Resumen: V-003

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Tipificacion antigénica y secuenciación genética de cepas del virus de la rabia paresiante en la provincia de Corrientes (Argentina). Estado de avance.

Miranda, Amaury O.

Facultad de Ciencias Veterinarias. UNNE.

Sgto. Cabral 2139 (3400) Corrientes.

Telefax: 03783-425753 interno 161.

E-mail: inmuno@vet.unne.edu.ar

ANTECEDENTES

La rabia es una zoonosis transmitida al hombre por la inoculación del virus rábico contenido en la saliva de un animal

infectado, principalmente por mordedura. Esta enfermedad tiene una letalidad del 100% si la persona expuesta no es tratada.

En los países en desarrollo, la rabia es un problema de Salud Pública, principalmente por la transmisión por perros,

gatos y murciélagos en áreas urbanas, y por animales silvestres en áreas rurales.

Se considera a los murciélagos hematófagos (Desmodus rotundus, quiróptero mamífero) como la principal fuente

natural de infección y reservorio del agente etiológico, virus de la Familia Rhabdoviridae, Género Lyssavirus, el que se aloja en

la grasa interescapular o grasa café, la que ha sido incriminada como tejido reservorio para el virus rábico, donde permanece

latente durante la hibernación a bajas temperaturas (fundamentalmente en murciélagos no hematófagos), y se ha sugerido que

éste órgano androgénico sirve como un mecanismo de sobrevivencia para el virus durante los períodos interepidémicos.

Características de los murciélagos: Ecología y Mastozoología.

Sub-Reino: Metazoos. Tipo: Vertebrados. Clase: Mamíferos. Sub-Clase: Placentarios. Orden: Quirópteros, el que comprende 19

Familias, unos 189 Géneros y aproximadamente 2.000 especies, muchas aún sin clasificar.

Son mamíferos voladores de hábitos nocturnos o crepusculares, se alimentan de insectos (insectívoros), otros de frutas

(frugívoros), algunos de peces (ictiófagos), otros de sangre (hematófagos).

Los Quirópteros beben agua con frecuencia, por la gran superficie de evaporación de sus alas, y por ello prefieren como

hábitat sitios sombríos, húmedos como grutas, cavernas, los huecos de los árboles, pozos aljibe abandonados, taperas, etc. En

reposo se coloca cabeza abajo asido con las uñas de sus patas, lo que no significa esfuerzo alguno; unas especies son migratorias

e hibernan, pero esto no acontece con los vampiros que son activos durante todo el año.

Es común o frecuente que las hembras tengan una sola cría por vez y la gestación se prolonga entre los cinco y siete

meses. Poseen ojos muy pequeños y de visión débil, con el agravante de que su desplazamiento se realiza normalmente en plena

oscuridad, no obstante su vuelo es elegante, con velocidad y bien orientado, permitiéndole capturar pequeños insectos en vuelo,

ello merced a que emite sonidos ultrasónicos orientadores de sus movimientos (50.000 a 100.000 vibraciones por segundo),

que el oído humano no registra, pero ellos lo perciben perfectamente. El cri-cri

ultrasónico dura 1-2 milésimas de segundo y necesita de la biaudición,

orientación llamada ecolación, la que no funciona cuando el animal aterriza.

Incorrectamente se suele decir que poseen un sistema de radar, lo correcto es

decir de sonar (ondas sonoras) que lo orientan en plena oscuridad.

El vampiro es de tamaño mediano entre los murciélagos, de unos 45 g en estado

adulto (Figura 1), pelo de color pardo a castaño, fino y largo y no posee cola.

Poseen pequeña prominencia en la nariz y su dentadura es la que tiene menor

número de dientes (20),

Figura 1: Desmodus rotundus en cambio otros tienen 32, y

particularmente un par de incisi-

vos superiores.

Durante la noche pueden andar unas cinco horas y según algunos

Autores su radio d e acción puede ser de unos 6 a 10 km y para otros de 15 a

20 km. La herida que produce el Desmodus es indolora y permite que fluya la

Sangre merced a enzimas que tiene en su saliva que actúan como anticoagulante

y disminuye el dolor, lo que le permite regresar sobre el mismo animal durante

varios días para alimentarse e ingerir sangre casi en la misma cantidad a la de

su peso (unos 30 g por noche), la lesión es relativamente pequeña, de aproxima-

damente 13 mm de largo por 6 mm de ancho y unos 5 mm de profundidad que Figura 2: Cabeza de Desmodus

produce solamente con los incisivos superiores con los que imprime un leve gol-

pe a modo de sacabocado.

Posiblemente los vampiros son los murciélagos más longevos, pudiendo vivir 14-15 años y más y constituyen colonias

con tan pocos integrantes como 10 y tan numerosas como 300.

Cuando los Desmodus están infectados con el virus de la rabia, y por ende padecen ésta enfermedad, se vuelven muy

agresivos y las luchas se intensifican con las consecuentes mordeduras entre ellos que favorecen la propagación.

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Los murciélagos enfermos de rabia, presentan dificultad para volar, se

los puede observar durante el día posados sobre el piso con dificultad para

desplazarse (Figura 3), con parálisis de los músculos alares e incontinencia

de orina, dicho estado suele ser corto de unos 5 días y de ordinario termina

con la muerte. La rabia bovina (Paresiante o Desmodina), es una

enfermedad que adquiere características de enfermedad Enzoótica en el

NOA y NEA, involucrando a las provincias de Formosa, Chaco,

Corrientes, Misiones, Salta, Jujuy, Tucumán, Santiago del Estero,

Catamarca y Norte de Santa Fe, región de preferencia como hábitat del

murciélago reservorio-vector hematófago Desmodus rotundus

(vulgarmente vampiro).

Figura 3: Desmodus rotundus de día sobre piso

Durante casi siete años (desde el primer caso, febrero/97) hasta el último registro correspondiente al mes de

septiembre/2003, se diagnostica para Corrientes casos de rabia todos los años.

Las dimensiones del virión, cuya característica morfológica responde a la forma clásica de bala o proyectil, son 180 nm

de longitud por 75 nm de diámetro. El virus está envuelto por una bicapa lipídica (membrana o envoltura), cuya composición es

semejante a la de la membrana neuronal. En la membrana está insertada la glicoproteína denominada G. Hacia el interior esta la

proteína de matriz o M, la nucleocápside constituida por tres proteínas (N, P y L) y el ácido nucleíco que es un RNA de cadena

sencilla y de polaridad negativa.

La información genética del virus esta contenida en 11.932 nucleótidos determinados en la cepa PV del virus de la

rabia. La posición de los genes en el RNA de cadena negativa es N, P, M, G y L en sentido 3´a 5´

La caracterización genética de los diferentes aislamientos de campo del virus permite la identificación de variantes

virales asociadas con brotes diferentes o provenientes de diferentes reservorios domésticos y silvestres. Por otra parte, también

hay que tener en consideración que brotes definidos solamente a través de los datos de la vigilancia epidemiológica pueden estar

viciados hacia especies animales encontradas más comúnmente alrededor de los asentamientos humanos haciendo aparecer

como responsable del brote a especies que en esa zona determinada sólo cumplen un rol menor en el ciclo de transmisión de la

enfermedad.

En conjunto, los datos proporcionados por el análisis de secuencia de nucleótidos, y la descripción epidemiológica de la

rabia humana y animal son de interés para la vigilancia epidemiológica de la enfermedad, por ello se dispuso realizar la

caracterización genética de los aislamientos de virus rábico recuperados en el período 1997-2003 lo que permitirá señalar la

circulación de las diversas variantes y sus reservorios, información que es de utilidad para el control y prevención de la rabia

humana y animal.

OBJETIVOS

Generales: - Caracterizar genéticamente los aislamientos de virus rábico recuperado en la provincia de Corrientes (Argentina), entre

los años 1997-2003.

Específicos: - Estudiar en el tiempo y en el espacio los casos de rabia en la región.

- Identificar las variantes antigénicas virales circulantes en la provincia de Corrientes (Argentina), y sus reservorios.

- Identificar las especies silvestres que mantienen los ciclos endémicos de transmisión de la rabia.

- Establecer un mapa nosológico para la región en base a la tipificación de cepas.

MATERIALES Y METODOS

Se procesaron en total 1.232 muestras de encéfalo de diferentes especies durante los años 1997-2003, en los que se

diagnosticó rabia en la provincia de Corrientes. Las especies corresponden a bovinos, equinos, caninos, felinos, porcinos,

caprinos, ovinos, roedores silvestres y sinantrópicos, murciélagos y humanos.

Recepcionada la muestra o extraída la misma en el laboratorio, se procede a su procesamiento de rutina para su

diagnóstico, para lo cual se realizó la prueba de los anticuerpos fluorescentes (AF) o también denominada inmunofluorescencia

directa (IFD) e inoculación intracerebral en ratones destetados (IR), cepa CF1 Romanelli, origen Charles River (U.S.A.), los que

se disponen en el Bioterio desde el año 1960, provistos por el Instituto de Energía Atómica, endocriados por consanguinidad en

sistema intensivo, cuya taxonomía responde a la Clase Mamífera, Familia Muridae, Género Mus, Especie musculus.

De las muestras que resultaron positivas mediante la Prueba de los AF e IR, el 20% tomadas al azar, se procesaron a

través de la prueba del índice de neutralización del virus en ratones (SNr) para determinar que se trate de virus rábico.

Confirmado, se confrontó con anticuerpos monoclonales (Ac Mc) y finalmente mediante transcripción reversa (RT), reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) y secuencia génica a los efectos de establecer con precisión y dirimir a qué variante antigénica

corresponde, las 66 muestras positivas.

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RESULTADOS

De acuerdo a un orden cronológico, se describen los resultado de las muestras procesadas como rutina mediante AF

seguida de la PB, SNr. Ac Mc, RT-PCR, secuenciación.

Se procesaron en total 1.232 muestras de encéfalo de diferentes especies durante los años 1997-2003, procedentes de la

provincia de Corrientes y correspondientes a las siguientes especies: bovinos, equinos, caninos, felinos, porcinos, caprinos,

ovinos, roedores silvestres y sinantrópicos, murciélagos y humanos, registrándose 66 positivos a los AF e igual número

mediante la PB correspondientes a bovinos y equinos. Cuadro 1.

Cuadro 1: Diagnóstico de rutina de rabia mediante AF y PB en 1.232 muestras procedentes de la provincia de Corrientes en el

período 1997-2003

Año Muestras Resultado

(=n) AF+ AF- PB+ PB -

1997 164 8 156 8 156

1998 171 2 169 2 169

1999 177 5 172 5 172

2000 187 30 157 30 157

2001 179 11 168 11 168

2002 175 4 171 4 171

2003 179 6 173 6 173

Totales 1.232 66 1.166 66 1.166

Las 66 muestras de bovinos y equinos que resultaron positivas fueron procesadas mediante RT-PCR y se establece la

secuencia genética para determinar la variante antigénica y poder comparar con los resultados obtenidos mediante los Ac Ms.

DETERMINACION: RT-PCR Rabia

Figura 4: Prueba de Primers Figura 5: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1400 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1.200-1.400 pb 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

21 22 23 24 25 26 27

Figura 6: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1.200-1.400 pb

En la figura 4, se registra las corridas en gel correspondientes a diferentes Primers usados para establecer el

de mejor calidad, y corresponde a 10G-304 (CDC), visible en la calle 5, identifica en 1.200-1.400 pb.

En la figura 5, la calle 21 resulta negativo, como las calles 9, 20 y 21 de la figura 6 los que se repiten para

su confirmación.

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Figura 7: Primers 10 G-304 confirma Rabia en 1.200-1.400 pb

En el gel de la figura 7, las calles 1 y 21 detectan positivo débil, se repiten, confirmándose en nueva corrida como

positivos. Se logra de ésta forma el resultado positivo RT-PCR en las 66 muestras que en principio lo fueron a los AF y PB.

Análisis Filogenético.

El alineamiento de las secuencias obtenidas se realiza mediante la utilización del programa "Clustal W”, mientras que el

análisis filogenético se realiza por programas como Phylip, MEGA. Las secuencias obtenidas se compararan con secuencias de

variantes de rabia hasta el momento conocidas en las Américas y en el resto del mundo. Se determina el grado de correlación,

análisis de ROC y se emplea el programa Statistix for Windows . Se realiza un estudio retrospectivo sobre la distribución

espacial y temporal de los diagnósticos de rabia en el NE desde el año 1997 al 2003. El análisis espacial se realiza teniendo en

cuenta los cuadrantes en que se subdivide la región y los indicadores se referirán a muertos / población promedio del cuadrante

y el tipo de virus (cepa) actuante. Se observa si existe alguna tendencia a formar conglomerados de acuerdo a la ubicación

geográfica (componente básico para un programa de control). Otras variables a ser relacionadas son el tipo de explotación y

densidad ganadera.

División del análisis temporal:

a) Construcción del canal endémico: para ello se utiliza la serie histórica hallando la mediana mensual, el primero y el tercer

cuartil. Como instrumento de suma utilidad para el seguimiento del programa oficial de control, el que permitirá cuantificar en

forma objetiva el número mínimo de casos necesarios para emitir un diagnóstico de epidemia.

b) Análisis de series cronológicas: la variación de la frecuencia de presentación de una enfermedad a través del tiempo se

explica porque ella está generalmente influenciada por diversos factores que se presentan con cierta regularidad, e intentará

descubrir cuál es la tendencia secular de la enfermedad y la probable existencia de variaciones cíclicas y estacionales.

Inicialmente se utiliza el modelo clásico que asume que las variaciones aleatorias de corto plazo en los puntos del tiempo

estudiados se neutralizan entre sí promediando cero (Lapin, 1973). Para ello se utiliza el programa Statistix 7.0.

BIBLIOGRAFIA:

- Cisterna, D. y col. Antigenic and molecular characterization of rabies virus in Argentina. www.Elsevier.com/locate/virusres

- Miranda, A.O., Brunel, C.M. (1991).Tres casos de Rabia en "Coatí" (Nasua sp.). Diagnósticados en la provincia de Formosa

(Argentina). Revista Veterinaria. Facultad de Ciencias Veterinarias de Corrientes. UNNE. Vol. III, Nº2: 8-84.

- Miranda, A.O. y Brunel, C. (1992). Inmunización Antirrábica en Humanos con Vacuna obtenida en cerebro de Rata Lactante.

Parte 1: Respuesta Inmune empleando distinta frecuencia de dosificación". Ciencia Pet's. Vol. 8-Nº 44: 286-291.

- Miranda, A. O.; Acosta, R. S. (2001). Diagnóstico de rabia mediante el uso de los anticuerpos fluorescentes en impresión

corneal de un humano de la ciudad de Corrientes (Argentina). Anuario en C. D. del III Congreso Argentino de Zoonosis. II

Congreso Latinoamericano de Zoonosis. 7 al 10/08/01. Bs. Aires. Argentina.

- Miranda, A. O.; Acosta, R. S. (2001). Persistente epidemia de rabia bovina (Paresiante) en la provincia de Corrientes

(Argentina). Anuario en C. D. del III Congreso Argentino de Zoonosis. II Congreso Latinoamericano de Zoonosis. 7 al

10/08/01. Bs. Aires. Argentina.

- Smith J. (1995). Molecular epidemiology of rabies in the United States. Seminars in Virology. Vol 6: 387-400.

Consta a la fecha de 108 citas por tratarse de tema de tesis, la que podrá consultarse y/o requerirse al publicarse como final que

incluya discusión y conclusión

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