TEMA 9

Métodos ópticos para eldiagnóstico de laboratorio

de enfermedades infecciosas

Tema 9. Métodos ópticos para el diagnóstico de laboratorio de enfermedadesinfecciosas

1. Examen microscópico del material fresco1.1. Tipos de microscopía óptica1.2. Preparaciones en fresco levemente modificadas

2. Examen de muestras teñidas2.1. Tinción de Gram2.2. Tinción de ácido-alcohol resistencia2.3. Otros tipos de tinciones

3. Microscopía de fluorescencia3.1. Fundamento3.2. Principales fluorocromos utilizados3.3. Inmunofluorescencia

4. Microscopía electrónica4.1. Transmisión4.2. Barrido

5. Resumen de las características y aplicaciones más frecuentes de los diferentes tipos de microscopía en Microbiología Clínica

1. Examen microscópico del material fresco

1.1. Tipos de microscopía óptica

Microscopía de campo claro

• Células sanguíneas

• Microorganismos en muestras líquidas (orina, heces diarreicas, LCR)

• Hongos en la piel

• Protozoos en sangre y tejidos

Microscopía de campo oscuro

• Movilidad bacteriana

• Células finas (espiroquetas)

Microscopía de fluorescencia

• Inmunofluorescencia

1.2. Preparaciones en fresco levemente modificadas

• KOH al 10% (azul de lactofenol)

− Hongos

• Tinta china o nigrosina

− Bacterias y levaduras capsuladas

• Lugol (solución de yodo)

− Quistes de parásitos

• Azul de metileno

− Leucocitos en heces

• Reacción de “Quellung”

2. Examen de muestras teñidas

2.1. Tinción de Gram

2.2. Tinción de ácido-alcohol resistencia

Ziehl-Neelsen (caliente) Kinyoun (frío)

2.3. Otros tipos de tinciones

• Esporas (Schaeffer y Fulton)

• Tinción de Wheatley

− Parásitos

• Tinción de Gomori

− Parásitos

2.3. Otros tipos de tinciones

• Tinción de Giemsa

− Diferenciación de parásitos en frotis de sangre y cortes de tejidos

• Tinción de Wright (Wright-Giemsa)

− Diferenciación de parásitos en frotis de sangre y cortes de tejidos

3. Microscopía de fluorescencia

3.1. Fundamento

• Naranja de acridina (se une a los ácidosnucleicos)

• Auramina-Rodamina (micobacterias)

• Blanco de calcoflúor (hongos)

• Isotiocianato de fluoresceína (inmunofluorescencia)

3.2. Principales fluorocromos utilizados

3.3. Inmunofluorescencia

4. Microscopía electrónica

4.1. Transmisión

4.2. Barrido

Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones

Microscopia óptica

Campo claro El contraste se logra por absorción. Imagen clara. Las muestras requieren tinción. Para observar organismos completos.

Contraste de fases El contraste se consigue por interferencia; las diferencias en el indice de refracción cambian la fase de la luz

Imágenes claras y detalladas rodeadas de un balo.

No requiere tinción; se pueden observar preparaciones en fresco de células vivas.Movilidad

Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la muestra entra en el objetivo, produciéndose un contraste elevado.

Imagen brillante contra un fondo oscuro. Para observar células vivas o flagelos demasiado finos para la microscopia de contraste de fases; pocos detalles internos. Movilidad.

Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir luz visible que tienen los especimenes fluorescentes cuando se les ilumina con luz uv.

Especimenes muy coloreados (luminosos) contra un fondo oscuro.

Utilizando anticuerpos fluorescentes se pueden identificar tipos especificosde microorganismos en una mezcla compleja.

Microscopía electrónica

Transmisión (MET) Hace pasar un haz de electrones a través de la preparación, produciendo un gran aumento útil

Imágenes muy ampliadas con gran detalle. Para observar virus y la ultraestructura celular. No se pueden observar organismos vivos porque las preparaciones ban de ser totalmente desecadas.

Barrido (MEB) Barre los especimenes con un chorro de electrones, produciendo la salida de electrones secundarios que crean una señal, que, a su vez, genera una imagen por ordenador.

Imagen tridimensional. Para ver estructuras de organismos intactos, e incluso estructuras internas con detalles reales. Las muestras han de ser desecadas, por tanto, no se puede aplicar a organismos vivos

5. Resumen de las características y aplicaciones más frecuentes de los diferentestipos de microscopía en Microbiología Clínica