tÉcnicas de laboratorio neuromuscular con aplicabilidad clÍnica inmunologia
TRANSCRIPT
TÉCNICAS DE LABORATORIO NEUROMUSCULAR CON APLICABILIDAD CLÍNICA
INMUNOLOGIA
OBJETIVOS
• Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente
• Destacar sus utilidades, ventajas e inconvenientes
• Análisis crítico con ejemplos reales de artículos destacados
RESUMEN• Inmunohistoquímica
• Diagnóstica• Investigación
• Screening autoanticuerpos• Confirmación de reactividad
• Técnicas basadas en células• Inmunocitoquímica• Citometría de flujo
• ELISA
• Western-blot
• Cromatografía de capa fina
INMUNOHISTOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
Inmunohistoquímica: es un procedimiento que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, para la localización e identificación de un antígeno en una muestra tisular.
Inmunohistoquímica
2 tipos de anticuerpos
Antígenos
Anticuerpo 1°
Anticuerpo 2°
Inmunohistoquímica
Inmunofluorescencia directa
Antígenos
Anticuerpo 1°
Utiliza un solo anticuerpo
Inmunofluorescencia indirecta
Antígenos
Anticuerpo 1°
Anticuerpo 2°
Utiliza un 2° anticuerpo conjugado
Inmunohistoquímica
Marcado con fluorocromo Marcado mediante enzimas +
sustrato
Inmunohistoquímica
Inmunohistoquímica
APLICACIONES
• Detectar la presencia/ausencia de una moleculas concretas en un tejido• Detectar moleculas que están y no deberían estar• Detectar moléculas que no están y deberían estar
• Analizar el patrón de tinción • Si las moléculas están donde tienen que estar y en la proporción
adecuada.
DISTROFINA
MHC I
INMUNOHISTOQUÍMICA INVESTIGACIÓN
UTILIDAD
• Enfermedad inmunes y no inmunes• Demostrar la presencia de anomalias estructurales o la alteración
del patrón de tinción de determinadas proteinas relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad
• Enfermedades inmunes• Demostrar que el suero/LCR de pacientes reacciona contra un
tejido relevante para la enfermedad estudiada.
EJEMPLOS• PRIMER CASO
EJEMPLOS• SEGUNDO CASO
Ensayos diagnósticos celulares (cell-based assays)
INMUNOCITOQUÍMICA CITOMETRÍA DE FLUJO
Cultivo celular y transfección
• Primarios: provienen de una persona/animal y su crecimiento es limitado.
• Ej: musculares, endoteliales, neuronas…
• Líneas: Células immortalizadas, crecimiento ilimitado, amplia utilización en investigación.
• Ej: HEK, CHO, HeLa….
Tipos de Cultivo
Cultivo de explantes Separación con CD56+
Proliferación de mioblastos Diferenciación a miotubos
Cultivo de biopsias musculares de pacientes
Inmunocitoquímica
Transfección: partículas lipídicas
Célula
Procéso immunocitoquímica
Célula
Contactin-1 CASPR1/Contactin-1
(Contactin1 complex) Neurofascin155
Serum
Commercial Ab
Merged
Serum
Commercial Ab
Merged
Serum
Commercial Ab
Merged
Proyecto de busqueda de nuevos antígenos en CIDP
VENTAJAS ICC• Expresión proteínas en su conformación nativa
• Incluye modificaciones post-traduccionales• Ideal para proteinas de membrana
• Permite el estudio de proteinas humanas sobre líneas celulares humanas
• Permite valorar el patrón de tinción (aspectos cualitativos)
• Sencillo y relativamente barato. Puede utilizarse de la misma manera o con mínimos cambios para muchas proteínas.
DESVENTAJAS
• No es útil para complejos de proteínas o proteínas con interacciones complejas
• Diferencias post-traduccionales respecto a proteina en su tejido de origen (diferente glicosilación, splicing…)
• No cuantitativo
• No mecanizable, consume tiempo.
CITOMETRIA DE FLUJO
VENTAJAS• En general las mismas que la ICC más
• Cuantificable
• Mecanizable
DESVENTAJAS• Similares a la ICC, más
• No permite análisis cualitativo (localización de la tinción…)
• Discrimina peor reactividad inespecífica
ELISA
ELISA
ELISA: es un inmunoensayo para la cuantificación de un antígeno o anticuerpo mediante la inmovilización en una superficie sólida de un anticuerpo o antígeno, respectivamente.
ELISA
Tipo Sandwich
Indirecta
Detección de anticuerpos anti-gangliósidos en suero
ELISA
ELISA
ELISA
Dilución punto final (cuando deja de ser positivo)
Analisis resultados• Dos formas
• Determinación pacientes positivos en función de una señal umbral
• Mejor especificidad
• Comparación de grupos
VENTAJAS• Versátil. Válido para muchos tipos de ensayo
• Gangliosidos• Proteinas• Acidos nucleicos
• Sencillo y barato. Permite muchas determinaciones en poco tiempo
• Muy bueno para moléculas sencillas, no dependientes de conformación, pero válido para moléculas dependientes de conformación
• Mayor sensibilidad que otras pruebas diagnósticas• Permite titular lo sueros
INCONVENIENTES• Resultados variables, muy dependiente de condiciones
externas de temperatura, tiempos de incubación, el estado de la molécula analizada…
• Más reactividad inespecífica, especialmente con sueros.• Falsos positivos
• No válido para moléculas muy dependientes de conformación, por ejemplo, con muchos dominios transmembrana
• Necesidad de proteinas recombinantes. Proteinas purificadas o ELISA de tejidos, muy sucios.
WESTERN BLOT
Control 1
250
150
100
75
50
37
2Marcador
WB para Disferlina
Western blot
Dysferlin
Β- actin
WB para distrofina
ROD (Dys 2) Carboxi (Dys 3)
1 2 3 1 2 3
1. Control
2. Paciente 1
3. Paciente 2
Dys 1 Dys 2 Dys 3
250KDa
Distrofina
Western blot
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
Características de los gangliósidos
Glicoesfingolípidos:ceramida
+uno o más azúcares (hexosas)
Selección de algunos de los gangliósidos relevantes en las
neuropatías (neuropatía motora multifocal y los
síndromes de neurona motora inferior).
TLC de gangliósidos
lámina de aluminio con gel de sílice
TLC de gangliósidos
Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina
No permite la cuantificaciónMayor especificidad en la determinación
Placa Cromatografía silica gelsolución de gangliósidosstandard revelada con resorcinolincubación con el suero del pacienteanti-IgG/IgM humana marcada con peroxidasarevelado por quimioluminiscencia
Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina, patrones de reactividad
Interpretación de los resultados
DISIALOSIL
EJERCICIO 1INMUNOHISTOQUÍMICA
EJERCICIO 2INMUNOCITOQUÍMICA
NEURONAS DRG – CIDP ATAXICA
EJERCICIO 3ELISA
EJERCICIO 4WESTERN-BLOT
1 2 3 4 5 6 7 8 9
carril Name DYSF ACTINA DYSF/ACT 100% expresión
1 control 59,06 163,56 0,36109073 100
2 paciente 1 1,17 115,78 0,01010537 2,798568721
3 paciente 2 27,1 95,23 0,28457419 78,80960772
4 paciente 3 38,6 138,89 0,27791778 76,96618955
5 paciente 4 14,94 149,3 0,10006698 27,71241978
6 paciente 5 37,03 136,96 0,27037091 74,8761704
7 paciente 6 26,36 116,77 0,22574291 62,51695042
8 paciente 7 1,97 151,08 0,01303945 3,611128221
9 paciente 8 47,45 159,14 0,29816514 82,5734675
237KDa
42KDa
Western blot
Dysferlin
Β- actin
EJERCICIO 5TLC
AMAN
CANOMAD