Tinción general. Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la hematoxilina-eosina

sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las

estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la tinción, si partimos de cortes de parafina,

tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que

estos cortes son hidrosolubles. Si partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una inclusión en parafina y teñido con hematoxilina-eosina. Los núcleos aparecen de color violáceo (hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.

Esquema del proceso histológico.

PROTOCOLO GENERAL

A continuación se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra cátedra para la técnica de Hematoxilina - Eosína para preparados de uso didáctico:

I. Fijación

En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos durante 6 hs.

II. Corte

Se le da el tamaño deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratación

1) Alcohol 70º, 1h30'.2) Alcohol 96º, 1h30'.3) Alcohol 100º (l), 1h30'.4) Alcohol 100º (ll), 1h30'.5) Toluol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusión

1) Secado de la muestra con gasa.2) Parafina 56º (l), 1h30'.3) Parafina 56º (ll), 1h30'.4) Formación de la barra.5) 30' de frezzer.6) Fractura del taco

V. Corte

VI. Coloración

1) Secado de los cortes en estufa a 58ºC, 15'.2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.3) Xilol o toluol (II), 2'.4) Alcohol 100º, 30".5) Alcohol 96º, 30".6) Alcohol 70º, 30".7) Alcohol 50º, 30".8) Agua destilada, 30".9) Hematoxilina, 1´30".10) Agua corriente, 2´.11) Alcohol 50º, 15".12) Eosina, 30".13) Alcohol 96º, 10".14) Alcohol 100º, 10".15) Xilol, 1´ por lo menos.16) Montaje con Bálsamo de Canadá sintético.

RECOMENDACIONES ÚTILES

- Las técnicas histológicas pertenecen al tipo denominado "técnicas contrarreloj". Si Ud. está apurado no las empiece, déjelas para cuando su trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad.- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que va a utilizar perfectamente limpios.- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier solución.- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100º siempre tapados.- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plásticos porque resultan atacados por estas sustancias.- Si debe trabajar con ácidos hágalo bajo campana. Si se derraman o salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con bicarbonato de sodio.- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo después comience con los pasajes del material.- Si debe realizar simultáneamente varios procesos de inclusión, confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto evitará confusiones.- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada técnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.- Antes de iniciar cualquier técnica, primero léala atentamente. Prepare el material de vidrio necesario, reúna los reactivos y colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y después comience el proceso.- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.

Tricrómica de GomoriSe trata de una solución acética estabilizada que contiene Chromotrope 2R, Azul de Anilina y Acido Fosfotúngstico. Listo para usar. No requiere dilución.Colorante Histológico. Tiñe citoplasma y fibras musculares de rojo, mientras que el colágeno toma un color azulado.

Tricrómica de MassonSoluciones colorantes destinadas a la tinción según técnica de Masson y sus modificaciones (Lillie). Los colorantes se presentan listos para usar. No requieren diluciones.Para su empleo pueden combinarse de acuerdo a las necesidades del usuario para lograr la tinción deseada.A diferencia de otros productos comerciales que poseen sólo 2 colorantes, Biopur dispone de los 4 colorantes desarrollados para la técnica. La ventaja principal de poder realizar estas combinaciones radica en la posibilidad de teñir con colores diferentes de acuerdo a los tipos de tejidos en estudio.Se dispone de soluciones de:Fucsina Acida - Punzó de XilidinaFucsina Acida - Escarlata de BiebrichAzul de AnilinaFast Green FCF

Verde de Metilo - PironinaSe trata de una solución de Verde de Metilo asociada con Pironina G según Tarf-Kurnick.Colorante Histológico.Empleado para la investigación histológica del ácido nucleico contenido en los tejidos, así como para demostrar la presencia de células de la serie linfática y células plasmáticas.También es útil en la identificación de células plasmáticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citológicas.

Carbohidratos

PAS Se trata de un kit compuesto por soluciones de:Acido Periódico al 1% (Conservar en Refrigerador 2-10°C)Reactivo de Schiff Biopur (Conservar en Refrigerador 2-10°C)Para la demostración histoquímica de componentes celulares que contienen Glicoles, tales como Carbohidratos, Glicoproteínas, etc.Permite la observación de Membranas Basales y algunas Mucinas

Mucicarmín Se trata de un kit que contiene soluciones de:Mucicarmín Concentrada BiopurAcética de Tartrazina BiopurColorante Histológico.Usado en la identificación de sitios de tumores primarios, ayudando a la distinción de células escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina-positivos.La cápsula de los criptococos (hongos) se tiñe de rosa oscuro.La tartrazina tiñe el citoplasma de amarillo.

Rojo Congo Se trata de un kit que contiene soluciones de:Rojo Congo (Alcohólica Clorurada) (Stock)Alcohólica al 80%, clorurada (Stock)Hidróxido de Sodio 0.25 MColorante Histológico (Bennhold-Puchtler). Destinado a la determinación de proteína amiloide en secciones de tejidos con el empleo de microscopios de luz común o polarizada.

Bacterias

GramSe trata de un kit para la coloración de bacterias con la tinción según GramSe dispone de soluciones de:Violeta CristalSolución Concentrada de IodoDecoloranteSafraninaLa tinción de Gram fue desarrollada en el año 1884 por Christian Gram. La tinción hoy en día es aplicada para la clasificación como paso inicial en la identificación de las bacterias. También, como consecuencia de la tinción, las bacterias muestran su forma, tamaño, etc., lo que ayuda significativamente al diagnóstico.

ZiehlSe trata de un kit compuesto por colorantes y decolorante.Se dispone de soluciones de:Fucsina BásicaDecolorante

Azul de MetilenoMétodo tradicional para la detección del bacilo tuberculoso. Para empleo con esputo, concentrado o por extensión directa, líquido cefalorraquídeo u otros fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de tejidos.

Tinciones NuclearesSe trata de soluciones de Hematoxilina a diferentes concentraciones y con aplicaciones específicas.Hematoxilina Biopur está basada en la fórmula de Gill #1 conteniendo 2g/L de Hematoxilina. Se trata de una solución acuosa preparada por vía química en frío, evitando de esta manera la perjudicial ebullición.No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee ácido acético en su fórmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de ácidos ni de mordientes. Lista para usar.Hematoxilina Biopur encuentra aplicación en técnicas citológicas fundamentalmente.Hematoxilina "Activada" Biopur está basada en la fórmula de Gill #2 conteniendo 4g/L de Hematoxilina. Se trata de una solución acuosa preparada por vía química en frío, evitando de esta manera la perjudicial ebullición.No precipita. No requiere filtrado para su empleo. Posee ácido acético en su fórmula, permitiendo su empleo inmediato, sin necesidad de aditivo alguno. Por esto, no requiere el agregado de ácidos ni de mordientes. Lista para usar.Hematoxilina Activada Biopur encuentra aplicación en técnicas histológicas fundamentalmente.Hematoxilina Férrica de Weigert Biopur se compone de 2 soluciones para la preparación de la misma. Una Solución de Hematoxilina Alcohólica y una Solución de Cloruro Férrico.Hematoxilina Férrica de Weigert Biopur encuentra aplicación específica en coloraciones especiales que requieren hematoxilina (Mucicarmín, Tricrómica de Masson, Tricrómica de Gomori)

Clásicas

May Grunwald - GiemsaSe trata de productos que se complementan para la técnica de tinción según May-Grünwald y Giemsa. Los colorantes según May-Grünwald y Giemsa son combinaciones de azul y azures de metileno asociados con eosina.Estabilizador es un buffer fosfatos pH 6.5 regulador del pH del agua a ser utilizada en tinciones hematológicas.Estabilizador Biopur asegura la tinción salmón de los hematíes, descartándose los accidentes de las tonalidades rojo fucsia, que dificultan la tinción de los leucocitos, y de las azuladas, que entorpecen la metacromasia.

WrightSe trata de una solución May-Grünwald-Giemsa compuesta.Tinción panóptica diferencial en un solo paso.

Tinción 15Se trata de un kit de tinción diferencial rápida compuesto por 3 soluciones:FijadorSolución 1 (Xanténicos)Solución 2 (Tiazínicos)Coloración de extendidos. Tinción diferencial rápida (15 segundos) Punción aspirativa Tejidos Biopsias por congelación Muestras hematológicas Recuento leucocitario diferencial

ShorrEn contraste con la tinción de Papanicolaou, la tinción de Shorr se usa solamente en citodiagnóstico hormonal en el cual es superior.Permite lograr la diferenciación neta de las células del epitelio vaginal. Tinción nuclear intensa y coloración citoplasmática homogénea.

Coloración Hematoxilina & EosinaHematoxilinaSi bien tanto Hematoxilina Biopur como Hematoxilina Activada Biopur pueden ser usadas para la técnica de coloración Hematoxilina-Eosina, recomendamos el uso de Hematoxilina Activada Biopur dada su doble concentración que permite lograr resultados en tiempos menores.EosinaSe trata de una solución de eosina.Colorante ácido. Utilizado como colorante de contraste de la hematoxilina en la tinción Hematoxilina-Eosina.

Coloración de PapanicolaouSe trata de una técnica citológica compuesta por 3 soluciones:Hematoxilina BiopurOG BiopurEA BiopurHematoxilina BiopurColorante nuclear. Las características y recomendaciones para el uso de Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la sección anterior. Rogamos referirse a la misma para información adicional.OG BiopurSe trata de una solución alcohólica de ácido fosfotúngstico y Orange G. El ácido fosfotúngstico acidifica la solución y aumenta la unión del Orange G a zonas citoplasmáticas densas.

EA BiopurSe trata de una solución alcohólica, fotoestable que elimina los problemas causados por las tradicionales e inestables fórmulas numeradas EA-36/50/65/etc. No requiere filtración. Listo para usar. Tiñe selectivamente el citoplasma de células que tuvieron actividad metabólica poco antes de la recolección de la muestra. Tiñe de rosa a rojo las células escamosas superficiales, cilios, nucleolo y eritrocitos.

Mujer de 64 años con ascitis y derrame pleural.En las semanas previas al ingreso presentó disnea a moderados esfuerzo y aumento del perímetro abdominal. En la exploración existía hipoventilación en base derecha y una sensación de masa en fosa iliaca derecha. En la analítica estaba elevado el Ca 125. El liquido pleural era un trasudado con citología negativa para malignidad. Tras histerectomía y doble anexectomía quedó asintomática y se resolvió el derrame pleural. Se muestra la radiografía de torax, la TC abdominal y la imagen anatomopatológica macro y microscópica de la masa anexial derecha.