tesis_leticia durán.pdf

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

“EFECTO DE LA DENSIDAD Y TEMPERATURA DE CO2 SOBRE LA

EXTRACCIÓN SUPERCRÍTICA DE ACEITE DE MICROALGA

(Botryococcus braunii)”

LETICIA ALEJANDRA DURÁN MANOSALVA

2012

UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

FACULTAD DE INGENIERÍA, CIENCIAS Y ADMINISTRACIÓN

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA




TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE

INGENIERO EN ALIMENTOS

Profesor Guía: Dr.Edgar Uquiche Carrasco


2012





2012

COMISIÓN EXAMINADORA

EDGAR UQUICHE CARRASCO

Profesor guía

CAROLINA SHENE DE VIDTS XIMENA INOSTROZA HOFFMANN

Profesor examinador Profesor examinador

Nota trabajo escrito :

Nota examen :

Nota final :

RESUMEN

Las microalgas son una fuente importante de componentes naturales de alto valor biológico como

proteínas, pigmentos carotenoides, ácidos grasos, aminoácidos, etc. Estos componentes pueden

ser aislados y empleados como ingredientes funcionales en la industria farmacéutica, cosmética y

alimentaria. Actualmente, la tecnología de extracción con CO2 supercrítico (SC-CO2) se perfila

como una técnica innovadora para extraer y aislar estas sustancias, por ser más seguro que el

hexano (sin dejar restos de solvente), ser una tecnología amigable con el medio ambiente y

limpia, ofreciendo una alta calidad del producto final en comparación a los extractos obtenidos a

través de técnicas convencionales. Dentro de los factores que se deben considerar para este tipo

de extracción se encuentran la densidad del fluido, temperatura, presión, entre otros.

El objetivo principal de este trabajo fue estudiar el efecto de la temperatura y la densidad del SC-

CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de extracción de aceite de microalga Botryococcus

braunii junto con evaluar el rendimiento y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles

presentes en el extracto. Para ello, se realizaron extracciones basadas en un diseño central

compuesto rotatorio con 5 niveles de cada variable independiente (temperatura de extracción y

densidad SC-CO2), con 2 factoriales, 2 axiales y 1 punto central. De acuerdo a los resultados

obtenidos, el mayor rendimiento de extracción de aceite fue 87,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 °C

y 957 kg CO2/m3. En carotenoides el mayor rendimiento fue 1550,0 mg car/kg SS obtenido a 69

°C y 957 kg CO2/m3. En tocoferoles se observó la mayor concentración a 41 °C y 957 kg CO2/m

3

siendo ésta 18,0 g tocoferoles/ kg aceite. La mayor concentración de carotenoides se obtuvo a 69

°C y una densidad de 957 kg CO2/m3 y fue 17,0 g car/kg aceite. En cuanto a la concentración de

esteroles, la mayor concentración fue 23,0 g esteroles/ kg aceite obtenida a 41°C y 957 kg

CO2/m3 Las variables densidad SC-CO2 y temperatura de extracción afectaron significativamente

(p≤0,05) el rendimiento de extracción de aceite explicando su comportamiento en un 89% siendo

la temperatura el factor que más afectó el rendimiento con un 46,36% de contribución a la

respuesta.

Se agradece al Proyecto Corfo Desert Bioenergy 09CTEI-6860 por el financiamiento para la

realización de este trabajo.

INDICE DE CONTENIDOS

Página

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1

1.1. Objetivos ............................................................................................................................................. 3

1.1.1. Objetivo general ............................................................................................................. 3

1.1.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 3

CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES ..................................................................... 4

2.1 Microalga (Botryococcus braunii). ...................................................................................................... 4

2.2 Lípidos ................................................................................................................................................. 5

2.3 Antioxidantes naturales ........................................................................................................................ 5

2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutrición. ............................................ 6

2.4.1 Carotenoides .................................................................................................................... 6

2.4.2 Esteroles .......................................................................................................................... 7

2.4.3 Tocoferoles ...................................................................................................................... 8

2.5 Fluidos Supercríticos y sus propiedades .............................................................................................. 9

2.6 Extracción con FSC ........................................................................................................................... 10

2.7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas. ................................................................... 11

2.8 Aplicación industrial de FSC. ............................................................................................................ 11

2.8.1 Extracción de aceites esenciales .................................................................................... 12

2.8.2 Fraccionamiento de la grasa láctea ................................................................................ 13

2.8.3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas .................................................................... 13

2.8.4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas. ..................................... 14

CAPÍTULO 3: MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................... 15

3.1. Materiales ......................................................................................................................................... 15

3.1.1 Materia prima ................................................................................................................ 15

3.1.2. Equipos e instrumentos ................................................................................................ 15

3.1.3. Material de vidrio y otros ............................................................................................. 15

3.1.4. Reactivos ...................................................................................................................... 16

3.2 Métodos de análisis ............................................................................................................................ 16

3.2.1. Determinación de humedad .......................................................................................... 16

3.2.2. Extracción de aceites utilizando SC-CO2 ..................................................................... 17

3.3. Análisis del aceite ............................................................................................................................. 17

3.3.1 Contenido de carotenoides totales ................................................................................. 17

3.3.2 Contenido de esteroles .................................................................................................. 18

3.3.3 Contenido de tocoferoles ............................................................................................... 19

3.4 Diseño de experimentos ..................................................................................................................... 20

3.4.1 Análisis estadístico ........................................................................................................ 20

CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 22

4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial ..................................................................................... 22

4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de

las respuestas. ........................................................................................................................................... 22

4.3 Análisis estadístico ............................................................................................................................ 24

4.3.1. Análisis del rendimiento de extracción de aceite ......................................................... 26

4.3.2 Análisis de concentración de carotenoides.................................................................... 28

4.3.3 Análisis de concentración de esteroles .......................................................................... 29

4.3.4 Análisis de concentración de tocoferoles ...................................................................... 31

4.3.5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides ................................................ 32

4.3.6 Rendimiento de extracción de esteroles ........................................................................ 34

4.3.7 Rendimiento de extracción de tocoferoles .................................................................... 35

4.4 Discusión General .............................................................................................................................. 37

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 39

BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 42

ANEXOS ...................................................................................................................................... 51

Anexo A. Determinación de la humedad del sustrato .......................... ¡Error! Marcador no definido.51

Anexo B. Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii. ......... ¡Error!

Marcador no definido.52

Anexo C. Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii). . 58

Anexo. D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii). .................................... 64

Anexo E Análisis Estadístico…...……………………………………………..………………………..67

INDIDE DE TABLAS

Página

Tabla 2.1.Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de

algas y microalgas....................................................................................................... 12

Tabla 3.1. Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio. .................................................. 22

Tabla 4.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles

con CO2 supercrítico. .................................................................................................. 23

Tabla 4.2. Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático ............................................ 24

Tabla 4.3. Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta ............................ 26

Tabla A-1. Determinación de la humedad del sustrato………………………………...………...51

Tabla B-1.Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de

diseño 1…………………………………………………………………………….52

Tabla B-2. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de

diseño 2)...………………………………………………………………………….52


diseño 3)…………...……………………………………………………………….53


diseño 4)…………………...……………………………………………………….53


diseño 5)………...………………………………………………………………….54

Tabla B-6. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 69 °C y 900 kg CO2/m3

(punto de

diseño 6)……………...…………………………………………………………….54


diseño 7)…………...……………………………………………………………….55


diseño 8)………...………………………………………………………………….55


diseño 9)………...………………………………………………………………….56


diseño (10)…..……………………………………………………………………...56

Tabla B-11 Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de

diseño 11)…………….…………………………………………………….....……57

Tabla B-12 Extracción de aceite de microalga B. braunii a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de

diseño 12)………….………………………………………………………..……...57

Tabla D-1 Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de

microalga B. braunii……………………………………………...………………...64

Tabla D-2 Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de microalga

B. braunii. ………………………….………………….…………………………….65

Tabla D-3 Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de microalga

(Botryococcus braunii)……….…...……………….………….………………..……66

Tabla E-1. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite…………………...70

Tabla E-2. Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite. …………...71

Tabla E-3. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite………………...71

Tabla E-4. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite……………...72

Tabla E-5. Análisis del rendimiento de carotenoides……………………………………………72

Tabla E-6. Análisis del rendimiento de esteroles………………………………………………..73

Tabla E-7. Análisis del rendimiento de tocoferoles……………………………………………..73

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 2.1. Forma estructural B. braunii………………...………………………………………..4

Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la región de un fluido supercrítico………………….9

Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de

la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3). ............................................................. 27

Figura 4.2. Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la

temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ................................................................. 29

Figura 4.3. Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la


Figura 4.4. Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la


Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como

función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3) ............................................ 33

Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función

de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3). ........................................................ 35

Figura 4.7. Superficie de respuesta del rendimiento de tocoferoles (Y7) como función de la


Figura C-1. Curva cinética de extracción a 45 °C y 860 kg CO2/m3 (Punto de diseño 1)……....58



Figura C-4. Curva cinética de extracción a 65 °C y 940 kg CO2/m3 (Punto de diseño 4)…..…..59

Figura C-5. Curva cinética de extracción a 41 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 5)….…...60

Figura C-6. Curva cinética de extracción a 69 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño).………..60

Figura C-7. Curva cinética de extracción a 55 °C y 843 kg CO2/m3 (Punto de diseño).….…….61

Figura C-8. Curva cinética de extracción a 55 °C y 957 kg CO2/m3 (Punto de diseño 8)………61


Figura C-10. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 10)……62

Figura C-11. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 11)...….63

Figura C-12. Curva cinética de extracción a 55 °C y 900 kg CO2/m3 (Punto de diseño 12)…....63

Figura D-1. Curva calibración carotenoides totales……………………………………………..64

Figura D-2. Curva de calibración esteroles totales………………………………………………65

Figura D-3. Curva de calibración para tocoferoles totales………………………………………66

Figura E-1. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite

(Y1)……………………………………………………………………………………………….67

Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2).

................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.67

Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3).


Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).


Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5). .. 69

Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6) ......... 69

Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).


CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Capítulo 1. Introducción

Efecto de la densidad y temperatura deCO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga

(Botryococcus braunii) 1

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

Actualmente existe una tendencia del consumidor por cambiar continuamente de gustos y escoger

productos innovadores, saludables y atractivos a la vista, lo cual es una señal de alerta en la

industria alimentaria que día a día busca la forma de satisfacer las demandas del mercado. Es por

ello, que resulta necesario buscar nuevas metodologías para desarrollar y extraer compuestos

altamente beneficiosos, por ejemplo: esteroles, carotenoides, tocoferoles, entre otros a partir de

sustancias naturales. Estos compuestos actúan en una o varias funciones del organismo, de modo

específico y positivo, contribuyendo a mantener y/o mejorar el estado de salud y reducir el riesgo

de sufrir determinadas enfermedades o alteraciones (Palou et al., 2005). Estos ingredientes son

preferidos por los consumidores debido a su origen natural, tales como plantas, subproductos de

alimentos o incluso algas y microalgas, las cuales están recibiendo mucha atención, debido a su

capacidad de realizar fotosíntesis y a su adaptación a la vida en medios marinos o en aguas

continentales (Mendiola, 2008).

Las algas en general han desarrollado compuestos de gran interés para la industria alimentaria,

pueden ser empleadas como fuente de ingredientes funcionales, ya que son reconocidas como una

importante fuente renovable de lípidos bioactivos con una alta proporción de ácidos grasos

poliinsaturados (PUFA, β-caroteno y otros pigmentos (antioxidantes), polisacáridos

sulfatados (antivirales) y esteroles) (Herrero et al., 2006).

Para la extracción de aceite a partir de microalgas, la tecnología con CO2 supercrítico (SC-CO2)

se mira con interés, por ser más seguro que el hexano, ser una tecnología amigable con el medio

ambiente y limpia, ofreciendo un tiempo de extracción corto y alta calidad del producto final

(Andrich et al., 2005).

La extracción con fluido supercrítico (EFS) es una operación unitaria que aprovecha el poder

solvente de los fluidos supercríticos en condiciones por encima de su temperatura y presión

crítica (31,1 °C y 7,9 MPa). Tiene las características tanto de un gas como de un líquido, su poder

solvente depende sólo de su densidad, la cual puede ajustarse fácilmente combinando las

variables presión y temperatura. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades

solventes de un fluido supercrítico; ya que, están ligados a la solubilidad y de este modo, la

selectividad del fluido puede ser modificada de acuerdo a los componentes que se requieran


Efecto de la densidad y temperatura del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga

(Botryococcus braunii). 2

extraer y para ello es necesario realizar pequeños cambios en las variables de presión y

temperatura del flujo solvente. Además, la temperatura tiene un efecto positivo sobre la

volatilidad del soluto. Se espera que a mayor temperatura, se aumente la presión de vapor del

soluto y de esta forma se mejore la transferencia del soluto a la fase supercrítica. Por otra parte,

se ha señalado que la solubilidad de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en el SC-CO2

aumenta con la densidad a temperatura constante y viceversa (Saldaña et al., 2010).

El presente trabajo de título tiene como objetivo estudiar el efecto de la temperatura de extracción

y densidad del CO2 supercrítico, sobre el rendimiento de extracción de aceite y velocidad de

extracción de microalga (Botryococcus braunii) incluyendo las características químicas del

extracto obtenido mediante la determinación del contenido de carotenoides, esteroles y

tocoferoles. Se empleará un diseño central compuesto rotatorio para la realización de los ensayos

de extracción y obtención de resultados experimentales, los que serán analizados con la

Metodología Superficie de Respuesta.


Efecto de la densidad y temperatura de CO2sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga


1.1. Objetivos

1.1.1. Objetivo general

Estudiar el efecto de la temperatura y densidad del CO2 sobre el comportamiento de la velocidad

y rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii) usando CO2

supercrítico.

1.1.2. Objetivos específicos

Estudiar el efecto de la temperatura de extracción y densidad de CO2 sobre la velocidad y el

rendimiento de extracción de aceite de microalga (Botryococcus braunii).

Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la velocidad y el rendimiento de

extracción de carotenoides, esteroles y tocoferoles.

Estudiar el efecto de la temperatura y densidad de CO2 sobre la concentración de

carotenoides, esteroles y tocoferoles.

Caracterizar el aceite de microalga obtenido bajo condiciones de extracción seleccionadas.

CAPÍTULO 2

ANTECEDENTES GENERALES

Capítulo 2. Antecedentes generales

Efecto de la densidad y temperatura de CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga


CAPÍTULO 2. ANTECEDENTES GENERALES

2.1 Microalga (Botryococcus braunii).

Existen al menos 30.000 especies conocidas de microalgas, tanto de agua dulce como salada,

pero sólo unas cuantas son de importancia comercial donde se incluyen: Chlorella, Spirulina,

Dunaliella, Haematococcus, Botryococcus, entre otras, a partir de las cuales se extraen

componentes de alto valor biológico como proteínas, pigmentos, vitaminas, minerales, enzimas

y ácidos grasos. El número de especies de color azul-verde es muy grande y se caracteriza por

tener un alto contenido de lípidos (Loera-Quezada y Olguín, 2010), además, algunas especies

marinas como Isochrysis, Nannochloropsis, Skeletonema, Chaetoceros etc., también se utilizan

para la alimentación de moluscos u otros propósitos de acuicultura (Bruton et al., 2009).

La microalga verde Botryococcus braunii es una especie de agua dulce perteneciente a la

familia Chlorophyceae, se distribuye en oligotróficos y eutróficos y según Fang et al. (2004),

posee niveles inusualmente altos de ácidos grasos libres. El verde alga colonial de esta microalga

(Figura 2.1) es bien conocido por su alto contenido de hidrocarburos, y se ha propuesto como una

fuente renovable para las necesidades futuras de energía en beneficio de la protección del medio

ambiente, ya que dentro de sus ventajas se encuentra su cultivo, que puede ser en agua de mar, en

agua salobre o en aguas residuales, creciendo en una amplia variedad de climas no compitiendo

por el agua dulce ni suelos requeridos para la producción de alimentos (Loera-Quezada y Olguín,

2010).

Figura 2.1. Forma estructural B.braunii (Barker et al., 2012).




2.2 Lípidos

El contenido de lípidos en las microalgas oleaginosas se encuentra dentro de un 20 a 50%,

llegando a alcanzar un 70% de la biomasa seca cuando las células están sometidas a condiciones

de estrés fisiológico o un medio ambiente desfavorable en cuanto a la limitación de nutrientes (Li

et al., 2008; Dorval et al., 2009). El contenido de lípidos, su composición y las proporción de los

diversos ácidos grasos en una microalga puede variar, ya que éstos pueden ser afectados por una

serie de variables ambientales como: intensidad de luz y fotoperiodo, temperatura, salinidad,

concentración de dióxido de carbono, concentración de nitrógeno, fósforo y la intensidad de la

radiación UV-B (Mansour et al., 2003).

Ahlgren et al. (1992) analizaron los ácidos grasos en 24 muestras de microalgas de un grupo

verde-azul (por ejemplo, Oscillatoria y Microcystis) procedentes de diferentes lotes de cultivos

continuos y en diversas fases de crecimiento. Encontraron altas cantidades de ácidos grasos de

18 carbonos de la familia ω-3 y ω-6, así como también, en el grupo de flagelados (grupo

taxonómicamente diverso) encontraron altas cantidades de ácidos grasos poliinsaturado de

cadena larga (20-22 carbonos), especialmente del tipo ω-3. Se determinó una relación ω3/ω6 más

alta en las algas en la fase de crecimiento exponencial. Las familias ω-6 y ω-3 destacan por sus

importantes funciones fisiológicas, como por ejemplo, son necesarios para el crecimiento y

desarrollo del sistema nervioso central y la retina, y el correcto funcionamiento del sistema

cardiovascular (Sahena et al., 2009).

Se han determinado los principales ácidos grasos que constituyen los lípidos de la microalga

verde B. braunii estos son: 2,3% ácido láurico (C12:0), 2,87% ácido mirístico (C14:0), 4,32%

ácido esteárico (C18:0), 13,2% ácido linolénico (C18:3), 14,5% ácido linoleico (C18:2), 22,3%

ácido oleico (C18:1) y finalmente 40,6% de ácido palmítico (C16:0) (Dayananda et al., 2007). La

investigación realizada por Dayananda et al. (2007) fue similar a las observaciones realizadas por

Fang et al. (2004) ya que ambas informan que el ácido palmítico y ácido oleico son los

principales ácidos grasos presentes en la microalga Botryococcus braunii.

2.3 Antioxidantes naturales

Los antioxidantes naturales están ampliamente distribuidos en la naturaleza formando parte de

semillas, frutos, hojas, raíces, etc. de una amplia variedad de plantas (Valenzuela et al., 2000)

presentándose como compuestos fenólicos, compuestos nitrogenados, flavonoides, tocoferoles,




aminas, o carotenoides. Una fuente inagotable de exploración es el mar y su biodiversidad, siendo

las algas marinas uno de los recursos potenciales de dichos compuestos, ya que se ha informado

que la actividad antioxidante de los extractos de algas depende de los componentes químicos de

los extractos que principalmente consisten en carotenoides, polifenoles, tocoferoles y vitamina C

(Díaz, 2012).

2.4 Importancia de los carotenoides, esteroles y tocoferoles en la nutrición.

2.4.1 Carotenoides

Los colores rojo, amarillo y naranjo en muchos vegetales son originados por la presencia de

carotenoides, pigmentos de origen vegetal que se clasifican dentro de los pigmentos liposolubles.

Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de

carbono, en su mayoría son solubles en solventes apolares, se clasifican en dos grupos: carotenos

y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrógeno (por ejemplo el ß-caroteno, el

licopeno, etc.), mientras que las xantofilas contienen además oxígeno (por ejemplo la luteína).

(Yeverino, 1997).

Los carotenoides debido a la alta conjugación de enlaces dobles presentes en sus moléculas se

descomponen por efecto de la luz, la temperatura y el aire. La luz favorece reacciones

fotoquímicas que cambian la estructura original del carotenoide (por ejemplo isomerismo cis y

trans), el calor también favorece reacciones térmicas de degradación y finalmente el aire debido

al oxígeno favorece la oxigenación de los enlaces dobles a funciones epóxido, hidroxilos y

peróxidos, entre otros (Martínez, 2003). Es debido a estas razones que la extracción de

carotenoides se debe realizar preferentemente en condiciones de ausencia de luz, a temperatura

ambiente o menor, y en ausencia de oxígeno, realizándose a partir de tejidos frescos, para evitar

la degradación por la acción conjunta de estos factores adversos.

Los carotenoides son muy utilizados como pigmentos y antioxidantes en diversos sectores

industriales, principalmente en la industria farmacéutica, nutracéutica y alimentaria. En los

últimos años se ha conducido a estimular la producción de carotenoides procedentes de

microalgas para su uso como colorantes y aditivos naturales (Mendiola 2008). Entre las




microalgas con mayor potencial para la producción de carotenoides se encuentran, Dunaliella

salina, Dunaliella viridis, Haematococcus y Chlorococcum (García, 1998).

Los carotenoides que se encuentran frecuentemente en las microalgas incluyen: astaxantina, β-

caroteno, cantaxantina, equinenona, luteína, neoxantina, violaxantina y zeaxantina.

(Abrahamsson et al., 2012). Entre las principales fuentes naturales de astaxantina está la

microalga Haematococcus pluvialis que tiene la capacidad de acumularla en altas

concentraciones (2 a 5% en base seca) (Borowitzka et al., 1991). Otro estudio realizado en

Spirulina platensis informa que contiene 5,53 mg/g de carotenoides totales dentro de los cuales

se identificaron cantaxantina, equinenona, mixoxantina y zeaxantina (Marquez et al., 1995).

2.4.2 Esteroles

Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal; y se les

encuentra en forma libre, como ésteres o como glicósidos, se caracterizan por ser sustancias

esteroideas en cuya estructura química aparece una agrupación de cuatro anillos, específica del

sistema fenantreno, portador del grupo OH en posición C-3 que le permite estar enlazado a

moléculas de ácidos grasos (Bello, 2000). La mayoría de esteroles naturales poseen una cadena

lateral de 8 a 10 átomos de carbono y un enlace doble en el C-5.

El gran interés despertado por los alimentos enriquecidos con esteroles vegetales se debe,

principalmente, a que disminuyen las concentraciones sanguíneas de colesterol, sin efectos

adversos colaterales. Por lo tanto, el aumento de la cantidad de esteroles vegetales en una

variedad de alimentos puede ser una ayuda importante en la protección de las personas con

hipercolesterolemia frente a la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares relacionadas,

causa principal de la mortalidad en las sociedades más desarrolladas (Palou et al., 2005).

En cuanto a las microalgas existen estudios que señalan que a partir de las especies Scenedesmus

obliquus y Navicula pelliculosa se obtienen esteroles precursores de la hormona cortisona,

hormona que reduce la inflamación, evitando que los glóbulos blancos (leucocitos

polimorfonucleares) viajen a la zona de inflamación del cuerpo (Molina y Morales, 2008).

Volkman et al., (1994.) estudiaron el contenido de esteroles en cinco especies de algas y

microalgas (viz. Tetraselmis chui, cordata Pyramimonas, pusilla Micromonas, Micromonas aff

pusilla. y provasolii Pycnococcus) las cuales se analizaron por cromatografía de gases y




espectrometría de masa. Los principales esteroles encontrados fueron: 24-methylcholesta-5, 24

(28)-dien-3β-ol, 24-methylcholest-5-en-3β-ol y 24-ethylcholesta-5 y 24 Methylcholest-5-en-3β-ol

entre otros.

2.4.3 Tocoferoles

Solamente los organismos fotosintéticos sintetizan tocoferoles, encontrándose presentes en

semillas oleaginosas, hojas y otras partes de plantas verdes de plantas superiores. Los tocoferoles

y tocotrienoles engloban un grupo de 8 compuestos liposolubles que reciben el nombre genérico

de vitamina E, con carácter esencial reconocido hace más de 40 años. Los tocoferoles tienen una

estructura química que consiste en dos anillos, uno fenólico y otro heterocíclico y una cadena

lateral de 16 átomos de carbono saturada. Dependiendo del número y la posición de los grupos

metilo en el anillo fenólico, estos compuestos se denominan como α-, β- γ y σ- tocoferoles (Calvo

et al., 2011). El α-tocoferol es el más abundante en la dieta y el que presenta mayor actividad

antioxidante in vivo.

La “vitamina E” es un término genérico que describe un grupo de antioxidantes que incluye los

tocoferoles y tocotrienoles. La vitamina E o α -tocoferol, presenta un gran interés debido a que es

una vitamina liposoluble que actúa como antioxidante, es decir, defiende las células reduciendo el

estrés oxidativo, estimula el sistema inmunológico y se ha comprobado que detiene el desarrollo

del Alzheimer. Además, ayuda a reducir los niveles de colesterol en la prevención de trombos en

las arterias es aún discutible (Belitz y Grosch, 1997).

El contenido de α-tocoferol en microalgas se ve afectado tanto por la fuente de nitrógeno de la

cual se alimenta y el tiempo de cosecha. Durmaz, (2007) evaluó el contenido de α-tocoferol en la

microalga Nannochloropsis oculata registrando una concentración de 2326 ± 39 mg g-1

(peso

seco), donde, además pudo predecir un aumento de la producción de α-tocoferol durante el ciclo

de vida debido a la necesidad de la microalga por obtener antioxidantes durante el proceso de

envejecimiento. Otra investigación realizada por Mendiola et al. (2008) determinaron el

contenido de α-tocoferol en Spirulina platensis, con valores que van desde 0,011 hasta 0,014 mg

de tocoferol/g Spirulina seca.




2.5 Fluidos Supercríticos (FSC) y sus propiedades

Un FSC es un material que se encuentra en condiciones de presión y temperatura por encima de

sus valores correspondientes de presión crítica (pc) y temperatura crítica (Tc). La pc es la presión

por encima de la cual el gas no condensa al disminuir la temperatura isobáricamente y la Tc es la

temperatura por encima de la cual el gas no condensa al aumentar la presión isotérmicamente (del

Valle y Aguilera, 1999). Los FSC poseen diferentes propiedades físico-químicas, entre las que

destaca: densidad, viscosidad y difusividad, las que se encuentran en rangos de valores

intermedios entre líquidos y gases (Figura 2.2); es debido a su baja viscosidad, difusividad

relativamente alta y poder solvente que los líquidos supercríticos tienen mejores propiedades de

transporte y penetrabilidad que los líquidos y, por lo tanto, pueden obtener mejores rendimientos

de extracción, por lo tanto, una de las principales características de un FSC es la posibilidad de

modificar la densidad del fluido, cambiando la presión y/o temperatura, ya que la densidad está

directamente relacionada con la solubilidad (del Valle y Aguilera, 1999), mediante la alteración

de la presión de extracción, la fuerza disolvente del fluido puede ser modificada.

Figura 2.2. Diagrama de fases que muestra la región de un FSC.




Otras ventajas, en comparación a otras técnicas de extracción, son el uso de disolventes

generalmente reconocido como seguro (GRAS), y alta eficiencia del proceso de extracción (en

términos de aumento de los rendimientos y la posibilidad de acoplamiento directo con técnicas de

análisis cromatográficas tales como cromatografía de gases (GC) o cromatografía de FSC)

(Herrero et al., 2006). En general, la EFS en lugar de extracciones tipo Sohxlet es justificada por

la reducción de los tiempos de extracción, por la selectividad que se puede llegar a obtener de

acuerdo a las condiciones de extracción y además, la eliminación de posibles compuestos que

puedan intervenir en el análisis (Mendiola, 2008).

2.6 Extracción con FSC

El CO2 es el FSC más utilizado en EFS debido a que es no tóxico, no inflamable, no corrosivo,

incoloro, no es costoso, se elimina fácilmente, no deja residuos, sus condiciones críticas son

relativamente fáciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede trabajar

a baja temperatura; por tanto, se pueden separar compuestos termo-sensibles (del Valle y

Aguilera, 1999).

En la EFS, además de seleccionar el solvente (fluido supercrítico), se deben considerar diversas

variables que influyen significativamente en la operación de extracción. Las principales variables

a tener en cuenta son: presión y temperatura que determinan la densidad del fluido, velocidad del

fluido, tamaño de partícula, humedad de la muestra, entre otros. La densidad del fluido por sobre

sus condiciones supercríticas (31,1 °C y 7,9 MPa), está estrechamente relacionada con los

cambios de presión y temperatura, debido a que un cambio en estas variables modifica su

magnitud. Estos cambios en la densidad son la base de las propiedades solventes del FSC ya que,

la densidad está ligada a la solubilidad y de este modo, la selectividad del fluido puede ser

modificada de acuerdo a los componentes que se requieran extraer. Esta propiedad hace que los

FSC sean solventes muy versátiles y que se pueden aplicar en la extracción de diversos

componentes naturales de materiales biológicos (Luque de Castro et al., 1993).

El efecto significativo de la presión sobre el rendimiento de extracción (g soluto/g sustrato seco)

se debe al aumento de la solubilidad de aceites y pigmentos carotenoides como también al

incremento del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010).




Al aumentar la temperatura permite aumentar el rendimiento de extracción debido al incremento

en la presión de vapor del soluto, aumenta la solubilidad permitiendo una mejor transferencia

desde el sustrato hacia la fase supercrítica, aumentando la velocidad de extracción (del Valle et

al., 2001). Otras variables que influyen son la humedad y el tamaño de partícula del sustrato, la

velocidad de flujo de solvente, el consumo específico de solvente. Se ha recomendado que los

sustratos posean una baja humedad, puesto que el agua reduce el poder solvente del CO2 a

condiciones supercríticas inhibiendo el contacto entre el SC-CO2 y el sustrato (Li et al., 2010).

Para conseguir una mejor velocidad de extracción y más completa posible del sustrato sólido, se

tiene que ofrecer al disolvente superficies de intercambio grandes y recorridos de difusión cortos.

Esto se puede lograr a través de la molienda de la matriz. Las muestras sólidas de diferente

granulometría deben ser molturadas para homogeneizar el tamaño de partícula, y, por ende, evitar

la variabilidad originada por la frecuente diferencia en composición de las porciones que tienen

distinto tamaño (Luque de Castro et al., 1993).

2.7 Antecedentes de extracción con SC-CO2 en microalgas.

En la Tabla 2.1 se observan algunas condiciones de las variables presión, temperatura y densidad

de CO2 que se han utilizado para extraer y analizar el aceite de diferentes microalgas. Se observa

que las temperaturas utilizadas están dentro de un rango de 40-85 ºC siendo las temperaturas

cercanas a 40 ºC las más utilizadas, ya que, en la gran mayoría se necesitan extraer componentes

termolábiles y a esta temperatura no van a ser perjudicados.

Las investigaciones expuestas utilizan diferentes rangos de presión, lo cual se debe a los

componentes que se desean extraer; por ejemplo, en el caso de Mendes et al. (2003) utilizan

presiones entre 125 y 300 bar para la extracción de hidrocarburos los cuales son altamente

volátiles y por lo tanto de menor peso molecular, en cambio, Andrich et al. (2005) utiliza un

rango de presión 550-700 bar para la extracción de lípidos, los cuales tienen un alto peso

molecular.

2.8 Aplicación industrial de FSC.

Los FSC se están utilizando a escala industrial principalmente en los sectores agroalimentario,

químico, farmacéutico, y cosmético. Entre otras aplicaciones se dirigen a la obtención de




extractos herbales a partir de plantas aromáticas, de extractos de especias para colorantes

alimentarios, aceites esenciales, etc. (Tornero, 2011).

2.8.1 Extracción de aceites esenciales

La extracción de aceites esenciales y especias con SC-CO2 es la aplicación industrial más

extendida, produciéndose más de 60.000 ton/año por esta tecnología, existiendo plantas

industriales en Europa, EEUU, Canadá, el Sudeste Asiático y Nueva Zelanda (Cocero, 2006).

En España, la empresa Solutex construyó, en el año 2004, una instalación para la producción de

alimentos funcionales mediante SC-CO2 en Mallén (Zaragoza). Esta planta dispone de

instalaciones de extracción y cromatografía en SC-CO2 produciendo 50 toneladas anuales de

EPA y DHA mediante cromatografía supercrítica a partir de aceite de pescado.

Flavex, otra destacada compañía ubicada en Rehlingen (Alemania) produce ingredientes

botánicos activos desde 1986 y en la actualidad produce más de 50 extractos obtenidos con SC-

CO2 operando con una presión máxima de diseño de 500 bar y logrando una producción anual

de 1000 toneladas. Entre los extractos obtenidos destacan: extracto de jengibre (40% aceites

Tabla 2.1. Condiciones de extracción con CO2 supercrítico utilizadas en algunas especies de algas y microalgas.

Tipo de microalga Temperatura

(°C)

Presión

(bar)

Densidad

(KgCO2/m3)

Componentes de interés

extraídos

Fuente

Haematococcus pluvialis 40-80 200−550 841,1- 897,4 Astaxantina Machmudah et al., 2006

Botryococcus braunii 40 125-300 731,5- 911,1 Hidrocarburos Mendes et al., 2003

Chlorella vulgaris 40 300 911,1 Carotenoides Palavra et al., 2011

Nannochloropsis sp 40-55 550-700 1007,5- 1009,3 Lípidos Andrich et al., 2005

Spirulina platensis

Nannoclhoropsis gaditana

Sargassum hemiphyllum

83,3

40-60

40-50

361

100-500

241-379

785,6

625,9-934,4

874,4-914,7

Vitamina E

Carotenoides y clorofila

Ácidos grasos

poliinsaturados

Mendiola et al., 2008

Macías-Sánchez et

al., 2005

Cheung et al., 1998

Arthrospira maxima 50-60 250-350 835,2-863,8 ácido γ-linolénico Mendes et al., 2006

Nannochloropsis oculata 40 250-300 880,7-911,1 Zeaxantina Liau et al., 2011

Dunaliella salina 40-60 100-500 625,9-934,4 Carotenoides y clorofilas Macías-Sánchez et

al., 2009

Ca

pítu

lo 2

. An

teceden

tes gen

erales

Efec

to d

e la d

ensid

ad

y temp

eratu

ra d

e CO

2 sob

re la ex

tracc

ión

sup

ercrítica d

e ace

ite de m

icroa

lga

(Bo

tryoco

ccu

s bra

un

ii). 12




esenciales y 30% gingeroles), extracto de romero rico en ácido carnosílico, extracto de vainilla

(10 veces más concentrado que mediante técnicas convencionales) y otros extractos como:

cúrcuma, orégano y pimienta con una producción de una tonelada al año aproximadamente

(Tornero, 2011).

2.8.2 Fraccionamiento de la grasa láctea

La grasa láctea es una mezcla de triglicéridos saturados (70%) e insaturados (30%) y contiene

también un pequeño porcentaje de colesterol. Los puntos de fusión están entre -40 y 40 °C y esto

hace que su utilización sea muy reducida. En el fraccionamiento de la grasa de leche con SC-CO2

generalmente se obtienen 3 fracciones de triglicéridos de peso molecular elevado (C54-42),

medio (C40-36) y bajo (C34-24).

Las condiciones de fraccionamiento se realizan después de mezclarlos en el extractor (en 3 o 4

separadores), reduciendo progresivamente la presión de 240 a 34 bar y aumentando gradualmente

la temperatura de 40 a 70 °C. De este modo se obtiene un producto lácteo refinado que contiene

menos colesterol, es rico en triglicéridos insaturados y antioxidantes como β-caroteno. Resulta

ser muy apreciado en leches funcionales enriquecidas, mantequillas, helados y quesos (Raventós,

2005).

2.8.3 Desalcoholización de bebidas alcohólicas

El contenido final de alcohol con EFS en estos productos oscila entre un 0,5 y un 1% en volumen

y ha tenido éxito en bebidas de bajo contenido alcohólico como cerveza, sidra, vino y licores de

aromas. El proceso de extracción del etanol de una bebida con este método se realiza

normalmente en continuo, sin tiempos muertos y con menos costes que el sistema discontinuo. Se

realiza en columnas extractoras de etapas de contacto múltiple donde se introducen, bombeados

continuamente, el SC-CO2 y la bebida alcohólica. La bebida fluye descendiendo y se pone en

contacto con la corriente ascendente del CO2. Las condiciones óptimas para la extracción del

etanol dependen del tipo de bebida, pero generalmente los valores oscilan entre los 80 y 120 bar a

temperaturas de 15 y 40 ºC (Carretero, 2012).




2.8.4 Obtención de sustancias antioxidantes a partir de microalgas.

En Chile más específicamente en la Región de Tarapacá se encuentra la empresa biotecnológica

Atacama Bio Natural products S.A., la cual utiliza SC-CO2 para extraer complejo de Astaxantina

natural a partir de oleorresinas de biomasa de microalga Haematococcus pluvialis. Esta empresa

elabora dos productos: Supreme Asta Oil y Supreme Asta Powder (Atacama Bio Natural

Products, 2012).

CAPÍTULO 3

MATERIALES Y MÉTODOS

Capítulo 3. Materiales y Métodos



CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Materiales

3.1.1 Materia prima

Se utilizó como sustrato microalga Botryococcus braunii, la cual fue proporcionada por la

Universidad de Antofagasta. Ésta viene en suspensión acuosa con 20% de sólidos totales. Fue

secada por convección con aire caliente y molida hasta obtener un diámetro de partícula menor a

1 mm. La muestra fue tamizada para trabajar con el mismo diámetro de partícula en todas las

extracciones. Finalmente, se almacenó bajo refrigeración (5 °C) hasta su posterior uso en ensayos

de extracción y análisis.

3.1.2. Equipos e instrumentos

Extractor supercrítico (Applied Separation Spe-ed SFE-2, modelo 7071, INC Allentown,

Estados Unidos)

Espectrofotómetro (Bausch & Lomb Spectronic, modelo SP-2000 UV, Estados Unidos)

Estufa rango 30-220 ºC (Electron Thermostatic Oven, modelo DHG-9037A, Japón)

Balanza analítica, sensibilidad ± 0,0001 g (Shimadzu, modelo AUX 220, Japón)

Balanza granataria (Shimadzu, modelo ELB600S, Japón)

Refrigerador (Frigidaire, modelo FRD22, China)

Cronómetro digital (Q&Q HS45, China)

Agitador tubos vortex (VELP Scientifica, Italia).

3.1.3. Material de vidrio y otros

Desecador con sílica gel

Frascos de vidrio (viales) 15 mL




Matraz aforado de 10 mL y 25 mL

Cubetas de cuarzo y vidrio

Matraz Erlenmeyer 250 mL

Pipeta total de 1, 3, 5 y10 mL

Micropipeta 10:100 μL y 100:1000 μL

Probeta de 50 mL y 100 mL

Vasos precipitados de 50, 100, 250 mL

Mortero y pistilo

3.1.4. Reactivos

CO2 99 % de pureza, AGA, Chile

Cloroformo p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania

Anhídrido acético p.a. A.C.S., Cicarelli, San Lorenzo, Argentina

Tolueno p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania

Etanol p.a. A.C.S., Merck Chemicals, Alemania

Ácido sulfúrico p.a. JT, Baker, México

Estigmasterol, 95%, Sigma, Estados Unidos.

2,2’-bipiridina, AcrosOrganics, New Jersey, Estados Unidos.

3.2 Métodos de análisis

3.2.1. Determinación de humedad

La humedad del sustrato se determinó a través del método gravimétrico (AOAC, 1990), el cual se

basa en la deshidratación de la muestra hasta peso constante mediante el secado en estufa a 105

°C. Este análisis se realizó en duplicado tanto al sustrato inicial como al agotado obtenido luego

de la extracción.




Se expresó el peso perdido por la muestra como el porcentaje de humedad en base húmeda (bh)

mediante la Ecuación (3.1).

( ) (m -mS)

m 100

Donde:

mH: masa muestra húmeda (g)

mS: masa muestra seca (g)

3.2.2. Extracción de aceites utilizando SC-CO2

Los ensayos de extracción de aceite se realizaron cargando 7 g de sustrato seco de B. braunii en

un extractor supercrítico de capacidad de 50 mL y un diámetro interno de 14 mm. Las

extracciones se realizaron bajo condiciones de extracción que combinan distintos niveles de

temperatura (41-69 °C) y densidad de CO2 (843-957 kg CO2/m3), presentadas en la Tabla 3.1.

Los extractos obtenidos se recuperaron en viales de vidrio de 60 mL de capacidad previamente

pesados para obtener la cantidad de aceite extraído por diferencia de masa entre el vial con aceite

y el vial vacío. El rendimiento de extracción de aceite se expresó como g aceite/kg sustrato seco

(Anexo B, Tabla B-1 a B-12) y el análisis del extracto consta de: concentración de carotenoides

(g car/kg aceite), concentración de esteroles (g est/kg aceite), concentración de tocoferoles (g

toc/kg aceite), rendimiento de carotenoides (mg car/kg sólido seco), rendimiento de esteroles (mg

est/kg sólido seco) y rendimiento de tocoferoles (mg toc/kg sólido seco).

3.3. Análisis del aceite

3.3.1 Contenido de carotenoides totales

El contenido de carotenoides totales se determinó por espectrofotometría UV, basado en la

metodología informada por Malaysian Palm oil Board. (2005). Las muestras de aceite obtenidas

fueron disueltas en cloroformo y a continuación fueron llevadas al espectrofotómetro UV donde

se estableció la absorbancia a una longitud de onda de 452 nm. En el Anexo D, Figura D-1 se

observa la curva de calibración del método de carotenoides totales.

(3.1)




Cd (mA) FD V

g 100

Donde:

Cd: Concentración de carotenoides totales (mg carotenoides/kg aceite)

m: pendiente de la curva patrón β-caroteno

A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 452 nm

FD: factor de dilución de la muestra

V: volumen del solvente utilizado en la preparación del extracto (mL)

g: masa de aceite analizado (g)

3.3.2 Contenido de esteroles

La concentración de esteroles se determinó a través del método espectrofotométrico informado

por Sabir et al. (2003).

Para este análisis se prepararon los siguientes reactivos:

Solución patrón de estigmasterol: Se disolvieron 10 mg de patrón estigmasterol en 10 mL

de cloroformo y luego se agitó.

Reactivo Liberman-Burchard: Se disolvieron 0,5 mL de ácido sulfúrico en 10 mL de

anhídrido acético. La solución se cubrió con papel aluminio para protegerla de la luz.

En primer lugar, se preparó una curva de calibración, adicionando a seis matraces de aforo de 10

mL la solución patrón (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 mL a cada matraz, el primero se considera como

blanco). A continuación, 2 mL del reactivo Liberman-Burchard fueron añadidos a cada matraz y

se aforaron con cloroformo a un volumen final de 10 mL. Los matraces fueron cubiertos por

papel aluminio y mantenidos en la oscuridad durante 15 min. Luego se estableció el cero de la

absorbancia del blanco a 640 nm y se midió la absorbancia de las demás soluciones, obteniéndose

de esta forma el gráfico de la curva patrón. En el Anexo D, Figura D-2 se observa la curva de

calibración de los esteroles totales.

(3.2)




Para el análisis de aceites se pesaron 100 mg de éste utilizando cloroformo como solvente. Se

tomaron 3 mL de la solución diluida y se determinó su absorbancia luego de añadir el reactivo

Liberman-Burchard mas cloroformo. La Ecuación (3.3) se utilizó para determinar el contenido de

esteroles totales presentes en el aceite.

C (mA) FD V

g 1000

Donde:

C: concentración de esteroles totales (mg esterol/kg de aceite)

m: pendiente de la curva patrón estigmasterol

A: absorbancia del aceite analizado en longitud 640 nm

FD: factor de dilución

V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL)


3.3.3 Contenido de tocoferoles

La concentración de tocoferoles totales se determinó a través de espectrofotometría UV-VIS,

usando el método colorimétrico Emmerie-Engel informado por Wong et al. (1988).

Para este análisis fue necesario preparar los siguientes reactivos:

Reactivo α- tocoferol: disolver 0,0150 g de α- tocoferol en 30 mL de tolueno y agitar.

Solución 2,2’-bipiridina: disolver 0,0700g de 2,2’-bipiridina en 100 mL de etanol-

agua (95%).

Solución FeCl3x 6H2O: disolver 0,0400 g de FeCl3*6H2O en 20 mL de etanol-agua

(95%).

En primer lugar se preparó una curva de calibración. A continuación, 3,5 mL de 2,2 fueron

añadidos a cada matraz más 0,5 mL la solución de Fe y se aforó con tolueno a volumen final de

(3.3)




10 mL. Se estableció el cero de la absorbancia del blanco a 520 nm y luego se procedió a medir

la absorbancia de las siguientes soluciones, para obtener de esta forma el gráfico de la curva

patrón observado en el Anexo D, Figura D-3.

Para el análisis de las muestras se disolvieron 0,2 g de aceite en 5 mL tolueno y se adicionaron

3,5 mL de 2,2’-bipiridina y 0,5 mL de Fe. La solución se aforó con tolueno a 10 mL y luego se

leyó a una absorbancia de 520 nm. La Ecuación (3.4) se utilizó para determinar la concentración

de trolox equivalente presente en la muestra extraída.

C (mA) V FD

g 1000

Donde:

C: concentración de Tocoferoles totales (mg tocoferoles/kg de aceite)

m: pendiente de la curva de patrón de α-tocoferol

A: absorbancia de la muestra analizada en longitud 520 nm

V: volumen del solvente utilizado en la preparación de aceite (mL)


3.4 Diseño de experimentos

3.4.1 Análisis estadístico

Se utilizó la metodología Superficie de Respuesta (MSR) que permitió evaluar el efecto de las

variables independientes temperatura codificada (X1) y densidad de CO2 codificada (X2)

(Ecuación 3.5 y 3.6 respectivamente) sobre las variables dependientes; rendimiento de extracción

de aceite (Y1), concentración de carotenoides (Y2), concentración de esteroles (Y3),

concentración de tocoferoles (Y4), rendimiento de extracción de carotenoides (Y5), rendimiento

de extracción de esteroles (Y6) y rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7).

(3.4)




10

551

TX

Donde:

T: temperatura ° C

40

9002

DX

Donde:

D: densidad (kg/m3)

Se utilizó un polinomio de segundo orden para expresar la variables respuestas como una función

de las variables independientes como sigue:

2

222

2

111211222110 XAXAXXAXAXAAY

Donde:

A0: es una constante

A1 y A2: coeficientes lineales

A12: coeficiente de interacción

A11 y A22: los coeficientes cuadráticos.

El diseño experimetal (Tabla 3.1) está basado en un diseño central compuesto rotatorio; el cual

consiste de un diseño factorial de 2 factores independientes con niveles de trabajo (-1,+1). El

diseño tiene 4 (2n) puntos experimentales y 4 (2n) puntos axiales con una distancia axial de 1,41

( = 2n/4

), y 4 replicas en el punto central (total 12 puntos de diseño). El ajuste del modelo fue

evaluado por el coeficiente de determinación R2 y mediante un análisis de varianza (ANOVA),

para estimar el efecto y significancia de las variables independientes (temperatura y densidad de

CO2) sobre las variables respuestas; rendimiento de extracción de aceite, concentración de

carotenoides, concentración de esteroles, concentración de tocoferoles, rendimiento de extracción

de carotenoides, rendimiento de extracción de esteroles y rendimiento de extracción de

(3.7)

(3.5)

(3.6)




tocoferoles en el aceite. Los coeficientes de la ecuación de segundo orden fueron estimados

usando el programa Design-Expert Versión 6.0.1 (Stat-Easy, Inc. Minneapolis, MN). La

significación estadística se basó en los criterios de error total con un nivel de confianza del 95%.

Tabla 3.1. Diseño experimental Central Compuesto Rotatorio.

Puntos de Temperatura (T) Densidad (D) X1 X2

diseño °C kg CO2/m3 ( - ) ( - )

1 45 860 -1 -1

2 65 860 1 -1

3 45 940 -1 1

4 65 940 1 1

5 41 900 -1,41 0

6 69 900 1,41 0

7 55 843 0 -1,41

8 55 957 0 1,41

9 55 900 0 0

10 55 900 0 0

11 55 900 0 0

12 55 900 0 0

CAPÍTULO 4

RESULTADOS Y DISCUSION

Capítulo 4. Resultados y discusión



CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Contenido de humedad de la muestra inicial

El contenido de humedad de la muestra inicial de microalga (Botryococcus braunii) fue 3,41 ±

0,21% (b.h) obtenido según el método gravimétrico (AOAC, 1990) (Anexo A, Tabla A-1). Según

Li et al. (2010), el agua interfiere en la eficiencia de la extracción, inhibiendo el contacto entre el

SC-CO2 y el sustrato, además, de actuar como anti-solvente y reducir la solubilidad de

carotenoides (Sun y Temelli, 2006) En este ensayo la humedad inicial del sustrato es baja y

favorable para la extracción de aceite como de carotenoides con SC-CO2.

4.2 Efecto de las variables independientes temperatura y densidad del CO2 sobre el

comportamiento de las respuestas.

Utilizando un diseño central compuesto rotatorio con dos variables independientes: temperatura

(X1) y densidad de CO2 (X2), se estudió el efecto de éstas sobre las respuestas: rendimiento de

extracción de aceite (Y1), concentración de carotenoides (Y2), concentración de esteroles (Y3),

concentración de tocoferoles (Y4), rendimiento de carotenoides (Y5), rendimiento de esteroles

(Y6) y rendimiento de tocoferoles (Y7) para, de esta forma, observar cuales son las mejores

condiciones de extracción en los rangos establecidos en el diseño estadístico utilizando el

programa Design Expert.

En la Tabla 4.1 se puede observar los valores de las respuestas antes citadas, donde Y1 presenta

valores de rendimiento que varían entre 60,9 y 84,2 (g aceite/kg SS), la respuesta Y2 presenta una

concentración de carotenoides que varía en un rango de 8,1 a 16,1 (g car/kg aceite), en cuanto a la

concentración de esteroles (Y3) presenta concentraciones comprendidas entre 15,9- 22,0 (g est/kg

aceite), la concentración de tocoferoles (Y4) se encuentra entre 16 y 17,6 (g toc/kg aceite),

mientras que el rendimiento de carotenoides (Y5) presenta valores comprendidos entre 497,4 y

1276,8 (mg car/ kg SS), en la respuesta Y6 se observan rendimientos entre 972,4 y 1676,9 (mg

est/kg SS) y finalmente, el rendimiento de tocoferoles (Y7) presenta valores que varían desde

974,5 a 1386,8 (mg toc/kg SS). El efecto de las variables se evaluará a continuación mediante la

metodología de superficie de respuesta usando la ecuación cuadrática (Ecuación 3.7) que describe

la respuesta Y en función de las variables independientes temperatura y densidad.

Tabla 4.1 Rendimiento de extracción y concentración de carotenoides, esteroles y tocoferoles con SC-CO2.

Temperatura (T,

°C)

Densidad

(D, kg / m3)

X1

( )

X2

( )

Y1

(g aceite/

kg SS)

Y2

(g car/

kg aceite)

Y3

(g est/

kg aceite)

Y 4

(g toc/

kg aceite)

Y 5

(mg car/

kg SS)

Y 6

(mg est/

kg SS)

Y7

(mg toc/

kg SS)

45 860 -1 -1 61,5

6

8,1 17,0 16,2 497,4 1044,3 993,8 65 860 1 -1 62,3

60

12,4 17,5 16,2 769,5

828,

1087,4 1009,6

45 940 -1 1 60,9 13,6 21,1 17,6 828,7

1282,0 1070,7

65 940 1 1 80,0 16,0 18,5 16,6 1276,8 1481,2 1330,2

41 900 -1,41 0 61,1 9,6 19,6 16,0 589,4 1193,4 977,9

69 900 1,41 0 84,2 14,6 15,9 16,5 1228,2 1337,1 1386,8

55 843 0 -1,41 60,9 8,8 16,0 16,0 533,1 972,4 974,5

55 957 0 1,41 76,1 16,1 22,0 17,5 1228,2 1676,9

1331,7

55 900 0 0 73,2 12,2 18,5 16,5 890,1 1353,1 1207,6

55 900 0 0 67,8 12,2 18,8 17,1 825,0 1270,8 1160,0

55

900 0 0 73,4 12,2 18,3 17,0 896,7 1340,5 1250,3

55 900 0 0 72,9 12,7 19,5 16,7 923,6 1421,5 1216,0

Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración de esteroles; Y4:

concentración tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides; Y6: rendimiento de extracción de esteroles;

Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.

Efec

to d

e la d

ensid

ad

y temp

eratu

ra d

e CO

2 sob

re la ex

tracc

ión

sup

ercrítica d

e ace

ite de m

icroa

lga

(Bo

tryoco

ccu

s bra

un

ii). 23

Ca

pítu

lo 3

.Resu

ltad

os y d

iscu

sión




4.3 Análisis estadístico

La evaluación estadística del modelo se efectuó mediante el análisis de varianza (ANOVA) el

cual permite determinar de forma analítica el comportamiento de los datos obtenidos a partir de

los ensayos de extracción. Mediante este análisis se podrá evaluar la significación y la adecuación

del modelo cuadrático propuesto (Ecuación 3.7). En la Tabla 4.2 se presentan los resultados del

análisis de varianza entregado por el programa Design Expert, versión 6.0.1.

Tabla 4.2. Tabla de análisis de varianza para el modelo cuadrático

Modelo Suma de

cuadrados

gl Cuadrado

medio

F Valor p

Y1

Regresión 663,48 5 132,7 9,5 < 0,0081

Residuo 83,81 6 13,97

Total 747,29 11

Y2

Regresión 72,12 5 14,42 170,72 < 0,0001

Residuo 0,51 6 0,084

Total 72,62 11

Y3

Regresión 34,24 5 6,85 11,36 < 0,0051

Residuo 3,62 6 0,6

Total 37,85 11

Y4

Regresión 2,64 5 0,53 5,30 < 0,0330

Residuo 0,60 6 0,10

Total 3,24 11

Y5

Regresión 7,53E+5 5 1,5E+5 51,97 < 0,0001

Residuo 12156,94 6 2900,14

Total 7,7E+5 11

Y6

Regresión 3,86E+5 5 77253,23 12,05 < 0,0044

Residuo 38459,13 6 6409,86

Total 4.2E+5 11

Y7

Regresión 2,2E5 5 44650,70 10,31 < 0,0066

Residuo 25982,21 6 4330,37

Total 2,4E+5 11

Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración

de esteroles; Y4: concentración de tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides;

Y6: rendimiento de extracción de esteroles; Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles.




En la Tabla 4.2 se puede observar los valores F para cada modelo de regresión. Para la respuesta

Y1 el valor de F es 9,5 lo que indica que el modelo utilizado es significativo ya que presenta un

valor p≤0,01. El valor p es el nivel de significancia observado en el modelo, cuanto más pequeño

sea su valor mayor será la evidencia para rechazar la hipótesis nula (H0), en este caso H0 indica

que el modelo utilizado no es apropiado para predecir el comportamiento de la respuesta en

función de las variables en estudio. Para la respuesta Y1 existe menos del 1 % de cometer un error

tipo I, es decir, rechazar una hipótesis nula cuando es cierta, en esta ocasión es improbable, por lo

tanto, se rechaza H0, y se establece que el modelo es adecuado. Esta situación se repite para las

respuestas Y2, Y3, Y5, Y6, Y7, lo cual indica que el modelo es significativo para predecir el

comportamiento de estas respuestas en función de las variables no codificadas temperatura de

extracción y densidad de CO2. La respuesta Y4 (concentración de tocoferoles), presenta un valor

p<0,033 lo que indica que existe una probabilidad menor 0,05 que el modelo pueda fallar debido

a perturbaciones experimentales.

En la Tabla 4.3 se observan los indicadores estadísticos para cada una de las respuestas, donde se

encuentran los valores del modelo (F), razón señal/ruido, coeficiente de variación, coeficiente de

determinación (R2) y falta de ajuste. El coeficiente de determinación R

2, indica la contribución de

todos los componentes de la ecuación a la respuesta, para Y1 es de 0,89, lo que quiere decir que el

89% del rendimiento de extracción de aceite está explicado por el modelo representado en la

ecuación. Este valor, al ser alto, le confiere validez al modelo obtenido, el 11% restante es la

contribución del error a la respuesta. Para las demás respuestas, el indicador R2 se encuentra

alrededor de 0,90 lo cual señala que el comportamiento de éstas está explicado adecuadamente

por las variables independientes involucradas en la ecuación cuadrática. En cuanto a la razón

señal/ruido estas presentan un valor mayor a 4 lo que indica que las respuestas obtenidas tienen

robustez y son de calidad, siendo consistentes en el tiempo sin importar las fuentes de ruido que

pueden comprometer su calidad.

Otro de los indicadores estadísticos que pueden observarse en la Tabla 4.3 es la falta de ajuste, la

cual no resultó significativa (p≥0,05) para ninguna de las respuestas, esto debido a que no existen

grandes diferencias entre el valor experimental y el valor predicho como se puede observar en el

Anexo E, (Figura E-1 a E-7), no se observa una alta dispersión de los datos.




Tabla 4.3. Indicadores estadísticos para el modelo de superficie de respuesta

Indicadores

estadísticos

Variable respuesta

Y1 (g /

kg SS)

Y2 (g car /

kg aceite)

Y3(g est /

kg aceite)

Y4 (g toc/

kg aceite)

Y5(mg car/

kg SS)

Y6 (mg est/

kg SS)

Y7 (mg toc/

kg SS)

F 9,50* 170,72* 11,36* 5,30* 51,97* 12,05* 10,31*

R2 0,89 0,99 0,90 0,82 0,97 0,91 0,91

Falta de

ajuste 61,93

ns 0,34

ns 2,78

ns 0,35

ns 12156,9

ns 26980,0

ns 21821,6

ns

Señal/ruido 9,4 40,4 9,6 7,5 22,6 10,2 9,8

CV 5,38 2,35 4,19 1,89 6,16 6,21 5,68

Y1: rendimiento de extracción de aceite; Y2: concentración de carotenoides; Y3: concentración de esteroles;

Y4: concentración de tocoferoles; Y5: rendimiento de extracción de carotenoides; Y6: rendimiento de

extracción de esteroles; Y7: rendimiento de extracción de tocoferoles; CV: coeficiente de variación;*

significativo p≤0,05* Significante (p≤0,01); ** Significante (p≤0,05); y ns

No-significante (p≥0,05).

En base a los resultados estadísticos obtenidos, el modelo cuadrático resulta adecuado y permite

utilizar las superficies de respuesta para analizar el efecto de las variables independientes

temperatura de extracción y densidad del CO2 sobre cada una de las respuestas en estudio.

4.3.1. Análisis del rendimiento de extracción de aceite

Para la respuesta rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii (Y1), se obtuvo la

Ecuación 4.1 que indica la relación causa/efecto que existe con las variables independientes

(temperatura de extracción y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se

indican con (*).

1 71,82+ *6,56 (T-55

10)+ *4,83 (

D-900

40) -0,71 (

T-55

10)2

-2,76 (D-900

40)2

+ *4,57 (T-55

10) (

D-900

40) (4.1)

A partir de la Ecuación 4.1 y el análisis de varianza para la contribución de cada término presente

en la ecuación polinómica (Anexo E, Tabla E-1), se puede observar que el rendimiento de

extracción de aceite fue afectado significativamente (p≤0,05) por los componentes lineales de

temperatura y densidad y la interacción de ambos componentes con un 45,9%, 24,8% y 11,2% de

contribución en la respuesta, respectivamente. Esto se observa en la Figura 4.1, donde el efecto

positivo de la temperatura se ve a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se observa a




alta temperatura. Los coeficientes de las variables lineales y la interacción de éstas fueron

significativos y positivos existiendo una relación directamente proporcional a condiciones de

densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C) aproximadamente.

Figura 4.1 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de aceite (Y1) como función de

la temperatura (ºC) y densidad (kg CO2/m3).

En la Figura 4.1 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en la zona de

alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo al modelo cuadrático,

el mejor rendimiento de extracción de aceite fue 90,0 g aceite/kg SS, obtenido a 69 °C y 957 kg

CO2/m3. Además, se observa una mayor pendiente para la variable temperatura, representando

gráficamente el mayor % de contribución a la respuesta. Finalmente, la Figura 4.1, muestra que el

menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas entre 41 y 48°C en el rango de

densidades de 843 a 872 kg CO2/m3, de acuerdo al modelo cuadrático el valor fue 53,0 kg

aceite/kg SS.

53

63

72

81

90

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957

Temperatura (°C) Densidad (kg CO2/m3)




4.3.2 Análisis de concentración de carotenoides

Para la respuesta concentración de carotenoides (Y2) se obtuvo la ecuación polinómica (4.2), la

cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes

temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se

indican con (*).

2 12,30+ 1,7 (T-55

10)+ 2,45 (

D-900

40) -0,036 (

T-55

10)2

+0,13 (D-900

40)2

- 0,47 (T-55

10) (

D-900

40) (4.2)

Del análisis de varianza (Anexo E, Tabla E-2) se establece que la concentración de carotenoides

(Y2) fue afectada principalmente por el componente lineal densidad de CO2 con un 65,9% de

contribución en la respuesta, también influyó significativamente (p≤0,05) el componente lineal

temperatura con un 32,0% y finalmente la interacción de los componentes temperatura y

densidad de CO2 influyó un 1,2% en la concentración de carotenoides en el aceite extraído. Se

puede decir entonces, que estos tres componentes explican en un 99,2% la respuesta Y2. En la

Ecuación 4.2 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que

indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO2

sobre la concentración de carotenoides (Y2), es decir, a medida que aumenta la densidad a

temperatura constante, se produce un aumento en la concentración de carotenoides (Y2), como se

observa en la Figura 4.2, la superficie sigue esta tendencia presentando una mayor concentración

en condiciones sobre el punto central (55°C y 900 kg CO2/m3).

A partir de la Ecuación 4.2 se obtuvo la superficie de respuesta observada en la Figura 4.2, donde

se ve un comportamiento lineal de la respuesta, presentando una mayor pendiente la variable

densidad de CO2, lo que gráficamente representa la contribución que realiza esta variable a la

respuesta. De acuerdo a los valores entregados por el modelo cuadrático la mayor concentración

de carotenoides es 17,0 g car/kg aceite encontrada a una temperatura de 69 °C y una densidad de

957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentración de carotenoides presenta un valor de 6,0 g

car/kg aceite a una temperatura de 42 °C y densidad de 843 kg CO2/m3.




Figura 4.2 Superficie de respuesta de la concentración de carotenoides (Y2) como función de la

temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).

4.3.3 Análisis de concentración de esteroles

Los valores experimentales de la concentración de esteroles se ajustaron a un modelo cuadrático

con la finalidad de generar la Ecuación 4.3 que indica la relación causa/efecto que existe con las

variables independientes (temperatura y densidad de CO2) donde los coeficientes significativos

(p≤0,05) se indican con (*).

3 18,76 - 0,90 (T-55

10)+ 1,71 (

D-900

40) - 0,48 (

T-55

10)2

+0,16 (D-900

40)2

- 0,76 (T-55

10) (

D-900

40) (4.3)

A partir del análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite (Anexo E, Tabla

E-3) y al analizar la Ecuación 4.3, se observa que la variable lineal densidad de CO2 influye

significativamente (p≤0,05) en la respuesta contribuyendo un 62,6%, presentando un coeficiente

de signo positivo lo que indica una relación directamente proporcional a la respuesta (Y3) a bajas

temperaturas. Otro de los factores que influyó significativamente en la respuesta (Y3) es la

Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C)

6

9

12

14

17

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957




variable lineal temperatura aportando un 17,4% a la respuesta, su coeficiente es negativo lo que

indica una relación indirecta entre temperatura y concentración de esteroles, este comportamiento

se observa en la Figura 4.3 donde, a medida que aumenta la temperatura a densidad de CO2

constante, la concentración de esteroles disminuye.

Figura 4.3 Superficie de respuesta de la concentración de esteroles (Y3) como función de la


En la Figura 4.3 se observa una mayor concentración de esteroles a temperaturas entre 41 a 48 °C

y densidad de CO2 entre 929 y 957 kg CO2/m3 y de acuerdo al valor entregado por el modelo

cuadrático la mayor concentración es 23,0 g esteroles/ kg aceite, a su vez la menor concentración

de esteroles presenta un valor de 15,0 g esteroles /kg aceite a una temperatura de 69 °C y

densidad de 860 kg CO2/m3.

15

17

19

21

23

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957





4.3.4 Análisis de concentración de tocoferoles

Para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4) se obtuvo la ecuación polinómica (4.4), la

cual indica la relación causa/efecto que existe entre la respuesta y las variables independientes

temperatura de extracción y densidad de CO2 donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se

indican con (*).

4 16,83-0,03 (T-55

10)+ 0,49 (

D-900

40) - *0,25 (

T-55

10)2

-3,12 10-3 (D-900

40)2

-0,25 (T-55

10) (

D-900

40) (4.4)

El análisis de varianza para la concentración de tocoferoles (Anexo E, Tabla E-4) y la Ecuación

4.4 indican que la respuesta fue afectada significativamente (p≤0,05) por la variable lineal

densidad de CO2 y la variable cuadrática temperatura de extracción, presentando una

contribución de 60,4% y 12,7% respectivamente. Al observar los signos que acompañan los

coeficientes, en el caso de la variable lineal densidad es positivo y su comportamiento se puede

observar en la Figura 4.4 donde a valores de temperatura bajo el punto central (55 °C) se observa

un comportamiento directamente proporcional a la respuesta (Y4). Mientras que el signo negativo

que acompaña el coeficiente de la variable cuadrática temperatura indica que dentro de un rango

de trabajo, desde una determinada temperatura la concentración de tocoferoles disminuye al

aumentar esta variable, presentándose un máximo en la respuesta lo que se observa en la Figura

4.4.

En la Figura 4.4 se observa que a valores bajos de densidad de CO2 la concentración de

tocoferoles aumenta a medida que aumenta la temperatura, mientras que a valores altos de

densidad de CO2, la concentración de tocoferoles disminuye con el aumento de la temperatura.

Este comportamiento explica porque el componente cuadrático de la variable temperatura es

negativo y significativo (p≤0,05). De acuerdo al valor entregado por el modelo cuadrático, la

mayor concentración de tocoferoles es 18,0 g tocoferoles/ kg aceite observada a condiciones de

41 °C y 957 kg CO2/m3, a su vez la menor concentración de tocoferoles presenta un valor de 15,0

g tocoferoles/ kg aceite a una temperatura de 41 °C y densidad de 843 kg CO2/m3




Figura 4.4 Superficie de respuesta de la concentración de tocoferoles (Y4) como función de la


4.3.5 Análisis de rendimiento de extracción de carotenoides

Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de

extracción de carotenoides en el aceite. La Ecuación 4.5 indica la relación causa/efecto que existe

entre la respuesta rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) y las variables independientes

temperatura y densidad de CO2, donde los coeficientes significativos (p≤0,05) se indican con (*).

5 883,85+ *202,99 (T-55

10) + *227,71 (

D-900

40) -0,40 (

T-55

10)2

-14,53 (D-900

40)2

+43,99 (T-55

10) (

D-900

40) (4.5)


15

16

16

17

18

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957




El análisis de varianza realizado para el rendimiento de extracción de carotenoides en el aceite

(Anexo E, Tabla E-5) y la ecuación polinómica (4.5) indican que la respuesta (Y5) fue afectada

significativamente (p≤0,05) por los componentes lineales densidad de CO2 y temperatura de

extracción presentando una contribución a la respuesta de 53,8% y 42,8% respectivamente. En la

Ecuación 4.5 se observa que el signo de los coeficientes de ambas variables es positivo, lo que

indica una relación directamente proporcional de la temperatura de extracción y densidad de CO2

sobre el rendimiento de extracción de carotenoides (Y5), es decir, a medida que aumenta la

densidad a temperatura constante, se produce un aumento en el rendimiento de extracción de

carotenoides (Y5), como se observa en la Figura 4.5, la superficie sigue esta tendencia

presentando un mayor rendimiento en condiciones sobre el punto central (55 °C y 900 kg

CO2/m3).

En la Figura 4.5 se observa un comportamiento lineal de la superficie de respuesta y según los

valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento es 1550,0 mg car/kg SS

obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3, a su vez, el menor rendimiento de extracción de carotenoides

es 333,0 mg car/kg SS, encontrado a 41 °C y 843 kg CO2/m3.

Figura 4.5. Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de carotenoides (Y5) como

función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3)

333

637

941

1246

1550

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957

Densidad (kg CO2/m3) Temperatura (°C)




4.3.6 Rendimiento de extracción de esteroles

Del análisis estadístico se obtuvieron las variables significativas para el rendimiento de

extracción de esteroles en el aceite. Los coeficientes significativos (p≤0,05) indicados con (*) se

observan en la Ecuación 4.6, ecuación polinómica que indica la relación causa/efecto que existe

entre la respuesta rendimiento de extracción de esteroles (Y6) y las variables independientes

temperatura y densidad de CO2.

6 1347,22+55,68 (T-55

10)+ 203,48 (

D-900

40) -58,81 (

T-55

10)2

-29,09 (D-900

40)2

+39,03 (T-55

10) (

D-900

40) (4.6)

Del análisis de varianza (Anexo E, Tabla E-6) y al observar la Ecuación 4.6 se establece que el

rendimiento de extracción de esteroles (Y6) fue afectado mayoritariamente por el componente

lineal densidad de CO2 con un 77,4% de contribución, presentando un coeficiente positivo el cual

indica un comportamiento directamente proporcional a la respuesta, lo que quiere decir que a

medida que la densidad de CO2 aumenta a temperatura constante el rendimiento de extracción de

esteroles aumenta, esta situación se puede observar en la Figura 4.6 tanto a bajas como a altas

temperaturas de extracción.

En la Figura 4.6 se observa que el mayor rendimiento de extracción se encuentra en condiciones

sobre el punto central (55 °C y 900 kg CO2/m3) presentando un valor de 1631,0 mg est/ kg SS,

además, el modelo cuadrático señala que el menor rendimiento de esteroles es 883,0 mg est/ kg

SS observado a 41°C y 843 kg CO2/m3.




Figura 4.6. Superficie de respuesta de la rendimiento de extracción esteroles (Y6) como función

de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).

4.3.7 Rendimiento de extracción de tocoferoles

A partir del análisis de varianza (ANOVA) desarrollado para el rendimiento de extracción de

tocoferoles (Anexo E, Tabla E-7) se observa que las variables de los componentes lineales

temperatura de extracción y densidad de CO2 influyen significativamente (p<0,05) en la

respuesta Y7 aportando un 36,2% y un 40,4% respectivamente.

Los valores experimentales del rendimiento de extracción de tocoferoles, se ajustaron a un

modelo cuadrático con la finalidad de generar la Ecuación 4.7 que indica la relación causa/efecto

que existe con las variables independientes (temperatura de extracción y densidad de CO2).

7 1208,47+ *106,70 (T-55

10)+ *112,83 (

D-900

40) -29,74 (

T-55

10)2

-44,34 (D-900

40)2

+60,94 (T-55

10) (

D-900

40) (4.7)

Densidad (kg CO2/m3)

Temperatura (°C)

883

1070

1257

1444

1631

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957




En la Ecuación 4.7 se observa el signo positivo que acompaña los coeficientes lineales

temperatura de extracción y densidad de CO2 lo que se ve en la Figura 4.7, donde el efecto

positivo de la temperatura se observa a alta densidad y el efecto positivo de la densidad se

observa a alta temperatura existiendo una relación directamente proporcional que se observa solo

a condiciones de densidad y temperatura sobre el punto central (900 kg CO2/m3 y 55 °C)

aproximadamente.

Figura 4.7 Superficie de respuesta del rendimiento de extracción de tocoferoles (Y7) como

función de la temperatura (°C) y densidad (kg CO2/m3).

En la Figura 4.7 se observa que el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se encuentra

en la zona de alta temperatura de extracción y alta densidad de CO2, ya que, de acuerdo a los

valores entregados por el modelo cuadrático el mejor rendimiento de extracción fue 1492,0 mg

toc/kg SS, obtenido a 69 °C y 957 kg CO2/m3. Finalmente, a partir de la Figura 4.7, también se

puede ver que el menor rendimiento de extracción se encuentra a temperaturas de 41 a 48 °C en

Temperatura (°C) Densidad (kgCO2/m3)

872

1027

1182

1337

1492

41

48

55

62

69

843

872

900

929

957




un rango de densidades de 843 a 872 kg CO2/m3 y de acuerdo al modelo cuadrático fue 872,0 mg

toc/kg SS.

4.4 Discusión general

Existen muchos factores que pueden influenciar el rendimiento de extracción supercrítica, estos

pueden ser: humedad del sustrato, presión de CO2, temperatura de extracción, tamaño de

partícula, densidad del CO2 entre otras. En este caso, se estudia el efecto de la temperatura de

extracción y densidad del CO2 sobre el rendimiento de extracción de aceite de la microalga

(Botryococcus braunii), donde, de acuerdo a los resultados presentados en la Tabla 4.1 existe

relación entre estas variables y cada una de las respuestas en estudio, observando un efecto

significativo de la temperatura sobre el rendimiento de extracción encontrando el mayor a una

temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3 lo cual concuerda con Maróstica et al.

(2010) que señalan que el aumento de la temperatura acelera la transferencia de masa,

aumentando la presión de vapor de los compuestos extractables y mejorando el rendimiento de

extracción.

Maróstica et al. (2010), indican que la solubilidad de los solutos está influenciada claramente por

dos factores: la densidad del SC-CO2, que aumenta con la presión trabajando a temperaturas

constantes, y la presión de vapor de los solutos, la cual aumenta por el incremento de la

temperatura, es decir, la solubilidad de los solutos cambiará de acuerdo al factor más

predominante.

En cuanto al contenido de aceite de microalga Botryococcus braunii, Antilaf (2011), extrajo

aceite a condiciones de 40 °C y 911,1 kg CO2/m3 logrando un rendimiento de 86,3 g aceite/ kg

SS, rendimiento similar al obtenido en esta investigación. Por otro lado, estudios realizados por

Chen y Walker (2012), lograron el mayor rendimiento de extracción de aceite de microalga

Chlorella protothecoides a condiciones de 50 °C y 900 kg CO2/m3, condiciones de extracción

dentro de nuestro rango de estudio, mientras que, Andrich et al. (2005), extrajo aceite a partir de

la microalga Nannochloropsis sp., obteniendo el mayor rendimiento (118,04 g aceite/kg SS) a 55

ºC de temperatura y una densidad de 1000 kg CO2/m3. Como se puede observar la densidad es

mayor a la utilizada en esta investigación y por ende el rendimiento de extracción también es

mayor. Este hecho se debe a la alta presión del solvente lo que genera una menor distancia entre




las moléculas provocando un aumento en la solubilidad del aceite como también un incremento

del poder solvente del SC-CO2 (Li et al., 2010).

Cabe mencionar que el aceite obtenido de microalgas y de otros sustratos en general se extrae

como mezcla de varias fracciones de lípidos, en el caso de B. braunii, Fang et al. (2004)

determinó que un 55,4% del extracto corresponde a ácidos grasos como ácido oleico, palmítico,

linoleico entre otros.

Los mejores resultados, en términos de rendimiento de extracción de carotenoides, se obtuvieron

trabajando con las densidades de CO2 más altas (sobre 900 kg CO2/m3), con valores superiores a

1500 mg car/ kgSS. Esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por

el empleo de elevadas densidades de CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Ibañez et

al., 1998).

Los carotenoides son pigmentos termolábiles y fotodegradables cuyas propiedades antioxidantes

están ampliamente estudiadas y para los que la extracción con CO2 supercrítico ha sido

ampliamente utilizada. Debido a la baja polaridad de estos compuestos y a la alta selectividad de

este método se ha llegado a calificar la extracción con fluidos supercríticos como “el método más

apropiado para la obtención de ácidos grasos, pigmentos, etc., a partir de biomasa de microalgas”

(Careri et al., 2001).

En el proceso de extracción de carotenoides tanto la densidad de SC-CO2 como la temperatura de

extracción influyeron significativamente en el rendimiento de carotenoides, logrando el mayor

rendimiento por sobre los 55 ºC y densidades sobre los 900 kg CO2/m3, resultados similares a la

investigación realizada por Macías-Sánchez et al. (2010), quienes utilizaron extracción con SC-

CO2, en la microalga S. almeriensis trabajando a temperaturas entre 32 y 60 ºC, densidades de

882 a 957 kg CO2/m3, obteniendo los mejores rendimientos de carotenoides a condiciones de

trabajo de 60 ºC, 890 kg CO2/m3. Por otro lado, los resultados obtenidos por Macias-Sánchez et

al. (2005), en Nannoclhoropsis gaditana utilizando SC-CO2 indican que a temperaturas de 60 ºC

y densidad de 890 kg CO2/m3 se obtiene el mayor rendimiento en la extracción de carotenoides,

esto puede ser debido a que la extracción de carotenoides está favorecida por el empleo de

elevadas densidades del CO2 cuando se trabaja en intervalos supercríticos (Favati et al., 1998).

Mendiola (2008) señala que a pesar de que en el rendimiento de extracción de carotenoides se

debe tener en cuenta la presencia de otros compuestos en el extracto, el rendimiento de




carotenoides tiene una relación directa con el total del aceite extraído. Esta relación se refleja en

los resultados obtenidos en esta investigación, ya que, el mayor rendimiento de carotenoides y el

mayor rendimiento de aceite se obtuvieron a las mismas condiciones (69 °C y 957 kg CO2/m3).

En cuanto al rendimiento de extracción de tocoferoles tanto la densidad de CO2 como la

temperatura de extracción influyeron significativamente p≥ 0,05 sobre el rendimiento. Estos

resultados coinciden con la aseveración de que los tocoferoles son compuestos fácilmente

extraíbles, dado que la temperatura afecta positivamente su extracción (King et al., 1996), por

tanto, es lógico pensar que el rendimiento estará favorecido a elevadas temperaturas. Otro estudio

realizado por Mendiola (2008) en extractos de Spirulina también concuerda con lo anteriormente

descrito, obteniendo el mayor rendimiento a condiciones máximas de temperatura (83 °C).

Finalmente, en este estudio el mayor rendimiento de extracción de tocoferoles se obtuvo a la

máxima temperatura del rango de trabajo (69 °C).

La velocidad de extracción de aceite de microalga Botryococcus braunii se puede observar en el

Anexo C, (Figua C-1 a C-12) donde se ven claramente dos fases predominantes en las curvas del

modelo de extracción. En la primera fase se observa una velocidad de extracción rápida durante

los primeros 10 minutos, esto ocurre debido a que en esta fase se encuentra todo el aceite

disponible para la extracción, luego se observa que la tasa de extracción va disminuyendo (fase

de transición), durante esta fase, una gran proporción del aceite ha sido extraído lo que

gráficamente se representa por una asíntota. Este comportamiento indica que el proceso sería

controlado por la transferencia de masa (difusión del CO2 al interior de la matriz vegetal y

difusión del CO2 mas el aceite desde el interior de las partículas hacia la superficie) (Macías-

Sánchez et al., 2009) Finalmente, a condiciones de 69 °C y 900 kg CO2/m3

(finalizada la

extracción) se obtuvo el mayor rendimiento. .

CAPÍTULO 5

CONCLUSIONES

Capítulo 5. Conclusiones



CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES

La temperatura y la densidad de CO2 afectaron significativamente (p≤0,05) el rendimiento

de extracción de aceite de microalga (B. braunii), explicando su comportamiento en un

89,0%, siendo la temperatura de extracción la variable que más afectó con un 46,4%, El

mayor rendimiento de extracción de aceite se obtuvo a 69 °C, con una densidad de 957

kg CO2/m3.

El comportamiento del rendimiento de extracción de carotenoides fue explicado en un

82,0% por las variables en estudio, siendo la densidad de CO2 la variable que más afectó

con un 53,9%, seguido por la temperatura con un 42,8%.

La densidad del CO2 afectó significativamente (p≤0,05) la concentración de carotenoides

en el extracto con un 66,1% de contribución seguido por el 32,0% de influencia de

temperatura. La mayor concentración de carotenoides fue 17,0 g car/kg aceite registrada a

una temperatura de 69 °C y una densidad de 957 kg CO2/m3.

La concentración de esteroles y tocoferoles en el extracto fueron afectadas

significativamente (p≤0,05) por las 2 variables en estudio, siendo la densidad del CO2 la

variable que más contribuyó a la respuesta con un 62,6% y un 60,4% respectivamente.

El aceite obtenido bajo condiciones seleccionadas (55 °C, 900 kg CO2/m3) presentó un

contenido de esteroles totales de 18,8 g esterol/kg aceite, un contenido de carotenoides de

12,2 g car/kg aceite y un contenido de tocoferoles totales de 16,8 g toc/kg aceite.

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

Efecto de la densidad y la temperatura de CO2 sobre la extracción de aceite de microalga (Botryococcus

braunii). 43

BIBLIOGRAFÍA

Abrahamsson, V., Rodríguez-Meizoso, I., Turner, T. (2012). “Determination of carotenoids

in microalgae using supercritical fluid extraction and chromatography”. Journal of

Chromatography A., 1250: 63-68.

Ahlgren, G., Gustafsson, I., Boberg, M. (1992). “Fatty acid content and chemical composition

of freshwater microalgae”. Journal of Phycology, 28: 37-50.

Andrich, G., Nesti, U., Venturi, F., Zinnai, A., Fiorentini, R. (2005). “Supercritical fluid

extraction of bioactive lipids from the microalga Nannochloropsis sp”. European Journal of.

Lipid Science and Technology, 107: 381-386.

Antilaf, I. (2011). “Estudio de ruptura celular de microalga (Botryococcus braunii) usando

CO2 supercrítico”. Trabajo para optar al título de Ingeniero en Alimentos. Universidad de La

Frontera, Temuco.

AOAC (1990). “Oficial Methods of Analysis of the Association of Official analytical

Chemists”. 15 th edition, Washington DC, USA.

Atacama Bio Natural Products S.A. http://www.atacamabionatural.com/spanish/index.html.

Chile. Visitada el 20 de Julio de 2012.

Balker, A., Marine, Estuarine, Freshwater. http://cfb.unh.edu/phycokey/phycokey.htm.

EE.UU. Visitada el 10 de Marzo de 2013.

Belitz, H., Grosch, W. (1997). “Química de los Alimentos”.2da

Ed. Editorial Acribia S. A.,

Zaragoza.

Bello, J. (2000). “Ciencia bromatológica”. 1era

Ed., Ediciones Días de Santos S.A., Madrid.

Borowitzka, M., Huisman, J., Osborn, A. (1991). Culture of the astaxantin-producing green

alga Haematococcus pluvialis. I. Effects of nutrients on growth and cell type. Journal of

Applied Phycology, 3: 295-304.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967312008011

Bibliografía


braunii). 44

Bruton, T., Lyons, H., Lerat, Y., Stanley, M., Rasmussen, M. (2009). “A Review of the

Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland”. Sustainable Energy Ireland.

Calvo, S., Gómez, C., López, C., Royo, M. (2011). “Nutrición, salud y alimentos

funcionales”. 1era Ed., Universidad Nacional de Educación a Distancia, Madrid.

Careri, M.; Furlattini, L.; Mangia, A.; Musci, M.; Anklam, E.; Theobald, A., Von Holst, C.

(2001). “Supercritical fluid extraction for liquid chromatographic determination of

carotenoids in Spirulina Pacifica algae: a chemometric approach”. Journal of

Chromatography A., 912: 61-71.

Carretero, F. Proceso de fabricación de bebidas alcohólicas.

http://es.scribd.com/doc/95692320/93/Extraccion-del-lupulo. Visitada el 22 de Agosto de

2012.

Cheng, Y., Walker, T. (2012). “Fed-batch fermentation and supercritical fluid extraction of

heterotrophic microalgal Chlorella protothecoides lipids”. Bioresource Technonogy,. 114:

512-517.

Cheung, P., Leung, A., Ang, P. (1998). “Comparison of supercritical carbon dioxide and

Soxhlet extraction of lipids from a brown seaweed, Sargassum hemiphyllum (Turn)”. Journal

of Agricultural and Food Chemistry, 46:4228-4232.

Cocero, M. (2006). “Procesos comerciales de extracción con fluidos supercríticos”. Dpto.

Ingeniería Química y Tecnología del Medio Ambiente. Universidad de Valladolid.

Dayananda, C., Sarada, R., Kumar, V., Ravishancar, G. (2007). “Isolation and

characterization of hydrocarbon producing green alga Botryococcus braunii from Indian

freshwater bodies”. Electronic Journal of Biotechnology, 10: 78-91.

del Valle, J. y Aguilera, J. (1999). “Revisión: Extracción con CO2 a alta presión.

Fundamentos y aplicaciones en la industria de alimentos”. Food Science and Technology

International, 5: 124.

Bibliografía


braunii). 45

del Valle, J., Germain, J., Uquiche, E., Zetzl, C., Brunner, G. (2001). “Microstructural effects

on internal mass transfer of lipids in prepressed and flaked vegetable substrates”. Journal of

Supercritical Fluids, 37: 178-190.

Díaz, K. (2012). “Biotecnología de microalgas como fuente de diversos compuestos de

interés para la industria farmacéutica y alimentaria”. Vitae, 19: s76-s77.

Dorval, N., Parisien, A., Wang, B., Lan, C. (2009). “Enhancement of lipid production using

biochemical, genetic and transcription factor engineering approaches”. Journal of

Biotechnology, 141: 31-41.

Durmaz, . (2007). “Vitamin E (α-tocopherol) production by the marine microalgae

Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) in nitrogen limitation”. Aquaculture. 272: 717-

722.

Fang, Y., Chiu, H., Wu, J., Chiang Y., Hsu, S. (2004). “Fatty acids in Botryococcus braunii

accelerate topical delivery of flurbiprofen into and across skin”. International Journal of

Pharmaceutics, 276: 163-173.

Favati, F., King, J., Friedrich, J., Eskins, K. (1998). “Supercritical CO2 extraction of carotene

and lutein from leaf protein concentrates”. Journal of Food Science. 53: 1532- 1536.

García, D. (1998). “Productos biotecnológicos de microalgas marinas. Trabajo para optar al

grado de doctor en acuicultura. Universidad de Santiago de Compostela. Galicia.

Herrero, M., Cifuentes, A., Ibañez E. (2006). “Sub- and supercritical fluid extraction of

functional ingredients from different natural sources: Plants, food-by-products, algae and

microalgae”. Food Chemitry, 98: 136-148.

Ibañez, E., López-Sebastián, S., Tabera, J. & Reglero, G. (1998). “Separation of carotenoids

by subcritical fluid chromatography with coated, packed capillary columns and neat carbon

dioxide”. Journal of Chromatography A., 823: 313-319.

King, J., Favati, F., Taylor, S. (1996). “Production of tocopherol concentrates by supercritical

fluid extraction and chromatography”. Separation Science. and Technology, 31: 1843-1857.

Bibliografía


braunii). 46

Li, Q., Du, W., Liu, D. (2008). “Perspectives of microbial oils for biodiesel production”.

Applied Microbiology and Biotechnology. 80: 749-756.

Li, H., Wu, J., Rempel, C., Thiyam, U. (2010). “Effect of operating parameters on oil and

phenolic extraction using supercritical CO2”. Journal of the American Oil Chemistry Society,

87: 1081-1089.

Liau, B., Hong, S., Chang, L., Shen, C., Li, A., Wu, Y., Jong, T., Shieh, C., Hsu, S., Chang,

C. (2011). “Separation of sight-protecting zeaxanthin from Nannochloropsis oculata by using

supercritical fluids extraction coupled with elution chromatography”. Separation and

Purification Technology, 78: 1-8.

Loera-Quezada, M., Olguín, E. (2010). “Las microalgas oleaginosas como fuente de

biodiesel: retos y oportunidades”. Rev. Latinoamericana Biotechnology Ambienta Algal, 1:

91-116.

Luque de Castro, M., Valcarcel, M., Tena, M. (1993). “Extracción con fluidos supercríticos

en el proceso analítico”. Editorial Reverte S.A., Madrid.

Machmudah, S., Shotipruk, A., Goto, M., Sasaki, M., Hirose, T. (2006). “Extraction of

Astaxanthin from Haematococcus pluvialis using supercritical CO2 and ethanol as entrainer”.

Industrial Engineering Chemistry Reserch, 45: 3652-3657.

Macías-Sánchez, M., Mantell, C., Rodríguez, M., Martínez, E., Lubián, L., Montero, O.

(2005). “Extraction of carotenoids and chlorophyll from microalgae with supercritical carbón

dioxide and ethanol as co-solvent”. Journal of Separation Science, 31: 1352-1362.

Macías-Sánchez, M., Mantell, C., Rodríguez, M., Martínez, E., Lubián, L., Montero, O.

(2009). “Comparison of supercritical fluid and ultrasound-assisted extraction of carotenoids

and chlorophyll a from Dunaliella salina”. Talanta, 77: 948-952.

Macías-Sánchez, M., Fernandez-Sevilla, J., Acién, F., Cerón, M., Molina, E. (2010).

“Supercritical fluid extraction of carotenoids from Scenedesmus almerensis”. Food

Chemistry, 123: 928-935.

Bibliografía


braunii). 47

Malaysian Palm Oil Board. (2005). “Determination of Carotene Content, Method No. p 2.6,

p.194-197. Bandar Baru Bangi, Selangor, Malaysia.

Mansour, M., Volkman, J., Blackburn, S. (2003). “The effect of growth phase on the lipid

class, fatty acid and sterol composition in the marine dinoflagellete, Gymnodinium sp. In

batch culture”. Phytochemistry, 63: 145-153.

Marquez, F., Nishio, J., Nagai, S., Sasaki, K. (1995). “Enhancement of biomass and pigment

production during growth of Spirulina platensis in mixotrophic culture”. Journal of

Chemical Technology and Biotechnology, 62: 159-164.

Maróstica, M., Vieira, A., Romanelli, N., Dragano, V. (2010). “Supercritical fluid extraction

and stabilization of Phenolic compounds from natural sources - Review (Supercritical

Extraction and Stabilization of Phenolic Compounds)”. The Open Chemical Engineering

Journal, 4: 51-60.

Martínez, A. (2003). “Carotenoides”. Universidad de Antioquia, Medellin.

Mendes, R., Nobre, B., Cardoso, M., Pereira, A., Palavra, A. (2003). “Supercritical carbon

dioxide extraction of compounds with pharmaceutical importance from microalgae”.

Inorganica Chimica. Acta, 356: 328-334.

Mendes, R., Reis, D., Palavra, A. (2006). “Supercritical CO2 extraction of γ-linolenic acid

and other lipids from Arthrospira (Spirulina) maxima: Comparison with organic solvent

extraction”. Food Chemistry, 99: 57-63.

Mendiola, J. (2008) “Extracción de compuestos bioactivos de microalgas mediante fluidos

supercríticos”. Trabajo para optar al grado de doctor en ciencias y tecnología de los

alimentos, Universidad Autónoma de Barcelona, España.

Mendiola, J., García-Martínez, D., Rupérez, F., Martín-Álvarez, P., Reglero, G., Cifuentes,

A., Babas, C. (2008). “Enrichment of vitamin E from Spirulina platensis microalga by SFE”.

Journal of Supercritical Fluids, 43: 484-489.

Bibliografía


braunii). 48

Molina, L., Morales, E. (2008). “Influencia de la salinidad, irradiancia y concentración de

nutrientes sobre el crecimiento de la microalga Rhodosorus marinus: caracterización de su

flora bacteriana asociada”. Trabajo para optar al grado de magister Scientiarum en

Microbiología. Universidad de Zulia, Maracaibo.

Palavra, A., Coelho, J., Barroso, J., Rauter, A., Fareleira, A., Mainar, A., Urieta, J., Nobre, B.,

Gouveia, L., Mendes, R., Cabral, J., Novais, J. (2011). “Supercritical carbon dioxide

extraction of bioactive compounds from microalgae and volatile oils from aromatic plants”.

Journal of Supercritical Fluids, 60: 21-27.

Palou, A., Picó, C., Bonet, M., Oliver, P., Serra, F., Rodríguez, A., Ribot, J. (2005). “El libro

blanco de los esteroles vegetales”, 2da

Ed., Ed. Unilever Foods S.A. España.

Raventós, M. (2005). “Industria alimentaria, Tecnologías emergentes”.1era

ed. Ediciones

UPC. Barcelona

Sabir, S. M., Hayat. I., Ahmed, S. (2003). “Estimation of sterols in edible fast and oils”.

Pakistan Journal of Nutrition, 3: 178-181.

Sahena, F., Zaidul, I., Jinap, S., Karim, A., Abbas, K., Norulaini, N., Omar, A. (2009).

“Application of supercritical CO2 in lipid extraction - A review”. Journal of Food

Engineering, 95: 240-253.

Saldaña, S., Temelli, F., Guigard, S., Tomberli, B., Gray, C. (2010). “Apparent solubility of

lycopene and b-carotene in supercritical CO2, CO2 + ethanol and CO2+ canola oil using

dynamic extraction of tomatoes”. Journal of Food Engineering, 99: 1-8.

Sun, M., Temelli, F. (2006). “Supercritical carbon dioxide extraction of carotenoids from

carrot using canola oil as a continuous co-solvent”. Journal of Supercritical Fluids, 37, 397-

408.

Tornero, A. (2011). “Aplicaciones de la tecnología de Fluidos Supercríticos (FSC) en la

industria alimentaria”. Centro Tecnológico Ainia. Valencia.

Bibliografía


braunii). 49

Valenzuela, A., Sanhueza, J., Nieto, S. (2000). “Rancidez oxidativa en la industria de

nutrición animal: el uso racional de los antioxidantes”. Grasas y aceites, 200: 547-546.

Volkman, J., Barrett, S., Dunstan, G., Jeffrey, S. (1994). “Sterol biomarkers for microalgae

from the green algal class Prasinophyceae”. Organic geochemistry, 21: 1211-1218.

Wong, M., Timms, R., Goh, E. (1988). “Colorimetric determination of total tocopherols in

palm oil, olein and stearin”. Journal of the American Oil Chemistry Society, 65: 258-261.

Yeverino, M. (1997). “Determinación cuantitativa de carotenoides en hojas de cinco especies

del genero leucaena”. Trabajo para optar al título de maestro en ciencias con especialidad en

alimentos. Universidad Autónoma de Nueva León, Monterrey.

http://www.springer.com/chemistry/journal/11746

ANEXOS

Anexos

Efecto de la densidad temperatura y del CO2 sobre la extracción supercrítica de aceite de microalga


ANEXOS

ANEXO A. Determinación de la humedad del sustrato

Tabla A-1: Determinación de la humedad inicial de la microalga (Botryococcus braunii).

N° de

réplica

Peso

placa

(g)

Peso muestra

húmeda

(g)

Peso placa +

Muestra seca

(g)

%

humedad

(b.h)

%

humedad

(b.s)

1 27,5029 28,5072 28,4737 3,3357 3,4508

2 27,8300 28,8315 28,7952 3,6246 3,7609

Promedio 4,480±0,205 3.606±0,220

ANEXO B. Determinación del rendimiento de extracción de aceite de microalga B. braunii.

Tabla B-1. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1)

Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)

Peso acumulado kg CO2

/ kg SS

g aceite

/ kg MP recuperado corregido

1 3 10,5 18,9 30,5457 30,6284 0,0827 0,0827 0,1639 2,8 24,20

2 5 17,5 31,5 30,9924 31,0069 0,0145 0,0972 0,1927 4,6 28,45

3 10 35 63,0 30,4248 30,4585 0,0337 0,1309 0,2595 9,3 38,31

4 20 70 126,0 30,3473 30,3828 0,0355 0,1664 0,3299 18,6 48,70

5 39 136,5 245,6 30,5223 30,566 0,0437 0,2101 0,4165 36,3 61,49

Tabla B-2. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).

Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 10,5 18,9 30,5872 30,6728 0,0856 0,0856 0,1068 2,8 15,79

2 5 17,5 31,5 30,5784 30,6369 0,0585 0,1441 0,1799 4,7 26,59

3 10 35 63,0 30,547 30,6289 0,0819 0,226 0,2821 9,3 41,70

4 20 70 126,0 30,7289 30,78 0,0511 0,2771 0,3459 18,6 51,13

5 39 136,5 245,6 30,5709 30,6312 0,0603 0,3374 0,4212 36,3 62,25

An

exos

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroa

lga (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

2


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,7 21,1 33,5708 33,6366 0,0658 0,0658 0,1182 3,1 17,49

2 5 19,5 35,1 33,3936 33,4343 0,0407 0,1065 0,1914 5,2 28,30

3 10 39 70,2 33,643 33,684 0,041 0,1475 0,2651 10,4 39,20

4 20 78 140,3 34,0229 34,0623 0,0394 0,1869 0,3359 20,8 49,67

5 40 156 280,7 34,0169 34,0592 0,0423 0,2292 0,4119 41,5 60,91


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,7 21,1 33,6488 33,7939 0,1451 0,1451 0,2226 3,1 32,91

2 5 19,5 35,1 33,5871 33,6186 0,0315 0,1766 0,2709 5,2 40,05

3 10 39 70,2 33,8261 33,8819 0,0558 0,2324 0,3565 10,4 52,70

4 20 78 140,3 34,1826 34,2442 0,0616 0,294 0,4510 20,7 66,67

5 40 156 280,7 33,8335 33,8921 0,0586 0,3526 0,5409 41,5 79,96

An

exo

s

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroalg

a (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

3

An

exos


Vial Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 30,3695 30,4398 0,0703 0,0703 0,1369 3,0 20,24

2 5 18,5 33,3 30,7299 30,7652 0,0353 0,1056 0,2056 4,9 30,41

3 10 37 66,6 30,6032 30,635 0,0318 0,1374 0,2676 9,8 39,56

4 20 74 133,2 30,6739 30,7071 0,0332 0,1706 0,3322 19,7 49,12

5 38 140,6 253,0 30,6121 30,6535 0,0414 0,2120 0,4128 37,4 61,05

Tabla B-6. Extracción de aceite de microalga B. braunii a 69°C y 900kg CO2/m3

(punto de diseño 6)

. Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 30,6479 30,696 0,0481 0,0481 0,0776 3,0 11,48

2 5 18,5 33,3 30,7255 30,7845 0,059 0,1071 0,1729 4,9 25,56

3 10 37 66,6 30,5671 30,6616 0,0945 0,2016 0,3254 9,8 48,11

4 20 74 133,2 30,6063 30,6835 0,0772 0,2788 0,4501 19,7 66,53

5 38 140,6 253,0 30,5292 30,6031 0,0739 0,3527 0,5694 37,4 84,17

An

exo

s

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroalg

a (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

4


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 10,5 18,9 30,6681 30,731 0,0629 0,0629 0,1256 2,8 18,56

2 5 17,5 31,5 30,7081 30,7292 0,0211 0,084 0,1677 4,7 24,79

3 10 35 63,0 30,5137 30,5532 0,0395 0,1235 0,2466 9,3 36,45

4 20 70 126,0 30,5791 30,6183 0,0392 0,1627 0,3249 18,6 48,01

5 40 140 251,9 30,6725 30,7162 0,0437 0,2064 0,4121 37,2 60,91


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,7 21,1 34,0924 34,2434 0,151 0,151 0,2311 3,1 34,17

2 5 19,5 35,1 34,1318 34,1689 0,0371 0,1881 0,2879 5,2 42,57

3 10 39 70,2 34,0229 34,0687 0,0458 0,2339 0,3580 10,4 52,93

4 20 78 140,3 33,6095 33,6719 0,0624 0,2963 0,4535 20,8 67,05

5 40 156 280,7 34,0595 34,0995 0,04 0,3363 0,5147 41,5 76,10

An

exos

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroalg

a (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

5


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 33,3068 33,371 0,0642 0,0642 0,0365 3,0 5,40

2 5 18,5 33,3 33,8312 33,8792 0,048 0,1122 0,0638 4,9 9,43

3 10 37 66,6 33,0507 33,7102 0,6595 0,7717 0,4390 9,8 64,89

4 20 74 133,2 34,1085 34,1559 0,0474 0,8191 0,4659 19,7 68,87

5 40 148 266,3 33,6374 33,6884 0,051 0,8701 0,4949 39,4 73,16


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 34,116 34,2167 0,1007 0,1007 0,1724 3,0 25,49

2 5 18,5 33,3 33,6449 33,6799 0,035 0,1357 0,2323 4,9 34,34

3 10 37 66,6 33,3696 33,4122 0,0426 0,1783 0,3052 9,8 45,13

4 20 74 133,2 34,0313 34,0765 0,0452 0,2235 0,3826 19,7 56,57

5 40 148 266,3 33,8631 33,9074 0,0443 0,2678 0,4585 39,4 67,78

An

exo

s

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroalg

a (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

6


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 33,8759 33,9593 0,0834 0,0834 0,1543 3,0 22,81

2 5 18,5 33,3 33,8559 33,8984 0,0425 0,1259 0,2330 4,9 34,44

3 10 37 66,6 33,8495 33,8989 0,0494 0,1753 0,3244 9,8 47,95

4 20 74 133,2 33,6447 33,6931 0,0484 0,2237 0,4139 19,7 61,19

5 40 148 266,3 33,5921 33,6368 0,0447 0,2684 0,4966 39,4 73,41


Vial

Tiempo

(min)

Consumo

L NPT

CO2

g

Peso

Inicial

vial (g)

Final

Peso

extracto (g)


/ kg SS

g aceite


1 3 11,1 20,0 33,6106 33,6832 0,0726 0,0726 0,1289 3,0 19,05

2 5 18,5 33,3 33,9505 33,9992 0,0487 0,1213 0,2153 4,9 31,82

3 10 37 66,6 34,0323 34,091 0,0587 0,18 0,3195 9,8 47,22

4 20 74 133,2 34,2318 34,2809 0,0491 0,2291 0,4066 19,7 60,10

5 40 148 266,3 33,8668 33,9157 0,0489 0,2780 0,4934 39,4 72,93

An

exos

Efecto

de la

den

sidad y tem

pera

tura

sobre

la ex

tracció

n su

percrítica

de a

ceite de m

icroa

lga (B

otry

oco

ccus b

rau

nii) 5

7

Anexos



ANEXO C. Determinación de la cinética de extracción de aceite de microalga (Botryococcus

braunii).

Figura C-1. Curva cinética de extracción de aceite a 45°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 1).

Figura C-2 Curva cinética de extracción de aceite a 65°C y 860kg CO2/m3 (Punto de diseño 2).

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S)

tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S)

tiempo (min)

Anexos



.


.


0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

Anexos





0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S)

tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Re

nd

imie

nto

(g

ace

ite

/kg

SS

Tiempo (min)

Anexos



Figura C-7.Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 843kg CO2/m3 (Punto de diseño 7).

.


0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S)

Tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

Anexos



.

Figura C. 9 Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño 9).

.

Figura C-10. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño

10).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

Anexos



.

Figura C-11. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3 (Punto de diseño

11)

.

Figura C-12. Curva cinética de extracción de aceite a 55°C y 900kg CO2/m3

(Punto de diseño

12)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50

Ren

dim

ien

to (

g a

ceit

e/k

g S

S

Tiempo (min)

Anexos



ANEXO. D Análisis del extracto de aceite de microalga (Botryococcus braunii).

Tabla D-1. Datos curva de calibración para la concentración de carotenoides en el aceite de

microalga B. braunii

Diluciones β-caroteno

(mg/mL)

Absorbancia

1 0 0

2 0,05 0,895

3 0,04 0,716

4 0,03 0,545

5 0,02 0,366

6 0,01 0,184

Figura D-1. Curva calibración carotenoides totales.

y = 0,0556x R² = 0,9998

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

β-c

aro

ten

o (

mg/m

L)

Absorbancia

Anexos



Tabla D-2. Datos curva de calibración para la concentración de esteroles en el aceite de

microalga B. braunii.

Figura D-2.Curva de calibración esteroles totales.

Diluciones Absorbancia a

15mn

Estigmasterol

(mg /mL)

1 0,951 0,40

2 0,678 0,30

3 0,574 0,25

4 0,442 0,20

5 0,357 0,15

6 0,234 0,10

7 0,102 0,05

8 0,000 0,00

y = 0,425x + 0,0039 R² = 0,9979

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000

mg e

stig

mast

erol/

ml

absorbancia a 15mn

Anexos



Tabla D-3. Datos curva de calibración para la concentración de tocoferoles en aceite de

microalga (Botryococcus braunii).

Diluciones α-Tocoferol

(mg/mL) Absorbancia

1 0,05 0,979

2 0,04 0,813

3 0,03 0,616

4 0,02 0,428

5 0,01 0,212

Figura D-3. Curva de calibración para tocoferoles totales.

y = 0,0497x R² = 0,9976

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

α-t

oco

fero

l (m

g/m

L)

Absorbancia

Anexos



ANEXO E

Análisis Estadístico

Figura E-1 Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de extracción de aceite

(Y1).

Figura E-2. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de carotenoides (Y2).

60

65

70

75

80

85

90

60 70 80 90

Y P

red

ich

o

Yac Experimental

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

8 10 12 14 16 18

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

Anexos



Figura E-3. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de esteroles (Y3).

Figura E-4. Valores actuales y predichos para la respuesta concentración de tocoferoles (Y4).

15

16

17

18

19

20

21

22

23

15 16 17 18 19 20 21 22 23

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

15,5

16,0

16,5

17,0

17,5

18,0

15,5 16,5 17,5 18,5

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

Anexos



Figura E-5. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de carotenoides (Y5).

Figura E-6. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de esteroles (Y6)

480

580

680

780

880

980

1080

1180

1280

1380

1480

490 690 890 1090 1290 1490

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

960 1060 1160 1260 1360 1460 1560 1660 1760

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

Anexos



Figura E-7. Valores actuales y predichos para la respuesta rendimiento de tocoferoles (Y7).

Tabla E-1. Análisis de varianza para el rendimiento de extracción de aceite.

Fuente Suma de

cuadrados Gl Varianza

Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 344,62 1 344,2 24,67 0,0025* 45,93

X2 186,36 1 186,36 13,34 0,0107* 24,84

X12

3,19 1 3,19 0,23 0,6495 0,43

X22

48,71 1 48,71 3,49 0,1111 6,49

X1X2 83,63 1 83,63 5,99 0,0500* 11,15 X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m

3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo

(p<0,05).

970

1020

1070

1120

1170

1220

1270

1320

1370

1420

1470

990 1090 1190 1290 1390 1490

Y P

red

ich

o

Y Ac Experimental

Anexos



Tabla E-2. Análisis de varianza para la concentración de carotenoides en el aceite.

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 23,21 1 23,21 274,7 0,0001* 31,97

X2 47,88 1 47,88 566,69 0,0001* 65,94

X12 0,0081 1 -0,0081 0,096 0,767 0,01

X22 0,1 1 0,1 1,22 0,3118 0,14

X1X2 0,9 1 0,9 10,68 0,0171* 1,24

X1: Temperatura [°C]; X2: Densidad [kg CO2/m3]; GL: grados de libertad y *: Indica coeficiente significativo

(p<0,05).

Tabla E-3. Análisis de varianza para la concentración de esteroles en el aceite.

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 6,51 1 6,51 10,8 0,0167* 17,32

X2 23,52 1 23,52 39,04 0,0008* 62,57

X12 1,5 1 1,5 2,49 0,166 3,99

X22 0,16 1 0,16 0,26 0,6288 0,43

X1X2 2,28 1 2,28 3,78 0,0997 6,07


(p<0,05).

Anexos



Tabla E-4. Análisis de varianza para la concentración de tocoferoles en el aceite.

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 0,0071 1 0,0071 0,072 0,797 0,22

X2 1,95 1 1,95 19,61 0,004* 60,42

X12 0,41 1 0,41 4,12 0,089* 12,70

X22 0,000062 1 0,000062 0,00062 0,981 0,00

X1X2 0,26 1 0,26 2,56 0,161 8,06


(p<0,05).

Tabla E-5. Análisis del rendimiento de carotenoides.

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 329600 1 329600 113,66 0,0001* 42,76

X2 414800 1 414800 143,03 0,0001* 53,81

X12 1,05 1 1,05 0,00036 0,9854 0,00

X22 1350,71 1 1350,71 0,47 0,5204 0,18

X1X2 7739,6 1 7739,6 2,67 0,1535 1,00


(p<0,05).

Anexos



Tabla E-6. Análisis del rendimiento de esteroles

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 24800,15 1 24800,15 3,87 0,0968 5,79

X2 331200 1 331200 51,68 0,0004* 77,36

X12 22136,55 1 22136,55 3,45 0,1125 5,17

X22 5415,63 1 5415,63 0,84 0,3935 1,27

X1X2 6093,36 1 6093,36 0,95 0,3672 1,42


(p<0,05).

Tabla E-7. Análisis del rendimiento de tocoferoles

Fuente Suma de


Valor F

exp Probabilidad

R2

%

X1 91071,51 1 91071,51 21,03 0,0037* 36,15

X2 101800 1 101800 23,52 0,0029* 40,41

X12 5660,12 1 5660,12 1,31 0,2965 2,25

X22 12580,5 1 12580,5 2,91 0,1392 4,99

X1X2 14853,52 1 14853,52 3,43 0,1135 5,90


(p<0,05).

tesis_leticia durán.pdf

Documents