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SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANO POR EL MÉTODO DE GELACIÓN IONOTRÓPICA COMO POTENCIAL SISTEMA DE LIBERACIÓN
CONTROLADA DE ANTIBIÓTICOS.
Rosvin E. Des Bouillons Gamboa
Tutores: Gabriela Montes de Oca, MSc Ricardo Starbird-Pérez, Dr. rer. nat
Lectores: José Roberto Vega-Baudrit, PhD Bernal Sibaja Hernández, PhD
201269016
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Rosvin E. Des Bouillons Gamboa ©
Contenido
Introducción Objetivos
Metodología Resultados & Discusión
Conclusiones Recomendaciones
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Fuente: The Royal Society & The Royal Academy of Engineering (20004)
Diseño, fabricación y uso de sistemas nanoestructurados
Nanopartículas (NP)
Nanotecnología2015 $1 Trillón Prod Global
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Watkins et al. (2015) . Int. J. Nanomedicine. 2015:10 6055–6074 doi: 10.2147/IJN.S92162
Nan
opar
tícul
as
(10-1000nm)
Chitosano (CS)
Liberación controlada de fármacos
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Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133 Taylor et al. (2015) Nature Scientific Reports. 5:10608. DOI: 10.1038/srep10608.
Brizzi, 2016 Scienza&Tecnica-ANSA
Chitosano (CS)
Desacetilación
Grado de desacetilación(%DDA)
QuitosanoQuitina
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Propiedades del CS%DDA Masa Molecular
Biodegradabilidad Mucoadhesividad
Biocompatibilidad
Baja Toxicidad
Antimicrobiano
Liberación controlada
&
Quitanasas, quitosanasas, lisozimas
6 g/kg azúcar∼
Cargas positivas Interacciones electrostáticas
No rx alérgicas/rechazo
Glicoproteínas
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Nanopartículas de CS(CSNPs)
Carga positiva
Internalizadas por tejidos y
células.
Área Superficial
50-100nm
Circulación Prolongada
Xiong et al. (2014).Advanced Drug Delivery Reviews doi:10.1016/j.addr.2014.02.002
Biodistribución
Especificidad
Ad y absorberCopyright
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8
Diagnosis y Terapia del Cáncer
saquinavir – VIH- Jurkat Linfocitos T
Ramana et al. (2014) Biochimica et Biophysica Acta 1840 (2014) 476–484 Lee et al. (2014) Nanomedicine (2014) 9(11), 1697–1713 de Campos et al. (2004) Pharmaceutical Research, 21(5)
Terapia VIH Tratamiento oftalmológico
Otras aplicaciones de las CSNPs
Conjuntiva – CSFL NP – CSFL - FMarcadores fluorescentes – NIRF
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Métodos de Síntesis de CSNPs
Entrecruzamiento por emulsión
Micelas reversasSpray-drying
Método de tamizadoCoacervación/precipitación
Gelación Ionotrópica
Solventes orgánicos
Viabilidad celular
Procesos complicados
Desestabilización del agente activo
NP de gran tamaño
Equipo
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Método de Gelación Ionotrópica
CS policatión Tripolifosfato de Sodio (TPP)
Younes & Rinaudo (2015) Mar Drugs. 13(3) 1133-1174 doi: 10.3390/md13031133
Entrecruzamiento iónico reversible
Fuerzas electrostáticas
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Método simple
No solventes orgánicos
T. ambiente
No entrecruzamiento químico
Entrecruzamiento físico reversible
Agente activo protegido
Disolución acuosa
Koukaras et al. (2012). Mol. Pharm. 9(10), 2856–2862. doi: 10.1021/mp300162j
VentajasMétodo de Gelación Ionotrópica
Relaciones CSTPP
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Sintetizar nanopartículas de quitosano utilizando el método de gelación ionotrópica por entrecruzamiento con Tripolifosfato (TPP).
Caracterizar las nanopartículas por Dispersión Dinámica de Luz (DLS), Espectroscopía Infraroja con Transformada de Fourier (FTIR), Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) y Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).
Evaluar la actividad antibacteriana in vitro, utilizando el método de la determinación de la concentración mínima inhibitoria en Escherichia coli (gram negativa) y Staphylococcus aureus (gram positiva).
Objetivo General
Sintetizar nanopartículas de quitosano por medio del método de gelación ionotrópica como sistema de liberación controlada de antibióticos
Objetivos Específicos
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Metodología
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Síntesis de CSNPs Caracterización MIC
[Se define relac. CSTPP por DLS]
FTIRTEM AFM
S. aureusE. coli
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Síntesis de CSNPs por gelación ionotrópica
-10°C
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Caracterización
Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
ZetaPotencial DHP3mL 1,5mL
5μL 1:50 Rejilla Desecador
5μL 1:50 Mica T. amb
150 kHz mica hidrofílica
modo intermitenteal aire
Rayado MH 1x 24h antes
Inóculo 2h antes Centrifugación
Pellet Dsln Salina
D.O. ideal
Ensayo resazurina
inhibición del crec.
viabilidad celular
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Resultados & Discusión
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Síntesis de CSNPs
100-300kDa %DDA 75-85%
CS
Prueba preliminar
Dsln. Opalescente
Dsln. turbia
Formación de NPs
Precipitación
Inestabilidad, floculación
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Espectroscopía Infraroja con Transformada de Fourier (FTIR)
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Interacción entre los iones fosfato (del TPP) y amonio (del CS).
FTIR
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Dispersión Dinámica de Luz (DLS)
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Stokes-Einstein
Mov. Browniano
Análisis de Fluct. De Intensidad
D
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Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP) y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)
Entrecruzamiento NH3 Libres
100-300kDa %DDA 75-85%
CS
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Cuadro 1. Distribuciones de Diámetro Hidrodinámico Promedio (DHP) y Zeta potencial (ZetaPot) determinados por DLS. (n=3)
Entrecruzamiento NH3 Libres
100-300kDa %DDA 75-85%
CS
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Distribución de DH de CSNPs
81,90% 18,30%
87,50% 10,40%
84,10% 11,8%
83,10% 16,90%
Dos Familias PdI
100-300kDa %DDA 75-85%
CS
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Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
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Vacío
Hidratación Mínima
Morfología No-esféricas
Dos poblaciones
Promedio=(65±13,77)nm
Desecación
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Vacío
Hidratación Mínima
Morfología No-esféricas
Dos poblaciones
(65±13,77)nm (194,57±9,23)nm Vs.
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Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)
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CSNPs no liof.
(102,34±17,91)nm diámetro
(10,27±2,82)nm altura
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CSNPs liof.
(557,69±178,58)nm
(12,71±4,78)nmAgregación
Centrifugación
Liofilización
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Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
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inhibición del crec. viabilidad celular
Ensayo de la Resazurina
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Columna 7
S. aureus
E. coli
Inhibición
Columna 6Inhibición
inhibición del crec. viabilidad celular
CSNPs en dsln. síntesis
A)
B)
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Modelos de interacción CSNPs - Células+ -
Fuerzas Electrostáticas
CS compite con iones Ca2+
En Membrana celular
Cambios en permeabilidad
Desbalances osmóticos
Viabilidad
salida de electrolitos intracelulares
Iones potasio, proteínas, ácidos nucleicos, glucosa y lactato
deshidrogenasa
http://bvs.sld.cu/
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Xu et al., 2015 Polymers 2015, 7(9), 1850-1870; doi:10.3390/polym7091488
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Catherine Stanley
Jeon et al., 2014 PLoS ONE 9(3): e92723. doi:10.1371/journal.pone.0092723.g003
Cadena O del LPS
Más negativa
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E. coli
inhibición del crec. viabilidad celular
NO HAY EFECTO1,38-0,25µg/mL
Crecimiento Celular
S. aureus
A)
B)
Crecimiento Celular
CSNPs proceso de liof.
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E. coli
inhibición del crec. viabilidad celular
NO HAY EFECTO22-4µg/mL
Crecimiento Celular
S. aureus
A)
B)
Crecimiento Celular
CSNPs proceso de liof.
[ 12 veces]∼
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Posibles Razones
Concentración
Kauper & Forrest (2006)
[CSNPs]
Filtrar 0,45μm y 0,22μm
35%
Valor de MIC >22μg/mL
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Posibles RazonesLiofilización
Centrifugación
Agregación del sistema
Congelamiento
DesestabilizaciónÁrea superficial
Interacción con las bact.
Con CSTPP NPs Var. 142,8%
Cristales
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inhibición del crec. viabilidad celular
Valor de MIC 100-22µg/mL
Total Inhibición550-100µg/mL
S. aureus
A)
B)
E. coli
Crecimiento Celular22-4µg/mL
Quitosano
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inhibición del crec. viabilidad celular
Valor de MIC 100-22µg/mL
Total Inhibición550-100µg/mL
S. aureus
A)
B)
E. coli
Crecimiento Celular22-4µg/mL
Quitosano
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Se logró definir la relación CSTPP 4:1 como la mejor relación valores de tamaño y ZetaPot adecuados.
Se logró caracterizar por los diferentes métodos físico químicos las CSNPs.
Se logró dar un acercamiento sobre la capacidad de inhibición de las CSNPs en solución de síntesis, pero no se logró obtener el mismo resultado luego de que las CSNPs fueron expuestas al proceso de liofilización.
Para las CSNPS 4:1 en solución de síntesis se vio una muy pequeña diferencia de inhibición entre S. aureus y E. coli, en donde S. aureus aparenta ser un poco más sensible.
Se logró acercar el rango para la determinación de la concentración mínima inhibitoria para el CS entre 100µg/mL y 22µg/mL.
ConclusionesCopyright
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Como un extra se se realizó la curva de calibración (R2=0,9965) para la ampicilina y se realizaron pruebas para la Eficiencia de Carga (EE) de las NPs con ampicilina, sin embargo se obtuvieron valores de (16,83± 2,36) por lo que se recomienda realizar más pruebas.
Evaluar la efectividad de diferentes crioconservantes como manitol, sacarosa y trehalosa para la preservación de la estabilidad de las CSNPs ante los procesos de centrifugación, congelamiento y liofilización.
Realizar ensayos comparativos entre las CSNPs, antibiótico y las CSNPs cargadas con antibiótico.
Realizar análisis por AFM, TEM y SEM de las bacterias tratadas con NPs para elucidar el mecanismo de acción de las NPs.
RecomendacionesCopyright
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Dr. José Vega-Baudrit, Lanotec, PoliUNA, CeniBiot, CeNAT, CIB, Gaby Oca, Bernal, Michael, Rey, Gaby Ávila, Laura, Daniels, MaJosé, Cano, Cristofer, Cristina,, Steph, Gia, Karen, Sebas, Mixie, Mattey, HDi, Antonio M.U., Hazel, D. Duesing,
AgradecimientosCopyright
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DIAPOSITIVAS DE APOYO
EE Ampicilina 197nm Curva calibración R2=0,9965 EE=(16,83±2,36)%
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Movimiento Browniano
Colisiones aleatorias con moléculas del
Solvente
Para NPs de mayor tamañoEl coef de Difusión es
pequeño,Se mueven más lento.
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