. 27, No. 1, pp. 1-6, 1993 Copyright 1993 Society for the Study of Amphibians and Reptiles GREEN, Linda y PELOQUIN, Jennifer. 2008. Acute toxicity of acidity in larvae and adults of four stream salamander species (plethodontidae). En: Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 27, No. 11, pp. 2361–2367.
60
GRIYS-KYLE, Kerry y RITCHIE, L. 2007. Amphibian survival, growth and development in response to mineral nitrogen exposure and predator cues in the Weld: an experimental approach. En: Revista Oecologia. 152:633–642. HEYER, R. W, et al. 1994. Measuring and monitoring biological diversity, standard methods for amphibians. Smithsonian Institution United States of America. p. 53
JUHA, Merila, et Al. 2004. Local adaptation and genetics of acid-stress tolerance in the moor frog,Rana arvalis. En: Conservation Genetics 5: 513–527
KARASOV, Jofre. 1999. Direct effect of ammonia on three species of north american anuran amphibians. En: Environmental Toxicology and Chemistry. Vol. 18, No. 8, pp. 1806–1812
LEHTINEN, Richard y SKINNER, Allen. 2006. The Enigmatic Decline of Blanchard’s Cricket Frog (Acris crepitans blanchardi): A Test of the Habitat Acidification Hypothesis. En: Copeia, 2006(2), pp. 159–167 MCKENZIE, Picker, et al. 1993. Embryonic Tolerance of Xenopus (Anura) to Acidic Blackwater. En: American Society of Ichthyologists and Herpetologists. Vol. 1993, No. 4, pp. 1072-1081. ORTIZ-SANTALIESTRAA, Manuel, et al. 2007. Effects of ammonium nitrate exposure and water acidification on the dwarf newt: The protective effect of oviposition behaviour on embryonic survival. En: Aquatic ToxicologyVolume 85, Issue 4, 30. Pages 251-257 Pechmann J.H. & H.M. Wilbur. 1994. Putting declining amphibian populations in perspective natural fluctuations and human impact. Herpetol. 50(1): 85-97.
PECHMANN, J.H. y WILBUR, H.M. 1994. Putting declining amphibian populations in perspective natural fluctuations and human impact. Herpetol. 50(1): 85-97
POUGH, F.H y WILSON, R.E. 1998. Acid precipitation and reproductive success of Ambystoma salamanders. Water Air Soil Poll. 7: 307-316. RÄSÄNEN, Katja, et al. 2003. Geographic Variation in Acid Stress Tolerance of the Moor Frog, Rana arvalis. Source: Evolution, Vol. 57, No. 2 (Feb., 2003), pp. 352-362 Published by: Society for the Study of Evolution SÁNCHEZ, Luis Enrique. 1995. Control de la contaminación de las aguas. En: “Aspectos Geológicos de Protección Ambiental”, Volumen I, UNESCO. WAKE D.B. 1991. Declining amphibian populations. Sci. 253-860.
61
ANEXOS Anexo A. Listado de modos reproductivos en anuros referenciados por Duellman y Trueb (1896).
Hábitat de Ovoposición
Tipo de Ovoposición
Características Modo
N°
Huevos Acuáticos.
Huevos depositados
en agua
Huevos y larvas desarrolladas en aguas lenticas 1
Huevos y larvas desarrolladas en aguas lóticas 2
Huevos y primeras etapas larvarias en nidos de barro. Estadios posteriores en aguas abiertas.
3
Huevos y larvas se desarrollan en huecos de árboles inundados o plantas fitotélmicas.
4
Huevos y primeros estadíos larvales en filtraciones y depresiones inundadas
5
Huevos y larvas depositadas en huecos de árboles inundados o plantas fitotélmicas.
6
Huevos acuáticos de incubación gástrica. 7
Huevos en nido de
espuma.
Nido de espuma en estanques. 8
Nido de espuma en estanques, desarrollo larval en quebradas.
9
Huevos en el dorso de la
hembra acuática.
Huevos incubados, larvas se alimentan en aguas libres. 10
Huevos incubados en sacos dorsales de la hembra. 11
Huevos terrestres o arbóreos.
Huevos en la
tierra o madrigueras.
Huevos depositados en excavaciones, larvas acuáticas. 12
Huevos en rocas o suelo encima del agua, larvas acuáticas.
13
Huevos incubados, larvas llevadas al agua por el adulto. 14
Huevos incubados, larvas con saco vitelino que completan su desarrollo en nidos.
15
Huevo incubados, larvas con saco vitelino que completan su desarrollo en el dorso del adulto.
16
Huevos dentro de nidos n la tierra o madrigueras, desarrollo directo.
17
Huevos
arbóreos.
Huevos depositados en vegetación sobre quebradas. Larvas caen al agua a manera de goteo.
18
Huevos depositados en vegetación, larvas caen en agua de filtración de cavernas o árboles.
19
Huevos dentro de nidos arbóreos. 20
Huevos en nidos de espuma.
Nidos en madrigueras, posterior a inundaciones las larvas se desarrollan en aguas abiertas.
21
Nidos en madrigueras, larvas con saco vitelino completan su desarrollo en él.
22
Nidos arbóreos, las larvas caen en goteo sobre estanque o quebradas.
23
Huevos llevados por el
adulto.
Huevos transportados en las piernas del macho, larvas de desarrollo acuático.
24
Huevos llevados en saco dorsal de la hembra, desarrollo de larvas acuático.
25
Huevos llevados en saco dorsal de la hembra, desarrollo directo.
26
62
Anexo B. Montaje de laboratorio.
63
Anexo C. Fichas técnicas de referencia de las especies de anuros objeto de estudio.
Rhinella marina (Linnaeus, 1758)
NV: Sapo de Caña
Clasificación científica
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Clase: Amphibia
Orden: Anura
Familia: Bufonidae
Género: Rhinella
Especie R. marina
Estado de conservación
IUCN 3.1
Hypsiboas crepitans (Linnaeus, 1758)
NV: Rana Blanca
Clasificación científica
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Clase: Amphibia
Orden: Anura
Familia: Hylidae
Género: Hypsiboas
Especie: H.crepitans
Estado de conservación
IUCN 3.1
Rhinella granulosa (Linnaeus, 1758)
NV: Bufo granulosa
Clasificación científica
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Clase: Amphibia
Orden: Anura
Familia: Bufonidae
Género: Rhinella
Especie R. granulosa
Estado de conservación
IUCN 3.1
Engystomops pustulosus (Linnaeus, 1758)
NV: Rana Túngara
Clasificación científica
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Clase: Amphibia
Orden: Anura
Suborden: Neobatrachia
Familia: Leiuperidae
Género: Engystomops
Especie E. pustulosus
Estado de conservación
IUCN 3.1