Practica N3: TINCION GRAM

I. INTRODUCCIN

La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gramm en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el colorante primario (cristal violeta) tie por igual a todas las bacterias, pero la combinacin con el colorante es ms permanente en los gram positivos. Para establecer la diferenciacin en estoados grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobe el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy difcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que haban retenido el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la composicin qumica y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del proceso de decoloracin. Otras tinciones que permiten obtener mayor informacin son la negativa y la selectiva. La tincin negativa facilita las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias sin alteracin por efecto del calor as como de estructuras especiales, como la cpsula de algunas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix es una estructura externa a la clula, formada de polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las bacterias contra ala desecacin y la fagocitosis. La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cpsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la clula bacteriana en un fondo oscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localizacin son importantes criterios de clasificacin taxonmico.II. OBJETTVOS

Recordar el manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias (importancia del objetivo de inmersin) Utilizar la tcnica de tincin diferencial con el colorante cristal violeta y safranina

Observar las diferentes formas de la estructura microbiolgica, obtenidas en el en aislamiento de microorganismos.

Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariota

III. MARCO TEORICO

3.1 MATERIALES Y METODOS

3.1.1 MATERIALES

Mechero Bunsen: Pinzas: Portaobjetos: Microscopios:

Goteros:

Gasas:

3.1.2 REACTIVOS

Agua destilada: Aceite de inmersin: Solucin de cristal Violeta: Solucin de safranina Etanol 95%: Lugol:

IV. MATERIALES Y REACTIVOS

4.1 Materiales

Mechero Bunsen o de Alcohol Asa de Siembra o aguja enmangada Pinzas Portaobjetos Muestras bacterianas de origen natural, Sarro Dental, etc. Palillos Microscopios Soporte de Tinciones Goteros Gasas

4.2 Reactivos

Agua destilada Aceite de inmersin Solucin de cristal Violeta Solucin de safranina Etanol 95% Lugol Alcohol acetona

V. METODOLOGIA

Desarrollar la prctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:

Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero. Colocar una gota de agua destilada o solucin salina sobre el porta objetos y luego esterilizar el asa bacteriolgica. Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos, posteriormente esterilizar el asa. Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la muestra. Colocar el portaobjetos sobre un soporte. Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y enjuagar. Cubrir la muestra con alcohol cetona. Esperar que transcurran 5 segundos. Escurrir y enjuagar. Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y enjuagar. Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el microscopio a 10x, 100x, etc.

VI. CUESTIONARIO

1. Indique la utilidad de los reactivos utilizados en la prctica.