tesis doctoral factor de necrosis tumoral alpha …
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FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
TESIS DOCTORAL
FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALPHA
COMO MARCADOR DE INFLAMACIÓN EN
FUMADORES SANOS
Autor: Juan Manuel Díez Piña
Directores:
Esteban Pérez Rodríguez
Salvador Díaz Lobato
Madrid, 2010
Es más fácil variar el curso de un río que el carácter de un hombre
Proverbio chino
A mi madre
AGRADECIMIENTOS
Parecía que nunca iba a llegar, pero siempre había tenido ilusión por realizar una tesis
doctoral. Es un duro trabajo, pero si algo me caracteriza es la tenacidad y el trabajo. Y al
final aquí está el fruto de dicho trabajo. Claro que sin ayuda no hubiera podido, por eso
quiero en este apartado agradecer a la gente que ha estado conmigo de una u otra
manera.
A Iván, mi “corrector” particular... y mucho más. Σέ ευχαριστώ, Σέ αγαπώ πολύ
A Javi y Juan, mis sobrinos, que no son simplemente mis sobrinos, son mis niños
A mi padre, a mi hermana y a mis tíos (Emilia y Jose)
Al resto de mi familia
A mis amigos, ellos saben quienes son, tanto en Sevilla, como en Madrid, en Écija y en
Granada
A Salva y Esteban, mis directores
A Sari, por sus buenos consejos. Y a Alvarito, por dejarle tiempo a sus padres
A Mª Jesús Fernández Aceñero, siempre está on-line cuando la necesito con el SPSS
A Mª Jesús Llorente, del laboratorio del hospital de Móstoles, por su ayuda en la
metodología del análisis de muestras. Y a sus técnicos de laboratorio, sobre todo a
Carmen
A mis compañeros del servicio de Neumología del Hospital de Móstoles, especialmente
a Lola Álvaro
A Asunción Flórez, enfermera de espirometrías, dispuesta siempre a colaborar
A Isabel González, por su apoyo logístico, y su ánimo
A todo el personal del hospital (y no perteneciente al mismo) que ha colaborado como
voluntario en este estudio
ÍNDICE
Índice
I.- Justificación, hipótesis y objetivos................................................................................1
1.- Justificación......................................................................................................2
2.- Hipótesis...........................................................................................................3
3.- Objetivos...........................................................................................................3
II.- Respuesta inflamatoria al tabaco.................................................................... Página 5
1.- Introducción......................................................................................................6
2.- Estudios comparativos......................................................................................8
2. a.- Fumadores sanos...............................................................................8
2. b.- EPOC y fumadores sin obstrucción al flujo aéreo.........................16
3.- Efectos agudos del tabaco..............................................................................26
4.- Respuesta inflamatoria dosis-dependiente.....................................................29
5.- Efectos de la reducción del consumo de tabaco en la inflamación................30
6.- Efectos del abandono del consumo de tabaco en la inflamación...................31
III.- Factor de necrosis tumoral alpha................................................................ Página 35
1.- Introducción....................................................................................................36
2.- Mecanismo de acción.....................................................................................38
3.- Metabolismo del TNF-α.................................................................................40
4.- Receptores del TNF-α....................................................................................41
5.- TNF-α y tabaco..............................................................................................42
6.- TNF-α y EPOC..............................................................................................50
6.1.- Estudios de laboratorio....................................................................50
6.2.- Estudios en humanos.......................................................................55
7.- Niveles de TNF-α en la población general....................................................56
Índice
IV.- Condensado de aire exhalado...................................................................... Página 58
1.- Introducción....................................................................................................59
2.- Descripción de la técnica................................................................................61
3.- Ventajas e inconvenientes de la técnica.........................................................66
4.- Posibles utilidades del condensado de aire exhalado.....................................75
5.- Conclusiones..................................................................................................78
V.- Material y métodos....................................................................................... Página 80
1.- Sujetos estudiados.........................................................................................81
1.a.- Criterios de inclusión.......................................................................81
1.b.- Criterios de exclusión......................................................................82
2.- Protocolo del estudio......................................................................................82
2.a.- Diseño..............................................................................................82
2.b.- Procedimientos................................................................................83
2.b.1.- Análisis de sangre.............................................................84
2.b.2.- Condensado de aire exhalado............................................84
2.b.3.- Pruebas funcionales respiratorias......................................87
2.b.4.- Determinaciones analíticas...............................................88
3.- Aspectos éticos...............................................................................................91
4.- Variables a estudiar.......................................................................................92
4.a.- Datos antropométricos.....................................................................92
4.b.- Datos de consumo de tabaco............................................................92
4.c.- Espirometrías...................................................................................92
4.d.- Condensado de aire exhalado..........................................................93
Índice
4.e.- TNF-α..............................................................................................93
5.- Análisis estadístico de datos...........................................................................93
VI.- Resultados................................................................................................... Página 95
1.- Análisis descriptivos.......................................................................................97
1.a.- Serie global......................................................................................97
1.b.- Grupo control.................................................................................103
1.c.- Grupo estudio.................................................................................106
2.- Análisis estadístico.......................................................................................110
2.a.- Comparación entre grupos estudio/control....................................110
2.b.- Correlaciones.................................................................................116
2.b.1.- TNF-α suero y condensado de aire exhalado vs datos
antropométricos..........................................................................116
2.b.2.- TNF-α suero y condensado vs función pulmonar..........123
2.b.3.- TNF-α suero y condensado vs consumo de tabaco........129
2.b.4.- TNF-α suero y condensado vs parámetros del
condensador................................................................................130
2.b.5.- Volumen de muestra vs consumo de tabaco...................133
2.b.6.- Volumen de muestra obtenido vs parámetros
condensador................................................................................134
VII.- Discusión................................................................................................. Página 135
1.- Metodología..................................................................................................136
1.a.- Diseño............................................................................................137
Índice
1.b.- Sujetos estudiados..........................................................................136
1.c.- Criterios de inclusión/exclusión.....................................................137
1.d.- Recogida de muestras del condensado de aire exhalado...............138
2.- Resultados.....................................................................................................141
2.a.- Valores de TNF-α plasmáticos......................................................141
2.b.- Valores de TNF-α en condensado de aire exhalado......................143
2.c.- Influencia de la cuantía de consumo de tabaco..............................144
2.d.- Volumen de condensado recogido.................................................145
3.- TNF-α como marcador precoz de enfermedad............................................147
VIII.- Conclusiones.......................................................................................... Página 150
IX.- Bibliografía............................................................................................... Página 153
X.- Abreviaturas............................................................................................... Página 169
XI.- Anexos...................................................................................................... Página 172
- Anexo I. Aprobación del estudio por el CEIC del hospital.........................173
- Anexo II. Modelo de consentimiento informado..........................................175
- Anexo III. Base de datos..............................................................................178
- Anexo IV. Resumen en Inglés.....................................................................191
I. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Justificación, hipótesis y objetivos
2
1.- Justificación
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es un problema de salud
pública, ya que actualmente ocupa el cuarto lugar en causas de mortalidad en países
desarrollados, pero se estima que en 2020 llegue a ocupar el tercer puesto en la referida
escala1. La población mundial está afectada por EPOC en un 10%, pudiendo llegar la
prevalencia al 50% cuando nos referimos a grupos de grandes fumadores2. En España,
el estudio IBERPOC estableció una prevalencia de EPOC del 9,1%, estando el 78,2%
de los casos sin diagnosticar previamente3. Más recientemente, y dentro del estudio
EPI-SCAN, se ha establecido la prevalencia de EPOC en personas entre 40 y 80 años en
10,2%4.
La EPOC se define como una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible,
siendo el consumo de tabaco el principal causante de dicha enfermedad. El problema del
diagnóstico de esta enfermedad es que, una vez detectada la obstrucción en la
espirometría, el proceso suele resultar ya irreversible.
La EPOC también se puede definir como una respuesta inflamatoria anómala a
partículas o gases nocivos, por lo que la inflamación forma parte del proceso de
desarrollo de la EPOC desde sus fases más tempranas. Por esta razón, sería muy
importante detectar los fenómenos inflamatorios en el período “silencioso” de la
enfermedad, fase en la que aún la obstrucción bronquial no es demostrable en la
espirometría. Aún desconocemos varios aspectos de la relación consumo de tabaco-
EPOC, como por ejemplo, por qué unos fumadores desarrollan una pérdida acelerada de
función pulmonar y otros no, o cuál es el “nivel de seguridad” de consumo de tabaco
(cantidad y tiempo) para desarrollar EPOC. Lo ideal sería poder contar con un método
Justificación, hipótesis y objetivos
3
que identificase a los fumadores en riesgo de padecer EPOC para poder detectarlos e
incidir en ellos más incisivamente en el abandono del consumo de tabaco.
Existen múltiples proteínas implicadas en la inflamación y descritas igualmente
en la EPOC. El factor de necrosis tumoral alpha (TNF-α) es una citocina pro-
inflamatoria que se ha detectado en varias enfermedades inflamatorias, así como en
pacientes EPOC, ya sean en fase estable o agudizado.
La toma de muestras para la determinación de la inflamación a nivel bronquial
ha limitado hasta ahora el número de muestras incluido en los estudios. Desde hace
unos años existe un interés creciente por una técnica no invasiva que obtiene muestras
que podrían equivaler al fluido extracelular de las vías aéreas inferiores: el condensado
de aire exhalado (CAE). Se piensa que este condensado procede de los alveolos y
bronquíolos, siendo por tanto el contenido equivalente al de un lavado broncoalveolar
(BAL)5. En el CAE se pueden detectar sustancias volátiles y no volátiles, como
proteínas o sustancias oxidantes, que están implicadas en varias patologías pulmonares.
2.- Hipótesis
En los fumadores sin patología existe una inflamación tanto a nivel local como
sistémico, que se puede detectar antes de que exista una pérdida de función pulmonar.
Esta inflamación está en relación con la cuantía de consumo de tabaco.
3.- Objetivos
• Objetivo primario: Analizar diferencias en la citocina inflamatoria factor
de necrosis tumoral (TNF-α) entre un grupo de fumadores y un grupo
control, ambos sin patología.
Justificación, hipótesis y objetivos
4
• Objetivos secundarios:
- Estudiar la influencia de las características antropométricas de los
pacientes en las cifras de la citosina a estudio.
- Estudiar la relación que el consumo de tabaco puede tener con los
valores de TNF-α.
- Saber si los valores de TNF-α se relacionan con la función
pulmonar.
5
II. RESPUESTA INFLAMATORIA AL TABACO
Respuesta inflamatoria al tabaco
6
1.- Introducción
Según la Organización Mundial de la Salud, la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica (EPOC) es la cuarta causa de muerte en países desarrollados, y se prevé que sea
la tercera en 20201. Esta enfermedad afecta al 10% de la población mundial, pero su
prevalencia entre los grandes fumadores puede alcanzar el 50%2.
La EPOC está infradiagnosticada por distintas causas: la enfermedad es de
comienzo insidioso; el paciente subestima sus síntomas, atribuyéndoselos al tabaco, por
lo que no suele consultar con su médico y llega tarde a la intervención por parte del
mismo; y aún no existe una buena concienciación médica del problema6. Cuando se
realizan programas activos de detección de esta enfermedad se suelen obtener resultados
llamativos, como en el caso del proyecto PADOC. Este consistía en realizar
espirometrías a todo paciente mayor de 35 años, fumador de más de 10 cigarros/día o
exfumador de al menos 10 paquetes-año. Se realizaron 3209 espirometrías válidas,
detectando 723 casos (22,5%) funcionales de EPOC no sospechada7. En el estudio
epidemiológico multicéntrico IBERPOC se estableció una prevalencia de EPOC en
España del 9,1%, estando el 78,2% de los casos (284 de 363) sin diagnosticar
previamente3. Más recientemente, y dentro del estudio EPI-SCAN, se ha establecido la
prevalencia de EPOC en personas entre 40 y 80 años en 10,2%. De ellos, el 56% eran
EPOC leves, el 39% moderados y el 5% graves o muy graves, siendo más frecuente en
varones, y aumentando el porcentaje en ambos sexos con la edad. Del total de EPOC
detectados el 13,2 % eran fumadores activos, el 12,3% eran exfumadores y el 5,65%
eran EPOC en personas que nunca habían fumado4.
El humo del tabaco está presente casi siempre que se diagnostica a un paciente
de EPOC. Sin embargo, sólo un 15% de los fumadores desarrolla EPOC. La definición
Respuesta inflamatoria al tabaco
7
de esta enfermedad es una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible; no
obstante cuando la espirometría detecta dicha obstrucción, el problema está ya
instaurado y aunque se abandone el hábito de fumar, el proceso inflamatorio puede
resultar irreversible. La EPOC también se define como una respuesta inflamatoria
anormal a partículas nocivas o gases, por lo que una inflamación pulmonar puede ser un
evento patológico temprano en la EPOC. Por esta razón es muy importante detectar los
fenómenos inflamatorios en el periodo “silencioso” de la enfermedad.
La inmunidad innata es una respuesta rápida y no específica a microorganismos
y a daño tisular. Aún no se conoce la causa por la cual el humo del tabaco desencadena
la respuesta inmune innata, aunque la hipótesis de inmunidad de Matzinger (“danger
model”)8 de que no son los microbios, sino el stress celular o el daño tisular secundario
a ellos los que desencadenarían la respuesta inmune, podría servir de explicación. Las
infecciones o el daño por exposición ambiental, el stress oxidativo o la muerte celular
pueden liberar autoantígenos secuestrados, modificar proteínas, dañar la mitocondria y
liberar DNA de células apoptóticas. El sistema inmune puede reconocer estos productos
como antígenos extraños y desencadenar una reacción inmune. En fumadores, esos
antígenos pueden ser liberados como resultado de necrosis y apoptosis de células
epiteliales y endoteliales, así como del daño de la matriz extracelular. El resultado final
es que los macrófagos y células dendríticas producen citocinas y quimiocinas que
dirigen las condiciones inflamatorias requeridas para activar el sistema inmune. La
mayoría de los fumadores no avanzan en este estado y no llegan a desarrollar EPOC9.
La inflamación inducida por el tabaco se puede resumir en los siguientes
eventos: los neutrófilos y macrófagos alveolares serían reclutados en la superficie
epitelial pulmonar, cuyas células serían dañadas al igual que las proteínas intersticiales,
Respuesta inflamatoria al tabaco
8
siendo ambas procesadas como péptidos y reconocidas por las células T iniciando su
activación y proliferación. Una vez activadas, las células T reclutarían al sitio de la
inflamación más neutrófilos y macrófagos alveolares, así como eosinófilos. Los
linfocitos CD8+ son capaces de iniciar la producción de IL-5, factor quimiotáctico de
eosinófilos y activador de citocinas, y de IL-8, que actúa como quimiotáctico potente de
neutrófilos. Se perpetuaría la respuesta inflamatoria inducida por el tabaco debido al
papel crucial de los CD8+ en la inflamación de la vía aérea pequeña10.
2.- Estudios comparativos
En la literatura médica se pueden encontrar muchas publicaciones que aportan evidencia
de la inflamación inducida por el tabaco. La mayoría son estudios comparativos entre no
fumadores y fumadores sanos o pacientes con EPOC diagnosticada.
2.a.- Fumadores sanos
El lavado broncoalveolar (BAL) ha sido un medio muy utilizado por
distintos autores a la hora de examinar la inflamación bronquial. Al estudiar en este
medio los niveles de TNF-α, IL-6, IL-8 en nueve fumadores sanos (con una historia de
al menos 3 paquetes-año) y otros nueve no fumadores se ha visto que el microambiente
pulmonar de los fumadores es anormal. También se comprobó que la capacidad de los
macrófagos de liberar IL-6 y TNF-α cuando se cultivaban con lipolisacáridos (LPS) era
igualmente distinta. El BAL de fumadores contenía dos veces y media más células que
los no fumadores, aunque no existían diferencias en las células de ambos grupos. La IL-
6 estaba disminuida en BAL de fumadores (1,8 vs 15,9 pg/ml), no detectándose en 6
fumadores. Para la IL-8 no se encontraron diferencias entre ambos grupos (26,7 pg/ml
Respuesta inflamatoria al tabaco
9
en fumadores y 14,6 pg/ml en no fumadores), aunque estaba elevada en dos de los
nueve fumadores. En ninguno de los dos grupos se encontró actividad TNF-α. Los
estudios in vitro demostraron en ambos grupos que la liberación de TNF-α tras cultivar
los macrófagos obtenidos en el BAL sin LPS era similar a las 6 y 24 horas. Sin
embargo, tras 6 horas de incubación con 100 ng/ml de LPS se producía un incremento 7
veces mayor en BAL de no fumadores, el cual se mantenía a las 24 horas. Este hecho no
se pudo constatar en el grupo de fumadores. En cuanto a la liberación de IL-6, los
macrófagos de no fumadores, tras estar incubados 6 horas en un medio de cultivo,
liberaban hasta 10 veces más IL-6 que los fumadores. Cuando se añadía al medio de
cultivo 100 ng/ml de LPS, y tras 6 horas de incubación, se producía un incremento en
no fumadores de once veces frente a fumadores11.
Se ha planteado la hipótesis de que la destrucción pulmonar por enfisema
secundario al consumo de tabaco está mediada por la elastasa liberada por neutrófilos
que emigran al espacio alveolar atraídas por el humo del tabaco. En un grupo de ocho
fumadores se encontró una cantidad significativamente mayor de neutrófilos en el BAL
respecto a un grupo control del mismo número de no fumadores. Estos neutrófilos no
emigran por el propio humo del tabaco sino que son los macrófagos los que liberan un
factor quimiotáctico para neutrófilos, una vez que han sido estimulados por el humo del
tabaco. Además, en este mismo estudio los autores comprobaron cómo los macrófagos
de no fumadores, una vez estimulados in vitro, podían liberar grandes cantidades de ese
mismo factor quimiotáctico. Dentro de este estudio, realizaron biopsias pulmonares
abiertas por resección de lesiones pulmonares únicas a tres fumadores y otros tantos no
fumadores sanos en ambos casos. Los hallazgos fueron similares a los del BAL: mayor
cantidad de neutrófilos en las piezas histológicas de los fumadores12.
Respuesta inflamatoria al tabaco
10
La anexina I es una proteína citosólica inhibidora de la fosfolipasa A2 con un
papel anti-inflamatorio que se puede encontrar fuera de la célula en fluidos segregados,
y así se ha encontrado su existencia en el BAL. Esta proteína parece que es degradada
en el BAL de fumadores. Se han encontrado niveles entre 10 y 25 veces más elevados
de proteínas en el BAL de fumadores; niveles significativamente más altos de elastasa
en BAL de fumadores (entre 2 y 10 veces más elevados); recuento celular total y
porcentaje de neutrófilos más altos en fumadores; también la anexina I estaba más alta
en BAL de fumadores, aunque sólo se encontró en la forma Mr 34,000, que carece del
péptido terminal anti-inflamatorio Mr 3,000. En los no fumadores las formas Mr 37,000
(con actividad proteolítica) eran las más abundantes. La anexina I inactivada encontrada
en BAL de fumadores puede conducir a una inflamación crónica incontrolada13.
Thompson et al estudiaron 28 pacientes con bronquitis crónica (BC) y
obstrucción al flujo aéreo, 15 fumadores asintomáticos y 25 voluntarios no fumadores
sanos. A todos ellos realizaron broncoscopia y determinaron el índice de bronquitis
(edema, eritema, friabilidad y secreciones), realizando en el mismo acto un BAL. Los
pacientes con BC y los fumadores asintomáticos tenían mayores valores en el índice de
bronquitis que los no fumadores, mientras que los BC tenían mayor índice que los
fumadores sanos. En cuanto al BAL, la celularidad era mayor en los BC que en el resto
de grupos estudiados. En fumadores y BC el porcentaje era mayor para neutrófilos y
había un menor porcentaje de macrófagos, aunque estos últimos no presentaban
diferencias entre los tres grupos. Al grupo de pacientes con BC lo dividieron en aquellos
que tenían valores de neutrófilos mayores del 20% frente a los que tenían menos del
20% para relacionarlos con parámetros clínicos, y comprobaron que el porcentaje de
neutrófilos se relacionaba con el número de cigarrillos fumados por día y con el número
de paquetes-año, así como con todos los valores espirométricos (FVC, FEV1,
Respuesta inflamatoria al tabaco
11
FEV1/FVC, FEF25-75 y PEFR). Midieron también la albúmina como medida de
trasudación en el tracto respiratorio inferior debido a la inflamación celular observada
en la BC y observaron que los pacientes con BC tenían mayores niveles que los otros
dos grupos. La BC se correlacionaría con la neutrofilia en la vía aérea, que a su vez está
relacionada con la obstrucción al flujo aéreo y con la producción de esputo14.
Pero no sólo ha sido el BAL el único medio empleado para el estudio de la
inflamación en fumadores, sino que se ha estudiado también la histología pulmonar.
Niewoehner et al fueron los primeros en identificar los cambios en la histología de la
vía aérea pequeña de jóvenes fumadores. Estos autores estudiaron los cambios en 39
pulmones de jóvenes fumadores (19) y no fumadores (20) en una muestra de muertes
súbitas producidas en un hospital. La lesión característica observada en el pulmón de los
fumadores fue una bronquiolitis respiratoria asociada a macrófagos alveolares
pigmentados en los bronquiolos respiratorios de primer y segundo orden distales al
bronquiolo membranoso terminal. En estos pulmones de fumadores también se podían
ver pequeños incrementos, aunque significativos, de células murales inflamatorias y
epitelio denudado en los bronquiolos. La ausencia de destrucción de tejido o fibrosis
sugeriría una reversibilidad de las lesiones. Los responsables de este estudio postulan
con que esta bronquiolitis sea precursora de lesiones anatómicas más severas y la
responsable de las anormalidades funcionales de los jóvenes fumadores15. La histología
de la vía aérea pequeña de fumadores se ha tratado de correlacionar con la función
pulmonar. Cosio et al estudiaron la relación entre la función pulmonar y las
anormalidades en la vía aérea pequeña en 36 pacientes (30 fumadores, 2 no fumadores y
4 exfumadores) que iban a ser sometidos a biopsia pulmonar abierta para diagnóstico de
lesiones pulmonares localizadas. En la vía aérea estudiaron ocho variables: grado de
oclusión de la vía aérea por células y moco, presencia o ausencia de úlceras mucosas,
Respuesta inflamatoria al tabaco
12
metaplasia de células caliciformes, metaplasia de células escamosas, grado de
infiltración de la pared de la vía aérea por células inflamatorias, cantidad de tejido
conectivo, de músculo y de pigmento en la pared de la vía aérea. Los pacientes con
menor puntuación patológica fumaban menos, y a medida que aumentaba el consumo
medio de tabaco, aumentaba también el nivel de hallazgos patológicos. A medida que se
avanzaba en la puntuación de hallazgos patológicos se vio que la fibrosis y la metaplasia
de células escamosas eran más marcadas, mientras que la infiltración por células
inflamatorias permanecía estable. En el grupo con menor puntuación se observó una
función pulmonar normal, que se deterioraba progresivamente al ir incrementándose los
hallazgos patológicos. Por tanto parece que existen unas lesiones que serían reversibles
(infiltrados celulares inflamatorios, metaplasia de células escamosas y mínima fibrosis
de la pared de la vía aérea) si se detectan antes de que el deterioro sea mayor16.
Existen multitud de publicaciones que estudian marcadores hematológicos de
inflamación en fumadores con resultados dispares. Se han realizado estudios que tratan
de correlacionar la función pulmonar con algunos marcadores inflamatorios. McKarns
et al estudiaron en un grupo de 32 fumadores sanos (17 varones y 15 mujeres, 20 ó más
cigarrillos al día al menos durante dos años) y otro de 29 no fumadores (15 varones y 14
mujeres) la función pulmonar y los niveles de marcadores hematológicos de
inflamación (leucocitos, monocitos, linfocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, IL-1,
LB4, PGE1, IgG, IgM, IgA, IgE). En varones fumadores no encontraron correlación
entre ninguno de los parámetros hematológicos estudiados y la función pulmonar; en
mujeres fumadoras, sólo los basófilos se correlacionaron de forma negativa con la
función pulmonar; en varones no fumadores, los leucocitos y los monocitos se
correlacionaban de forma negativa, y la IgE de forma positiva con la función pulmonar;
en mujeres no fumadoras, sólo la PGE1 se correlacionaba de forma negativa con la
Respuesta inflamatoria al tabaco
13
función pulmonar17. Las citocinas han sido objeto de numerosos estudios. Gander et al
no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en fumadores tras estudiar a 198 no
fumadores (entre los que se incluían exfumadores de al menos 6 meses), 24 fumadores
irregulares y 78 fumadores activos (de al menos 3 cigarros/día). Los niveles de TNF-α
estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml) frente a no fumadores y fumadores
irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg / ml), pero sin alcanzar
significación estadística18. Dentro del tercer estudio MONICA se estudió a 196 hombres
y 221 mujeres con edades entre los 25 y 74 años para medir los niveles de IL-6, y se
comprobó que los niveles aumentaban con la edad, sin existir diferencias entre sexos.
En relación al consumo de tabaco comprobaron que los exfumadores y no fumadores
tenían niveles similares de IL-6, mientras que los fumadores activos tenían mayores
niveles para ambos sexos. Las cifras de IL-6 correlacionaban con la edad, con los
niveles de fibrinógeno y de leucocitos, con la viscosidad de plasma y sangre, así como
con el consumo de tabaco19. Otros estudios publicados (tras estudiar 75 fumadores y 78
no fumadores) encontraron cifras de IL-6 plasmáticas un 10% mayor en fumadores,
aunque esta diferencia no alcanzaba significación estadística20.
La liberación de citocinas in vitro también ha aportado evidencia a la
inflamación producida por el consumo de tabaco. La liberación de TNF-α en leucocitos
de 41 varones fumadores sanos y 52 no fumadores tras ser estimulados con LPS y
posteriormente inhibidos con glucocorticoides arrojaron los siguientes resultados: los
fumadores tenían unos niveles basales de TNF-α más elevados que los no fumadores,
sin que la diferencia llegara a ser estadísticamente significativa; tras ser estimulados con
LPS, los leucocitos de los fumadores liberaban menos TNF-α por 105 monocitos; los
fumadores necesitaban menores concentraciones de glucocorticoides para alcanzar 50%
de inhibición de liberación de TNF-α, demostrando por tanto una mayor sensibilidad a
Respuesta inflamatoria al tabaco
14
los glucorticoides. Por tanto, los leucocitos de los fumadores no serían los responsables
del nivel elevado de citocinas pro-inflamatorias circulantes21. Sin embargo, otros
autores sí encontraron diferencias significativas a favor de fumadores en la producción
in vitro de TNF-α. 75 fumadores y 78 no fumadores fueron seleccionados para estudiar
los niveles de IL-6 en plasma y las cifras de TNF-α en sangre tras ser esta estimulada
con 10 ng/ml de endotoxina (LPS). Las cifras de IL-6 plasmáticas eran un 10% mayor
en fumadores, aunque esta diferencia no alcanzaba significación estadística. La
producción de TNF-α en la sangre de los fumadores tenía un 38% de diferencia, que en
este caso sí resultaba ser significativa20.
El condensado de aire exhalado (CAE) es un medio que se ha utilizado en
investigación sobre todo en los últimos años, pues refleja el contenido de la vía aérea
inferior y así se puede estudiar el componente inflamatorio de la misma en los
fumadores. Garey et al estudiaron once fumadores y nueve no fumadores sanos para ver
las diferencias entre ambos grupos en proteínas, nitritos, IL-1β y TNF-α, así como la
actividad quimiotáctica de neutrófilos. Los niveles de proteínas totales eran inferiores
en los no fumadores (5,7 vs 28,8 μg/ml); las cifras de nitritos también eran inferiores en
no fumadores (16,156 mmol/l vs 24,672 mmol/l); los niveles de IL-1β eran similares en
no fumadores y en fumadores (1,5 y 1,6 pg/ml); el TNF-α estaba más elevado en
fumadores respecto a no fumadores (7,4 vs 3,9 pg/ml); la actividad quimiotáctica de
neutrófilos estaba incrementada en fumadores frente a no fumadores. En jóvenes
fumadores sanos, por tanto, se detectan mayores niveles de determinados mediadores
inflamatorios y de la actividad quimiotáctica de neutrófilos, lo cual se podría utilizar
como una herramienta de detección de inflamación temprana en fumadores como
identificación de población en riesgo de desarrollar EPOC22. Otro clásico estudio de
CAE en fumadores sanos es el de Carpagnano et al, que determinaron los niveles de IL-
Respuesta inflamatoria al tabaco
15
6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica) en el CAE de 21 fumadores de
al menos 10 cigarros/día. Los niveles de IL-6 estaban más elevados en fumadores (5,6
vs 2,6 pg/ml). Existían diferencias entre aquellos que fumaban menos de 1 paquete al
día, los que fumaban 1 paquete al día, y los que fumaban más de 1 paquete, siendo todas
las diferencias estadísticamente significativas. Así mismo comprobaron que existía una
correlación de los niveles de IL-6 con el número de cigarrillos/día y con el CO espirado,
siendo esta correlación negativa con FEV1 y FVC. Igualmente los niveles de LTB4
estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y se correlacionaban
con los de IL-6. Se vuelve a confirmar la utilidad de determinados productos no
volátiles del CAE como marcadores de inflamación en fumadores23. Balint et al
estudiaron 15 fumadores sanos y 14 no fumadores a los que midieron el óxido nítrico
exhalado (NO), y realizaron pruebas de función pulmonar y toma de condensado de aire
exhalado para medir nitritos, nitratos, S-nitrosotiol y nitrotirosina (metabolitos del óxido
nítrico). Las concentraciones de NO en fumadores eran significativamente menores que
en no fumadores. No se vieron diferencias significativas entre ambos grupos para los
niveles de nitritos, nitratos, S-nitrosotiol ni nitrotirosina. Parece que no existe un efecto
del consumo de tabaco a largo plazo en el metabolismo del óxido nítrico, lo que sugiere
que deben de existir otras vías que jueguen un importante papel en el efecto nocivo del
tabaco24.
2.b.- EPOC y fumadores sin obstrucción al flujo aéreo
Se han demostrado en distintos estudios la diferencias que existen en la
celularidad del BAL de los fumadores según si tienen o no obstrucción al flujo aéreo.
Spurzem et al estudiaron el BAL de 28 fumadores con bronquitis crónica (BC) y
obstrucción al flujo aéreo, 15 fumadores sanos y 33 no fumadores25. El grupo de
Respuesta inflamatoria al tabaco
16
fumadores con BC tenía mayor celularidad en el líquido recuperado del BAL que los
fumadores sanos y los no fumadores. Las células caliciformes estaban
significativamente elevadas en el grupo BC frente a los otros dos grupos, y también
existían diferencias en los fumadores asintomáticos frente a no fumadores. El porcentaje
de células caliciformes correlacionaba bien con las características de bronquitis
sugiriendo que es el reflejo de la anormalidad del epitelio, pues se relacionaba con el
índice visual de bronquitis y con el porcentaje de neutrófilos. También se relacionaba
con el número de paquetes-año y con medidas del flujo aéreo, relacionándose
negativamente con FEV1 porcentual, con FEV1/FVC y con FEF25-75. La celularidad
también es distinta en EPOC (fumadores activos y exfumadores) con respecto a
fumadores sanos y no fumadores26. El hecho de padecer EPOC hace tener un mayor
número total de células. El consumo de tabaco y el diagnóstico de EPOC influyen sobre
el porcentaje de neutrófilos, pues los que mayores porcentajes presentaban eran los
EPOC fumadores activos; los fumadores sanos tenían niveles similares a los EPOC
exfumadores, y eran superiores a los no fumadores. En el esputo inducido de los dos
grupos EPOC no se encontraron diferencias en la metaloproteinasa 12 (MMP-12,
mediador del enfisema secundario al consumo de tabaco), aunque sí se vieron con
respecto al grupo de sanos (fumadores y no fumadores); los fumadores sanos tenían
mayores niveles que los no fumadores. En BAL ocurría algo similar: niveles mayores
de EPOC frente a sanos; de EPOC fumadores frente a exfumadores; y de fumadores
sanos frente a no fumadores sanos. Se ha encontrado también correlación entre el
número de paquetes-año con: 1) los neutrófilos en BAL de ambos grupos de EPOC y de
fumadores sanos; 2) con MMP-12 en esputo inducido de EPOC fumadores y
exfumadores, así como en fumadores sanos. Por lo tanto, parece que el abandono del
tabaco puede alterar la composición del compartimento alveolar (menor cantidad de
Respuesta inflamatoria al tabaco
17
neutrófilos en BAL de EPOC exfumadores frente a los EPOC fumadores activos). El
consumo de tabaco puede estimular la expresión de MMP-12 en los compartimentos
aéreos (esputo inducido y BAL) de los pacientes EPOC. La diferente inflamación de los
fumadores EPOC también ha sido puesta de manifiesto por Linden et al, que estudiaron
el lavado bronquial (primera alícuota del BAL obtenido) y el BAL de doce fumadores
con bronquitis crónica (BC), once fumadores con EPOC, cinco fumadores sanos y diez
no fumadores sanos para medir la celularidad inflamatoria, la actividad de neutrófilos
mediante mieloperoxidasa (MPO) y la de eosinófilos mediante la proteína catiónica
(ECP)27. También estudiaron los niveles de glutation, como un compuesto no proteínico
que protege frente al daño oxidativo, y la albúmina como indicador de exudación. Las
células estaban incrementadas en todos los grupos de fumadores, especialmente en los
sujetos con BC, siendo la células recuperadas en su mayoría macrófagos. El número de
macrófagos estaba disminuido en los EPOC en comparación con los BC, así como en
fumadores asintomáticos frente a BC. Existía también una tendencia a menores
concentraciones de la mayoría de las células (a excepción de células epiteliales) en
EPOC y fumadores asintomáticos frente a BC. El glutation estaba más elevado en el
BAL de EPOC, mientras que era similar en los cuatro grupos en el lavado bronquial. La
MPO y la ECP estaban más elevadas en el lavado bronquial que en el BAL en todos los
grupos, pero sólo significativamente elevadas en el lavado bronquial del grupo BC. Al
comparar los grupos de fumadores frente a no fumadores se observó una mayor
concentración de MPO y ECP en BAL. La albúmina sólo mostraba una diferencia en el
lavado bronquial de EPOC (mitad de concentración). Existía una relación inversa entre
el FEV1 y la historia de tabaquismo (paquetes-año y cigarrillos/día), así como con las
concentraciones de neutrófilos, basófilos, glutation, MPO y ECP en BAL. La
concentración de neutrófilos correlacionaba de forma positiva con la historia de
Respuesta inflamatoria al tabaco
18
tabaquismo. Se demuestra así la existencia de una inflamación distinta en fumadores
con BC que en aquellos que ya han desarrollado EPOC.
La elastina es un componente de la degradación de la proteolisis de las
fibras elásticas, componente fundamental en la producción de enfisema. Las
concentraciones de elastina en plasma, orina y BAL de seis no fumadores, seis
fumadores sanos y diez pacientes con EPOC han sido estudiados por Schriver et al28.
Los valores de elastina en plasma estaban muy elevados en EPOC en comparación con
fumadores sanos y no fumadores; lo mismo ocurría con los valores en orina, siendo
estos hasta diez veces superiores que en plasma en los tres grupos. Los niveles de
elastina plasmática y urinaria se correlacionaban con la ratio FEV1/FVC. En el BAL no
existían diferencias significativas entre grupos, posiblemente debido a la menor
recuperación de líquido en el grupo EPOC, aunque los fumadores y los EPOC tenían
niveles más altos, lo cual sugeriría el origen pulmonar como una fuente importante de
elastina. Los productos de degradación de la elastina (desmosina e isodesmosina) y del
colágeno (hidroxilisilpiridinolina y lisilpiridinolina) fueron estudiados en la orina de 22
no fumadores, 13 fumadores sanos y 21 EPOC (ocho de ellos fumadores activos). Estos
productos estaban 50% más elevados en EPOC y fumadores sanos que en no
fumadores. El tabaquismo activo y la presencia de EPOC eran factores
independientemente asociados con una mayor excreción urinaria de estos productos.
Entre los EPOC, aquellos que continuaban fumando tenían niveles de desmosina e
isodesmosina más elevados. Ni el sexo ni la edad tenían influencia sobre los niveles de
los productos de degradación de elastina. Los niveles de hidroxilisilpiridinolina estaban
más elevados en EPOC que en fumadores sanos y no fumadores, sin tener influencia el
hecho de continuar o no fumando. En el grupo no EPOC, las mujeres tenían unos
niveles urinarios 37% mayores que hombres, no existía influencia de la edad, y en estos
Respuesta inflamatoria al tabaco
19
grupos sí que existía una asociación con el hecho de ser o no fumador activo. Por tanto,
estos resultados evidencian una mayor degradación de elastina y colágeno en fumadores
activos y EPOC, la cual persiste en este último grupo a pesar de abandonar el tabaco29.
Se han realizado también estudios histológicos de pulmones de pacientes EPOC,
como el estudio de Hale et al, que estudiaron los pulmones de dieciocho fumadores con
obstrucción al flujo aéreo que habían fallecido sin que existiera neumonía con evidencia
radiológica ni déficit de α1-antitripsina30. Los resultados fueron comparados con los
pulmones de catorce no fumadores y veinticinco fumadores sin enfermedad pulmonar.
En los pulmones estudiados se identificaba: 1) la severidad del enfisema; 2) los
bronquíolos con diámetro menor de 2 mm asignándole puntuación de 0 a 3 en infiltrado
celular inflamatorio, hipertrofia de músculo liso y metaplasia de células caliciformes; y
3) el grosor de la capa media e íntima de las arterias de calibre menor de 500 μm. Estos
autores encontraron que la severidad del enfisema era significativamente mayor en los
fumadores con obstrucción al flujo aéreo, y no había diferencias entre fumadores sin
obstrucción y no fumadores. Los fumadores tenían mayor puntuación que los no
fumadores en las características estudiadas, y los fumadores con obstrucción tenían
mayores diferencias respecto a los otros dos grupos, con la salvedad de las células
caliciformes que no mostraban diferencias en los fumadores con obstrucción. En el
grupo de fumadores con obstrucción, se correlacionaron los valores de FEV1 en
porcentaje de su teórico con los hallazgos estudiados, encontrando correlaciones con
enfisema, con el diámetro bronquial y con el porcentaje de bronquíolos menores de 400
μm. En cuanto al estudio de las arterias, observaron que el grosor de la media (y no así
el de la íntima) estaba aumentado en fumadores frente a no fumadores, y sobre todo en
fumadores con obstrucción. Este grupo comparado con los no fumadores tenía el doble
de grosor de la media y hasta el triple en la íntima. Saetta et al estudiaron a dieciséis
Respuesta inflamatoria al tabaco
20
pacientes fumadores que iban a ser intervenidos por carcinoma pulmonar periférico
solitario, nueve de los cuales tenían obstrucción al flujo aéreo y siete eran fumadores
asintomáticos con FEV1 normal31. En las vías aéreas periféricas utilizaron
inmunohistoquímica para identificar neutrófilos, macrófagos, y linfocitos CD4+ y
CD8+ infiltrando la vía aérea y el músculo liso. Los hallazgos encontrados fueron que
los CD8+ estaban aumentados en los EPOC, mientras que los neutrófilos, macrófagos y
CD4+ no presentaban diferencias significativas entre ambos grupos. Las características
morfométricas de la vía área periférica no mostraban diferencias entre ambos grupos,
salvo por el área muscular lisa normalizada por el perímetro interno, que estaba
incrementada en EPOC. El número total de CD8+ y el área muscular lisa normalizada
por el perímetro interno correlacionaban negativamente con el FEV1. Esto demostraría
el importante papel de los CD8+ y del remodelado de la vía aérea en la patogénesis de
la EPOC.
Además de la vía aérea periférica, también la vía aérea central ha sido objeto de
estudio comparativo entre fumadores y no fumadores32. Se han estudiado cuarenta y
cinco pacientes que iban a ser sometidos a toracotomía para resección de carcinoma
broncogénico con el fin de comparar la estructura de la vía aérea central. De ellos,
quince eran fumadores activos con hipersecreción mucosa, catorce fumadores sin
hipersecreción, cinco exfumadores con hipersecreción (de al menos cuatro meses de
abstinencia) y once exfumadores sin hipersecreción mucosa. Entre los grupos
estudiados no se observaron diferencias en el tamaño de las glándulas, en el músculo
liso, en el tejido conectivo ni en el índice de Reid. La vía aérea central de los pacientes
con hipersecreción mucosa mostraba mayor inflamación mucosa. Los cinco
exfumadores con hipersecreción tenían tanto las vías aéreas centrales como las
periféricas afectadas por la respuesta inflamatoria, así como mayor grado de enfisema e
Respuesta inflamatoria al tabaco
21
hipertrofia de músculo liso en los bronquíolos membranosos. Este grupo de
exfumadores con hipersecreción era el que mostraba mayor grado de inflamación,
incluso más que los fumadores activos. Los fumadores activos mostraron mayor
metaplasia de células caliciformes, mientras que los exfumadores con hipersecreción
presentaban mayor metaplasia de células escamosas. En este estudio se trató de
correlacionar estos hallazgos con la función pulmonar de los pacientes, estudiando la
curva fase 3 de lavado de nitrógeno, la cual ha mostrado ser un buen predictor de caída
de FEV133. Los exfumadores con hipersecreción mucosa tenían una mayor curva que el
resto de los grupos, demostrando así que este grupo, además de una mayor inflamación
de las vías aéreas central y periférica, tenía una mayor obstrucción de las mismas. Lams
et al estudiaron en la vía aérea de gran tamaño los CD8, los eosinófilos y neutrófilos en
las biopsias de once fumadores con obstrucción al flujo aéreo frente a once no
fumadores y ocho fumadores asintomáticos34. En los pacientes EPOC existía un
incremento de CD8 infiltrando el subepitelio en comparación con fumadores
asintomáticos. Además existía una relación negativa entre el número de CD8 y el FEV1,
y positiva con el número de paquetes-año. No existían diferencias significativas entre
los grupos en el número total de eosinófilos ni en el número de eosinófilos activados,
aunque existía una correlación negativa del ratio eosinófilos activados/totales con el
FEV1 porcentual predicho. Tampoco existían diferencias entre grupos en el número total
de neutrófilos, pero sí había una correlación negativa entre el número de paquetes-año y
número de neutrófilos.
Se han propuesto distintos modelos de inflamación según la enfermedad
respiratoria que se padezca. Estudios con pacientes EPOC, asmáticos, bronquitis crónica
y “fumadores sanos” demostraron diferencias en determinados marcadores
inflamatorios. Los pacientes EPOC mostraron unos mayores niveles de neutrófilos, de
Respuesta inflamatoria al tabaco
22
IL-8 y sTNF-R75 en esputo; y de IL-8, sTNF-R75 y proteína ligadora de
lipopolisacáridos (LBP) en plasma. Los asmáticos mostraban eosinofilia en esputo,
mientras que los pacientes con bronquitis crónica tenían más linfocitos en esputo y
valores significativamente inferiores en plasma de sTNF-R75 y 55. Los fumadores
sanos sólo mostraron unos mayores niveles de LBP en plasma35.
El hialurónico es un componente inflamatorio de la matriz extracelular que está
presente en cantidades importantes en el BAL y en plasma de pacientes con
enfermedades inflamatorias. Los fragmentos de bajo peso molecular (en torno a 250
kDa de masa molecular) estimulan la producción de citocinas, quimiocinas y
metaloproteinasa 12 de macrófagos. Para conocer su posible influencia en la
patogénesis de la EPOC, Dentener et al estudiaron el esputo inducido de dieciocho
pacientes EPOC (media FEV1 62%) y catorce fumadores sanos, a los cuales midieron
también los niveles de IL-8 y de los receptores solubles 55 y 75 del TNF-α. Los niveles
de hialurónico estaban más elevados en EPOC que en fumadores sanos. Al grupo EPOC
lo dividieron en dos subgrupos según niveles de hialurónico: aquellos con niveles más
elevados (n = 6, HA 1000 ng/ml) tenían una menor función pulmonar que aquellos con
niveles moderados (n = 12, HA 201 ng/ml). Los niveles de IL-8 y los de los factores
solubles de TNF-α estaban significativamente más elevados en pacientes con mayores
niveles de hialurónico respecto a controles y pacientes con niveles moderados. Por
tanto, puede existir una relación entre los niveles de hialurónico, inflamación local y
severidad de la enfermedad pulmonar36.
También el condensado de aire exhalado (CAE) es un medio utilizado en
fumadores sintomáticos que están en riesgo de padecer EPOC para el estudio de
marcadores inflamatorios. Mazur et al estudiaron a cuarenta pacientes a los que
realizaron esputo inducido y CAE: catorce no fumadores (cuatro de ellos habían dejado
Respuesta inflamatoria al tabaco
23
de fumar al menos veinte años antes), diecisiete fumadores asintomáticos y nueve
fumadores con síntomas de bronquitis crónica (sólo uno de ellos con alteración en la
función respiratoria, estadio I GOLD)37. Se utilizó como grupo control positivo a diez
pacientes EPOC agudizados, ya que se sabe que tanto IL-8 como 8-isoprostano están
elevados en las agudizaciones. El 8-isoprostano se detectaba en todos los sujetos
estudiados, tanto en esputo inducido como en CAE mientras que IL-8 se encontraba
sólo en 14% de no fumadores, 20% de fumadores asintomáticos y 43% de fumadores
sintomáticos. Los niveles de ambos marcadores estaban más elevados en el esputo
inducido que en el CAE. Los no fumadores tenían los niveles más bajos de 8-
isoprostano en ambos medios y de IL-8 en esputo. Los niveles de ambos marcadores se
correlacionaban inversamente con varios parámetros de función respiratoria (FVC,
FEV1 , FEV1 /FVC, DLCO%). Las concentraciones de IL-8 en esputo diferenciaban a
fumadores asintomáticos de fumadores sintomáticos en riesgo de padecer EPOC,
mientras que 8-isoprostano en CAE distinguía no fumadores de fumadores no
sintomáticos. Corhay et al estudiaron cuarenta y cinco pacientes EPOC (veintiocho en
grado moderado y diecisiete grado severo) y sesenta y cinco sujetos sanos para conocer
la actividad quimiotáctica de eosinófilos y neutrófilos en CAE. En ambos grupos se
detectó actividad quimiotáctica de neutrófilos, que era mayor en sujetos EPOC. Dentro
del grupo de sanos, los fumadores tenían valores significativamente más altos que los
no fumadores y exfumadores. En el grupo EPOC, los fumadores activos tenían mayores
niveles que aquellos EPOC que habían dejado de fumar; los valores además eran
independientes del grado de EPOC del paciente y de si estaban en tratamiento con
corticoides inhalados; los exfumadores tenían mayores niveles que los exfumadores
sanos, aunque no existían diferencias entre controles fumadores y EPOC fumadores.
También se observó actividad quimiotáctica de eosinófilos en los dos grupos, que era
Respuesta inflamatoria al tabaco
24
mayor para sujetos sanos que para EPOC. El consumo de tabaco no influía en la
actividad quimiotáctica de eosinófilos en EPOC ni en sujetos sanos. Estos resultados
demuestran que el consumo de tabaco favorece la actividad quimiotáctica de neutrófilos
y que los pacientes EPOC tienen una mayor actividad quimiotáctica de neutrófilos
frente a la de eosinófilos cuando se comparan con sujetos sanos38.
La hipótesis de que los nitritos elevados en CAE reflejan hiperinsuflación
pulmonar en pacientes EPOC se confirmó en el estudio que llevaron a cabo Gessner et
al39. Estos investigadores estudiaron la concentración de nitritos en CAE de un grupo de
fumadores sanos (n = 18), otro de no fumadores sanos (n = 17) y un grupo EPOC
exfumadores de al menos un año (ocho estadio 0 GOLD; trece estadio 1; veinticinco
grado 2; quince grado 3; y dieciséis estadio 4) y lo compararon con parámetros
inflamatorios y de función pulmonar. Los niveles de nitritos estaban más elevados en
pacientes EPOC frente a los fumadores y no fumadores, siendo mayor la elevación en
los EPOC estadio IV, e iba disminuyendo la concentración de nitritos a medida que iba
disminuyendo el estadio GOLD de la EPOC. Encontraron una correlación logarítmica
del nitrito en CAE de pacientes EPOC con el volumen residual, la capacidad pulmonar
total y el volumen de gas torácico, pero no con FVC ni con FEV1; los grupos de
fumadores sanos y no fumadores, por el contrario, no mostraron tener dicha correlación.
Al realizar un análisis de subgrupos en pacientes EPOC, se comprobó que existía una
relación logarítmica con volumen residual, capacidad pulmonar total y volumen de gas
intratorácico en pacientes con grado 2 de EPOC o mayores. Los niveles de citocinas
eran más elevados en el grupo de fumadores sanos (salvo IL-10) frente al grupo EPOC
y no fumadores. En los distintos subgrupos EPOC no se observaron diferencias en los
niveles de citocinas. No existía correlación entre los niveles de nitritos y los niveles de
Respuesta inflamatoria al tabaco
25
IL-8, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 y TNF-α. Tampoco se pudo comprobar correlación de
los niveles de citocinas con ninguno de los parámetros de función pulmonar.
El stress oxidativo es mayor en pacientes EPOC como se demuestra por la
mayor producción de radicales libres al compararlos con no fumadores y fumadores
sanos. Montuschi et al estudiaron el efecto del stress oxidativo en pacientes EPOC
(veinticinco exfumadores y quince fumadores), no fumadores (n = 10) y fumadores
sanos (n = 12) midiendo los niveles de 8-isoprostano en CAE. Tanto los EPOC
fumadores como los fumadores sanos se habían mantenido abstinentes al menos doce
horas antes de la toma de muestra. Los niveles de 8-isoprostano eran similares en EPOC
exfumadores (40 pg/ml) y fumadores activos (45 pg/ml), y a su vez eran 1,8 mayores
que en fumadores sanos (24 pg/ml). Los niveles de estos últimos eran 2,2 veces
mayores que los de no fumadores (10,8 pg/ml)40.
Vamos a repasar los efectos del consumo agudo y del consumo continuado del
tabaco sobre la inflamación. Es muy importante conocer la respuesta inicial al tabaco
para entender los efectos del consumo crónico del mismo, pues el efecto agudo repetido
puede tener efecto acumulativo y conducir a un daño irreparable y, como consecuencia,
al desarrollo de EPOC.
3.- Efectos agudos del tabaco
Se han realizado estudios en humanos y en animales para conocer el efecto
agudo del tabaco, realizando mediciones en distintos fluidos. Algunos estudios con ratas
demuestran que el humo del tabaco provoca una reacción inflamatoria aguda con
liberación de citocinas proinflamatorias. Un grupo de ratas eran sacrificadas
inmediatamente tras la exposición aguda a humo de tabaco, mientras que otro grupo de
ratas eran sacrificadas a las 2, 4, 8 y 24 horas de dicha exposición. En esos momentos
Respuesta inflamatoria al tabaco
26
de tiempo se les extraía sangre, se les realizaba una extracción de líquido peritoneal tras
instilar suero salino con heparina para recoger macrófagos, y se les realizaba un lavado
broncoalveolar separando los macrófagos. Existía un grupo de ratas control a las que se
les realizaba el mismo procedimiento, pero estaban expuestas a aire sin contaminar por
humo de tabaco. Se comprobó que el número de macrófagos alveolares se incrementaba
tras ocho horas de exposición a tabaco. Tras incubar estos macrófagos durante 24, 48 y
72 horas se vio que se liberaban cantidades variables de TNF-α, siendo mayor a las
ocho horas tras la exposición. Ni los macrófagos peritoneales ni los alveolares
procedentes de ratas no expuestas a tabaco liberaban ninguna cantidad de TNF-α41.
En fumadores intermitentes se han visto resultados dispares, pues se ha
comprobado que tras el consumo existe un aumento en determinados parámetros
inflamatorios, mientras que a la vez hay un efecto supresor sobre otros. Esto se puede
comprobar en el estudio de Van der Vaart et al, que estudiaron a dieciséis fumadores
intermitentes sanos a los que pidieron no fumar durante los nueve días previos al
estudio, siendo fumador intermitente aquel que fumaba más de un cigarro al mes, pero
no diariamente, durante los últimos seis meses. En estos fumadores determinaron los
niveles de células sanguíneas (leucocitos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos)
y de marcadores inflamatorios en condensado de aire exhalado (óxido nítrico), esputo
inducido (estudio de células, nitritos y nitratos, ECP, IL-8, LTB4, MMP-9, inhibidor
tisular de MMP-1, y elastasa de neutrófilos), plasma (TNF-α, IL-1β, IL-8 y IL-10) y
orina (leucotrieno E4) a las 0, 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96 y 192 horas tras fumarse dos
cigarros separados por treinta minutos. Los resultados que encontraron fueron: 1) el NO
en CAE no sufría ningún cambio por el consumo agudo de tabaco; 2) en sangre, el
número de eosinófilos disminuía más a las tres horas de fumar, mientras que no tenía
efecto en ninguna otra célula sanguínea. La IL-8 producida por células sanguíneas
Respuesta inflamatoria al tabaco
27
estimuladas con LPS era mayor entre cero y tres horas tras fumar, mientras que no había
ningún efecto sobre la producción de TNF-α, IL-10 y IL-1β; 3) en esputo, el número de
neutrófilos incrementaba significativamente tras 3-12 horas de fumar; el número de
linfocitos disminuía entre cero y tres horas tras fumar y luego incrementaba entre tres y
doce horas. Ninguna otra célula ni mediador inflamatorio en esputo sufría efecto alguno
por el consumo agudo de tabaco; 4) en la orina, no existía ninguna influencia del
consumo de tabaco en los niveles de leucotrieno E4. Otros autores sí han encontrado
diferencias en los niveles de IL-1β (menores valores) y de TNF-α (valores más
elevados) en condensado de aire exhalado treinta minutos después de fumar un
cigarrillo, mientras que las proteínas y los nitritos presentaba niveles muy similares
antes y después de fumar42.
El stress oxidativo está aumentado tras el consumo agudo de tabaco. Se ha
podido comprobar que un grupo de doce fumadores sanos, tras doce horas de
abstinencia a los quince minutos de fumar un cigarrillo, presenta unos niveles de 8-
isosprostano en CAE significativamente más elevados que los basales (32,3 vs 20,7
pg/ml), y que estos niveles a las cinco horas no mostraban diferencias significativas,
aunque existía una tendencia a mantenerse elevados (28,9 vs 20,7 pg/ml)40.
El efecto agudo del consumo de tabaco ha sido utilizado para el estudio del
metabolismo del óxido nítrico (NO). Balint et al estudiaron quince fumadores sanos y
catorce no fumadores a los que midieron el óxido nítrico exhalado y realizaron pruebas
de función pulmonar y toma de condensado de aire exhalado para medir nitritos,
nitratos, S-nitrosotiol y nitrotirosina (metabolitos del óxido nítrico). También estudiaron
el efecto agudo de dos cigarros en el grupo de fumadores tras una abstinencia de cuatro
horas, repitiendo la toma de muestras a los treinta y noventa minutos posteriores. Tras el
consumo agudo de tabaco se observó que los niveles de nitritos y nitratos estaban
Respuesta inflamatoria al tabaco
28
significativamente más elevados a los treinta minutos y volvían a niveles basales a los
noventa minutos. El resto de parámetros no mostraba diferencias con la exposición
aguda al tabaco. No existía correlación entre los niveles de NO exhalado y sus
metabolitos en CAE antes y después de la exposición aguda al tabaco. Por tanto, el
tabaco puede modular el metabolismo de NO facilitando la oxidación de NO,
incrementando así los productos de oxidación, lo que contribuye al efecto dañino del
tabaco24.
4.- Respuesta inflamatoria dosis-dependiente
Pero la inflamación producida depende de la cuantía del consumo de tabaco. Así
se ha comprobado que la cantidad de tabaco consumido puede tener un valor predictivo
para los valores de determinados parámetros inflamatorios. Kuschner et al estudiaron en
el BAL de catorce fumadores sanos y dieciséis no fumadores el porcentaje celular,
algunos mediadores proinflamatorios (TNF-α, IL-6, IL-1β) y quimioatrayentes (la
proteína quimiotáctica de monocitos y la IL-8 como quimiotáctica de neutrófilos)43.
Observaron que, en fumadores, existían valores significativamente más altos de
neutrófilos, macrófagos, IL-1β, IL-6, IL-8 y MCP-1. Cuando dividían a los fumadores
según el consumo en menos de un paquete al día, un paquete al día, o más de un
paquete al día, vieron que un mayor consumo tenía valor predictivo para cifras de
neutrófilos, macrófagos, IL-1β y IL-8. También Lind et al han demostrado el efecto que
tiene un mayor consumo diario de tabaco sobre las proteínas inflamatorias44. Estos
autores estudiaron proteínas inflamatorias (α1-glicoproteína ácida, α1- antitripsina,
haptoglobina, fibrinógeno y ceruloplasmina) para conocer el riesgo cardiovascular en
una serie de varones de entre 28 y 61 años de los cuales 1489 eran no fumadores, 1685
exfumadores (de al menos cinco años) y 2901 fumadores activos. Los niveles de los
Respuesta inflamatoria al tabaco
29
marcadores de inflamación estudiados estaban significativamente más elevados en
fumadores activos que en no fumadores y exfumadores; además, los niveles más altos
estaban en el grupo de fumadores de más de un paquete al día. La proporción de niveles
elevados de al menos dos de los marcadores estudiados en el cuartil superior se
incrementaba con la cuantía de tabaco consumido (19,5% en no fumadores y 56% en
fumadores activos) y con los niveles de carboxihemoglobina. Estas diferencias se
mantenían incluso después de ajustarlas a otros factores de riesgo cardiovascular (edad,
diabetes, colesterol, IMC, hipertensión sistólica arterial, etc). Carpagnano et al también
han demostrado diferencias significativas según el nivel de consumo diario de tabaco23.
Han estudiado los niveles de IL-6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica)
en CAE de fumadores de al menos 10 cigarros / día. Existían diferencias entre aquellos
que fumaban menos de un paquete al día, los que fumaban un paquete al día y los que
fumaban más de un paquete, siendo todas las diferencias estadísticamente significativas.
También encontraron correlación entre los niveles de IL-6 y el número de
cigarrillos/día, así como con el CO espirado; y correlación negativa con FEV1 y FVC.
Los niveles de LTB4 estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y
se correlacionaban con los de IL-6.
5.- Efecto de la reducción del consumo de tabaco en la inflamación
Para demostrar la influencia del consumo de tabaco sobre la inflamación es muy
importante también saber qué ocurre si se reduce el mismo. Rennard et al estudiaron
quince grandes fumadores sanos (nueve varones y seis mujeres, mínimo consumo de
dos paquetes/día) y quince no fumadores también sanos, a los que realizaron
broncoscopia con BAL. Se estudió en todos ellos el índice visual de bronquitis, la
celularidad del BAL, y la actividad de elastasa antigénica de neutrófilos. El grupo de
Respuesta inflamatoria al tabaco
30
fumadores fue tratado con 20 mg diarios de chicles de nicotina para que redujesen el
consumo al 50% a lo largo de dos meses y posteriormente se les repitió la broncoscopia.
El índice de bronquitis estaba significativamente más elevado en fumadores frente a no
fumadores, y a los dos meses existía una reducción significativa en el mismo, aunque
sin llegar al nivel de los no fumadores. Los fumadores tenían mayores porcentajes de
neutrófilos que los no fumadores, y esos porcentajes se reducían significativamente tras
la reducción del consumo de tabaco. No se detectó actividad elastasa de neutrófilos en
el BAL de ninguno de los sujetos estudiados, por lo que se usó un método ELISA
antigénico, y se pudo observar que el complejo antigénico de elastasa estaba
significativamente elevado en fumadores y que se reducía significativamente con la
reducción del consumo. Esto demuestra que una reducción del consumo mejora la
inflamación del tracto respiratorio inferior45.
6.- Efecto del abandono del consumo de tabaco en la inflamación
Más importante aún que el efecto de la reducción del consumo en la inflamación
es el abandono absoluto del mismo. Turato et al estudiaron a un grupo de pacientes con
bronquitis crónica, nueve fumadores activos y siete exfumadores de al menos un año, y
lo compararon con siete no fumadores. A todos ellos les realizaron biopsias
transbronquiales para estudiar el número de células inflamatorias (eosinófilos,
neutrófilos, macrófagos, y linfocitos T con sus subpoblaciones CD4 y CD8), los
marcadores de activación de células mononucleares (IL-2R, VLA-1) y la expresión en
el subepitelio de citocinas (TNF-α, IL-1β) y células de adhesión endotelial (ICAM-1,
anti-E selectina y anti-CD31). Encontraron que tanto los fumadores como los
exfumadores tenían mayor número de macrófagos que los no fumadores, aunque el
Respuesta inflamatoria al tabaco
31
número de neutrófilos y eosinófilos era similar en los tres grupos. Aunque existía una
tendencia a tener un mayor número de linfocitos T y sus subpoblaciones en fumadores y
exfumadores, no se encontraron diferencias significativas con los no fumadores. Los
marcadores de activación de células mononucleares VLA-1 y IL-2R sí estaban
significativamente elevados en fumadores activos y exfumadores, al igual que las
células de adhesión endotelial; por el contrario, IL-1β y TNF-α no mostraron
diferencias entre los tres grupos. Al comparar fumadores activos con exfumadores se
vio que no existían diferencias para ninguno de los parámetros estudiados. Esto
demuestra una persistencia de la inflamación a pesar del abandono del tabaco cuando
existen síntomas de bronquitis crónica46.
Se ha visto que la respuesta tras el abandono del tabaco es distinta en los
fumadores según si son fumadores asintomáticos o existe ya una EPOC instaurada, ya
que estos últimos muestran una inflamación que persiste a pesar del abandono47.
Willemse et al estudiaron en un grupo de pacientes el efecto de un año de abandono de
consumo de tabaco en la inflamación de las vías aéreas. Realizaban a los pacientes una
toma de esputo inducido y una broncoscopia con toma de biopsias en lóbulo medio o
inferior derecho. Los grupos estaban formados por veintiocho fumadores EPOC (trece
leves, ocho moderados y siete graves), diez fumadores con síntomas de bronquitits
crónica pero con función pulmonar normal, y veinticinco fumadores asintomáticos
también con función pulmonar normal. De todos ellos, doce EPOC (cuatro fumadores
con bronquitis crónica y dieciseis fumadores asintomáticos) consiguieron abandonar el
consumo de tabaco. En el grupo EPOC, la concentración de células, el número de
neutrófilos y de linfocitos, los niveles de IL-8 y de proteína catiónica de eosinófilos
estaban aumentados al año del abandono del tabaco, mientras que los eosinófilos y
macrófagos tendían a disminuir. En los fumadores asintomáticos, el número y
Respuesta inflamatoria al tabaco
32
porcentaje de macrófagos, porcentaje de eosinófilos y niveles de IL-8 se reducían al
año. En los EPOC, las biopsias al año no mostraban ningún cambio en marcadores
celulares de inflamación ni moléculas de adhesión vascular; por el contrario, en
fumadores asintomáticos los mastocitos disminuían significativamente, mientras que las
células B aumentaban.
También se ha comprobado que existe una diferente morfología en la vía aérea
de los fumadores activos, que es similar a la de los exfumadores, pero muy diferente a la
de los no fumadores. Wright et al estudiaron noventa y siete pacientes a los que se les
iba a realizar una toracotomía diagnóstica de lesiones nodulares y estudiaron la
morfología de las vía aéreas periféricas. De ellos, nueve eran no fumadores, cincuenta y
uno fumadores activos, dieciocho exfumadores de menos de dos años y diecinueve
exfumadores de más de dos años. Los bronquíolos membranosos en fumadores activos
y exfumadores mostraban mayor metaplasia de células mucosas que los no fumadores.
Los bronquíolos respiratorios de fumadores activos y exfumadores eran muy diferentes
a los de los no fumadores, con mayor inflamación, fibrosis y depósito de pigmento, así
como mayor número de macrófagos intraluminales48.
La citomorfología del esputo ha sido estudiada por Swan et al, que comprobaron
que, con el abandono del consumo de tabaco, alguna de las características del mismo
retornaban a sus valores basales49. Estos autores estudiaron los cambios en células
exfoliadas traqueobronquiales de cuarenta y seis fumadores que abandonaron el
consumo de tabaco durante doce meses, y treinta y siete fumadores que continuaron
fumando. Realizaban análisis mensuales de los esputos analizando: macrófagos
(pigmentados y no pigmentados), neutrófilos, moco, espirales mucosas, células
cilíndricas y células metaplásicas benignas, así como presencia de displasia (leve,
moderada o grave). Estas características correlacionaban con determinados parámetros
Respuesta inflamatoria al tabaco
33
de la siguiente manera: los sujetos de mayor edad tenían mayor número de macrófagos
pigmentados, neutrófilos y células columnares; los de mayor consumo de tabaco
(paquetes-año) tenían elevadas todas las características estudiadas salvo el número de
macrófagos; menores niveles de FEV1/FVC estaban asociados con mayores niveles de
todas las características estudiadas salvo los macrófagos y espirales. Existía una
correlación positiva hacia mayor cantidad de características citológicas entre el hecho
de continuar fumando y la edad y el número de paquetes-año; mientras que la ratio
FEV1/FVC correlacionaba de forma negativa con las características citológicas en los
que lograban dejar el hábito. Tras analizar los dos grupos, los que lograban abandonar el
hábito tenían diferencias significativas en las siguientes características: 14.7% reducción
de macrófagos; descenso de 3,9% de macrófagos pigmentados; y descenso de
neutrófilos, frente al ascenso en los que continuaban fumando. Se observaba una
diferencia no significativa en lo siguiente: los que dejaban de fumar tenían menores
niveles de células columnares, de moco, de espirales y de metaplasia. En cuanto a la
displasia, no se observó diferencia entre los dos grupos a lo largo del periodo de estudio.
34
III. FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALPHA
Factor de necrosis tumoral alpha
35
1.- Introducción
El Factor de Necrosis Tumoral (TNF-α) fue descubierto en 1975 por Carswell et
al, autores que identificaron una sustancia que producía necrosis en determinados
tumores en el suero de ratas infectadas con el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y
tratadas con endotoxinas. Esta sustancia (TNF-α) mediaba la necrosis tumoral inducida
por endotoxinas, y además podía ser responsable de la citotoxicidad selectiva de
macrófagos activados50.
Tras esta primera definición, se identificó el TNF-α como una citocina con
diferentes efectos en tejidos y células entre los que se encuentran: 1) la activación del
endotelio, que conduce a una liberación del factor de crecimiento derivado de las
plaquetas51 y a cambios en la morfología endotelial y en la organización celular52; 2) la
estimulación de las linfocitos B humanos, si se combina con otros mitógenos de dichas
células53 ; 3) y otras propiedades inmunomoduladoras54.
El TNF-α se ha considerado tradicionalmente un agente antitumoral que
originaba caquexia e inflamación55. Hoy día es bien conocido su papel en la defensa
contra virus, bacterias e infecciones parasitarias, así como su mediación en la
inflamación y en varias reacciones inmunológicas. Su producción fisiológica sirve como
protección, pero su sobreproducción puede ser perjudicial e, incluso, letal56.
El efecto perjudicial en la sobreproducción del TNF-α se observa en el efecto
letal de las endotoxinas en el shock séptico mediado por el TNF-α, como demostraron
Rothstein et al. Estos autores comprobaron que existía una sinergia entre TNF-α y
bacterias o productos de éstas, causando necrosis hemorrágica y shock letal a ratones no
manipulados. Estos autores inyectaron TNF-α como única sustancia subcutánea, o junto
con: 1) lipolisacáridos (endotoxinas) de Escherichia Coli; 2) Corinebacterium parvum
(gram positivo) inactivado por calor; 3) lisados de células infectadas por micoplasmas.
Factor de necrosis tumoral alpha
36
El TNF-α no producía necrosis hemorrágica cuando era administrado como único
producto; tampoco producía shock letal, salvo cuando se administraba a la dosis
máxima (160 μg) y sólo en el 10% de los ratones. La combinación de TNF-α con LPS
tenía una acción sinérgica sobre la mortalidad por shock. De la misma manera,
inyecciones secuenciales de LPS seguidas de TNF-α originaban una necrosis
hemorrágica masiva en la mayoría de los ratones (21 del total de 26), y muerte posterior
en la mitad de ellos (11 de 21). Sin embargo, si la inyección primera era el TNF-α
seguida de LPS, no se producía ni necrosis hemorrágica ni muerte por shock, sugiriendo
así que son los LPS los que sensibilizan el tejido subcutáneo para la inducción de
necrosis. El TNF-α, junto con una suspensión de C. Parvum, producía necrosis
hemorrágica en el sitio de la administración pero no causaba muerte por shock. Pero si
la administración era intravenosa, se observaba un efecto sinérgico produciendo muerte
por shock, aunque en menor grado que la asociación TNF-α-LPS. Los preparados de
TNF-α con micoplasmas no demostraron efecto alguno sobre la mortalidad por shock,
aunque sí producían necrosis hemorrágica. Estos resultados indican que una sinergia
entre el TNF-α y bacterias (o sus productos) causa necrosis hemorrágica y shock mortal
en ratones normales57.
La actividad del TNF-α en la inflamación la encontramos en el trabajo de
Michie et al. Estos autores publicaron en 1988 un trabajo en el cual inyectaban
endotoxina de Escherichia coli a 13 voluntarios sanos. Medían los niveles de TNF-α
tras la administración de dicha toxina y tras un periodo control con administración de
suero salino. A un grupo de 8 pacientes les suministraron ibuprofeno previo a la
endotoxina o al suero salino. Comprobaron que entre 90 y 180 minutos tras la
endotoxina se producía un pico de TNF-α de 240 pg/ml, cifra significativamente mayor
a los 35 pg/ml de los controles con salino. En ese período de pico de TNF-α se
Factor de necrosis tumoral alpha
37
detectaban los síntomas gripales (escalofríos, dolor de cabeza, mialgias, náuseas), así
como fiebre, taquicardia y un incremento en las cifras de hormonas del estrés (ACTH y
adrenalina). En el grupo de pacientes que recibió ibuprofeno previo, se detectaron cifras
elevadas (170 pg/ml) a las 2 horas, que sin embargo volvían a la normalidad a las 4
horas. Y lo más destacado fue la ausencia de síntomas y la menor síntesis de hormonas
de estrés en este grupo. Por tanto, parece que la inhibición de la ciclooxigenasa no
afecta a los niveles de TNF-α circulante tras endotoxina; no obstante, la ausencia de
síntomas indicaría que las citocinas producen unas respuestas a través de la vía de la
ciclooxigenasa, y que es ésta la vía a través de la cual actuaría este grupo de fármacos, y
no inhibiendo la producción del TNF-α58.
2.- Mecanismo de acción
El TNF-α a nivel celular ha sido implicado en multitud de acciones, como por
ejemplo en la activación de varios genes relacionados con las respuestas inmunológica e
inflamatoria, en proliferación celular, respuesta antiviral, inhibición del crecimiento y
muerte celular56. Actualmente se ve como un mediador endógeno de la inflamación y
fenómenos asociados, siendo las células endoteliales las principales dianas
proinflamatorias del TNF-α. Esta sustancia no tiene actividad enzimática y todas sus
acciones resultan de las respuestas de células ante la presencia de la citocina. Ésta activa
dos vías de señalización: una que conduce a la activación de nueva transcripción de
genes, y otra que lleva a la muerte celular.
El TNF-α induce la muerte celular en células tratadas con la citocina, a través de
la apoptosis o por necrosis celular, dependiendo de determinadas variables como el tipo
de célula, dosis y condiciones de la exposición al TNF-α. El receptor I del TNF-α
(TNFR-I, correspondiente al receptor de 55 kDa) es el principal implicado en la
Factor de necrosis tumoral alpha
38
transducción de la muerte celular. Estos receptores se encuentran localizados en su
mayoría en el complejo perinuclear de Golgi. No obstante, y ante determinadas
circunstancias, el receptor II (TNFR-II, de 75 kDa) ensalza la señal de muerte celular
del receptor I, o bien interviene él mismo en dicha muerte. Este último receptor se
localiza en la superficie celular. Existe suficiente evidencia de que el TNF-α induce
cambios en la estructura y función de las mitocondrias, que tienen un papel activo en la
muerte celular. Pero además el TNF-α activa sistemas de señalización en múltiples
compartimentos subcelulares como plasma celular, mitocondrias, endosomas, citosol y
núcleo59. (Fig. 1)
Figura 1: Receptores I y II del TNF-α en la célula, sus complejas relaciones con
órganos intracelulares y con otros mediadores. Tomado de Ledgerwood et al59.
3.- Metabolismo del TNF-α
El metabolismo del TNF-α marcado con yodo 125 radiactivo se ha estudiado en
ratas a las cuales se les había inyectado LPS. En estos animales se observó una
elevación en niveles de TNF-α a los 15 minutos de la administración, con un pico a las
Factor de necrosis tumoral alpha
39
2 horas, alcanzando de nuevo niveles basales a las 5 horas. La vida media plasmática
fue de 6 minutos aproximadamente. Los tejidos que captaban el 80% de actividad de
TNF-α no circulante fueron: piel, tracto gastrointestinal, riñón, hígado y pulmón; el
cerebro fue el órgano que menos captación radiactiva tenía. Se comprobó que el TNF-α
era degradado rápidamente en el tejido periférico sin formación de productos
intermedios; sólo 10% de la sustancia radiactiva se detectó en la orina (como producto
de degradación y no como sustancia activa)60.
Con la intención de conocer la farmacocinética, la toxicidad y la actividad
biológica del TNF-α, se realizó un estudio con TNF-α recombinante (TNFr) en 20
pacientes con cáncer metastásico. Inyectaron TNFr dos veces por semana durante 4
semanas de forma alternativa, bien vía intravenosa (IV) o vía intramuscular (IM). Tras
la administración IV, se detectaban niveles en suero entre 25 y 100 μg/m2, y se calculó
una vida media de 14-18 minutos. Tras la inyección IM, los niveles en suero eran de
150 μg/m2 o mayores, con un pico de concentración en las 2 primeras horas, y
ocasionalmente se detectaba en el límite más bajo a las 24 horas61.
Por tanto, podemos decir que el TNF-α circulante tiene un vida media de entre 6
y 18 minutos, que su degradación se produce en su mayoría en los tejidos periféricos,
sin originar productos activos, y con mínima eliminación en orina.
4.- Receptores del TNF-α
Estos receptores fueron identificados por Hohmann et al, tras varios intentos
previos con descripción de productos de distintas masas moleculares. Estos autores
demuestran que las células mieloides tienen mayoritariamente productos cruzados de
98-100 kDa, mientras que los de las células de origen epitelial eran de 75 y 95 kDa.
Esto les sugiere que, al menos, existen dos tipos de receptores TNF-α62.
Factor de necrosis tumoral alpha
40
Brockhaus et al, a través de estudios con TNF-α marcado con yodo radiactivo y de
inmunoprecipitación, reconocen dos proteínas, de 55 kDa y 75kDa, que actúan en la
señal de reconocimiento de TNF, pudiendo así ser consideradas como receptores de
TNF-α63.
El TNF-α es una citocina, liberada por macrófagos y linfocitos, con una potente
actividad proinflamatoria que realiza sus acciones a través de dos receptores
transmembrana: TNF-R p55 y TNF-R p7564. Estos receptores forman parte de una
superfamilia que incluye el factor de crecimiento de nervios (NGFR), antígeno Fas,
CD27, CD30, CD40, OX40 y 4-1BB. Los dominios ricos en cisteína de la parte
extracelular de estos receptores, son homólogos a proteínas víricas producidas por el
virus de la varicela vacuna, el virus del fibroma Shope y el virus mixoma. La
cooperación entre estos receptores es compleja y su interacción puede resultar en una
inhibición o una excitación de la señal. La señal del TNF-α a las células está mediada
por el receptor p55, mientras que la principal función del receptor p75 es la de presentar
el TNF-α al receptor 5565.
El receptor p55 interviene en: la inducción del receptor de IL-2, actividades
antivirales, estímulos del crecimiento, la expresión de antígenos HLA y la adhesión de
células endoteliales. El receptor p75 actúa en la proliferación de los timocitos inducida
por el TNF-α66.
Aunque ambos receptores se expresan en la superficie de la mayoría de los
diversos tipos de células, TNF-R p55 se expresa principalmente en células de estirpe
epitelial , y TNF-R p75 en células de origen mieloide63.
Factor de necrosis tumoral alpha
41
5.- TNF-α y tabaco
La influencia del tabaco en los niveles de TNF-α ha provocado mucha
controversia entre los diversos estudios publicados al respecto: unos llevados a cabo en
células de laboratorio, otros en animales y algunos también en humanos.
Ouyang et al estudiaron el efecto de extractos del tabaco sobre la producción
humana in vitro de IL-1β, IL-2, TNF-α y IFN-γ. Determinaron la concentración de
hidroquinona y catecol en extractos del humo del tabaco mediante cromatografía líquida
de alta eficacia (HPLC). Las células mononucleares de sangre periférica de humanos no
fumadores (PBMC) se trataron con extractos del humo del tabaco (hidroquinona,
catecol, nicotina, fenol, resorcinol, o-cresol, m-cresol o p-cresol), y posteriormente se
estimularon con anti-CD3 y forbol-12-miristato-13-acetato. Los niveles de citocina en el
sobrenadante fueron medidos por ELISA. Estos autores demostraron que: 1) los
extractos del humo del tabaco suprimían de forma muy intensa (en relación a la
concentración de estos tóxicos) la producción de IL-1β, IL-2, TNF-α y de IFN-γ; 2) la
nicotina disminuía ligeramente, en cultivos de sangre periférica, la producción de TNF-
α (38%), IL-2 (27%), IFN-γ (21%), IL-1β (8%); 3) la hidroquinona y el catecol
(productos de la pirolisis del tabaco) llegaban a producir una inhibición de la
producción de las 4 citocinas hasta en un 90%, incrementándose así el riesgo de
infecciones y de cáncer de pulmón67.
En discrepancia con este trabajo, Morimoto et al68 no lograron demostrar que el
humo del tabaco influya por sí solo en la producción de TNF-α. Estos autores realizaron
experimentos en ratas que eran expuestas durante 4-5 días a concentraciones de 10
mg/m3 de humo de tabaco durante 8 horas (Fig. 2).
Factor de necrosis tumoral alpha
42
Figura 2: Diagrama del sistema utilizado por Morimoto et al para la exposición al
humo del tabaco en ratas68.
Tras esta exposición al humo de tabaco, se les realizaba un BAL y se comparaba con el
BAL de ratas similares que no habían sido expuestas al humo del tabaco. Las expuestas
al humo de tabaco demostraban tener un número significativamente mayor de células en
el BAL, aunque el contaje celular diferencial de ambos grupos no variaba. De los
macrófagos de dicho BAL se estudió la producción de TNF-α y se observó que, en
ambos grupos, la producción era similar. Sin embargo, si a dichos macrófagos se les
estimulaba con crisolita, las diferencias eran significativamente mayores para el grupo
de ratas expuestas al humo del tabaco. Además, esta mayor producción dependía de las
concentraciones de crisolita. En el caso de usar fibras de cerámica para estimular a los
macrófagos, la producción de TNF-α era mayor en el grupo de ratas expuestas, pero sin
Factor de necrosis tumoral alpha
43
diferencias significativas. Concluyen, por tanto, que el humo del tabaco y las fibras
minerales tienen un efecto sinérgico en la producción de TNF-α por los macrófagos
alveolares.
Zhang et al estudiaron el efecto del humo del tabaco en ratas y el efecto de un
inhibidor del TNF-α (proteína de fusión Fc IgG: receptor II de TNF recombinante
humano, rhTNFR:Fc) sobre la apoptosis de células del septo alveolar. Distribuyeron a
las ratas en 4 grupos de 12 ratas cada uno: un grupo estaba formado por ratas control;
otro grupo por ratas sometidas a humo de tabaco (fumadoras pasivas); otro grupo, ratas
tratadas con TNF recombinante humano; y el último grupo, tratado con placebo. Los 3
últimos grupos fueron expuestos diariamente al humo del tabaco durante 80 días. Tras
un mes, a los 2 últimos grupos se les inyectaba rhTNFR:Fc o placebo dos veces por
semana durante 7 semanas. En estos grupos estudiaron la función pulmonar
(FEV0.3/FVC y PEF) y los niveles de TNF-α en suero y BAL, así como el intercepto
linear medio (medida de distancia entre las paredes alveolares), el número medio de
alveolos (como indicador de densidad alveolar) y el índice de TUNEL (como análisis
cuantitativo de apoptosis, mediante la reacción diaminobentidina mediada por
peroxidasa). Con respecto a la función pulmonar, comprobaron que el grupo de
fumadoras pasivas tenían valores de función pulmonar inferiores que el resto de grupos;
las del grupo intervención tenían niveles más elevados que las del grupo placebo. Los
valores del TNF-α en suero eran mayores en ratas fumadoras pasivas; las del grupo
placebo tenían niveles significativamente más altos que las del grupo intervención. En
BAL, el TNF-α estaba más alto en fumadoras pasivas, pero no se veían diferencias
significativas entre el grupo placebo y el grupo de intervención. El estudio histológico
revelaba que en el grupo control no existía enfisema, mientras que en los otros 3 grupos
sí era evidente un enfisema histológicamente avanzado: el intercepto linear medio
Factor de necrosis tumoral alpha
44
estaba aumentado y el número medio de alveolos disminuido. Además, observaron que
este proceso se caracterizaba por un infiltrado inflamatorio celular (Fig. 3).
Figura 3: Histología del parénquima pulmonar (hematoxilina-eosina, amplificada x
100). 1: ratas control. 2: ratas fumadoras pasivas. 3: ratas que recibieron el TNF
recombinante humano. 4: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.
En cuanto a la apoptosis, las fumadoras pasivas tenían un mayor índice de TUNEL
respecto al grupo control y al grupo intervención, sin existir diferencias con el grupo
placebo (Fig. 4 y 5). Por tanto, un inhibidor del TNF-α podría reducir la apoptosis
alveolar septal en fumadores69.
Figura 4: Apoptosis de células del septo alveolar (fluorescencia amplificada x 200). 5:
ratas control. 6: ratas fumadoras pasivas. 7: ratas que recibieron TNF recombinante
humano. 8: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.
Factor de necrosis tumoral alpha
45
Figura 5: Apoptosis de células del septo alveolar (TUNEL, amplificado x 400). 9: ratas
control. 10: ratas fumadoras pasivas. 11: ratas que recibieron TNF recombinante
humano. 12: ratas tratadas con placebo. Tomado de Zhang et al69.
Estudios en humanos, como el de Keatings et al, encuentran niveles más
elevados de TNF-α en el esputo inducido de fumadores con EPOC, pero no en
fumadores asintomáticos70. Estos autores estudiaron a 14 pacientes EPOC, 23
asmáticos, 12 fumadores control y 18 no fumadores control. Midieron en el esputo
inducido de todos los grupos el recuento celular y los niveles del TNF-α y la IL-8. Los
pacientes EPOC presentaban cifras más elevadas de neutrófilos en esputo que el resto
de grupos de pacientes estudiados, los cuales se correlacionaban con el grado de
obstrucción bronquial (FEV1). Los fumadores tenían también niveles significativamente
más elevados que los no fumadores. Los niveles de TNF-α también eran mayores en
EPOC, y ligeramente en los asmáticos frente a los grupos control. Sin embargo, y en
contra de lo que cabía pensar, los fumadores no mostraban diferencias en las cifras de
TNF-α en esputo inducido frente a los no fumadores; por tanto, los niveles elevados de
TNF-α en EPOC no deben ser efecto del consumo de tabaco per se. Por el contrario, IL-
8 sí era mayor en fumadores control frente a no fumadores. Estos autores sugieren que,
como TNF-α activa la proteolisis extracelular producida por los neutrófilos, y esta
Factor de necrosis tumoral alpha
46
actividad es un mecanismo de producción de enfisema, es este el mecanismo a través
del cual TNF-α actúa en la progresión de la enfermedad. Sin embargo, el hecho de que
los fumadores tengan mayores niveles de neutrófilos, pero no de TNF-α, sugeriría que
es necesaria la presencia de TNF-α para el desarrollo de la enfermedad.
Continuando la misma línea de estudio en humanos, Kuschner et al71 estudiaron
un grupo de 14 fumadores (que se abstuvieron de fumar las 8 horas previas a la
realización de la toma de muestras), y un grupo de no fumadores, en ambos casos sin
patología crónica ni aguda (4 últimas semanas) y sin tratamiento farmacológico activo.
A los dos grupos se les realizó espirometría y fibrobroncoscopia con BAL. En el BAL
de los fumadores existían niveles significativamente más elevados de macrófagos (524
vs 220 x 103/ml) y de neutrófilos (12,9 vs 2,1 x 103/ml); dichos niveles guardaban
relación con la intensidad del consumo de tabaco. En cuanto a las citocinas y proteínas
estudiadas en el sobrenadante del BAL, se observó que existían niveles
significativamente más elevados para los fumadores en las siguientes interleukinas: IL-
1β, IL-6, IL-8 y MCP-1 (proteína 1 quimiotáctica de macrófagos). Las cifras de TNF-α
eran más altas en fumadores (2,5 vs 0,2 pg/ml) pero no alcanzaban significación
estadística.
Sin embargo, existen series que describen el efecto supresor del tabaco sobre la
producción del TNF-α por los macrófagos alveolares y monocitos periféricos, estudiado
tanto in vivo como in vitro. McCrea et al seleccionaron a un grupo de 9 fumadores y 9
no fumadores sin patología crónica ni aguda en las 6 semanas previas, sin tratamiento
farmacológico en el momento del estudio y con valores espirométricos dentro de la
normalidad. Realizaron BAL, centrifugando inmediatamente el mismo, y congelando el
resultante libre de células. El BAL de los fumadores contenía 2 veces y media más
células que el de los no fumadores (65,3 x 108 vs 27,2 x 108). En el contaje diferencial
Factor de necrosis tumoral alpha
47
no existía diferencia entre ambos grupos. Los niveles de IL-6 del BAL de fumadores
eran muy inferiores a los de los no fumadores (1,8 vs 15,9 pg/ml). No existían
diferencias entre ambos grupos para los niveles de IL-8 y actividad quimiotáctica de
neutrófilos. No se detectaron niveles en ninguno de los dos grupos para TNF-α. Los
macrófagos del BAL fueron puestos a cultivar con lipolisacáridos (potente estímulo
fisiológico para la liberación de TNF-α e IL-6) y observaron que la liberación de TNF-
α por dichos macrófagos era mayor en el grupo de no fumadores que en el de
fumadores a las 6 horas (211 vs 1,406 unidades por 106 células), y esa mayor liberación
se mantenía a las 24 horas de dicha incubación. De la misma forma, la liberación de IL-
6 era también mayor en los no fumadores (5,8 vs 64,9 unidades hibridoma por ml). Por
tanto, concluyen que, incluso en fumadores sanos y jóvenes, el microambiente
pulmonar es anormal, explicado por niveles inferiores de IL-6, macrófagos con
disminución de capacidad para liberación de citocinas mediada por LPS, y
concentraciones elevadas de IL-811.
También el efecto supresor del tabaco sobre TNF-α es descrito por Dandrea et
al72, que estudiaron el efecto que el dióxido de nitrógeno (NO2) tenía sobre la liberación
de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-8, MIP-1) por los macrófagos alveolares de fumadores y
no fumadores. El NO2 está presente en altas concentraciones (hasta 1000 ppm) en la
corriente principal del humo del tabaco, aunque no es ésta la concentración a la que se
encuentra expuesto el pulmón. Las células del BAL de un grupo de 6 fumadores y otro
de 6 no fumadores, sanos en ambos casos, fueron expuestas a este gas tóxico. En
fumadores, con concentraciones de 5 ppm no se producía ningún cambio en la
producción de estas citocinas; sin embargo, al incrementar la exposición a 20 ppm se
producía una disminución significativa de IL-8, TNF-α y MIP-1, pero no de IL-1β. Esta
inhibición se producía también en las células que habían sido estimuladas con LPS. En
Factor de necrosis tumoral alpha
48
el grupo de no fumadores, la exposición a 20 ppm de NO2 inhibía sólo la liberación de
TNF-α; no se producía ninguna alteración en la liberación de citocinas tras estimulación
con LPS. Sí comprobaron que los macrófagos del BAL de no fumadores liberaban 1,5
veces más TNF-α que el de los fumadores durante la incubación control. Esta alteración
en la liberación de citocinas mediada por NO2 sugiere que la inhalación de este gas en
los fumadores puede contribuir a la deteriorada defensa pulmonar contra infecciones.
6.- TNF-α y EPOC
Se han relacionado determinadas citocinas, entre ellas el TNF-α, con la EPOC
sobre todo en estadíos avanzados, formando parte de la cascada inflamatoria sistémica
desatada una vez que la enfermedad está establecida y desarrollada. Pero también está
implicada esta citocina en la patogénesis de la propia enfermedad. Así se sabe que el
TNF-α, junto con los neutrófilos, conducen a una degranulación, liberando elastasa,
lisozima y otras enzimas73, 74. Existen multitud de publicaciones que tratan de estudiar la
influencia del TNF-α en el desarrollo de EPOC, unas realizadas en estudios de
laboratorio y otras en humanos.
6.1.- Estudios de laboratorio
Gamble et al, usando TNF-α recombinante humano, demostraron que
éste aumentaba la adherencia de los neutrófilos sanguíneos a las células endoteliales de
vena umbilical in vitro. Dicha acción la ejercía mediante su efecto sobre los neutrófilos
y sobre las células endoteliales. El efecto sobre los neutrófilos era máximo en los
primeros cinco minutos, y no precisaba síntesis de proteínas o de RNA. Los máximos
efectos sobre las células endoteliales se alcanzaban a las 4 horas, y por el contrario, sí
que requerían síntesis de nuevas proteínas y RNA. Los efectos sobre los neutrófilos y
Factor de necrosis tumoral alpha
49
sobre las células endoteliales eran bloqueados por anticuerpos monoclonales anti-TNF.
El TNF-α inducía un rápido incremento en la superficie de antígenos neutrofílicos, que
eran reconocidos por los anticuerpos monoclonales. Así se demuestra que el TNF-α es
inductor de un proceso clave para el desarrollo de la respuesta inflamatoria73.
También se ha estudiado el TNF-α recombinante humano como estímulo
de la ruptura y degranulación de los neutrófilos del tracto respiratorio. Klebanoff et al
vieron que la LDH (marcador citoplasmático) era liberada por los neutrófilos tras ser
estimulados con TNF-α, lo que sugería un efecto lítico sobre los neutrófilos. Pero era
aún mayor la liberación de lisozima (presente principalmente en los gránulos de los
neutrófilos), con lo cual se observaba que el TNF-α tenía un efecto secretagogo sobre
los gránulos. Además, a diferencia de la acción del TNF-α sobre determinadas células
(células endoteliales, adipocitos, etc), que requieren su unión a receptores superficiales
y modificación genética, el efecto sobre los granulocitos era rápido e independiente de
la síntesis de RNA. Así, se puede concluir que el TNF-α es un estimulante natural de
neutrófilos que promueve la adherencia a células endoteliales y a partículas, lo que
origina fagocitosis y degranulación74.
Lucey et al75 encontraron que el enfisema inducido por la elastasa pancreática
porcina estaba muy disminuido en ratones cuyos receptores TNF-α se habían
inactivado. Estos autores estudiaron a un grupo de ratones a los que se les había
bloqueado el receptor de IL-B, el del TNF-α o ambos, y lo compararon con ratones que
no habían sido manipulados y disponían de todos los receptores anteriormente citados.
Administraron a estos ratones, una vez anestesiados, una única dosis intratraqueal de 30
μg de elastasa pancreática porcina (EPP) o bien 0,1 ml de suero salino. Posteriormente
los animales fueron exsanguinados y se extrajo su pulmón, obteniendo muestras de su
tejido pulmonar. Para la localización in situ de apoptosis, utilizaron un kit de marcaje de
Factor de necrosis tumoral alpha
50
DNA fragmentado, obteniendo una tinción de color marrón al microscopio. Una vez
llegados a este punto, medían el tamaño del espacio aéreo pulmonar (intercepto linear)
de los ratones manipulados y lo comparaban con el de los ratones control. Observaron
que en los días 1 y 3, las diferencias entre los ratones tratados con elastasa y los tratados
con salino eran mínimas. Sin embargo, a los días 5, 10 y 21, los valores medios eran
significativamente más elevados en los ratones manipulados (en los días 10 y 21, los
valores llegaban a ser el doble). El examen microscópico demostró que no existían
diferencias entre los 3 grupos de ratones sin receptores que habían sido tratados con
suero salino. En los tratados con EPP, existía un importante aumento de tamaño de las
paredes alveolares, compatible con destrucción (Fig. 6).
Figura 6: Fotomicrogramas de parénquima pulmonar tratado con 30 μg de EPP o suero
salino. A: ratón sin manipular tras ser tratado 21 días con suero salino. B: ratón sin
manipular tras tratamiento de 21 días con EPP. C: ratones sin ningún tipo de receptor
tras 21 días con EPP. El tamaño y la estructura alveolar son normales en la figura A. En
la figura B existe una destrucción de las paredes alveolares y un aumento de tamaño del
espacio alveolar. La severidad del enfisema es menor en la figura C que en la B. EPP:
elastasa pancreática porcina. Tomado de Lucey et al75.
Factor de necrosis tumoral alpha
51
También se observó un incremento de las células marcadas para detectar
apoptosis en las ratas no manipuladas tratadas con EPP. Por el contrario, análisis de las
imágenes de este material en ratones sin receptores demostraron menores niveles de
apoptosis (Fig. 7). Por tanto, concluyen que los mediadores inflamatorios incrementan
el enfisema inducido por EPP en ratones y que la cuantía de la apoptosis, producida de
alguna manera por estos mediadores, contribuye al desarrollo de enfisema mediante el
defecto en el proceso de reparación.
Figura 7: Fotomicrograma del parénquima pulmonar de un ratón no manipulado, 1 día
después de ser tratado con EPP, que demuestra células positivas para el marcado de
transferasa desoxinucleótida. Las flechas indican las áreas positivas. EPP: elastasa
porcina pancreática. Tomado de Lucey et al75.
Churg et al76 también realizaron experimentos con ratones a los que se les había
eliminado los receptores TNF-α (p55/p75). Exponían a estos ratones al humo de 4
cigarrillos, utilizando un dispositivo para fumar. Una vez transcurridas 24 horas de la
exposición, se les inducía la muerte por sobredosis de halotano y se les extraían los
Factor de necrosis tumoral alpha
52
pulmones. Les introducían un catéter a través de la tráquea y realizaban un lavado
intrapulmonar con 1 ml de suero salino frío para contaje celular, o con agua destilada
para el análisis de degradación de tejido conectivo. De un grupo determinado de ratones
obtenían el RNA pulmonar, según el método de Chomezynski y Sacchi77, y realizaban
la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa. En los ratones control
observaron que 2 horas tras la exposición al humo del tabaco, se incrementaba
ligeramente la expresión genética del TNF-α, se producía una marcada expresión de la
proteína-2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2), y, aproximadamente, se duplicaba la
expresión de la proteína 1 quimiotáctica de macrófagos (MCP-1). Por el contrario, los
ratones manipulados no tenían incremento en ninguno de los productos genéticos, y
existía, de hecho, una disminución en la expresión de TNF-α. A las 6 horas de la
exposición, los niveles de TNF-α, MIP-2 y MCP-1 volvían a los niveles basales en los
ratones control, y así se mantenían igualmente a las 24 horas. En los ratones sin
receptores TNF-α, no se producía cambio alguno ni a las 6 ni a las 24 horas. En los
ratones control, a las 24 horas, se observaba un incremento importante de los neutrófilos
en el lavado, así como un ligero incremento en macrófagos, desmosina (medida de
ruptura de elastina) e hidroxiprolina (media de ruptura de colágeno). Esta misma
observación no se podía demostrar en los ratones manipulados, de la misma forma que
tampoco se veían cambios tras exposición durante 7 días (mientras sí se veía un
continuo incremento en neutrófilos y macrófagos del lavado en los ratones control).
Estos autores concluyen, pues, que el TNF-α es clave para la inflamación aguda
producida por el tabaco y produce una destrucción del tejido conectivo, precursor de
enfisema.
Factor de necrosis tumoral alpha
53
6.2.- Estudios en humanos
Takabatake et al estudiaron pacientes EPOC frente a sanos para tratar de
conocer la fisiopatología de la EPOC. Determinaron los niveles de Fas (receptor
transmembrana expresado en células normales y malignas) y TNF-α en 34 pacientes
EPOC frente a 35 controles sanos. Ambas sustancias son dos importantes mecanismos
de apoptosis en humanos, que in vitro, han demostrado similar activación por la
hipoxia. La hipoxia crónica está presente en la EPOC y se ha demostrado que el sistema
TNF-α está activado debido a la misma.78 Estos autores intentaron demostrar si los
cambios fisiológicos en pacientes EPOC hipoxémicos tenían influencia sobre el sistema
Fas-Fas. Demostraron que los niveles de TNF-α estaban significativamente más
elevados en los pacientes EPOC (6,45 vs 5,21 pg/ml). Por el contrario, no encontraron
diferencias significativas en los niveles de Fas entre ambos grupos. Concluyen así que
el sistema Fas por sí solo no juega un importante papel en la fisiopatología del EPOC79.
Estos mismos autores pretendían demostrar in vivo lo que algunos autores
habían demostrado in vitro: la hipoxia acelera la producción de TNF-α en macrófagos
alveolares estimulados por lipopolisacáridos y en células mononucleares periféricas.
Estudiaron a 27 varones con diagnóstico de EPOC estable en los 3 últimos meses, y
comprobaron cómo los valores de TNF-α estaban significativamente más elevados en
los EPOC (6,15 vs 5,41 pg/ml). Comprobaron igualmente que existía una relación
inversa entre PaO2 y el TNF-α circulante. Además, los pacientes con PaO2 < 60 mm
Hg tenían niveles significativamente mayores que los que mantenían PaO2 > 60 mm
Hg. (6,76 vs 5,79 pg/ml). Concluyen así que la hipoxemia activa el sistema TNF-α en
pacientes EPOC78.
Factor de necrosis tumoral alpha
54
7.- Niveles de TNF-α en la población general
Los niveles de TNF-α han sido estudiados en la población general y se ha visto
que dichos niveles están significativamente asociados al sexo (ligeramente inferiores en
mujeres) y a la edad (niveles más elevados en grupos de mayor edad)80. Se estudiaron
568 pacientes de entre 13 y 80 años, incluidos en el segundo estudio nutricional de
bávaros, a los cuales se les extrajo una muestra sanguínea. Se estudió la relación entre
los niveles de TNF-α, de sus receptores y de IL-6 con sexo, edad, IMC, historia de
tabaquismo, hipertensión o diabetes. Así, observaron que las mujeres tenían unos
niveles de TNF-α ligeramente menores que los varones, al igual que ocurría con el
receptor p55. Sin embargo, el receptor p75 y la IL-6 no tenían relación con el sexo del
paciente. El grupo de mayor edad (>= 70 años) tenía niveles significativamente más
elevados que el resto de grupos de edad en TNF-α, sus receptores e IL-6. EL IMC no
tenía relación con los niveles de TNF-α; sin embargo, los pacientes con mayor IMC sí
demostraban tener mayor IL-6 y receptores de TNF-α (incluso tras corregirlo con edad
y sexo). Después de ajustar a los pacientes por edad, sexo e IMC, no se encontró que el
consumo de tabaco, ni el padecer diabetes o hipertensión estuvieran asociados con las
cifras de las citocinas estudiadas.
A diferencia del estudio anterior, se ha comprobado que existen niveles más
elevados en pacientes obesos81. Park et al estudiaron a 100 asiáticos (46 obesos frente a
54 con IMC < 25 kg/m2), una vez excluidos aquellos con enfermedad maligna o
inflamatoria previamente diagnosticada. En ambos grupos determinaron los niveles de
PCR, IL-6 y TNF-α. Para las tres citocinas estudiadas existían unos niveles
significativamente más elevados en los obesos (para TNF-α, 1,72 vs 2,69 pg/ml).
Además, dichos niveles se correlacionaban con peso, IMC, perímetros de cintura y de
cadera, y la relación cintura-cadera. Sin embargo, y a diferencia de PCR y de IL-6, en
Factor de necrosis tumoral alpha
55
los sujetos obesos, TNF-α no se relacionaba con los parámetros antropométricos o
depósito abdominal de grasa (tejido adiposo total, tejido adiposo subcutáneo, tejido
adiposo visceral).
También se ha estudiado la influencia de la diabetes. Se comprobó que los
pacientes diabéticos tenían igualmente mayores niveles de TNF-α, lo cual se ha
relacionado con la resistencia a la insulina en modelos animales de obesidad. En estos
animales se comprobó que se recuperaba la sensibilidad a la insulina al neutralizar el
TNF-α mediante la administración de receptor soluble de TNF-α82.
Por tanto, parece que TNF-α está más elevado en varones, de mayor edad, en
relación al peso y con la presencia de diabetes.
56
IV. CONDENSADO DE AIRE EXHALADO
Condensado de aire exhalado
57
1.- Introducción
El árbol bronquial presenta inflamación en relación con multitud de enfermedades.
La medida de esta inflamación local se ha realizado tradicionalmente con pruebas
invasivas, como el lavado broncoalveolar, o mediante técnicas no invasivas, pero no
exentas de problemas, como el esputo inducido. Una técnica aún no difundida en la
práctica clínica habitual es el condensado de aire exhalado (CAE). Esta técnica comenzó a
conocerse en la década de los ochenta por medio de un grupo de autores rusos83, y
posteriormente suscitó interés de tal forma que se han publicado multitud de artículos en la
literatura acerca de la utilidad de este método en la investigación de enfermedades
pulmonares y en enfermedades ocupacionales. Desde hace varios años el aire exhalado se
utiliza como herramienta de diagnóstico y control de tratamiento. Así el análisis del óxido
nítrico exhalado se está difundiendo como medida de inflamación en enfermedades
respiratorias, como el asma bronquial84.
La muestra recogida en el CAE reflejaría la capa de fluidos extracelular
broncoalveolar. En la capa de fluidos de las vías aéreas inferiores se han encontrado
múltiples sustancias volátiles y hasta 200 no volátiles. Entre las moléculas no volátiles que
se encuentran en el aire exhalado se incluyen proteínas, lípidos, oxidantes y nucleótidos.
Estas moléculas representan marcadores de varios procesos patológicos pulmonares.
Distintos marcadores de stress oxidativo y/o mediadores de la inflamación (8-isoprostano,
leukotrienos, postraglandinas, etc.) se han detectado en el CAE de sujetos sanos y de
pacientes con diferentes patologías inflamatorias de las vías aéreas. No obstante, en la
literatura científica existe una gran variabilidad en la concentración de solutos en el CAE,
algunos de los cuales se han visto que son similares para sujetos sanos y enfermos de
distintas patologías.
Condensado de aire exhalado
58
Se piensa que la capa de fluidos de la vía aérea, debido a la turbulencia del flujo de
aire, se convierte en aerosol y, por tanto, el contenido del condensado procedería de los
alveolos y bronquíolos, reflejando así la composición del lavado broncoalveolar (BAL)5.
A pesar de esto, las comparaciones realizadas en determinadas publicaciones no
correlacionan los marcadores en CAE y BAL. Así Jackson et al llevaron a cabo un estudio
comparativo entre CAE y BAL para tratar de determinar concentraciones de
biomarcadores en enfermedades e investigar el lugar de procedencia del CAE. Las
muestras fueron recogidas de 49 pacientes a los que se les iba a realizar una broncoscopia
por indicación clínica. Para identificar los componentes alveolar y mucinoso, realizaron
determinaciones de: óxido nítrico, 8-isoprostano, peróxido de hidrógeno, pH, proteínas
totales, y fosfolípidos y queratina. Los resultados de 8-isoprostano, óxido nítrico y pH
fueron significativamente más elevados en CAE que en BAL (3,845 vs 0,027 ng/ml; 28,4
vs 3,8 μM; y 7,35 vs 6,4 respectivamente; p<0,001). Por el contrario, el peróxido de
hidrógeno no mostró ninguna diferencia entre ambas muestras (17,5 vs 20,6 μM), mientras
que las proteínas estaban significativamente más elevadas en BAL (33,8 vs 183,2 μg/ml,
p< 0,001). Los fosfolípidos totales en el CAE estaban en mayor concentración, pero la
queratina no presentaba diferencias. No encontraron asociaciones entre CAE y BAL para
ninguno de los marcadores estudiados, corregidos o no según dilución. Por lo tanto,
concluyen que, aunque se pueden medir fácilmente biomarcadores en el CAE, estos
valores no deben ser comparados directamente con la información que proporciona el
BAL. Aunque no era el motivo principal de su estudio, sí destacaron que en contra de lo
esperado, la queratina (que procede de las células epiteliales) era similar en CAE y BAL
(cuando se supone que debería ser mayor en CAE, ya que éste examina toda la vía aérea,
desde la orofaringe a los alveolos), mientras que los fosfolípidos (que se encuentran
principalmente en el surfactante) estaban significativamente más elevados en CAE85.
Condensado de aire exhalado
59
2.- Descripción de la técnica
Se han utilizado dispositivos cuasi-artesanales que recogen la muestra mediante un
tubo, a través del cual se exhala, que se encuentra introducido en una cubeta con hielo o
nitrógeno líquido (Fig. 8).
Figura 8: Representación de un dispositivo semi-artesanal de recogida de condensado de
aire exhalado utilizado en los primeros estudios. Tomada de Hunt et al90.
Muchos tipos se han usado como tubos de teflón inmersos en agua helada86,
condensadores de doble pared con una cámara interna con hielo87 (Fig. 9), tubos de doble
luz enfriados mediante aire frío a través de la luz externa, y más recientemente
dispositivos disponibles comercialmente que disponen de un cilindro de aluminio para
enfriar (Rtube, Respiratory Research Inc, Charlottesville, VA)88 (Fig. 10) o refrigerar el
sistema (EcoScreen, Jaeger, Alemania).
Aire exhalado
Cubeta con hielo Condensado
recogido
Condensado de aire exhalado
60
Figura 9: Representación esquemática del aparato de colección de condensado exhalado.
Tomada de Horváth et al87.
Figura 10: Rtube, Respiratory Research Inc, Charlottesville, VA. Sistema de recogida de
CAE. a) El sujeto respira a volumen corriente a través de la boca. El aire ambiente se
inhala a través de una válvula unidireccional. El aire exhalado es conducido a través de
otra válvula unidireccional que está dentro del dispositivo. El condensado se forma y se
recoge de la pared del condensador mediante un émbolo tipo jeringa. b) Para monitorizar
la ventilación, un monitor de dióxido de carbono para el final del volumen tidal se añade a
la cámara del condensador. El flujo unidireccional asegura que las medidas sean lo más
Sujeto
Hielo
Válvula unidireccional Cámara Interna
Cámara Externa
Condensado exhalado
Válvula
Condensado de aire exhalado
61
exactas posibles. c) El mismo sistema de colección conectado a un circuito de ventilación.
Un tubo endotraqueal fenestrado se utiliza para aislar la vía aérea inferior. El condensador
se coloca en el brazo de exhalación del circuito. Tomada de Vaughan et al88.
Existen ya en el mercado dispositivos comercializados muy simples para su uso
(Fig. 11), como el EcoScreen, fabricado por Eric Jaeger GMBH (Hoechberg, Alemania),
el cual es un sistema eléctrico refrigerado modificado de dispositivo de aire frío. Dispone
de un brazo extensible y móvil que permite al paciente sentarse cómodamente en una silla
y exhalar en el interior de una cámara congelada. Esta es eficiente en condensar fluidos ya
que el condensador mantiene una temperatura de unos – 10º C en el período de
recolección de la muestra.
Figura 11: Representación esquemática del funcionamiento de un dispositivo de
condensador.
Previo al inicio de la prueba se le pide al paciente que se enjuague la boca y que
trague saliva periódicamente para evitar la contaminación de la muestra por saliva. El
Respiración tidal
Cámara de recogida de muestra
Aire ambiental
2-4 ml de condensado/5-10 min
Condensado de aire exhalado
62
paciente respira a través de una boquilla que dispone de una “trampa” cerca para retener la
saliva y evitar contaminación de la muestra por saliva del paciente (Fig. 12). El aire
inspirado procede del aire ambiente, y una válvula “no rebreathing” evita que el aire
espirado vuelva al paciente y se dirige así hacia el aparato, en cuyo interior hay una
cámara congelada, que mantiene una temperatura de – 20º C89.
Figura 12: Representación esquemática de un dispositivo de condensador. La válvula de
bloqueo es una válvula que impide que se mezclen el aire espirado y el inspirado. Tomada
de Montuschi et al5.
La técnica consiste en realizar respiraciones a volumen corriente entre 10 y 15
minutos, tiempo suficiente para recoger entre 1-3 ml de CAE. Debe congelarse la muestra
a –70º C, ya que son necesarias temperaturas bajas para preservar la labilidad de
determinados marcadores inflamatorios como los mediadores lipídicos. Posteriormente es
Válvula unidireccional
Depósito de recogida de muestra
Cubierta refrigerante
Válvula de bloqueo
Condensador lamelar
Pieza bucal
Condensado de aire exhalado
63
analizado por cromatografía y/o espectrofotometría de extracción o por
enzimainmunoensayo (ELISA)84, 90.
3.- Ventajas e inconvenientes de la técnica
Esta técnica tiene la ventaja de ser no invasiva, de poder repetirse sin problemas,
de poder usarse en fase estable o en fase aguda de la enfermedad, se puede usar en niños y
en pacientes graves. Así se ha usado en pacientes ventilados en UCI, conectándolo al
brazo espiratorio del ventilador, para comparar parámetros inflamatorios de estos
pacientes con personas sanas fumadores y no fumadores. Sack et al estudiaron a 11
pacientes conectados a ventilación invasiva en UCI durante 24-72 horas (con diagnóstico
de neumonía grave y síndrome de distrés respiratorio), 12 fumadores sanos y 21 controles
sanos. En las muestras de CAE de todos ellos determinaron varias IL (1B, 6, 8, 10), TNF-
α y IL-12p70. Los pacientes con enfermedades inflamatorias pulmonares tenían niveles
elevados de todos los parámetros estudiados en CAE en comparación con el grupo
fumador y el no fumador sano91. Además se ha demostrado que la técnica no tiene
influencia posterior en la función pulmonar ni en la inflamación5. No obstante, existen aún
algunos problemas en la recogida, análisis e interpretación del condensado de aire
exhalado que han de ser tenidos en cuenta84, 92.
La principal limitación es la ausencia de métodos estándares de recolección. Además otros
problemas son la falta de reproducibilidad, la variabilidad, la influencia de factores
externos (alcohol, tabaco, fármacos) y la labilidad de determinadas sustancias encontradas
en el CAE para su medición tras congelación. Debido a la falta de consenso, y para tratar
de que todos los trabajos que utilicen CAE sigan las mismas normas, se publicó una
normativa conjunta entre las sociedades europea y americana de Neumología (ERS /
ATS)90. Otro inconveniente con el que nos encontramos es la falta de guías clínicas que
Condensado de aire exhalado
64
nos informen sobre valores de referencia para personas sanas o con determinadas
enfermedades pulmonares, relación de dichos valores con síntomas o con función
pulmonar; o estudios clínicos que analicen la respuesta a fármacos5, 90, 93. No obstante, se
han realizado trabajos para intentar comparar los valores de sujetos sanos y pacientes con
determinadas patologías. Así, Montuschi et al midieron 8-isoprostano en CAE como
marcador de stress oxidativo en 12 fumadores sanos, 10 no fumadores y pacientes EPOC
(25 exfumadores y 15 fumadores activos). Los niveles de 8-isoprostano eran similares en
EPOC exfumadores (40 pg/ml) y EPOC fumadores activos (45 pg/ml), pero eran menores
en fumadores sanos (24 pg/ml, p< 0.001) y menores aún en no fumadores (10,8 pg/ml, p<
0,05). Para conocer el efecto del consumo agudo de tabaco, a 12 fumadores sanos les
midieron 8-isoprostano tras una abstinencia de 12 horas, y 15 minutos (así como 5 horas)
después del consumo de dos cigarrillos consecutivamente. Con respecto a los niveles
basales, el 8-isoprostano estaba más elevado a los 15 minutos del consumo de tabaco (32,3
vs 20,7 pg/ml; p< 0,03), y aunque mostraba una tendencia, no existían diferencias
significativas a las 5 horas (28,9 vs 20,7 pg/ml; p< 0,073)94.
También se desconoce todavía la influencia de la edad, sexo, maniobras
respiratorias (espirometrías), calibre de la vía aérea, ritmo circadiano, infecciones y uso de
medicación sobre marcadores de CAE. No obstante, Koutsokera et al, en una revisión
reciente, analizan la influencia de determinados factores demográficos en sujetos sanos
para tratar de establecer unos valores de referencia95. Así por ejemplo analizan:
- Tabaco: los fumadores tienen niveles más altos de H2O2 y 8-isoprostano en
relación a no fumadores.
- Obesidad: IL-6, a diferencia de 8-isoprostano, está elevado en CAE de sujetos
obesos frente a sujetos con valores de peso dentro de la normalidad. Otros
autores, discrepan de esta afirmación y han publicado datos de que el IMC no
Condensado de aire exhalado
65
se correlaciona con H2O2 y TBARs (sustancias reactivas al ácido
tiobarbitúrico) en CAE.
- Sexo: existen datos controvertidos en cuanto al impacto que pueda tener el
género del sujeto sobre niveles de H2O2 en CAE.
En cuanto a circunstancias especiales revisan las siguientes:
- Efecto del flujo y parámetros de función pulmonar: existen muchas dudas de la
influencia del patrón respiratorio en la cantidad de muestra obtenida o en la
concentración de los mediadores a estudio. Existen trabajos que han encontrado
que el factor que más influye en el volumen exhalado es la ventilación minuto
y la duración de la recolección. Gessner et al estudiaron la influencia sobre la
cantidad de condensado obtenida, de factores como la frecuencia respiratoria,
el volumen tidal, los parámetros de función pulmonar, el peso, la edad y la
altura del paciente. Tomaron muestras de 22 voluntarios sanos y 23 pacientes
EPOC. En ambos grupos observaron una fuerte correlación del volumen de
condensado obtenido con el volumen total respirado. No se encontró
correlación significativa con TLC, VR, VC, FEV1, Rtot, altura, peso o edad en
ninguno de los dos grupos. Sí encontraron un dato muy interesante: si la
ventilación se mantiene constante, el volumen de condensado obtenido se
incrementa linealmente a través del tiempo. Por tanto, concluyen que depende
más de ventilación que de datos de función pulmonar96. Otros trabajos han
demostrado que incrementando el volumen minuto y el volumen corriente se
puede obtener una mayor cantidad de condensado sin influir en la
concentración de determinadas sustancias no volátiles, como nitritos y
proteínas. McCafferty et al estudiaron el agua total exhalada y el volumen de
Condensado de aire exhalado
66
CAE obtenido en 3 grupos de 10 pacientes cada uno a los que ponían a respirar
a diferentes volumen minuto, volumen tidal (VT) y condiciones de aire
inspirado distintas. Observaron que los volúmenes obtenidos se incrementaban
significativamente con el volumen minuto, de tal forma que para 7,5, 15 y 22,5
l/min, el CAE obtenido era 627, 1019 y 1358 μl, respectivamente (p<0.001)97.
Menores VT proporcionaban menores cantidades de vapor de agua exhalado
(26,6 vs 30,7 μl/l, diferencia media 4,1 μl/l, p<0,001) y de CAE (4,3 vs 7,6 μl/l,
diferencia media 3,4 μl/l , p<0,001). En este mismo trabajo se observó que las
características del aire inspirado también influían en el volumen de condensado
obtenido, ya que respirando un aire más seco y frío, la cantidad de condensado
obtenida era menor que en condiciones estándar (p<0,05). Los cambios en
parámetros de respiración no tenían influencia sobre las concentraciones de
proteínas y nitritos en CAE, ni tampoco en pH. Por tanto, concluyen que el
volumen de condensado puede ser incrementado usando mayores volúmenes
tidal y mayores Vmin sin comprometer la dilución de la muestra. Un trabajo
más reciente de Liu et al analiza la influencia que determinados parámetros de
función pulmonar (VT, Vmin y TLC) puedan tener sobre el volumen de CAE
obtenido. Estudiaron 23 sujetos sanos, 25 pacientes EPOC y 17 pacientes
asmáticos, obteniendo cantidades de 5,55 μl/respiración, 3,56 μl/respiración y
5,77 μl/respiración respectivamente. El volumen de CAE obtenido se
relacionaba significativamente con VT (r Pearson = 0,075, p<0,0005) y Vmin
(r Pearson = 0,425, p< 0,0005), pero no se correlacionaba con TLC. Tampoco
se encontró correlación alguna con edad, sexo ni status de enfermedad98.
- Efecto del consumo agudo de tabaco: existen varios estudios con escaso
número de pacientes, que analizan este efecto. En general, los niveles de
Condensado de aire exhalado
67
compuestos derivados del NO, aldehídos y proteínas totales no cambian por el
consumo de tabaco; el 8-isoprostano y el TNF-α aumentan; y la IL-1B y el
glutation disminuyen a los pocos minutos de fumarse un cigarro.
- Variación diurna: Nowak et al demostraron que el ritmo circadiano afectaba a
los niveles de H2O2, que se exhala con un patrón de variación diurn99.
- Exposición a ozono: una exposición de 2 horas a 0,1 ppm de ozono es capaz de
producir cambios en marcadores de inflamación y estrés oxidativo.
- Ejercicio: un significativo incremento en H2O2 se puede ver inmediatamente
después de realizar un ejercicio máximo en sujetos sanos.
- Uso de medicación inhalada: una inhalación de salbutamol o ipratropio no tiene
efectos en niveles de H2O2 y TBARs en CAE de sujetos sanos99. La
administración de budesonida no afectaba a los niveles de nitritos, incluso
después de haber sido expuestos a ozono100. Szkudlarek et al demostraron que,
aunque la inhalación de agua desionizada o cloruro sódico estéril al 0,9% no
producía ningún cambio en los niveles de H2O2, la inhalación de N-
acetilcisteína producía una abolición casi completa de la producción de H2O2.
Tras 2,5 horas, los niveles de H2O2 en CAE aumentaban a 1,8 por encima del
nivel basal, observándose así un efecto bifásico de la N-acetilcisteína en las
vías aéreas101.
- Efecto del test de metacolina y AMP: no se han apreciado cambios
significativos en niveles de leucotrienos ni histamina antes y después de
realizar test de metacolina y AMP.
- Esputo inducido: en sujetos sanos, tras inducir el esputo, se han visto mayores
niveles de leucotrieno B4, IL-6 y TNF-α, mientras que el pH disminuye.
Condensado de aire exhalado
68
- Condiciones hiperbáricas y aire seco: un estudio analiza la influencia de
inmersiones profundas e inhalación de aire muy seco sobre los niveles de LTB4
en CAE, sin que ninguna de esas situaciones influyan en los mismos102, 103.
- Inhalación de sustancias neumotóxicas: existen estudios que han analizado la
exposición laboral (como la exposición a trabajadores de maquinaria de barco o
plateado de cromo), mientras que no existe ningún estudio que haya analizado
el efecto del tabaquismo pasivo en CAE de adultos.
Otro problema a tener en cuenta a la hora de interpretar los resultados de sustancias
obtenidas en CAE es la dilución de las sustancias no volátiles, como las proteínas, en el
vapor de agua. La formación de las gotas no se realiza a un ritmo constante y no tiene una
relación lineal con la producción de vapor de agua. Por tanto, las diferencias en dilución
de gotas exhaladas por el vapor de agua puede necesitar del uso de indicadores de dilución
para una más precisa interpretación. Así, Effros et al usaron la concentración de sal y urea
como factores de normalización, asumiendo que en sujetos sanos y en enfermos tienen la
misma concentración en plasma que en el fluido de las vías aéreas. Estos autores en su
trabajo afirman que las gotitas obtenidas en el CAE están muy diluidas por vapor de agua.
Ellos estimaron la dilución de las gotitas comparando concentraciones de indicadores de
referencia no volátiles (cationes no volátiles totales, urea o conductividad) en 18 sujetos
normales con concentraciones normales en plasma, asumiendo que las concentraciones en
plasma y tracto respiratorio son similares. Las concentraciones de NH4+ constituían el 93
+/- 3% del total de cationes en las muestras de CAE antes de liofilizarlo. Tras realizar èsta,
el 9% del NH4+ se eliminaba y así se podía usar la conductividad para estimar las
concentraciones totales iónicas no volátiles y facilitando el análisis de urea. Así obtienen
que las estimaciones de dilución basadas en cationes totales (20,472 +/- 2,516 meq/l),
conductividad (21,019 +/- 2,427 μmol/l) y urea (18,818 +/- 2,402 mmol/l) no fueron
Condensado de aire exhalado
69
significativamente diferentes. Por tanto, concluyen que la conductividad de muestras
liofilizadas se puede usar como método barato, simple y fiable para estimar la dilución de
mediadores no volátiles hidrofílicos104. Estos autores en un trabajo previo utilizan la
concentración de electrolitos para calcular la dilución de las gotas de fluido respiratorio en
20 pacientes sin antecedentes recientes de patología pulmonar ni consumo de tabaco. Estos
pacientes exhalaron durante una hora hasta obtener al menos 10 ml de CAE. La
concentración total de iones fue 498 +/- 68 μM, de los cuales 229 +/- 43 μM era NH4+.
Observaron que grandes variaciones en concentraciones de Na+ en CAE correlacionaban
bien con variaciones de K+ y de Cl-, lo que atribuían a dilución de las gotas del CAE. Al
dividir valores en CAE de Na+ y K+ entre los de plasma se obtenían unos valores de
fluidos respiratorios entre 0,01% y 2,00% del volumen del condensado. Se pudo
comprobar cómo existían variaciones importantes de concentración de solutos intra- e
intersujetos. Por tanto, concluyeron que es imposible determinar si el aumento de
concentración de mediadores descritos en varias enfermedades reflejan una mayor
formación de gotas o un aumento en las concentraciones de estos mediadores en la capa de
fluidos del tracto respiratorio. En este mismo artículo, minimizaron el efecto de dilución
de los solutos no volátiles por vapor de agua depositado en las paredes del condensador
mediante la división de la concentración de solutos entre la suma de las concentraciones
de los principales cationes no volátiles en el CAE (Na+ y K+)105.
La contaminación nasal, por saliva o por esputo, es un problema que se ha puesto
de manifiesto en distintos estudios. El grupo de trabajo conjunto ATS / ERS recomienda
usar una pinza nasal para evitar que se pierda muestra por la nariz, o que la inspiración se
realice a través de la misma. Sin embargo, en otras publicaciones anteriores se recomienda
la realización de inhalaciones y exhalaciones a través de la boca sin usar pinza nasal, ya
Condensado de aire exhalado
70
que se piensa que la pinza nasal favorecería la contaminación procedente de la nariz al
abrir el velo nasofaríngeo5, 92.
Las ventajas y limitaciones de la colección y análisis del CAE se resumen en la
siguiente tabla.
Ventajas
- fácil
- no invasiva
- posibilidad de uso domiciliario
- nos permite toma de muestras de
forma longitudinal
- los compuestos no volátiles
obtenidos están asociados con
fisiopatología pulmonar
- posibilidad de estudiar DNA y
RNA amplificados de células
eucarióticas y procarióticas
- posibilidad de estudiar la
farmacocinética y farmacodinamia
de fármacos
- permite el estudio de aclaración de
solutos
Limitaciones
- ausencia de estandarización del
método de recogida
- no es posible estudiar un sitio
anatómico específico
- ausencia de evidencia del origen
de las partículas de aerosol
(bronquios vs vías respiratorias
terminales)
- la concentración puede estar
artefactada debido a evaporación de
las muestras
-viabilidad y utilidad de
biomarcadores no relacionados con
stress oxidativo no demostrados
aún
-escasa información de
biomarcadores en enfermedades
intersticiales pulmonares
Condensado de aire exhalado
71
4.- Posibles utilidades del CAE
El estudio del CAE puede ser útil en la evaluación de la inflamación bronquial o
del daño epitelial, investigar la integridad del surfactante, crecimiento de tumores y
posibles mutaciones genéticas. La mayoría de ellos se centran en patologías como EPOC,
asma o discinesia ciliar primaria5, 106. También se han hecho trabajos con fumadores sin
patología conocida, que demuestran una mayor concentración de determinados
marcadores de inflamación en dicho grupo. Garey et al estudiaron a 9 no fumadores y 11
fumadores, a los cuales se les recogió CAE (en el grupo de fumadores también se recogió
una muestra 30 minutos tras fumar un cigarrillo). Su intención era conocer las
concentraciones de proteínas totales, nitritos, IL-1B, TNF-α y actividad quimiotáctica de
neutrófilos. Sus hallazgos fueron que los niveles de proteínas totales (28,8 vs 5,7 ug/ml),
nitritos (24,672 vs 16,156 nmol/l), TNF-α (7,4 vs 3,9 pg/ml) y actividad quimiotáctica de
neutrófilos eran significativamente mayores en fumadores. Los niveles de IL-1B (1,5 vs
1,6 pg/ml) eran similares para ambos grupos. Además, ninguno de los parámetros
cambiaban de forma significativa tras fumar un cigarrillo (salvo IL-1B que descendía
significativamente)22. Carpagnano et al estudiaron a 21 fumadores y 14 no fumadores para
determinar la influencia del consumo de tabaco (número de cigarrillos y niveles de CO) en
los niveles de IL-6 y LT B4. Estos autores encontraron que los niveles de IL-6 estaban
significativamente más elevados en fumadores (5,6 vs 2,6 pg/ml, p< 0,01), de la misma
manera que ocurría con los niveles de LT B4 (9,4 vs 6,1 pg/ml, p< 0,001). Además vieron
que los niveles de IL-6 se correlacionaban con el número de cigarrillos/día consumidos,
los niveles de CO espirado, y el porcentaje de FEV1 y FVC23.
El campo en el cual el análisis de CAE puede tener una pronta aplicación a la
práctica clínica es en el asesoramiento de la exposición a compuestos químicos dañinos
para el sistema respiratorio, como por ejemplo, en la exposición laboral a determinadas
Condensado de aire exhalado
72
sustancias. Goldoni et al estudiaron 33 trabajadores expuestos a cobalto y tungsteno
(trabajadores con diamantes o metales) y 16 controles sanos. Medían en todos ellos, tanto
en orina como en CAE, el cobalto, el wolframio y el malondialdehido (MDA) como
marcador pulmonar de estrés oxidativo. En los expuestos, medían los niveles antes de la
jornada laboral (15 horas tras la última exposición) y después de la misma. En el CAE de
los controles, el cobalto se detectó a niveles ultrasensibles, mientras que no se detectó
wolframio. En los trabajadores, los niveles de cobalto en CAE oscilaban entre 40,7 y 163
nmol/l; los de wolframio entre menos de 0,5 y 25,6 nmol/l; y los de malondialdehido entre
11,5 y 26,5 nmol/l (frente a los 7,6 nmol/l de los controles). Al comparar los datos antes y
tras la jornada laboral, observaron que los niveles de cobalto en CAE y en orina mostraban
incrementos significativos tras la exposición, mientras que los datos pre-exposición no
mostraban diferencias significativas con los controles. Los niveles de malondialdehido
postexposición mostraban diferencias significativas con controles, y en un grupo de
trabajadores sí se encontró incrementos significativos tras la exposición. En el caso del
wolframio, sólo en un grupo de trabajadores se observó mayores niveles pre-exposición
laboral tanto en CAE como en orina; en el resto, los niveles no eran detectables. Además
observaron una correlación positiva entre los niveles de MDA y las concentraciones de
cobalto, siendo mayor cuando la exposición era conjunta cobalto-wolframio. Esta
correlación no se observó con los niveles de MDA urinarios. Estos autores le dan un papel
prometedor al CAE para el estudio de sustancias neumotóxicas en ambientes laborales
contaminados y de marcadores de la exposición a las mismas107. Se han realizado también
trabajos de investigación en otras patologías como el síndrome de apneas obstructivas
durante el sueño (SAOS), observando que existen parámetros inflamatorios que pueden
predecir el SAOS. Li et al estudiaron a 22 pacientes con SAOS leve, 22 moderados, 24
graves , 22 controles y 10 fumadores, en los cuales midieron los niveles plasmáticos y en
Condensado de aire exhalado
73
CAE de IL-6, IL-10, TNF-α y 8-isoprostano. Los niveles de IL-6, TNF-α y 8-isoprostano
correlacionaban bien con el índice apneas-hipoapneas (IAH) tanto en CAE como en
plasma, mientras que este índice mostraba una correlación negativa con IL-10. Los niveles
de los marcadores en el grupo de fumadores estaban en la zona intermedia de todos los
grupos. Tras realizar análisis de regresión logística y análisis linear discriminante
encontraron que: IL-10 mostraba la mejor correlación con IAH (kappa = 0,88); usando IL-
6 con regresión linear distingue perfectamente a los SAOS moderados-graves de los leves-
no SAOS, y casi perfectamente usando IL-10. Por tanto, podría ser que IL-6 e IL-10 en
CAE pudieran predecir la severidad del SAOS108. Carpagnano et al estudiaron a 18
pacientes con SAOS, 10 obesos y 15 sanos y determinaron los niveles en CAE de IL-6 y
8-isoprostano para demostrar que estos marcadores de inflamación y estrés oxidativo
estaban elevados en pacientes SAOS y obesos. Para conocer el diagnóstico de SAOS
realizaron polisomnografía a todos los pacientes, diagnosticando de SAOS aquellos con un
IAH > 20 y síntomas de somnolencia diurna excesiva; mientras que los obesos y controles
tenían un IAH < 5. Encontraron que los SAOS tenían niveles de IL-6 significativamente
mayores que los sanos (8,7 vs 1,6 pg/ml, p < 0,0001) y más que los obesos (2,1 pg/ml, p <
0,0001), aunque estos sí tenían valores significativamente mayores que los controles
(p<0,05). El 8-isoprostano era igualmente mayor en SAOS (7,4 pg/ml) que en obesos (5
pg/ml, p = 0,4) y sanos (4,5 pg/ml, p< 0,005). Existía una correlación positiva entre los
dos marcadores estudiados y la circunferencia del cuello y el índice de apneas-hipoapneas,
así como entre ambos marcadores entre sí. Concluyen que en el SAOS existe un estado de
inflamación y estrés oxidativo (no así en obesos), cuyos niveles se relacionan con el
IAH109.
Los pacientes con cáncer de pulmón también han sido objeto de estudio con CAE,
tanto para medir parámetros inflamatorios110, como para detectar mutaciones genéticas,
Condensado de aire exhalado
74
abriendo una interesante posibilidad para el diagnóstico oncológico en el futuro. Gessner
et al estudiaron DNA en CAE de pacientes con carcinoma pulmonar no microcítico y en
controles sanos. El DNA humano fue amplificado mediante PCR para detectar mutaciones
en el gen p53. Un PCR del fragmento b-actina se usó para detectar DNA humano en las
muestras de CAE, hallándose el mismo en el 65,7% de las muestras. Los exones 5-8 del
p53 fueron amplificados y secuenciados en las muestras de pacientes con cáncer de
pulmón, encontrándose mutaciones en 4 de los 11 pacientes (36,4%), mientras que en los
10 voluntarios no se encontró ninguna mutación. Las mutaciones encontradas en el CAE
se compararon con las del tejido tumoral, viéndose que existían diferentes mutaciones
puntuales. Por tanto, el CAE podría ser una herramienta útil para el análisis de mutaciones
genéticas en un área de daño directo de DNA en relación con el consumo de tabaco111.
5.- Conclusiones
El condensado de aire exhalado (CAE) es una técnica a la que le queda aún camino
por recorrer para ser considerada como una herramienta diagnóstica más en el campo de la
neumología. No obstante, su uso dentro de la investigación queda demostrado por la
cantidad de artículos publicados al respecto en los últimos años. Hemos de esforzarnos
por utilizar las mismas condiciones en la técnica para hacer más homogéneos los trabajos
y poder así compararlos. Debemos seguir esperando conclusiones de mayor peso para
poder difundir esta técnica dentro del arsenal diagnóstico neumológico habitual.
75
V. MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos
76
Para tratar de demostrar que los fumadores sin patología presentan un status
inflamatorio a nivel local y sistémico, a pesar de mantener niveles de función pulmonar
en rangos dentro de la normalidad, se ha realizado un estudio analítico observacional
prospectivo de cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de sanos no fumadores.
1.- Sujetos estudiados.
Se estudiaron dos grupos de sujetos: el grupo estudio, compuesto por
fumadores, y un grupo control de no fumadores, en ambos casos sanos. El grupo de
fumadores se seleccionó de la consulta de deshabituación tabáquica del Hospital
Universitario de Móstoles, y el grupo control de no fumadores lo componían
trabajadores del mismo centro que colaboraron de forma voluntaria. A todos ellos se
les informaba del estudio y se obtenía el consentimiento informado, si cumplían todos
los criterios de inclusión y ninguno de los de exclusión.
1.a.- Criterios de inclusión
Pacientes mayores de edad
Firma del consentimiento informado
Ausencia de síntomas clínicos de bronquitis crónica
Ausencia de episodios previos de hiperreactividad bronquial
Ausencia de diagnóstico de enfermedad crónica
Ausencia de enfermedad aguda las ocho semanas previas a la
toma de muestras
No toma de fármacos de forma continuada en las ocho semanas
previas a la toma de muestras
Hemograma y bioquímica básicas en rango de normalidad
Material y métodos
77
Pruebas de función pulmonar en rango de normalidad
Test broncodilatador negativo
1.b.- Criterios de exclusión
• No firmar el consentimiento informado
• Presencia de criterios clínicos de bronquitis crónica
• Episodio previo de hiperreactividad bronquial
• Diagnóstico de enfermedad crónica
• Haber padecido alguna enfermedad aguda en las ocho semanas
previas a la toma de muestras
• Haber realizado algún tratamiento de forma continuada en las
ocho semanas previas a la toma de muestras
• Alteración en alguno de los parámetros de las pruebas de función
pulmonar
• Hemograma y bioquímica básicas con algún parámetro fuera de
los rangos de normalidad
• Test broncodilatador positivo
2.- Protocolo del estudio
2.a.- Diseño
Se trata de un estudio analítico observacional prospectivo de dos
cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de no fumadores sanos.
Material y métodos
78
2.b.- Procedimientos
Tanto al grupo estudio como al grupo control se le explicó el objetivo y el
protocolo del estudio. Una vez obtenido el consentimiento verbal de ser incluidos en el
estudio se comprobaba que cumplieran con todos los criterios de inclusión, para lo cual
se les realizaba una historia clínica en la que se reflejase: los antecedentes personales
médicos y quirúrgicos, los antecedentes familiares, la medicación habitual y una
exploración física completa. Se hacía especial hincapié en los antecedentes de
enfermedades agudas o toma continuada de medicación en las ocho semanas previas a
la toma de muestras para el estudio. En el grupo de fumadores interrogábamos de
forma especial por los criterios de bronquitis crónica y / o clínica previa de
hiperreactividad bronquial. Además, a este último grupo se le realizaba una historia
específica de tabaquismo en la que se recogían los siguientes datos:
- número de cigarrillos / día fumados
- edad de inicio del consumo
- índice paquetes-año: calculado multiplicando el número de cigarrillos
fumados al día por el número de años de fumador, y dividido entre 20
- intentos previos de abandono y duración de los mismos
A ambos grupos se les realizaba igualmente una exploración física que incluía
auscultación cardíaca y auscultación respiratoria, con toma de constantes que incluían
peso, talla, tensión arterial, saturación arterial de oxígeno y medición de monóxido de
carbono, en el caso de los fumadores.
Una vez firmado el consentimiento informado del estudio, que había sido
previamente aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica del Hospital
Universitario de Móstoles, los sujetos eran incluidos en el estudio y eran citados para la
Material y métodos
79
toma de muestras y realización de pruebas funcionales respiratorias. Al grupo de
fumadores se les realizaba la toma de muestras antes del intento del abandono del
consumo de tabaco. Los sujetos eran citados a primera hora de la mañana, debían estar
en ayunas, y en el caso del grupo de fumadores, sin fumar desde la noche anterior (al
menos ocho horas de abstinencia). Primero se procedía a la extracción sanguínea,
posteriormente la toma del condensado de aire exhalado, y por último la espirometría
con test broncodilatador. La realización de estas pruebas se llevó a cabo en la sala de
espirometrías, siempre bajo las mismas condiciones ambientales de humedad y
temperatura.
2.b.1.- Análisis de sangre
. La extracción de sangre se realizó mediante venopunción
obteniéndose 3 mililitros (ml) diluido en EDTA para el estudio hematológico y 10 ml
en un tubo con gel separador para la bioquímica básica. Una muestra (2 ml) de suero se
congelaba a – 70º C hasta su análisis.
2.b.2.- Condensado de aire exhalado (CAE)
Para la toma de muestras de CAE se utilizó un
condensador distribuido comercialmente (Ecoscreen; Jaeger, Hoechberg, Alemania)89
(Fig. 13). Este es un sistema eléctrico refrigerado modificado de dispositivo de aire
frío.
Material y métodos
80
Figura 13: Fotografía del modelo comercial de condensador de aire exhalado
utilizado en el estudio.
Este dispositivo dispone de un brazo extensible y móvil que permite al paciente
sentarse cómodamente en una silla y exhalar en el interior de una cámara congelada
(Fig. 14). Esta cámara es eficiente en condensar fluidos ya que el condensador
mantiene una temperatura de unos – 10º C en el período de recolección de la muestra
(Fig. 15).
Material y métodos
81
Figura 14: Fotografía de un sujeto durante la toma de muestras del condensado de aire
exhalado.
Figura 15: Representación esquemática del modelo de condensador de aire exhalado
utilizado para la toma de muestra en el estudio.
Respiración tidal
Cámara de recogida de muestra
Aire ambiental
2-4 ml condensado/5-10 minutos
Material y métodos
82
Previo al inicio de la prueba, se le indicaba al sujeto que se enjuagara la boca,
para posteriormente realizar respiraciones a volumen corriente, sin usar pinza nasal,
inspirando y exhalando por la boca, durante 15-20 minutos o hasta obtener un volumen
total de 200 ml. El sujeto se debía separar de la boquilla periódicamente para tragar la
saliva acumulada en la cavidad bucal. La muestra obtenida se congelaba
inmediatamente a – 70º C hasta su análisis.
2.b.3.- Pruebas funcionales respiratorias
Se realizaba a todos los sujetos incluidos en el estudio
una espirometría forzada (Jaeger MS Body/diff Master Screen) según las normativas
publicadas por distintos autores para espirometrías forzadas, con el fin de comprobar la
existencia de una función pulmonar normal. También realizamos un test de
broncodilatación con salbutamol para descartar reversibilidad basándonos en los
valores recogidos en las normativas publicadas por las asociaciones de neumología
americanas y europeas (ATS/ERS)112.
Figura 16: Fotografía del modelo de espirómetro utilizado para la realización de las
pruebas funcionales respiratorias.
Material y métodos
83
2.b.4.- Determinaciones analíticas
Todas las determinaciones analíticas se llevaron a cabo
en los servicios de hematología y en el de bioquímica del Hospital Universitario de
Móstoles.
La determinación de la hematología se realizó mediante técnica láser
(Advia 120, Bayer). Las determinaciones analíticas de bioquímica básica se realizaron
en un HITACHI modular (Roche Diagnostics) en el suero obtenido tras centrifugado
de la muestra. La valoración de TNF-α en suero y condensado de aire exhalado se
realizó mediante un inmunoensayo ELISA (DRG Diagnostics GMBH, Alemania)
(Fig. 17).
Figura 17. Fotografía del autoanalizador para placas ELISA utlizado para el análisis
de las muestras (DRG Diagnostics GMBH, Alemania) en el estudio.
Material y métodos
84
Se utilizaron anticuerpos monoclonales dirigidos frente a distintos epitopos de TNF-α.
El conjugado anti-TNF-α estaba marcado con peroxidasa (HRP) en buffer TRIS
maleato con albúmina bovina, EDTA y timol. Se utilizó tetrametilbencidina en
dimetilformamida (TMB) como cromógeno. La concentración de TNF-α es
proporcional a la intensidad de color desarrollada y se determina por interpolación en
la curva de calibración a cinco puntos (fig. 18).
Figura 18. Curva de determinación del valor de TNF-α. En el eje de abscisas se
expresa la densidad óptica en relación al color, y en el de ordenadas el valor de TNF-α
expresado en pg/ml.
Material y métodos
85
Se hizo una lectura bicromática de la placa microtiter a 450 nm frente a filtro de
referencia de 620 nm (Fig. 19). El ensayo se realizó de forma automatizada en DSX
(Dynex Tecnology).
Figura 19. Fotografía de placa ELISA utilizada para las determinaciones de TNF-α,
donde se pueden apreciar distintas intensidades de color. La primera columna
corresponde a la curva automática de concentraciones según densidad de color
realizada por el dispositivo. La mayor intensidad del color indica una mayor
concentración de TNF-α.
3.- Aspectos éticos.
El estudio obtuvo la aprobación por parte del Comité de Ética y de
Investigación Clínica del Hospital Universitario de Móstoles (anexo I), el cual aprobó
Material y métodos
86
también el consentimiento informado que debía firmar el sujeto previo a su inclusión
en el estudio (anexo II).
4.- Variables a estudiar
4.a.- Datos antropométricos
- Sexo
- Edad (años)
- Talla (cm)
- Peso (kg)
- IMC (kg/m2)
4.b.- Datos de consumo de tabaco (grupo de fumadores)
- Edad de inicio (años)
- Número de cigarrillos / día
- Número de paquetes-año
4.c.- Espirometría
- FVC (ml)
- FVC (%)
- FEV1 (ml)
- FEV1 (%)
- FEV1/FVC (%)
- MMEF 75-25 (ml)
- MMEF 75-25 (%)
- Test broncodilatador
Material y métodos
87
o Positivo
o Negativo
4.d.- Condensado de aire exhalado
- Volumen total (l)
- Tiempo (minutos)
- PEF ( l / s)
- VT (l)
- Volumen minuto ( l / m)
- Frecuencia respiratoria ( l / m)
- Volumen de muestra obtenida (ml)
4.e.- TNF-α
- niveles en suero (pg/ml)
- niveles en condensado de aire exhalado (pg/ml)
5.- Análisis estadístico de datos
Los resultados fueron analizados con el paquete estadístico SPSS 11.0 (SPSS®
Inc., 1989-2001). La analítica descriptiva de las variables cuantitativas se realizó con la
media (desviación estándar) tras confirmar normalidad de la distribución con la prueba
de Kolmogorov-Smirnov y con mediana (rango) en variables de distribución normal.
Las variables cualitativas se describieron con porcentajes. El análisis bivariable se
realizó con la prueba de t de Student para comparación de las medias de las variables
cuantitativas entre los grupos de variables cualitativas dicotómicas o con ANOVA para
las variables con más de dos categorías. Para las variables de distribución no normal se
eligieron las correspondientes pruebas no paramétricas: U de Mann-Whitney o prueba
Material y métodos
88
de Kruskal-Wallis. La asociación entre las variables cualitativas se analizó con la
prueba de xi cuadrado y las correspondientes tablas de contingencia. La correlación
entre variables cuantitativas se realizó con r de Pearson para las variables de
distribución normal y con rho de Spearman para las no normales. El valor de
significación se fijó en todos los casos para un valor de p < 0,05.
89
I.-RESULTADOS
Resultados
90
Una vez descrita la metodología del estudio, en el capítulo actual se realiza una
minuciosa redacción del análisis descriptivo tanto de la serie global como de cada uno
de los grupos por separado (control y estudio), así como un análisis de comparación
entre las variables a estudio (TNF-α en suero y en CAE) de ambos grupos; y un análisis
de correlación entre los valores de TNF-α en suero y en CAE con el resto de parámetros
incluidos en el estudio (valores antropométricos, valores de función pulmonar, consumo
de tabaco y valores de recogida de CAE); y un análisis de correlación entre el volumen
de muestra de condensado de aire exhalado recogido y los parámetros de recogida de
CAE, y entre el citado volumen y el consumo de tabaco.
Resultados
91
1.- Análisis descriptivos
1. a. Serie global
Se han incluido en este estudio 51 pacientes, cuyas características
generales se pueden ver en la tabla 1. La distribución según sexo y hábito tabáquico
están representados en las figuras 20 y 21.
Edad (años) 39,88 (7,61)
Sexo (% mujeres) 56,9%
Hábito tabáquico (% fumadores) 60,8%
Peso (kg) 73,64 (19,98)
IMC (kg/m2) 25,33 (5,74)
Tabla 1. Características generales de los sujetos estudiados. Las cifras están expresadas
en medias con desviación estándar (entre paréntesis) para variables cuantitativas, y en
porcentajes para variables cualitativas.
Resultados
92
Figura 20. Distribución según hábito tabáquico de la serie global.
Figura 21. Distribución por sexos de la serie global.
43,1%
56,9%
VARONESMUJERES
60,8%
39,2%FUMADORESNO FUMADORES
Resultados
93
Los datos de función pulmonar se pueden ver en la tabla 2 y los obtenidos del
condensador de aire exhalado en la tabla 3.
FVC (ml)
4359,61 (1059,55)
FVC (%)
97,12 (11,80)
FEV1 (ml)
3579,22 (853,87)
FEV1 (%)
102,16 (12,78)
MMEF (ml) 3545,68 (981,59)
MMEF (%)
88,90 (19,70)
FEV1/FVC 82,30 (4,70)
Tabla 2. Datos de función pulmonar de la serie global. Datos expresados en medias con
desviación estándar entre paréntesis.
Resultados
94
Volumen de muestra (ml)
3,44 (1,03)
Volumen total aire (l)
249,27 (102,58)
Tiempo (min)
15,44 (3,63)
Pico flujo (l/s)
0,45 (0,26)
Volumen tidal (l) 0,63 (0,33)
Volumen minuto (l/min)
15,07 (14,38)
Frecuencia respiratoria
19,48 (4,54)
Tabla 3. Valores de los parámetros recogidos en el condensador. Datos expresados en
medias con desviación estándar entre paréntesis.
Resultados
95
El valor medio de TNF-α en suero y en el CAE se puede ver en la tabla 4.
En las figuras 22 y 23 se puede ver la distribución de los niveles de TNF-α en
suero y en CAE.
TNF-α suero
(pg/ml)
6,29 (1,16)
TNF-α CAE
(pg/ml)
4,04 (0,58)
Tabla 4. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Datos expresados en
medias con desviación estándar entre paréntesis.
Resultados
96
0,00 2,50 5,00 7,50 10,00 12,50
TNF suero (pg/ml)
0
5
10
15
Núm
ero
de p
acie
ntes
Figura 22. Distribución del número de pacientes según los niveles de TNF-α en suero
de los sujetos estudiados. Se puede apreciar que la mayoría de pacientes se encuentran
en valores comprendidos entre 4 y 8 pg/ml.
4,00 5,00 6,00 7,00
TNF condensado (pg/ml)
0
5
10
15
20
Núm
ero
de p
acie
ntes
Figura 23. Distribución del número de pacientes según los niveles de TNF-α en
condensado de aire exhalado. La mayoría de los pacientes se concentran en valores
menores de 5 pg/ml.
Resultados
97
1. b. Grupo control
Se incluyeron 20 pacientes, cuyas características generales se pueden ver
en la tabla 5.
Edad (años)
38,10 (7,65)
Peso (kg)
67,7 (16,04)
IMC (kg/m2) 23,53 (3,66)
Tabla 5. Características generales de los sujetos del grupo control. Las cifras están
expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis).
La distribución por sexos de este grupo está representada en la figura 25.
Figura 25. Distribución por sexos del grupo control.
45,0%
55,0%
VARONESMUJERES
Resultados
98
Los valores de función pulmonar de este grupo y los obtenidos
del condensador se pueden ver en las tablas 6 y 7.
FVC (ml)
4432,50 (1072,81)
FVC (%)
98,56 (10,77)
FEV1 (ml)
3701,00 (872,45)
FEV1 (%)
104,79 (10,51)
MMEF (ml)
3756,50 (990,21)
MMEF (%)
91,35 (18,13)
Tabla 6. Datos de función pulmonar del grupo control. Datos expresados en medias con
desviación estándar entre paréntesis.
Resultados
99
Volumen de muestra (ml)
3,42 (1,03)
Volumen total aire (l)
245,10 (83,07)
Tiempo (min)
14,99 (2,64)
Pico flujo (l/s)
0,48 (0,29)
Volumen tidal (l)
0,62 (0,29)
Volumen minuto (l/min)
19,03 (21,49)
Frecuencia respiratoria 19,72 (5,86)
Tabla 7. Datos de condensado en el grupo control. Datos expresados en medias con
desviación estándar entre paréntesis.
Resultados
100
El valor de TNF-α en suero y en CAE se puede ver en la tabla 8.
Tabla 8. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Datos expresados en
medias con desviación estándar entre paréntesis.
1. c. Grupo estudio
Se incluyeron 31 sujetos cuyas características generales se puede ver en
la tabla 9, y la distribución por sexos en la figura 26.
Figura 26. Distribución por sexos del grupo estudio.
TNF-α suero (pg/ml)
5,88 (0,94)
TNF-α CAE (pg/ml)
4,05 (0,51)
41,9%
58,1%
VARONESMUJERES
Resultados
101
Edad (años)
38,10 (7,65)
Sexo (% mujeres)
55%
Peso (kg)
67,7 (16,04)
IMC (kg/m2)
23,53 (3,66)
Nº cigarrillos/día (n)
21,68 (9,18)
Edad inicio consumo (años)
15,77 (2,56)
Paquetes-año
28,47 (14,97)
Tabla 9. Características generales del grupo estudio. Las cifras están expresadas en
medias con desviación estándar (entre paréntesis).
Resultados
102
Los valores de función pulmonar y los obtenidos en el condensador se pueden
ver en las tablas 10 y 11. El valor medio de TNF-α en suero fue de 6,55 +/- 1,23 pg/ml
y en el CAE de 4,03 +/- 0,62 pg/ml (Tabla 12).
FVC (ml)
4312,58 (1065,99)
FVC (%)
96,18 (12,49)
FEV1 (ml)
3500,64 (846,64)
FEV1 (%)
100,47 (13,95)
MMEF (ml)
3409,67 (967,54
MMEF (%)
87,31 (20,78)
FEV1/FVC 81,39 (4,45)
Tabla 10. Datos de función pulmonar del grupo estudio. Las cifras están expresadas en
medias con desviación estándar (entre paréntesis)
Resultados
103
Volumen de muestra (ml) 3,45 (1,04)
Volumen total aire (l)
251,97 (114,67)
Tiempo (min)
15,74 (4,16)
Pico flujo (l/s)
0,43 (0,25)
Volumen tidal (l)
0,64 (0,35)
Volumen minuto (l/min)
12,51 (5,91)
Frecuencia respiratoria
19,33 (3,53)
3
,
5
3
Tabla 11. Valores del condensado en el grupo de fumadores. Las cifras están
expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis)
Resultados
104
TNF-α suero (pg/ml)
6,55 (1,23)
TNF-α CAE (pg/ml)
4,03 (0,62)
Tabla 12. Valores de TNF-α (pg/ml) en los medios estudiados. Las cifras están
expresadas en medias con desviación estándar (entre paréntesis)
2. Análisis estadístico.
2. a. Comparación entre grupos estudio/control
No existían diferencias significativas entre grupos en los parámetros
antropométricos estudiados, salvo por el IMC, que era mayor en el grupo de fumadores
(26,50 vs 23,53 kg/m2, p = 0,044). Los valores de función pulmonar tampoco mostraron
diferencias entre grupos. Los valores recogidos en el condensador y el volumen de la
muestra recogida no demostraron diferencias entre grupos.
Todos estos valores comparativos se pueden ver en las tablas 13, 14 y 15.
Resultados
105
No Fumador Fumador Valor p
Edad (años)
38,10
41,03
0,18
TNF-α suero (pg/ml)
5,88
6,54
0,043
TNF-α CAE (pg/ml)
4,05
4,03
0,89
Peso (kg)
67,70
77,48
0,09
IMC (kg/m2)
23,53
26,50
0,044
Tabla 13. Diferencias en los parámetros cuantitativos estudiados entre el grupo control
y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias. Valor significativo de p
si es menor de 0,05.
Resultados
106
No fumador Fumador Valor p
FVC (ml)
4432,50
4312,58
0,70
FVC (%)
98,56
96,18
0,48
FEV1 (ml)
3701,00 3500,64 0,42
FEV1 (%)
104,79
100,47
0,24
MMEF (ml)
3756,50
3409,68
0,22
MMEF (%)
91,35
87,32
0,48
FEV1/FVC
83,71
81,39
0,09
Tabla 14. Diferencias en los parámetros funcionales respiratorios estudiados entre el
grupo control y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias. Valor
significativo de p si es menor de 0,05.
Resultados
107
No Fumador Fumador Valor p
Volumen de muestra (ml)
3,42
3,45
0,92
Volumen total aire (l)
245,10
251,97
0,81
Tiempo (min)
14,99
15,74
0,43
Volumen tidal (l)
0,62
0,64
0,84
Volumen Minuto (l/min)
19,03
12,51
0,12
Frecuencia respiratoria
19,72
19,33
0,77
Tabla 15. Diferencias en los parámetros de condensado de aire exhalado estudiados
entre el grupo control y el grupo estudio. Los valores están expresados como medias.
Valor significativo de p si es menor de 0,05.
Resultados
108
Al comparar los valores de TNF-α en suero y CAE del grupo control y grupo estudio, se
observó una diferencia estadísticamente significativa en los valores de TNF-α en suero
de los fumadores (p= 0,043) (Fig. 27), diferencia que era independiente de edad, sexo y
valor de IMC. No encontramos diferencias para el TNF-α en CAE (Fig. 28).
3120 N = Fumadores No fumadores
TNF-α suero
11
10
9
8
7
6
5
4
Figura 27. Niveles de TNF-α en suero en los dos grupos. Diferencias estadísticamente
significativas entre ambos grupos. Los valores de TNF-α expuestos en la gráfica
corresponden a medianas.
5,64 pg/ml
6,41 pg/ml
Resultados
109
3120N =
MOTIVO PETICION
FumadoresNo fumadores
TNF
cond
ensa
do
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Figura 28. Niveles de TNF-α en el condensado de aire exhalado en los dos grupos.
Diferencias estadísticamente no significativas entre ambos grupos. Los valores de TNF-
α expuestos en la gráfica corresponden a las medianas.
2. b. Correlaciones
2. b. 1. TNF-α suero y condensado vs datos antropométricos.
No existía correlación entre los niveles en suero de TNF-α con el
sexo (Tabla 16; Fig. 29), aunque sí existía una correlación con la edad (p= 0,04; r =
0,29) y con el IMC (p=0,037; r = 0,29) (Fig. 30 y 31).
No se encontró correlación alguna entre el TNF-α en CAE con los datos
antropométricos. (Fig. 32, 33 y 34).
3,92 pg/ml
3,79 pg/ml
Resultados
110
Mujer
Varón
Valor p
TNF-α suero (pg/ml)
6,27 (1,30)
6,30 (0,97)
0,93
TNF-α condensado (pg/ml)
4,01 (0,49)
4,08 (0,68)
0,63
Tabla 16. Valores de TNF-α en suero y CAE según sexo. Las cifras están expresadas
en medias con desviación estándar (entre paréntesis). Valor significativo de p si es
menor de 0,05.
2229N = V arones M ujeres
T N F -α suero
11
10
9
8
7
6
5
4
Figura 29. Valores de TNF-α en suero según sexos. Diferencias no significativas (6,27
en mujeres y 6,30 los varones). Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.
6,27 pg/ml
6,30 pg/ml
Resultados
111
TNF-α suero (pg/ml)
1098765 4
Edad
60
50
40
30
20
Figura 30. Correlación entre la edad y los niveles de TNF-α en suero. Los
valores de TNF-α se expresan en pg/ml y la edad en años. Esta correlación
fue estadísticamente significativa (p=0,04; r = 0,29).
TNF-α suero
1098765 4
IMC
50
40
30
20
10
Figura 31. Correlación entre el IMC y los niveles de TNF-α en suero. Los
valores de TNF-α se expresan en pg/ml y el IMC en kg/m2. La correlación
resultó estadísticamente significativa (p=0,037; r = 0,29).
Resultados
112
2229N =
SEXO
VaronesMujeres
TNF
cond
ensa
do
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Figura 32. Valores de TNF-α en condensado según sexos. Diferencias no
significativas (4,01 para mujeres y 4,08 los varones). Los valores de TNF-α
se expresan en pg/ml.
Edad
6050403020
TNF
cond
ensa
do
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
Figura 33. Representación gráfica de la correlación entre la edad y los
niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se expresan en
pg/ml y la edad en años. Esta correlación no alcanzó valores
estadísticamente significativos (p = 0,56; r = 0,083).
Resultados
113
TNF condensado
6,56,05,55,04,54,03,53,0
IMC
50
40
30
20
10
Figura 34. Representación gráfica de la correlación entre el IMC y los
niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se expresan en
pg/ml y el IMC en kg/m2. No existe una correlación estadísticamente
significativa entre los valores estudiados ( p = 0,26; r = 0,16).
2. b. 2. TNF-α suero y condensado vs función pulmonar.
Se pudo apreciar una correlación entre los niveles de TNF-α
en suero con los valores porcentuales de FVC (p = 0,012; r = - 0,35), y
rozaba la significación con el valor porcentual de FEV1 (p = 0,054; r = -
0,27) (Fig. 35 y 36). No tenía valores de significación estadística la
correlación con FEV1/FVC (Fig. 37).
Los niveles de TNF-α en el condensado no guardaban correlación con los
valores espirométricos (Fig. 38, 39 y 40).
Resultados
114
TNF suero
10987654
FVC
(%)
130
120
110
100
90
80
70
Figura 35. Gráfico que expresa la correlación significativa (p = 0,012; r = -
0,35) entre el FVC expresado en valor porcentual y los niveles de TNF-α en
suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.
TNF suero
10987654
FEV
1 (%
)
140
130
120
110
100
90
80
70
Figura 36. Gráfico que expresa la correlación cercana a la significación ( p
= 0,054; r = - 0,27) entre el FEV1 expresado en valor porcentual y los
niveles de TNF-α en suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml.
Resultados
115
TNF suero (pg/ml)
10987654
FEV
1/FV
C
100
90
80
70
Figura 37. Gráfico que expresa la correlación entre el FEV1/FVC y los
niveles de TNF-α en suero. Los valores de TNF-α se expresan en pg/ml. La
correlación no alcanzó niveles de significación estadística ( p = 0,87; r =
0,023).
TNF-α condensado
6,56,05,55,04,54,0 3,5 3,0
FVC %
130
120
110
100
90
80
70
Figura 38. Gráfico que expresa la correlación entre el FVC expresado en
valor porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de
TNF-α se expresan en pg/ml. Esta correlación no alcanzó valores de
significación estadística ( p = 0,56; r = - 0,082).
Resultados
116
TNF condensado
6,56,05,55,04,54,03,53,0
FEV
1 (%
)
140
130
120
110
100
90
80
70
Figura 39. Gráfico de correlación entre el FEV1 expresado en valor
porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de TNF-α se
expresan en pg/ml. Esta correlación no fue estadísticamente significativa (p
= 0,29; r = - 0,15).
TNF condensado
6,56,05,55,04,54,03,53,0
FEV
1/FV
C
100
90
80
70
Figura 40. Gráfico que expresa la correlación entre el FEV1/FVC expresado
en valor porcentual y los niveles de TNF-α en condensado. Los valores de
TNF-α se expresan en pg/ml. No existía significación estadística para esta
correlación ( p = 0,16; r = - 0,20).
Resultados
117
2. b. 3. TNF-α suero y condensado vs consumo de tabaco.
En el grupo de fumadores se analizó la influencia del
consumo de tabaco (edad de inicio, número de cigarrillos / día consumidos e
índice paquetes-año) en los valores de TNF-α en suero y CAE, y sólo se
observó una relación estadísticamente significativa entre los valores de
TNF-α plasmáticos y la edad de inicio en el consumo de tabaco (p=0,006, r
= 0,48) (Fig. 41).
TNF-α suero
109876 5 4
Edad Inicio
26
24
22
20
18
16
14
12
10
Figura 41. Correlación significativa entre la edad de inicio en el consumo
de tabaco y los niveles de TNF-α en suero ( p = 0,006; r = 0,48). Los
valores de TNF-α se expresan en pg/ml.
2. b. 4. TNF-α suero y condensado vs parámetros del condensador
Para saber si existía correlación entre los valores de respiración del
condensado y los niveles de TNF-α en la muestra de condensado observamos que el
tiempo que se mantenían respirando y el volumen de muestra obtenido eran los únicos
parámetros que obtenían significación estadística ( p = 0,028 y 0,016 respectivamente).
Resultados
118
En el análisis por sexos se observó que el TNF-α en mujeres no guardaba correlación
con ningún volumen, mientras que en hombres sólo lo guardaba con el volumen total de
muestra. Al dividirlo entre grupos de estudio y control vemos que en el grupo control no
existe correlación con ninguno de los parámetros estudiados, mientras que en el grupo
de fumadores la correlación encontrada en la serie general entre TNF-α en CAE con el
tiempo de respiración y el volumen de muestra obtenida se hace más significativo aún
(p = 0,001 en ambos casos; r = 0,55 para el tiempo; r = 0,56 para el volumen de
muestra) (Fig. 42 y 43).
TNF-α condensado
6,56,05,55,04,54,0 3,5 3,0
Tiempo
30
20
10
0
Figura 42. Correlación significativa entre los valores de TNF-α en la muestra de
condensado y el tiempo que se mantiene el sujeto respirando (grupo estudio). Los
valores de TNF-α se expresan en pg/ml, y el tiempo en minutos.
Resultados
119
TNF-α condensado
6,56,05,55,04,54,03,5 3,0
Volumen de muestra
6
5
4
3
2
1
0
Figura 43. Correlación significativa entre los valores de TNF-α (pg/ml) en la muestra
de condensado y el volumen de muestra obtenido (ml) en el grupo de fumadores.
2. b. 5. Volumen de muestra vs consumo de tabaco
En el grupo de fumadores se estudió la posible correlación de los datos
de consumo de tabaco con los volúmenes de CAE y se observó una correlación entre el
número de cigarrillos / día (p = 0,001; r = 0,55) y número paquetes-año con el volumen
de muestra obtenido ( p = 0,003; r = 0,53) (Fig. 44) y el volumen tidal (p = 0,034; r =
0,38 para ambos).
Resultados
120
Volumen de muestra
654321 0
Número cigarros/día
60
50
40
30
20
10
0
Figura 44. Correlación significativa entre el volumen de muestra obtenido (ml) y el
número de cigarrillos consumidos cada día ( p = 0,001; r = 0,55).
2. b. 6. Volumen de muestra obtenido vs parámetros condensador
Al analizar el volumen de muestra obtenido con el resto parámetros del
condensador pudimos comprobar que sólo se relacionaba con el tiempo que se
mantenían respirando y no con el resto de parámetros.
121
VII.-DISCUSIÓN
Discusión
122
Una vez descrita la metodología del estudio y expuestos los resultados obtenidos
se procede a exponer la comparación con los estudios encontrados en la literatura de
similares características. Se analiza en un primer apartado la metodología seguida en
este estudio, posteriormente los resultados, y por último el papel del TNF-α como
marcador precoz de enfermedad.
1.- Metodología
1.a.- Diseño
Se trata de un estudio analítico observacional prospectivo de dos
cohortes: cohorte de fumadores sanos y cohorte de no fumadores sanos. La primera
intención era realizar un estudio longitudinal para comprobar el cambio en los niveles
de TNF-α en el grupo estudio tras el abandono del consumo de tabaco durante un año, y
compararlo con el grupo control. No obstante, y tras comprobar el bajo porcentaje de
éxito de abstinencia a lo largo del seguimiento, se decidió no realizar el análisis de los
resultados anuales. No se ha encontrado en la literatura ningún estudio que realice un
seguimiento longitudinal para comprobar si existe reducción de proteínas inflamatorias
tras el abandono del consumo de tabaco en fumadores sin patología conocida.
1.b.- Sujetos estudiados
Existen en la bibliografía múltiples trabajos que comparan los niveles de
TNF-α en distintos grupos de pacientes: EPOC estables, EPOC agudizados, pacientes
con distrés respiratorio, etc. El grupo control en los mencionados estudios suele estar
constituido por fumadores sanos. No hemos encontrado artículos que estudien los
niveles de TNF-α en fumadores en suero y en condensado, aunque sí existen series que
estudian el TNF-α sólo en el condensado de aire exhalado22, o en plasma 113, 114. En el
Discusión
123
trabajo que hemos realizado ampliamos el estudio a dos muestras biológicas para
conocer la inflamación a nivel local (condensado de aire exhalado) y a nivel sistémico
(plasma).
El número de fumadores sanos reclutados no es muy elevado, debido a la
dificultad de encontrar fumadores que no padezcan ningún tipo de patología, ya sea
derivada del consumo de tabaco, o bien sin relación con el mismo, pero de alta
prevalencia como hipertensión, dislipemia, etc. Igualmente, muchos de los inicialmente
reclutados tuvieron que ser excluidos ya que, bien en la espirometría, bien en la analítica
general, se detectaba algún parámetro fuera del rango de normalidad, desconocido hasta
ahora por ellos. No obstante, en los estudios similares al nuestro, el número de sujetos
no es muy elevado tampoco22, 113, 114. Existen otros estudios que comparan grupos de
fumadores sanos con no fumadores, y en ningún caso superan la muestra obtenida por
nosotros115.
1.c.- Criterios de inclusión/exclusión.
En los sujetos incluidos en ambos grupos se descartó enfermedad crónica
o aguda en las ocho semanas previas por la propia entrevista clínica con el paciente. En
la historia clínica se incidía de forma marcada en los síntomas de bronquitis crónica y
antecedentes de hiperreactividad bronquial. Se realizó una exploración física así como
una analítica general para descartar algún hallazgo patológico. Igualmente se descartó
mediante espirometría algún trastorno a nivel funcional respiratorio, o la existencia de
reversibilidad mediante el test broncodilatador. Esta selección de sujetos sanos es más
exhaustiva que la realizada en otros estudios, en los cuales sólo constatan mediante
historia clínica la ausencia de enfermedad respiratoria crónica o aguda, sin realizar
espirometría22. Otros estudios con grupos de fumadores sanos y no fumadores descartan
Discusión
124
patología respiratoria y confirman parámetros dentro del rango de la normalidad
simplemente mediante la realización de una espirometría91, 114, 115, 116.
El periodo de tiempo marcado en nuestro estudio para enfermedad aguda que
excluyera al paciente del estudio fue de 8 semanas. En la bibliografía consultada,
podemos coincidir con algunos autores113, 115, y en otros casos los límites de tiempo
oscilan entre 4 semanas22, 43, 6 semanas11 y 12 semanas114, 117.
1.d.- Recogida de muestra de condensado de aire exhalado.
La muestra recogida en el CAE reflejaría la capa de fluidos extracelular
broncoalveolar. En la capa de fluidos de las vías aéreas inferiores se han encontrado
múltiples sustancias volátiles y no volátiles. Entre las moléculas no volátiles que se
encuentran en el aire exhalado se han detectado citocinas que pueden representar
marcadores de algún proceso patológico pulmonar, entre ellas la molécula TNF-α, que
es la utilizada en nuestro estudio. Se ha postulado que la composición del CAE podría
reflejar la del BAL, y existen datos a favor y en contra de dicha afirmación. Jackson et
al comprobaron las correlaciones entre ambos fluidos de las concentraciones de óxido
nítrico, 8-isoprostano, peróxido de hidrógeno, pH y proteínas totales, sin encontrar
correlación alguna. Sin embargo, al estudiar las concentraciones de fosfolípidos y
queratina pudieron comprobar que eran similares los niveles de queratina en BAL y
CAE, mientras que los fosfolípidos estaban significativamente más elevados en CAE.
Estos últimos resultados no eran de esperar ya que la queratina tiene un origen epitelial,
y se presuponía mayores concentraciones en CAE al examinar éste toda la vía aérea; y
los fosfolípidos proceden del surfactante, por lo que era de presuponer una mayor
concentración en BAL85.
Discusión
125
Entre las principales ventajas de esta técnica están: la de ser no invasiva, puede
repetirse sin problemas, se puede usar en fase estable o en fase aguda de la enfermedad,
se puede usar en niños y en pacientes graves. Además se ha demostrado que la técnica
no tiene influencia posterior en la función pulmonar ni en la inflamación5. Sin embargo,
su principal limitación es la ausencia de métodos estándares de recolección. Están
descritos también otros problemas de la técnica como son la falta de reproducibilidad, la
variabilidad, la influencia de factores externos (alcohol, tabaco, fármacos) y la labilidad
de determinadas sustancias encontradas en el CAE para su medición tras la congelación.
Otro inconveniente con el que nos encontramos es la falta de guías clínicas que nos
informen sobre valores de referencia para personas sanas o con determinadas
enfermedades pulmonares, relación de dichos valores con síntomas o con función
pulmonar; o estudios clínicos que analicen la respuesta a fármacos5, 90, 93. También se
desconoce todavía la influencia de la edad, sexo, maniobras respiratorias
(espirometrías), calibre de la vía aérea, ritmo circadiano, infecciones y uso de
medicación sobre marcadores de CAE.
Debido al uso cada vez mayor del condensado de aire exhalado como una
novedosa herramienta de investigación en el campo de la neumología, la European
Respiratory Society publicó en 2005 unas normativas para tratar de unificar la
metodología de los trabajos que se estuvieran llevando a cabo con CAE90. Hemos
tratado de cumplir con la mayoría de las recomendaciones descritas en dicha
publicación. Así hemos utilizado el modelo comercializado Ecoscreen; Jaeger,
Hoechberg, Alemania; hemos registrado para cada paciente el tiempo de recolección, el
volumen minuto y el volumen de muestra recogido; y se han congelado las muestras a la
menor temperatura disponible en nuestro centro (-70º C). Por el contrario, no hemos
usado un atrapador de saliva para evitar la contaminación salival; no utilizamos una
Discusión
126
pinza nasal para evitar el paso de aire por el conducto nasal, tanto en la inspiración
como en la espiración; y no realizamos mediciones del pH. La contaminación salival sí
es un potencial problema que puede interferir con los resultados. En la realización de la
técnica a nuestros pacientes, al no disponer de atrapador, le pedíamos que se retirasen de
la pieza bucal y tragasen la saliva de forma periódica. Nuestro esfuerzo para evitar la
contaminación nasal consistió en pedir a los sujetos que trataran de respirar única y
exclusivamente por la boca. En el estudio más similar al nuestro encontrado en la
bibliografía (Garey et al) no usaron pinza nasal22, y existen otros estudios donde
también evitan el uso de esa pieza, ya que se piensa que la pinza nasal puede favorecer
la contaminación procedente de la nariz al abrir el velo nasofaríngeo5, 92. El pH de la
muestra no es una medida directa de que el líquido proceda de la vía aérea. En el estudio
de Garey et al tampoco realizan mediciones de pH. Estos motivos, y las limitaciones
económicas, nos inclinaron a tomar la decisión de no medir el pH de las muestras, a
pesar de que la recomendación está realizada por unanimidad de los expertos.
Como ya se señala en las normativas que estamos comentando, existe un posible
error de tipo II debido a la pérdida de sustancia durante el tiempo de congelación y hasta
su análisis. En lo que respecta al TNF-α, se conoce la vulnerabilidad de esta citocina,
con poca resistencia a la congelación-descongelación, con datos publicados de hasta un
15% de desviación estándar en los resultados91. Teniendo en cuenta este dato, hay que
asumir un posible sesgo en los resultados obtenidos en nuestra serie.
Discusión
127
2.- Resultados
2.a.- Valores de TNF-α plasmáticos
Existen dudas del efecto supresor o no del tabaco sobre TNF-α. Se
conoce que la producción de TNF-α por parte de las células mononucleares periféricas
de fumadores sanos frente a las de no fumadores es mayor en los fumadores118. Estudios
in vitro han demostrado el efecto supresor de extractos de humo del tabaco y de la
nicotina (ésta disminuía un 38% la producción de TNF-α en sangre periférica)67.
Estudios realizados en ratas han encontrado mínimas diferencias no significativas en
BAL de ratas “fumadoras pasivas”69, o ninguna diferencia68. En estudios con humanos,
se han visto cifras más elevadas de TNF-α en BAL de fumadores sanos frente a un
grupo control de no fumadores43. Sin embargo, existen trabajos que hablan del poder
supresor del tabaco sobre la producción del TNF-α11. También Dandrea et al describen
el efecto supresor del tabaco sobre la producción de TNF-α en las células del BAL de
un grupo de fumadores y otro de no fumadores tras ser incubadas con NO272
.
El valor medio de TNF-α plasmático en fumadores incluidos en nuestro estudio
fue de 6,55 pg/ml en plasma, frente a los 5,88 del grupo control, diferencias que fueron
significativas. Estas diferencias significativas las podemos encontrar en varios artículos
113, 114, aunque discrepan con lo publicado por otros autores, que no hallaron diferencias
en plasma según el estatus de fumador del sujeto, aunque en este última cita se trata de
un estudio poblacional80.
De Maat et al, en un estudio de TNF-α en plasma de pacientes con enfermedad
coronaria y 30 controles sanos (15 de ellos fumadores y 15 no fumadores), encontraron
que no existían diferencias significativas entre fumadores y no fumadores aunque estaba
ligeramente más elevado en el grupo de fumadores (2,21 vs 2,12 pg/ml)117. Gander et al
Discusión
128
no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en fumadores tras estudiar a 198 no
fumadores (entre los que se incluían exfumadores de al menos 6 meses), 24 fumadores
irregulares y 78 fumadores activos (de al menos 3 cigarros/día). Los niveles de TNF-α
estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml) frente a no fumadores y fumadores
irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg / ml), pero sin alcanzar
significación estadística18. Tampoco Shaker et al encuentran diferencias en los niveles
de TNF-α en suero de fumadores y no fumadores sanos, aunque sí con un grupo de
pacientes con EPOC diagnosticado115.
Los niveles de TNF-α en plasma han sido estudiados en la población general y
se ha visto que dichos niveles están significativamente asociados al sexo (ligeramente
inferiores en mujeres) y a la edad (niveles más elevados en grupos de mayor edad)80. En
nuestro estudio, al igual que en el mencionado estudio poblacional, los niveles en
plasma también son ligeramente inferiores en mujeres (6,27 vs 6,30 pg/ml) sin alcanzar
la significación estadística. En nuestro estudio también encontramos diferencias
asociadas a la edad, de modo que a mayor edad, mayor niveles de TNF-α en plasma. En
este estudio, al igual que alguna otra publicación no encuentran relación entre TNF-α en
suero y el IMC115; sin embargo, nosotros sí encontramos que existe correlación entre
ambos valores, al igual que otros autores han encontrado relación entre TNF-α y
obesidad81.
2.b.- Valores de TNF-α en condensado de aire exhalado
El valor medio de TNF-α en CAE de nuestros fumadores fue de 4,03
pg/ml, siendo de 4,05 en el grupo control. Garey et al obtienen unos resultados muy
diferentes a los nuestros, ya que encuentran valores significativamente más elevados en
el grupo de fumadores que en el de controles sanos (7,4 vs 3,9 pg/ml)22. Sack et al
Discusión
129
encontraron diferencias en niveles de TNF-α en CAE entre fumadores y no fumadores,
aunque no queda especificado en su artículo las cifras de TNF-α en cada grupo. No
obstante, la figura incluida en el artículo referido demuestra que los valores en ambos
grupos eran muy bajos (menores a 0,5 pg/ml según dicha figura)91.
Estos resultados en CAE hay que asumirlos con el posible sesgo descrito en la
bibliografía, que es el debido a la labilidad del TNF-α al proceso congelación-
descongelación. El hecho de que no exista uniformidad en la recogida del CAE en los
trabajos existentes en la bibliografía, también puede influir en la discrepancia entre
nuestros resultados y lo publicado hasta ahora. Además el efecto supresor del tabaco en
la producción de TNF-α descrito en la literatura se aprecie más a nivel local (CAE) que
a nivel sistémico, de ahí que no encontremos diferencias en dicho medio y sí en plasma.
Para obtener una mayor cantidad de condensado se puede incrementar el
volumen minuto y el volumen corriente, sin que ello influya en la concentración de
determinadas sustancias no volátiles, como nitritos y proteínas97. Con la finalidad de
conocer la posible influencia de los parámetros de recogida de condensado, realizamos
un análisis de correlación entre los niveles de TNF-α y los parámetros recogidos en el
estudio (volumen de muestra, tiempo, volumen total de aire, pico flujo, volumen tidal,
volumen minuto y frecuencia respiratoria), y pudimos comprobar que los niveles de
TNF-α en CAE de fumadores se correlacionaban con el tiempo que estaban respirando
y con el volumen obtenido, sin que dichos niveles guarden relación con el resto de
parámetros analizados.
2.c.- Influencia de la cuantía de consumo de tabaco
La inflamación producida por el consumo de tabaco depende de la cuantía del citado
consumo. Así se ha comprobado que la cantidad de tabaco puede tener un valor
predictivo para los valores de determinados parámetros inflamatorios.
Discusión
130
Kuschner et al estudiaron en el BAL de catorce fumadores sanos y dieciséis no
fumadores el porcentaje celular, algunos mediadores proinflamatorios (TNF-α, IL-6,
IL-1β) y quimioatrayentes (la proteína quimiotáctica de monocitos y la IL-8 como
quimiotáctica de neutrófilos)43. Observaron que en fumadores, existían valores
significativamente más altos de neutrófilos, macrófagos, IL-1β, IL-6, IL-8 y MCP-1. En
este grupo de fumadores, comprobaron que aquellos que fumaban más de un paquete al
día tenían un valor predictivo para cifras de neutrófilos, macrófagos, IL-1β y IL-8.
También Lind et al han demostrado el efecto que tiene un mayor consumo diario de
tabaco sobre las proteínas inflamatorias44. Estos autores estudiaron un grupo de
proteínas inflamatorias (α1-glicoproteína ácida, α1-antitripsina, haptoglobina,
fibrinógeno y ceruloplasmina), encontrando mayores niveles en fumadores activos que
en no fumadores y exfumadores. Además, los niveles más altos estaban en el grupo de
fumadores de más de un paquete al día. La proporción de niveles elevados de al menos
dos de los marcadores estudiados en el cuartil superior se incrementaba con la cuantía
de tabaco consumido (19,5% en no fumadores y 56% en fumadores activos) y con los
niveles de carboxihemoglobina. Estas diferencias se mantenían incluso después de
ajustarlas a otros factores de riesgo cardiovascular (edad, diabetes, colesterol, IMC,
hipertensión sistólica arterial, etc). Carpagnano et al también han demostrado
diferencias significativas según el nivel de consumo diario de tabaco10. Estos autores
han estudiado los niveles de IL-6 y LTB4 (como marcador de inflamación neutrofílica)
en CAE de fumadores de al menos 10 cigarros / día. Existían diferencias entre aquellos
que fumaban menos de un paquete al día, los que fumaban un paquete al día y los que
fumaban más de un paquete, siendo todas las diferencias estadísticamente significativas.
También encontraron correlación entre los niveles de IL-6 y el número de
cigarrillos/día, así como con el CO espirado; y correlación negativa con FEV1 y FVC.
Discusión
131
Los niveles de LTB4 estaban también más elevados en fumadores (9,4 vs 6,1 pg/ml), y
se correlacionaban con los de IL-6.
En el análisis estadístico de nuestra serie sólo hemos encontrado correlación
entre los valores de TNF-α plasmáticos y la edad de inicio en el consumo, sin que
influya la cantidad diaria consumida ni el consumo total acumulado. En un estudio de
43 fumadores sanos, a diferencia de nuestro trabajo, sí demostraron una relación
positiva entre los valores de TNF-α en suero y el consumo diario, así como con el
índice paquetes-año113. En nuestros resultados hay que tener en cuenta, no obstante, que
la edad de inicio es un factor en la ecuación del cálculo del índice acumulado de
consumo (índice paquetes-año). El TNF-α en CAE no guarda relación con ninguno de
los parámetros de consumo recogidos en el estudio.
2.d.-Volumen de condensado recogido
La media de volumen de condensado obtenido fue de 3,44 ml, sin
diferencias entre sexos. No hemos encontrado en la bibliografía estudios que analicen la
posible influencia del género en el volumen de muestra ni en la concentración de
biomarcadores. Tampoco hemos encontrado diferencias entre el grupo control (3,42 ml)
y el grupo estudio (3,45 ml).
El volumen de CAE obtenido en nuestra serie sólo se correlacionaba con el
tiempo que estaban respirando, a pesar de que existen trabajos que han encontrado que
el factor que más influye en el volumen exhalado es, además de la duración de la
recolección, la ventilación minuto96. Otros trabajos han demostrado que incrementando
el volumen minuto y el volumen corriente se puede obtener una mayor cantidad de
condensado sin influir en la concentración de determinadas sustancias no volátiles97.
Discusión
132
La media de tiempo empleada por los sujetos estudiados (tanto fumadores como
no fumadores) para la recolección de CAE fue de 15,44 minutos, con un volumen de
muestra obtenido de 3,44 ml. En las recomendaciones ATS / ERS se sugiere un periodo
de tiempo de 10 minutos (como la mayoría de estudios publicados), ya que con ese
tiempo se obtienen entre 1 y 2 ml de condensado, y porque es un periodo de tiempo con
buena tolerancia por parte de los pacientes. Nosotros decidimos prolongar el tiempo de
recogida de muestra para disponer de un mayor volumen de condensado con la
intención de incluir en el análisis de alguna otra citocina inflamatoria.
En nuestro trabajo no hemos encontrado que exista una correlación entre los
valores de función pulmonar (tanto en niveles absolutos como en el porcentaje respecto
al teórico) y el volumen de muestra obtenido. En la literatura se describe cómo es mayor
la influencia de la ventilación que la de la función pulmonar en la cantidad de muestra
resultante, ya que si la ventilación se mantiene constante, el volumen de condensado se
incrementa con el tiempo, incluso en pacientes EPOC96. Además se ha comprobado que
el volumen obtenido se relaciona con el volumen tidal y con el volumen minuto, pero
no con la capacidad pulmonar total98.
3.- TNF-α como marcador precoz de enfermedad
La EPOC es una enfermedad infradiagnosticada y con una prevalencia que va en
aumento, ya que se estimaba en 9,1% en nuestro país hace unos años3 y recientemente
se ha publicado una cifra ligeramente superior (10,2%) en personas entre 40 y 80 años4.
El humo del tabaco está presente casi siempre que se diagnostica a un paciente de
EPOC. Sin embargo, sólo un 15% de los fumadores desarrolla EPOC. La definición de
esta enfermedad es una obstrucción crónica al flujo aéreo poco reversible; no obstante
cuando la espirometría detecta dicha obstrucción, el problema está ya instaurado y
Discusión
133
aunque se abandone el hábito de fumar, el proceso inflamatorio puede resultar
irreversible. La EPOC también se define como una respuesta inflamatoria anormal a
partículas nocivas o gases, por lo que una inflamación pulmonar (consistente en un
incremento en el número y actividad de células inflamatorias como neutrófilos y
macrófagos)119 puede ser un evento patológico temprano en la EPOC. Por esta razón es
muy importante detectar los fenómenos inflamatorios en el periodo “silencioso” de la
enfermedad, que puede ser de años de duración.
Se conocen datos de inflamación en fumadores sin patología establecida. El
BAL de pacientes con bronquitis crónica tiene mayor celularidad y mayor porcentaje de
neutrófilos que el BAL de fumadores sanos y no fumadores14, 25. Además, el porcentaje
de neutrófilos en aquellos que superan el 20% se relaciona con el consumo diario de
tabaco y con el índice acumulado de paquetes-año, así como con todos los valores
espirométricos. Las células caliciformes están más elevadas en pacientes con bronquitis
crónica y guardan relación con el número de paquetes-año y de forma negativa con
FEV1, FEV1/FVC y con FEF25-75. También se ha observado que el índice de bronquitis
determinado mediante broncoscopia es menor en fumadores asintomáticos que en
aquellos que ya padecen una bronquitis crónica14. A nivel histológico se han
identificado lesiones típicas posiblemente reversibles, que pueden ser las precursoras de
lesiones anatómicas más severas, como es la bronquiolitis respiratoria asociada a
macrófagos alveolares pigmentados en los bronquíolos respiratorios de primer y
segundo orden distales al bronquiolo membranoso terminal15. Comparando pulmones de
pacientes EPOC con los de un grupo de fumadores sin patología y otro grupo de no
fumadores, se vio que la severidad del enfisema era mayor en el grupo EPOC, sin que
existieran diferencias entre los otros dos grupos. En el grupo de fumadores sanos
Discusión
134
respecto al grupo control se vio que los bronquíolos de menos de 2 mm de diámetro
tenían mayor infiltrado celular inflamatorio y mayor hipertrofia de músculo liso30.
Además, se han realizado intentos de correlacionar los hallazgos patológicos
encontrados en fumadores antes de padecer enfermedad con la función pulmonar. En el
grupo con menor puntuación patológica se ha visto una función pulmonar normal, que
se deterioraba progresivamente al ir incrementándose los hallazgos patológicos. Con
esto se han podido identificar unas lesiones potencialmente reversibles, como son los
infiltrados celulares inflamatorios, la metaplasia de células escamosas y una mínima
fibrosis de la pared de la vía aérea16.
Se han realizado intentos para identificar un marcador plasmático de inflamación
en fumadores. Gander et al no demostraron unos niveles mayores de TNF-α en
fumadores. Los niveles de TNF-α estaban elevados en fumadores activos (2,2 pg / ml)
frente a no fumadores y fumadores irregulares (que mostraban cifras similares de 1,8 pg
/ ml), pero sin alcanzar significación estadística18. Garey et al, utilizando el CAE
encuentran diferencias entre un grupo de fumadores sanos y un grupo control no
fumador (7,4 vs 3,9 pg/ml)22.
Se han propuesto distintos modelos de inflamación según la enfermedad
respiratoria que se padezca. Estudios con pacientes EPOC, asmáticos, bronquitis crónica
y “fumadores sanos” demostraron diferencias en determinados marcadores
inflamatorios. Los pacientes EPOC mostraron unos mayores niveles de neutrófilos, de
IL-8 y sTNF-R75 en esputo; y de IL-8, sRNF-R75 y proteína ligadora de
lipopolisacáridos (LBP) en plasma. Los asmáticos mostraban eosinofilia en esputo,
mientras que los pacientes con bronquitis crónica tenían más linfocitos en esputo y
valores significativamente inferiores en plasma de sTNF-R75 y 55. Los fumadores
sanos sólo mostraron unos mayores niveles de LBP en plasma35.
Discusión
135
También el condensado de aire exhalado (CAE) es un medio utilizado en
fumadores sintomáticos que están en riesgo de padecer EPOC para el estudio de
marcadores inflamatorios. Los no fumadores tienen niveles más bajos de 8-isoprostano
respecto a fumadores asintomáticos y fumadores con síntomas de bronquitis crónica.
Los niveles de IL-8 y de 8-isoprostano se correlacionaban inversamente con varios
parámetros de función respiratoria (FVC, FEV1 , FEV1 /FVC, DLCO%). Además el 8-
isoprostano en CAE permite distinguir ente no fumadores y fumadores no
sintomáticos37.
En nuestro intento por encontrar un posible papel del TNF-α como predictor de
inflamación en fumadores sanos, sólo hemos encontrado diferencias significativas en
los valores de TNF-α en plasma, y no en CAE. Dichos valores sólo correlacionaban
discretamente con los valores de función pulmonar (FEV1% y FVC%). La influencia del
consumo de tabaco tampoco se ha podido demostrar, aunque los niveles de TNF-α
plasmáticos correlacionaban de forma positiva con la edad de inicio en el consumo,
factor clave en la carga tabáquica acumulada.
136
VIII. CONCLUSIONES
Conclusiones
137
1.- Los fumadores tienen valores más elevados que los no fumadores de la
citosina proinflamatoria TNF-α en suero.
2.- No existen diferencias en los valores de TNF-α en condesado de aire
exhalado (CAE) entre fumadores y no fumadores.
3.- El sexo no demuestra ser un factor determinante en los niveles de TNF-α en
ninguno de los medios estudiados.
4.- A mayor edad de los sujetos, se pueden encontrar mayores niveles de TNF-α
en suero.
5.- No existe influencia de la edad sobre los valores de TNF-α en CAE.
6.- Un mayor índice de masa corporal (IMC) influye en mayores niveles de
TNF-α plasmáticos.
7.- No existe relación entre el IMC y los valores de TNF-α en CAE.
8.- El tiempo de duración del hábito tabáquico influye más sobre la inflamación
sistémica que el consumo diario.
9.- Los niveles de TNF-α en CAE no se modifican por ninguno de los
parámetros de consumo de tabaco.
Conclusiones
138
10.- La función pulmonar (FVC y débilmente FEV1) guarda relación con los
valores plasmáticos de TNF-α.
11.- Los parámetros de función pulmonar no influyen en los valores de TNF-α
en CAE.
139
IX. BIBLIOGRAFÍA
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154
X._ABREVIATURAS
Abreviaturas
155
ADN: ácido desxosirribonucleico
AMP: adenosín monofosfato
BAL: lavado broncoalveolar
BC: bronquitis crónica
CAE: condensado de aire exhalado
CO: monóxido de carbono
DLCO: capacidad de difusión del monóxido de carbono
ECP: proteína catiónica de eosinófilos
ELISA: enzima inmunoensayo
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica
FEF25-75: flujos meso-espiratorios
FEV1: flujo espirado en el primer segundo
FEV1/FVC: relación entre el flujo espirado en el primer segundo y la capacidad vital
forzada
FVC: capacidad vital forzada
HA: ácido hialurónico
Ig: inmunoglobulinas
IFN: interferón
IL: interleukinas
IMC: índice de masa corporal
LBP: proteína ligadora de lipopoilisacáridos
LPS: lipopolisacáridos
LT: leucotrienos
MCP: proteína quimiotáctica de monocitos
MMEF75-25: flujos meso-espiratorios
Abreviaturas
156
MMP: metaoloproteinasa
MPO: mieloperoxidasa
NO: óxido nítrico
PCR: proteína C reactiva
PCR: reacción en cadena de polimerasa
PEF: pico flujo espiratorio
Ppm: partes por millón
Rtot: resistencias totales pulmonares
TLC: capacidad pulmonar total
TNF-α: factor de necrosis tumoral alpha
VC: capacidad vital
Vmin: volumen minuto
VR: volumen residual
VT: volumen tidal
157
XI. ANEXOS
Anexos
158
Anexo I. Aprobación del estudio por el CEIC del hospital
Anexos
159
Anexos
160
Anexo II. Modelo de consentimiento informado
Anexos
161
Estimado Sr. Dº/ª ……………….
Queremos solicitarle su autorización para la extracción de una muestra de sangre
y para la recogida de una muestra de condensado de aire exhalado con el fin de realizar
un estudio de investigación que se llevará a cabo en nuestro centro. El estudio lleva el
título de “REDUCCIÓN DE INFLAMACIÓN SISTÉMICA Y DEL TNF-ALPHA EN
EL CONDENSADO DE AIRE EXHALADO EN FUMADORES QUE ABANDONAN
EL HÁBITO CON BUPROPION: ESTUDIO DE CASOS Y CONTROLES”. Antes de
firmar este documento, léalo con atención. No está obligado a firmarlo si no lo desea, y
en este caso, no se verá mermada su atención en nuestra consulta de deshabituación
tabáquica.
Objeto de la Investigación
El consumo de tabaco es la principal causa de la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica (EPOC), enfermedad que ocupa el cuarto lugar de causas de mortalidad en
países desarrollados. Esta enfermedad está definida por una obstrucción al flujo aéreo
detectada en la espirometría, pero una vez se observa este hecho, la situación es ya
irreversible. La inflamación forma parte del proceso inicial de la enfermedad, por lo que
sería muy importante detectarla antes de que se establezca la obstrucción bronquial. En
esta inflamación intervienen múltiples proteínas, siendo una de ellas el TNF-α, la cual
es objeto de estudio por nuestra parte.
Nuestra intención es demostrar que los fumadores sin enfermedades tienen un
estado de inflamación en comparación con los no fumadores, también en este caso sin
enfermedad conocida. Esta inflamación se relacionaría con el consumo de tabaco, y con
los datos de función pulmonar obtenidos en la espirometría que se realiza de forma
rutinaria en nuestra consulta. Tras el abandono del tabaco utilizando la medicación
bupropion, los datos de inflamación en los fumadores se reducen y alcanzan valores
Anexos
162
similares a los de los no fumadores. Con ello intentamos contribuir a la detección de
fumadores en riesgo de desarrollar EPOC.
Implicaciones del estudio
Todas las investigaciones que se llevan a cabo para este estudio cuentan con la
supervisión del Comité de Ética e Investigación Clínica de nuestro hospital.
La colaboración en este estudio es altruista y por lo tanto no conlleva ningún
beneficio económico para la persona que decide colaborar.
El uso que se haga de la información obtenida será confidencial. Por lo tanto, su
identidad será siempre preservada. Igualmente los datos obtenidos sólo podrán ser
publicados de forma anónima y agregada, es decir, en forma de porcentajes o datos
numéricos sin identificación del participante, y nunca de manera individual.
Consentimiento
El doctor....................................... me ha proporcionado suficiente información acerca
del estudio denominado “REDUCCIÓN DE INFLAMACIÓN SISTÉMICA Y DEL
TNF-ALPHA EN EL CONDENSADO DE AIRE EXHALADO EN FUMADORES
QUE ABANDONAN EL HÁBITO CON BUPROPION: ESTUDIO DE CASOS Y
CONTROLES”, y me ha aclarado las dudas surgidas. Por ello, consiento en participar
en este estudio y autorizo que mi muestra de sangre y de condensado de aire exhalado
sea utilizada para la investigación.
Firma del propietario de la muestra
Anexos
163
Anexo III. Base de datos
Anexos
164
Paciente Edad Sexo Tabaco TNF-α suero TNF-α CAE
1 38 Varón No 4,95 3,97
2 40 Varón Si 5,66 4,90
3 38 Varón No 6,19 4,10
4 54 Varón Si 5,37 5,50
5 38 Varón Si 6,28 6,06
6 49 Mujer Si 5,09 4,39
7 41 Mujer Si 5,46 4,20
8 32 Mujer No 5,00 4,60
9 25 Varón No 5,73 3,87
10 39 Mujer Si 5,36 4,51
11 33 Varón No 5,20 4,20
12 31 Mujer No 4,73 3,90
13 43 Mujer Si 5,79 3,64
14 42 Varón No 5,97 3,65
15 31 Varón No 5,37 4,30
16 33 Mujer No 5,40 3,85
17 47 Mujer No 6,28 5,83
18 37 Mujer Si 6,62 3,77
19 26 Varón No 7,17 3,71
20 31 Mujer Si 5,12 4,34
Anexos
165
Paciente
FVC
(ml)
FVC
(%)
FEV1
(ml)
FEV1
(%)
MMEF
(ml)
MMEF
(%)
IT
1 5.870 119,2
4.630 119,9
4.000 90,70 78,87
2 5.470 99,6
4.650 109,3
4.940 110,90 84,94
3 5.240 90,4
4.410 98,3
4.380 94,90 84,30
4 4.490 90,6
3.410 92,1
2.550 68,00 76,14
5 5.140 92
3.750 86,3
2.680 58,80 72,84
6 2.980 91,1
2.460 97,8
2.230 69,20 82,77
7 4.430 122,4
3.820 134,1
4.480 126,70 86,20
8 4.020 85
3.470 91,9
3.160 69,60 86,22
9 5.370 94
4.410 96,5
4.400 86,20 82,05
10 2.860 88
2.460 94,2
3.140 90,00 85,92
11 6.060 99,6
4.910 102,9
4.490 90,90 80,99
12 4.100 104,6
3.810 120,5
4.910 125,70 92,83
13 4.260 114,7
3.420 118,4
3.040 86,70 80,35
14 4.440 98,1
3.930 111,3
4.650 112,40 88,48
15 4.640 91,1
3.870 95,3
3.910 82,70 83,36
16 4.150 102,3
3.700 114,4
4.660 119,90 89,12
17 3.270 94,8
2.700 101,3
2.810 84,50 82,61
18 3.890 94,5
3.220 99,7
3.500 92,40 82,89
19 5.760 91,2
5.340 106,9
6.130 117,10 92,82
20 3.630 88,5
2.720 81
2.250 66,10 75,03
Anexos
166
Paciente IMC
Número
cigarrillos/día
Número
paquetes-año
Edad
inicio
1 26,64
No fumador No fumador No fumador
2 36,2
18 24 14
3 29,11
No fumador No fumador No fumador
4 32,2
20 40 15
5 32,86
25 30 13
6 25,96
20 30 18
7 28,66
50 74 14
8 21,41
No fumador No fumador No fumador
9 28,25
No fumador No fumador No fumador
10 20,56
30 39 14
11 26,3
No fumador No fumador No fumador
12 19,57
No fumador No fumador No fumador
13 18,03
20 25 18
14 25,71
No fumador No fumador No fumador
15 23,6
No fumador No fumador No fumador
16 18,11
No fumador No fumador No fumador
17 21,88
No fumador No fumador No fumador
18 22,15
24 30 13
19 20,65
No fumador No fumador No fumador
20 18,03
14 15 15
Anexos
167
Paciente
Volumen
muestra Volumen
Total Tiempo PEF
Volumen
Tidal
Volumen
minuto
Frecuencia
respiratoria
1 4,4 312,9 15,18 0,5 0,82 17,8 17,9
2 4,2 400,5 29,11 0,4 0,38 9,6 23,5
3 3,7 250,2 14,01 0,4 0,38 11,8 19,5
4 4,3 200,4 20,28 0,5 1,11 15,1 17,6
5 4,6 250,9 20,03 0,5 0,76 19,8 22,4
6 4,2 202,6 21,50 0,4 0,40 8,2 21,2
7 5,0 216,9 20,56 0,4 0,54 8,8 16,4
8 4,2 274,1 14,18 0,4 0,68 15,6 20,6
9 5,0 304,1 20,03 0,9 0,99 17,1 17,2
10 5,1 223,9 21,29 0,4 0,63 12,4 22,0
11 4,0 527,6 15,07 1,2 1,16 19,9 25,2
12 4,9 262,3 15,07 0,4 0,59 12,5 18,7
13 4,7 232,8 13,19 0,3 0,83 4,8 16,5
14 4,4 206,2 17,49 0,3 0,42 6,8 15,1
15 2,9 204,9 12,05 0,4 0,66 18,1 18,9
16 3,2 287,9 10,11 0,6 1,19 107,2 35,2
17 2,1 135,0 12,13 0,1 0,27 6,9 21,7
18 4,2 284,7 13,22 0,3 0,57 11,3 17,0
19 3,2 244,7 12,54 0,6 0,85 14,1 15,3
20 3,0 151,5 12,39 0,3 0,54 7,8 19,0
Anexos
168
Paciente Edad Sexo Tabaco TNF-α suero TNF-α CAE
21 26 Mujer Si 6,17 3,56
22 50 Mujer Si 7,55 3,83
23 45 Varón Si 7,74 3,73
24 42 Mujer No 6,72 3,93
25 45 Mujer No 5,55 4,22
26 54 Mujer Si 8,46 3,77
27 40 Mujer Si 9,84 4,11
28 32 Mujer Si 8,38 4,13
29 44 Varón Si 7,47 3,49
30 39 Varón Si 7,32 4,63
31 30 Varón No 4,98 4,40
32 45 Mujer Si 5,02 3,86
33 47 Mujer No 4,89 3,76
34 50 Varón Si 7,74 3,73
35 43 Varón Si 7,08 4,10
36 48 Mujer Si 6,19 4,70
37 43 Mujer No 5,47 4,06
38 44 Varón Si 6,41 3,69
39 46 Mujer No 6,24 3,88
40 36 Mujer Si 5,97 3,78
Anexos
169
Paciente
FVC
(ml)
FVC
(%)
FEV1
(ml)
FEV1
(%)
MMEF
(ml)
MMEF
(%)
IT
21 3320 75,7 2970 83,9 3270 78,3 89,35
22 2970 87,8 2210 85,2 1640 50,9 74,26
23 4480 93,1 3580 96,7 3300 81,3 79,80
24 4130 100,9 3320 104,7 3030 83,2 80,31
25 3830 114,2 3080 116,8 2950 86,6 80,50
26 3110 81,9 2540 89,4 2470 76,6 81,53
27 3970 98,7 3450 109,9 4410 119,8 86,88
28 3110 77,2 2810 86,9 3850 98,5 90,10
29 4930 88,5 3830 89,7 2870 66,5 77,68
30 6190 109,7 5230 119,5 5590 123,2 84,41
31 6410 108,2 4870 104,0 3820 76,4 75,92
32 4260 118,9 3470 124,8 3420 100,2 81,50
33 3860 106,4 3290 117,0 4050 118,3 85,20
34 5340 103,1 3980 101,8 3020 76,0 74,63
35 3990 76,1 3120 77,3 2640 61,9 78,20
36 3430 98,9 2690 100,8 2280 69,1 78,50
37 2780 86,5 2340 92,0 2790 82,6 84,17
38 5130 85,8 4000 87,6 3400 76,7 78,01
39 3970 111,6 3200 116,1 2990 88,4 80,50
40 3110 87,7 2510 88,2 2400 65,6 80,72
Anexos
170
Paciente IMC
Número
cigarrillos/día
Número
paquetes-año Edad inicio
21 22,23
10 11 12
22 46,09
25 35 16
23 26,99
30 42 16
24 18,93
No fumador No fumador No fumador
25 21,78
No fumador No fumador No fumador
26 31,46
25 35 19
27 23,67
22 18 24
28 31,57
30 24 16
29 21,37
20 26 13
30 26,25
12 14 16
31 29,11
No fumador No fumador No fumador
32 18,07
20 27 18
33 19,57
No fumador No fumador No fumador
34 23,95
20 30 20
35 30,02
40 60 14
36 23,92
30 45 16
37 23,92
No fumador No fumador No fumador
38 25,17
10 13 17
39 20,2
No fumador No fumador No fumador
40 32,05
20 20 16
Anexos
171
Paciente
Volumen
muestra
Volumen
total Tiempo PEF
Volume
Tidal
Volumen
minuto
Frecuencia
respiratoria
21 3,0 203,5 12,25 0,2 0,40 13,9 21,9
22 3,4 180,8 14,16 0,3 0,58 8,3 16,7
23 2,8 217,9 10,46 1,4 1,34 28,1 19,6
24 2,9 200,8 16,58 0,2 0,36 24,1 16,5
25 3,5 218,4 15,44 0,5 0,29 7,8 12,7
26 3,3 203,8 16,26 0,4 0,40 11,7 28,2
27 4,0 224,2 17,28 0,3 0,41 11,4 17,6
28 3,3 228,6 14,01 0,8 1,34 15,4 11,5
29 3,2 254,3 12,47 0,4 0,42 13,1 17,1
30 3,3 200,0 11,51 0,5 0,39 9,9 21,7
31 4,7 243,7 14,04 0,4 0,71 18,7 19,5
32 4,0 199,9 14,08 0,3 0,67 13,1 20,7
33 1,0 155,1 14,18 0,3 0,34 12,9 33,8
34 2,6 629,4 9,48 0,8 0,92 17,3 17,7
35 3,8 349,4 17,52 0,5 1,73 30,8 17,6
36 5,4 222,0 16,08 0,6 0,42 8,6 19,9
37 2,6 182,0 13,57 1,0 0,67 13,7 13,9
38 1,8 180,2 15,14 0,1 0,27 6,7 16,9
39 3,2 301,5 12,47 0,7 0,86 23,6 15,9
40 3,7 327,8 18,41 0,1 0,22 5,3 15,7
Anexos
172
Paciente Edad Sexo Tabaco TNF-α suero TNF-α CAE
41 38 Varón Si 5,43 3,97
42 45 Varón Si 7,26 3,25
43 43 Varón No 7,18 3,35
44 52 Mujer No 6,14 3,63
45 35 Varón Si 7,03 3,52
46 26 Varón Si 5,07 3,77
47 38 Mujer No 8,41 3,91
48 29 Mujer Si 4,67 3,55
49 36 Mujer Si 6,58 3,36
50 48 Mujer Si 7,47 3,79
51 47 Mujer Si 7,38 3,35
Anexos
173
Paciente
FVC
(ml)
FVC
(%)
FEV1
(ml)
FEV1
(%)
MMEF
(ml)
MMEF
(%)
IT
41 6360 100,1 5160 105,1 5110 106,2 81,21
42 4360 82,5 3780 93,6 4570 123,6 86,70
43 4740 97,7 3820 101,5 3180 75,9 80,53
44 3390 101,5 2590 102,0 1850 58,6 76,38
45 5630 105,0 4640 110,4 4420 95,9 82,47
46 4540 104,5 3880 110,6 4370 105,0 85,48
47 2620 74,0 2330 82,5 2970 82,5 88,94
48 3680 103,5 3040 104,0 3180 82,3 82,65
49 6920 118,8 5420 119,5 4120 87,5 78,36
50 4080 102,7 3240 107,2 2910 84,7 79,33
51 3630 100,1 3060 109,5 3650 108,2 84,17
Anexos
174
Paciente IMC
Número
cigarrillos/día
Número
paquetes-año
Edad
inicio
41 30,15
10 13 14
42 35,58
30 45 15
43 25,61
No fumador No fumador No fumador
44 21,48
No fumador No fumador No fumador
45 17,43
25 30 14
46 17,99
10 11 16
47 28,84
No fumador No fumador No fumador
48 21,08
20 17 13
49 28,68
15 16 15
50 23,66
7 10 20
51 29,37
20 32 15
Anexos
175
Paciente
Volumen
muestra
Volumen
total Tiempo PEF
Volumen
Total
Volumen
minuto
Frecuencia
respiratoria
41 3,7 298,6 18,00 0,5 0,64 18,0 16,7
42 3,5 192,0 16,00 0,3 0,52 11,2 21,0
43 3,0 194,8 17,43 0,2 0,49 18,6 19,4
44 3,3 203,7 19,06 0,5 0,52 10,3 15,7
45 3,0 206,3 17,32 0,4 0,62 9,9 17,8
46 2,5 216,7 16,46 0,4 0,35 9,4 24,4
47 2,1 192,1 19,18 0,1 0,16 3,2 21,8
48 2,4 128,9 14,06 0,1 0,19 5,3 27,8
49 2,0 620,8 12,23 0,7 0,97 17,2 18,0
50 1,0 149,4 10,00 0,3 0,71 14,3 17,5
51 1,8 212,3 13,21 0,3 0,54 11,1 17,8
Anexos
176
Anexo IV. Resumen en Inglés
Anexos
177
The aims of this study were to demonstrate an inflammatory status of healthy
smokers in comparison to a group of healthy non smokers by measuring the levels of a
proinflammatory citokyne: TNF-α. We also wanted to know whether there was
influence of gender, age and weight on TNF-α levels; and to determine the association
between smoking, pulmonary function and TNF-α.
We made a prospective study of smokers and non-smokers without any known
disease. Respiratory function tests, samples of exhaled breath condensate (EBC) and
blood were performed before smoking cessation. Statistical analysis were made with
SPSS 11.0.
We studied 51 patients, 60,8% smokers (n = 31), 56,9% female (n = 29), mean
age 39,88 +/- 7,61 years old, and mean body mass index (BMI) 25,33 +/- 5,74 kg/m2 .
There were no significant differences between the two groups, except for BMI that was
higher in smokers (26,50 vs 23,53 kg/m2, p = 0,044). Smokers had significant higher
levels of TNF-α in plasma (6,54 pg/ml vs 5,88 pg/ml, p = 0,043), but there were no
differences in TNF-α in EBC (4,03 pg/ml vs 4,05 pg/ml, p = 0,89). Age and BMI has an
influence on the levels of serum TNF-α, but not in EBC values. Of the parameters of
smoking studied, only the age when smoking first began had an influence on TNF-α
plasma values, but not in EBC TNF-α levels. In terms of lung function, we just found a
correlation between FVC and FEV1 (porcentual values) with serum TNF-α (not in
EBC).
In conclusion, we can say that healthy smokers showed higher levels of TNF-α
in serum but not in EBC when compared to non smokers. There was an influence of
body mass index on serum TNF-α levels. The time when smoking started is the main
Anexos
178
data of tobacco consumption that influenced the levels of TNF-α in plasma. There was a
correlation between lung function and serum TNF-α.