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DESDOBLAMIENTO MECNICO DEL DOMINIO I27 DE LA PROTENA TITINA
POR FUERZAS EXTERNAS UTILIZANDO EL MTODO DE SIMULACIN PULL
AND WAIT (PWN)
JOS DANIEL PIMIENTO FLREZ
CARLOS MAURICIO ACOSTA CASTRILLN
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN FSICA
BOGOTA, D.C.
2014
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DESDOBLAMIENTO MECNICO DEL DOMINIO I27 DE LA PROTENA TITINA
POR FUERZAS EXTERNAS UTILIZANDO EL MTODO DE SIMULACIN PULL
AND WAIT (PWN)
JOS DANIEL PIMIENTO FLREZ
CARLOS MAURICIO ACOSTA CASTRILLN
TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR AL TTULO DE
LICENCIADO EN FSICA
Director
MANUEL FLOREZ
DOCTOR EN FSICA
Codirector
GERMAN PABN
DOCTOR EN BIOFSICA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN FSICA
BOGOTA, D.C.
2014
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NOTA DE ACEPTACIN
_________________________________
_________________________________
_________________________________
_________________________________
Presidente del Jurado
_________________________________
Jurado
_________________________________
Jurado
Bogot, ___ de _______________ de 2014
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DEDICATORIA
Este trabajo esta dedicado a mi familia, principalmente a mis padres Luz Enith y
Jorge Humberto quienes con su mayor esfuerzo, paciencia y sabidura han dirigido
cada una de mis decisiones de la mejor manera, por su inmensa proteccin y
apoyo que me han brindado en todos los instantes de mi vida
Carlos Mauricio
Este trabajo de grado est dedicado especialmente a mi mam Carmen, a mi
hermana Marcela y a mi pap Jos Angel (QEPD) por creer y confiar en mi, por
mostrarme un cario incondicional que me impulsa a nuevas y ms grandes
metas, a mis hermanas Andrea, Nubia y a mi compaera Mara por el apoyo y el
temple que han tenido conmigo
Jos Daniel
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos principalmente al Doctor German Pabn por abrirnos las puertas y
permitirnos aprender de l y trabajar con l, ya que sin su inmensa ayuda no se
hubiera podido realizar este trabajo, tambin al Doctor Alfonso Leiva quien por
medio de su particular forma de ensear nos acogi en su grupo de trabajo e
incentiv y motiv por el camino de la investigacin, adems, queremos
agradecerle al Doctor Manuel Florez por dedicar gran parte de su tiempo y de su
conocimiento en la realizacin de este trabajo quien con sus consejos nos brind
lo necesario para culminar este proyecto. Finalmente agradecemos a los docentes
del proyecto curricular de Licenciatura en Fsica quienes con su exigencia y
entrega han formado a personas crticas y preocupadas por una mejor sociedad,
igualmente a Renata quien con su cordialidad y paciencia nos ha ayudado durante
toda la carrera siempre con la misma calidez y entrega.
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LISTA DE FIGURAS
pg.
Figura 1. Esquema de una protena ...................................................................15
Figura 2. Representacin de las estructuras de las protenas ........................16
Figura 3. Ubicacin de la titina en el sarcmero..................................................17
Figura 4. Imagen del dominio I27 de la titina. .................................................18
Figura 5. Hebras y lminas beta .........................................................................20
Figura 6. Diagrama general de AFM ...................................................................21
Figura 7. Representacin de los potenciales bonded y non-bonded del campo de
fuerzas de CHARMM ...........................................................................................24
Figura 8. Grfica de potencial de Lennard-Jones en funcin de la distancia ......25
Figura 9. Grfica de la fuerza contra la extensin de la protena a tres diferentes
velocidades ........................................................................................................27
Figura 10. Representacin del estiramiento por fuerzas armnicas del dominio I27
de la titina utilizando PNW .....................................................................................29
Figura 11. Grfica de fuerza contra extensin del dominio I27 ........................30
Figura 12. Grfica de la extensin de los puentes de hidrgeno en funcin del
tiempo ....................................................................................................................31
Figura 13. Dominio I27 de la titina ...................................................................36
Figura 14. Representacin del estiramiento por fuerzas armnicas del dominio I27
de la titina utilizando PNW .....................................................................................37
Figura 15. Dominio I27 en una caja de aguas .......................................................38
Figura 16. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena, calculada a una
temperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 3Kcal/mol2 ..39
Figura 17. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena, calculada a una
temperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 4Kcal /mol2 ..40
Figura 18. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena, calculada a una
temperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 5 Kcal/mol2 ..40
Figura 19. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de las
hebras A' y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
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pg.
3Kcal/mol2 a una temperatura de 300K. ..........................................................42
Figura 20. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de las
hebras A' y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
4Kcal /mol2 a una temperatura de 300K. ..........................................................42
Figura 21. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de las
hebras A' y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
5Kcal/mol2 a una temperatura de 300K. ..........................................................43
Figura 22. Detalle de la interaccin entre las molculas de agua y los puentes de
hidrgeno ..............................................................................................................44
Figura 23. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena, calculada a una
temperatura de 350K utilizando un coeficiente de elasticidad de 2Kcal /mol2 ..45
Figura 24. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de las
hebras A' y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
2Kcal /mol2 a una temperatura de 350K. ..........................................................46
Figura 25. Comparacin de la curva de fuerza frente a la extensin de la protena
..........................................................................................................................47
Figura 26. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de las
hebras A y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
5Kcal /mol2 a una temperatura de 300K aumentando el tiempo de simulacin a
1ns entre el paso cinco y seis.................................................................................47
Figura 27. Descripcin general para realizar una simulacin con el mtodo
PNW........................................................................................................................50
Figura 28. Pestaa de la pgina web titulada STUDY OF I27 DOMAIN OF TITIN
..........................................................................................................................51
Figura 29. Pestaa de la pgina web titulada STUDY OF I27 DOMAIN OF TITIN
..........................................................................................................................52
Figura 30. Segunda y tercera pestaas de la pgina web....................................53
Figura 31. Pestaa cuatro de la pgina web .......................................................53
Figura 32. Pestaa cinco de la pgina web .......................................................54
-
Figura 33. Imagen de la sexta pestaa de la pgina web ....................................54
Figura 34. Imagen de la sptima pestaa de la pgina web ..............................55
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CONTENIDO
pg.
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .........................................................10
1.1. Objetivos..........................................................................................12
1.1.1. Objetivo general.................................................................12
1.1.2. Objetivos especficos..........................................................12
2. INTRODUCCIN.........................................................................................13
3. REVISIN TERICA...................................................................................15
3.1. Las protenas y su clasificacin..........................................15
3.2. Titina y su papel en el sarcmero.......................................16
3.3. Dominio I27 de la titina.......................................................19
3.4. Microscopio de Fuerza Atmica (AFM)..............................20
3.4.1. Modo de operacin del AFM.................................21
3.5. Mtodos de simulacin.......................................................22
3.5.1. Steered Molecular Dynamics (SMD).....................26
3.5.1.1. Resultados obtenidos con SMD.......................27
3.5.2. Pull And Wait (PNW).............................................28
3.5.2.1. Resultados del mtodo de simulacin PNW....29
3.6. Visual Molecular Dynamics (VMD).....................................31
4. DESARROLLO DE LAS SIMULACIONES..................................................33
4.1. Desarrollando los script y generando los archivos para simular........33
4.2. Metodologa de las simulaciones.......................................................35
5. RESULTADOS DE LAS SIMULACIONES...................................................39
5.1. Fuerza de rompimiento y desestabilizacin del dominio I27 de la
titina.....................................................................................................39
5.2. Rompimiento de los puentes de hidrgeno de las hebras A' y G......41
5.3. Papel de las molculas de agua en el rompimiento de los puentes de
hidrgeno.............................................................................................44
5.4. Simulacin a temperatura de 350K....................................................45
5.5. Simulacin en largos periodo de tiempo............................................46
5.6. Comparacin entre los mtodos SMD y PNW...................................48
-
6. Componente pedaggico............................................................................49
6.1. Desarrollo de la pgina Web...............................................................51
7. CONCLUSIONES........................................................................................56
8. REFERENCIAS...........................................................................................59
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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En los mtodos de simulacin usuales como Steered Molecular Dynamic (SMD),
una protena se solvata y es sometida a fuerzas mecnicas externas, lo cual
permite dilucidar aspectos sobre la estabilidad mecnica de dicha molcula, para
este caso particular se estudiar el dominio I27 de la titina porque es uno de los
pocos dominios resueltos experimentalmente y que adems est incluida dentro
de los principales artculos de estudio. Sin embargo, estos mtodos, generalmente
no dan informacin detallada de los procesos que se ocasionan a nivel atmico
tales como el mecanismo de la ruptura de los enlaces de hidrgeno, responsables
fundamentales de la estabilidad de sus estructuras secundarias y terciarias.
Adems, hay evidencia que las fuerzas necesarias para romper stos enlaces
pueden depender del tipo y caractersticas de la fuerza aplicada junto con la
direccin de estiramiento. El mtodo Pull And Wait (PNW)1 permite hacer un
seguimiento detallado de los procesos conducentes al rompimiento de enlaces en
la estructura sometida a tensin mecnica y adems, manipular parmetros en el
proceso de extensin que pueden dar valiosa informacin del mecanismo.
Debido a que la titina es una protena sarcomrica a la que se le atribuyen
propiedades elsticas principalmente en la regin de la banda I, en donde se
encuentra el dominio I27 , esta banda regula el largo del sarcmero por medio de
sus varios segmentos extensibles que permiten la distencin muscular y el
desarrollo de la tensin pasiva. Puesto que esta protena se encuentra en los
msculos estriados como los msculos esquelticos y cardacos, es de gran
importancia el estudio de la estabilidad de los enlaces de hidrgeno. Por otro lado,
al demostrar que el mtodo PNW funciona en la titina, se podra inferir que
tambin es aplicable a otras protenas mucho ms pequeas que sta.
1 Pabon, G., Amzel, M. (2006). Mechanism of Titin Unfolding by Force: Insight from Quasi-Equilibrium Molecular Dynamics Calculations. Biophysical Journal, (91), 467-472.
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1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo general
Comprobar los resultados obtenidos en el artculo titulado Mechanism of Titin
Unfolding by Force: Insight from Quasi-Equilibrium Molecular Dynamics
Calculations escrito por los doctores en biofsica Germn Pabn y Mario Amzel en
Julio de 2006 y publicado en la revista Biophysical Journal.
1.1.2. Objetivos especficos
Proporcionar una descripcin de las fuerzas y los mecanismos de ruptura
que conducen al despliegue de I27 y el papel que juegan las molculas de
agua en dicho proceso.
Determinar el comportamiento de la fuerza aplicada como funcin de la
extensin de I27 entre sus terminales N y C, teniendo en cuenta los
parmetros del mtodo de simulacin aplicado.
Comparar los resultados de estiramiento de I27 por fuerzas mecnicas
obtenidos con SMD (Steered Molecular Dynamics) publicados en el artculo:
Steered molecular dynamics simulation of conformational changes of
immunoglobulin domain I27 interprete atomic force microscopy
observation2 y los resultados obtenidos en la simulacin con el mtodo
PNW.
Entregar un material didctico de anlisis de simulaciones computacionales
que sirva como herramienta para la asignatura de Biofsica en la carrera de
pregrado de licenciatura en fsica.
2 Lu Hui, Schulten Klaus. (1999). Steered molecular dynamics simulation of conformational changes of immunoglobulin domain I27 interprete atomic force microscopy observation. Chemical Physics, (247), 141153.
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2. INTRODUCCIN
Las protenas hacen parte fundamental de la vida y es usual escuchar acerca de la
cantidad de las mismas, contenidas en ciertos alimentos, por ejemplo se suele
decir que la carne contiene ms protenas que las frutas [9]. Pero, A que se debe
que sta tenga ms protenas que el hueso o que la fruta?, simplemente por que
la carne est conformada de msculos, los cuales estn compuestos por actina y
miosina, protenas necesarias para el movimiento, mientras que el hueso es un
elemento de estructura y sirve para soportar el peso del cuerpo [9], y la fruta se
caracteriza por un alto contenido de fibra y antioxidantes.
Aunque las protenas estn ms presentes en las partes que requieren de
movimiento, hay excepciones a la regla, por ejemplo el colgeno el cual es un
material con funciones estructurales est compuesto mayoritariamente por
protenas [9].
Las protenas estn constituidas por veinte (20) diferentes aminocidos y a partir
de stos, se conforman alrededor de unas treinta mil (30.000) que existen en el
cuerpo humano [9]. Unas protenas producen el movimiento mediante la
contraccin del msculo, otras trasmiten los impulsos nerviosos desde el cerebro
hasta los msculos, otras captan la luz y la convierten en impulsos nerviosos que
permiten realizar una imagen del objeto delante de los ojos, otras sirven de
catalizadores, etc [9].
Una clula de una bacteria como la Escherichia coli, tiene al rededor de cuatro mil
trescientas (4.300) protenas diferentes, las cuales se encargan de proporcionar el
trabajo necesario para que la clula pueda subsistir en el medio; las protenas
introducen iones como potasio, hierro, carbono, fosfato y cada uno de los
nutrientes que la clula necesita [9].
Debido a la multitud de funciones que los diferentes tipos de protenas realizan
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tanto en los seres vivos como en los alimentos que stos consumen, como frutas y
verduras, se hace necesario y de fundamental importancia conocer la estructura y
estabilidad de estas, ya que se podran conocer los defectos que producen una
enfermedad, predecir las estructuras de las susodichas [9][10], Introducir
mediante las tcnicas de ingeniera de protenas, cambios en la secuencia de una
protena que le confiera propiedades nuevas. Ello significa hacerla ms estable,
introducirle grupos que permitan fijarla a soportes slidos, conferirle afinidad para
compuestos que no son sus sustratos naturales (Gomz-Moreno. Caleras, Carlos.
2003. p. 29); y disear mediante farmacologa, medicamentos que permitan
mejorar y/o curar enfermedades [10].
En el presente trabajo, se muestra y se detalla el desdoblamiento del dominio
I27 de la titina por fuerzas mecnicas utilizando mtodos computacionales que
describen la estabilidad mecnica del dominio I27 . Para ello se realiz una
comparacin de los resultados entre dos mtodos computacionales, SMD y PNW,
tomando como base los datos publicados por cada uno de los mtodos y
realizando una simulacin con el mtodo PNW, obteniendo una descripcin de las
fuerzas y los mecanismos de ruptura, el papel de las molculas de agua en dicho
proceso y el comportamiento de la fuerza en funcin de la extensin del dominio
I27 de la titina, creando a partir de estos resultados una pgina web que
describe el desarrollo de las simulaciones.
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3. REVISIN TERICA
3.1. Protenas y su clasificacin
Un aminocido es una molcula que contiene por lo menos un grupo amino neutro
(grupo funcional derivado del amoniaco) y un grupo carboxilo cido. Las protenas
se caracterizan por que estn formadas de la unin de aminocidos que tienen el
grupo amino y el grupo carboxilo enlazados por un mismo carbono denominado
carbono , a ste tambin se le une un tomo de hidrgeno y como cuarto
constituyente un grupo adicional denominado cadena lateral, el cul diferencia a
cada protena (por ejemplo la glicina, cuya cadena lateral es un tomo de
hidrgeno) [9]. ver figura 1.
Figura 1. Esquema de una protena
Los enlaces entre un grupo carboxilo y un grupo amino de los aminocidos en una
protena son covalentes, liberan una molcula de agua y reciben el nombre de
enlaces peptdicos. Cuando se unen los aminocidos de las protenas quedan en
sus extremos un grupo amino y un grupo carboxilo sin reaccionar [9].
Para especificar una protena se debe nombrar los carbonos que la componen
comenzando con el am ino (N-terminal) y terminando con el c ar bo x i l o (C-
terminal) [9], de aqu que algunos nombres de protenas sean muy extensos.
Las protenas son cadenas de aminocidos unidas por medio de enlaces
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peptdicos [3], con cuatro tipos de estructuras, la primera estructura est
compuesta por los enlaces peptdicos y sus aminocidos, la estructura secundaria
la conforman los plegamentos regulares conocidos como hlices alfa y hebras
beta que se enlazan por medio de puentes de hidrgeno y mantienen la
estabilidad de la protena, la estructura terciaria aparece cuando se generan
plegamentos adicionales en la estructura secundaria, y la estructura cuaternaria es
la conformacin de mas de una cadena de aminocidos [5]. (ver figura 2)
Figura 2. Representacin de las estructuras de las protenas segn su clasificacin. a)Estructura Primaria: Enlaces peptdicos con sus aminocidos. b) Estructura Secundaria:Plegamentos regulares (hlices alfa y hebras beta) . (c) Estructura Terciaria: la unin de
varias cadenas peptdicas d) Estructura Cuaternaria: Cadena de aminocidos. [16]
3.2. Titina y su papel en el sarcmero
Las protenas se encuentran en las clulas siendo el motor fundamental de la vida
biolgica como se conoce, es por esta razn la importancia de realizar estudios
que permitan seguir conociendo la biofsica de la naturaleza de stas. A partir de la
aplicacin de la dinmica molecular a las protenas, se puede conocer las
propiedades mecnicas y el funcionamiento de stas maquinas biolgicas [5].
Dentro de las protenas ms estudiadas se encuentran la elastina, la ubiquitina y la
titina, esta ltima es una protena sarcomrica gigante con mas de 30,000
aminocidos conocida como connectin, a la cual se le atribuyen las propiedades
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elsticas del sarcmero, que se encuentra en los msculos esquelticos y
cardacos, acta recuperando la longitud del musculo despus de su contraccin.
Figura 3. Ubicacin de la Titina en el sarcmero. Imagen tomada del artculo Papel de laTitina en la Modulacin de la Funcin Cardaca y sus Implicaciones Fisiopatolgicas
Carrion. M. (2007) define el sarcmero como una mquina biolgica de gran
tamao la cual principalmente se ocupa de la contraccin del musculo y est
conformada por tres protenas, miosina, actina y titina. El sarcmero se divide en
cuatro regiones distintas (ver figura 3), la linea Z, banda I, banda A y linea M [5];
dentro de ste se encuentra la titina, principal objeto de estudio, la cul se
extiende desde la lnea Z hasta la lnea M.
La titina conecta la linea Z con la linea M contribuyendo de esta manera a
transmitir la fuerza a la linea Z y liberando la tensin en la banda I [5], de esta
forma logra la contraccin del msculo, interactuando y uniendo las otras
protenas del sarcmero, la miosina y la actina, que son protenas miofilamentares
[3,5]. La miosina segn Carrion. M. (2007) es la encargada de ejercer la fuerza
para la contraccin del msculo pasando por encima de la actina que funciona
como un riel rgido.
La titina, funciona como un resorte molecular por su elevada propiedad elstica,
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permitiendo el estiramiento del sarcmero y determinando tanto su longitud como
la tensin pasiva del msculo cardaco y esqueltico, adems proporciona cierta
rigidez y estabilidad en el sarcmero cuando est tensionado y recuperando su
longitud natural [3].
La propiedad elstica de la titina junto con el estudio de sus enlaces de hidrgeno,
permiten realizar estudios sobre las propiedades fsicas y la estabilidad de la
protena, pero en su totalidad la titina no es una protena elstica, solo cierta parte
de su estructura presenta esta propiedad, como tal la titina est compuesta por
diferentes tipos de dominios presentes en las bandas y las lineas del sarcmero,
en la banda A se encuentra gran parte de la titina formada por repeticiones de
dominios Ig y Fn3 que no son extensibles, al contrario de lo que sucede en la
banda I en donde se encuentran dominios Ig, N2 y PEVK, los dominios N2 pueden
contener dos tipos de elementos diferentes llamados N2A Y N2B, la diferencia
entre estos elementos es la cantidad de dominios Ig y la cantidad de residuos
presentes en cada dominio [5]. Las propiedades elsticas de la titina como se ha
mencionado se encuentran ubicados solamente en ciertos dominios
principalmente en los dominios Ig, en donde se encuentra el dominio I27 , este
dominio en particular
es el primer dominio de Ig determinado estructuralmente en la regin de la
banda I responsable de regular la elasticidad para el msculo sarcomrico.
Dos hojas beta de I27, estn estrechamente conectadas a las regiones
terminales a travs de un bucle enrollado entre las hebras alfa. Para evitar
que se desenreden espontneamente (Case Study: Titin Ig domains, Gao.
Mu y Lee. Eric).
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3.3. Dominio I27 de la titina
Figura 4. Imagen del dominio I27 de la titina tomada con VMD utilizando el mtodode color que muestra la estructura secundaria del dominio.
El dominio I27 de la titina es el primer dominio determinado estructuralmente,
responsable de regular la estabilidad pasiva del msculo estriado, por su
propiedad elstica ha sido de gran inters en el estudio del desdoblamiento de
protenas tanto por mtodos computacionales como por experimentos con
microscopa de fuerza atmica (AFM por sus siglas en ingles) [8], el dominio I27se compone de 89 residuos y tiene una longitud promedio de 43,66 , a lo largo
del eje X, cuenta con dos (2) lminas u hojas beta ABED y AGFC, como muestra
las figuras 4 y 5.
El dominio contiene ocho hebras beta que son antiparalelas entre si, excepto las
hebras A' y G las cuales son paralelas. A y A' pertenecen a diferentes lminas
debido a la interaccin entre los residuos formando puentes de hidrgeno con las
hebras B y G, al mismo tiempo, esto permite que el dominio I27 de la banda I de
la titina sea estable.
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Figura 5. Hebras y lminas beta en representacin new cartoon, con estructurasecundaria del dominio I27 de la titina. En amarillo lmina compuesta por las hebrasABED, en naranja lmina compuesta por las hebras A'GFC. Tomada de Unfolding of
Titin Immunoglobulin Domains by Steered Molecular Dynamics Simulation [18]
3.4. Microscopio de fuerza atmica (AFM)
El microscopio de fuerza atmica (AFM) es un instrumento creado a principios de
los aos ochenta con el fin de obtener imgenes a escalas nanomtricas [23],
ademas, en los ltimos aos esta herramienta a parte de sus mltiples usos
investigativos en materiales ha permitido estudiar y analizar las propiedades
mecnicas de las molculas individuales de las protenas.
En la mayora de las protenas esta herramienta permite calcular la fuerza que se
le aplica a la estructura estable de la protena mediante la conversin de energa
mecnica a energa elctrica [3].
Los resultados de los diferentes estudios realizados muestran que la utilizacin
experimental del AFM en protenas, permite obtener las propiedades elsticas y la
estabilidad mecnica de resistencia que presentan las protenas al ser estiradas
[4].
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3.4.1. Modo de operacin del AFM
Para empezar se debe aislar una cadena de poliproteinas (repeticiones de
protenas de la misma clase) que depende de la protena a estudiar, luego se
coloca sobre el piezoelctrico y por medio de procesos fsicos o qumicos se ancla
a dos puntos sobre el cubre objetos mvil y el brazo sensor flexible, el
cubreobjetos efecta el movimiento de forma constante de tal manera que el
piezoelctrico calibrado en Armstrong estira la protena, el brazo sensor indica por
medio del cambio en su desplazamiento la resistencia que la protena ejerce para
no romper los puentes de hidrgeno y mantener su estabilidad. Los resultados
obtenidos aplicando este mtodo para el desdoblamiento del dominio I27 de la
titina segn Lu y Schutlen. (1999), demuestran que la fuerza requerida para
desestabilizar tal dominio debe ser superior a los 100pN, con una extensin mayor
de los 7. Ver figura 6.
Figura 6. Diagrama general de AFM. Imagen tomada del artculo Microscopio deFuerza Atmica. [23]
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3.5. Mtodos de simulacin
En el estudio de sistemas de partculas se debe tener en cuenta la cantidad de
molculas que se observan. Por ejemplo cuando se tiene un gas, se pueden
obtener las ecuaciones analticas que solucionan el problema ya sea con
mecnica cuntica o con mecnica clsica, slo se debe hacer una reduccin de
muchas partculas a unas cuantas, basados en que el sistema se puede
considerar de baja densidad y realizar una estadstica del sistema [25]. Cuando el
sistema es un cristal, la mecnica clsica o la cuntica proporcionan una buena
aproximacin basndose en la simetra del estado slido. Pero si el sistema es un
lquido, soluciones, macromolculas, slidos amorfos, etc, no es posible una
reduccin a unas cuantas partculas o a unos cuantos grados de libertad, pues se
requiere describir suficientemente las propiedades del sistema. Esto nos lleva
inevitablemente a una simulacin numrica del comportamiento del mismo, el cual
produce un conjunto estadstico de configuraciones en el espacio de fase que
representan dicho estado del sistema o ensamble [25].
Para realizar un promedio en un sistema de muchas partculas o una integral de
ese espacio de configuraciones, implica que se debe integrar muchos grados de
libertad, por lo que se escoge slo aquellos grados de una propiedad especfica
para ser calculada [25]. De lo anterior se deduce que el nivel de aproximacin del
modelo usado depender de la propiedad especfica en la cual se est interesado.
Cuando los grados de libertad son demasiados, la exactitud de las predicciones
depende nicamente de la calidad de las asunciones y aproximaciones del campo
de fuerzas utilizado en la simulacin. [Van Gunsteren , W, y Berendsen , H. 1990,
p. 994]
En CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) software
utilizado para la simulacin del desdoblamiento del dominio I27 de la titina, se
tiene en cuenta los siguientes potenciales [12][13][22]:
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-
U c harmm=U e nl a ce s+U noenlazados (1)En donde U e n l ace s son los potenciales, descritos de la siguiente forma:
U e n l ace s=U estiramieno+U ngu l o s+UU r e yBrad l e y+U d ie dr os+U im p ro p i o s+U c ma p(, ) (2)
En la ecuacin (2), los trminos descritos representan lo siguiente:
U estiramiento= Kb(bb )2 (3)La ecuacin (3) representa el potencial de estiramiento-encogimiento o bonded
consistente en la suma de los potenciales armnicos entre pares de tomos
separados entre s por un enlace covalente [12].
El trmino:
Un gul os= K( fo)2 (4)La ecuacin (4) representa el potencial de los ngulos asociados principalmente a
la alteracin en los ngulos de valencia o [12].
El potencial de Urey-Bradley UUB de la ecuacin 2, es:
UU B= KU B( b13b13,0 )2 (5)Y representa el trmino armnico de la distancia entre los tomos 1 y 3 de
(algunos) ngulos y se introdujo para la optimizacin final de los espectros de
vibracin. Este trmino resulta importante para las deformaciones en el plano, as
como la separacin de los modos de enlace simtrico y asimtrico del estiramiento
[13].
El potencial de los diedros o de torsin de la ecuacin 2 es:
U d i e d r os= K [1+co s( n ) ] (6)el cual sirve para modelar barreras estricas entre tomos separados entre s por
tres enlaces covalentes [12].
El penltimo potencial mostrado en la ecuacin 2, de los impropios corresponde a
las energas que se usan para mantener la quirilidad y la planaridad de la protena
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[12], y est dado por:
U im pro p i o s= Kw (ww )2 (7)y los potenciales CMAP:
UC M A P= U c ma p(, ) (8)son los que pueden en principio, aplicarse a cualquier par de ngulos diedros,
pero se utiliza en el campo de fuerza CHARMM actual para mejorar las
propiedades conformacionales de las cadenas principales de las protenas [13].
Figura 7. Representacin de los potenciales bonded y non-bonded del campo defuerzas de Charmm. [15]
La figura 7 muestra el resumen de los potenciales de bonded y non-bonded.
Los potenciales de los no enlazados o non-bonded son:
U noe n lazados=U L J+UCoul (9)
en donde:
U LJ= i j[( rminri j )12
2( rmin
rij )6] (10)
es el potencial de Lennard-Jones (LJ) y representa los pares de tomos no
enlazados, en donde i j es la profundidad del potencial, rmin es la distanciamnima en donde el potencial es cero y r ij es la distancia entre los tomos.
Finalmente el potencial de Coulomb que es:
24
-
UCou l= KC [ q iq jr i j ] (11) (para informacin ms detallada de los potenciales ver la fuente
http://www.charmmtutorial.org/index.php/CHARMM_Tutorial)
Los potenciales de LJ y de Coulomb sealados anteriormente, describen todas las
interacciones presentes de los tomos no enlazados durante el fenmeno de
ruptura de los puentes de hidrgeno, sin embargo, es necesario considerar el
consumo en tiempo del clculo de cada una de las interacciones entre todos los
pares de partculas, que en si influyen en el tiempo que tarda en completarse una
simulacin [12]. En teora se debera evaluar todos trminos para cada uno de los
tomos presentes, el problema de hacerlo para N tomos, resulta en la necesidad
de NxN pasos para calcularlo, lo cul es prcticamente imposible por el tiempo
que tardara [12][13]. Para acelerar el clculo se suelen ignorar interacciones entre
tomos que estn separados a cierta distancia prefijada o distancia de corte
(cutoff). Sin embargo, ste corte no se hace de forma abrupta, puesto que al
realizarlo, se introducira una discontinuidad que puede afectar negativamente a
la estabilidad del clculo de la dinmica molecular [13]. En el Charmm, para evitar
estos cambios bruscos, se llama una funcin la cul permite apagar suavemente
las interacciones (ver figura 8), en la imagen se muestra la grfica del potencial LJ
(en azul) y se observan dos ejemplos de cutoff (rojo y verde), en el primero se da
la orden de realizar un corte a una distancia ms corta que en el segundo; en la
figura 8, puede observase que el potencial no cambia de forma abrupta.
Figura 8. Grfica del Potencial de Lennard-Jones en funcin de la distancia. Imgentomada de Charmm Tutorial [13]
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-
La fiabilidad de las predicciones hechas por los mtodos de dinmica molecular
depende de la exactitud del campo de fuerzas escogido y de la bsqueda del
espacio de configuraciones acorde a las propiedades de inters del sistema.
Aunque la exactitud de una simulacin por computador puede ser estimada
considerando las aproximaciones y las simplificaciones, la prueba para
proporcionar una base firme a la dinmica molecular es comprobar los datos
obtenidos con datos experimentales siempre que sto sea posible. [Van
Gunsteren, W, y Berendsen , H. 1990, p. 996]
A continuacin se presentan dos mtodos de simulacin utilizados para
representar el desdoblamiento de protenas que usualmente se realizan
experimentalmente con el AFM.
3.5.1. Steered Molecualr Dynamics (SMD)
Este mtodo de simulacin permite replicar con gran exactitud el proceso
realizado con AFM, los principales ejecutores de este mtodo de simulacin son
Klaus Schulten, Rosemary Braun, Barry Isralewitz, Hui Lu, Justin Gullinsrud,
Zergei Izrailev, Dorina Kosztin y Ferenc Morlan, este mtodo utiliza herramientas
computaciones y cdigos en paralelo de dinmica molecular como NAMD, XPLOR
Y CHARMM, cada uno de estos programas realiza una tarea especfica y con la
ayuda de la base de datos de Protein Data Bank (PDB), en donde se encuentra la
topologa de cada una de las protenas determinadas con resonancia magntica
nuclear (RMN) [1][11][20] y rayos x (RX), se ejecuta la simulacin bajo los
parmetros requeridos. En sntesis el desarrollo de SMD, funciona aplicando
fuerzas externas a los carbonos terminales de las protenas a velocidades
constantes comparables, aunque mayores a las utilizadas en AFM, el tiempo de
simulacin vara de acuerdo a la capacidad de la CPU, como tal las simulaciones
se realizan en tiempos aproximados de nano a picosegundos logrando fuerzas de
200pN a 2000pN.
26
-
3.5.1.1. Resultados obtenidos con SMD
En los ltimos aos se han desarrollado muchas simulaciones aplicadas al
desdoblamiento del dominio I27 de la titina debido a sus propiedades elsticas,
Hui Lu y Klaus Schulten, (1999), aplicaron el mtodo SMD para observar y
analizar el desdoblamiento del dominio I27 de la titina en su artculo titulado
Steered molecular dynamics simulation of conformational changes of
immunoglobulin domain I27 interprete atomic force microscopy observations. El
mtodo de simulacin se prepar utilizando el campo de fuerzas de CHARMM22 y
software de dinmica molecular NAMD y XPLOT, tomaron la topologa de I27llamado 1TIT de la base de datos de PDB y se coloc dentro de en una esfera de
agua con radio de 30, con aguas preequilibradas, un dielctrico constante de
valor 1 y un tiempo de integracin de 1fs. Se aplicaron fuerzas externas simulando
un resorte de coeficiente de elasticidad de valor promedio de 5 Kcal/mol2 y se
estir de forma constante con velocidades de 0.1, 0.5, y 1 / ps . La fuerza fue
aplicada sobre el carbono terminal de Leu-89 y se mantuvo fijo el carbono terminal
Leu-1. Los resultados que se obtuvieron con el mtodo SMD del anlisis de las
fuerzas se representa en la figura 9.
Figura 9. Grfica de la fuerza contra la extensin de la protena a tres diferentesvelocidades. Tomado de Steered molecular dynamics simulation of conformational
changes of immunoglobulin domain I27 interprete atomic force microscopyobservation. [19]
27
-
Las tres lineas representan la fuerza que realiza la protena como resistencia a la
fuerza aplicada a medida que sta se va extendiendo, cada una de ellas se
diferencia por la velocidad a la cual fue aplicada la fuerza de tirado sobre la
protena. Como se puede observar, el primer pico de fuerza representa el
rompimiento de la estabilidad de la protena es decir el rompimiento de los
primeros puentes de hidrgeno que mantienen la forma y las propiedades fsicas
de la protena, segn la figura 9, entre las tres lineas, la que requiere mayor fuerza
para romper los puentes de hidrgeno y desestabilizar la protena, es la simulacin
en la cual la velocidad de tirado es 1 / ps esto quiere decir que a mayor
velocidad mayor fuerza se requiere para desestabilizar la protena. La distancia
promedio de los rompimientos de los puentes de hidrgeno se dan despus de
una extensin aproximada de 15 para los tres casos, esto significa, segn Lu, H.
y Schulten, K. (1999), que la distancia de rompimiento de los puentes de
hidrgeno no depende de la fuerza o la velocidad de tirado si no de la extensin a
la cual la protena es sometida.
3.5.2. Pull And Wait (PNW)
Este mtodo de simulacin fue desarrollado por los doctores en biofsica German
Pabon y Mario Amzel, (2006) los resultados de este mtodo son comparables con
SMD y AFM, la diferencia radica en la forma en que se aplica la fuerza, al igual
que SMD, PNW utiliza el campo de fuerza de CHARMM y visualiza las
simulaciones utilizando VMD.
PNW aplica fuerzas armnicas por ejemplo, a los carbonos terminales de las
protenas, manteniendo estable el primer carbono terminal como si fuese un punto
fijo y moviendo el ltimo carbono terminal por medio de la fuerza a una distancia
(x). Esto se hace como su nombre lo indica jalando y esperando a que se efecte
un equilibrio con el sistema, es decir, que la simulacin se hace por pasos. se
aplica la fuerza armnica como si fuese un resorte, se espera a que se equilibre el
sistema y de nuevo se ejecuta la accin hasta obtener los picos de resistencia de
28
-
la protena a la fuerza aplicada, en promedio las velocidades a las cuales se
aplican la fuerza son mucho menores a las realizadas en SMD y comparables a
las de AFM , obtenindose fuerzas alrededor de los 350pN y 1500pN.
3.5.2.1. Resultados del mtodo de simulacin PNW
Pabon, G,. y Amzel, M., (2006) estudiaron el desdoblamiento del dominio I27 de la
titina utilizando el protocolo de simulacin PNW para analizar y comparar los
resultados de la fuerza de resistencia de la protena con la extensin de la misma.
Pabon, G. et al. (2006), prepararon la muestra utilizando el campo de fuerzas de
CHARMM, utilizaron la topologa de I27 del banco de datos de PDB llamado 1TIT,
la cul, se coloc en una caja de agua con repeticiones del tipo TIP3P
previamente equilibradas, lo suficientemente grande para la extensin del dominio
I27 , un dielctrico uniforme y constante de valor 1 y un tiempo de integracin de
1fs, se llevaron a cabo 5 simulaciones a 300K aplicando una fuerza armnica con
coeficientes entre 1 y 5 Kcal /mol2 y una simulacin a 350K aplicando una
fuerza armnica con coeficiente de 2Kcal /mol2 .
Figura 10. Representacin del estiramiento por fuerza armnica del dominio I27 dela titina utilizando PNW. Tomado de Mechanism of Titin Unfolding by Force: Insight
from Quasi- Equilibrium Molecular Dynamics Calculations [21]
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-
Como se muestra en la figura 10, se tom el carbono terminal del primer residuo
Leu-1 como un punto fijo, luego se aplic la fuerza armnica al carbono terminal
del ltimo residuo Leu-89, la fuerza se aplic por pasos desplazando el resorte 4
por cada uno de ellos, de forma tal que se le permitiera al sistema equilibrarse
durante un tiempo de 30 a 170ps y descansar durante 30ps.
Los resultados obtenidos se presentan en las siguientes grficas:
Figura 11. Grfica de fuerza contra extensin del dominio I27 . Tomado deMechanism of Titin Unfolding by Force: Insight from Quasi- Equilibrium Molecular
Dynamics Calculations [21]
La figura 11 muestra el pico mximo de fuerza ejercido para romper los puentes
de hidrgeno del dominio I27 a una temperatura de 350K, este pico corresponde a
una extensin de un promedio de 12-14, tambin aparece un conjunto de puntos
A y B, en donde se extendi la simulacin durante 10ns (un paso), para el conjunto
A se extendi un paso y el conjunto B dos pasos antes del rompimiento de los
puntes de hidrgeno.
Como se muestra en la figura 11, la fuerza requerida para romper los puentes de
hidrgeno se da entre 800pN y 1000pN a una extensin promedio de 12-14. En
la figura 12 se muestra en sus lineas de color que la separacin entre los puentes
de hidrgeno entre los -pliegues A y G (ver figura 10) de los residuos descritos
en la esquina superior izquierda se da casi de forma instantnea en un tiempo de
60 a 70ps.
30
-
Figura 12. Grfica de la extensin de los puentes de hidrgeno en funcin deltiempo. Tomado de Mechanism of Titin Unfolding by Force: Insight from Quasi-
Equilibrium Molecular Dynamics Calculations [21].
Segn Pabon, G. et al (2006), durante la simulacin, los cuatro puentes de
hidrgeno mostrados en la figura 12 son los encargados de mantener la
estabilidad del dominio I27 , el papel de las aguas es fundamental en el proceso
de rompimiento de los puentes de hidrgeno ya que stas interactan formado
enlaces con el donador y aceptor entre los OC y NH, tomos que forman los
puentes de hidrgeno durante periodos cortos de tiempo debilitando los enlaces
para al final romperse, el mtodo permite observar con detalle a diferencia de
SMD y AFM lo que ocurre durante el rompimiento de los puentes en la columna
vertebral de la protena y permite que el sistema se equilibre, algo que no se
evidencia con los otros mtodos.
3.6. Visual Molecular Dynamics (VMD)
Este programa como su nombre lo indica permite visualizar molculas definidas
por resonancia magntica nuclear (RMN) o cristalografa de rayos X [14], que se
encuentran en la base de datos de PDB, adems, ofrece una amplia variedad de
herramientas de representacin para obtener grficos mucho mas definidos en 3D,
31
-
en si, VMD permite ver las trayectorias de una dinmica molecular realizadas por
medio de simulaciones [14].
32
-
4. DESARROLLO DE LAS SIMULACIONES
4.1. Desarrollando los script y generando los archivos para simular
Esta seccin est dedicada a hacer una breve introduccin de los componentes y
parmetros que se deben tener en cuenta para realizar una simulacin con el
mtodo PNW. Adems, Describe rpidamente los script (cdigo de programacin)
y algunos comandos utilizados para realizar el trabajo de grado.
El primer paso consiste en instalar el software de CHARMM y el de VMD. Aunque
el CHARMM no es un software libre, tiene la ventaja de poderse correr como un
ejecutable en mquinas con similares arquitecturas. El software de VMD es muy
sencillo de conseguir, para sto, se debe ingresar a la pgina de la Universidad de
Illinois dedicada a la biofsica computacin, Theoretical and Computational
Biophysics Group, inscribir el correo electrnico con el usuario y descargar el
programa cuya ltima versin estable es 1.9.1.
Una vez se tiene el software instalado con las libreras necesarias, se deben
descargar los paquetes o archivos de la estructura de la protena que se quiere
estudiar desde el Protein Data Bank (PDB), se recomienda hacerlo desde la
misma pgina de charmm-gui.
Seguido de sto, se debe generar archivos con las coordenadas y los parmetros
de la protena.
Ahora se debe generar una caja de agua para solvatar la protena. Esta
solvatacin se realiza para simular las condiciones en las cuales se encuentra sta
en el cuerpo humano, lo cul se conoce como simulacin insilico. En Charmm se
realiza la solvatacin con el tipo de aguas llamado TIP3P por que ste modelo
evita que el campo de fuerzas de Charmm colapse cuando los tomos estn muy
cercanos, lo cul llevara a la imprecisin de la simulacin.
33
-
En el script para generar la caja de aguas, el Charmm debe leer los archivos .rtf
y .prm, adems debe definir el tipo de agua TIP3, las repeticiones de la misma
necesarias en cada una de las coordenadas x, y, z, posicionndolas de forma
aleatoria; el tamao y la forma de la caja, ubicando la protena en el interior de la
caja, minimizando el nmero de molculas de agua, se recomienda no usar una
caja de agua muy grande para una molcula pequea, en tanto el costo de
simulacin es muy alto en trminos del tiempo y de procesamiento de datos.
Como en la simulacin el nmero de molculas es parmetro de entrada, en el
script se describen las condiciones peridicas de frontera, las cuales, deben
garantizar que el nmero de partculas sea constante. Finalmente, se define la
temperatura del sistema a la cul se desarrolla la simulacin. Para este caso en
particular, es de 300k. Todo lo anterior, hace posible la generacin de las
coordenadas de las molculas de agua. Para verificar el tamao, orientacin y el
nmero de molculas, es recomendable generar en el mismo script un archivo
.pdb y observarlo en VMD.
Teniendo en cuenta la cantidad de molculas y las diferentes interacciones entre
ellas, tales como Van der Waals, coulombianas entre otras, el costo computacional
es alto y se hace necesario utilizar el procesador del computador a su ms alta
capacidad por medio del cdigo:
-p4pg host [archivo de salida].
Al comienzo de la lnea de comando se debe invocar el ejecutable de charmm. Al
llamar el archivo host, se invoca un script que tiene los siguientes parmetros:
localhost [nmero de procesadores] [direccin del archivo en el cual se encuentrael ejecutable charmm]
El siguiente paso es generar la solvatacin (introducir la protena en la caja de
aguas). Se debe crear un script que contenga los parmetros de la caja, las
dimensiones, los parmetros de los cut-off y que lea los archivos .rtf y los .prm de
la protena, los archivos .psf, adems, las coordenadas generadas en el primer
paso. En ste script se deben escribir las coordenadas de orientacin y de
34
-
traslacin de la protena en caso de ser necesario, adems se debe incluir el
nmero total de molculas de agua teniendo en cuenta las dimensiones y
repeticiones dadas cuando se gener. Tambin se deben eliminar los tomos de
agua que se salen de la caja cuando se introduce la protena; generar los archivos
de las coordenadas nuevas de las aguas con la molcula y los archivos de la
estructura de la protena (protein structure file .psf); utilizar el campo de fuerzas de
Charmm para minimizar la energa del sistema. Finalmente, se generan los
archivos de las coordenadas (.crd) y un .pdb despus de la minimizacin.
Finalmente, se hace un script para halar la protena. En ste, se definen las
condiciones de los cutoff de los non-bonded, debe leer los archivos .rtf, .prm y .psf
generados con los anteriores script; tambin se definen la constante elstica del
resorte (dada en Kcal /mol2 ), la distancia en a la cual, se va a halar la
protena en cada paso, el tiempo de equilibrio en fentosegundos ( fs), la cantidad
de pasos o jalones que se aplica y los contadores de los pasos. El srcipt debe leer
las coordenadas inicial del sistema, tambin es indispensable que contenga las
dimensiones de la caja creada, el tipo de agua utilizada, el cdigo de Charmm
para calcular la energa, el tiempo de integracin, el mtodo de integracin que se
va a utilizar, el intervalo de los ensambles, la temperatura inicial y final del sistema;
es importante crear mediante el script archivos que guarden la informacin de
calentamiento y equilibrio en cada uno de los pasos, as como las coordenadas del
sistema.
Con este ltimo script la simulacin PNW est completa. Para determinar el
rompimiento de los puentes de hidrgeno se puede utilizar VMD cargando los
archivos .pdb y .dcd.
4.2. Metodologa de las simulaciones
Con el procedimiento descrito anteriormente, se realizaron cuatro simulaciones
cambiando el coeficiente de elasticidad del resorte, utilizando valores de (3 a 5
35
-
Kcal /mol2 ) y una ltima simulacin a 350K con coeficiente de elasticidad del
resorte de 2Kcal /mol2 . Adems de lo anterior, se toma la posicin del carbono
terminal del ltimo residuo en cada paso de integracin para obtener la grfica de
fuerza contra distancia.
Utilizando el men de VMD, se selecciona el donador y receptor del puente de
hidrgeno de la columna principal de la protena, en la opcin tools se selecciona
bonded y se da la orden de graficar, con este procedimiento, se obtiene la grfica
de distancia de separacin entre el donador y el receptor en los puentes de
hidrgeno,
Figura 13. Dominio I27 de la titina, en amarillo las hebras beta, en blanco y verdelos aminocidos que unen las hebras beta en azul un pequeo cilindro alfa que seforma en el dominio. Tomado con el programa VMD representado por el mtodo de
dibujo New cartoon y mtodo de color que muestra la estructura secundaria deldominio.
Las simulaciones de dinmica molecular para el estiramiento del dominio I27 de la
titina se llevaron a cabo mediante el campo de fuerzas del programa CHARMM.
Se realizaron tres simulaciones a temperatura constante de 300K y una simulacin
con temperatura constante tambin de 350K, con un dielctrico constante y
uniforme de valor 1 y un tiempo de integracin de 1fs, un corte de fuerzas de Van
der Waals de 9 y llegar a cero a 10, la protena se coloc en una caja de agua
36
-
con dimensiones (93.12960, 40.35616, 37.25180 ) respectivamente, con
repeticiones de molculas preequilibradas TIP3P que contiene 4680 molculas de
agua para un total de 14040 tomos ver figura 13. El modelo de partida fue una
estructura determinada por RMN llamada 1TIT, la cual se detalla en la figura 13,
descargada desde el banco de datos PDB de CHARMM. Esta estructura, se
coloc dentro de la caja de agua y se equilibr a una temperatura de 300K con un
total de 13926 tomos. Ver figura 14.
Figura 14. Representacin del estiramiento por fuerza armnica del dominio I27 dela titina utilizando PNW. Tomado con VMD en representacin New Cartoon.
Se realiz el estiramiento del dominio I27 fijando el primer carbono alfa terminal
(N-terminal) del primer residuo llamado (Leu-1) y se aplic fuerza externa sobre el
ltimo carbono alfa terminal del ltimo residuo (C-terminal) llamado (Leu-89) ver
figura 14. La fuerza armnica se aplica sobre la lnea del carbono N y C-terminal
estirndolo mximo hasta 4, por un tiempo de equilibrio de 170ps para cada
paso de simulacin, posterior a este proceso se permite a la estructura un tiempo
de descanso de 30ps, para un total de 200ps de simulacin por paso, este
protocolo se repite hasta lograr el rompimiento de los puentes de hidrgeno.
37
-
Figura 15. Dominio I27 en una caja de agua. Las lneas rojas y blancas representanlas aguas que conforman la caja. Tomado con el programa de visualizacin VMD.
Para cada una de las simulaciones se realiz cambios en el coeficiente de
elasticidad del resorte, utilizando valores de (3 a 5 Kcal /mol2 ) y una ltima
simulacin a 350K con coeficiente de elasticidad del resorte de 2Kcal /mol2 .
38
-
5. RESULTADOS DE LAS SIMULACIONES
Las figuras mostradas a continuacin son el resultado de las simulaciones
llevadas a cabo con valores de coeficiente entre 3-5 Kcal /mol2 a 300K y una
simulacin a 350K con coeficiente de 2Kcal /mol2 . Se representa el valor de la
fuerza y la extensin promedio de cada una de ellas, la distancia y el tiempo de
rompimiento de los puentes de hidrgeno y el papel de las molculas de agua en
dicha desestabilizacin.
5.1. Fuerza de rompimiento y desestabilizacin del dominio I27 de la
titina.
Cada una de las siguientes grficas representa la fuerza que el dominio I27 de
la titina realiza a medida que es estirada, El pico de fuerza representa la barrera
en la cual la protena pierde su estabilidad por el rompimiento de los puentes de
hidrgeno despus de ser estirada una distancia (x).
2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
100200300400500600700800900
fuerza realizada por la proteina vs extensin
Extensin de la proteina en (A)
Fuer
za p
N
Figura 16. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena, calculada a unatemperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 3Kcal/mol2
En la figura 16. Se representa la fuerza mxima para un coeficiente de elasticidad
de 3Kcal /mol2 , a una temperatura de 300K, en la cul, se puede apreciar el
pico de fuerza ~600pN a una extensin de ~11, se observa una disminucin de la
39
-
misma hasta ~ 350pN.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
100200300400500600700800900
fuerza realizada por la proteina vs extensin
Extensin de la proteina en (A)
Fuer
za p
N
Figura 17. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena calculada a unatemperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 4Kcal /mol2 .
En la figura 17. el coeficiente de elasticidad, a una temperatura de 300K, utilizado
tiene un valor de 4Kcal /mol2 y se puede observar un pico de fuerza ~700pN
en un estiramiento de ~13 y luego disminuye la fuerza hasta ~400pN.
Figura 18. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena calculada a unatemperatura de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 5Kcal /mol2
En la figura 18. el pico de fuerza alcanzado utilizando un coeficiente de elasticidad
de 5Kcal /mol2 , a 300K, es de ~900pN a una extensin de ~13 y disminuye
40
2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
100200300400500600700800900
fuerza realizada por la proteina vs extensin
Extension de la proteina en (A)
Fuer
za p
N
-
hasta ~450pN.
De la figura 16 a la 18, se observa que la fuerza aumenta considerablemente
durante los primeros 5 pasos de simulacin (simulaciones cortas de 200ps cada
una con un tiempo de relajacin de 30ps), sto indica que durante un intervalo de
tiempo de 1000 a 1200ps se obtiene el rompimiento de la columna de puentes de
hidrgeno que mantienen estable el dominio I27 y en el intervalo inmediatamente
anterior (800 a 1000ps) se obtiene la mayor resistencia a la desestabilizacin.
A medida que el coeficiente de elasticidad aplicado es mayor, los picos de fuerza
son mayores y varan entre (600 y 900pN), pero despus del rompimiento los
valores de la fuerza de cada simulacin disminuyen a un valor ~400pN.
5.2. Rompimiento de los puentes de hidrgeno de las hebras A' y G
Las siguientes figuras muestran la distancia de rompimiento de la columna de
puentes de hidrgeno (CO NH) entre las hebras A' y G del Dominio I27 frente a
los fragmentos (imgenes en VMD) que muestra cada simulacin. Cada fragmento
es equivalente a 0,1ps de la simulacin para un total de 1800 a 2000ps de
simulacin.
La columna principal del dominio I27 est formada por seis puentes de
hidrgeno, de los cuales, cuatro de ellos realizan la mayor parte de la fuerza para
mantener estable la protena. La hebra A' por medio de sus tomos CO de los
residuos TRY 9 y VAL 11 forman enlaces con los tomos NH de la hebra G de los
residuos ASN 83 y LYS 85, y la hebra G por medio de sus tomos CO de los
residuos ASN 83 y LYS 85 forman enlaces con los HN de la hebra A' de los
residuos VAL 11 y VAL 13.
41
-
Figura 19. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de lashebras A y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
3Kcal/mol2 a una temperatura de 300K.
Figura 20. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de lashebras A y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
4 Kcal /mol2 a una temperatura de 300K.
42
-
Figura 21. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de lashebras A y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
5Kcal/mol2 a una temperatura de 300K.
Como se puede observar, la distancia inicial entre cada uno de los puentes de
hidrgeno es de ~3 excepto entre TRY 9 CO-ASN 83 NH cuya distancia inicial es
de 6 y luego se acerca para romperse definitivamente.
Durante la simulacin se puede observar como los puentes de hidrgeno
aparecen y desaparecen cuando ha pasado un tiempo ~900ps. En este punto las
molculas de agua entran a jugar un papel importante, el cual consiste en formar
en periodos cortos de tiempo enlaces con los tomos de NH de VAL 11 y LYS 85
manteniendo estable la protena hasta que la distancia sea lo suficientemente
grande y se rompan definitivamente los enlaces y alcancen una distancia de
separacin por encima de 5.
Las figuras 19 a 21, demuestran que el rompimiento de los enlaces se da en
promedio en el mismo periodo de tiempo entre los 800 y 1000ps de simulacin
siendo ms evidente para coeficientes de elasticidad mayores.
43
-
5.3. Papel de las molculas de agua en el rompimiento de los puentes
de hidrgeno
Durante el proceso de desestabilizacin del dominio I27 de la titina, las molculas
de agua juegan un papel importante, a medida que la fuerza es aplicada sobre la
protena, las molculas de agua pasan por medio de las hebras A y G y
empiezan a formar enlaces con los tomos de CO tal y como muestra la figura
22A. Esto permite que los puentes de hidrgeno se rompan con mayor facilidad y
la protena se estire.
A
B C
D
Figura 22. Detalle de la interaccin entre las molculas de agua y los puentes dehidrgeno entre las hebras A' y G del dominio I27 de la titina.
En la figura 22B. se muestra el proceso en el cual las molculas de agua
interaccionan con los donadores y receptores de los puentes de hidrgeno de la
hebras A' y G del dominio I27 . La molcula de agua se acerca a los enlaces (ver
44
-
figura 22C) y comienza la interaccin de tal forma que a distancias mayores de 3
entre los puentes de hidrgeno la molcula de agua lo sustituye sin causar
alteraciones a la estructura. Una segunda molcula de agua entra en esta
interaccin (ver figura 22D) formando tres enlaces entre los CO de las hebras A' y
G. luego la interaccin entre las molculas de agua y los carbonos CO permite que
la protena se desestabilice generando as la ruptura de los puentes de hidrgeno.
5.4. Simulacin a temperatura de 350K
Al realizar la simulacin a una temperatura de 350K con coeficiente de elasticidad
de 2Kcal /mol2 se encontr que el valor promedio de desdoblamiento del
dominio I27 es mucho ms pequeo en comparacin a las simulaciones
realizadas a temperaturas de 300K. En promedio el rompimiento de los puentes de
hidrgeno se da a una extensin por debajo de los 10, 3 por debajo del valorpromedio encontrado en las simulaciones realizadas a 300K. Adems, la fuerza
requerida para desestabilizar el dominio es ~550pN, por debajo del valor de la
fuerza requerida a una temperatura de 300K.
Figura 23. Curva de fuerza frente a la extensin de la protena calculada a unatemperatura de 350K utilizando un coeficiente de elasticidad de 2Kcal /mol2
45
2 4 6 8 10 120
100
200
300
400
500
600
700
fuerza realizada por la proteina vs extensin
Extensin de la proteina en (A)
Fuer
za p
N
-
Figura 24. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de lashebras A y G de I27, entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a
2Kcal /mol2 a una temperatura de 350K.
El rompimientos de los puentes de hidrgeno requiere de mayor tiempo de
simulacin, en promedio este rompimiento se da a los 2000ps de simulacin
producto del valor del coeficiente que es menor al utilizado en las simulaciones a
300K.
5.5. Simulaciones en largos periodos de tiempo
Durante el proceso de simulacin es importante detallar la influencia y la
importancia del tiempo de simulacin utilizado, los resultados obtenidos
anteriormente se dan en simulaciones cortas tiempos por paso de 200ps, pero,
para obtener resultados ms detallados segn Pabn, et, al. (2006) se puede
ampliar este rango de tiempo justo en los pasos durante el proceso de
rompimiento y despus del rompimiento de los puentes de hidrgeno para analizar
con precisin el papel de las aguas y la fuerza de desestabilizacin de la protena,
para sto, se extendi el tiempo de simulacin de 200ps por paso a 1ns durante el
quinto y sexto paso de simulacin es decir durante y despus del rompimiento.
La figura 25 muestra como la fuerza disminuye si se extiende el tiempo de
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simulacin, bajando en promedio 200pN, lo cual, quiere decir que se da una mayor
exactitud en los resultados comparados con los obtenidos en AFM.
Figura 25. Comparacin de la curva de fuerza frente a la extensin de la protena, ennaranja simulacin a periodo corto de tiempo en azul simulacin a periodo largo detiempo durante el quinto y sexto paso de simulacin, calculadas a una temperatura
de 300K utilizando un coeficiente de elasticidad de 5Kcal /mol2
Figura 26. Distancia entre los cuatro principales puentes de hidrgeno de lashebras A y G de I27 , entre sus donadores y receptores (CO-NH). Simulacin a5Kcal/mol2 a una temperatura de 300K aumentando el tiempo de simulacin a
1ns entre el paso cinco y seis.
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2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 220
100
200
300
400
500
600
700
800
900
fuerza realizada por la proteina vs extensin
Extensin de la proteina en (A)
Fuer
za p
N
-
El rompimiento de los puentes de hidrgeno se da entre los 1000 y 1200ps
teniendo en cuenta que el tiempo total de simulacin es de 3ns, ya que se
extiende el tiempo del quinto y sexto paso de simulacin a 1ns, el rompimiento se
da por encima de los 3 y se evidencia que despus del rompimiento se
mantiene constante la distancia entre el donador y receptor (CO y NH) a ~10.
Ver figura 26.
5.6. Comparacin entre los mtodos SMD y PNW
Utilizando el mtodo de simulacin PNW para desdoblar el dominio I27 de la titina
German Pabn y Mario Amzel en su articulo titulado Mechanism of Titin Unfolding
by Force: Insight from Quasi-Equilibrium Molecular Dynamics Calculations
encontraron que las fuerzas de rompimiento de los enlaces de hidrgeno se dan a
1440pN con una extensin de ~15 para simulaciones cortas (500ps) y entre
300pN y 600pN para simulaciones largas (10ns) con una extensin de ~12,5.
Mientras que los resultados obtenidos por Hui Lu y Schulten Klaus escritos en el
artculo titulado Steered molecular dynamics simulation of conformational changes
of immunoglobulin domain I27 interprete atomic force microscopy observation,
evidencian que la fuerza necesaria para romper los puentes de hidrgeno se
encuentran al rededor de los 1200 y 2200pN con una extensin entre los 15 y 17.
En el captulo anterior se mostr que realizando simulaciones de 2ns, los
resultados son comparables a los obtenidos por los doctores Pabn y Amzel (ibid),
ya que las fuerzas de ruptura fueron entre 600 y 900pN con una extensin que
oscil entre los 11 y 13 en simulaciones cortas, ademas, al extender el tiempo de
simulacin durante y despus del rompimiento de los puentes de hidrgeno de
200ps a 1ns se obtiene que la fuerza disminuye de 900pN a ~680pN.
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6. COMPONENTE PEDAGGICO
En los ltimos aos el desarrollo de nuevas tecnologas de la informacin ha
permitido a estudiantes, docentes e investigadores conocer ms sobre los nuevos
avances en ciencias y educacin [24], no solo la aplicacin de las herramientas
didcticas estn enlazadas al desarrollo de estrategias de aprendizaje en el aula
sino tambin fuera de ella. La TICs se definen como la tecnologa informtica de la
comunicacin y todas aquellas herramientas como plataformas, foros, blogs,
simuladores entre otros. Propuestas ms fuertes han permitido establecer que una
red de comunicacin entre varios individuos interesados en un tema particular,
puede generar una mayor interaccin y apropiacin del conocimiento en particular,
en este caso para la Biofsca y explcitamente el desdoblamiento de protenas.
Actualmente existen muchos portales, pginas web, blogs dedicados a construir
diariamente una base de datos de investigaciones recientes y de gran utilidad para
los usuarios [17], partiendo del hecho que cada uno de estos portales importantes
en su mayora son de habla inglesa, la necesidad de construir portales de
informacin en espaol sobre temas en ciencia y que adems recoja mucha
informacin sobre temas de inters es indispensable y se hace cada vez ms
necesario. Por este motivo, se propone el diseo y creacin de una pgina web
sobre biofsica que contenga informacin detallada sobre el desdoblamiento de
protenas, en la cual, se pueda encontrar informacin de desarrollos recientes,
links de pginas importantes de cada uno de esos temas, informacin sobre las
nuevas herramientas tecnolgicas mtodos de simulacin. Esto con el fin de
fomentar la participacin de los docentes de biofsica del proyecto Curricular de Lic
en Fsica, en la cooperacin de sus estudiantes en el desarrollo de investigaciones
y ayude a ver la practicidad de los temas vistos durante el semestre.
El portal desarrollado se llama (STUDY OF I27 DOMAIN OF TITIN), este portal se
cre utilizando la herramienta de creacin de pginas web wix.com que permite
editar y crear sin la necesidad de cdigos una pgina web y brinda un dominio en
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Internet para que sea posible encontrar la pgina en la web. El dominio que
wix.com proporcion para ser utilizada desde la red es
http://dominioi27titina.wix.com/protein, esta pgina contiene la mayora de datos
importantes y esenciales del presente trabajo por ejemplo, descripcin de las
protenas, mtodo de simulacin, videos, fotos, resultados importantes, enlaces a
los programas y pginas especializadas en el tema, enlaces a artculos, entre
otros.
Esta pgina web se desarroll como herramienta pedaggica para dar a conocer
la importancia del desdoblamiento de protenas a partir del desdoblamiento del
dominio I27 de la titina, adems para guiar al lector al desarrollo de una
simulacin de dinmica molecular utilizando programas como CHARMM y VMD,
en que se puede encontrar un mapa conceptual que muestra de forma general los
pasos a seguir para realizar una simulacin utilizando el mtodo PNW. ver figura
27.
Figura 27. Descripcin general para realizar una simulacin con el mtodo PNW.
50
-
6.1. Desarrollo de la pgina web
Para la creacin de la pgina web se tuvo en cuenta herramientas que permiten
crear sitios web sin la necesidad de cdigos, se encontr que wix.com es uno de
estos portales que brinda esta posibilidad. WIX contiene tutoriales que explica
como escoger el diseo de pgina deseada y al mismo tiempo editarlo.
En la primera parte de la pgina se describe el tema, se tienen enlaces, fotos y
videos que permiten orientar inmediatamente a la persona en el tema que se
aborda en ste trabajo, ver figura 28.
Figura 28. Pestaa inicial de la pgina web titulada STUDY OF I27 DOMAIN OFTITIN, en el cuadro azul se encuentran enlaces a las pginas principales de VMD yCHARMM GUI, en el cuadro amarillo se muestra los enlaces y temas dentro de lamisma pgina, en el cuadro naranja se encuentra otros enlaces especficos de
temas concretos y videos.
En la figura 29 se muestra los enlaces a los temas de inters como descripcin del
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-
mtodo, artculos relacionados, otros videos que se encuentran en la pgina
creada como apoyo del presente trabajo.
Figura 29. pestaa inicial de la pgina web titulada STUDY OF I27 DOMAIN OF TITIN,enlaces de inters dentro de la misma pgina sobre temas relacionados.
Para que la pgina web fuera concreta se cre una segunda y tercera pestaas de
informacin que contiene resmenes e imgenes de inters y que relaciona lo
desarrollado en el presente trabajo de manera lineal, ver figura 30.
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Figura 30. segunda y tercera pestaa de la pgina web, se muestran los resumeshe imgenes importantes de los temas tratados en el presente trabajo.
Figura 31. Pestaa cuatro de la pgina web, en la que se encuentra los vnculos alas pginas principales donde estn los programas de simulacin y otros archivos
requeridos para las simulaciones.
En la figura 31, se encuentran los vnculos a otras pginas como CHARMM
TUTORIAL, CHARMM GUI y VMD, programas requeridos para iniciar las
simulaciones de protenas y dinmica molecular, adems, se especifica la utilidad
de cada uno de ellos.
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Figura 32. Se describen y muestran los resultados obtenidos del presente trabajo.
En la figura 32, se desarroll un resumen de los resultados obtenidos en el
presente trabajo al igual que el anlisis de cada uno de ellos.
Adems de la informacin, enlaces, resmenes y fotos, en esta pgina se puede
encontrar videos tutoriales y videos de las simulaciones desarrollados en ste
trabajo, al igual que el anlisis del papel de las molculas durante el proceso de
desdoblamiento de la protena, en la figura 33, se ve el pantallazo de la sexta
pestaa la cual contiene la informacin anteriormente mencionada.
Figura 33. Imagen de la sexta pestaa de la pgina que contiene el video y elanlisis del papel de las aguas en el proceso de desdoblamiento de la protena.
Durante la creacin de la pgina web se evidenci la importancia de resaltar los
artculos ms notables encontrados durante la investigacin, adems de permitir
su acceso por medio de vnculos que muestren los documentos y que lleven al
lector a encontrar informacin relacionada para la comprensin del mismo. Ver
figura 34.
54
-
Figura 34. Imagen de la sexta pestaa de la pgina que contiene el video y elanlisis del papel de las aguas en el proceso de desdoblamiento de la protena.
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-
7. CONCLUSIONES
Los resultados mostrados con el mtodo experimental de AFM, permite comparar
los resultados con los mtodos PNW y SMD. En AFM las extensiones de ruptura
de los enlaces de hidrgeno estn por encima de los 7 con un pico de fuerza
entre los 200 y 350pN, dependiendo de la velocidad de tirado. Es evidente que los
resultados ms cercanos al mtodo experimental son los obtenidos por el mtodo
de simulacin PNW, como se muestra, en los resultados obtenidos en este
trabajo, las diferencias son de ~300pN, pero tambin se constat que al aumentar
el tiempo de equilibrio, estos picos de fuerza disminuyen a valores similares a los
de AFM, anlogos a los obtenidos en el artculo de los doctores Pabn y Amzel
(Ibid).
Las fuertes cadas de los picos de fuerza se deben a la importancia de las
molculas de agua en el despliegue de las protenas. Cuando el donador y el
aceptor (CO y NH) de los enlaces de hidrgeno estn a una distancia mayor a los
3, una molcula de agua interrumpe el enlace, pero ste an no est roto del
todo, slo cuando una segunda molcula hace un puente entre la primera y el CO
el NH, la distancia de separacin entre el donador y el aceptor es lo
suficientemente larga (mayor a los 4) para considerar la ruptura. Este papel
desempeado por las aguas en el despliegue de protenas no es mostrado por los
mtodos SMD ni por AFM en los artculos de referencia de los doctores Lu y
Klaus, por lo tanto PNW muestra una ventaja con respecto de los anteriores,
puesto que en ninguno de ellos se especifica.
Otra ventaja de realizar el desdoblamiento de las protenas con PNW es que al
igual que las simulaciones en SMD y AFM, se evidencian los dientes de sierra que
estos dos ltimos mtodos muestran en sus resultados. De igual forma, el mtodo
PNW predice que a una temperatura mayor los enlaces de hidrgeno se rompen a
una extensin menor. En resumen, AFM muestra de forma experimental el
comportamiento de la estabilidad mecnica de una cadena de dominios de una
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protena, pero no arroja resultados de una molcula individual, para ello se puede
utilizar el mtodo SMD, en el cul se asla un dominio y se le aplica una fuerza
mecnica externa para obligar su desdoblamiento, adems se le jala con una
velocidad constante. Los productos encontrados con SMD desafortunadamente
son muy altos a los experimentales y no proporcionan mucho detalle en el
ejercicio. Por otro lado, PNW exhibe resultados similares a los experimentales,
adems, proporciona detalles de la sucesin de eventos dados en el despliegue
del dominio I27 de la titina y del papel que juegan las molculas de agua en dicho
proceso. Resultados mostrados en el artculo de los doctores Pabn y Amzel
(Ibid).
Es evidente que en el presente trabajo de grado los resultados mostrados an
estn por encima de los experimentales debido a que los tiempo de simulacin
ms largos son de slo 2ns, pero como se dijo anteriormente, si se alarga el
tiempo de equilibrio, los resultados esperados sern mucho ms cercanos a los de
AFM y tambin a los de Pabn y Amzel (Ibid).
Por otro lado, se puede concluir que en la realizacin de un trabajo de grado como
ste, las personas deben introducirse en un rea transversal como lo es la
biofsica, puesto que se deben tener bases en la qumica, biologa, por supuesto
en la fsica y adicionalmente en los sistemas de programacin. Es un trabajo
constructivo que puede llevarse al aula de clase a estudiantes de pregrado y
bachillerato, ya que es una forma de mostrar el modelo actual de las interacciones
entre muchas partculas (mostradas en el campo de fuerzas del CHARMM) y a un
nivel ms bsico es una herramienta muy llamativa para mostrar interacciones y el
modelamiento de las molculas de agua y protenas (constituyentes
fundamentales para la vida).
Finalmente, se pude concluir que este documento, junto a la pgina web creada
para el complemento pedaggico del trabajo de grado, constituyen una
herramienta a tener en cuenta para la asignatura de biofsica del pensum de la
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carrera de licenciatura en fsica, en carreras afines y en otras universidades,
puesto que no slo se abordan los temas bsicos de la biologa y la fsica, sino
tambin muestra los alcances, limitaciones, asunciones y aproximaciones que se
hacen en dinmica molecular. As mismo, se da una descripcin de los parmetros
mnimos para realizar una simulacin con el mtodo PNW. Por ltimo se debe
recordar que los temas como se abordaron en ste trabajo, son en esencia
bsicos para el conocimiento del manejo en mecnica molecular de la biofsica, ya
que la profundizacin en ellos puede constituir fcilmente otra tesis de grado. Por
lo tanto, se recomienda y se motiva al lector que quiera profundizar en el campo,
consultar las referencias bibliogrficas en el presente documento y los enlaces
referenciados en la pgina web.
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