Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR ) Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste. Variante histológica

Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos necesarios

para su realización son los siguientes:

1. ácido periódico 58%

1. carbol fucsina de Ziehl culina(fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:

1. 0,5 g fucsina básica

2. 50 cc agua destilada

3. 5 cc etanol absoluto

1.

1. 28,5 g cristales de fenol derretidos

2. hematoxilina

3. alcohol ácido 1%:

1. alcohol de 35º

2. ácido clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. desparafinar e hidratar los cortes

2. ácido periódico 5%, 10 min

3. lavar con agua destilada

4. fucsina fenicada, 15 min

5. decolorar en alcohol ácido al 50%

6. lavar con agua destilada

7. hematoxilina, 10 min

8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio

9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

Resultados [editar · editar código]

Los microorganismos teñidos con el primer colorante (fucsina) serán rojos, rosas, seran

ácido resistentes, presuntivamente micobacterias. Los otros organismos son azules.

Para confirmar neumonía ha de hacerse un cultivo en medio selectivo.

BAAR: rojo.

Núcleos: azul semiamarillo.

Variante clásica o "en caliente" [editar · editar código]

Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas.

1. Hacer un frotis de la muestra.

1. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos.

Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis

muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.

2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los

extendidos hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.

2. Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

3. Aplicar fucsina-fenicada.

1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos.

Mantenga el calor durante este período.

4. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la

pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría

hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que

el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

5. Decolorar con alcohol-ácido.

1. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y

manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora

suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede

permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite

el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad

adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

6. Aplicar azul de metileno (1 minuto).

1. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

7. Enjuagar con agua

1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos

hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en

una gradilla a que sequen al aire.

8. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al

microscopio con 100 x 100

o en "frío" (Tinción de Kinyoun) [editar · editar código]

1. Hacer un frotis.

2. Dejarlo en el puente de tinción.

3. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de fucsina).

4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.

5. Decolorar con alcohol ácido.

6. Lavar con agua del grifo.

7. Contrastar con azul de metileno

Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes [editar · editar código]

• Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.1

• Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.2

• Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].3

TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus,

producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las

condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas

extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma

vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora

al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma

vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias

productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación

son de enorme interés.

FUNDAMENTO

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los

factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el

microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con

agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

REALIZACIÓN

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias

produzcan las esporas. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos

resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1. Preparar los frotis bacterianos

indicados.

2. Teñir con verde malaquita. Con unas

pinzas de madera colocar la muestra encima de la

llama del mechero de forma que el colorante humee

durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierva. Añadir

más colorante si éste se evapora; es importante que la

muestra no se seque.

3. Lavar con abundante agua el exceso

de colorante.

4. Teñir con safranina 1 min.

5. Lavar con abundante agua el exceso

de colorante.

6. Secar la preparación.

7. Observar la preparación al

microscopio. Anotar la disposición y la morfología de

las tres especies del género Bacillus.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen

un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.

Antibiograma: Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton.

Material

� Cultivo Puro de un microorganismo

� Placa con medio de Mueller-Hinton

� Pinzas metálicas

� Discos de antibióticos

Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una

gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped.

La siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo

líquido o se impregna en un cultivo sólido.

Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y

extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden

espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibióticos a testar.

Los antibióticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión en alcohol. Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no hayan interferencias entre la acción de unas sustancias y otras.

La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el

diámetro de los halos de inhibición del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.

Resultados:

Api 20s

IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.

A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):

1) Obtener un cultivo puro

2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento . Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas,crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad.

5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)

Serotipo

A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos. Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el número o letra del antígeno correspondiente.

En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antígeno. Existen en el comercio antisueros para caracterización de: Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc.

Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:

Yersinia entercolítica 4 03 género especie biotipo serotipo

ENSAYOS BIOQUIMICOS

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de

identificación, comerciales, etc.).

a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

Los sistemas comerciales más comúnmente usados son :

* BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas.

* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

* API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana.

Otros sistemas:

Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. API 10S, versión miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria - Haemophilus)

Existen también sistemas de identificación comerciales para levaduras:

API 20 C (Para levaduras del género Candida) Auxacolor de Diagnostics Pasteur Fongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificación de levaduras de interés médico)

b) En la Cátedra se desarrolló un sistema para la identificación de Enterobacterias que consta de nueve pruebas bioquímicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identifica las 23 especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas. Está integrado por las siguientes pruebas: producción de H2S en agar triple azúcar hierro (TSI), fenilialanina deaminasa, producción de indol, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina ,crecimiento en citrato, fermentación de arabinosa, fermentación de

sorbitol y producción de acetoína (VP).

En esquema, la realización de una prueba bioquímica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.

Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente.

1) Enzimas vinculadas con la respiración

a) oxidasa b) catalasa

2) Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros

2.1) Requerimientos de oxígeno

OF (óxido-fermentación) Crecimiento en caldo tioglicolato

2.2) Producción de ácido, o ácido y gas Fermentación de carbohidratos

2.3) Detección de enzimas y vías metabólicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico) d) Esculina e) Hipurato

3) Fuente única de carbono a) citrato

b) malonato c) hipurato para coliformes

4) Utilización de compuestos nitrogenados

4.1) Reducción de nitrato

a) asimilación b) denitrificación

4.2) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros a) indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea

5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azúcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina

6) Detección de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7) Misceláneos

a) KCN b) Bilis c) producción de pigmentos

8) Test de crecimiento o inhibición

a) Temperatura b) NaCl c) Antibióticos

TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICA CION DE BATERIAS HETERÓTROFAS

tinción gram (cultivo fresco)

+ + + + + + + + – – – – –

forma coco coco coco coco bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón bastón coco agrupación racimos racimos cadenas tetradas pares

crecimiento aerobio

+ + + + + – + + + + + + +

crecimiento anaerobio

– + + + + + + – – – + + –

esporas – – – – – + + + – – – – – movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + – catalase + + – – – – + + + + + + + oxidase + + – + +

fermentación de glucosa a acido o a acido+gas

– + + + + + (o –) + – – – + + –

O/F – O F F O Micrococcus X Staphylococcus X Streptococcus X Lactococcus X Enterococcus X Leuconostoc X Pediococcus X X Aerococcus X Lactobacillus X Clostridium X Bacillus X X Alcaligenes X Pseudomonas X Enterobacterias X Aeromonas X Chromobacterium X Neisseria X