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Test de detección de la Toxina A de Clostridium difficile
Estudiantes:Fabricio José Sevilla Acosta
Luis Benjamín Ramírez CisnerosKarla Coto Chinchilla
Jeffry Jiménez Delgado
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CONTENIDO• INTRODUCCIÓN– Clostridium difficile y Colitis seudomembranosa– Toxinas A y B– Prueba de Citotoxicidad Celular
• TEST DE DETECCIÓN DE TOXINA A DE Clostridium difficile– Características– Fundamento– Metodología– Diagnóstico
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INTRODUCCIÓN
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Clostridium difficile
• Bacilo anaerobio Gram positivo.• Patógeno nosocomial.• Produce diarrea y colitis pseudomembranosa.• Asociado a antibióticos de gran espectro:
ampicilina y cefalosporinas.
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Clostridium difficile
Figura 1. Clostridium difficile en tinción de Gram.
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Clostridium difficile
Figura 2. Colonias de Clostridium difficile en Agar Sangre.
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Clostridium difficile
Figura 3. Clostridium difficile en microscopía electrónica de barrido.
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Colitis seudomembranosa
Figura 4. Colon con Colitis seudomembranosa debido a Clostridium difficile.
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Toxinas
• Toxina A: – Secreción fluida, daño a mucosa e inflamación.
• Toxina B: – Más potente.– No es enterotóxica.
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Prueba de Citotoxicidad celular• Fundamento: – Citotoxicidad: Interfiere en división celular.– Rojo neutro: Se acumula solo dentro de células
viables.• Método:– Se coloca la toxina y células en cultivo con rojo
neutro (células Vero). Se determina concentración de rojo neutro tras un tiempo.
• Características: – Determina Toxina B.– Tarda 48h.
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TEST DE DETECCIÓN DE TOXINA A DE Clostridium difficile
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Características
• Inmunoensayo rápido para detección cualitativa de la Toxina A de C. difficile en heces.
• Tarda 30min en dar Diagnóstico.
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Fundamento de la prueba
• Anticuerpos monoclonales frente a la Toxina A de C. difficile unidos a partículas de látex color azul.
• Se determina mediante reacciones de tipo Antígeno- Anticuerpo que producen cambios de color.
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METODOLOGÍA
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Preparación de muestra
1. Añadir 1ml de diluyente de muestra a un tubo de micro-centrífuga (microtubo).
2. Añadir 100µl de heces líquidas o una porción de heces de 5mm de diámetro si son sólidas (dentro de 3h de su recogida).
3. Tapar el tubo y mezclar en “vortex” durante 10-15s.
4. Centrifugar a 13 500rpm por 10min.5. Utilizar sobrenadante como MUESTRA.
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Equipo
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Equipo
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Metodología
1. Adición de 125µl de muestra a almohadilla absorbente en Ventana de Muestra.
− Anticuerpos monoclonales anti- Toxina A de ratón unidos a partículas azules de látex.
− Reacción Ag-Ac.
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Metodología
2. Migración por capilaridad a la tira de prueba.
− Complejo Ag-Ac-Látex.− Anticuerpos monoclonales
de ratón unidos a látex azul y la muestra migran por tira de prueba.
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Metodología
3. Ventana de resultados.
− Reacción complejo Ag-Ac-Látex y Anticuerpo fijado.
− Línea Azul.
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Metodología
4. Ventana de control.− Muestra sigue migrando y
entra en contacto con anticuerpos de conejo anti-ratón y se forma una línea azul.
− Reacción complejo Ag-Ac-Látex y Anticuerpo Anti- Ratón.
− Indica que la prueba ha funcionado correctamente.
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DIAGNÓSTICO
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Diagnóstico• Consiste en demostrar la presencia de toxinas
de C. difficile en heces.• Se realiza siempre que un paciente tenga
diarrea asociada a uso de antibióticos.• Se realiza 30min después de colocada la
muestra.
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Diagnóstico
* Puede haber diferencia entre el color en ventana de Control y Resultados.** Si no aparece la línea de Control se ensayará de nuevo.*** Si la línea no es azul en Resultados se considera negativa.
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DEMOSTRACIÓN
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GRACIAS