TEXTO TEÓRICO-PRACTICO DE BIOQUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA

Irma Peláez Garavito, Marcela Uribe Lastra, Luis Gonzaga Gutiérrez

Facultad de Ciencias Ambientales Administración Ambiental

Universidad Tecnológica de Pereira

3

TABLA DE CONTENIDO

1. Reacciones y propiedades de caracterización de aminoácidos 2. Reacciones generales de las proteínas y aislamiento de la caseína de la leche 3. Acción y especificidad de las enzimas 4. Enzimas oxidativas 5. Aislamiento del Glucógeno 6. Fotosíntesis: Reacción de Hill 7. Reconocimiento de microorganismos 8. Metabolismo aerobio y anaerobio en aguas residuales domésticas 9. Lípidos 10. Modelos de ADN 11. Visualización de ADN geonómico 12. Cultivo ¨ in vitro ¨

4

1. REACCIONES Y PROPIEDADES DE CARACTERIZACION DE AMINOACIDOS

INTRODUCCION

Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas. Se unen entre si por medio de enlaces covalentes llamados peptídicos formando diferentes tipos de proteínas, globulares o

fibrosas. Existen unos 20 aminoácidos distintos, que pueden combinarse en cualquier orden y

repetirse de cualquier manera. Una proteína media está formada por unos cien o doscientos aminoácidos alineados, lo que da lugar a un número de posibles combinaciones diferentes

realmente abrumador (en teoría 20200). Y por si esto fuera poco, según la configuración espacial tridimensional que adopte una determinada secuencia de aminoácidos, sus propiedades pueden

ser totalmente diferentes.

El componente más preciado de las proteínas es el nitrógeno que contienen. Con él, podemos

reponer las pérdidas obligadas que sufrimos a través de las heces y la orina. El ser humano necesita un total de veinte aminoácidos, de los cuales, nueve no es capaz de sintetizar por sí

mismo y deben ser aportados por la dieta. Estos nueve son los denominados aminoácidos esenciales, y si falta uno solo de ellos no será posible sintetizar ninguna de las proteínas en la

que sea requerido dicho aminoácido. Esto puede dar lugar a diferentes tipos de desnutrición,

según cual sea el aminoácido limitante. Los aminoácidos esenciales más problemáticos son el triptófano, la lisina y la metionina.

Las reacciones que se utilizan para caracterizar los aminoácidos y las proteínas se resumen en la

siguiente tabla:

REACCION AMINOACIDO REACTIVO COLORACION

Ninhidrina Aminoácidos Púrpura

Millon Hidroxibenceno Roja

Xantoprotéica Aminoácidos aromáticos Roja

Acido glioxílico Triptófano Anillo violeta en interfase

Ehrlich Indoles, aminas aromáticas, compuestos uréicos

Variable

Nitroprusiato Aminoácidos con grupos tioles (R-SH) Roja

Sakaguchi Grupos guanidinos (Arginina) Roja

Biuret Urea, pépidos y proteínas Azul

En la actualidad, la síntesis protéica in vitro permite a los investigadores cambiar ciertos aminoácidos específicos de las proteínas para hacerlas por ej, más alimenticias, o en otros casos,

como en el de las enzimas, par hacerlas más eficientes en ciertas reacciones metabólicas y en procesos de descontaminación del medio ambiente.

OBJETIVOS

Caracterizar aminoácidos mediante reacciones de coloración típicas de los mismos.

5

MATERIALES

Tubos de ensayo

Gradillas Pipetas de 10 ml

Vaso de precipitado

Solución de clara de huevo Acido nítrico concentrado (HNO3)

NaOH al 40% Nitrato de sodio al 1% y al 0.5% (NaNO2)

Fenol

Acido acético glacial Acido sulfúrico concentrado (H2SO4)

Reactivo de Millon (sulfato mercúrico en

H2SO4) Acido sulfanílico al 5% en HCl al 2%

NH4OH al 10% Aminoácidos de referencia

PROCEDIMIENTO

Reacción Xantoprotéica: Agregue a 5 tubos de ensayo los siguientes reactivos:

Tubo 1: 0.5 ml de Glicina + 0.5 ml de ácido nítrico Tubo 2: 0.5 ml de Tirosina + 0.5 ml de ácido nítrico

Tubo 3: 0.5 ml de Triptófano + 0.5 ml de ácido nítrico Tubo 4: 0.5 ml de Fenilalanina +0.5 ml de ácido nítrico

Tubo 5: 0.5 ml de Albúmina + 0.5 ml de ácido nítrico

Caliente los tubos moderadamente, deje enfriar y verifique el cambio de color. Agregue 5 ml de

NaOH al 40%.

Repita este mismo procedimiento pero remplazando el ácido nítrico por fenol.

Reacción de Millon: Agregue a 4 tubos de ensayo los siguientes reactivos:

Tubo 1: 1 ml de Glicina + 5 gotas de reactivo millon

Tubo 2: 1 ml de Tirosina + 5 gotas de reactivo millon

Tubo 3: 1 ml de Fenilalanina + 5 gotas de reactivo millon Tubo 4: 1 ml de albúmina + 5 gotas de reactivo millon

Caliente los tubos a baño María durante 10 min y verifique el cambio de color. Enfrie los tubos a

chorro y agregue a cada uno 5 gotas de Nitrato de Na al 1%. Anote cualquier cambio en la coloración.

Reacción del Acido Glioxílico: Agregue a 4 tubos de ensayo los siguientes reactivos:

Tubo 1: 1 ml de Glicina + 2 ml de ácido acético glacial Tubo 2: 1 ml de Tirosina + 2 ml de ácido acético glacial

Tubo 3: 1 ml de Triptófano + 2 ml de ácido acético glacial Tubo 4: 1 ml de albúmina + 2 ml de ácido acético glacial

6

Agite cuidadosamente los tubos y deje reposar durante 5 min. Enseguida, agregue a cada tubo

1ml de H2SO4 y verifique la formación de un anillo violeta en la interfase.

Reacción de Erlich:

Agregar a 4 tubos de ensayo 1ml de ácido sulfanílico y 1ml de NaNO2 al 0.5%. Deje la mezcla en

reposo durante 15 min y luego agregue al:

Tubo 1: 1ml de glicina Tubo 2: 1 ml de triptófano

Tubo 3: 1ml de hidroxiprolina Tubo 4: 1 ml de albúmina

A continuación agregue a cada tubo 5 gotas de NH4OH al 10% (1ml) y verifique el cambio de color.

CUESTIONARIO

1. Investigue la estructura de los siguientes aminoácidos: glicina, tirosina, triptófano y fenilalanina. Cuales de estos constan de un grupo bencénico?

2. ¿Qué relación existe entre aminoácido, péptido y proteína?

3. ¿Qué aminoácidos contiene la albúmina de huevo?

4. Investigue cuales son los mecanismos de las reacciones xantoproteica, Ehrlich y la del ácido glioxílico

5. ¿De que sustancias esta compuesto el reactivo de Millon?

7

2. REACCIONES GENERALES DE LAS PROTEINAS Y AISLAMIENTO DE LA CASEINA

DE LA LECHE

INTRODUCCION

Las proteínas son moléculas que desempeñan un gran número de funciones en las células de todos los seres vivos, pues por un lado forman la estructura básica de los tejidos, y por otro,

desempeñan funciones metabólicas y reguladoras, como es el caso de las enzimas. Dada la creciente preocupación por el deterioro de los recursos naturales y el efecto adverso sobre el

medio ambiente, las enzimas han ganado interés, pues gracias a ellas es posible degradar

contaminantes, y por lo tanto son la base de procesos hoy en día muy utilizados, como es la biorremediación, entre otros. En este orden de ideas, antes de comprender el funcionamiento de

las enzimas, debemos tener claras las propiedades de las proteínas.

En el trabajo en Bioquímica, la precipitación y purificación de proteínas es una actividad usual se

basa en un principio muy simple.

En términos generales, cualquier factor físico o químico que modifique la interacción con el disolvente de la proteína, disminuirá su estabilidad en disolución y provocará su precipitación.

Así, la precipitación total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas o la ruptura de puentes de hidrógeno facilitará la agregación molecular y provocará la precipitación.

Esta precipitación suele ser consecuencia de un fenómeno llamado desnaturalización mediante el cual la proteína pierde su estructura de orden superior (secundaria, terciaria, cuaternaria)

quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero sin ninguna estructura tridimensional.

Para fines de esta práctica se precipitarán por agentes químicos y/o físicos la albúmina, de la

clara de huevo, y la caseína de la leche.

La caseína está presente en una concentración de aproximadamente 35g/l y no es un compuesto simple sino una fosfoproteina que resulta de la mezcla heterogénea de sus componentes

proteicos.

Las proteínas son solubles principalmente por los residuos de aminoácidos polares cargados que

establecen interacciones con el agua. Cualquier agente que rompa estas interacciones proteína/agua disminuirá la solubilidad de la proteína y precipitará. Un cambio en el pH de la

solución altera el estado iónico de la proteína pudiendo llevarla a un estado neutral (punto isoeléctrico) en el que la carga de la proteína es neutra y la solubilidad es mínima. Las moléculas

de proteína neutras no se repelen eléctricamente y tienen a agregarse precipitando.

Teniendo en cuenta este principio, es posible separar la caseína ajustando el pH de la leche a

4.8, su punto isoeléctrico. La caseína es también insoluble en alcohol lo cual permite remover grasa de las preparaciones.

OBJETIVOS

1. Conocer el método para la extracción cuantitativa de la caseína.

2. Reconocer algunas de las propiedades de las proteínas.

8

3. Caracterizar las proteínas mediante reacciones específicas de coloración y calentamiento.

MATERIALES

Leche pHmetro

Vasos de precipados de 100 ml Vaso de precipitado de 250 ml

Amortigador de acetato de sodio (0.2 ml/l, pH 4.6)

Etanol (95%)

Estufas y mallas de asbesto Eter o cloroformo (inflamable)

Agua destilado Termómetro de 0 a 100ºC

Embudo de Buchner

Papel filtro

Bomba de vacío Clara de huevo

Agua destilada Formaldehído

Acido sulfúrico concentrado Acido acético diluido

Etanol al 95%

Tubos de ensayo Gradilla

Pinza para tubo de ensayo Vaso de precipitado de 250 ml

Plancha de calentamiento

METODOLOGIA

Aislamiento de la caseína de la leche:

En un vaso de precipitados de 100 ml vierta 25 ml de leche entera y caliéntela a 40ºC.

Aparte, caliente también 25 ml de solución amortiguadora de Acetato de Sodio.

Agregue los 25 ml de Acetato de Sodio a los 25 ml de leche agitando lentamente. Verifique el pH

de la solución con el pHmetro, su valor debe ser de aproximadamente de 4.8.

Deje reposar la mezcla anterior durante 5 min antes de filtrarla por medio de la muselina.

Para realizar la filtración, ponga muselina sobre la soba de un beacker y comience a agregar la

mezcla lentamente. Simultáneamente se debe ir lavando el precipitado con agua destilada.

Recupere el precipitado, el cual se encuentra sobre la muselina, y suspéndalo ahora en 10 ml de etanol en otro beacker.

La suspensión obtenida debe ser filtrada en el embudo de Buchner. Para esto es indispensable que antes de acercarse al embudo tenga ya mezclados 5 ml de éter con 5 ml de etanol, y que

tenga aparte otros 12 ml de éter. Tanto el éter como el etanol serán utilizados para lavar la suspensión.

Durante la filtración, lave primero con la mezcla de éter-etanol, y luego con el éter solo. Después de este lavado secar al vacío y con una espátula recoja el precipitado y póngalo sobre un vidrio

de reloj. El éter se evaporará.

El peso de caseína recuperada será publicado por el monitor en la puerta del laboratorio. Este dato debe usarse para calcular el porcentaje de recuperación de proteína. Es indispensable

9

anotar el número del vidrio de reloj que le fue entregado para que luego pueda sacar de la lista

el peso de su proteína.

Reacción coloreada del formaldehído para proteínas: Prepare una solución (1:4) de clara de huevo diluida en agua destilada.

En un tubo de ensayo ponga 2 ml de solución de clara de huevo y agregue 1 gota (0.5ml) de formaldehído.

Enseguida, agregue por las paredes del tubo 1ml de Acido Sulfúrico concentrado (H2SO4).

Coagulación por calentamiento: Prepare una solución (1:4) de clara de huevo diluida en agua destilada.

En un tubo de ensayo ponga 2 ml de solución de clara de huevo y agregue dos gotas de ácido acético diluido (1ml).

Sumerja el tubo de ensayo en un baño maría hasta observar algún cambio.

Retire el tubo de ensayo, déjelo enfriar y anote las observaciones.

Repetir este mismo procedimiento pero utilizando triptófano en vez de albúmina. Coagulación por acción del alcohol: Transferir aproximadamente 1ml de clara de huevo a un tubo de ensayo y adicione 3.5 ml de etanol al 95%.

Anote sus observaciones.

CUESTIONARIO

1. Qué función cumple el buffer o amortiguador de Acetato de Sodio?

2. Qué metodología se podría emplear para extraer proteína de tejidos?

3. Qué propiedades de las proteínas se pueden verificar a partir de esta práctica?

4. Aparte de la caseína que otras proteínas tiene la leche?

5. Qué relación podría tener esta práctica con el impacto ambiental?

10

3. ACCIÓN Y ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

INTRODUCCION

Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran las reacciones metabólicas de los seres vivos. Resulta, por lo menos en lo que concierne su parte proteica, de una síntesis proteica a

nivel celular. Existe al menos una enzima diferente por reacción catalizada, lo que representa miles de enzimas en un mismo organismo. Las hay extracelulares e intracelulares.

Desde el punto de vista ambiental, la capacidad de ciertos microorganismos para degradar y metabolizar compuestos orgánicos contaminantes, de absorber compuestos inorgánicos, de

inmovilizar o inactivar sustancias tóxicas, es dada por sus enzimas. De ahí su importancia desde el punto de vista ambiental y su importante aporte a la biotecnología. Por otro lado, no se puede

olvidar su función en la fotosíntesis, la cual nos proporciona la atmósfera con oxígeno que

necesitamos la mayoría de los seres vivientes.

En cuanto a la catálisis enzimática, esta se da por la formación de un sitio activo. Este sitio es una región privilegiada que interactúa con substratos que a su vez se transforman en productos.

El sitio activo está constituido por aminoácidos de 4 tipos: de contacto, auxiliares, colaboradores y no colaboradores. Son los grupos funcionales radicales de los aminoácidos los que intervienen

directamente en la catálisis. Su participación se debe a su capacidad para transferir electrones

(carácter nucleofílico) y protones (carácter ácido-básico).

La estructura terciaria es primordial para la catálisis. Permite la formación del sitio activo ya que aproxima los aminoácidos que lo constituyen. Esta conformación juega a la vez un rol importante

en la protección del sitio activo, y se adapta con exactitud al substrato.

11

La reacción enzimática in vivo o in Vitro puede inhibirse utilizando inhibidores que pueden ser o

no ser análogos estructurales de los verdaderos substratos de la enzima. De acuerdo a la complejidad de los complejos que forman en presencia de la enzima y/o del substrato, y de la

modificación cinética que generen, los inhibidores son calificados como competitivos, incompetitivos, no competitivos o mixtos. En presencia de una enzima (E) y su sustrato (S), un

inhibidor (I) puede formar complejos binarios complejos EI o ternarios ESI. Solo el complejo ES

es productivo.

Cuando el inhibidor se fija a la enzima libre formando el complejo EI se habla de inhibición competitiva. Cuando se fija sobre el complejo ES es incompetitivo. Cuando se fija con afinidades

diferentes a E y a ES es mixto y cuando lo hace con la misma afinidad por ambos es no competitivo.

, ,

OBJETIVOS

Observar la acción de las enzimas y evidenciar el efecto que sobre ellas tienen el calor y los

metales pesados.

Realizar una comparación entre una enzima y un catalizador inorgánico y demostrar la

especificidad de una enzima.

MATERIALES

Papa

Mortero Vaso de precipitado

Tubos de ensayo Gradilla

Mucelina

Agua destilada

Solución de catecol al 0.1%

Nitrato de plata (AgNO3) Acido ascórbico

Fenol (0.1%) Plancha de calentamiento

12

METODOLOGIA

Acción de la catecolasa: Preparar un extracto de papa. Para esto, en primer lugar lave y pele la papa, luego córtela en

cuadritos y pese 7 gramos.

A continuación macérela en el mortero con 40 ml de agua que se pueden ir añadiendo poco a poco.

Enseguida, filtre el extracto de papa obtenido utilizando muselina.

Enumere 6 tubos de ensayo y adicione las siguientes diluciones a cada tubo siguiendo estrictamente el orden:

Tubo 1: 5ml de agua + 5ml de solución de catecol. Tubo 2: 5ml de agua + 5ml de extracto de papa.

Tubo 3: 5ml de extracto de papa + 5ml de solución de catecol. Tubo 4: 5ml de extracto de papa hervido + 5ml de solución de catecol.

Tubo 5: 5ml de extracto de papa + 10 gotas (5ml) de Nitrato de plata (AgNO3) + 5ml de solución de catecol.

Tubo 6: 5ml de extracto de papa + 10 gotas de ácido ascórbico (5ml) + 5 ml de solución de

catecol.

Anote sus observaciones y no descarte el tubo 3 ya que servirá para comparar con el tubo del procedimiento siguiente.

Especificidad del sustrato

En un tubo de ensayo agregue 5ml de extracto de papa y 5ml de fenol al 0.1%. Agite, observe y compare con el tubo número 3 del experimento anterior.

Comparación de una enzima y un catalizador inorgánico

Con este experimento se comprobará la actividad de la enzima respecto al bióxido de manganeso, un catalizador inorgánico, sobre un sustrato, en este caso el agua oxigenada (H2O2).

Tenga en cuenta la siguiente reacción:

catalizador 2 H2O2 2H2O + O2

Enumere 6 tubos de ensayo proceda de la siguiente manera:

Tubo 1: porción pequeña de papa + 3ml de agua.

13

Tubo 2: porción pequeña de papa + 3ml de agua. Caliente durante 10 minutos a baño María y

enfriar a chorro. Tubo 3: porción pequeña de papa + 5 gotas (2.5ml) de bicloruro de mercurio (HgCl2).

Tubo 4: 3ml de agua + 0.5 gramos de dióxido de manganeso (MnO2). Tubo 5: 3ml de agua + 0.5 gramos de dióxido de manganeso (MnO2). Caliente durante 10

minutos a baño María y enfriar a chorro.

Tubo 6: 3ml de agua + 0.5 gramos de dióxido de manganeso (MnO2) + 5 gotas de bicloruro de mercurio (HgCl2).

Una vez estén todos los tubos listos, adicione 10 gotas (5ml) de peróxido de hidrógeno (H2O2) a

cada tubo. Anote sus observaciones teniendo en cuenta la cantidad de burbujas producidas. Proponemos la siguiente escala de grado:

Ausencia de burbujas: - Producción escasa de burbujas: +

Producción mediana de burbujas: ++ Producción abundante de burbujas: +++

CUESTIONARIO

Acción de la catecolasa: 1. ¿Cual es el efecto del ácido ascórbico sobre la catecolasa? Compárelo con el jugo de limón.

2. ¿Prediga la reacción que ocurre cuando la solución de catecol y el agua son mezclados? Y explique

3. Investigue la estructura química del catecol y del fenol e indique sus diferencias

4. ¿Es la especificidad de una enzima absoluta o relativa?

5. ¿Por qué los venenos como el bicloruro de mercurio son tóxicos para los seres vivientes?

6. ¿Cual es la evidencia de que la papa posee una enzima llamada catalasa?

7. ¿Qué acelera el rompimiento del peróxido de hidrógeno (H2O2)?

IMPORTANTE !

Para este laboratorio es indispensable que cada grupo traiga una papa y un cuchillo o bisturí.

14

4. ENZIMAS OXIDATIVAS

INTRODUCCION

Dentro del mundo de las enzimas, las oxidasas reciben este nombre por su capacidad de oxidar. Hoy en día, la enzima más conocida y utilizada en los laboratorios por su acción oxidativa es la

peroxidasa, y una de sus fuentes comunes es la raíz de rábano. Esta enzima descompone entonces peróxidos, derivados tóxicos del O2 como el H2O2 o peróxido de hidrógeno. Al tener un

grupo Hemo (hierro ionizado y capaz de unirse al hidrógeno) su acción se encuentra ligada a la

química del oxígeno y sus derivados.

La catalasa también forma parte de las enzimas oxidativas, y su uso también es amplio debido a que es una enzima que se encuentra tanto en tejidos vegetales (patata, zanahoria, lechuga, etc.)

como en tejidos animales (carne, pescado, etc.) produciendo la siguiente reacción química:

catalasa 2 H2O2 2H2O + O2

Es decir, la enzima descompone el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada en agua y oxígeno gaseoso, que se desprenderá en forma de burbujas en un medio acuoso.

Ya que la catalasa es una proteína, si es sometida a algún procedimiento que lleve a su

desnaturalización, como la exposición a altas temperaturas, perderá su estructura terciaria,

perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada y no se observará ningún tipo de reacción.

OBJETIVOS

Cuantificar la producción de oxígeno desprendido por la acción de las catalasas.

Demostrar la presencia y definir el modo de acción de otros sistemas enzimáticos tales como

polifenoloxidasas y deshidrogenasas.

MATERIALES

Tubos de ensayo de 180x20

Tubos de ensayo de 160x18 Trozos de manguera plástica

Tapones perforados de caucho Jeringas de 1 ml

Pipetas graduadas de 1 y 2 ml Cuchillo

Rallador

Frascos grandes con tapa Gradillas

Papel de aluminio

Cajas de Petri

Vasos de precipitado de 100 ml Plancha de calentamiento

Peróxido de hidrógeno 20% Azul de metileno 0.025%

Guayacol 3% Metabisulfito de sodio 1%

Papas

Manzanas Rábanos

15

METODOLOGIA

Cuantificación de la producción de oxígeno por la actividad de las catalasas:

Pele una papa y ráyela y ponga aproximadamente 2 gramos de rallado en el tubo de ensayo del

montaje (ver esquema). Asegúrese de tapar bien el tubo con el tapón perforado.

Con una jeringa vacía verifique si el montaje está correctamente hecho. Para esto, al subir y bajar el émbolo de la jeringa, el rojo neutro se mueve hacia atrás y hacia adelante. Asegúrese de

que la pipeta quede horizontal a la mesa de trabajo.

Una vez verificado el buen funcionamiento del sistema, tome con la jeringa 0.5ml de H2O2 y

agréguelos a la papa atravesando el tapón perforado con la aguja.

La gota de rojo neutro comenzará a moverse. Simultáneamente se debe sostener un frasco al final de la pipeta para recoger la gota de rojo neutro. Este colorante mancha.

Anote el volumen desplazado por la gota en relación al tiempo transcurrido y grafique. Dado que la gota se desplaza rápidamente, se recomienda que un estudiante lea el volumen recorrido, otro

tome el tiempo y otro tome nota de lo sucedido.

Repita este mismo procedimiento pero utilizando un trozo de papa hervida. En este caso, no es necesario hacer un rallado.

Jeringa Gota de rojo neutro

Tapón perforado Pipeta

Papa

Acción de las deshidrogenasas:

Corte unos 4 trozos de papa cruda, previamente lavada y pelada, de aproximadamente 5cm, y

sumérjalos en un tubo de ensayo con azul de metileno. Es indispensable que el tubo quede completamente lleno por el colorante, sin aire. Cubra el tubo de la luz utilizando papel aluminio y

déjelo por 24 horas. Transcurrido este tiempo saque los trozos de papa y verifique el cambio de color al aire.

Simultáneamente, repita el procedimiento anterior pero utilizando trozos de papa hervida.

16

Acción de las polifenol-oxidasas: Corte 12 tiras delgadas de manzana y rábano de aproximadamente 5cm, raspando los bordes

para destruir células del tejido. A continuación, hierva la mitad de los trozos de manzana y rábano.

Sobre una caja de Petri ponga 2 trozos de manzana y rábano sin hervir, y sobre otra ponga 2 trozos de cada uno pero hervidos.

Enseguida, sumerja 2 trozos de manzana y rábano sin hervir en un tubo de ensayo con solución

de metabisulfito sódico. Haga lo mismo con 2 trozos de manzana y rábano hervidos.

Para finalizar, ponga los 2 trozos de manzana y rábano restantes en un tubo, y agregue guayacol

(sustrato oxidable) hasta cubrirlos. Haga lo mismo con 2 trozos de manzana y rábano hervidos.

CUESTIONARIO

Pardeamiento enzimático

Cuantificación de la producción de oxígeno:

1. Diseñe una tabla para anotar los resultados del experimento para cuantificar oxígeno.

2. Compare los resultados en la producción de O2 de ambos tubos y explique las diferencias.

3. Observe lo que ocurre en cada uno de los tubos y anote.

4. Cómo podría determinar qué gas se está formando?

Acción de las deshidrogenasas: 1. Averigüe qué reacción ocurre en el tejido con el azul de metileno.

Acción de las polifenol-oxidasas:

1. Elabore un cuadro para consignar cada uno de los tratamientos para el material crudo y hervido, anotando el desarrollo de los cambios.

2. Qué efecto tiene el metabisulfito sódico?

3. ¿Qué es el pardeamiento enzimático?

4. Es posible encontrar diferencias entre el material crudo y hervido. Explique

5. Cual es la función del guayacol? Averigüe su fórmula estructural.

6. La manzana pelada se vuelve café después de un tiempo. Por qué no ocurre lo mismo con la

manzana con su cáscara intacta?

17

5. AISLAMIENTO DEL GLUCOGENO

INTRODUCCION

La gluconeogénesis se define como la biosíntesis de hidratos de carbono a partir de precursores de tres y cuatro carbonos, que generalmente no tienen naturaleza de hidratos de carbono. Esta

biosíntesis es importante para la dieta, pues los hidratos de carbono son la principal fuente de energía para el organismo, y tienen la ventaja de obtenerse con facilidad y de digerirse con

mayor facilidad que los demás nutrientes.

Los hidratos de carbono representan compuestos orgánicos sintetizados por las plantas con la

ayuda de la luz solar, el agua y el bióxido de carbono, es decir por medio de la fotosíntesis. En éste proceso, las hojas verdes captan la luz solar y recogen bióxido de carbono del aire y agua

de la tierra, combinándose todo esto con la clorofila (pigmento verde de las plantas), para así producir algún tipo de carbohidrato y liberar oxígeno hacia el aire.

Desde el punto de vista químico, los hidratos de carbono se pueden definir como compuestos constituidos por elementos orgánicos, a saber: carbono (C), hidrógeno (H2) y Oxígeno (O2).

Normalmente la vía gluconeogénica tiene su inicio con la formación de piruvato, en el compartimiento mitocondrial, y su final con la formación de glucosa, en el citosol. La

gluconeogénesis debe considerarse como una vía energética ascendente, a la que se debe

aportar energía para sintetizar glucosa.

Por otro lado, los hidratos de carbono adquiridos mediante la dieta se almacenan eventualmente en el organismo en la forma de glucógeno. Los lugares principales destinados para las reservas

de glucógeno en el cuerpo son el hígado y los músculos esqueléticos. Estos almacenes son de

vital importancia en la prevención de afecciones a nivel celular. El glucógeno protege las células de deficiencias en el metabolismo y de lesiones. Las reservas de glucógeno (particularmente el

glucógeno hepático) nos permiten comer intermitentemente al proveer fuentes inmediatas de glucosa sanguínea (entre las comidas) para su uso como combustible metabólico. Durante el

ayuno nocturno, el glucógeno hepático también provee la glucosa que el cuerpo necesita. Las

reservas del glucógeno hepático son solamente adecuadas por aproximadamente 12 horas o menos sin depender de las vía gluconeogénicas (síntesis de glucógeno a partir de precursores

que no son hidratos de carbono).

OBJETIVOS

Demostrar la presencia de glucógeno en el hígado como fuente almacenada de glucosa.

Cuantificar la cantidad de glucógeno presente en la muestra.

Conocer uno de los métodos para la extracción de polisacáridos.

MATERIALES

Hígado de res o de cerdo (12g)

Acido tricloroacético al 5 y al 10 %

Etanol absoluto Etanol al 95%

Cloruro de sodio

18

PROCEDIMIENTO

Se debe mantener conservado el hígado todo el tiempo en hielo. Pese aproximadamente 12 gramos los cuales se cortan en trozos y de maceran en un mortero previamente enfriado

durante 10 min aproximadamente. La maceración se realiza con 12 ml de ácido tricloroacético al

10 %. Todo el tiempo el mortero debe permanecer en un baño de hielo. Evite que salte ácido tricloroacético a sus manos. Al final de la maceración agregue 15 ml de ácido tricloroacético

lavando bien las paredes del mortero.

Ponga el homogenizado en 2 tubos de centrífuga, teniendo en cuenta que el volumen de ambos sea el mismo, de tal manera que la centrífuga no se desequilibre durante el proceso. La

centrifugación debe hacerse durante 5 min a 4000 rpm. Decante el sobrenadante, el cual es un

líquido opalescente, en una probeta de 100ml, anote el volumen. Añada el doble de este volumen en etanol al 95%. Agite esta mezcla y luego déjela en reposo durante 5 min hasta que

aparezca un precipitado. En caso de que no aparezca agregue un poco de cloruro de sodio y caliente suavemente en un baño María hasta la obtención del mismo.

Recoja el precipitado en 2 tubos de centrífuga y centrifugue durante 3 min a 8000 rpm. Descarte el sobrenadante y conserve el precipitado al fondo de los tubos.

A uno de los tubos agréguele 2.5 ml de agua destilada y con un asa raspe el precipitado de

glucógeno para diluirlo. Enseguida, tome el contenido de este tubo y páselo al otro tubo.

Adicione 5ml de etanol al 95% y centrifugue durante 5 min a 8000 rpm. Descarte el

sobrenadante y lave el precipitado con 1ml de etanol al 95% y 1ml de éter etílico dispersando con una varilla de vidrio.

Con la ayuda de un asa, extienda el precipitado en un vidrio de reloj y pesarlo. Calcule el

rendimiento total del glucógeno (gramos de glucógeno/100 gramos de tejido fresco).

CUESTIONARIO

1. ¿Qué factores pueden influir sobre el porcentaje de glucógeno en el hígado de res o de cerdo?

2. ¿Por qué es necesario lavar la preparación de glucógeno con alcohol y éter?

3. ¿Por qué son importantes el tiempo y la temperatura en las etapas iniciales de aislamiento y no en las finales?

4. ¿Cual es la estructura de la glucosa? Y la del glucógeno?

5. ¿Qué función cumple el glucógeno en los seres vivos?

6. ¿Qué es centrifugación?. ¿Para que se centrifuga en esta practica?

7. En los mamíferos que porcentaje del peso del hígado es glucógeno?

19

6. FOTOSINTESIS: REACCION DE HILL

La fotosíntesis es un proceso metabólico que realizan las plantas, las cianobacterias y algunos

protistas. En los organismos eucariotes se realiza en los cloroplastos. La reacción general de la

fotosíntesis es la siguiente:

Energía solar + 6 H2O + 6 CO2 → C6H12O6 + 6 O2 + Energía

La fotosíntesis no es un proceso simple y consta de múltiples etapas. Las primeras etapas se conocen como Reacciones lumínicas y se encargan de convertir la energía solar en energía

química produciendo oxígeno, como producto de desecho. Se dan en las membranas de los

tilacoides. Las segundas reacciones se conocen como Ciclo de Calvin (o reacciones de oscuridad) y producen moléculas de azúcar utilizando el CO2 y los productos de alto contenido

energético de las reacciones luminosas. Se llevan a cabo en el estroma. De acuerdo al dibujo anterior, la energía luminosa se utiliza para:

1) Fabricar ATP a partir de ADP y P.

2) Impulsar la transferencia de electrones (e-) desde el H2O a la molécula de NADP 3) formando NADPH. El H2O se rompe (se oxida) liberando oxígeno.

Este rompimiento de la molécula de H2O se conocer como Reacción de Hill y puede ejemplificarse

mediante la siguiente reacción:

A + H2O H2A + ½ O2

En la reacción, A es el aceptor de electrones, es decir la molécula de NADP. Durante esta práctica

se utilizará un aceptor artificial, el colorante 2,6 diclorofenol inodefenol, el cual es reducido:

Colorante + H2O colorante -H2 + ½ O2

Azul incoloro

Por otro lado, en el Ciclo de Calvin, el carbono del dióxido de carbono se fija en compuestos orgánicos y las enzimas fabrican carbohidratos (principalmente glucosa).

Desde el punto de vista ambiental, el proceso de fotosíntesis es seguramente el proceso bioquímico más importante de la biosfera por varios motivos, tales como:

1. La síntesis de materia orgánica a partir de la inorgánica permite el comienzo de múltiples

cadenas tróficas.

2. Libera oxígeno, fundamental para la supervivencia de todos los seres aeróbicos.

20

3. De ella depende la energía almacenada en los combustibles fósiles, como carbón,

petróleo y gas natural.

OBJETIVOS

Verificar la capacidad de los cloroplastos aislados de llevar a cabo el proceso de fotosíntesis.

Aprender a cuantificar la concentración de clorofila por medio de la espectrofotometría.

MATERIALES

Hojas verdes frescas de espinaca Cloruro de Sodio 0.35 M

Acetona

Buffer de fosfato 0.1M, pH:6.5 Solución colorante de diclorofenol indofenol,

1.2x10-4 M Agua destilada

Gasa Mortero

Baño de agua fría

Centrífuga Lámpara

Espectrofotómetro

Pipetas Vaso de precipitado

Tubos de ensayo Papel de aluminio

Muselina

PROCEDIMIENTO

Preparación de la solución de cloroplastos:

Tome 4 gramos de espinaca, retire las venas y pese unos 4 gramos. Macérelos con 10 ml de NaCl 0.35 M. Esto debe hacerse manteniendo el mortero en hielo. A continuación, filtre en un

vaso de precipitado. Ponga el extracto filtrado en un tubo de ensayo y centrifugue a 4000 rpm durante 5 min. En la fase superior quedarán los cloroplastos.

Tome la solución de cloroplastos y pásela a otro tubo de ensayo. Centrifugue nuevamente a 4000 rpm durante 5 min. Esta vez, los cloroplastos estarán al fondo del tubo. Descarte los desechos

teniendo cuidado de no botar los cloroplasto, y agregue a estos últimos 5 ml de NaCl 0.35 M y frío. Agite la mezcla. Cubra el tubo con papel aluminio y consérvelo en un baño frío.

Reacción de Hill:

Tome dos tubos de ensayo y ponga en cada uno 1 ml de suspensión de cloroplastos y adicione: 2ml de Buffer 0.1M, 2ml de solución colorante, 6ml de agua destilada.

Cubra con papel aluminio uno de los tubos, el otro, expóngalo a la luz durante 10 min.

Transcurrido este tiempo, obsérvelos contra un fondo blanco y compárelos.

Cuantificación de clorofila: Tome 1ml de solución de cloroplastos, póngala en un tubo de ensayo, y adiciónele 8 ml de

acetona. Mezcle y agregue enseguida 1ml de agua destilada. Centrifugue a 4000 rpm por 15 min

21

y ponga el sobrenadante en la celda del espectrofotómetro. Lea la absorbancia en el

espectrofotómetro a 650 nm. Para esto, utilice como blanco agua destilada.

Calcule la cantidad total de clorofila en 1ml de suspensión utilizando la siguiente fórmula:

mg Clorofila/ml = Aborbancia x 10 / 34.5

Observación de cloroplastos: Sobre una placa ponga una gota de solución de cloroplastos, cubra con una laminilla y observe al

microscopio.

Dibuje lo observado identificando estructuras del cloroplasto si es posible.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué el procedimiento de aislamiento de los cloroplastos debe llevarse a cabo en frío?

2. ¿La solución de cloruro de sodio 0.35M es una solución hipotónica ¿Qué significa esto y que

relación tiene con la práctica?

3. ¿En que consiste la reacción de Hill?

4. ¿Qué función cumple el buffer de fosfato 0.1M, pH: 6.5?

5. ¿Con que fin se adiciona el colorante diclorofenol indofenol?

6. ¿Qué es un espectrofotómetro?

7. Dibuje un cloroplasto

IMPORTANTE !

Para esta práctica cada grupo debe traer espinaca fresca.

22

7. RECONOCIMIENTO DE MICROORGANISMOS

INTRODUCCION

Los microorganismos son organismos dotados de individualidad que a diferencia de kas plantas y

animales presentan una organización biológica elemental. En su mayoría son unicelulares. Dentro de los microorganismos se encuentran organismos unicelulares procariotas como las bacterias, y

eucariotas como los protozoos, una parte de las algas y los hongos, e incluso los organismos de tamaño ultramicroscópico como los virus.

El conjunto de procesos mediante los cuales un organismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse se denomina metabolismo microbiano. Los organismos utilizan

numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies pueden distinguirse con base a estas estrategias.

Algunos ejemplos son:

Grupo Género Importancia

Indicadores Escherichia, Enterobacter, Streptococcus, Clostridium

Se les utiliza como indicadores de contaminación de una fuente de agua,

por contacto con heces humana

Nitrificadores Nitrobacter, Nitrosomonas Oxidan compuestos inorgánicos de nitrógeno

Denitrificadores Basillus, pseudomonas Reducen nitritos y nitratos a nitrógeno molecular gaseoso o a óxido nitroso

gaseoso

Bacterias degradadoras

Methanobacterium, Methanococcus,

Methanosarcina

Productores abaerobios de metano a partir de ácidos grasos.

Pseudomonas, Degradación de compuestos orgánicos

Flavobacterium, Degradación de poteínas

Zooglena, Formación de flóculos en lodos

activados

Clostridium Productor anaeróbio de ácidos grasos

Bactérias Del azufre Thiobacillus, Desulfovivrio Oxidación y reducción de azúfre y

hierro

Bacterias fotosintéticas

Chlorobium, Rhodospirillum Reducen sulfuros a azufre elemental

OBJETIVOS

1. Identificar microorganimos y sus estructuras más relevantes.

2. Clasificar microorganismos según su metabolismo y funciones ambientales.

3. Reconocer la importancia del metabolismo microbiano en procesos de desconatmninación.

23

MATERIALES

Placas microscópicas de:

Escherichia coli, Spirillum, Methanobacterium, Thiocystis, Anabaena, Spirulina, Diatomeas,

Rotíferos.

PROCEDIMIENTO

Observe las placas al microscopio y haga los dibujos correspondientes. Haga una revisión

bibliográfica sobre la importancia ecológica de estos microorganismos en la naturaleza.

Seleccione la información, nos interesa la que puede aportar al medio ambiente.

Por favor no vaya a cambiar el objetivo del microscopio, ni a mover el tornillo macrométrico de este. Estas placas no sólo han sido traídas desde el exterior sino que ha sido muy costosa su

compra, y por lo tanto placas quebrada es irrecuperable.

INFORME DE LABORATORIO

Elabore un informe de laboratorio (Ver anexo), donde en la discusión de resultados se tenga en cuenta lo siguiente:

- Dibujo de cada microorganismo (el que usted vio en el laboratorio) comparado con una fotografía del mismo (investigada por usted)

- Clasificación taxonómica (bacteria, hongo, alga, protozoo)

- Hábitat

- Tipo de metabolismo

- Aplicaciones y funciones ambientales

24

ANEXO

ELABORACION DE UN INFORME DE LABORATORIO

1. Titulo: Debe ser el mismo de la guía de laboratorio

2. Introducción: Consiste en una breve revisión sobre el tema tratado en el laboratorio y

debe estar igualmente relacionado con los objetivos de la práctica. Debe ser breve

máximo de hoja y media. No puede ser el mismo que aparece en la guía.

3. Objetivos: Siempre se escriben en infinitivo. Por lo general son los mismos de la guía.

4. Materiales y Métodos: Consiste en contar en forma organizada el procedimiento que

usted realizó durante la práctica, por lo tanto deben estar escritos en pasado. Los materiales (reactivos, instrumentos, muestras entre otros) se van nombrando a medida

que el método se describe, por lo tanto no se deben separar los materiales de los métodos. Absténgase de hacer comentarios como: La profesora dijo…. ó la monitora nos

entrego.

5. Resultados y discusión: Corresponde al reporte y análisis de las observaciones que

usted hizo durante el laboratorio. Es la parte mas importante del informe. Para ello usted debe apoyarse en la bibliografía tratando de dar una explicación lógica a lo observado en

la práctica. La bibliografía utilizada debe ir reportada en el texto por ejemplo si usted extrae un párrafo del libro de Villee, al final de este usted debe poner entre paréntesis el

autor y el año de la siguiente forma: (Villee, 2001). Solo deben ir estos datos el nombre

del libro, la editorial, las páginas y la demás información deben ir en la bibliografía. Cuando se trata de dos autores deben ir los dos por ejemplo (Jensen y Salisbury, 1994)

cuando son más de dos autores la referencia se hace así: (Alberts et al.,1996).

Se deben analizar cada uno de los resultados. Sus figuras y tablas deben estar

enumeradas, por lo que usted debe citarlas a la hora de hacer el análisis.

6. Conclusiones: Son frases cortas que se refieren a sus resultados y discusión, por lo que deben ser redactadas con sus propias palabras. No se salga del contexto.

7. Bibliografía: Debe hacerse de la siguiente manera: apellido de cada autor, seguido por

las iníciales del nombre. Luego el título del libro ó del artículo, luego el año de

publicación, la edición, la editorial, el lugar de publicación y las paginas consultadas. Ejemplo: Villee, C.A. 2001. Biología. Octava edición. Mc Graw Hill. México. Pp 216-217.

25

8. METABOLISMO AEROBIO Y ANAEROBIO EN AGUAS RESIDUALES DOMÉSTICAS

INTRODUCCION

El metabolismo de un organismo permite un intercambio de materia y energía con el entorno a

través de reacciones bioquímicas, esto permite la degradación oxidativa de las moléculas orgánicas. La degradación oxidativa, es la obtención de energía necesaria para que la célula

pueda desarrollar sus funciones vitales, de allí se presume que existe una última molécula que capte los electrones o los hidrógenos desprendidos en las reacciones de oxidación. Si el aceptor

de electrones es el oxígeno molecular la ruta la siguen metabolismos aerobios y si es otra

molécula, el metabolismo será anaerobio.

El metabolismo aerobio presenta varias rutas metabólicas que conducen finalmente a la obtención de moléculas de ATP. Estas moléculas mas tarde serán imprescindibles para dar

energía en las rutas anabólicas. La energía no usada se disipará en forma de calor.

El metabolismo anaerobio es aquel que poseen solo los organismos capaces de reducir

compuestos diferentes al O2, y están adaptados a vivir en condiciones anóxicas.

Desde tiempos muy antiguos, el hombre vio la necesidad de disponer de los residuos provenientes de la actividad humana, para así mejorar la salud de la población. Desde el siglo

XVII D.de C., se empezó a acelerar el crecimiento de la población humana y por lo tanto a

aumentar la producción de vertimientos líquidos, derivados de las actividades domésticas e industriales, los cuales comenzaron a ser dispuestos indiscriminadamente, sobre los cuerpos de

agua. Entonces se hizo más urgente la necesidad de diseñar sistemas para tratar esta agua residuales.

Los sistemas de tratamiento de aguas pueden ser de dos tipos básicamente: sistemas de tratamiento no-naturales como los que usan procesos fisicoquímicos, y sistemas naturales o

biológicos, que utilizan microorganismos que realizan las actividades de degradación o depuración del agua residual

OBJETIVOS

1. identificar los ambientes que presentan condiciones aerobias y anaerobias, para el tratamiento

de materia orgánica.

2. Evaluar ambientes aerobios y anaerobios

MATERIALES

Papel filtro

Embudo de filtración de vidrio Erlenmeyer de 250 ml

Probeta de 100 ml Beaker de 100 ml

Pipeta volumétrica de 50 ml

Medidor de oxígeno disuelto

Electrodo + voltímetro, para medición de Nitrogeno amoniacal

Fotómetro UV-VIS HCl 1.0 N

NaOH 10 N

26

PROCEDIMIENTO

1. Identificación de ambientes

Observe cada uno de los ambientes y sus características más importantes

a. Color del agua b. Olor característico

2. Evaluación de ambientes

Medición de oxígeno disuelto

a. Tome una muestra de agua (utilizando un erlenmeyer de 250 ml) del tanque aerobio y repita el procedimiento con agua del tanque anaerobio.

b. Con el oxímetro mida el oxigeno disuelto del sistema en diferentes tiempos, comenzando con el tiempo

c. Grafique los datos de oxigeno disuelto vs tiempo

Medición de Nitrógeno amoniacal

a. Realice una toma de 100 ml de muestra del tanque aerobio y repita el procedimiento con

agua del tanque anaerobio. b. Adicione 1 ml de NaOH 10 N

c. Introduzca en la muestra un electrodo de medición de nitrógeno amoniacal

d. Agite la muestra constantemente, con agitación magnética durante el tiempo de medición

e. Realice la lectura de los mV

CUESTIONARIO

1. Investigue las rutas del metabolismo aerobio y anaerobio

2. ¿Por qué se contamina el agua con los residuos orgánicos?

4. Investigue en que consisten los sistemas de tratamiento de aguas residuales convencionales:

FAFA (Filtro anaerobio de flujo ascendente) y los lodos activados.

5. Explique cómo los humedales pueden ayudar a la descontaminación de aguas residuales.

27

9. LIPIDOS

INTRODUCCION

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que la forman: glicerina y los ácidos grasos. Estos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en definitiva las sales sódicas o potásicas

de los ácidos grasos. A este proceso se le conoce como saponificación y puede representarse

mediante la siguiente reacción:

A parte de la saponificación, otra característica de las grasas es que son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una

"emulsión" de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupación

de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sitúa sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, benceno,

xilol, cloroformo, etc.

Las moléculas de agua se unen entre sí gracias a las cargas positivas y negativas de oxígenos e

hidrógenos respectivamente que se atraen formando grupos OH. En los lípidos no existen estos grupos, pues están formados básicamente por C y H, y por esto mismo no son miscibles en agua.

28

Por otro lado, es pertinente definir una molécula tensoactiva. Esta se caracteriza por tener una

cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica. En el caso de los jabones y detergentes, las moléculas tensoactivas son sus iones carboxilados RCCOˉ. Por otro lado, las fuerzas de tensión superficial

son aquellas que tienden a disminuir la superficie libre del líquido que se forma entre el agua y el aire. Durante el lavado de grasas, los jabones y detergentes disminuyen esta tensión superficial

rodeando la grasa, orientando su extremo hidrofílico hacia el agua.

Desde el punto de vista sanitario, se consideran aguas duras aquellas que requirieren cantidades

considerables de jabón para producir espuma. Esta dureza es causada por iones metálicos capaces de reaccionar con el jabón para formar precipitados, y con ciertos aniones presentes en

el agua para formar incrustaciones. Por lo tanto, cuando se utilizan aguas duras, la cantidad de jabón que se necesita es mayor, y el valor de la dureza determina por lo tanto, su conveniencia

para el uso doméstico e industrial, y la necesidad de un proceso de ablandamiento.

Algunas durezas son el hierro, el mercurio y el calcio. En el caso del hierro, su presencia en el

agua la hace estéticamente inaceptable, pues al ser expuestas al aire, por acción del oxígeno, se oxida formando precipitados coloidales. El Ca es una dureza muy fuerte, y cuando está

acompañada de magnesio la dureza es total. De la misma manera, el Hg+2, de carácter muy

ácido, es soluble en agua y puede formar compuestos estables para su metabolización como también resultar corrosivo y ser una constante amenaza de contaminación como por el ejemplo

en el caso de los HgCl2.

Dado que los detergentes han resultado ser tan útiles para emulsionar grasas con mayor eficiencia que los jabones, su uso se ha popularizado creando un problema de contaminación ya

que muchos no son degradables. Estos contienen además como adivitos perfumes,

abrillantadores, espumantes, blanqueadores y principalmente tripolifosfato de Na, el cual se encuentra en el mercado en los detergentes llamados antibacteriales. Su acción bactericida

regula el número de microorganismos, pero al mismo tiempo, éstos son necesarios para degradar el detergente. Los detergentes y algunos jabones contienen además sulfatos, por lo que estos se

acumulan en grandes cantidades en ríos y aguas subterráneas. Al ser estos fertilizantes,

estimulan el crecimiento de las plantas a tal grado que se agota el O2 disuelto en el agua causando la muerte de los peces y demás organismos aeróbicos que viven en ella.

Para el control de estas descargas de jabones y detergentes, se ha propuesto la modificación

genética de bacterias, y otros seres que contribuyan la descomposición de esas sustancias para

mantener el equilibrio de los ríos.

OBJETIVOS

Extraer los constituyentes lipídicos de materiales de origen animal o vegetal utilizando la

solubilidad de estos compuestos en solventes polares.

Realizar ensayos químicos generales de caracterización de lípidos.

Reconocer diferentes tipos de jabón experimentalmente.

MATERIALES

Acetona Etanol

Metanol Eter etílico

Cloroformo

NaOH en lentejas 10 % HCl al 2%

Agua destilada Aceites y grasas comerciales

Jabón en barra

Detergente en bolsa Solución de cloruro de calcio (CaCl2)

Tricloruro férrico (FeCl3)

bicloruro de mercurio (HgCl2) al 5% Sulfato ácido (KHSO4)

Tocino o cebo Tubos de ensayo

Vasos de precipitado

Mechero

PROCEDIMIENTO

Prueba para el glicerol: Coloque una capa de aproximadamente 0.5 cm de KHSO4 en un tubo de ensayo, adicione 5 gotas de grasa de tocino y nuevamente agregue KHSO4. Agite la mezcla y caliente moderadamente

hasta ebullición.

Aprecie el color de la acroleína y su olor característico.

Prueba de solubilidad de lípidos:

Enumere 5 tubos de ensayo y adicióneles lo siguiente:

Tubo 1: 1ml de agua destilada

Tubo 2: 1ml de acetona Tubo 3: 1ml de etanol

Tubo 4: 1ml de cloroformo Tubo 5: 1ml de éter

A continuación agréguele a cada uno de ellos una gota de aceite vegetal y anote sus observaciones.

Propiedades de jabones y detergentes:

a) Sales insolubles de los ácidos grasos:

Tome dos vasos de precipitado y a cada uno agréguele 100 ml de agua destilada. Luego, al primero adiciónele 0.5 g de detergente en polvo, y al segundo 1g de jabón de manos.

Caliente ambos vasos pero sin llevar a ebullición. Deje enfriar y distribuya el contenido de cada

uno de ellos en 5 tubos de ensayo de la siguiente manera:

Tubo 1: 5 ml de solución de jabón + 3 gotas de CaCl2

Tubo 2: 5 ml de solución de jabón + 3 gotas de HgCl2

Tubo 3: 5 ml de solución de jabón + 3 gotas de FeCl3

Tubo 4: 5 ml de solución de jabón + 0.5 ml agua del grifo

Agite los tubos y anote sus observaciones. Anote las diferencias entre los tubos que contienen

detergente y los que contienen jabón de manos.

b) Acción lavadora de jabones y detergentes:

30

Ponga en 4 tubos de ensayo lo siguiente:

Tubo 1: 5ml de jabón detergente + 1 gota de aceite vegetal

Tubo 2: 5ml de jabón de manos + 1 gota de aceite vegetal Tubo 3: 5ml de NaOH + 1 gota de aceite vegetal

Tubo 4: 5ml de HCl + 1 gota de aceite vegetal

c) Reacción de saponificación:

Transfiera 12 gramos de grasa de origen animal a un vaso de precipitado y adicione 5 gramos de

NaOH disueltos en 15 ml de agua destilada y 10 ml de metanol.

Agite la mezcla y caliente hasta ebullición manteniendo el volumen de la solución constante

mediante la adición, cuando sea necesario, de una mezcla agua-metanol 1:1.

CUESTIONARIO

1. ¿A qué llamamos aguas duras?

2. ¿Cuáles son las características estructurales necesarias para que un compuesto tenga una

buena acción como detergente?

3. Cuál es el efecto de los iones metálicos sobre el jabón?

4. Investigue las enzimas producidas por microorganismos para la reconversión tecnológica (“

tecnología limpia”) de detergentes.

IMPORTANTE !

Para esta práctica de laboratorio, cada grupo de trabajo debe traer jabón detergente, jabón de

manos, aceite vegetal y tocino o cebo.

BIBLIOGRAFIA

Hart H., Hart D.J, Craine L.E. Química Orgánica. Novena edición. Editorial Mc Graw Hill. México.

1995.

Kent V. Jabones y detergentes Revista de divulgación de I.E.S. N17, 2002, Madrid.

White A. Principios de Bioquímica. Segunda edición. Editorial Mac Graw Hill. 1983. España.

31

10. MODELOS DE ADN

PROCEDIMIENTO

Cada grupo de laboratorio recibirá las piezas para formar una doble hélice de ADN. En una de las hebras haga la secuencia A-G-C-T-A-T y en la otra replique las bases correspondientes por

complementariedad. Luego realice la transcripción a ARN mensajero y por último observe en el código genético a que aminoácidos corresponden los codones del dipéptido formado.

OBJETIVOS

Familiarizarse con la estructura del ADN

MATERIALES

Kit Modelos de ADN:

12 Triángulos negros: azúcar

12 Fosfatos: rojos 3 Adeninas: Rojas

3 Guaninas: Grises

3 Timinas: azules 3 Uracilos: Blancos

3 Citocinas: Verdes 1 Eje gris

6 puentes de hidrógeno blancos: Unen pirimidinas con purinas

24 conectores amarillos: enlaces fosfodiester 1 Soporte del eje

3 Soportes de la base

TALLER

1. Si se tiene la siguiente secuencia de ADN: TACGGTTTTAAACCTATT,

a) Cuál será la secuencia en el transcrito de RNA m? b) Cuál será la secuencia de aminoácidos correspondientes?

c) Por qué cree que una mutación en el cuarto codón es de tipo silencioso? La mutación es

UUC.

2. Mediante un diagrama explique la replicación del ADN Explique en que consiste la replicación del ADN

3. Explique brevemente como ocurre la transcripción del ADN

4. Explique en qué consiste el código genético.

5. Haga una tabla comparativa entre ADN y ARN teniendo en cuenta: el azúcar, las bases, tipo de cadena, lugar dentro de la célula eucariota y función.

32

6. Qué son intrón y exón. El RNAm copia y conserva la información del intrón?

7. Cuál es la función del ADN polimerasa en la replicación del ADN? Qué requiere para comenzar su trabajo?

8. Qué tipos de enlaces unen las hebras del ADN y qué tipos de enlaces unen los diferentes nucleótidos?

33

11. VISUALIZACIÓN DE AND GENOMICO

INTRODUCCIÓN

El ADN (ácido desoxirribonucléico), portador de la información genética, se caracteriza

estructuralmente por consistir en una doble hélice constituída por bases nitrogenadas (A, T, G y

C) que dentro de la misma hebra se unen mediante enlaces fosfodiester, mientras que las de hebras diferentes lo hacen mediante puentes de hidrógeno. Un punto importante, es que para

bases de hebras diferentes, solo la unión A-T y G- C son permitidas, lo cual nos indica de antemano la exactitud con que los procesos que implican la replicación del ADN deben ser

llevados.

Muchos campos de la biología pueden verse beneficiados por el conocimiento de los patrones de

variación genética en organismos, y el método más directo para medirla es por supuesto midiendo la variación a nivel del ADN. Esta puede ser detectada mediante electroforesis, una

técnica analítica de separación de macromoléculas. Las diferencias detectadas tras el análisis, al comparar varios organismos, pueden ser la evidencia de la existencia de genes o de mutaciones

que confieren a ciertos seres vivos la propiedad de ser, por ejemplo, más resistentes a

condiciones ambientales adversas, como podría ser el frío, el calor, la alta concentración de sal o de contaminantes. Esto explica la importancia de esta técnica en la biotecnología ecológica como

un primer paso antes de mejorar o crear organismos, especialmente microorganismos, con características genéticas deseadas.

La separación electroforética tiene lugar gracias a la diferente movilidad que presentan las

macromoléculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. Los ácidos

nucleicos son macromoléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas

condiciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximadamente igual al número de grupos fosfato.

La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente horizontales, y requiere dos elementos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La

fase móvil es el medio amortiguador que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacionaria o

soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa con un tamaño de poro homogéneo que se

haya sumergido y embebido en la fase móvil. El polímero utilizado para el análisis electroforético de ácidos nucleicos de gran tamaño (100pb-10kb) es la agarosa.

La migración de los fragmentos de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en un gel de agarosa sometido

a un campo eléctrico depende tanto del voltaje del campo, como del tamaño de poro del gel de agarosa. La separación efectiva de los fragmentos de ADN o ARN (resolución)

depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos, en realidad de la

relación carga/masa. Transcurrida la electroforesis, la localización relativa de los fragmentos se determina mediante distintos métodos de detección. La tinción con bromuro de etidio, una sonda

fluorescente tras iluminación con luz UV, es un método generalizado de detección de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre la doble hélice de ADN y emite luz.

34

OBJETIVOS

Aprender a realizar una electroforesis de ADN y comprender el principio de ésta.

Determinar la relación entre el tamaño de la cámara electroforética y la velocidad de migración.

MATERIALES

ADN vegetal

Agarosa

Buffer de corrido Buffer de carga

Bromuro de etidio Tubos de ensayo falcon

Tubos eppendorf

Papel absorbente Papel parafina

Baño Maria Centrífuga

Cámara de extracción

Balanza

Cámaras de electroforesis Fuente de poder

Transiluminador Pipeta

Micropipeta

Guantes Modelos de ADN

PROCEDIMIENTO

Electroforesis de ADN: Para poder realizar la electroforesis del ADN extraído es necesario preparar un gel de agarosa al 0.8%. Para esto, pese 0.8 g de agarosa por 100 ml de buffer TBE 1X (de corrido). Caliente la

preparación hasta ebullición de tal manera que no queden grumos de agarosa, y agregue 10 μl de Bromuro de etidio.

► Evite que el bromuro de etidio haga contacto con su piel, es altamente mutagénico !

A continuación distribuya la solución de agarosa en la cubetas de ambas cámaras de electroforesis (grande y pequeña) y ponga las respectivas peinillas de pozos.

Deje enfriar hasta que gelifique y retire la peinilla.

Introduzca el gel dentro de la cámara de electroforesis y llene la cámara con buffer de corrido de tal manera que el gel quede cubierto por éste.

Sobre una tira de papel parafina mezcle 5 μl de buffer de carga y 15 μl de ADN y luego tome 15 μl y deposítelo en uno de los pozos del gel dejados al retirar la peinilla.

Cierre la cámara de electroforesis y conéctela a la fuente de poder de tal manera que los cables

vayan del cátodo (negativo) al ánodo (positivo).

35

Encienda la fuente de poder y póngala a 100 voltios. Como se desea comparar la velocidad de

migración de ambas cámaras, es necesario, interrumpir la migración cada 10 min. Esto significa apagar la fuente de poder, abrir la cámara y medir la distancia recorrida por el buffer de carga, el

cual se mezcló con la muestra y migra independientemente de ésta. Su presencia reconoce por una banda de color azul. El recorrido del ADN de las muestras no se puede ver de esta forma.

A los 40 min aproximadamente, desde que se conectó por primera vez la cámara, apague la fuente de poder, abra la cámara de electroforesis, tome el gel y póngalo sobre el transiluminador

cubriéndolo con la tapa protectora. Bajo la luz UV emitida por el transiluminador al prenderlo ud. podrá observar el ADN.

Realización de una electroforesis de ADN CUESTIONARIO

1. Investigue algunas de las aplicaciones de la electroforesis

2. Investigue que factores influyen en el corrido electroforético de las moléculas

3. Porqué al conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder, ésta debe hacer del polo

negativo al positivo? Que tiene que ver esto con la carga del ADN?

4. Cual es la importancia ambiental de estudiar la biodiversidad

BIBLIOGRAFIA

Peláez Irma y Marulanda Marta. Texto teórico-práctico de Biología. Universidad Tecnológica de

Pereira, 2005, Colombia.

36

12. CULTIVO ¨ IN VITRO ¨

INTRODUCCION

El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de

reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente

iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.

A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las

mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de

extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. Muchas de estas plantas podrían ser de

importancia ambiental en procesos de biorremediación.

OBJETIVOS

1. Conocer un método de propagación ¨ in Vitro ¨ como técnica biotecnológica

2. Reconocer los factores que intervienen en el cultivo ¨ in Vitro ¨

3. Observar el efecto de las hormonas vegetales en el cultivo ¨ in Vitro ¨

MATERIALES

Gradillas Mecheros bunsen

Pinzas

Bisturí Cajas de petri esterilizadas

Frascos de vidrio esterilizados Frascos con medio de cultivo MS 1 Sin hormonas y 3 con 3 mg/l de BAP

Cinta plástica (vinilpel) Etanol al 70%

Yemas de clavel

Tapa bocas

METODOLOGIA

Medidas de asepsia para el establecimiento del material vegetal:

Se limpian muy bien los mesones con hipoclorito de sodio comercial y luego con alcohol al 70 %, luego todos los estudiantes deben lavarse las manos y los brazos hasta el codo con agua y jabón,

para esto se deben quitar anillos, pulseras y relojes. Posteriormente ponerse el tapabocas, se recomiendo hablar lo menos posible para evitar la contaminación.

37

Establecimiento del material vegetal:

Primero se prende el mechero, este se ubica cerca de la gradilla, luego se desinfectan las pinzas y el bisturí, los cuales se encuentran en un frasco que contiene alcohol al 70%, la desinfección se

realiza flameándolos en el mechero

NOTA: Estos dos instrumentos deben flamearse cada vez que se siempre uno de los explantes.

Se destapa la caja de petri y se pone sobre la gradilla para que quede a la altura de la llama del

mechero, con la pinza se extrae una yema de clavel del frasco que los contiene y se vuelve a tapar inmediatamente, esta yema se deposita en la caja de petri, con el bisturí se procede a

cortarle los extremos, de manera que solo quede la yema, posteriormente usando las pinzas la

yema se siembra en un frasco con medio de cultivo, se recomienda no enterrar el explante en el medio, solamente depositarlo. Se repite el procedimiento hasta tener una yema en cada frasco,

estos se sellan con vinilpel y se marca con el número del grupo.

Se realizaran observaciones por aproximadamente tres semanas, los parámetros a evaluar son:

Fenolización del medio de cultivo

Oxidación ó necrosamiento del explante

% de Brotación

% de contaminación por hongo o por bacteria

Recomendaciones

Trabajar lo más cerca posible de la llama del mechero, para evitar la contaminación del medio

de cultivo.

Los integrantes de cada grupo deben permanecer en la mesa de trabajo, deben evitar circular

por el laboratorio para evitar el flujo de corrientes de aire que llevan consigo esporas de hongos.

Se debe hablar lo menos posible, debido a que en las vías respiratorias se alojan esporas de

hongos.

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es tan importante evitar la contaminación en el cultivo ¨ in Vitro ¨

2. Explique los diferentes efectos que tienen las hormonas vegetales en el material vegetal ¨ in Vitro ¨

3. ¿Qué métodos de micropropagación existen y cuales son sus aplicaciones?