tesis agronomía 27 septiembre

8/13/2019 Tesis Agronoma 27 SEPTIEMBRE

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECASFRANCISCO GARCA SALINAS

UNIDAD ACADMICA DE AGRONOMA

EFECTO DE TEMPERATURAS ALTAS EN LAEXPRESIN DE Hsp70 DE EMBRIONES DE

FRIJOL

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE:

INGENIERO AGRNOMO

PRESENTA:

GRACIELA GONZLEZ BEZ

ASESORES:

M. en C. EDGAR LEN ESPARZA IBARRADr. en C. MIGUEL ANGEL SALAS LUVANODr. en C. FRANCISCO AVIER CABRAL ARELLANO

ZACATECAS, ZAC., NOVIEMBRE 2006.


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AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Franc !c" #a$ %r Ca&ral Ar%llan", '"r la ( r%cc )n * a'"*" + %-% &r n() ( ran % la r%al /ac )n (% %! % ra&a ".

Al M. %n C. E(1ar L%)n E!'ar/a I&arra, '"r ! 1ran a* (a, a!%!"r a *c"la&"rac )n a'"r a("! ( ran % %l (%!arr"ll" (% %! % ra&a ".

Al Dr. M 1 %l An1%l Sala! L 3$an", '"r %l a'"*" &r n(a(", '"r ! !$al "!"! c"-%n ar "! * '"r ! c""'%rac )n %n la r%$ ! )n (%l 'r%!%n % ra&a ".

A la M. %n C. Mar an(r%a Ca&ral Enc !", '"r ! a'"*" 'r%! a(" %n lar%$ ! )n (% %! % ra&a ".

Al M. %n C. #"!3 4a r"c n " G)-%/ D%l1a(", '"r la r%$ ! )n * a'"*" %nla 'r%!%n % %! !.

A M. %n C. Man %la C5 $%/ C5a r%/, '"r la a* (a 'r%! a(a %n %lla&"ra "r ".

A la 7n (a( Aca(3- ca (% B "l"1 a E8'%r -%n al, a! c"-" a la 7n (a(

Aca(3- ca (% A1r"n"- a (% la 7n $%r! (a( A )n"-a (% Zaca %ca! '"r !a'"*" n! c "nal.


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DEDICATORIAS

A D "!9

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#"!3 Al:r%(", '"r ! 1ran a'"*", c"-'r%n! )n, 'ac %nc a * -" $ac )nnc"n( c "nal %n "(" l" + % 5% %-'r%n( (".

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FINANCIAMIENTO

El presente trabajo de tesis se realiz en el Laboratorio de Biologa

Molecular de Plantas de la Unidad Acadmica de Biologa

Experimental de la Universidad Autnoma de acatecas! bajo el

"inanciamiento del pro#ecto de FUNDACIN PRODUCE No.

070/FP /!00"# UA $ 0%0&&"' ( DGIP $ UA No. !00" ) &'%%$


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I. INTRODUCCIN

En Mxico! existen %%& millones de 'ect(reas potencialmente agrcolas # de las

cuales )* millones son laborables$ +e esta super"icie! slo ,$- millones de'ect(reas son de riego # %-$) millones son de temporal. # de stas! %/$& millonesson tierras laborables! de las cuales unos ,$/ millones reciben una precipitacinmenor a los ,// mm anuales. &$0 millones de 'ect(reas son tierras improductivas!principalmente por su aridez 1Lpez! %22%3$ +ada la importancia 4ue tiene el pascon respecto a una gran cantidad de suelos 4ue son de temporal! es indispensablecontar con cultivos 4ue sean tolerantes a estas condiciones clim(ticaspredominantes$ +e esta manera! se tendra una ma#or produccin en el campo!mejorando las posibilidades del agricultor # su "amilia de sobrevivir en sus lugaresde origen$ En este sentido! la investigacin biotecnolgica de plantas! o"rece laoportunidad de encontrar mejoras en los cultivos a "avor del campesino 1Lindse# #5ones! %2-23$

El "rijol es considerado junto con el maz! como uno de los elementos m(simportantes en la dieta de la ma#ora de los mexicanos! su cultivo data desde 'ace

0!/// a6os a$ 7$ 18idalgo # +ebouc9! %2-03$ Mxico es uno de los pases conma#or consumo! #a 4ue cultiva una super"icie de ) millones de 'ect(reasprincipalmente en el ciclo primavera:verano. obteniendo una produccin nacionalde %! /;)! 2&* toneladas en el a6o agrcola )///A AD! %22;. >EC A!%22; # rtiz! %22-3$ Estas cantidades de produccin! representan la demanda de


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un alto consumo generalizado entre la poblacin! produccin 4ue se ve a"ectadapor la carencia de recursos econmicos disponibles por parte de los ejidatarios. ascomo tambin de los apo#os "inancieros por parte del gobierno$ Adem(sintervienen otros "actores 4ue in"lu#en en 4ue la produccin promedio sea baja! #esto es debido= %3 a 4ue se cultiva principalmente en terrenos de temporal. )3 a 4ueno se usan variedades mejoradas! *3 al uso incorrecto de "ertilizantes. ,3 a lapresencia de plagas # en"ermedades # al inadecuado control de stas. 03 a "actoresambientales importantes como la temperatura! #a 4ue puede causar estrs enpocos minutos a di"erencia de la "alta de agua del suelo! 4ue toma das o semanasen actuar como estresor # a los nutrientes minerales! 4ue tardan 'asta meses enser estresantes 17sermel# # La9'otia! %22-3$

El estrs ambiental! implica la respuesta de un sistema biolgico "rente a laexposicin a condiciones "sicas # 4umicas extremas en el medio ambiente! ante lacual! dic'o sistema debe ajustarse para llevar a cabo sus "unciones de maneranormal$ La temperatura del aire! la radiacin solar indirecta # una pobre nutricin!son los principales "actores 4ue a"ectan el balance energtico de los sistemasbiolgicos en las zonas (ridas 1>ilani9ove! %2-&3$ La radiacin solar es el e"ecto de

la energa radiante del sol # la radiacin trmica del medio ambiente circundante17#mbalu9 # 7'ristison! %22/3! # es el principal "actor 4ue causa estrs calrico eincrementa la ganancia de calor! tanto directo como indirecto 1>'earer et al $! %22%3$+urante las 'oras de luz del da! casi todo el calor obtenido del medio directo oindirectamente del sol! puede reducir la e"iciencia reproductiva en un nic'o! # estose debe probablemente a la energa gastada en liberar al organismo del exceso dela carga calrica! mediante un incremento en la respiracin # otras actividadesrelacionadas 4ue alteran el metabolismo de un ser vivo 1Cu4ua#! %2-%3$

El estrs calrico se de"ine como cual4uier combinacin de condicionesambientales! 4ue causan 4ue la temperatura de la zona termoneutral de losorganismos sea superior$ >in embargo! es di"cil especi"icar cu(l es la exactacombinacin de condiciones ambientales para 4ue se origine el estrs calrico para

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cual4uier tipo de organismos! #a 4ue existen varias di"erencias entre los mismos1Bu""ingtonet al $! %2-%3$ Fambin se 'a se6alado 4ue la importancia de la variacinen la radiacin solar para producir respuestas "isiolgicas! es comparable bajocondiciones de campo con las variaciones en la temperatura del aire! #considerablemente ma#or 4ue la de presin de vapor # la velocidad de los vientos18arris et al $! %2;/3! existiendo escasa in"ormacin sobre la carga calrica extra dela radiacin solar sobre el balance energtico! el consumo de nutrientes # elmetabolismo 'drico de un organismo 1Mac"arlane et al $!%2;; # >ilani9ove! %2-&3$Por otra parte! las zonas semi(ridas! se caracterizan por condiciones estacionalesextremas! con lluvias relativamente escasas # perodos mu# prolongados dese4ua$ Las "luctuaciones diarias # estacionales con respecto a la temperatura son

mu# amplias casi todo el a6o! con una intensa radiacin solar por la atms"eraseca # los cielos despejados 1>'arma! %22%3$

7on respecto a la respuesta celular generada por las agresiones ambientales!stas propician el replegado inapropiado de las protenas! lo cual es mu# peligrosopara la clula$ Por m(s de */ a6os 'a sido reconocido 4ue la lenta elevacin de latemperatura! puede inducir la respuesta llamada de c'o4ue calrico en todas las

clulas 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ Esta respuesta de estrs! se caracteriza por unr(pido aumento en la sntesis de un grupo de polipptidos llamados protenas dec'o4ue trmico calrico 8sp 18eat s'oc9 proteins3$ Mismas 4ue se clasi"ican encinco "amilias con"orme al peso molecular aproximado con respecto a susdi"erentes miembros= 8sp%//! 8sp2/! 8sp&/! 8sp;/! 8spGs pe4ue6as de %0 a ,/9ilodaltones$ Por a6os! las "unciones de stas protenas "ueron desconocidas! peroestudios recientes las 'an de"inido como los compuestos moleculares centrales enla ma4uinaria del plegado de las protenas 18artl! %22;3$ Muc'as de las 8sp est(nasociadas a c'aperonas! las cuales son expresadas constitutivamente en todas lasclulas. donde se expresan genes para las "amilias de las 8sp con distintos gradosde variacin respecto a la secuencia # a sus patrones de expresin$ Adem(s!participan en la sntesis de protenas! en la traduccin e interaccin protenain embargo! desde el punto de vista bio4umico


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existentes en otras especies productoras de grano #Jo modelos biolgicos1Miern#9! %2223$

La propuesta de un modelo alternativo basado en algunas de las caractersticasrelevantes del "rijol como= variedades de amplia utilizacin en la regin! semillasrelativamente grandes! gran disponibilidad de material gentico! conservacin delas caractersticas de la especie! embriones con alto porcentaje de germinacin! esen s! una propuesta original$

Los embriones de "rijol permiten contar con un sistema estable de molculas! lascuales pueden ser puri"icadas para su estudio # utilizacin! #a 4ue podran sermonitoreadas in vivo e in vitro a travs del proceso de germinacin o durante elciclo biolgico de la planta$ Ensa#os preliminares 'an demostrado 4ue es viable lautilizacin de este modelo biolgico! puesto 4ue permite la manipulacin moleculara un bajo costo si se compara! por ejemplo! con el costo del cultivo de clulasanimales o vegetales! el cultivo de protoplastos o el del cultivo de tejidos vegetales$

Adem(s! existe una gran cantidad disponible de este material biolgico para sucaracterizacin bio4umico:molecular! con lo cual se estudiaran los productos de

los genes expresados en el ambiente natural de las plantas # se aportaranelementos novedosos al conocimiento de la din(mica molecular de los genes1genmica3 # sus productos 1protemica3 para su mejor entendimiento$

7on base a lo anterior # ante los escasos estudios sobre las protenas de c'o4uecalrico 18sp&/3 en "rijol 1Phaseolus vulgaris L3! el objetivo general! objetivosparticulares e 'iptesis. "ueron los siguientes=

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O*+,- o ,1,234

+eterminar la expresin del AD@m # de la protena 8sp&/ en embrionesgerminados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrs calrico$

O*+,- os p32- 56432,s

%$ 7onocer la relacin de un rango de temperatura de )0K7 a ,/K7! con laexpresin del AD@m # de la protena de c'o4ue trmico 8sp&/! en embrionesde Phaseolus vulgaris en el proceso inicial de la germinacin$

)$ 7uanti"icar los niveles de la expresin in vitro ! del AD@m # de la protena dec'o4ue trmico en embriones germinados de Phaseolus vulgaris ! sometidos aestrs calrico$

H p -,s s

El AD@m # la protena 8sp&/! muestran un patrn de expresin di"erencial enembriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrs trmico$


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II. RE8ISIN DE LITERATURA

!.9 C3235-,2:s- 53s ,1,234,s ;,4

El "rijol es un cultivo de gran importancia tanto por la produccin nacional #regional. como por el consumo generalizado del mismo entre la poblacin$ Es unaplanta anual! 'erb(cea intensamente cultivada desde las zonas tropicales 'asta lastempladas$ >e le conoce con di"erentes nombres= poroto! 'aricot! caraota! juda!alubia # 'abic'uela$ El "rijol pertenece a la "amiliaLeguminoceae # es una semilla"ormada por una cubierta! dos cotiledones # un embrin 1Cigura %3! el cual esta"ormado por las estructuras de la radcula! epictilo! plHmula e 'ipoctilo 18idalgo #+ebouc9! %2-03$

Cigura %$ 7orte transversal de una semilla de "rijol$ 8idalgo # +ebouc9! %2-0

A nivel mundial se conocen %-/ especies del gnero Phaseolus ! de las cualesaproximadamente %); son originarias del continente Americano. 0, del sur de Asia# oriente de A"rica. ) de Australia # tan slo % de Europa$ En Mxico! se 'anidenti"icado m(s de ;& especies del gnero Phaseolus ! de stas slo cuatro secultivan con el propsito de usarse en la alimentacin 'umana= P. coccineus ! P $


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lunatus ! P $acutifolius # P $vulgaris $ >iendo sta Hltima la m(s utilizada! es originariadel (rea comprendida por Mxico< uatemala 1Lpez! %22%3$

El "rijol es cultivado con el "in de cosec'ar grano seco 1contiene alrededor de )0

de protena3 # en menor proporcin para la produccin de vaina! es decir! "rijolejotero! el cual puede consumirse "resco! enlatado o congelado$ La semilla # vainasse usan como alimento! en la produccin de "orraje para el ganado # en elmejoramiento de suelos como abono$ Adem(s! es rico en lisina pero de"iciente enlos amino(cidos azu"rados= metionina! cistina # tript"ano. por lo 4ue una dietaadecuada en amino(cidos esenciales se logra al combinar "rijol con cereales comomaz! arroz # otros 1 rtiz! %22-3$

!.! E4 p2o5,so ;, ,2? 135 1);o2?315 3

Las semillas son un componente vital de la dieta en el mundo! siendo los granos decereales los 4ue comprenden aproximadamente el 2/ de todas la semillascultivadas. 4ue contribu#en con la mitad de la ingesta de energa per capita $ noes de sorprenderse! de 4ue la biologa de las semillas es una de las (reas de la"isiologa de las plantas con ma#or investigacin$ Pero! a pesar de la gran cantidad

de publicaciones sobre germinacin # dormancia! aHn no se pueden responder doscuestiones "undamentales= %3 7mo emerge el embrin de la semilla para unacompleta germinacinN # )3 7mo la emergencia del embrin es blo4ueda! de talmanera 4ue las semillas pueden mantenerse en estado de dormanciaN 1BeIle#!%22&3$

Una semilla viable de "rijol! germina a los pocos minutos de 'aber embebido agua!

siempre # cuando la temperatura sea la apropiada # exista adem(s un suministroadecuado de oxgeno$ La germinacin del "rijol es epgea 1Cigura )3! donde loscotiledones salen a la super"icie sostenidos por el 'ipoctilo 4ue se alarga # seendereza por encima del suelo durante el desarrollo de la planta$


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Cigura )$ erminacin epgea de una semilla de "rijol$ BeIle# # Blac9! %22,$

La planta de "rijol 1Cigura *3! "lorece cuando cambia de la "ase vegetativa a la "asereproductiva! donde aparecen in"lorescencias 4ue al madurar en vainas! stas seabren # dejan escapar las semillas propag(ndose as por de'iscencia$

Cigura *$ Planta de "rijol$ Cuente= BeIle# # Blac9! %22,$

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En cuanto a lo 4ue respecta a la germinacin! se sabe 4ue sta incorpora varioseventos 4ue comienzan con la imbibicin de agua por una semilla seca #4uiescente! # termina con la elongacin de los ejes embrionarios 1BeIle# # Blac9!

%22,3$ El signo visible de 4ue la germinacin se llev a cabo! es la penetracin delas estructuras 4ue rodean el embrin por la radcula$ Los eventos subsecuentesinclu#endo la movilizacin de las reservas almacenadas! se asocia con elcrecimiento # desarrollo de la pl(ntula$ Fodos los eventos metablicos # celulares4ue ocurren 'asta antes de la germinacin en semillas no dormantes! ocurren enlas semillas en dormancia inclu#endo la imbibicin! pero stas Hltimas "allan en laelongacin de los ejes embrionarios$ Por otro lado! el "enmeno de dormanciasucede en la Hltima etapa de la embriognesis! cuando la semilla est( totalmente"ormada # madura! es decir! des'idratada # con capacidad para sobrevivir demanera independiente de la planta 1Bentsin9 # Ooornnee"! )//)3$

!.& I?* * 5 1 ( 2, 1 5 o ;,4 ?,-3*o4 s?o ,1 43 ,2? 135 1

La toma de agua por la semilla madura 1seca3! tiene tres "ases= la "ase ? en la cual'a# un ingreso inicial r(pido del agua! seguido de una "ase de meseta 1"ase ??3. en

tanto 4ue el incremento posterior 1"ase ???3 slo ocurre despus de 4ue lagerminacin se 'a completado$ La toma de agua durante el inicio de la "ase ?!resulta en perturbaciones estructurales particularmente de membranas! 4uepermiten la salida de solutos # metabolitos de bajo peso molecular$ Esto essintom(tico de las membranas bilipdicas en "ase de gel en la maduracin #des'idratacin! a la "ase normal de 'idratacin # "ase l4uida cristalina 17roIe #7roIe! %22)3$ +entro de un tiempo corto de re'idratacin las membranas cortan la

"uga de solutos$ 7abe mencionar 4ue a nivel molecular aun no se conoce como sereparan las membranas plasm(ticas # las de organelos 1>andoval et al $! %2203$

Bajo la imbibicin! las semillas secas # 4uiescentes rapidamente reinician laactividad metablica$ Las estructuras # enzimas necesarias para reiniciar tal


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actividad! se encuentran en la semilla seca! las cuales sobreviven por lo menosparcialmente intactas al proceso de desecacin 4ue termina en la semilla madura$La introduccin de agua permite la actividad metablica sin sntesis de nuevasenzimas! 4ue en pocas 'oras son remplazadas por el metabolismo completo$ Unode los primeros cambios con la imbibicin! es el reinicio de la actividad respiratoria!la cual es detectada en minutos despus del incremento inicial en el consumo deoxgeno$ La tasa respiratoria se reduce 'asta 4ue la radcula penetra lasestructuras 4ue la rodean! gener(ndose un nuevo incremento de la actividadrespiratoria 1BeIle# # Blac9! %22,3$

La va glicoltica # la ruta de las pentosas "os"ato se reinician en "ase ?! as comotambin se activan las enzimas del ciclo de Orebs$ >e conoce tambin de laexistencia de mitocondrias en los tejidos embrionarios! pero con pocadi"erenciacin los cuales en unas cuantas 'oras se redi"erencian # permiten lageneracin de nuevas mitocondrias! en donde se expresan los primeros genesnucleares 1E'rens'a"t # Brambl! %22/3$

!." S:1-,s s ;, p2o-,:13s ;6231-, 43 ,2? 135 1

Foda la ma4uinaria para el reinicio de la sntesis de protenas durante la imbibicin!est( presente en las clulas de los embriones maduros! donde no se detecta lapresencia de polirribosomas$ >in embargo! en los primeros minutos de lare'idratacin se disminu#e la presencia de ribosomas simples # se detectancomplejos de sntesis de protenas en polirribosomas$ La sntesis inicial dependede ribosomas existentes! pero! se sintetizan nuevos ribosomas en unas 'orasdespus de 4ue se detecta la asociacin en polisomas$ Los AD@m 4ue son

traducidos inicialmente! existen en el embrin seco # maduro 1Cigura ,3. porejemplo! los 4ue codi"ican para las protenas ribosomales despus de su traduccinson remplazados por nuevos AD@Gs mensajeros 1Beltr(net al $! %2203$ Elalmacenamiento de los mensajeros en las semillas! apunta a 4ue se almacenanasociados con protenas en "orma de ribonucleoprotenas mensajeras 1D@Pm3 enel citoplasma! o bien almacenados en el nHcleo 1Peumans et al $! %2&23$

2


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Cigura ,$ Cormacin de AD@Gs mensajeros durante el desarrollo completo de lasemilla$ Peumans et al $! %2&2$

!.' E4 ,s-2@s

El estrs es todo a4uello 4ue no causa bienestar al organismo # es provocado por

diversos "actores! 4ue implica la respuesta de ste "rente a una amenaza ante lacual necesita ajustarse 1 on! %2203$ En plantas! usualmente es de"inido como el"actor 4ue ejerce una in"luencia de desventaja en stas$ El estrs puede ser bitico!impuesto por otros organismos! o abitico despertado por un exceso o de"icienciaen el ambiente "sico o 4umico 17uadro %3$


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7uadro %$ Cactores 4ue causan estrs$ Cuente= on! %220$

A* - 5o 7alorCro>e4ua

>al Airexidativo

AnaerbicoMetales pesadosLesionesCalta de nutrientesExceso de luz

B - 5o Patgenos8erbvoros

Las plantas "recuentemente se en"rentan al estrs 1condiciones externas 4uea"ectan adversamente el crecimiento! el desarrollo o la productividad3$ Qstedespierta un amplio rango de respuestas en la planta! desde una alteracin en laexpresin de genes # del metabolismo celular! 'asta cambios en las tasas decrecimiento # rendimiento de las cosec'as$ La duracin! severidad # el rango alcual el estrs es impuesto in"lu#en en la respuesta de la planta$ Algunascondiciones adversas en combinacin! pueden inducir una respuesta di"erente de

a4uella proveniente de un solo tipo de estrs$ 7aractersticas de la plantainclu#endo identidad de los rganos # tejidos! la edad del desarrollo # el genotipotambin in"lu#en en la respuesta al estrs$ Algunas respuestas claramente"avorecen la aclimatacin al estrs! mientras el papel "uncional de otras no es claro$+e tal manera! 4ue identi"icar cu(les respuestas promueven o mantienen elcrecimiento # desarrollo de las plantas durante este proceso! es de sumaimportancia para entender el proceso de respuesta al estrs$ >i se compara elrendimiento m(s alto con el rendimiento promedio! el impacto del medio ambientesobre la productividad 4ueda de mani"iesto$ >i este crecimiento m(ximo se asumecomo el 4ue representa el desarrollo de las plantas bajo condiciones ideales!entonces! las prdidas asociadas con el estrs bitico # abitico! reducen laproductividad media en ;0 a -& dependiendo del tipo de cultivo 1Polla et al $!%22-3.


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sido identi"icadas tambin en 'umanos! plantas # microorganismos$ 7uando lasclulas o pl(ntulas de "rijol de so#a son sometidas de )0K7 a ,/K7 1justo debajo dela temperatura letal3! la sntesis de AD@m # protenas! es suspendida mientras seestimula la transcripcin # traduccin del grupo de protenas 8sp$ Los transcritosnuevos de AD@m 'an sido detectados de * a 0 minutos despus del c'o4uecalrico 1>ac's # 8o! %2-;3$

Los rangos de los pesos moleculares de las 8sp se encuentran entre los %0 a %%/9ilodaltones 19+a3! las protenas de bajo peso molecular 18sp de %0


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estomas est(n parcial o totalmente cerrados # la irradiacin es alta. en lagerminacin! cuando el suelo es calentado por el sol. en rganos con capacidadreducida para la transpiracin$ Las plantas pueden ser aclimatadas al estrs porcalor! o ad4uirir termotolerancia si son sujetas a temperaturas altas no letales1permisivas3 por unas pocas 'oras antes de encontrar las condiciones de c'o4uecalrico$ El proceso de aclimatacin se cre involucra nuevas protenassintetizadas en respuesta a temperaturas altas permisivas! las cuales con"ierentermotolerancia al organismo$ Una planta aclimatada puede sobrevivir atemperaturas 4ue podran ser de otra "orma letales$ A pesar de esa capacidad 'a#por supuesto lmites de la cantidad de calor 4ue debe recibir la planta 1Bra#et al $!)///3$

La germinacin despus de la siembra a temperaturas entre )/ # )0K7 es de , a ;das 1con crecimiento de por lo menos 0 cm para poder emerger a la super"icie3! entanto 4ue al incrementar el rango 'asta */K7! germinan de ) a , das 17olbr# et al $!%2;%. +u""us # >laugt'er! %2-/. Parson! %2-%3$ >i bien muc'as semillas germinanen un amplio rango de temperaturas! usualmente no germinan por arriba o pordebajo de sus rangos espec"icos de especie$ La temperatura mnima de muc'asespecies es de / a 0K7! la m(xima es de ,0 a ,-K7! # la ptima! es de )0 a */K71Daven et al $! %2223$ Los tejidos 'idratados con crecimiento activo di"cilmentesobreviven a ,0 K7 1Faiz # eiger! %22-3$

Las plantas expuestas a calor excesivo ex'iben un grupo de caractersticas derespuesta celular # metablica! de las cuales muc'as est(n conservadas en todoslos organismos$ La caracterstica de la respuesta a calor es un decremento en lasntesis de protenas normales! acompa6ada por una transcripcin # traduccin

acelerada de las protenas de c'o4ue calrico 1conocidas como 8sp3! estarespuesta se observa cuando las plantas son expuestas a por lo menos 0K7 porencima de las condiciones ptimas de crecimiento$ En adicin a la alteracin de lospatrones de expresin gentica! el calor tambin a"ecta la estabilidad de lasmembranas! aumentando la "luidez de los lpidos de la membrana! lo cual secorrelaciona con la prdida de la "unciones biolgicas cuando se presenta cierta


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adaptacin "isiolgica al incremento de la temperatura$ +e igual manera se a"ectala "uerza de las interacciones electrost(ticas de las protenas con otroscomponentes solubles # con los lpidos 1Daisonet al $! %2-)3$ El incremento de latemperatura a"ecta la "otosntesis! por4ue se ven a"ectados los "otosistemas ? # ??de las membranas de los cloroplastos$ Existen plantas 4ue se 'an adaptado a lascondiciones ambientales de una radiacin solar intensa # 'an desarrollado algunasestructuras mor"olgicas # "uncionales 4ue les permiten proteccin contra un calorexcesivo 1BSjormanet al $! %2-/3$

En ese contexto de adversidades es 4ue las protenas 8sp se expresan!precediendo las posibilidades de aclimatacin! proteccin # sobrevivencia$ +e a'

la relevancia de estudiar el comportamiento de las mismas en uno de los eventoscrticos de la agricultura= la germinacin! asunto Htil desde el punto de vista de laproduccin # del cultivo del "rijol. # al mismo tiempo evento "isiolgico! celular #molecular! 4ue merece ser estudiado para la obtencin de conocimientos b(sicos!para su entendimiento # posterior manipulacin 1Bra#et al $! )///3$

La "uncin espec"ica de las di"erentes 8sp aun no se conoce! pero las 8sp #

algunas otras protenas actuan como c'aperonas! involucrando estabilizacin #doblado de protenas dependientes de AFP # ensamble de protenas oligomricas1Cigura 03$ Fambin! est(n involucradas en el transporte de polipptidos a travs delas membranas a compartimentos celulares 1Telc' # BroIn! %22;3$ Algunas de lasprincipales 8sp est(n conservadas entre todos los organismos vivos= eucariotes #procariotes! muc'as de esas protenas "uncionan como c'aperonas # est(ninvolucradas en el re


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8sp en plantas! 'a sido in"erido por estudios de complementacin en levaduras deSaccharomyces cerevisiae 1@overet al $! %22;3$

Cigura 0$ Cunciones de c'aperonas moleculares$ Cuente= Telc' # BroIn! %22;$

Los residuos 'idro"bicos de las cadenas de los polipptidos no doblados sonprotegidos por las 8sp del ambiente acuoso! de tal manera 4ue evitaninteracciones 'idro"bicas # "ormaciones agregativas no nativas de lospolipptidos$ Estudios in vitro de "racciones protecas enri4uecidas con 8sp%0muestran 4ue se comportan como protenas estabilizadoras no espec"icas! 4ue estabilizan otros polipptidos 4ue se degradan "(cilmente con el incremento de

calor$In vivo la unin de 8sp a pptidos particulares dentro de compartimentossubcelulares se cre es muc'o m(s espec"ica! tales uniones de 8sp


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Las condiciones 4ue inducen la tolerancia trmica en plantas correlacionanestrec'amente con las 4ue inducen la acumulacin de 8sp! pero tal correlacin noprove evidencia de 4ue las 8sp jueguen un papel esencial en la aclimatacin alestrs calrico$ La expresin del "actor activador 18s"3 de la transcripcin de las8sp! induce la sntesis constitutiva de las 8sp e incrementa la termotolerancia en

Arabidopsis 1Leeet al $! %2203$ Estudios en plantas de Arabidopsis 4ue conteniansecuencias antisentido de A+@! redujeron la sntesis de 8sp&/! mostrando 4ue lasaltas temperaturas extremas a las cuales las plantas podan sobrevivir! seredujeron en )K7 comparados con el control$ Mutantes crecieron a la temperaturaptima 1Lee # >c'oe""l! %22;3$

Las protenas de c'o4ue calrico 18sp3 se 'an denominado # agrupado en cincodistintas "amilias! con base a sus pesos moleculares 1Ellis! %22;3$

%3F3? 4 3 ;, 43s Hsp900 =900)990 D3>$ ?nclu#en protenas de bacterias!levaduras! tripanosomas! mam"eros # plantas! contienen dos dominiosconservados de unin a AFP$ >e pueden distinguir * sub"amilias con base a la'omologa de los dominios 4ue "lan4uean los dominios de unin a AFP$ Una de lassub"amilias es inducible por calor # estan involucradas en la termotolerancia$ Estasc'aperonas "uncionan en la desagregacin! m(s 4ue en prevenir la agregacin #doblados errneos durante la exposicin a altas temperaturas 1Easton et al $! )///3$

)3 F3? 4 3 ;, 43s Hsp%0 = &)%0 D3>$ Las 8sp2/ se asocian con receptores de'ormonas en clulas animales # podran estar involucradas en su activacin! pero!no 'a# in"ormacin e4uivalente en plantas$ >e encuentran en bacterias!compartimentos citopl(smicos! nucleares # de retculo endopl(smico de eucariotes!

donde "uncionan como c'aperonas moleculares de larga vida de interaccin$ Enlevaduras son esenciales para la sobrevivencia a las temperaturas altas 1Laevis etal $! %22;3$

*3 F3? 4 3 ;, 43s Hsp70 = )7 D3> $ >on esenciales para la "uncin celularnormal! algunos miembros de esta "amilia son expresados constitutivamente! otros

20


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son iducibles por "ro o calor! se localizan en muc'os compartimentos celulares!son c'aperonas dependientes de AFP involucradas en el doblado! ensamble #desensamble$ La localizacin nuclear de las 8sp&/ es redistribuda al citoplasmadurante la recuperacin por estrs$ La caracterstica m(s conservada entreorganismos es el dominio amino terminal de unin a AFP! la expresin de 8sp&/en plantas generalmente no es tan "uerte como en otros organismos$ +osmiembros distintos pero mu# 'omlogos por su igualdad en composicin deamino(cidos son= la 8sp&/ # la 8sc&/! 4ue residen respectivamente en elcitoplasma # nHcleo de las clulas de mam"eros 1Marimoto # Milas9i! %22/. 7ravenet al $!%22&3$

,3 F3? 4 3 ;, 43s Hsp 0 ='0$ 0 D3>$ Fambin se cre 4ue "uncionan comoc'aperonas moleculares! se presentan en el citoplasma bacteriano! matrizmitocondrial # en el estroma de cloroplastos$ >on abundantes aun en temperaturasnormales! su "uncin principal est( asociada al ensamble de protenas$ Presentanuna estructura oligomrica! ) 'ept(meros en "orma de anillo 4ue re4uieren de AFP$En plantas! la m(s estudiada es la c'aperonina ;/ de cloroplasto codi"icada ennHcleo! involucrada en el ensamble de la enzima Dubisco! pero! no se incrementaen respuesta al estrs por calor 1 o9ota et al $! )///3$

03F3? 4 3 ;, 43s p, 6, 3s s?Hsp =9'$"0 D3> $ Un aspecto Hnico de las plantas!es la presencia de sm8>Ps 1small 'eat s'oc9 proteins3 contienen por lo menos 0clases de estas protenas! mientras otros organismos tienen slo una clase desm8>P! las distintas clases se distribu#en dos en citoplasma! una en cloroplasto!una en retculo endopl(smico! una en mitocondria$ El extremo amino de ellas

comparte 'omologa con las protenas


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volumen de agua destilada$ >e 'izo un lavado "inal con agua destilada estril$Franscurridas las %) 'oras del proceso de germinacin en condiciones de'umedad! oscuridad # de temperatura constante! las semillas se sometieron a unincremento de temperatura de 0K7 por una 'ora! de tal manera 4ue el primertratamiento slo contaba con %) 'oras a )0K7$ El segundo tratamiento contaba conlas %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a */K7$ El tercer tratamiento contaba con las%) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a *0K7$ #! el Hltimo tratamiento contaba con las%) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a ,/K7! es decir! 4ue el segundo tratamiento "usometido 0 grados sobre los )0K7 iniciales por una 'ora! en tanto 4ue el Hltimotratamiento "ue sometido %0 grados sobre los )0K7 durante una 'ora$ 7omocontrol! se utilizaron semillas de "rijol de la misma variedad en estado de

dormancia! las cuales solo "ueron tratadas con agua # sin aplicar estrs calrico$ Atodas las semillas se les extrajeron los embriones! )/ gramos rindenaproximadamente -// miligramos de embriones en seco$ +espus se les 'izoextraccin # cuanti"icacin de AD@ # protenas solubles 1Brad"ord! %2&;3. todo elensa#o se realiz por triplicado! para veri"icar su reproducibilidad en el resultado$

&." E -2355 1 ;, ARN -o-34 5o1 T2 o4

>e tomaron en un tubo eppendor" de %$0 mL 0/ miligramos de embriones de "rijol!# se les adicion % mL de reactivo de Frizol 1 ibco BDL3! se mezcl # se incub por%/ minutos$ Luego se puso la mitad del 'omogeneizado en otro tubo eppendor"

estril$ +espus se le adicion a cada tubo )// L de cloro"ormo 1>igma3 "ro! se

taparon bien # se agitaron vigorosamente con la mano por %0 segundos # sedejaron reposar durante * minutos para posteriormente centri"ugar a %*!/// rpmpor %0 minutos$ La "ase acuosa e incolora 1parte de arriba3! se tom

cuidadosamente # se trans"iri a otro tubo eppendor" estril # se le adicion a cada

tubo 0// L de alco'ol isoproplico 1>igma3 "ro! se mezclaron ligeramente con la

mano # se dejaron reposar por )/ minutos a ,K7 en el re"rigerador! para luegocentri"ugar a %*!/// rpm por %/ minutos$ Posteriormente! se decant elsobrenadante # se lav el pellet de AD@ 1gel translHcido3! adicionando % mL 1por

2


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cada tubo3 de etanol al &0 en aguae mezcl un poco #nuevamente se centri"ug a %*!/// rpm por %/ minutos$ Por Hltimo! se decant elsobrenadante # el remanente acuoso se retir con papel absorbente! luego se dejel tubo abierto para secar un poco al aire durante 0 minutos # despus se

resuspendi el AD@ de cada! tubo en 0/ L de agua tratada con +EP7 1Apndice3$

>e cuanti"ic el AD@ en el espectro"otmetro # despus se mantuvo a


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a partir de 4ue una densidad ptica de %$/ es igual a ,/ g de AD@ por mililitro

1/$%% mM3$ Por ejemplo! si la densidad ptica "ue de /$)0! 'aciendo una regla de

tres dara igual a %/ g por los 0 L 4ue se aplicaron de AD@! 'abiendo as una

concentracin "inal de ) g de AD@ por % microlitro de muestra$ 7adadeterminacin se 'izo por triplicado$ Para la concentracin de A+@c # oligos! sta

se calcul a partir de 4ue una densidad ptica de %$/ es igual a 0/ g de A+@ por

mililitro 1/$%0 mM3 # de **g de oligos por mililitro 1/$%/ mM3 respectivamente

1+avis et al $! %2-;3$

Por otra parte! la cantidad de protenas se midi de manera colorimtrica en el

espectro 1Brad"ord! %2&;3! donde se adicionaron en varios tubos eppendor"cantidades de % a 0 microlitros de muestra ajustando a un volumen de -// L con

solucin de @a7l %0/ mM 1Apndice3! despus se a6adieron )// L de solucin de

trabajo Brad"ord 1Apndice3$ >e mezclaron los tubos en el vortex # se dejaronreposar por * minutos a temperatura ambiente$ +espus se trans"iri a una cubetade pl(stico # se le# la absorbancia a una densidad ptica de 020 nanmetros enla regin visible$ El blanco para ajustar el espectro"otmetro a cero! contena -//

L de @a7l %0/ mM )// L de solucin de trabajo Brad"ord$ La cantidad deprotena se calcula! interpolando la densidad ptica obtenida en una curva patrnde protena o sacando la regresin lineal # sustitu#endo el valor en la ecuacin deuna recta 1Apndice3$ 7ada determinacin se 'izo por triplicado$

&.7 E4,5-2o %/ V1Apndice3$ >e puso la solucin a calentar en el 'orno de microondas # se dej a'!'asta 4ue desaparecieron los grumos "ormados. de vez en cuando se sac elmatraz # se agit para luego observar si #a se 'aba disuelto completamente laagarosa$ +espus! se dej en"riar # cuando lleg a una temperatura de ;/K7! se le

26


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adicion 1en una campana de extraccin3 )$& mL de "ormalde'ido al *& # 0l de

bromuro de etidio %/ mgJmL 1apndice3$ >e mezcl # se vaci el contenido a unac(mara de electro"oresis sumergida previamente armada con su peine! # se dejgeli"icar la solucin de agarosa$ 7ada muestra se prepar con ) microgramos de la

muestra! e4uivalentes a 0 l de AD@ total diludo! m(s %0l de bu""er de muestra

para AD@ 1Apndice3! se calentaron a 20K7 por * minutos$ +espus de 4ue seretir el peine del gel! se carg cada pozo con la muestra # se puso bu""er decorrida M P> %V para la electro"oresis! luego se le aplic una corriente constantede %// olts por */ minutos$ Una vez terminada la electro"oresis! se puso el gel enel transiluminador # se encendi la l(mpara de luz ultravioleta para visualizar lasbandas 1+avis et al $! %2-;3$

&. RT)PCR =R, ,2s, T231s52 p-3s,$Po4(?,23s, C 3 1 R,35- o1>

7on el AD@ obtenido! se realiz DFuper>criptFM netep DF


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7uadro *$ 7iclos de temperatura # tiempo para la DF


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&.90 E4,5-2oe 'icieron electro"oresis para la separacin de protenas bas(ndose en su pesomolecular! en condiciones desnaturalizantes # reductoras 1Laemmli! %2&/3$ >e

utiliz una minic(mara de electro"oresis dual Mini protean ?? de Bioe cargaron los pozos con la muestra de inters!preparada en bu""er de muestra para protena 1Apndice3 # luego se a6adilentamente bu""er de corrida %V sobre los pozos cargados con la muestra! # secorri el gel a %// olts constantes por aproximadamente ) 'oras usando una

"uente de poder PoIer Pac de Bio


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7uadro ,$ 7antidades para preparar ) minigeles de poliacrilamida

S!&'*,!ne% Ge& %e#+r+1!r+& /5 8

Ge& *!n*en$r+1!r +& 9.) 8

Acr la- (a & !acr la- (a = 090. >Tr ! Cl . M, '; .Tr ! Cl 0. M, '; 6.; 2O & (%! . " r (%! la(aSDS al 0 4SA al 0 T%-%(

.00 -L2. 0 -L

0 -L. 0 -L

200L

0 L

0 L

0.60 -L0 -L

.00 -L2. 2 -L

0 L

2 L

LLaemmli U$ O$ %2&/$

&.99 T 15 1 ;, *31;3s ;, p2o-,:13s 5o1 5o4o231-, 3 64 ;, Coo?3ss ,

Esta tcnica se utiliz para visualizar las protenas separadas despus de laelectro"oresis! donde el azul de 7oomassie se une a las protenas de manera no

espec"ica # el lmite de deteccin es de /$* g a %g por banda de protena$ Para

realizar esta tincin! primero se coloc el gel de poliacrilamida en un recipiente depl(stico! al cual se le adicion solucin "ijadora para tincin de 7oomassie1Apndice3 'asta cubrir totalmente el gel # se agit suavemente por %0 minutos enun orbital s'a9er$ Luego se decant la solucin "ijadora # se cubri el gel consolucin de tincin r(pida de 7oomassie 1Apndice3 # se agit suavemente por )'oras o 'asta observar las bandas te6idas en el s'a9er$ +espus se tir la solucinde tincin # se cubri el gel con solucin deste6idora de (cido actico al %/ 1Apndice3$ >e Agit suavemente! 'asta 4ue dio un "ondo claro$ +espus se

analiz el gel en un "otodocumentador! para realizar densitometra o c(lculo depesos moleculares de las bandas de inters o simplemente escanear el gel puestoentre dos acetatos para obtener la imagen # as analizarla con un so"tIareapropiado$ Para almacenar el gel! ste se sec en papel celo"(n a temperaturaambiente 1Bollag # Edelstein! %22%3$

0


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&.9! S,53;o ;, ,4,s ;, po4 352 43? ;3

Para secar los geles para su conservacin prolongada! se llevaron a cabo lossiguientes pasos= primero! el gel # el papel de celo"(n dulce se embebieron por */

minutos! en un recipiente de vidrio 4ue contena solucin de secado para geles1Apndice3$ Luego se coloc el gel en medio de dos trozos de papel celo"(n"ormando un emparedado$ Posteriormente! sto se puso sobre una placa de vidrio!# se estir. luego se coloc encima un marco de pl(stico # se sujet ste conpinzas de clip! evitando la "ormacin de burbujas$ El gel se dej secar atemperatura ambiente por * das 1Bollag # Edelstein! %22%3$

&.9& E4,5-2o-231se utiliz un aparato trans blot para realizar latrans"erencia en semiseco 1modelo Frans Blot >em# +r# marca Bio


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1Apndice3 todo el papel o una sola tira 4ue correspondi a un solo carril$ Para ello!se aplica en un recipiente de pl(stico un poco de esta solucin al papel # se agitacon la mano 'asta visualizar las bandas de protena$ Para remover el colorante!slo 'a# 4ue adicionar agua destilada # poner en agitacin$ +espus se determinla presencia de la protena 8sp&/ mediante la reactividad del anticuerpomonoclonal anti


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IV. RESULTADOS

Una vez extradas las protenas de los embriones en dormancia # de los sometidos

a estrs calrico 1cuadro 03! se separaron por electro"oresis las bandas de protena1"igura &3 se les determin el peso molecular 1"igura -3. # se analizaron pordensitometra para su cuanti"icacin 1"igura 23$

Feniendo el antecedente de 'aber identi"icado a la protena 8sp;/ en embrionesde "rijol sometidos a varias temperaturas 1"igura %/3$ Las bandas resueltas porelectro"oresis! se electrotrans"irieron a membranas de nitrocelulosa 1"igura %%3!para identi"icar la banda de protena 8sp&/ por Testern blot 1"igura %)3! a la cualse le 'izo an(lisis densitomtrico 1"igura %*3$

Fambin se extrajo # veri"ic por electro"oresis! la integridad del AD@ total de losembriones en dormancia # de los germinados sometidos a estrs calrico 1"igura%,3$ 7on el AD@ obtenido se realiz DF


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F 1 ra . El%c r":"r%! ! (% 'r" % na! %n 1%l (% '"l acr la- (a al 2

Marca("r%! 'r% %? ("! (% '%!" -"l%c lar =carr l * >, c"n r"l =carr l 2>, %-&r "n%!!"-% ("! a9 2 C =carr l >, 0 C =carr l >, C =carr l > * 0 C =carr l 6>.

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F 1 ra 0. A "ra( "1ra: a (% ;!'60 %n %-&r "n%! (% :r "l a $ar a!%-'%ra ra!

T%! 1" = >, C =2>, C = >, C = >, 6 C = >, C =6>, C = >, C = > * 0 C = >. S n - %! ra = 0>.

C+rr,&: / 5 6 9 ) < /0


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C+rr,&: / 5 6


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ADN* 1e %# 0


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F 1 ra . D% %r- nac )n (%l '%!" -"l%c lar %n 'ar%! (% &a!%! (%lADNc (% ;!' 0

Marca("r%! (% '%!" n cl%" ( c" 'ara ADN =carr l >, ADNc (% ;!' 0 (%9ca&ra =carr l 2>, c%&a(a =carr l >, n"'al =carr l > * :r "l =carr l >.

V. DISCUSIN

C+rr,&: / 5 6 9 )

660 #

/ 60 #


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El objetivo de este trabajo "ue determinar la expresin del AD@ mensajero # de laprotena 8sp&/ en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos aestrs calrico! as como generar datos de las protenas 8sp&/ # del AD@mensajero de "rijol bajo condiciones de semillas en latencia # germinacin! paraconocer sus caractersticas moleculares # poder asociar sus "unciones b(sicas enlas clulas vegetales u otros modelos biolgicos$ El en"o4ue se centr en lasetapas iniciales de la germinacin en "rijol! en esta "ase del ciclo biolgico no seencontraron reportes de estudios de protenas de estrs calrico! en tanto 4ue enotros modelos! sobre todo de microorganismos # animales s abundan 1Lu"t # +ix!%2223$

Al momento de comenzar la germinacin se inicio el "enmeno de 'idratacin #vacuolizacin celular! lo cual "ue in"luido por accin de la temperatura! #a 4ue seobserv 4ue 'ubo una disminucin de la concentracin de protenas a los )0 K7!en tanto 4ue a los */ K7 se presento el valor m(s alto en condiciones degerminacin! a partir de esa temperatura disminu# el rendimiento en cuanto aconcentracin de proteinas a los *0 K7 # aumento nuevamente a los ,/ K7 1cuadro03$ Las concentraciones de los extractos de proteinas de embriones permitieron

comparar los rendimientos # de"inir el e"ecto del estrs calrico de cada una de lastemperaturas aplicadas$ Los resultados permitieron comprobar 4ue la sntesis deprotenas totales se incrementa por el estrs de acuerdo con lo propuesto porLind4uist # 7raig %2--! sin embargo un dato importante es el rendimiento deprotenas totales en los embriones en dormancia! 4ue se 'a reportando como elvalor m(s alto! ello es importante en trminos de 4ue en latencia se tiene toda lama4uinaria protica para iniciar el proceso de germinacin # generacin de la

nueva planta 1Beltr(n et al$! %2203$

La importancia de la concentracin de los extractos de protenas explican lasntesis de las mismas en los tratamientos del presente trabajo$ Es importantecomentar 4ue el rendimiento de protenas es alto! si se considera el rendimiento4ue produce un cultivo de clulas animales! por ejemplo= 8eLa$ La cantidad de


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protenas permiti estandarizar las cantidades aplicadas para separar porelectro"oresis # monitorear 8sp&/ por Testern blot$

Al separar las protenas por electro"oresis se observ un correspondencia con los

rendimientos de los extractos! es decir! 4ue se corri la misma cantidad de protenapara cada muestra en cada carril 1"igura &3! sin embargo se observ un incrementoen la concentracin de alguna bandas! indicando el incremento a los */ K7! con undescenso a los *0 K7 # nuevamente se incrementaron a los ,/ K7! sobre todo lasprotenas entre los pesos de 0/ # 2/ 9+a! 4ue se pueden apreciar de maneravisible en el gel te6ido con azul de 7oomassie$ +atos 4ue corresponden con lopropuesto en >o#a por! >ac's # 8o! %2-;$

+espus de te6ido el gel con las protenas separadas por peso molecular secalcul el peso molecular aproximado de las mismas! los datos permitieron concluir4ue la concentracin de poliacrilamida al %) "ue su"iciente para separar protenasentre los )/ # %// 9+a sin perder resolucin! # 4ue los marcadores estandarizadosde peso molecular sirvieron adecuadamente para calcular el peso de las protenasde peso desconocido! mediante una regresion lineal 4ue procesa autom(ticamenteel so"Iare Ruantit# ne empleado 1"igura -3$

El an(lisis densitomtrico de las bandas de protena observados en la "igura 2!demuestraron 4ue al incrementar la temperatura de las muestras 1carriles * a ;."igura 23! se increment la densidad de las bandas de protena # por tanto de suconcentracin individual en el gel 4ue las separ! demostrando de manera clara ele"ecto del estrs en los embriones germinados sobre la expresin de protenasasociadas a la germinacin! #a 4ue 'a# ma#or sntesis de algunas protenas conrespecto al control 1carril ). "igura 23$ Por ejemplo! en la banda de peso aproximado

a los &/ 9+a! se observ una densidad promedio en embriones en dormancia de%%$)% unidades! alcanzando un valor de ),$&& unidades a los ,/ K7! es decir! unincremento de m(s del doble! en donde evidentemente! se demuestr el impactodel "actor calor sobre la sntesis de protenas # por tanto sirvio para validar elmodelo biolgico de embriones$ Al nivel de protenas cercanas a los 2/ 9+a en


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embriones en dormancia la densidad "ue de %0$%& unidades contra )2$%) deembriones a ,/ K7 1carril ;. "igura -3$ As mismo bandas cercanas a los ;/ 9+a$presentaron valores de %;$;& unidades 1carril ). "igura -3 en embriones endormancia! contra *%$** a los ,/ K7 1carril ;. "igura -3$ Por otro lado! en bandascercanas a los ,/ 9+a$ el valor "ue de %;$2/ unidades de densidad en losembriones en dormancia 1carril ). "igura 23 4ue aumentaron 'asta ,;$,, 1carril ;."igura 23 a los ,/ K7$ Esto es interesante! #a 4ue todas estas bandas coinciden conlas principales "amilias de protenas de c'o4ue calrico 1 os'ida et al $! %2223.siendo probable 4ue tambin sean las mismas$ Por otro lado! se observ unincremento de embriones en dormancia a )0 # */ K7! con un decremento a los *0K7 # una recuperacin del incremento de las densidades a ,/ K7! lo cual conserva

el mismo nivel de comportamiento para todas las protenas asociadas con las"amilias de 8sp 1 os'ida et al $! %2223$

El an(lisis de los geles de poliacrilamida a nivel de bandas te6idas! peso molecular# densitometra permiti realizar la siguiente etapa! en la cual se se explor laexpresin de la protena 8sp&/ por Testern blot con el antecedente de 4uepreviamente se realizaron experimentos para monitorear la protena 8sp;/ 1"igura%/3$ La e"iciencia del procedimiento de electrotrans"erencia de las protenas del gela la membrana de nitrocelulosa! "ue evidente al ser te6ido con verde r(pido elpapel 1"igura %%3$ La deteccin de 8sp&/ como muestra la "igura %) de"ini laexpresin de la 8sp&/ 1Telc'! %22)3 # otra protena 4ue puede ser una iso"ormade 8sp&/ o la "orma constitutiva de sta! as como tambin una protena norelacionada con 8sp&/. la cual dio reactividad cruzada con el anticuerpo empleado$Fal reconocimiento de ambas protenas se present en los embriones endormancia! como en todos los tratamientos. lo cual probablemente indica 4ue el

anticuerpo reconoce estructuras o epitopes conservados de 8sp&/ 18uang et al $!)///3$ 7abe mencionar 4ue no existen anticuerpos monoclonales espec"icos paraesta protena en plantas de manera comercial # muc'o menos para "rijol! por ello elantecedente m(s directo es 4ue la protena 8sp&/ es una de las m(s conservadaentre los organismos 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ >in embargo! es interesante el

0


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'ec'o de 4ue no 'ubo reactividad cruzada con otros antgenos de la muestra! #a4ue "ueron las Hnicas bandas detectadas$ Un aspecto importante es 4ue ladeteccin de las bandas de 8sp&/ en el Testern blot re4uiri de tiempos largos deexposicin del extracto proteco con el anticuerpo anti


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un control de embriones! en el cual se ampli"ic con primerGs espec"icos! el AD@mde una de las protenas >m 4ue participan en el procesamiento del AD@ 1U% &/9+a$3 4ue es conservado entre los genomas eucariotes 1"igura %0 iz4uierda3$ En elcual se obtuvo el A+@ complementario a partir de AD@ resuspendido en aguatratada con dietil pirocarbonato 1carriles ) # ;. "igura %03 # en "ormamida 1carril 0."igura %03$ >e observo 4ue se obtuvo mejor A+@c a partir de AD@ en aguae observa4ue en el control 1carril %. "igura %;3 # en las dem(s temperaturas 1carriles ) a 03!se obtuvo una sola banda de A+@c de 8sp&/. lo 4ue indica la pureza del sistema!#a 4ue no se observa otra banda! ni degradacin alguna del ampli"icado. #a 4ueesta reportado 4ue 'a# polimor"ismo del gene de 8sp&/ en otras especies1Cavatier et al$! %22&3$ Adem(s 'ubo di"erencias visibles en sus concentraciones #a4ue tambin se observ 4ue a temperaturas de */ # *0 K7 1carriles * # ,. "igura%;3 se obtuvo la ma#or densidad! lo cual corresponde con los resultados obtenidosen el Testern blot! correlacionando las temperaturas tanto en la expresin del genecomo del producto 1"igura %*3$

Se realiz una electro"oresis para calcular el tama6o del "ragmento ampli"icado1"igura %-3$ >e calcul el peso molecular del "ragmento obtenido en base amarcadores moleculares de peso nucleotdico conocido 1carril %. "igura %-3 # seobserv 4ue en todos los A+@c de 8sp&/ de "rijol! tenia un peso aproximado de**/ pb 1carril 0. "igura %-3$ >e tuvo como control! un producto ampli"icado con los

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mismos primerGs utilizados de 8sp&/! de A+@c proveniente de clulas de ovario decabra. # el cual present un tama6o aproximado de %&*/ pb 1carril ). "igura %-3$Fambin se puso un ampli"icado de 8sp&/ de cebada 1carril *. "igura %-3 # nopal1carril ,. "igura %-3$ Esto es interesante! #a 4ue los primerGs ampli"icaron AD@mensajeros para 8sp&/ de varias "uentes! lo cual indica 4ue es un gene mu#conservado en la escala "ilogentica$

Aun4ue en revisiones e"ectuadas 'asta la "ec'a! no se 'a reportado estudiossimilares! autores mencionan la expresin de protenas 8sp 4ue se expusieron adi"erentes tipos de estrs 1Milioniet al. )//%3. donde se encontr 4ue en lneascelulares de zana'oria la 8sp2/ se expresaba constitutivamente a )0 Y7 # 4ue a

*- Y7 la induccin aumentaba con"orme se acrecentaba el tiempo de exposicin enuna! dos # tres 'oras! cesando cuando se elevaba la temperatura a ,/ Y7$ Fambin'a# datos en la literatura! de 4ue en los blot de protenas en tejidos de 'ojas deespinaca mostraban niveles de protenas 8sp&/ relativamente constantes conrespecto a la actividad metablica durante el da 1Liet al. )///3$

Por otro lado! se encontr 4ue una lnea de maz resistente! PBL %*/,! puedeestar involucrada en el desarrollo de resistencia bajo condiciones de campo a la

se4ua # al calor observadas en 8sp de ,0 9+a$ 1B'adula et al $! %22&3$ 8a#antecedentes 4ue para para inducir embriognesis en polen de !rassica napus esnecesario aplicar estrs calrico severo # corto para iniciar la sntesis de +@A enclulas vegetales para complementar su ciclo celular # posterior divisin 1Binarovaet al $! %22&3$ se 'a demostrado previamente 4ue en 'ojas de "rijol con di"erentesgrados de maduracin! la 8sp&/ localizada en la matriz mitocondrial declinaba susniveles de 8sp! sugiriendo 4ue esta reduccin de niveles de 8sp&/ limitaba la

importacin de protenas mitocondriales en tejidos vegetales maduros 1Mooreetal $!%22&3$

+e estas revisiones e"ectuadas # de otras mencionadas anteriormente! se puededecir 4ue es necesario analizar # pro"undizar en los estudios de 8spXs para unmejor entendimiento de cmo las protenas de c'o4ue calrico actuaran no


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A431 J. T o2p, R. =9% >. Production o" Antibodies$ Production o" antibodies$Dadiolabelling Fec'ni4ues$ Pol#acr#lamide gel tec'ni4ues! A""init# 7'romatograp'#and immunoprecipitation! ?mmunoc#toc'emistr#$ ?n ?mmunoc#toc'emistr# inpractice$ 7'ap$ )!0!&!%/!%)$ Ed Bla9Iell >cienti"ic Publication $ x"or UO$ pp$ */eed dormanc# and germination$ F'e Arabidopsis boo9$ American societ# o" Plants Biologists$ pp$ %. >eed germination and dormanc#$ F'e Plant 7ell! vol$ 2= %/00. A s'ort severe'eat s'oc9 is re4uired to induce embr#ogenesis in late bicellular pollen o" !rassicanapus L$ >exual Plant Deproduction$ %/1,3= )//.Protein Met'ods$ A 5'on Tile# W >ons! ?nc$! @eI#or9$B +o2?31 O.# B3; ,2 M.# 31; A2?o1;# P. =9% 0>. Desponse and adaptation o"p'otosint'esis to 'ig' temperatures$ ?n= Adaptations o" Plants to Tater and 8ig'Femperature >tress$! @$ 7$ Furner and P$ 5$ Oramer! eds$! Tile#! @eI or9! pp$)**Puri"ication and c'aracterization o" c'aperonin ;/ and 'eatPP$ Mar#land U>A$ 7'apter ))= %%0-


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B6.Blac9 globeA$ pp$ &&%. A novel sub"amil# o" 8sp &/s in t'eendoplasmic reticulum$ Frends Bioc'emestr# >cience$! vol$ ))= %**. Membrane integrit# in an'#drobiotic organisms=toIard a mec'anism "or stabilizing dr# seeds$ ?n Tater and Li"e! $@$ >omero! 7$B$smond! and 7$L$ Bolis! eds 1Berlin= >pringer< erlag3$ pp$ -&. Molecular biolog# o" stress responses in ?ndia$7ell >tress W 7'aperons$ *1%3= % < 0$C622 , R. =9%%7>. >tresstress W 7'aperons$)1*3= )%/ < )%%$C(?*346 N. C 2 s- so1 I. =9%%0>. Environmental e""ects on t'ermoregulationand nutrition o" 'orses$ et$ 7lin$ @$ Am$tress W 7'aperons$ 01,3= )&; < )2/ $E 2,1s 3. Despiration and mitoc'ondrial biognesis ingerminating embr#os o" maize$ Plant P'#siol$! vol$ 2*= )20. +iscover# o" molecular c'aperones$ 7ell >tress W 7'aperons$ %1*3= %00 < %;/$F3 3- ,2 F.# Bo21?31 L.# H -oQ,2 L.# G 1- ,2 E. 31; Po443 B. =9%%7> ariationin 'sp gene expression and 8sp pol#morp'ism= do t'e# contribute to di""erentialdisease susceptibilit# and stress toleranceN$ 7ell >tress W 7'aperons$ )1*3= %,% < %00$F2(;?31 J. =!009>. Colding o" neIl# translated proteins in vivo = F'e role o"molecular c'aperones$ Annu$ DevieIs Bioc'emistr#$ &/= ;/*


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F6+ Q323 T.# N3?*323 E.# 3?3 s .# Go-o D. 31; N3 -o S. =!00!>. >torageproteins$ F'e Arabidopsis boo9$ American >ociet# o" Plants Biologists$ pp$ %. 8eat stress as it a""ects animal production$ 5ournal o" Animal>cience 0)1%3= %;,. A stud# o" solar radiationas related to p'#siological and production responses o" lactating 8olstein and5erse# coIs$ 5ounal +air# >cience$ ,*= %)00$H32-4 F. =9%% > Molecular c'aperones in cellular protein "olding$ @ature$ ol$ *-%=0&%


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L p, T. =9%%9>. Desistencia de las plantas a= se4ua! salinidad! "ro! calor!insectos! contaminacin # en"ermedades$Devista Mxico! pp$ )/P&/ in transgenic tobacco$ >ession @umber 0)$ >$ name= Mitoc'ondriaand respiration$ Aspb$ Abstract @umber= %/)%$N3?*323 E.# N3 -o S. 31; M5Coo2- P. =9%%!>. A Mutant o" Arabidopsis Iic' isde"ective in seed development storage protein accumulation is a neI abi* allele$F'e Plant 5ournal$ )1,3= ,*0.F'e 8s" Iorld= classi"ication and properties o" plant 'eat stress transcription "actors$7ell >tress W 7'aperons$ %1,3= )%0 < ))*$O2-: 8. =9%% >. El "rijol en el estado de acatecas$ obierno del Estado deacatecas$ acatecas! Mxico$ p$%-%P32so1 D. =9% 9>. Crijol # c'c'aro$ En manuales para la educacin agropecuaria$

Area= produccin vegetal$ >EPJFrillas Mxico +$ C$ %)$ pp$ %%. >ome aspects o" t'e s#nt'esis o"longtress W7'aperones$ )1)3= &-.>tress s#mposium in 5o'annesburg=plants versus 'umans$ 7ell >tress W 7'aperones$ *1*3= %,*# Understending plant response to stress and breeding "or

improved stress resistance : t'e generation ap$ ?n Plant Desponses to 7elluar


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+e'#dratation +uring Enviromental >tress! Fimot# 5$ 7lose and Elizabet' A$ Bra#!eds! A>PP$ Mar#land! U>A! pp$ )),. 8eatA$ 7'$ )0= &)0. Electrop'oretic trans"er o" proteins"rom pol#acrilamide gel to nitrocelulose s'eets= Procedure and some Aplications$Proccedings @ational Academ# >cience$ U>A$ ol$ -/= ,*0/


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832 3s A.# G2313;os J.# M32-:1, L.# G ?, C.# 6 3 J.# S34 3;o N.#H,21K1;, # P.# H,s 6 o R.# Ro;2: 6, R.# G3?*o3 R.# A45o5,2 8. 31; A213:8. =!000>.Lac9 o" association betIeen t'e pol#morp'ism at t'e 'eatLE3 in t'e Mexican Mestizopopulation$ enes and ?mmunit#$ %1;3= *;&tress W 7'aperons$%1)3= %/2 < %%0$

o o-3 S.# H 23-3 D.# M 1o-3 S.# H 3s (3?3 T.# 62 ?o-o M.# 313 H.# 623T. 31; 6*o-3 H. =!000>. Autoantibodies against c'aperonin 77F in 'uman seraIit' r'eumatic autoimmune diseases= comparison Iit' antibodies against ot'er8sp;/ "amil# proteins$ 7ell >tress W 7'aperons$ 01,3= **& < *,;$

os ;3 M.# E1;o T# I-o .# Hoso 3Q3 N. 31; N3 3-3 . =9%%%>. +#namics andregulation o" t'e stress response= meeting report on t'e stress response andmolecular c'aperones "rom O#oto$ 7ell >tress W 7'aperons$ ,1%3= ;; < &,$

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AP NDICE

So465 1 ;, T2 s)C4 '00 ?M# pH 7."

Pesar ;$/0 g de Fris base 1/$0 M3 # disolver en 0/ mL de agua! luego ajustar a p8de &$, con (cido clor'drico concentrado # a"orar a %// mL con agua destilada$

Almacenar a ,K7$

B6


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/ 0/ %// %0/ )// )0/

/$/

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/ 0/ %// %0/ )// )0/

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C7RVA 4ATRON DE ALB7MINA SERICA BOVINA

L Z A U B [ V

Param alor sd

A /$%;2) /$//0*)

B /$/%,&, /$//-%

D Z /$222)

\///% )$))-%)E


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So465 1 ;, *2o?62o ;, ,- ; o 90 ? /?4

Adicionar /$% g de bromuro de etidio 1cancergeno3 a %/ mL de agua destilada!

mezclar bien # 'acer alicuotas de % mL en tubos ependor"" 1cubiertos con papelaluminio3$ Almacenar una alicuota 1en uso3 a ,K7 # el resto a


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Mezclar *$/* g de tris base 1)0 mM3! %,$, g de glicina 1%2) mM3! )// mL demetanol 1)/ 3 # a"orar a % litro con agua destilada$ +ebe dar aproximadamente unp8 de -$*$ Almacenar a temperatura ambiente$So465 1 ;, ,2;, 2Kp ;o =F3s- G2,,1>Mezclar /$% g de colorante "ast green 1/$% 3! 0 mL de (cido actico 10 3! %/ mLde metanol 1%/ 3 # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a temperaturaambiente en "rasco (mbar$

So465 1 ;, !HPO" 9 M = ;, N3 !HPO">

22$*& g de "os"ato de potasio dib(sico 1P$M$Z %,%$2;3 se disolvieron poco a pocoen agua destilada # se a"or a &// mL$ 7alentar la solucin un poco para disolver

los grumos$

So465 1 ;, H !PO" 9 M = ;, N3H !PO">

)&$)) g de "os"ato de potasio monob(sico 1P$M$Z %*;$%3 se disolvieron poco a pocoen agua destilada # se a"or a )// mL$ 7alentar la solucin un poco para disolverlos grumos$

So465 1 5o15,1-23;3 ;, PBS '0 X

A &// mL de solucin de O)8P , % M! ajustar el p8 a &$, con aproximadamente%0/ mL de solucin de O8)P , % M$ Almacenar inde"inidamente a temperaturaambiente$

So465 1 ;, PBS 9 X

Mezclar )/ mL de la solucin concentrada de PB> 0/ V! m(s &$02 g de cloruro desodio # a"orar a % litro con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a

temperatura ambiente$

So465 1 ;, PBS)4,5 ,

Mezclar * g de lec'e descremada 1* 3 con calcio 1marca >velt# de @estle3 en %//mL de solucin de PB> % V$ Preparar en "resco$

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So465 1 ;, PBS)TQ,,1

Mezclar % mL de FIeen % V$ Almacenarinde"inidamente a temperatura ambiente$

GLOSARIOAn %! (% Cr ! " 3. C.c (" (%!"8 rr &"n cl3 c" ADNc (" (%!"8 rr &"n cl3 c" c"-'l%-%n ar " (% ("&l% ca(%na ='r"( c " (%l 4CR> ADN5c (" r &"n cl3 c" -%n!a %r" ARN?B"$ n% !%r - al& - n% =al& - na !3r ca &"$ na> BSACa l"1" C3-.D%n! (a( )' ca D. O.D (%"8 n cl3" ("! ;NTPD % l ' r"car&"na " DEPCGra("! c%n 1ra("! CGra-"!Gra$%(a(%! g ;%a !5"c< c"1na %! ='r" % na (% c5"+ % cal)r c" c"n! $a> Hs5;%a !5"c< 'r" % n! ='r" % na! (% c5"+ % cal)r c" ) 3r- c"> Hsp;%a !5"c< :ac "r =:ac "r ac $a("r (% la ran!cr 'c )n (% la! ;!'> Hs< ;*(r"c5l"r (% ac ( = c (" cl"r5 (r c"> HC4l"&a!%! *l"(al "n%! D3l"1ra-"!l)-% r"! ?

L r"! LM% r"! ?M cr"1ra-"! M cr"l r"! LM cr"-"lar MM l 1ra-"! ?M l l r"! ?LM l -% r"! ??M l -"lar ?MM n "! ? 1M"lar MM"r'5"l n" 'r"'an%! l:"n c ac ( = c (" 'r"'an"! l:)n c" -"r:"l n"> MOPS Nan)-% r"! 1? N"r-al N N -%r" No.4ar%! (% &a!%! p*4%r! l:a " (% a-"n " PSA4%!" -"l%c lar P. M.4"l*-%ra!% c5a n r%ac "n =r%acc )n %n ca(%na (% la '"l -%ra!a> PCR4"rc %n " VR%$%r!% ran!cr ' a!%J4"l*-%ra!% c5a n r%ac "n =R%$%r!a ran!cr ' a!a 4CR>RT)PCRR%$"l c "n%! '"r - n " 2p?R &"n cl%"'r" % na! -%n!a %ra! RNP?

0


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S%1 n("! sS-all 5%a !5"c< 'r" % n! ='r" % na! (% c5"+ % cal)r c" '%+ %?a!> s?HSPS"( - ( "(%c l ! l:a % =( "(%c l ! l:a " (% !"( "> SDS7l ra$ "l% a U8V%r! ! =c"n ra> sV"l -%n 8o4

tesis agronomía 27 septiembre

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