Casa abierta al tiempo

T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

R, IAESTRO EN RIOTECNOLOG~A P R E S E N T A

G E EtARIIO ‘CiUTIÉRREZ SANCHEZ .#

SlJSTENTADA EL 7 DE SEPTIEMBRE DEL 2000, ANTE EL JURADO FORMADO POR

[IR. GERARD0 SAUCEDO CASTANEDA DIRECTOR DE TESIS

DR. ARMANDO ME.J[A ALVAREZ PRESIDENTE 13K. DANIEL MAFlTlrJEZ CARRERA SECRETARIO DRA. ISABELLE GAIME PERRAUD VOCAL DR. CHRISTOPHER AUGUR VOCAL

El Posgrado ell Ric,tecl~ología cle l a IJnivel-sidad Auldnoma Metropolitana está

incluido en el Padrón de Posgrados de Excelencia del CONACyT y ademis

m m t a con el apoyo del mismo Consejo, con el convenio

471-O/Maestrí;l en Biotecnología.

Comité Tutorial:

A 'L)íos

.A Fly, m í amiga y esposa

mispadres y lierwmn(a)os

A G R A I ) E C I I V l I E N ' I ' O S :

CONTENIDO ..................................................... PHESENTACIÓN DEL PROYECTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . RESUMEN ........................................................

................................................ CA I J f I - ~ ~ ~ . O 2

2 . REVISIÓN B I B L I O G R ~ F I C A ...................................... 2.1. El café ell México ............................................ 2.2. La pllI1);l de c:1ré ............................................. 2.3. 1 ~ 3 cnrc'eilln ..................................................

2.3. I . @títnicff tie I l l ce~@ttn .................................... 2.3.2 l(fec(o.s bioltjgtms de k l crrJcirr~r ..............................

2.4. Cntabolisrno de ¡:I cafeina ..................................... 2.4. I Dcgtu~lctct~jtr por l c t . s p l ~ ~ t r / ~ t . s ................................ 2 . -1.2. I)cp:'Ncincidtr por e l llorrtbre ................................ 2 . -J . 3 . 1 ) c ~ g 1 ~ ~ t c l o ~ i ( ~ t t /NI' Itts b m ~ / c t . t ~ ~ s .............................. 2.4.4. 1~cgt~LlllílCit~rl por los h o l t g o . s , ~ l ~ ~ l ~ l c ~ . , r l n s o Y ......................

2.5. Los coa~peestos fcenólicos ...................................... 2.6. L m tallinos .................................................

2.6.1. ('ltrsificctcitirr [/e los ~nrlir~os ................................ 2 .62 . l::/cc/o.s rtjxicos y ~ ~ t r / t ~ ~ t ~ / / . / c / ~ ) ~ r c ~ l ~ ~ ~ , de los mrrI t0 . s . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.3 1 )cgrtrclrrctti/r 1 1 ~ ~ 1o.s / a ~ r i l t o . s .................................

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2 6 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . /.<I / ( l l l l l ~ l l 'c, 2 .7 . 1.0s Ilo~lgos 1il;rlllclltosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2 7 I / ~ l ! ~ l l / l l C l t ~ l l &'L?llL' / l l~l l [/C. / l l l l ~ ~ l l / ~ O ~ l . \ l l l i / l /C / l / / / l . l l ,L! L . / / ¡ / 1'11 l i J > / l ( J l l . . . . 7 8

2 7 . -3 b. .I L ~ C ~ w ~ - o l~cllici//inm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2 7.3. I lsos ~ I O I ~ C I I O / ~ ~ ~ I L : O . S tie PctlicilliloII ......................... 30

2.8. <:ollclusi~ll ................................................. 3 0

C.4~i1u1.o . OBJETIVOS ................................................... 38

3.1. Objetivo gener:ll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2. Objetivos p;jrtic111;1res . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

35

36

37

3 8

39

39

39

3 9

40

40

'I 0

40

40

4.4. Condiciolres d e cult ivo ........................................ 4 1

4. 4 . I . ~ ~ l ~ e c l l l l ; c l / / ~ l i.lKlilli ........................................ 4 1

4 . 4 . 2 . ~ ' r c C i l l l l c l l / l ~ / o l l ~ ~ / / l l / ; l l ~ l / . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.4.3. ~ ~ ~ I U / I / ~ I C I ( ~ I I JC I t / c~tr/)trc~it/[rt/ 11'. ~ ¡ c ~ , ~ I . ~ I ~ / ~ I I ~ /¡I c.~!fi~ill~t . . . . . . . . . . . . . . -1.3

. . . . .

" i

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. . 'I ........

8. CONC ilS

6.3. El IO

6.4. Co 111 óI1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

.le ~ d ~ l ~ ~ t ; l c i ó l l y d e C l l l l i V O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 3

¡ÓI1 ............................... , ,. . . . . . . . . . . . . . IOcJ

-. ............... " ....

¡'O \ I t. \ / / I O

La Universidad Autónoma Metropolitana Onitlad I r tapa l ; lp t ~11.~~M-1) ha trabajado con

el Instituto de lnvestigación para el Desarrollo, I l { O ( I ' l n l l t u t de I<cclwclw pour le

I)iveloppenlent, ex-ORSTOM) por más de 17 alios en pro!;rarn;l:> de I3lutecnolc)gla

Esta tesis, se desarrolla dentro del proyecto denolninado "Desal ~ o l h de bioplocesos par-a la

conservación, detoxificación y valorización de la p u l p de Cali; ( 1 3 I O P ~ J L C . A ) " El objetivo

global del proyecto tiene conlo finalidad aprovechar la pulpa de cafk n~rdiante procesos

13iotecnológicos y uno de los intereses dentro de este: proytcto es cl de eliminar los

compuestos antifisiolóyicos (cafeina) y alltirltltrizionales (i:ol11ptlc~stos tkncilicos) q u e contiene

la pulpa de café. El proyecto BIOPLJLCA, se encuentra apoyado linancieramen~e dentro de. un

proyecto de la Unión europea (BIOPULCA t f IC 18*C7'070185) se colabora con el Instituto

de Investigación para el Desarrollo (IRD-Francia), la Uniucrsidad de Ceading (1JR-lnglaterra),

la Universidad Federal de Paraná (UFPR-Brasil) y la IJniversic~~d Aut6nonla hletropolitana

Unidad lztapalapa (UAMI-México).

Esta Tesis de Maestria, file realizada en la Universidad Autcillonla hletropolitnna Unidad

lztapalapa en la Planta Piloto de Fermentaciones Sditlns (1'1'4) y el 1,aboratolio de t3iologia

Molecular de Hongos Filamentosos

23

B L

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, I ' I .~ . . n

3 70'% (Zultragn. I9S9)

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Cti, ; T C O ~ ~ O I I I I I I ; I

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- < - I O

lllii;n2

El ácido clorogénico, un depsido del ácido cafiico y ácido quinico, es resistente a la accion de

la tanasa, a pesar que el ácido caféico contienc dos g t ~ p o s fenólicos 011, esto se atribuye a la

presencia de un doble enlace sobre la cadena dcl y u 1 1 0 COO1 I esterificatlo (I.ekha y L..onsarle,

1997). Sin enlbargo. Yanlada y Tanaka (1972), ell m a patente para el uso de la tanasa en la

iabricación de vinos, reportan que la tanasa I l l d l J ~ z a el icido clorogénico en el jugo de uva,

produciendo asi icido caftiico y acido quinico. 'T'ambién se ha reportado que In tanasa hidroliza

:I galato de epicatequina y el 3-galato de epi~:Jloc.;lteq"inn. los cuales son taninos condensados

que se encuentran en el IC (Nierenstein, 1936, 1lr;tJlicld y Penny, 1948)

I

,

"" . .

2.7.2. El ginero Perricilliulrl

El género /'P/K~///IU~, forma parte de los hongos Inás utilizados en la biotecno1cgi.k para la

preparación de productos alinlenticios (quesos, productos orientales), prodtlci:1on de

metabolitos secundarios (antibióticos, aromas) o producción de enrimas (pectinasas, c8:iul.ms)

Ptnrci//hm, pertenece a la fanlilia de los Eurotiaceae (Alexopoulos y M i n q I9';9) y es

clasificado taxonómicamente de la siguiente manera

Clase: ASCOMYCETES

Subclase: I'LECTOMYCETIDAE

Orden: EIJRO'I'IALES

Familia: E:UIIOTIACEAE

El genero / ' L ~ I I I L . I I / / I I I I I , se caracteriza por tener un nlicelio septado y ramitlc;tdu LAS

conidióforos pueden ser septados o no septados, y ramificados hasta t1-e~ veces, simidl u n l e n t e

o asimetricamentz. L a base no ramificada del conidióforo se llama estipe. Los cortldioforos

lienen en los estremos las fiilides, de las cuales se van separando sucesivamente los cokiios.

de modo que l a longitud de la célula perrllanece sensiblemente constante (Snith, 1962)

i

OBJETIVOS

OBJETIVOS ..., .. . . . ... .. ..,. .. ,.., .,, ,.....,, ...... , I ....... , ., . . , . . . . , . ~, .... . . . , . . ,. .,. . , .

3.1. OoJrrn 'o G E N E R A L

Establecer las condiciones de fermentación líquida para la degradación de c a f e m ' en

presencia de icido tánico, empleando un hongo filamentoso.

3.2. OBJETI\'OS PARTICULARES

3.2.1. Seleccionar cepas de hongos filamentosos con capacidad de crecer sohe u n

sustrato sólido preparado a partir de infusión de pulpa de café.

3.2.2. Seleccionar cepas de hongos filamentosos con capacidad de degradar la cafeina.

3.2.3. Evaluar métodos de conservación de cepas a corto y largo plazo.

3.2.4. Estudiar, el efecto de filentes de nitrógeno y carbono de fácil asimilación, sobre

la degradación de la cafeina en presencia de icido thico

3.2.5. Determinar, el grado de asociación de la producción de l a enzima Cafeín-

desnletilasa, con el crecimiento

.

I

Y

MÉTODOS

j, altivo y las técnicas utilizadas para seleccionar y J u ' t r el hongo lilamentoso con la mejor i: ; opacidad de para degradar cafeina en presencia dc icitlo tinico, adelnas la est[-ategia

uperimental que se sigui6 para cumplir con los o l~ jz~i , CIS prol)t~estos.

4.1. MICROORCAN~SMOS

1.8s cepas utilizadas pertenecen a la coleccicin 1111) (JAM (Roussos et d . , 1995) y a la

Colección Espahola de Cultivos Tipo (CECT) Las CCIICIS de la colección IRD-IJAhI fireron

hisladas a partir de muestras tomadas sobre 11)s siliob de produccidn de cafi en Xalapa,

Veracruz. Las cepas empleadas en el presellte c:.tudio tienen la característica de ser

consideradas conlo cepas GRAS (Generally Rec..ogr;iretl As Safe), es decir, que bajo ciertas

condiciones, no producen toxinas y los productos de lirll1eniaciÓn resultantes pueden utilizarse

como alimento Por ejemplo, cuando una mezcla de ~ I I J O I de soya y trigo es inoculada con

Ayergi//rrs o/:)~:~rc y posteriormente se incuba b,ljo ciel-las condiciones, al final del p~-oceso se

obtendrá la salsa de soya (Jong y Birn1ingllaln, 10c12), como el producto final de la

ferrnentación es de consumo humano, entonces se considera que Aqwrgillrls olyzrrc es un

microorganismo GRAS, para l a elaboración de la salsa di: soya

En la 7 ' ~ h l ~ r 4. I se presentan las cepas utilizadas 'y las claves que se usaron para identificarlas

1-2095

)-2004

i-2088

i

)-2339

b2340

L2774

-2267

'33A25

4 3NSERVACIÓN DE LAS C 1 !

I conservacion de las ce.

Aa A n ;I 11 C

Sacarosa "_ "_ 2 0 2 o "_ Café molido _" _" 40.0 40 O 40.0

Pulpa de cafe fresca 421.1 427 7 "_ "_ Acido Tánico* -" "_ "_ 10

-I-

i I5 'c"' B

I = ! 0

I,

h .i

c L

43.3. M e d i o i l l f w i ó l l d é - S;IC;II'OS;I - agar (rrrerlin I h ) Se colocaron 40 g de café molido (Grand'Mere "familial", cafk Grand'Mere S ti., Francia)

en una cafetera marca KurpO junto con 700 rnL de agua destilada Una vcr preparada la

infusión de cnfk, ésta fue filtrada a travks de un filtro de papel Wllallnan No 41

Posteriornlente se adicionaron las sales minerales. El volumen se afol-o a 1 1- y el p l i se ajustó a

I5 empleando H2S0, . Se agregó el agar bacteriológico y se calentó a ebulliciim E 1 nledio se

esterilizó a 120°C por 15 minutos.

4.3.4. Medio infusión de café - sacarosa (medio 11)

El medio infLsión de cafe - sacarosa, es un medio liquido que se empleó para evaluar la

capacidad de degradación de la cafeína Este medio se preparó de la misma Illanera que se

preparó el I I W ~ / / ( J / k t , con la ilnica diferencia q w no se le agregó agar

4.3.5. Rletlio illfusión (le café - Acido t h i c o - ag;w (rrrerlio C')

Se preparó una infusión de cafk como se describe en la seccitilr 4.3.3 El volu~uen se ajustó a

800 mL. Posteriormente se agregó el agar bacteriológico y se calentó a ebullici6n. E l medio se

esterilizó a 120°C por 15 minutos. El Bcido tinico se disuelve en 200 1111. de a;;tla y se agrega

por filtración (menIbrana Millipore de O 45pnl) al ~nedio previanlenre esterilizado

Posteriormente el pl1 se ajusta con una soluci6n esteril de N a O l 1 J N E l objetivtl de estcrilirar

el ácido tanico por filtración, obedece a que sufre una hidrólisis si &te es calentado

4.4. CONDICIONES DE CULTIVO

En esta sección se explica, l a forma en que se inoculó cada tmo de los medios de cul~ivo y

lascondiciones de cultivo utilizadas en cada uno de los difererdzs experimentos

4.4.1. Crecinliento Indi;ll

A partir del tubo de conservación, se hizo una reactivación wbre m d i o A L I Después de 4 a

7 días de incubación a 30°C, este precultivo es utilizado para irlocular las cajas de Petri que se

usaron para evaluar el crecimiento radial.

Los medio empleados para evaluar el crecimiento radial ftleron los siguientes. inftlsiórl de pulpa

de café - agar ( ~ r w d i o A t r ) y Agar Papa Dextrosa (PD;\) Cada irno de los ensayos se realizó por

Iriplicado.

El crecimiento l - a d i a l file evaluado en cajas de Pelri (Trinci, 1 l W ) , las cuales t i w o n llenadas

con 30 mL de / t d i o Act y se utilizó medio PDA cow0 contIol Se dejó solidificar el medio y

posteriormente se inoculó por picadura en el centro de la caja (/?gruu 4. ](I), despuis se

incubaron a 30°C La base de la caja de Petri se dividió en matro partes con u n marcador a

partir del centro de inoculacion para hacer las lecturas del (:I ccinliento del hongo del centro

hacia las orillas (/,'/grmr 4. / h ) Las lecturas se tomaroll tach 12 lloras durante los prinw-os

4 días y posteriormente cada 24 horas, hasta que se irwadicr,i totalnlenle la supel l ick Los

valores de las pendientes se calcularon en la f ~ s e de crecilnicllto lineal. obteniendu de esta

nmera la velocidad de crecimiento radial en unid¿1des de lmgitud por unidad de tiempo

(Inn1 t1.l)

I - . . . . . . , .

i 1 IllL

17

1 I 1 I

so collstante.

- . . .

9 Fare 111Óvil: Acetonitrilo 10% (v:v), isocritico

C M ~ R Patrón: de 0-250 111g L ' con cafeina anhidra 99% Fluka ChemikaO

luados espectrofotonlétricamente (k=480 nnl)

portado por Aguilar e / d . , (1999)

una clilucicin (con agua dcsionizada) de la twestra libre de células, de tal forma de tener

n (le I I I I L con u n a concentración de 2 g 1;' de ácido tánico, de sacarosa o de la

que contenian icido tinico se congelaron con

liquitio y posteriormente todas las llwcstras fueron alnlacenadas en congelación hasta

A l 17t.111 l 1 . l . S I ' A í ~ l O 1 ) f f . Y

””

C i l r ~ l l o tIc In velocidad esl,erifica de crecimiento (,u)

h e h ; \ y u n gran nímcro d e nlodelos citlCticos que han sido desarrollados para

f Colllportanliento de las poblaciones de los nlicroorganismos. Para calcular la

ihca de crecinlicnto ( p ) , se evaluator1 tres modelos:

. "

Efecto del nlétoclo de conservación y adaptación

de la capacidad de degradar la cafeina

Efccto dc la rclacion C/N dc SO, sobrc la vclocidad

SELECCIÓN DE CEPAS

. . . .. ""

3 0 1 2 5 1

3.0

1 2 . 5

I O 0

o 3 6

Ntírnero de precultivos

LZ.CIN~TICA DE I)EC;RADACI~)N DE LA CAFEINA OI~SERVADA EN LOS DIFERENTES

P brt.roDos DE CONSEIWACI~N Y ADAPTACI~N P $ rott t ) t l tw 1'33,425 fue sometido a cuatro diferentes nletodos de conservacion y

l i b n antes de ser inocrllndo en 1111 medio liquido con cafeina ( m t f i o H). EII la / ; / gum 6. I

Y I l r a la degradacion de In cafeinn por 1'. co/ tm/lre 1'33,425 conservado por los cuatro

ppropuestos y renli7atldo muestreos cada 12 horas durante u n periodo de 72 horas.

' I

i

6 T

- "

PRESENCIA DE ÁCID0 T Á N N I C O : EFECTO D E

LA A D K I ~ N D E FUENTES DE N I T H ~ G E N O Y

CAKBONO S I M P L E S

1.a pulpa de café es rica en carbohidratos y proteinas (Elias, 1979; Zuluaga, 1989), razón por

bcual se ha propuesto utilizar este subproducto de la agroindustria del cafe, en la alimentación

kmal (Cabezas e/ d . , 1979; Vargas c/ d.. 1982; Abate y PfeITer, 1986) pero la presencia de

hores antifisiológicos, como la cafeina, y factores antinutricionales como 10s compuestos

blicos, que restrirlgen su uso como alimento animal.

bbs ultimos ailos, se han realizado estudios de aislamiento de cepas de hongos filarnentosos,

rfcces de degradar la cafeina en medios sintéticos (Aquiahuatl, 1992; Roussos et ul., 1995);

brtla degradación de la cafeina presente en la pulpa de café (Roussos e/ d . , 1994; Gaime,

S), eshdios sobre el efecto de la adición de sulfato de alnonio y urea a medios de cultivo

ina, con el objetivo de mejorar la velocidad de degradación de la cafeina, utilizando

S de fermentacih tanto liquida como sólida (Denis, 1996; Hakil e/ d.. 1999) Pero no

CleaIizado ningirn estudio en el cual se consideren además de la cafeina, a los compuestos

OS ylo tanirlos presentes en la pulpa de café.

ltnnte una cotnptensión del efecto de Ins fuentes de nitrógeno y carbono sobre la

sciOtl de la cafeina en presencia de compuestos fenólicos (ácido tinico) utilizando

ttllcrltc 1111 nlodelo de estrldio (fermentacih en nledio líclttidn) que pcrtnita caracterizar

ilia n l disclio, opcracii)n e i t ~ ~ ~ ) l c t t ~ c t t t a c i ~ ) t ~ de bioprocesos pala el al)rovccllalnietlto dc

de cale. así COIIK) ~ ~ ~ c j o ~ a l - su c;didatl nutlilnelltal

cl lA

2 O .- a

I .5

I . o

o 5

P

I P P

P

1 - 1

24 4 8 7 2 96 I20

Mcdio col1 cafcína y ácido tánico, D (m); mcdio con cafcína y sacarosa; E (O)

x7

m

f

u . SULF,\?’O DE AhlONIO COMO FIJENTE DE F(I’1Ri)GENO

Atorltinuacion, se preselltarl los resultados de producción de biomasa, consunlo de la fuente

3 5 i 3 0

I 7- 2 5 1 e 2 0 I f

I - 8

6 f. f

. "

Y

IC cot~cctltmción adimcnsionnl dc biomnsa (O)

las variables aditllensionales sot1 las siguientes.

I 7.5. CONCLUSION

t

CONCL USIONES Y

PERSPECTIVAS

AI

FIGURA 2.1.

FIGURA 2.2.

FIGURA 2.3.

FIGURA 2.4.

FIGURA 2.5.

FIGURA 2.6.

FIGURA 2.7.

FIGURA 2.8.

FIGURA 2.9.

FIGURA 4.1.

fICURA 4.2.

IlGURA 4.3.

Producción tnundial de café para la cosecha 1997-98 .............. RepresentaciCln quinlica de cafeina y sus derivados desmetilados . . . . . Metabolisnlo de la cafeina en el cafeto y ell el te . . . . . . . . . . . . . . . . . . Metabolismo de la cafeina en el honlbre ........................ Via de dcgradaci6n de la cafeina en ~ ' . ~ ~ / / ~ / ( ~ / ~ ~ ~ ~ / / ~ ~ . s ~ ~ / ~ / / ~ / t / . . . . . . . . . . Degradacion de la cafeina por los hongos filamentosos ............ Ejemplos de taninos hidrolizables ............................. Ejemplos de taninos condensados (proantocianidinas) ............. En la reacci6n de hidrolisis de una mol de ácido tinico (tanino hidrolizable) se libera una mol de glucosa y de 7 a 9 moles de ácido gilico. dependiendo del grado de sustitución Rl. galoil y R2. digaloil . . a) Inoculación por piquete de las cajas de Petri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b) División de las cajas de Petri y rnedición del crecimiento radial .... Inoculación y lectura del crecimiento longitudinal ................ Tratamiento de las muestras para evaluar la capacidad de degradación de la cafeína y el metodo de conservación .......................... Tratamiento de las muestras para evaluar el efecto de la filente de nitrógeno y c:trbono sobre la capacidad de deyadnciOn (le cakína . . . . Diaglatna de Ilujo de la estrategia seguida ell el plesente trabajo . . . . . Crecinliento radial en el medio I'DA y en el / r r c d / o At?. de las cepas (le hollpos estudiudas .......................................... Crecimiento lolrgitudinal en el mcdio ['DA y en el mctfio A(? pala los diferelltcs hongos estudiados .................................. ConcentraciOll de cafeina y prodrlcci6n (le biolnnsa al final de 72 lloras de felnwltaci6n Medio infusión pulpa de cale ( r r r c d i o A ) . . . . . . . . . . . .

7

10

14

16

18

20

23

24

29

42

43

46

47

58

62

63

67

FIGURA 7.1.

FIGURA 7.2.

FIGURA 7.3.

FIGURA 7.4.

FIGURA 7.5.

FIGUIU 7.6.

F’IGIJILZ 7.7.

68

70

76

79

U6

87

U8

90

92

97

98

p

'rbla 2.1. Con~posición quirnica de la pulpa de café fresca ...................... 'abla 2.2. Contenido de otros compuestos en la pulpa de cafe ................... Tabla 2.3. Solubilidad de la cafeina en diferentes solventes en fLrrlción de la

teniperatura .................................................. lrbla 4.1. Clave de identificacihn, norribre y procedencia de los hongos filanlentosos

utilizados en este estudio ........................................ l'abls 4.2. Medios de cultivos empleados para evaluar el crecimiento radial y

longitudinal (metlio no), la capacidad de degradación de cafeina ( / r w t h o Bo) y rnedio de conservacibn para evaluar el efecto de las fuentes de Nitrógeno y Carbono (rnetlro C ) ..............................................

Tabla 4.3. Medios de cultivos empleados para evaluar la degradación de cafeina en presencia de icido tánico y el efecto de la adición de una fuente Nitrógeno y Fuente de Carbono, sin~ples ......................................

Tabla 4.4. Curva patrón de ácido tinico, sacarosa o mezcla de itcido tlnico y sacarosa

Talrla 5.1. Velocidad de crecinliento radial y longitudinal y coeficiente de correlación (I(') entre el crecin1iento radial (Ca) y el crecimiento longitudinal (CI,) sobre el nledio de inftrsión de pulpa de café con agar ( r w f i o no). . . . . . . . . . . . . . .

Tabla 6.1. Retardo en el inicio de la degradación de la cafeitla, velocidad y poIcentaje de degradación la cafeina por /'cn/ci//i//ru C O I I I I N I I I I C V33A25, utilizando cuatro nlctodos de conservación e inducción .........................

hbla 7.1. Porcentaje de Nitrógeno y Carbono que aportó cada molécula al medio de cultivo Fuente de Nitrógeno (FN) y Fuente de Carbono (FC) . . . . . . . . . . . . .

1 n I h 7.2. I'arimctros citldticos, relacionados al catabolisnio y Inctabolisnlo de /'c/r/ci//i///rr c o m r ~ w t c ' V33A75, en los diferentes Inedios de cultivo utilizactvs

Tabla 7.3. Cocticientes de la ecuacicitt de Lwdeking y Piret para la calcitl-tlestlletilasa I b r n~acla por 1'. c ' o / n n l r / / w V33A25, en cI n1cdio de cultivo I 1 . . . . . . . . . . . .

8

9

11

36

37

3 8

51

65

I7

84

93

o 9

A7

' AO-2095

140-2093

AN-2088

R0-2339

RO-2340

rc-2267

". A N ,' PR

t R.

i I.í

i ci

IC;

A7

SihlUoLos

lallgitud dc onda

cocficicnte dc formacióll dc producto asociada al crccimicnto. UI gX I

cocficicnte dc formaci611 dc producto 110 asociada al crecimiento, U1 gX I

conccntracióll dc producto (cnzinla), U1 licnlpo

Cocficicntc de corrclación, adimcnsional

tnsn especifica de formnción dc producto, U1 gX" 11"

wlocidnd cspccifica de crccinlicnto, 1 1 . '

collcclltl-aci¿~n dc bi0mns:I. g L I

concclltraciÓ11 de biolnns:l n1i\inla (observada). g L I

conccntraci6n dc biolnas:l. g L.'

I./ ...,.

i A4

E F F E C T OF C O S S E R ~ ' . - \ T I O U . \ l E T t l O D OS CAFFEIXE U P T A K E B\' PE.VfCfLLIL ' .W CO.\l.llL'.VE \33.\25

C . Gutierrez-Sanchez', 1. Perraud-Gaime', C. Ausur'. J.M. Romano- ?.lachado'. G. Saucedo-Castarieda'

'Deparronlento de Biorecrrologia. Uniuersidad Aurdrroma .\lerropoliroua. L'nrdnd !:rnpaiopa I UASlfJ. .4. P. 55-535. C. P. 093-10. .\íe!!co. D. F.. Me.rlco. *lrrsrir!lr de Recherche pour Ir Diveloppentrnr. llirrco /IRD.,~lerrco), Clcerd!r 609. Los Morales. C. P. 11530. .\íe.rrco D F.. .\ferico

I . Inrroduction

Cotfee pulp IS one of !he major b!-producrs obtsincd during [he pulpins opcration of ;offc: chcrrte: .A fraction of this m a r e n a l is used for compost production for coffee plant nurwrtcs and other par1 is spilt in ritcrs or p led up near them. For ?\cry tu0 tons ( l i :rifcc <he? processed. nearly one ron of pulp is generared. During the 1997-98 reclod. IO -1 million of sacks (60 kg each) of fresh cofftc pulp nerc produced in h lcx ico , B J~TTC I~O . 19991. Coffee pulp is rich in prorcrns. minerals m d fibre that can be used for ~ n t r n a l fccdlng. but utilizarron OÍ coffee pulp for feed is constrained by anti- ph! jlolO;ol<JI (cafitine) and anli-nulritional (potyphcnols) compounds (Roussos er al.. 1939) T h t s < compounds c3uct .adkcrse effects on the snimds that consume coffee pulp. CJiiclns I .3.;-trlmeth! Iranthinc. Figure I ) conccntrxion \ a r k s according to the coffte \xtcr! 109.2 1 5 dry u t . basis). Its ph!sioloqical role is probsbly to defend coffsc F l J n l j from pred~ors and to inhibit p o u l h o f other plants. In humans. caffeine is Jcnizlh! lared inlo three prlmary merabolires: theophylline. theobromine. and p a r a ~ ~ n r h i n e . A t 100 rng kg reophylline is tolic to rats. Theobromine has bccn related ~ l t h hc~dxhe . insornnla. restlessness. excitement. mild delirium. muscle tremor. txh>cudia 2nd cxuasystoles in man and caffeine has been reponed to have many other ~ c : t \ tlrci includinz mutagenic. ter~rogenic 2nd carcinogenic capacities (Denis 1996).

I ~ F L L - E ~ C I . ~ DEL MÉTODO D E C O N S E I I V A C I ~ ~ N E INDUCCION, EN L A CAPACIDAD DE D E G R A D A C I ó N D E CAFEINA L'C Penicillium sp. V33

~ , ~ ~ ~ ~ , j o Gut ienez-S inchcz. Gerard0 Saucedo-Castaf icda, Isabtile Gairne-Penaud", y C h r i s t o p h e r A u p r ' Depanan ien lo de B io tecno log ia . Un iver s idad Autonorna Met ropo l i tana. I z tapa lapa. AP 55-5.75

Av. h l i choacan y L a P u r í s i m a S/N, Iztapalapa. Mexico. D.F., MEXICO F a x ( 5 )723 -63 -55 , e-mail: ggs@xanuln.uarn.rnu

" I RD - h l e x i c o . lnstirut de Reche rche pou r le Déve l oppmen t , FRANCIA

Palabras clave: cofeino. degrodacidn. indurcrdn

I ~ I ~ ~ ~ I u c c ~ ~ ~ . La pulpa de CzfC es un subproducto ap'cola abundante en MCxico y America Latina y es rica en nurrtcnlcs Se obtiene durante la operacion de despulpeo de 12s cereza de cafc. Sin embargo, su aprovcchamiento en la allmcnlacicn animal se reduce notablemcnte debido a la

corno :aft ,nl. fcnolcs. taninor. acidos clorogenicos. cafeico y p!csar:cia de compueslos ~ox icos . dificiles dc depradar. tales

t a n ~ c ~ (I) Cna d e las alternativas que se proponen p a n la U I I I I Z J : ~ ~ ~ de l a pulpa de cafc. cs ensilarla y poslcriormcnlc dcsro\ificula empleando hon2os filarncntosos.

capacihd de degndacion de cafeina Csta se encucnm El objelibo dr csrr rrabajo cs conocer si una vez expresa& la

influcnciada por e l metodo de conservacion de la ccpa de Pen~crllrurn JP V33.

\letodoloEia. La cepa de Petllcilliurn sp V3; utilizada en cst: esrud io pertenece a l a colcccion IRD-UAM (I) y fue sclscctonada por su capacidad de d c g a d u cafeina L o s

bíFC.4. rncdio infusión de pulpa de Cali y agar: M P C . rntdics de activacion empleados fueron los siguientes:

rnedlo infvslon de pulpa de cafe: M C A . medio infusion de uli molido > agar: MC. medio infusion de cafe mol ido ( 2 . j )

Resultados y Discusiones. En la Fisura 1. se aprecia la dtzr2J2cicn dc d c h a oblcnida empleando los difcrcntcs lnrrodos de consenacion propuestos. Cuando la ccpa fir

de c3reir.a de 0.0116 g.L'.h". l a cual comenzo a las 12 h r , conscnadr en hlCA. presento una velocidad de dcgradacion

cumdo se conscr~b en h1PCA. hubo una devdacibn del : Q ' 0 a las -? hora\. pero fue necesario hacer un total de 6

( 0 O095 g L.' h '1 a l a prcrenwda cuando se conservo en resicmbras a k m n r una tasa de dcyadacion similar

r.~c,\ C o l esporas obtenidas e n MCA y liofilizadas. la dcgra,lacicn comienm a las 36 horas y cuando se cosechan a F"1Ir dc P D Sc obscma que la ccpa comienza a d e g w h

f ~ a r n m ! c l a cafcina a las 60 lloras. tfakil ( 2 ) usbajd : l r :Flcmdn e l mctodo hlC,\, obtcnicndo una degradacion de cafc:n2 rlla!nr 31 90 96 decpufs de 80 horas incubation

ImenCICIIBr que no ehisttn repones en e l que se indique a l l e 18 c n 2 m rctpons3blc de l a dc_eradacion de la cafeh3 se3 In(luclhlc

Figura I. Influcncia dc merodo dc conserracion sobre IP

capacidad de dcpradacion dc car'ina dc Penrr l l l lum sp Vj3. 1*1 Conscrvada sobre hlC.4: (01 conscrvsda sohrc h4PC.4 ! posrcriormcnrc cobre MCA: ( A t ccporaj corcchah% w h r c SI( ' 1 y liofilizsdas: ( A l esporas coscchJdar zohrc PDA ! linliliZ:Id2.

Conclus iones. Los resultados de este estudio. sugicrcn quc la actividad enzimatica responsable dc l a degradacion de 12

cafeina es inducible y una vez e\presada dicha miv idad e< imponante consewar la cepa en medio que contenfa al menos una contentracidn de 0.5 g .L de cdeina.

Agradecimientos. Apoyo financiero a IC IR'CT97018i

T",.'D*

CO.\~~.A!L\CJON DE DOS METOUOS PARA LA SELECCI6N DE CEPAS PARA SU USO EY FI-R~IENTACIONES EN hlEDlO SOLIDO: CRECIMIENTO RADIAL Y LONGlTUDINAL

Gerard0 Guriérrez-Sinchez. Gcrardo Snucedc-Castar leda. Isabel le Gaime-Perraud' , y Christopher Augur' D e p a n 2 t n e n t o d e B i o l e c n o l c g i a . I l n i v e r s i d a d A u t ó n o m a M e t r o p o l i t a n a . I z t a p a l a p a . A P 55-535

A v . h f i c h o a c i n y La Purís ima S M , I n a p a l a p a , M é x i c o . D.F. MEXICO Fax (5)723-63-55. e-mail: ggs@xanum.uam.mx

' I R D - M f x i c o , l n s t i t u t d e R e c h e r c h e p o u r le D i v c l o p p m c n t . FRANCIA

Pnlabras clave: seleccidn. crecimienro. pulpo de cojk

Inlroduccibn. L3 medici611 de la velocidad de crecimienro en hcnsos filarn:nrosos. indica la capacidad del mlcrocrgantsrno p m co lon im algun susnato empleado en procesos d c f e r m c n u c i o n en medio s6lido. El crecimiento radial y longi~udinal son dos mccodos propueslos pam e~atuar l a capacidad d e los hongos para invadiry adaptme a los nurricnres sobre un susiraro (2. 3); e n csfc ca;o sc empleo pulpa de car? k s c a la cual scri empleada posteriomtnte como susmalo p m fmnentacion.

slgnificariva entre el rnctodo de crccimicnro radial y El objctlbo de e s l e trabajo fue evaluar s i habia diferencia

longirudinal.

hlctodología. Se cvdunron diez cepas de hongos filmentosos las c u a l c ~ pcrtencciw a lor gtncros R / y q ~ u s .

CECT y l a colcciicn penenccicnre al IRD.UAM. Los ~ly¿rg ;/ iuJ y Pewrrlirunr. y fueron proporcionadas por la

medios enxpleados fueron los siguicnles: MPCA: medio

dcrrrors El crccimicnro radial fue evaluado en cajas de Perr i iniusion dc pulpa de d k y agar ( I ) ; PDA: agar papa

( 2 ) . y para e l crecimitnlo longirudinal se emplearon tubos de Ralph (3). cn ambos casos se ernpled MPCA y como testigo

Cada uno d e los cnsl!os se rcalizb por triplicado. PDA La \clccidad de crccirnicnro se expreso en mrnlh.

para una distribucion t-rnrdcnl. con un nivel de sipificancia Resulrndos Y Discusiones. Se rcalizd un andlisir csladistico

r J l l a l (\'CS.) > IonSiludinal (VcL) de cada una de las ccpas. En de O OS. en cI cual S? cornpub I3 velocidad de crecimiento

la Figura I . s e muermn los datos obrenidos de la VCR y la vet, en donde se observa quc no hay difcrcncia significativa a l C \ a I w V C B y \'cL. empleando MPCA. Se repiti6 e l C n W O anrenor pero crnplcmdo en cste caso PDA y x @ h w ~ o que l m r c c o habia diferencia significariva enrrc la

Y l a L'CL ,Ambos parimmetros nos dan la misma i,IromCion sobre I ? velocidad de colonizacidn del h o n p sobre u n susiraro En 1a.mayori;l de los procesos donde se quien u1iliz;LT algGn microorganismo es imponanle g a a n r i w r W llahr3 un crecirnlcn!o ripido para evitar la c o n t m h a c i c j n Por alS"n olro nricroor_eanismo indeseable y para disminuir 101 l ' ~ ~ n p c r zn e l proceso.

AS

~ ~ r l i n n M d i n F 1 6 - (Cafeina - Acido Tanico) (Cafeina - Sacarosa)

O 24 48 72 96 120

Tiempo (11)

r-"" -1

0 24 48 72 96 120

Tiempo (h)

Medio F &Sulfato de Amonio - Acido Tánico)

, ~. ~ .~~

Medio G (Sulfato de Arnonio - Sacarosa) 3

0 biornasa (g/L) Gornpertz Logistic0

;;; 2 0 ; (D x- Exponenciat

0 0

O 24 4R 7 3 ac 4 - n

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I lempo (11)

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-. Tiempo (h)

~ _ _ _ -

Medio H I (Cafeina - Sulfalo de Arnonio: Ac. 3.0 3 Tánico - Sacarosa)

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0 24 48 72 96 120 Tiempo (h) I

I

E 0.993 0.995 F

0.935 1 .o00 0.999 0.9 J5 :f h E \ 05

04 ?Q- li 0.993 0.990 " 0.9 16 :

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