tesis fuente de amonio
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
INFLUENCIA DE GLICINA O SULFATO DE AMONIO EN LAFERMENTACIÓN DE Agave potatorum Zucc (TOBALÁ)
TESISQUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO EN ALIMENTOS
PRESENTAERIC GILBERTO ORTIZ BRAVO
DIRECTOR DE TESISDR. RAÚL SALAS CORONADO
CO-DIRECTOR DE TESISM.C. ENRIQUE LEMUS FUENTES
HUAJUAPAN DE LEÓN OAXACA, MARZO DE 2006
ii
RESUMEN
La elaboración del mezcal es un proceso sobre el cual influyendiversos factores, obteniéndose productos de calidad variable. En estetrabajo se estudió el proceso de transformación de azúcares a alcohol enmosto de agave tobalá, bajo condiciones controladas de temperatura,mezclado y concentración de azúcares; empleando la especie delevadura Saccharomyces cerevisiae a una concentración inicial de 5.0g/L. Además, se determinó el efecto de la adición de nitrógeno utilizandopor separado sulfato de amonio ((NH4)2SO4) y un aminoácido (glicina),efectuándose la comparación con un experimento control, preparado enausencia de fuentes de nitrógeno externas. Las variables elegidas paramedir el efecto de estos compuestos fueron el contenido de azúcares,etanol (EtOH) y biomasa.
Al término de la fermentación, el mosto adicionado con (NH4)2SO4mostró un consumo del 80.0% de azúcares, un crecimiento del 100.0% debiomasa y una concentración de EtOH de 27.5 g/L; en tanto que en elmosto con glicina existió un consumo del 65.0% de azúcares, uncrecimiento de biomasa del 56.0% y una concentración de EtOH de 16.9g/L. Por su parte, el mosto control presentó un consumo del 70.7% deazúcares, un crecimiento de biomasa del 61.6% y una concentración deEtOH de 17.5 g/L.
Con esto se concluyó que el uso de (NH4)2SO4 ofrece mejoresresultados en la fermentación de mosto de agave tobalá, incrementado elconsumo de sustrato, el crecimiento de biomasa y la generación deproducto.
iii
A mis padres Amelia e Isidro, a mis hermanas Ariadna y
Mitzi, a mis familiares y amigos
iv
AGRADECIMIENTOS
A la M.C. Araceli M. Vera Guzmán, al Ing. Saúl Martínez
Ramírez, y al Lic. Martín C. Ramales Osorio, por el material
bibliográfico proporcionado.
Al Ing. Víctor M. Chagoya Méndez por permitirme conocer el
proceso de elaboración del mezcal.
Al M.C. Vania S. Robles González; a las Ing. Brenda I. G.
Licona Morán, Itzel N. García Luna e Irma González Cruz, a la
Q.F.B. Griselda Bravo Villa así como al Tec. Pec. Eugenio
Hernández Morales, por el apoyo y facilidades prestadas para
el desarrollo del proyecto.
Al Lic. Ricardo García Jiménez, por las observaciones y
correcciones realizadas.
A mi familia, amigos, maestros y a todas aquellas personas
cuyo apoyo y paciencia brindados resultaron indispensables
para la culminación de esta tesis.
v
ÍNDICE PáginaResumen....................................................................................... ii
Dedicatoria.................................................................................... iii
Agradecimientos............................................................................ iv
Índice............................................................................................. v
Índice de figuras............................................................................ viii
Índice de gráficas.......................................................................... ix
Índice de tablas............................................................................. x
1. ANTECEDENTES..................................................................... 1
1.1. Definición de mezcal.......................................................... 1
1.2. Clasificación del mezcal..................................................... 2
1.2.1. Según el sustrato utilizado en la fermentación........... 2
1.2.2. Según sus características sensoriales........................ 2
1.3. Importancia económica del mezcal.................................... 3
1.4. Importancia social.............................................................. 5
1.5. La región productora de mezcal........................................ 5
1.6. Normas y control de calidad.............................................. 5
1.7. Características del agave tobalá........................................ 7
1.8. El proceso de elaboración de mezcal................................ 10
1.9. La fermentación alcohólica................................................ 14
1.9.1. Definición................................................................... 14
1.9.2. El microorganismo..................................................... 15
1.9.3. El sustrato.................................................................. 16
1.9.4. Los nutrimentos......................................................... 16
1.9.5. La temperatura........................................................... 18
vi
1.9.6. El contenido de oxígeno disuelto............................... 18
1.9.7. La concentración de iones hidrogeno (pH)................ 19
1.10. Técnicas para el análisis de la fermentación................... 19
1.10.1. Cuantificación de microorganismos......................... 19
1.10.2. Determinación de la cantidad de EtOH.................... 20
1.10.3. Determinación de la cantidad de azúcares.............. 21
2. ANÁLISIS DE FUNDAMENTOS............................................... 23
3. HIPÓTESIS............................................................................... 25
4. OBJETIVOS.............................................................................. 26
4.1. Objetivo general................................................................. 26
4.2. Objetivos específicos......................................................... 26
5. METODOLOGÍA....................................................................... 27
5.1. Diagrama de bloques......................................................... 27
5.2. Materiales y métodos......................................................... 28
5.2.1. Colección y tratamiento de las plantas deagave......................................................................... 28
5.2.2. Obtención del mosto.................................................. 28
5.2.3. Características del reactor......................................... 29
5.2.4. Establecimiento de los parámetros defermentación.............................................................. 29
5.2.5. Preparación del mosto previo a la inoculación.......... 30
5.2.6. Inoculación del mosto................................................ 30
5.2.7. Determinación de azúcares por colorimetría ............ 31
5.2.8. Determinación de azúcares por cromatografía delíquidos (HPLC)......................................................... 31
5.2.9. Determinación de biomasa por sólidos volátiles........ 31
5.2.10. Determinación de EtOH por cromatografía degases (CG).............................................................. 32
vii
5.2.11. Análisis estadístico.................................................. 32
6. RESULTADOS......................................................................... 33
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS.................................................. 41
8. CONCLUSIONES..................................................................... 43
9. PERSPECTIVAS...................................................................... 44
10. PUBLICACIONES................................................................... 45
BIBLIOGRAFÍA............................................................................. 46
ANEXO.......................................................................................... 51
viii
ÍNDICE DE FIGURAS Página1. Vista superior del agave papalomé.......................................... 7
2. Escapo floral (quiote) de agave................................................ 8
3. Recolección de cabezas de agave........................................... 10
4. Piñas de agave cocido en horno tradicional............................. 11
5. Molienda de las piñas............................................................... 12
6. Fermentación del mosto........................................................... 12
7. Destilación y obtención del mezcal........................................... 13
8. Resumen de la fermentación alcohólica................................... 14
9. Estructura del complejo generado a partir de la reacción defructosa con fenol en medio ácido............................................ 21
10. Diagrama de flujo para la realización de las pruebas defermentación.......................................................................... 27
11. Reactor para la fermentación de mosto................................. 29
12. Equipo de espectrofotometría UV/Visible.............................. 52
13. Cromatógrafo de líquidos....................................................... 53
14. Cromatógrafo de gases.......................................................... 54
ix
ÍNDICE DE GRÁFICAS Página1. Consumo de azúcares en la fermentación de mosto de agave
a una concentración inicial de 30 g azúcar/L............................ 33
2. Consumo de azúcares en la fermentación de mosto de agavea una concentración inicial de 107 g azúcar/L.......................... 35
3. Velocidad volumétrica de consumo de sustrato (Qs) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 gazúcar/L................................................................................... 36
4. Crecimiento de biomasa en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L............... 37
5. Velocidad volumétrica de crecimiento de biomasa (Qx) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 gazúcar/L.................................................................................... 38
6. Generación de EtOH en la fermentación de mosto de agavea una concentración inicial de 107 g azúcar/L.......................... 39
7. Velocidad volumétrica de generación de producto (Qp) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 gazúcar/L.................................................................................... 40
8. Curva estándar para la determinación de azúcares porcolorimetría............................................................................... 51
9. Curva estándar para la determinación de azúcares porHPLC........................................................................................ 52
10. Curva estándar para determinación de EtOH por GC........... 53
x
ÍNDICE DE TABLAS Página1. Consumo nacional aparente (CNA) y exportaciones............... 3
2. Destino de las exportaciones de mezcal.................................. 4
3. Exportaciones en volumen y en valor monetario...................... 4
4. Especificaciones para la elaboración de mezcal...................... 6
5. Especificaciones para la elaboración de bebidas alcohólicas.. 6
6. Experimentos realizados y condiciones de fermentación......... 30
7. Consumo de azúcares en fermentación de mosto de agave auna concentración inicial de 30 g azúcar/L.............................. 33
8. Consumo de azúcares en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L............... 36
9. Crecimiento de biomasa en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L............... 38
10. Generación de EtOH en la fermentación de mosto de agavea una concentración inicial de 107 g azúcar/L....................... 40
1
1. ANTECEDENTES
1.1. Definición de mezcal
La NOM-070-SCFI-1994 define al mezcal como: “Bebida alcohólica
regional obtenida por destilación y rectificación de mostos preparados,
directa y originalmente, con los azúcares extraídos de las cabezas
maduras de las siguientes especies de agave:
• Agave potatorum Zucc.
• Agave angustifolia Haw.
• Agave esperrima Jacobi.
• Agave weberi Cela.
• Agave salmiana Otto.
• Otras especies, siempre y cuando no sean utilizadas como
materia prima para otras denominaciones de origen dentro del
estado.
Cada una de las cuales se someten a una hidrólisis o cocción, y
posteriormente a una fermentación alcohólica con levaduras, cultivadas o
no, siendo susceptible de efectuarse un enriquecimiento hasta con 20%
de otros carbohidratos, siempre y cuando no se eliminen los componentes
que le confieren las características a este producto.
El mezcal es un líquido de olor y sabor característico de acuerdo a su
clasificación. Es incoloro o ligeramente amarillento cuando es reposado o
añejado en recipientes de madera de roble o encino”.
2
1.2. Clasificación del mezcal
El mezcal puede clasificarse de diferentes formas de acuerdo con los
siguientes criterios:
1.2.1. Según el sustrato utilizado en la fermentación. Como lo cita la
NOM-070-SCFI-1994, los mostos de agave pueden ser enriquecidos
con otros carbohidratos dando origen a dos tipos de mezcal:
• Mezcal tipo I (100% agave). Es aquel que para su elaboración
se utilizan únicamente los mostos obtenidos de la cocción de
las cabezas de agave.
• Mezcal tipo II. Es aquel que para su elaboración se utilizan los
mostos obtenidos del agave, con un enriquecimiento que puede
comprender hasta un 20% de otros carbohidratos.
1.2.2. Según sus características sensoriales. Aquí se involucran
tanto el tiempo de reposo, como la adición de ingredientes para
contribuir al sabor y aroma de la bebida:
• Mezcal blanco. Aquel que no sufre cambios en su sabor, ya
sea por almacenamiento o por la adición de algún componente.
• Mezcal reposado. Aquel que después de su obtención se deja
reposar en barricas de roble blanco o encino por un periodo no
menor de dos meses y no mayor a un año.
• Mezcal añejo o añejado. Aquel que después de su obtención
se deja reposar en barricas de roble blanco o encino por un
periodo mínimo de un año.
• Mezcal abocado. Aquel cuyo sabor ha sido suavizado o
modificado mediante la adición de uno o más productos
3
naturales, saborizantes o colorantes, siempre y cuando estén
permitidos por la Secretaría de Salud.
1.3. Importancia económica del mezcal
Para comprender la importancia económica del mezcal, es indispensable
analizar algunos datos relacionados con la cantidad de la bebida
producida y la suma de ingresos generados tanto a nivel nacional como
internacional, involucrando de manera implícita el volumen de
exportaciones. Ramales-Osorio y Barragán-Ramírez (2002), muestran
que en el año 2000, el volumen de mezcal producido a nivel nacional fue
superior respecto al generado en el año 1994 (Tabla 1). Así mismo, al
efectuarse un análisis del Consumo Nacional Aparente (CNA) y del
volumen de exportaciones realizadas, se tiene que un porcentaje alto de
la producción nacional se exportó hacia países de América, Europa y Asia
(Tabla 2).
Tabla 1. Consumo nacional aparente(CNA*) y exportacionesAño Producción
nacional(L)
CNA(L)
CNA(% de la
produccióntotal)
Exportaciones(L)
Exportaciones(% de la
producción total)
1994 2, 875, 000 2, 238 ,000 78.0 637, 000 22.01995 4, 109, 820 2, 997, 594 72.9 1, 112, 226 27.11996 5, 875, 000 4, 015, 000 68.0 1, 860, 000 32.01997 7, 220, 000 3, 940, 000 57.6 3, 280, 000 45.41998 8, 500, 000 4, 500, 000 53.0 4, 000, 000 47.01999 9, 000, 000 4, 300, 000 47.7 4, 700, 000 52.22000 8, 400, 000 3, 700, 000 44.0 4, 700, 000 56.0
*CNA = producción nacional + importaciones – exportacionesFuente: Ramales-Osorio M. y Barragán-Ramírez M. (2002)
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Tabla 2. Destino de las exportaciones de mezcalAmérica Europa Asia
Argentina Alemania Hong KongBolivia España Japón
Canadá Francia TaiwánColombia Grecia Turquía
Chile ItaliaEcuador Países Bajos
El Salvador PortugalEUA Reino Unido
Fuente: Ramales-Osorio M. y Barragán-Ramírez M. (2002)
Las exportaciones, traducidas a valores monetarios (Tabla 3), indican una
fuerte contribución a la economía estatal y nacional, pasando de
1,274,000 dls en 1994 a 79,900,000 dls en 2000.
Tabla 3. Exportaciones en volumen y en valormonetario
Año Exportaciones (L) Exportaciones (dólares)1994 637, 000 1, 274, 0001995 1, 112, 226 1, 392, 2561996 1, 860, 000 5, 580, 0001997 3, 280, 000 11, 480, 0001998 4, 000, 000 16, 000, 0001999 4, 700, 000 23, 500, 0002000 4, 700, 000 79, 900, 000
Fuente: Ramales-Osorio M. y Barragán-Ramírez M. (2002)
De la misma forma, puede observarse que a partir de 1998 existió un
comportamiento relativamente uniforme por parte del CNA y de las
importaciones, lo cual no impidió un aumento en los ingresos aportados
por estas últimas.
5
1.4. Importancia social
Ramales-Osorio y Barragán-Ramírez (2002), señalan que, debido a los
niveles altos de pobreza que presenta el estado de Oaxaca, la industria
del mezcal tiene una gran trascendencia a nivel social, favoreciendo la
generación de empleos y divisas por las exportaciones del producto y
evitando así fenómenos como la emigración. Así mismo, los autores
citados consideran a la industria mezcalera como una de las pocas
manufactureras existentes en el estado de Oaxaca, de suma importancia
para su desarrollo económico y social, dada la escasa participación del
sector secundario en la producción de bienes y servicios (18.9% de la
producción total).
1.5. La región productora de mezcal
Según la denominación de origen, publicada en el Diario Oficial de la
Federación en el mes de noviembre de 1994; la siembra, cultivo y
extracción de agave para la elaboración del mezcal deben desarrollarse
en los estados de Guerrero, Oaxaca, Durango, San Luis Potosí y
Zacatecas. Particularmente, en el estado de Oaxaca, existe una zona
dedicada principalmente a la producción de mezcal que comprende los
municipios de Sola de Vega, Miahuatlán, Yautepec, Tlacolula, Ocotlán,
Ejutla y Zimatlán.
1.6. Normas y control de calidad
La importancia económica y social del mezcal exige definir lineamientos
que permitan regular su calidad, limitando la concentración de
componentes que puedan ser nocivos para la salud, o bien, que puedan
afectar sus características sensoriales. Por ello, a partir de 1994 se
6
estableció la NOM-070-SCFI, que especifica los aspectos a regularse en
la obtención del mezcal (Tabla 4).
Tabla 4. Especificaciones para la elaboración de mezcalEspecificaciones Mínimo Máximo
% de alcohol en volumen a 20 oC (oG.L.) 36.0 55.0Extracto seco (g/L) 0.2 10.0Acidez total (mg/mL de alcohol anhidro) N.E.* 170.0Alcoholes superiores (mg/mL de alcohol anhidro) 100 400Metanol (mg/mL de alcohol anhidro) 100 300
*No especificado
Así mismo, la NOM-142-SSA1-1995, referente a las especificaciones
sanitarias de bebidas alcohólicas (Tabla 5), establece la regulación de las
siguientes características:
Tabla 5. Especificaciones para la elaboración debebidas alcohólicas
Especificaciones Límite máximo(mg/mL de alcohol anhidro)
Metanol 300Aldehídos 40Furfural 4
Alcoholes superiores* 500*Expresados en aceite de fusel o alcoholes de peso molecularsuperior al alcohol etílico expresado como alcohol amílico
Además, con la finalidad de vigilar la aplicación de estas normas, se fundó
el Consejo Mexicano Regulador de la Calidad del Mezcal A. C.
(COMERCAM), integrado por productores de mezcal de los estados de
Oaxaca, Zacatecas, San Luis Potosí, Guerrero y Durango, quienes
trabajan en coordinación con la Secretaría de Desarrollo Industrial y
Comercial (SEDEINCO), así como con la Secretaría de Comercio y
Fomento Industrial (SECOFI).
7
1.7. Características del agave tobalá
El agave tobalá pertenece al tipo de plantas conocidas como plantas
crasas, esto es, plantas caracterizadas por contar con un tallo engrosado
cuya finalidad es la de ser una reserva de agua debido a las condiciones
climáticas en las que crecen. Sus hojas se encuentran dispuestas a
manera de espiral confiriéndole una forma de roseta (Figura 1).
Figura 1. Vista superior del agave tobalá
La planta se divide en una zona aérea y una subterránea. La zona aérea
está integrada por el tallo (cabeza o piña), las hojas (pencas) y otro tallo
(escapo floral) conocido como quiote, que es donde se localizan las flores
al alcanzar la madurez (Figura 2); en tanto que la zona subterránea se
conforma por el sistema de raíces.
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Como reporta Martínez-Ramírez, el tamaño de la planta varía desde los
33 cm hasta 1 m, dependiendo de factores como el tipo de suelo y el
clima.
Figura 2. Escapo floral (quiote) de agave
El mismo autor menciona que sus hojas se caracterizan por ser de color
verde grisáceo, más anchas en la zona media y estrechándose en las
zonas de la base y punta, finalizando esta última con una espina muy
rígida, cuya tonalidad va desde el rojo óxido hasta el café rojizo. Las
partes laterales de las hojas se encuentran cubiertas de espinas de una
tonalidad rojo óxido y en forma de gancho. El ancho de la hoja puede
variar desde los 9 a los 18 cm y su largo desde los 25 a 40 cm.
El comportamiento de las hojas es el siguiente: Se despliegan a partir de
una estructura en forma de cono (cogollo) situada en la parte superior de
9
la planta (zona apical). Conforme las hojas se van desplegando, estas van
ocupando la parte media de la planta para después morir de manera
progresiva al ser desplazadas por hojas nuevas, tomando como destino
final la zona inferior de la planta.
En la zona apical también se lleva a cabo el crecimiento del escapo floral
o quiote, que es una estructura que solo crece al alcanzar su madurez
reproductiva. Según el autor citado anteriormente, el diámetro y la altura
del escapo pueden variar dependiendo de las condiciones donde crece la
planta y especialmente por la fertilidad del suelo, variando desde los 4
hasta los 12 cm de diámetro y desde los 2 hasta los 5 m de altura
(considerando la distancia desde la base del maguey hasta la punta del
escapo).
El tiempo necesario para la maduración de la planta oscila entre los seis y
nueve años y podría observarse de la siguiente manera: al llevarse a cabo
la germinación y en las primeras etapas de desarrollo, la planta es
pequeña y se integra únicamente por el sistema de raíces en la zona
basal y las hojas en la zona apical. Al aproximarse a su estado de
madurez el tallo comienza a engrosarse y, al encontrarse plenamente en
el estado maduro, el cogollo comienza a tomar una forma cilíndrica, el
cual es indicio de que el escapo está por aparecer. Al surgir este, su
crecimiento es rápido, alcanzando su estado final en aproximadamente
dos meses.
En la elaboración del mezcal, un agave en el óptimo estado de madurez
resulta de especial importancia debido a que, en esta etapa, puede
proporcionar cantidades altas de azúcar, lo que equivale a un rendimiento
alto de alcohol.
A pesar de la amplia terminología que los trabajadores de las fábricas
utilizan para reconocer al agave en sus diferentes estados de madurez,
las condiciones que generalmente se toman en cuenta para la
identificación y selección de este son:
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• Ausencia de enfermedades o plagas.
• Grado de desarrollo del escapo floral.
• Coloración de las pencas.
Por otra parte, para evitar que se lleve a cabo la reproducción de la planta
(y su muerte posterior), se corta el escapo floral, conservándose así la
planta el tiempo necesario para recolectarla.
1.8 . El proceso de elaboración de mezcal
La fabricación de mezcal empieza con la recolección y recepción de las
cabezas de agave (Figura 3), que en una primera etapa se fraccionan y
se someten a un cocimiento en hornos de forma cónica inversa,
recubiertos con piedras con el fin de mantener el calor (Figura 4).
Figura 3. Recolección de cabezas de agave
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Figura 4. Piñas de agave cocido en horno tradicional
El cocimiento se realiza con calor directo (utilizando leña), existiendo
pérdidas de azúcares, ya que en ocasiones una parte de la piña no se
cuece y en otras, la piña que tiene contacto con las piedras se quema,
generándose mieles amargas. Además, el sabor a humo que queda en el
agave cocido puede conferirle un sabor desagradable al mezcal.
Posteriormente, el agave se coloca en una pila de piedra en donde una
piedra lleva a cabo su trituración (también conocida como molienda),
empleando la fuerza de un caballo (Figura 5). Cuando el encargado de la
fábrica considera que el proceso ha terminado, se procede a transferir la
materia prima triturada (150 kg) a las tinas de fermentación (Figura 6).
Luego de colocar el agave triturado en las tinas, se le adiciona agua a
40ºC y (NH4)2SO4 (1 kg por tina de 300 L), se deja reposar por un periodo
de 24 h y se añade agua fría (extraída de pozos a una temperatura de
15ºC), mezclándose manualmente durante 2 h. A continuación, se deja
reposar durante tres días o hasta que termine el proceso de fermentación,
evaluando de forma empírica el progreso de la operación mediante la
intensidad del ruido que se genera en el fermentador, debido a la
formación de CO2 (Fábrica de mezcal “Chagoya”).
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Figura 5. Molienda de las piñas
Figura 6. Fermentación del mosto
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Finalmente, se realiza una destilación empleando alambiques de cobre
(Figura 7) y aplicando calor directo (para esto, generalmente se utiliza
leña). Los vapores de alcohol (mezcal) generados por el calentamiento
del mosto fermentado, se enfrían al pasar por un condensador o
serpentín, que se encuentra inmerso en un estanque de agua a
temperatura ambiente.
Es importante mencionar, que todo el proceso de elaboración de mezcal
se basa en parámetros de calidad establecidos de manera empírica por
cada fábrica. Esto hace que, además de la especie de agave y el tipo de
microorganismos utilizado; el procedimiento de elaboración de mezcal sea
un factor adicional que influye de forma notable sobre sus características
sensoriales.
Figura 7. Destilación y obtención del mezcal
14
1.9. La fermentación alcohólica
1.9.1. Definición. El término “fermentación alcohólica” se refiere a la
transformación bioquímica de la glucosa y fructosa a EtOH y dióxido de
carbono (CO2) de acuerdo a la ecuación de Gay-Lussac:
CH3 OHC6H12O6 + 2CO22
Este proceso inicia con la degradación de los azúcares a ácido pirúvico
vía glicólisis utilizando la ruta de Embden-Meyerhof. De manera
subsecuente, el ácido pirúvico es descarboxilado a acetaldehído
seguido por su reducción a EtOH en presencia de la enzima alcohol
deshidrogenasa y NADH2 (Figura 8) (Delfini y Formica, 2001).
HO
OOH
P
OHO
OOH
P
OHO
CH3 O
HO
CH3
CH3 OH
Fructosa
H2O
Glicólisis
NAD NADH2
CO2
Figura 8. Resumen de la fermentación alcohólica
A partir del ácido pirúvico y el acetaldehído, las levaduras pueden
formar ácido acético, láctico, málico, butírico, acetilmetilcarbinol y
acetona. Otros subproductos generados son los aminoácidos, ácidos
grasos, esteroles, etil ésteres de ácidos grasos, alcoholes como el
propanol, alcohol amílico e isoamílico, dióxido de azufre y en general,
todos los compuestos volátiles producidos por las levaduras.
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La precursora de muchos de estos productos secundarios es la acetil-
CoA derivada del ácido pirúvico. La acetil-CoA puede dar origen a
ácidos grasos de cadena media (caproico, caprílico, cáprico y láurico),
ácidos grasos de cadena larga (mirístico, palmítico y esteárico), ácidos
grasos insaturados de cadena larga (palmitoleico, oléico, linoléico y
linolénico) y esteroles.
Cuando el mosto es deficiente en estos compuestos, se sintetizan a
partir de la acetil-CoA en presencia de oxígeno. Por el contrario, si ya
existen en el medio, la levadura puede asimilarlos directamente y
transformarlos en otras moléculas como los polifenoles, que son útiles
para la regulación de los procesos de óxido-reducción (Delfini y
Formica, 2001).
1.9.2. El microorganismo. Las características deseadas de un
proceso de producción industrial de EtOH depende en gran medida del
microorganismo utilizado en la fermentación. Estos deben tener un
rendimiento alto de formación de producto por unidad de sustrato
asimilado, una tolerancia importante al EtOH, la capacidad de
mantenerse viable a temperaturas altas y tolerancia a valores de pH
bajos. Debido a estas características los microorganismos utilizados
para la producción de EtOH son las levaduras del género
Kluyveromyces y Saccharomyces (Greenfield, Pamment y Jones,
1981). De estas últimas, la especie Saccharomyces cerevisiae se
utiliza comúnmente debido a su alta tendencia hacia la fermentación
alcohólica y por su capacidad de crecimiento bajo condiciones
anaerobias estrictas (Pronk y col., 1996).
Las levaduras son capaces de utilizar una gran variedad de sustratos
dependiendo de la especie en cuestión. En general, estos
microorganismos son capaces de crecer y fermentar de manera
eficiente a pH de 3.5 a 6.0 y temperaturas de 15 a 35 ºC. Aunque a
temperaturas elevadas (40 ºC) la tasa inicial de producción de EtOH es
16
alto, el rendimiento total de la fermentación disminuye debido a una
inhibición atribuida a concentraciones elevadas del EtOH producido y a
la temperatura del reactor (Kosaric y col., 1983).
1.9.3. El sustrato. Según su importancia técnica, los sustratos pueden
ser divididos en tres tipos: ricos en azúcares simples (melazas, jugo de
caña, etc.); ricos en almidones (cereales, papa, etc.) y ricos en celulosa
(madera, bagazos, etc.) (Esser y Schmidt, 1982 y Ostergaard, Olsson y
Nielsen, 2000). Cuando se utilizan sustratos ricos en almidón o
celulosa, se requiere efectuar una hidrólisis para fragmentar y
transformar las cadenas de polisacáridos en azúcares simples
(Greenfield, Pamment y Jones, 1981). Tal es el caso de los agaves, en
donde existen azúcares denominados fructanos que necesitan
fragmentarse mediante la hidrólisis (cocción) para dar origen a
azúcares simples, siendo en su mayoría fructosa.
1.9.4. Los nutrimentos. Existen numerosos compuestos, tanto
orgánicos como inorgánicos, que son utilizados por los
microorganismos para desempeñar tareas muy importantes además de
la obtención de energía como lo es la síntesis de aminoácidos y la
regulación de reacciones de carácter metabólico. Los nutrimentos
utilizados por las levaduras se detallan a continuación.
• Nitrógeno. El contenido de nitrógeno de las levaduras es de
aproximadamente el 10% del peso seco y como tal representa
un constituyente importante de cualquier medio de crecimiento.
Por lo general, las levaduras son capaces de utilizar iones
amonio como única fuente de nitrógeno. El (NH4)2SO4 es la
fuente de nitrógeno más utilizada en fermentaciones de carácter
industrial (Greenfield, Pamment y Jones, 1981).
17
Las fuentes de nitrógeno más complejas, como mezclas de
aminoácidos, péptidos, ácidos nucléicos, bases simples (colina,
betaína, etc.), ácidos grasos y material lipídico presentan una
capacidad potenciadora del crecimiento y fermentación de las
levaduras. La contribución de los aminoácidos constituye la
mayor parte de estos efectos con los aminoácidos
transportados activamente por sistemas generales y
específicos. El transporte de iones amonio y aminoácidos se
inhiben mutuamente debido a su competencia por el ATP de la
membrana.
Las mezclas de aminoácidos son fuentes de nitrógeno más
eficientes que los iones amonio, debido a que los aminoácidos
proveen de una cantidad adicional de carbono respecto a los
iones amonio (Greenfield, Pamment y Jones, 1981).
La concentración de nitrógeno provisto por aminoácidos, así
como la relación carbono nitrógeno, regulan la actividad de la
ruta glicolítica. De forma adicional, los aminoácidos sirven como
buffer contra efectos de inhibición iónica y regulan las
reacciones de óxido-reducción (Mauricio y col., 2001).
Las purinas, pirimidinas y péptidos son fácilmente asimilados
por la levadura e incrementan los rendimientos de biomasa. La
contribución de estas fuentes adicionales de nitrógeno es
compleja, sin embargo su omisión disminuye el rendimiento de
la fermentación (Greenfield, Pamment y Jones, 1981 y Albers y
col., 1996).
• Azufre. Además del azufre elemental, se puede utilizar el
sulfato inorgánico. En este caso, el sulfato se reduce a
metionina dentro de la célula. La metionina, sin embargo, es
muy costosa como fuente de nitrógeno, por lo que se utiliza
generalmente el (NH4 )2SO4.
18
Otros compuestos importantes son el fósforo y las vitaminas, así como
algunos elementos como el potasio, magnesio, cloro, entre otros
(Greenfield, Pamment y Jones, 1981).
1.9.5. La temperatura. Las temperaturas óptimas de crecimiento y
fermentación guardan una dependencia con el tipo de microorganismo.
Particularmente, el género Saccharomyces presenta velocidades altas
de crecimiento en un intervalo de temperatura de 28 a 35 °C. Sin
embargo, para que se lleve a cabo un consumo completo del sustrato y
una mayor producción de EtOH en fermentaciones por lotes, la
temperatura óptima debe ser inferior a las anteriormente descritas, esto
con la finalidad de regular la velocidad de generación de EtOH y evitar
acumulaciones dentro de la célula, trayendo como consecuencia la
inhibición en el crecimiento de las levaduras (Greenfield, Pamment y
Jones, 1981).
1.9.6. El contenido de oxígeno disuelto. El oxígeno disuelto en el
medio se emplea principalmente como aceptor de electrones al final de
la cadena respiratoria. De manera adicional, el oxígeno también actúa
como factor de crecimiento al estar aparentemente relacionado con la
síntesis de ácido oleico y ergosterol, estimulantes del crecimiento de
las levaduras en condiciones anaerobias (Andreasen y Stier, 1954;
véase Nagodawithana, Castellano y Steinkraus, 1981). Adicionalmente,
estos autores demostraron la existencia de una relación entre la
temperatura y la cantidad de oxígeno disuelto en la producción de
EtOH, al fermentar soluciones de miel utilizando S. cerevisiae. Sus
estudios, mostraron que a una concentración de oxígeno disuelto del
13% y una temperatura de 15 °C, la cantidad de EtOH y de
microorganismos viables fue mayor que al emplear temperaturas y
concentraciones de oxígeno mayores.
19
1.9.7. La concentración de iones hidrógeno (pH). Saccharomyces
cerevisiae es un microorganismo acidófilo, que presenta un intervalo de
pH de crecimiento óptimo entre 4 y 6.
La importancia del pH en fermentaciones radica en que, durante su
crecimiento, las levaduras necesitan mantener un pH constante en su
interior, con la finalidad de que las enzimas que participan en su
metabolismo y crecimiento funcionen de manera adecuada. Cuando
existe una variación en el pH extracelular, las levaduras invierten
energía buscando equilibrar su pH interno, incorporando o eliminando
iones hidrógeno. Sin embargo, al existir variaciones altas, les resulta
imposible mantener el pH intracelular, desactivándose sus enzimas e
impidiendo el crecimiento celular y la producción de EtOH. (Greenfield,
Pamment y Jones, 1981; Neelakantam, Narendranath y Power, 2005).
1.10. Técnicas para el análisis de la fermentación
La fermentación alcohólica puede analizarse efectuando la medición de
variables como el contenido de biomasa, la concentración de azúcares
reductores y la cantidad de EtOH generado.
1.10.1. Cuantificación de microorganismos. La cuantificación de
microorganismos puede llevarse a cabo por diferentes técnicas como la
cuenta directa al microscopio, la determinación del peso seco o el
contenido de sólidos volátiles.
• Determinación de sólidos volátiles. Consiste en determinar el
contenido de microorganismos en forma de biomasa,
considerándose como materia orgánica calcinada a una
temperatura de entre 500 y 600 oC. Este valor se obtiene a partir de
la diferencia entre la materia inorgánica residuo de la calcinación y
el peso total de la muestra antes de la calcinación. Esta muestra
20
debe prepararse, haciéndose pasar por un microfiltro de fibra de
vidrio con un tamaño de poro de 0.45 micrones, esto con la
finalidad de eliminar sólidos solubles. Así mismo la muestra debe
encontrarse libre de humedad. La ventaja principal de esta técnica
es su confiabilidad, debido a que elimina la interferencia de sales u
otra materia soluble (Metcalf-Eddy Inc., 1985).
1.10.2. Determinación de la cantidad de EtOH. Para la determinación
del contenido de EtOH en una muestra, la mayoría de las técnicas
empleadas requieren la destilación de la misma, con la finalidad de
eliminar componentes que puedan interferir en el análisis. Sin embargo, la
cromatografía de gases (GC), reduce la importancia de este aspecto,
debido a que las condiciones de operación del equipo permiten la
separación de los componentes de la mezcla, permitiendo identificar y
cuantificar el EtOH sin la presencia de otros compuestos. Además, tiene
la gran ventaja de requerir volúmenes de muestra muy pequeños (de 1 a
5 µL), lo que permite realizar análisis a pequeña escala.
Como descripción general, la muestra en estado gaseoso se desplaza
con ayuda de un gas inerte (denominado fase móvil) a través de una
columna en cuyo interior se halla un agente denominado fase
estacionaria. Al pasar por la columna, existe una retención por parte de la
fase estacionaria hacia los componentes de la muestra, variando en
mayor o menor grado, dependiendo de la afinidad de cada uno de los
componentes hacia la fase. Así, al crearse un distribución desigual de
componentes entre la fase móvil y la fase estacionaria, los componentes
que sean más fuertemente retenidos por la fase estacionaria se
desplazarán de manera más lenta a través de la columna que aquellos
cuya retención sea menor. Como consecuencia de este fenómeno se
efectúa la separación, representada por la formación de picos (conocidos
como cromatogramas), los cuales pueden analizarse tanto de manera
cualitativa como cuantitativa (Skoog, Holler y Nieman, 2001).
21
1.10.3. Determinación de la cantidad de azúcares. En la cuantificación
de azúcares, específicamente azúcares reductores, se emplean técnicas
que evalúan propiedades como el índice de refracción o la capacidad de
reducción de reactivos como el sulfato de cobre (Pearson, 1986). Hay
otras técnicas que emplean equipos de análisis instrumental como el caso
del método colorimétrico (Dubois, 1956) y la cromatografía de líquidos,
cuyas características se describen a continuación.
• Método de Dubois. Esta determinación consiste en hacer
reaccionar el azúcar con fenol utilizando ácido sulfúrico para
generar un compuesto colorido (Figura 9).
OHOH
OHOH
O
OHOH
OH2
OHOH
O
OH
OHOSO3H
OHOH
O
OH
OHOH
O
OHOH
O
OH
H2SO4++
HSO4+-
-H2O
+-H2SO4
Complejo
Fructosa
Figura 9. Estructura del complejo generado a partir de la reacción defructosa con fenol en medio ácido
Existiendo una estrecha relación entre la intensidad de coloración y
la concentración de azúcares reductores presentes en la muestra.
Está técnica determina concentraciones bajas de azúcar, teniendo
como límite máximo las 60 ppm.
22
• Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC, por sussiglas en inglés). La cromatografía de líquidos se considera de
importancia especial debido su alta sensibilidad en los resultados,
utilizando cantidades reducidas de muestra (10 a 50 µL) y al amplio
número de compuestos susceptibles de ser analizados, siendo
algunos de estos no volátiles o bien, termolábiles. Dentro de estos
compuestos se encuentran los carbohidratos.
Su funcionamiento consiste en desplazar un volumen de muestra
en estado líquido, con ayuda de una mezcla de disolventes (fase
móvil), a través de una columna con una fase estacionaria
adecuada según el tipo de compuesto que se pretende analizar. De
forma semejante a la cromatografía de gases, la diferencia de
afinidad hacia la fase estacionaria, permite la separación y posterior
cuantificación de componentes de la muestra.
En general, estas técnicas tienen la ventaja de ser precisas, además de
determinar concentraciones tan pequeñas de azúcar como las partes por
millón (ppm), por lo que se necesita poca cantidad de muestra para
realizar el análisis.
23
2. ANÁLISIS DE FUNDAMENTOS
De los estudios relacionados con fermentaciones en la elaboración del
mezcal, destacan los realizados con los agaves tobalá y espadín (Agave
angustifolia Haw), por Vera-Guzmán y col. (2002). Ellos demostraron que
la fermentación del agave tobalá tuvo una mayor eficiencia de conversión
de azúcares en EtOH (48% de rendimiento), que la fermentación del
agave espadín (29% de rendimiento). Además, al efectuarse la
comparación del contenido de alcoholes superiores (2-metil-1-propanol y
3-metil-1-butanol) se encontró una concentración menor en el mosto de
agave tobalá que en el agave espadín. Estos resultados se atribuyeron a
las diferencias en las concentraciones de compuestos nitrogenados en el
mosto de cada uno de los agaves, correspondiendo a valores iniciales de
nitrógeno total de 403 mg/mL para el agave tobalá y 209 mg/mL para el
agave espadín. Por otra parte, el uso de (NH4)2SO4 permite acelerar el
proceso de fermentación y es una práctica común en los palenques. En
otro estudio realizado por Terán-Sangermán y col. (2002), se demostró
que la eficiencia en la formación de EtOH con respecto al contenido inicial
de azúcares en mosto de agave espadín, utilizando (NH4)2SO4, fue del
32.2%, en tanto que para mostos del mismo agave sin este compuesto, la
eficiencia fermentativa fue del 20.8%. Estos resultados se atribuyeron a
una mayor cantidad de nitrógeno proporcionado por el (NH4)2SO4. Dentro
de las particularidades de los estudios, está el hecho de que todos estos
se realizaron en fábricas, midiendo las condiciones ambientales, sin
establecer un control sobre las mismas.
Estudios efectuados por Albers y col. (1996), en fermentaciones de un
medio sintético compuesto principalmente por glucosa, revelaron que en
comparación con el uso de aminoácidos, el rendimiento en la cantidad de
EtOH obtenido fue menor al utilizar (NH4)2SO4, atribuyéndose este
comportamiento a una relación existente entre la producción de glicerol y
la existencia de sales de amonio como única fuente de nitrógeno.
24
El efecto de la adición de glicina ha sido reportado por Manginot y col.
(1997) y Manginot, Roustan y Sablayrolles (1998) en la fase estacionaria
de crecimiento de biomasa, al fermentar un medio sintético compuesto
por glucosa y fructosa como fuentes de carbono y con una mezcla de
aminoácidos como fuentes de nitrógeno inicial. En el estudio se encontró
que la glicina se asimiló de forma similar o mejor que la mayoría de los 30
aminoácidos utilizados, e incluso que el NH4Cl utilizado como fuente
inorgánica de nitrógeno en el experimento.
25
3. HIPÓTESIS
El empleo de glicina como fuente de nitrógeno aumenta el consumo de
azúcares, el crecimiento de biomasa y la producción de etanol en la
fermentación de mosto de agave tobalá (Agave potatorum Zucc), respecto
al empleo de sulfato de amonio.
26
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Realizar un estudio a nivel laboratorio de la fermentación de mosto de
agave tobalá en ausencia y presencia de glicina y (NH4)2SO4.
4.2. Objetivos específicos
• Determinar el consumo de azúcares, el crecimiento de biomasa y la
producción de EtOH durante el período de fermentación.
• Establecer la influencia de la glicina y (NH4)2SO4 sobre la
fermentación de mosto de agave tobalá.
27
5. METODOLOGÍA
5.1. Diagrama de bloques. Las operaciones realizadas se presentan
en la Figura 10.
Figura 10. Diagrama de bloques para la evaluación del proceso defermentación
Ajuste de laconcentración de
azúcares
Determinaciónde azúcares,
biomasa y EtOH
Selección ycolección de
agave
Obtención delmosto
Fermentación siny con (NH4)2SO4
o glicina
30 g/L 100 g/L
Fermentación siny con (NH4)2SO4
o glicina
Determinaciónde azúcares
Especificaciónde parámetros
de fermentación
28
5.2. Materiales y métodos
5.2.1. Colección y tratamiento de las plantas de agave. Los agaves
se seleccionaron y colectaron dentro de la zona habitada de la
Universidad Tecnológica de la Mixteca, tomando en cuenta las
siguientes características:
• Coloración verde-amarillenta en las pencas.
• Presencia de inflorescencias (quiote), las cuales se eliminaron.
• Ausencia de plaga y enfermedades (La presencia de una resina
color rojiza indica la existencia de gusano).
• Peso de la planta entre 20 y 25 kg.
Después de la colección de las plantas, se les eliminaron las pencas,
utilizándose únicamente la cabeza, cortándose en trozos.
5.2.2. Obtención del mosto. Se efectuó la cocción del agave durante
6 h a una temperatura de 121 °C y a una presión de 15 psia,
utilizándose una autoclave marca Presto con capacidad de 21 L. La
proporción de agua añadida fue de 5 L por 3 kg de agave.
Al finalizar la operación, se colectaron las mieles (mosto) contenidas en
el agave por medio de prensado y se eliminaron sólidos suspendidos
mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 3 min, utilizando una
centrifugadora IEC modelo HN-SII.
Se diluyó la concentración inicial de azúcares en el mosto a 30 y 100
g/L para posteriormente esterilizarlo y conservarlo en refrigeración a
4°C.
29
5.2.3. Características del reactor. El reactor construido se muestra en
la Figura 11 y consistió de un matraz Kitazato de 500 mL, en cuya
salida lateral se colocó una manguera de hule (cánula) para colectar
muestras.
La boca se selló con un tapón de hule bihoradado en el que se colocó
un termómetro y otra cánula para permitir la descarga de dióxido de
carbono.
El mezclado se realizó mediante una parrilla con agitación magnética
marca Thermolyne modelo CIMAREC SP131325.
5.2.4. Establecimiento de los parámetros de fermentación. La
fermentación se realizó en un intervalo de temperaturas de 20 a 25 °C
con una agitación de 100 rpm. El volumen de mosto se estableció en
200 mL con una concentración de azúcares inicial de 30 g/L y 100 g/L.
Figura 11. Reactor para la fermentaciónde mosto
30
5.2.5. Preparación del mosto previo a la inoculación. Antes de
efectuarse la inoculación, el mosto refrigerado se agitó durante 5 min a
300 rpm, calentándose de manera simultánea hasta alcanzar un
intervalo de temperatura de 20-25 °C.
Tomando como base cantidades empleadas en la industria, se pesaron
0.5 g de cada compuesto nitrogenado ((NH4)2SO4 y glicina), los cuales
se añadieron por separado, siguiendo las especificaciones mostradas
en la Tabla 7. Estas cantidades representaron el 30% del nitrógeno
necesario para efectuar el balance de nitrógeno en el mosto con una
concentración de fructosa de 30 g/L y el 9% para el balance del mosto
con concentración de fructosa de 107.6 g/L (Galíndez-Mayer y Ruiz-
Ordaz, 1994).
Tabla 6. Experimentos realizados y condiciones de fermentaciónSerie Experimento Sustrato g/L inicial de
azúcares Fuente denitrógeno
Agitación(rpm)
Análisisrealizados
Control Ninguna1 Sulfato (NH4)2SO4
GlicinaMosto 30
Glicina100 Azúcares *
Control Ninguna2 Sulfato (NH4)2SO4
GlicinaMosto 107
Glicina100
Azúcares aBiomasa
EtOH* Método de Duboisa HPLC
5.2.6. Inoculación del mosto. Experimentos realizados inoculando con
32 g de levadura (AOAC, 945.30) mostraron tiempos de fermentación
demasiado cortos (5 h) y generación excesiva de espuma, por lo que la
cantidad de levadura para inocular el mosto se redujo hasta 1 g. Esto
permitió prolongar el tiempo de fermentación a 14 h, colectándose
muestras de 7 mL cada 2 h.
31
5.2.7. Determinación de azúcares por colorimetría. El método se
aplicó según lo reportado por Dubois (1956) utilizando un
espectrofotómetro UV/Vis marca Perkin Elmer, modelo lambda 35
(Figura 12) a una longitud de onda de 490 nm.
Para eliminar la levadura contenida en la muestra colectada, se
centrifugó por 3 min a 1,500 rpm en una centrifugadora marca SOL-
BAT modelo J-12, y posteriormente una porción del sobrenadante se
diluyó con agua destilada a una relación de 1:10000.
Con la finalidad de evaluar la confiabilidad de los resultados arrojados
por la técnica de Dubois, se efectuó la fermentación de una solución de
fructosa con una concentración inicial de 35 g/L y se determinó su
concentración de azúcares a diferentes tiempos de fermentación.
5.2.8. Determinación de azúcares por cromatografía de líquidos(HPLC). Se utilizó un equipo de HPLC marca GBC con detector de IR
(Figura 13) y equipado con una columna cromatográfica de fase amino
(250 X 4.6 mm SS Exil Amino 5µm) cuya temperatura se mantuvo a 50oC con ayuda de un horno marca Eppendorf modelo TC-50.
Se usó agua grado HPLC (J.T. Baker) como eluyente a una velocidad
de flujo de 1 mL/min y a un intervalo de presión de 900-1,200 psia.
Las muestras colectadas se prepararon haciéndose pasar por
membranas filtrantes de celulosa o nylon de tamaño de poro de 0.45
µm marca Agilent y se diluyeron a una concentración de 10% v/v
utilizando agua HPLC (J.T. Baker). El volumen inyectado fue de 20 µL.
5.2.9. Determinación de biomasa por sólidos volátiles. Se midió un
volumen de 5 mL de la muestra colectada y se filtró a vacío en un crisol
Gooch equipado con un filtro de fibra de vidrio marca Sartorius, grado
GMF 1. Posteriormente, se eliminó la humedad de la muestra mediante
calentamiento a un intervalo de temperatura de 90-110 °C durante 2 h
(horno marca RIOSSA) y finalmente se colocó en una mufla marca
32
Thermolyne modelo Furnace 1400FB141SM a un intervalo de
temperatura de 545-560 °C durante 20 min para su calcinación.
5.2.10. Determinación de EtOH por cromatógrafía de gases. Se
utilizó un equipo de cromatografía de gases con detector FID marca
Perkin Elmer modelo Autosystem XL (Figura 13) y equipado con una
columna capilar de gel de sílice recubierta con polietilenglicol (PE-
WAX, 30 m x 0.250 mm 0.25 micron). Se usó helio como gas
acarreador a una presión de 14.0 psia y un flujo de 14 mL/s. La
temperatura del inyector se mantuvo a 150 oC y la del detector a 200oC, en tanto que la temperatura inicial del horno se programó a 80 oC,
incrementándose a una velocidad de 10 oC/min hasta alcanzar los 90oC.
Las muestras colectadas se prepararon haciéndose pasar por
membranas filtrantes de celulosa o nylon de tamaño de poro de 0.45
µm marca Agilent y se diluyeron a una concentración del 40% v/v en el
caso de la hora 2; y a una concentración del 30% v/v para las horas
restantes. El volumen inyectado fue de 4 µL.
5.2.11. Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza
(ANOVA), aplicando la prueba de Dunnett con α=0.05 para
comparaciones bilaterales.
33
6. RESULTADOS
Los resultados de la fermentación de mosto de agave tobalá con una
concentración inicial de azúcares de 30 g/L se presentan en la Gráfica
1, en donde puede observarse que el empleo de (NH4)2SO4 tuvo una
influencia importante sobre la fermentación, asimilándose una mayor
cantidad de azúcares que en el mosto adicionado con glicina y en el
mosto control a partir de las cuatro horas de fermentación,
aprovechándose hasta el 90.9% del total entre las horas ocho y diez
(Tabla 7).
Gráfica 1. Consumo de azúcares en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 30 g azúcar/L
Tabla 7. Consumo de azúcares en fermentación de mosto de agavea una concentración inicial de 30 g azúcar/L
g/L deazúcares
iniciales [σ]
Fuente denitrógeno
g/L deazúcaresfinales [σ]
Consumo(%)
Prueba deDunnet
30.2[±0.22] Ninguna 10.5 [±0.10] 65.2 ---31.4[±0.48] (NH4)2SO4 2.9 [±0.13] 90.9 7.64>0.3229.9[±0.17] Glicina 12.6 [±0.18] 57.9 2.09>0.32
σ = Desviación estándar
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Azú
care
s (g
/L)
ControlSulfatoGlicina
34
El mosto adicionado con glicina mostró una asimilación de azúcares
menor que al utilizar (NH4)2SO4, observándose un comportamiento
similar en el experimento control. No obstante, la Tabla 7 muestra que
al final de la fermentación, en el mosto control existió un
aprovechamiento de azúcares del 65.2%, en tanto que en el mosto con
glicina solo existió un consumo del 57.9%.
Al aplicar la prueba de Dunnet, se obtuvo que el valor de la diferencia
entre la concentración final de azúcares al emplear alguno de los
compuestos nitrogenados y la concentración final de azúcares en el
experimento control fue mayor al compararlo con un valor de
referencia. Esto, en otras palabras, expresa que el empleo de
(NH4)2SO4 o glicina produjo una diferencia significativa respecto al
control en el consumo de azúcares de mosto.
35
La Gráfica 2 muestra los resultados de las fermentaciones de mosto de
agave tobalá a una concentración inicial de azúcares de 100 g/L. En el
mosto adicionado con (NH4)2SO4, el consumo de azúcares fue mayor
que en el mosto con glicina y en el mosto control, a partir de las seis
horas de fermentación. Por otra parte, en el mosto adicionado con
glicina existió el menor consumo de azúcares durante la mayor parte
del periodo de fermentación.
Gráfica 2. Consumo de azúcares en la fermentación de mostode agave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
En la Tabla 8 se observa que al utilizar (NH4)2SO4, el porcentaje de
aprovechamiento de azúcares al final del proceso fue del 71.0%, en
tanto que en el mosto control y en el mosto con glicina, el
aprovechamiento fue del 57.3% y del 49.0% respectivamente.
El análisis estadístico mostró que el empleo tanto de glicina como de
(NH4)2SO4 produjo una diferencia significativa respecto al control al
final de la fermentación.
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Azú
care
s (g
/L)
ControlSulfatoGlicina
36
Tabla 8. Consumo de azúcares en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
g/L deazúcares
iniciales* [σ]
Fuente denitrógeno
g/L deazúcaresfinales [σ]
Consumo(%)
Prueba deDunnet
107.6 [±0.41] Ninguna 31.5 [±0.07] 70.7 ---107.6 [±0.62] (NH4)2SO4 21.4 [±0.10] 80.0 10.06>2.09107.6 [±0.49] Glicina 37.6 [±1.55] 65.0 6.14>2.09
* Valor teóricoσ = Desviación estándar
Las velocidades volumétricas de consumo de sustrato (Qs) alcanzadas
en cada uno de los experimentos realizados se presentan en la Gráfica
3. Al analizar el comportamiento de Qs desde el inicio de la
fermentación hasta las diez horas, puede observarse que en el mosto
adicionado con (NH4)2SO4, Qs fue mayor que en los otros
experimentos a partir de las seis horas.
Gráfica 3. Velocidad volumétrica de consumo de sustrato (Qs) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
El mosto adicionado con glicina mostró un ligero incremento en Qs en
las primeras dos horas de fermentación, sin embargo, presentó la Qs
más baja durante la mayor parte del proceso. En el experimento
control, existió un incremento importante en Qs durante las cuatro
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Qs
(g/L
h) ControlSulfatoGlicina
37
horas de fermentación, sin embargo también se presentó un descenso
considerable después de este periodo.
En la Gráfica 4 se muestra el comportamiento de la concentración de
biomasa con respecto al tiempo. Puede apreciarse que, después de
seis horas de fermentación, el mosto con (NH4)2SO4 presentó una
mayor concentración de biomasa que en el mosto control y en el mosto
con glicina. En este último, existió la menor concentración de biomasa
durante todo el periodo de fermentación.
Gráfica 4. Crecimiento de biomasa en la fermentación de mostode agave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
En la Tabla 9 se observa que, al finalizar la fermentación, la concentración
de biomasa en el mosto con (NH4)2SO4 se incrementó en un 100%
respecto a su concentración inicial, en tanto que en el mosto con glicina y
en el mosto control, existió un incremento del 56.0% y del 61.6%
respectivamente.
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Bio
mas
a (g
/L)
ControlSulfatoGlicina
38
Tabla 9. Crecimiento de biomasa en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
g/L de biomasainicial
Fuente denitrógeno
g/L de biomasafinal
% de incremento
5.0 Ninguna 8.1 61.65.0 (NH4)2SO4 10.0 100.45.0 Glicina 7.8 56.0
Las velocidades volumétricas de crecimiento de biomasa (Qx) alcanzadas
en cada uno de los tres experimentos se muestran en la Gráfica 5.
En las primeras dos horas de fermentación, el mosto control y el mosto
con (NH4)2SO4 presentaron una Qx similar, en tanto que en el mosto con
glicina fue menor. A partir de seis horas, la biomasa en el mosto con
(NH4)2SO4 alcanzó una Qx mayor que en el mosto control y en el mosto
con glicina.
Gráfica 5. Velocidad volumétrica de crecimiento de biomasa (Qx) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
La adición de (NH4)2SO4 en el mosto tuvo efecto sobre la generación de
producto, existiendo una concentración mayor de EtOH respecto al
mosto adicionado con glicina y al mosto control a partir de las seis
horas de fermentación según se muestra en la Gráfica 6.
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Qx
(g/L
h) ControlSulfatoGlicina
39
También puede observarse que la concentración de EtOH en el mosto
adicionado con glicina fue menor al control entre las cuatro y diez
horas, presentando un comportamiento similar al finalizar la
fermentación.
Gráfica 6. Generación de EtOH en la fermentación de mosto deagave a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
La Tabla 10 presenta las concentraciones de EtOH obtenidas al finalizar
la fermentación. El mosto con (NH4)2SO4 presentó una concentración de
27.5 g/L de EtOH, la cual fue mayor que las obtenidas en el mosto control
y en el mosto con glicina.
La prueba de Dunnett reveló que únicamente la adición de (NH4)2SO4
provocó una diferencia significativa en la concentración final de EtOH en
la fermentación del mosto.
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
EtO
H (g
/L)
ControlSulfatoGlicina
40
Tabla 10. Generación de EtOH en la fermentación demosto de agave a una concentración inicial de 107 g
azúcar/Lg/L de EtOH
inicialFuente denitrógeno
g/L de EtOHfinal
Prueba deDunnett
0.00 Ninguna 17.48 ---0.00 (NH4)2SO4 27.52 10.03>1.150.00 Glicina 16.86 0.63<1.15
Al efectuarse un análisis de las velocidades volumétricas de formación
de producto (Qp) mostradas en la Gráfica 7, puede apreciarse que a
partir de las seis horas, existe una diferencia notable en las Qp de los
tres experimentos, siendo la Qp del mosto con (NH4)2SO4 mayor
respecto al mosto control y al mosto con glicina, manteniéndose
durante la mayor parte del tiempo de fermentación. Al efectuar la
comparación de Qp entre el mosto control y el mosto añadido con
glicina se tiene que, a pesar de que existió una concentración de EtOH
similar al término de la fermentación, no existe el mismo
comportamiento en la Qp durante el desarrollo de la fermentación.
Gráfica 7. Velocidad volumétrica de generación de producto (Qp) en lafermentación de mosto a una concentración inicial de 107 g azúcar/L
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (h)
Velo
cida
d vo
lum
étric
a (g
/Lh)
ControlSulfatoGlicina
41
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos mostraron que la adición de (NH4)2SO4 en la
fermentación de mosto de agave tobalá influyó sobre la producción de
biomasa y EtOH aumentando su concentración, y sobre el consumo de
azúcares aumentando su porcentaje de consumo. Un efecto similar del
(NH4)2SO4 en mosto de agave espadín (Agave angustifolia Haw) fue
observado por Terán-Sangermán, atribuyendo los resultados obtenidos a
la fácil asimilación del nitrógeno contenido así como a un aporte de azufre
adicional. Trabajos realizados por Arrizon y Gschaedler (2002) mostraron
que el empleo de (NH4)2SO4 en combinación con otros aminoácidos,
disminuyó el tiempo de consumo de azúcares, además de aumentar la
cantidad de EtOH generado y el crecimiento de biomasa en mostos de
agave azul (Agave tequilana Weber var. azul). Estos autores atribuyen el
efecto del (NH4)2SO4 a la activación de la síntesis de proteínas, la cual a
su vez tuvo efecto sobre la activación del transporte de azúcares, que
guarda relación con la cantidad de nitrógeno asimilable en el medio.
Los resultados también revelaron que el uso de glicina no incrementó el
consumo de azúcares, la producción de biomasa ni la generación de
EtOH, encontrándose valores más bajos o similares a los obtenidos en
mostos sin nitrógeno adicional. Este comportamiento ha sido reportado
por Kolothumannil e Ingledew (1990) en trigo hidrolizado, en donde los
experimentos adicionados con glicina presentaron un consumo de
sustrato menor que un experimento control, al que no se le adicionó algún
compuesto nitrogenado. La explicación que dan los autores a estos
resultados es que la ausencia de oxígeno impide la conversión de la
glicina en glioxilato. Transformación intracelular que, bajo condiciones
aerobias, es necesaria para la asimilación del nitrógeno. Así mismo,
mencionan que la presencia de ciertos aminoácidos como la lisina y la
arginina pueden inhibir el crecimiento y la división celular de las
levaduras. Respecto a esto último, Pirt (1975) señala la existencia de
42
grupos de aminoácidos que, en conjunto, inhiben el crecimiento de los
microorganismos, debido a la competencia por una permeasa común.
Para el caso específico de la glicina, la presencia de serina, treonina y
alanina pueden provocar este efecto.
43
8. CONCLUSIONES
El (NH4)2SO4 tuvo influencia sobre la fermentación de mosto de agave
tobalá, observándose las velocidades volumétricas más altas de consumo
de sustrato, crecimiento de biomasa y generación de EtOH.
La glicina no incrementó la formación de EtOH, presentando además,
velocidades volumétricas más bajas de consumo de sustrato y de
crecimiento de biomasa.
44
9. PERSPECTIVAS
La información generada, amplía el conocimiento en lo que respecta a la
elaboración del mezcal al mostrar el efecto del (NH4)2SO4 y la glicina,
sobre la fermentación de mosto de agave tobalá. Sin embargo, se vuelve
importante efectuar trabajos que permitan determinar la cantidad óptima
de (NH4)2SO4 para producir las concentraciones más altas de EtOH.
También es necesario estudiar de forma comparativa, el efecto del
(NH4)2SO4 sobre la fermentación de mostos obtenidos a partir de otras
especies de agave, mencionadas en la NOM-070-SCFI-1994 (Agave
angustifolia Haw, Agave weberi Cela, etc). Esto tendría como finalidad
comparar la producción de EtOH y establecer los requerimientos de
(NH4)2SO4 según la especie de agave.
Finalmente, conviene verificar la existencia de alguna relación entre el uso
de (NH4)2SO4 y la generación de compuestos como los alcoholes
superiores, aldehídos, cetonas o el glicerol. Este último, de acuerdo a
Albers y col. (1996), está relacionado con una reducción en la producción
de EtOH.
45
10. PUBLICACIONES
Esta tesis ha dado origen a tres publicaciones:
• Ortiz-Bravo E.G., Robles-González V.S., Lemus-Fuentes E. y
Salas-Coronado R. (2005). “Fermentación de Agave potatorum Zucc
en presencia de glicina o sulfato de amonio”. Revista de la Sociedad
Química de México. 49, c-163, 175.
• Ortiz-Bravo E.G. y Salas-Coronado R. (2005). “El proceso de
elaboración del mezcal”. Temas de ciencia y tecnología. 9, 45-51.
• Ramales-Osorio, M. y Ortiz-Bravo E.G. (2006). “El proceso de
elaboración del mezcal y la importancia económica de la industria”.
Observatorio de la Economía Latinoamericana:
http://www.eumed.net/cursecon/ecolat/mx
46
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del mezcal y la economía oaxaqueña”. Observatorio de la
Economía Latinoaméricana:
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Bautista P. B., López-Pérez M. G. y Santiago-García P. (2002).“Estudio comparativo de la fermentación natural e inducida del
mosto de agave (Agave angustifolia Haw), en la elaboración
50
tradicional del mezcal”. Memorias del Segundo Foro de la
Agroindustria del Mezcal, Oaxaca, Oax.
• Vera-Guzmán A., Terán-Sangermán U., Bautista P. B., López-
Pérez M. G. y Santiago-García P. (2002). “Evaluación química del
mosto de Agave angustifolia Haw y Agave potatorum Zucc durante
la fermentación en la elaboración del mezcal oaxaqueño”.
Memorias del Segundo Foro de la Agroindustria del Mezcal,
Oaxaca, Oax.
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Dekker Inc., Nueva York, Estados Unidos. 599-626.
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España. 759-776, 785-800.
• Stanbury P. y Whitaker A. (1989). “Principles of fermentation
technology”. Ed. Pergamon Press, Nueva York, Estados Unidos.
11-23.
51
ANEXO
CONSTRUCCIÓN DE CURVAS DE CALIBRACIÓN
• Determinación de azúcares por el método de Dubois.La curva de calibración se construyó empleando soluciones de
fructosa de 10, 20, 30, 40 y 50 ppm, analizándose por triplicado
utilizando el espectrofotómetro UV/Vis mostrado en la Figura 12. El
coeficiente de correlación fue de 99.9% con un error residual de
0.0069 (Gráfica 8).
Gráfica 8. Curva estándar para ladeterminación de azúcares por colorimetría
y = 0.0118xR2 = 0.9992
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0 10 20 30 40 50
Concentración (ppm)
Abs
orbe
ncia
52
Figura 12. Equipo de espectrofotometría UV/Visible
• Determinación de azúcares por HPLCLa curva de calibración se construyó empleando soluciones de
fructosa de 2,000, 4,000, 6,000, 8,000 y 10,000 ppm, analizándose
por triplicado en el equipo de HPLC mostrado en la Figura 13. Se
obtuvo un coeficiente de correlación del 99.9% (Gráfica 9).
Gráfica 9. Curva estándar para la determinación deazúcares por HPLC
y = 263.57xR2 = 0.9999
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
2000 4000 6000 8000 10000
Concentración (ppm)
Are
a
53
Figura 13. Cromatógrafo de líquidos
• Determinación de EtOH por GC. La curva de calibración se
construyó empleando soluciones de EtOH de 0.2, 0.5, 1.0, 3.0, 6.0,
9.0 y 11.0%, analizándose por triplicado mediante el uso del equipo
de GC mostrado en la Figura 14. Se obtuvo un coeficiente de
correlación del 99.7% (Gráfica 10).
Gráfica 10. Curva estándar para determinación deEtOH por GC
y = 5666.3xR2 = 0.9967
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Concentración (% v/v)
Are
a
54
Figura 14. Cromatógrafo de gases