temajs aisa

Javier Seorns

Anlisis Instrumental y Sensorial de Alimentos

Grado en Nutricin Humana y Diettica 1

Tema 2. La preparacin de la muestra

F. Javier Seorns RodrguezSeccin Departamental de Ciencias de la AlimentacinM - 08 despacho 502 E-mail: [email protected]

Pgina web: www.uam.es/javier.senorans

Asignatura de Anlisis Instrumental y Sensorial de AlimentosGrado en Nutricin Humana y Diettica

Tema 2. La preparacin de la muestraAislamiento y concentracin de compuestos en alimentos. Tcnicas de muestreo de la fase vapor: el anlisis del espacio de cabeza (mtodo esttico y mtodo dinmico). Tcnicas actuales de concentracin del espacio de cabeza.La microextraccin en fase slida (SPME).La extraccin en fase slida (SPE). La extraccin supercrtica analtica (SFE).La extraccin acelerada con disolventes (ASE). La extraccin asistida por microondas (MAE). Aplicaciones al anlisis del aroma de alimentos y al anlisis de residuos.

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La mayora de las muestras de alimentos que se analizan por mtodos instrumentales de separacin son demasiado complejas, estn demasiado diluidas o son incompatibles con el sistema cromatogrfico, lo que impide su introduccin directa

Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra

se necesita preparar la muestra antes de su introduccin en el sistema,mediante fraccionamiento, extraccin o pre-separacin.

Consecuencia:

PREPARACINDE MUESTRA

PROBLEMA PREPARACIN DE MUESTRA

CROMATOGRAFA DE GASES CON COLUMNAS CAPILARES

ALTA RESOLUCIN

MUESTRA GC

MUESTRA GC

Nuevas tcnicas de preparacin de la muestra

Javier Seorns



Problemas actuales de mtodos oficiales y tradicionales:

lentitud y laboriosidad empleo de grandes cantidades de disolventes txicos

poca selectividad poco rendimiento

Mtodos tradicionales de preparacin de la muestra:-ms de 2/3 del tiempo del analista-responsable de al menos 1/3 del error en el anlisis-enorme volumen de disolventes

Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin demuestras de alimentos

posibilidad de automatizacintcnicas limpias y selectivasmayor rapidez y eficaciafiabilidad

Metas

Idealmente, adems, baratas, sencillas, sin disolventes txicos

Creciente demanda de :

mayor productividad en los laboratoriosanlisis ms rpidosmtodos ms automatizados

Necesidad de nuevas tcnicas de preparacin demuestras de alimentos

Javier Seorns



Posibilidades clsicas: CristalizacinDestilacinPrecipitacinExtraccin con disolventes

LLE, Soxhlet, etc.

Otras: Dilisis y microdilisisFiltracinUltrafiltracinSeparaciones con membranas

Tcnicas instrumentales de preparacin de muestrasde alimentos

Cromatografa en capa fina (TLC)Cromatografa en columnas abiertas (flash)LC prep. cromatografa preparativaAcoplamiento LC-GC SFC preparativa


Tcnicas basadas en la cromatografa:

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Extraccin Slido-liquidoExtraccin Lquido-lquidoExtracciones modernas (ASE, MAE, SFE, etc.)SPE, SPME, etc.


Tcnicas basadas en la extraccin

Fundamento

La cromatografa en capa fina al igual que otras tcnicascromatogrficas se basa en la retencin y elucin debidoa la diferente interaccin del analito entre una fase sliday otra lquida.

La placa se introduce en un recipiente que contiene la fase mvil y alineada con una tira de papel adsorbente. El disolvente asciende por capilaridad y la separacin se basa en la diferente velocidad a la que los distintosanalitos presentes en la muestra ascienden por la placa.

Fundamentos de la Cromatografa en capa fina(TLC, Thin Layer Chromatography)

Javier Seorns



Clculo de los Factores de Retencin (RF)Para ello se emplea la siguiente formula

siendo DA la distancia recorrida por el analito y DS la distancia recorrida por el disolvente o frente del disolvente.

Fundamentos de la Cromatografa en capa fina

Frente del disolventePosicin del analito

tras la cromatografa

origen

DS

DARF =

Cromatografa en columna

Fundamento

La cromatografa en columna al igual que otras tcnicas cromatogrficas se basa en la retencin y elucin debido a la diferente interaccin del analito entre una fase slida querellena una columna abierta y otra lquida (normalmente un disolvente orgnico o una mezclade disolventes).

Javier Seorns



Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra

Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra

Extraccin lquido-lquido

Extraccin Asistida por Microondas (MAE, MicrowaveAssisted Extraction)

Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE, AcceleratedSolvent Extraction)

Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna

Extraccin slido-lquido

Extraccin en Fase Slida (SPE, Solid Phase Extraction)

Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME, Solid PhaseMicro-Extraction)

Muestras slidas de alimentos:

Componentes mayoritarios y minoritarios de todo tipo de alimentos(ej: vitaminas, carotenoides, polifenoles)Residuos y contaminantes en alimentos

MAE ASESFE

Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo aroma o sabor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc

Espacio de cabeza

SPME

Diferentes tcnicas para problemas distintos

Componentes naturales o contaminantes de alimentos lquidos:zumos y bebidas, aceites, leche, etc.

Extraccin en fase slida

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Determinacin de compuestos voltiles en muestras de

alimentos

Cromatografa de gases

Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos

voltiles de la matriz

Problemas:

trazas

aislamiento compuestos voltiles del alimento o del producto a analizar

se requieren grandes cantidades de producto para obtener la adecuada cantidad para anlisis por CG o CG-EM

Tcnicas de aislamiento y concentracin de compuestos voltiles de la matriz

Nuevas tcnicas basadas en el anlisis del espacio de cabeza

- se basan en la preconcentracin, para posterior anlisis y determinacin, de los compuestos voltiles que se desprenden del alimento slido o lquido

Objetivos:

extraer analitos de inters lo ms concentrados posible elevada recuperacin cuantitativa mnimas interferencias

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Micro-extraccin en fase slida (SPME)

Se basa en la adsorcin de los compuestos orgnicos del alimento por una fase slida inmovilizada sobre una fibra de slice fundida.

Una vez alcanzado el equilibrio, los compuestos adsorbidos se desorben trmicamente en el inyector de un cromatgrafo de gases

La matriz puede ser aire, agua, muestras lquidas, etc.

Alternativamente, tambin se puede disolver el extracto en un disolvente orgnico para analizarlo por HPLC.

Principios de la Tcnica

Microextraccin en fase slida (SPME)

SPME es una nueva tcnica de extraccin para compuestosorgnicos, que se basa en la adsorcin de los analitos de la matriz(aire, agua, muestras lquidas, etc.) por una fase slida inmovilizadasobre una fibra de slice fundida.

Si se emplea un recubrimiento polimrico, la cantidad de analitoadsorbida por el recubrimiento en equilibrio est relacionadadirectamente con la concentracin en la muestra.


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Esquema del sistema para SPME y detalle de la fibra adsorbente.

La fibra es de slice fundida recubierta de un polmero adsorbente selectivo.

Microextraccin en fase slida (SPME)

KfhVfVsCo

KfhVf+Vs

n =

n: masa de analito adsorbida por el recubrimiento

Vf,Vs: Volumen de recubrimiento y de muestra

K : coeficiente de reparto del analito entre el recubrimiento y la muestra; [K = f ( T, fibra)]

Co: concentracin inicial del analito en la muestra

Microextraccin en fase slida (SPME)Principio Terico

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Microextraccin en fase slida (SPME)En relacin al reparto de los analitos.......

Principales variables que influyen en el proceso de reparto:

constante de distribucin temperatura de la muestra y tipo de calentamiento

25 C

130 C

200 C

Es una tcnica rpida y relativamente sencilla

Existen diferentes fibras adsorbentes disponibles en el mercado que permiten cierta selectividad

Se puede acoplar fcilmente a otras tcnicas de separacin (GC y HPLC)

No requiere ningn disolvente

SPME es una tcnica econmica (reutilizable)

Est limitada a muestras lquidas o compuestos voltiles (espacio de cabeza)

No permite conservar el extracto para otros anlisis

Ventajas y desventajas de la Microextraccin en faseslida

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Deteccin de enranciamiento de aceites por SPME de aldehdos y otros subproductos de la oxidacin

Anlisis de aromas naturales y extraos de alimentos

Aromas de vinos, bebidas espirituosas, zumos y otras bebidas

Diferenciacin de tipos de caf, origen, tueste, etc.

Compuestos azufrados en cerveza y otras bebidas alcohlicas

Caracterizacin y control de calidad de alimentos de alto valor: jamones, trufas, pats, etc.

Microextraccin en fase slida (SPME)Aplicaciones:

Micro-Extraccin en Fase Slida (SPME)

Ejemplo de anlisis de compuestos voltiles en un zumo de fruta sin usar ningn disolvente txico

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MAE ASESFE


Espacio de cabeza

SPME




Tcnicas de Purga y Trampa y Desorcin Trmica

Procedimiento

arrastre continuo de la muestra por medio de un flujo de gas inerte (He o N2) captura o adsorcin de los compuestos voltiles en una trampa adsorbente desorcin, mediante calentamiento, de los compuestos retenidos

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Tcnica de Purga y Trampa

Arrastre y captura:

1

3

2

4

5

MS GCP&T

Gas inerte: para no alterar componentes de la muestra Temperatura ambiente

Tcnica de Purga y Trampa

Realiza, de forma automtica, las etapas de arrastre, captura y desorcin

Elevada reproducibilidad

Evita manipulacin de muestra

No requiere ningn disolvente

Elevada sensibilidad

No existen interferencias de compuestos no voltiles de la matriz

Optimizacin de todas las variables en conjunto

Ventajas y desventajas P&T:

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MAE ASESFE


Espacio de cabeza

SPME




Esquema Tema 2. AISA Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra








Javier Seorns




Espacio de cabeza

SPME






MAE ASESFE

Extraccin slido-lquido: Extraccin de alimentosslidos con disolventes

Mtodo tradicional de extraccin

disolvente orgnico (lquido) caliente, en ebullicin, en contacto conmuestra de alimento (slido)

(ej. Soxhlet)

Temperatura mxima del Disolvente== Punto de ebullicin (60-80C)

Disolvente

Disolvente+ extracto

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Necesidad de nuevas tcnicas de extraccin dealimentos slidos

Mtodos tradicionales de extraccin slido-lquido : lquido en ebullicin en contacto con muestra slida

difusividad del disolvente lentaintercambio de energa poco eficazprocesos estticos o semi-estticos

Extraccin lenta y poco eficaz

disolventes convencionales calor como nica energa

Extraccin lenta y poco selectiva

Pasos previos:Homogeneizar la muestraReducir su tamaoEvitar cambios en la muestra:

Inactivacin enzimticaProteccin de lpidosInhibicin del crecimiento microbianoCambios fsicos, agua, estructura, etc.

Congelacin, secado, tratamiento trmico, conservantes qumicos (o una combinacin de varios de ellos)


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Extractor Soxhlet

Mtodo tradicional, muy aceptado y extendido

Lento

Esquema Tema 2. La preparacin de la muestra

Introduccin a las tcnicas de preparacin de muestra








Javier Seorns



Principios comunes a las nuevas tcnicas de extraccin:

Extraccin asistida por microondas (MAE).Extraccin acelerada con disolventes (ASE).Extraccin supercrtica analtica (SFE).

Se emplean disolventes de alta difusividad elevando la temperaturay controlando la presin

Debido a los mayores coeficientes de difusin, las extracciones seaceleran considerablemente

Tcnicas instrumentales de extraccin de muestras slidas de alimentos

Extracciones de slidoscon mayor rapidez y eficacia

Lquidos a alta TFluidos Supercrticos

SFE ASEMAE

Presinelevada

Energa localizada

selectividad rendimiento

Tcnicas avanzadas de preparacin de muestrasde alimentos slidos

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Principios de la Extraccin Asistida porMicroondas (MAE)Se extrae la muestra aplicando energa de microondas en un disolvente adecuado.

Energa de microondas: calienta selectivamente unas especies qumicas frente a otras produce extracciones rpidas y con cierta selectividad.

El calentamiento producido depende de la naturaleza qumica de la matriz y del disolvente

Cuanto mayor es la constante dielctrica, mayor es la absorcin de energa.

Extraccin Asistida por Microondas (MAE)

Cuando el disolvente absorbe energa microondas:

La muestra se coloca en un recipiente cerrado

se calienta a temperaturas mayores que su punto de

ebullicin durante un tiempo muy corto (aumenta la presin)despus se enfra y se despresuriza

se separa o filtra el extracto

Procedimiento habitual

Javier Seorns




Esquema de una celda comercial con control de presin y de temperatura para MAE

Equipo necesario: Microondas Celdas apropiadas

Caractersticas de las celdas no absorber microondas, ser inertes,fciles de abrir y cerrarreutilizables resistentes a altas P y temperaturas

Extraccin Asistida por Microondas (MAE)Principales variables:

Relativas a la muestra

Tiempo de irradiacin y extraccin

Potencia de irradiacin

Caudal de disolvente (en procesos continuos)

Disolvente: composicin y propiedadesconstante dielctrica

Javier Seorns




MAE es ms rpida (30 seg.-10 min) y emplea menos disolvente (1-15 mL) que la extraccin lquida tradicional

La energa esta localizada y se aprovecha mejor (menor consumo)

El tamao de muestra puede ser muy variado MAE es una tcnica robusta y fcil de usar Se pueden extraer varias muestras a la vez No hace falta deshidratar o procesar la muestra

Ventajas


MAE depende de la matriz y limita los disolventes que se pueden utilizar

MAE plantea problemas de seguridad El extracto queda en contacto con la muestra al acabar la

extraccin y necesita una posterior filtracin o separacin MAE es difcil de automatizar o acoplar a tcnicas de

anlisis Degradacin de compuestos trmicamente lbiles Poca selectividad en la extraccin

Desventajas

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Esquema de un extractor asistido por microondas

Extraccin de grasa de carne, huevo y slidos lcteos

Extraccin de oleorresina de pimentn

Extraccin de monoterpenoles de mostos para anlisis por GC

Extraccin de contaminantes (residuos de pesticidas, PAHs, PCBs, etc.)

Ejemplos de Aplicaciones:

Extraccin de esencias de vainilla, menta, ginseng, ctricos, etc.

Ejemplo de Extraccin Asistida por Microondas (MAE)


Homogeneizacin de la muestra

Se aade el disolvente: ter de petrleo o hexano

La muestra se coloca en un recipiente abierto adecuado

Se irradia a 300 W durante 60 + 90 segundos

El extracto se filtra a vaco para separar la muestra del disolvente

Se concentra el extracto, evaporando el disolvente en rotavapor

Javier Seorns





SFE ASEMAE

Presinelevada

Energa localizada



Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)

nueva tcnica de extraccin disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rpidas y efectivas de muestras slidas


Temperaturas: 30 - 200 CPresiones: 100 - 140 atm

Disolventes: orgnicos, agua, mezclas, etc.

Muestras: slidas

Javier Seorns




nueva tcnica de extraccin disolventes habituales presiones y temperaturas elevadas extracciones rpidas y efectivas de muestras slidas


Efectos interesantes que se producen a temperaturas elevadas: mejores solubilidades de los analitos en lquidos aumento de las cinticas de desorcin de los compuestos de la matriz


La muestra slida se coloca en un recipiente que se sella Se llena con disolvente y se calienta a temperatura mayor que el punto de ebullicin del disolvente, provocando un gran aumento de la presin en la celda.

Durante el tiempo de extraccin parte del lquido es liberado y recogido en un vial.

Al final de la extraccin, el extracto se expulsa de la celda con nitrgeno y se transfiere automticamente a un vial.

Procedimiento

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Principales variables:

Relativas a la muestra

Tiempo de extraccin

Temperatura de extraccin

Nmero de ciclos

Disolvente o mezcla de disolventes


Disolvente

Bomba

Nitrgeno

Vlvula de purga

Vial colector

Horno

Celda de Extraccin

Vlvula Esttica

Vial de desecho

Vlvula de presin

Salidaaire


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Imagen de un extractor con disolventes presurizados (ASE)


Pesticidas en harinas, piensos, etc.

Micotoxinas en cereales y frutos secos

Extraccin de contaminantes (residuos de pesticidas, dioxinas, PCBs, etc.)

Ejemplos de Aplicaciones:

Extraccin de productos naturales


Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos

ASETM es ms rpida que los procedimientos de extraccin lquida tradicionales

Javier Seorns



Extraccin Acelerada con Disolventes (ASE)de alimentos

Las extracciones son ms completas, pero menos selectivas

ASE requiere el empleo de temperaturas ms altas que en SFE

El equipo tiene un precio elevado

Desventajas



SFE ASEMAE

Presinelevada

Energa localizada



Javier Seorns



Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)

Se extrae con un fluido a presiones y temperaturas mayores que las de su punto crtico

extrae rpida y selectivamente algunos compuestos

Variando la presin (la densidad del fluido) se controla la solubilidad de los analitos en dicho fluido.


Diagrama de fases

Presin

Temperatura

Lquido

Gas

Slido

FluidoSupercrtico

Qu es un Fluido Supercrtico?

Punto Crtico

(Para CO2 es 31.3C y 72.9 atm)

Javier Seorns



Moderadas presin (72.9 atm) y temperatura (31.3C) crticas Gas a temperatura ambiente, no deja residuos No es txico ni inflamable Precio moderado y sin problemas de eliminacin Baja polaridad, se pueden aadir modificadores en pequea proporcin para extraer compuestos polares

Propiedades del dixido de carbono

Extraccin Analtica con Fluidos Supercrticos (SFE)

El fluido supercrtico ms utilizado es el dixido de carbono (CO2)



MAE ASESFE

Aroma y compuestos voltilesde alimentos y bebidas cuyo flavor es importante: vinos, quesos, aceites esenciales, etc

Espacio de cabeza

SPME




Javier Seorns



Fundamentos de la Extraccin Lquido-Lquido

Particin de los componentes de una mezclaentre dos lquidos inmiscibles de diferente densidad

Extraccin en fase slida (SPE)

SPE es una tcnica de extraccin que se basa en la retencin sobre un adsorbente slido de los compuestos deseados disueltos en una muestra lquida. La adicin de un eluyente permite eliminar los componentes de la matriz que interfieren, para despus eluir y concentrar los analitos de inters.La extraccin en fase slida sustituye a la extraccin lquido-lquido clsica.


Javier Seorns



Procedimiento de la Extraccin en Fase Slida (SPE)

Muestra Acondicio-namiento

Adicin de muestra

Lavado Elucin del analito

Extraccin en Fase Slida (SPE)

Ejemplos de Aplicaciones: Eliminacin de pigmentos de

vegetales y hortalizas Retencin de antocianinas y otras

interferencias en anlisis de pesticidas en vinos

Vitaminas en zumos Residuos de antibiticos en leches

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Extraccin en Fase Slida (SPE)

Imagen de un colector mltiple para SPE con aspiracin a vaco.

Permite la extraccin simultnea de 20 tubos con muestra.

Equipo automtico para SPE con microplacas de 96 / 384

Ventajas y desventajas de SPE

Es una tcnica muy sencilla y rpida Existen numerosos adsorbentes disponibles en el

mercado para SPE Se puede acoplar a otras tcnicas de separacin Emplea poco o ningn disolvente SPE es muy efectiva para extraer compuestos

polares o apolares de muestras lquidas Se puede automatizar Est limitada a muestras lquidas

Javier Seorns



Sumario de propiedades de nuevas tcnicas deextraccin

Rpidas: tiempos de extraccin de 1 - 30 minutos

Ninguna tcnica es ideal para todos los analitos de todas las matrices

Las nuevas tcnicas son cada vez ms comunes y van a continuar su expansin debido a sus numerosas ventajas

Posibilidad de automatizacin

Eficaces y selectivas

Libros sobre Anlisis Instrumental incluyendo preparacin de muestra:Rubinson K.A., Rubinson J.F. (2001). Anlisis Instrumental.Prentice Hall-Pearson. Madrid.

Matissek R., Schnepel F.M., Steiner G. (1998). Anlisis de losAlimentos. Fundamentos, Mtodos, Aplicaciones. Acribia.Zaragoza.

Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. (2001). Principios de AnlisisInstrumental. [Quinta Edicin] McGraw-Hill. Madrid.

Bibliografa recomendada

temajs aisa

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