tipificación vph pcrtr - comanes.org · o sugestivo de vph nic 1 nic2 nic 3 carcinoma h.e 460 ......
TRANSCRIPT
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Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privado
Dr. Jos de J. Curiel ValdsAnatomopatlogo
Patlogo ClnicoColposcopista
Academia Mexicana de Ciruga
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Evolucin en la deteccin del Cncer de Crvix
ThinPrep SurePath
1996 19991949
LBC: Citologa lquida
2003
Revisin de las pautas de screening
1990s LBC 2000sTest de Papanicolau
VHP 99,7% Cnceres de Crvix1
1Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado )
PCR
1980
P16 CINTecCervatec p16 ELISA
L1Ag CytoactivONCOTEC mRNA E6/E7Screening 1 basado en
DNA HPV
HC-2 / H VentanaAmplicor* RocheDNA Invader* WD
2008PREVENCION PRIMARIA
ESCENARIO POSTVACUNAL
Prevencin SecundariaProg. Base PoblacionalFinlandia 1963-2008
Meisels and Fortin 1976Purola and Savia 1977Coilocito / Efecto citopatico HPV
Drst et al. 1983
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1.- Estudio de Papanicolaou citologa cervical.
2.- Colposcopa
3.- Biopsia Estndar de
4.- Pruebas moleculares
Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?
FORMA TRADICIONAL
FORMA MODERNAMAS SEGURA
BASE LIQUIDA
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Es el mtodo de deteccin recomendado Se considera en NIC 1 poco sensible y especfica. Solo es positiva por definicin si existe una fase
productiva. NIC 2 y 3 es mas sensible y especfica. En base lquida sube la sensibilidad y especificidad. Es estndar para medir esta sensibilidad y
especificidad ha sido la biopsia.
Citologa
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Indicada cuando existe una citologa anormal
Usada de rutina y en personas de 20 a 30 aos es causa de sobre diagnstico
Imgenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrn de vasos etc.
Algunos muy caractersticos.
Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.
Colposcopa
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2.- Colposcopa
3.- Biopsia Estndar de Oro (?)
4.- Pruebas moleculares
Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?
NORMAL
VIRUS
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ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICA
FinoMetaplasia Madura
Metaplasia InmaduraRara vez NIC
DensoNIC Alto Grado
Liso
FinoMetaplasia Maduracon paraqueratosis
GruesoNIC Alto Grado
a Carcinoma Invasor
Mosaico
FinoNIC I
GruesoNIC II y III
Punteado
Metaplasia queratinizante
Siempre ver quehay por debajo
Leucoplasia
Aceto Blanco
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1.- Estudio de
2.- Colposcopa
3.- Biopsia Estndar de Oro (?)
4.- Pruebas mol
Cmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?
NORMAL
VIRUS
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TODAS LESIONES ACETOBLANCAS
NINFLAMATORIO/REACTIVO
O SUGESTIVO DE VPH NIC 1 NIC2 NIC 3 CARCINOMA
H.E 460 R /S 128 296 28 5 3
NEGATIVO 46.3 %POSITIVO
53.7 % DE + A +++ NUCLEAR O CITOPLASM
P16 460 213 212 20 12 3
P16 VS HISTOLOGA
Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008
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Valor Predictivo positivo: VP(+) = 0.5650
Valor Predictivo Negativo: VP(-) = 0.5986
Sensibilidad: Se = 0.7540
Especificidad: Es = 0.3872
ESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16
Curiel-Valds Rev Mex de enf del Tr Gen inf 2008
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CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOS
CONCORDANCIA INTEROBSERVADORCON H.E Y P16
NORMAL L. No Dx NIC 1 NIC 2 NIC 3 CARCINOMA TOTAL CONCORDANCIA
NORMAL 71% 3% 52% 35% 72% 94% 3800 71%
P 16 94% * 91% 100% 99% 100% 96%
KLAES AM. J. SURG PATH. NOV 2002
NIC DE 40 A 97 %
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FRAG 1 NIC 1
FRAG 2 NIC 2
100 % OBJETIVO
PATOLOGOSMEXICANOS
POSITIVO FOCAL
POSITIVO DIFUSOCuriel-Valds Rev Mex de G y obstet 2008
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No todo lo que parece es!!!
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UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR
80-90% < 25 aos~20 % > 30 aos
40-50% < 25 aos~20 % 30 aos
30 aos
A quienes seleccionar
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UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVENUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR
P16
PCR Y CH II
A quienes seleccionar
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J.J.C.V.
PORTADOR
Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema
antes de cualquier tratamiento
METAPLASIAS
HS
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Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPH
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DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO
DEFINICIN DE ALTO RIESGO POR BIOLOGA MOLECULAR Y DATOS
EPIDEMIOLGICOS. CASOS CON Dx HISTOLGICO DE CNCER Y NIC
META
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PCR CH2 OTROS
Inmunohistoqumica: P16 L 1 DE Cpsula otros
METODOS MOLECULARES
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PRODUCTIVA: L1 Y L2 TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (gRb) (ONCOGNICA)
AMBAS EN TRES ETAPAS CLNICAS PORTADOR SANO INFECCIN SUBCLNICA INFECCIN CLNICA
INFECCION POR VPHDOS MODALIDADES
TRES ETAPAS
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Deteccin
Como riesgo
Enfermedad
Diagnstico yCapacidad de progresin
Estudio citolgico
Sensibilidad medianaEspecificidad alta
Colposcopa
Sensibilidad altaEspecificidad baja
Biopsia
Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta
Clnico GineclogoColposcopista
Colposcopa y Toma de muestras
AnatomopatlogoCitopatlogo
Interpretacin y diagnstico
Patlogo
Deteccin a confirmacin
Donde est el Patlogo en el diagnstico del VPH
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EPIDEMIOLOGIADETECCION: Presencia de VPH como mtodo primario de tamizaje antes de citologa
CONFIRMACION DE DX ?
SEGUIMIENTO DESPUS DE TRATAMIENTO
CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA
Involucrados: Bilogos molecularesAnatomopatlogos Patlogos Clnicos, Qumicos
Para que se usan las pruebas moleculares
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EVOLUCIN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE
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HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-54
55-59
60-65
Age (Years)
HPV
Pre
vale
nce
(%) HPV (HC2)
Cancer
1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al. 2000 SEER Cancer Stats NCI, 1973-1997. Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.
0
5
10
15
20
25
30
0
5
10
15
20
25
30
Canc
er in
cide
nce
per 1
00,0
00
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Porque? Involucionan o evolucionan
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Ciclo viral productivo y transformante
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Replicacin, y electroforesis con comparacin de un codigo de barras contra controles ya establecidos.
No es absoluta la comparacin, similitud de un % decreciente 95 % virus de alto riesgo 89 % virus de bajo riesgo 70 Virus de alto riesgo.
PCR secuencial o de punto final
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Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente
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Como un mtodo de Dx epidemiolgico.
Detecta desde portadores y enfermedad transitoria hasta enfermos
No distingue fase productiva o transformante
Selecciona a quienes vigilar de los 30 aos en adelante.
PCR de punto finalIndicaciones de uso
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Hibridacin ADN/ARN. Cctel de sondas:
- Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
- Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de
tamizaje de VPH (1 pg/mL). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable.
(Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)
Deteccin del VPH mediante amplificacin de la seal. Tecnologa de captura de hbridos (HC2)
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Al ser menos sensible a travs de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia.
Factor pronstico de progresin.
Aprobado por FDA
Posteriormente su fuerza especificidad de no LAG o CaCu
CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA
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Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus
El mtodo ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolucin a Ca Cu
Se requiere un nmero relativamente elevado de copias para que sea oncognico
Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 aos
CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA
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El mismo mtodo para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA
Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz
Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos especficos de virus
El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee EN TIEMPO INMEDIATO (REAL) la progresin de la replicacin viral.
PRC en tiempo real
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Deteccin segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unin y el color en cada ciclo
Deteccin de enfermedades mixtas (varios tipos virales) PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan.
Tiempo de proceso: el mismo da (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mnimo 10 das
Costo: es semejante
PRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto final
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Mtodo de tamizaje Es mas senisble que el estudio citolgico (pero es mas caro) Si se realiza de manera simultnea obliga a revisar la
citologa de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG
Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)
CH2 y PCR tiempo real FUTURO
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Es preferible hacer colposcopa y tomar biopsia. La Positividad de PCR, CH2 no indica necesariamente
NIC, puede ser metaplasia atpica o inmadura con virus en reposo.
En EU la colposcopa y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2.
Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopa y biopsia.
En ASC US o H en Mxico
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PCR tr REPORTE
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Detalles de informe
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Controles detalles
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PCRtr permite la cuantificacin de los virus y ello permitehacer una homologa con CH2 ya que esta no significa queen realidad no se tenga VPH
Reporte grfica
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Ejemplos de infeccin mixta
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Ejemplos de infeccin mixta
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Ejemplos de infeccin mixta
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Se realizaron 1234 estudios de PCRtr para determinar la presencia y en su caso, el genotipo de VPH
3 aos (2013-2015) en pacientes atendidos en nuestra clnica de patologa.
En el 98% de las determinaciones se realizaron en mujeres (cervicales), el resto en hombres (no cervicales).
El promedio de la edad global fue de 33.74+9.39 aos, con un rango de los 11 a los 83 aos de edad. La edad en relacin al sexo no fue diferente (p>0.05), sin embargo, la edad de los hombres fue 3 aos mayor a la edad de las mujeres (36.9+11.91 vs 33.5+9.0).
El 36.2% de las muestras realizadas pertenecan a personas menores de 30 aos
Deteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aos
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Estudio estadstico
Se determin media y desviacin estndar, frecuencias y porcentajes.
Se aplicaron las pruebas de Kolmogorov-Smirnov, T de Student, ANOVA y Chi cuadrada.
Se calcularon los parmetros de prueba diagnstica con un intervalo de confianza del 95%.
El anlisis se realiz con el programa SPSSv19 y con el programa Epidat3.1.
Se tom como significancia estadstica un valor de p
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Resultados
Tabla 1. Intervalos de la edad de las personas evaluadas con la tcnica de PCR
Frecuencia
Porcentaje vlido
Intervalos de edad (aos)
11-18
10
0,8
19-25
206
17,0
26-33
472
39,0
34-43
365
30,2
44-53
106
8,8
54-63
41
3,4
64-73
8
0,7
74-83
2
0,2
Total
1210
100,0
-
PCR en relacin al sexo
Tabla 2. Relacin del resultado de la PCR y el sexo.
P=0.17
pcr
Total
pos
neg
Sexo
mujeres
442
657
1099
40,2%
59,8%
100,0%
hombres
12
11
23
52,2%
47,8%
100,0%
Total
454
668
1122
40,5%
59,5%
100,0%
-
Tabla 3. Asociacin del resultado de la PCR de acuerdo a los intervalos de edad.
P=0.001
pcr
Total
pos
neg
edad cat1
11-18
4
6
10
0,9%
0,8%
0,8%
19-25
104
102
206
23,3%
13,4%
17,0%
26-33
175
297
472
39,1%
38,9%
39,0%
34-43
116
249
365
26,0%
32,6%
30,2%
44-53
30
76
106
6,7%
10,0%
8,8%
54-63
16
25
41
3,6%
3,3%
3,4%
64-73
2
6
8
,4%
,8%
,7%
74-83
0
2
2
,0%
,3%
,2%
Total
447
763
1210
100,0%
100,0%
100,0%
-
05
10152025303540
11 a 25aos
26 a 33 34 a 43 44 a 53 54 a 83
PositivosNegativosColumna1
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PCR y citologa
*
* Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba
Tabla 4. Relacin entre el resultado de la PCR y del PAP.
P=0.0001
pcr
Total
pos
neg
papResul
Neg I y II
236
560
796
82,8%
99,5%
93,9%
ASCUS
16
0
16
5,6%
,0%
1,9%
NIC
33
3
36
11,6%
,5%
4,2%
Total
285
563
848
100,0%
100,0%
100,0%
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PCR y Biopsia
* Otros virus no comprendidos en los 28 de la prueba
Tabla 5. Relacin del resultado de la PCR con los resultados de la Biopsia.
P=0.43
pcr
Total
positivo
negativo
BIOPSIA
Metaplasia
66
17
83
56,9%
68,0%
58,9%
NIC 1
38
4 *
42
32,8%
16,0%
29,8%
NIC2
3
0
3
1,7%
,0%
1.7%
NIC3
2
0
2
1,7%
,0%
1,4%
No cervical
8
3
11
6,9%
12,0%
7,8%
Total
116
25
141
100,0%
100,0%
100,0%
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Sensibilidad y especificidad de PCRtr
Tabla 6. Resultados de la PCR como prueba diagnstica tomando en cuenta a la biopsia como estndar de oro
Sensibilidad
(IC 95%)
Especificidad
(IC 95%)
VPP
(IC 95%)
VPN
(IC95%)
ndice de Validez
IC95%)
Prevalencia (IC95%)
PCR (n=141)
85.71%
(75.66-95.77)
20%
(10.91-29.09)
41.38%
(31.99-50.77)
68%
(47.71-88.29)
46.1%
(37.5-54.6)
39%
(31.29-48.15)
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Los genotipos de AR se asociaron a la Citologa positiva (P=0.0001)
Los genotipos de bajo riesgo estn asociados tanto a Citologa como a la Biopsia positiva (P=0.0001)
En relacin a sexo, (mujer) (p=0.0001)
No hubo validez estadstica con la edad (p=0.035)
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PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013
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Positivos AR 76 43.6% 16 27 15.5 % 18 12 6.9% 31 7 4.0% 16 y 18 5 2.9%
Positivos BR 24 6 7 29% 11 5 20.8% 37 4 16.7%
PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormal
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Pareja con PCRtr correlacin 80% Pareja con PCR tradicional 20%
En relacin a persistencia: Con PCR tradicional se opt por inicial tipificar y despus con
CH2. Haba cambios de tipo viral frecuente
Con PCRtr en infecciones mltiples se aprecia eliminacin de varios y se conservan algunos o es negativo en su totalidad.
Seguimiento y correlacin con la pareja
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Mujer de 40 aos de edad con estudio citolgico anormal, LAG
Colposcopa normal, UEC en el orificio muy pequeo PCRtr positiva VPH 16 y 31 Cono diagnstico
Caso clnico 1
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Cono diagnstico
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PCR RT es una metodologa que se est usando en forma alterna y mas segura que CH2 y PCR de punto final
1.- Detecta infecciones mltiples 2.- El tipo viral detectados en el mas real 3.- Mismo costo 4.- Menos tiempo de proceso 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a los
dos cultivos.
Conclusin
Tipificacin VPH PCRtrResultados en medio privadoEvolucin en la deteccin del Cncer de CrvixCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?CitologaColposcopaCmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?ALGUNAS IMGENES COLPOSCPICAS Y SU CORRELACIN HISTOLGICACmo se si lo tengo?Cmo se diagnostica?P16 VS HISTOLOGAESTADSTICA ENTRE H.E. Y P16CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR EXPERTOSNmero de diapositiva 12No todo lo que parece es!!!Nmero de diapositiva 14A quienes seleccionarA quienes seleccionarNmero de diapositiva 17Espectros molecular y visiblepara diagnstico de VPHMETANmero de diapositiva 20METODOS MOLECULARESINFECCION POR VPHDOS MODALIDADESTRES ETAPASDonde est el Patlogo en el diagnstico del VPHPara que se usan las pruebas molecularesNmero de diapositiva 27Nmero de diapositiva 28Nmero de diapositiva 29Nmero de diapositiva 30Nmero de diapositiva 31HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by AgeNmero de diapositiva 36Nmero de diapositiva 37Porque? Involucionan o evolucionanCiclo viral productivo y transformantePCR secuencial o de punto finalNmero de diapositiva 47Los tipos pueden variar dentro de los grupos ya que se parecen molecularmente PCR de punto finalIndicaciones de usoNmero de diapositiva 52CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICACAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICAPRC en tiempo realPRC en tiempo realVentajas sobre PCR de punto finalCH2 y PCR tiempo real FUTURONmero de diapositiva 61En ASC US o H en MxicoPCR tr REPORTEDetalles de informeControles detallesReporte grficaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaEjemplos de infeccin mixtaDeteccin de tipo viral en medio privado D.F. 2.5 aosEstudio estadsticoResultadosPCR en relacin al sexoNmero de diapositiva 84Nmero de diapositiva 85PCR y citologaPCR y BiopsiaSensibilidad y especificidad de PCRtrNmero de diapositiva 89PCR de punto final dos etapas 1994 a 2004 2013PCR punto final o secuencia 2013174 casos Poblacin con E anormalSeguimiento y correlacin con la parejaCaso clnico 1Cono diagnsticoConclusin