técnicas básicas de biologia molecular

Técnicas Básicas de Biologia Molecular

Diamar Costa-PintoFIOCRUZ

Visão da Apresentação

PCRBibliotecas genômica e de expressãoFragmentação - digestãoSeparação - eletroforeseClonagem molecularSequênciamentoSouthern, Northern e Western blotting

By Diamar

Diagnóstico do século 21- Podemos fazer análises genômicas, pois a maioria dos cromossomo já estão mapeados.

- O projeto genoma tem sido uma grande ferramenta para unir genomas e laboratório clínico.

Mapas Genéticos, Citológicos e Físicos

EST – Sequências expressas marcadas. cDNA curtos que ligam mapas físicos a genéticos

RFLP- Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição

By Diamar

Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro.

Solange Farah

By Diamar

Enzimas de Restrição

1953 – a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeiraVerificou-se, então, a presença de nucleasesBactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando)Fenômeno chamado restrição/modificaçãoAdvento das endonucleases de restriçãoSítio é normalmente uma palíndrome

By Diamar

Enzimas de Restrição(continuação)

Palíndrome:

ARARAARARA

OMOOMO

ANAANA

By Diamar


Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de basesCortes com extremidades abruptas ou coesivasPrimeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies1073 – foram usadas para clonagem molecularPode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécieFragmentos separados por eletroforese

By Diamar


By Diamar

Vídeo de Enzima de Restrição

By Diamar

Eletroforese

Já conhecida desde 1930Difundida em 1950-1960Movimentação de moléculas submetidas a campo elétricoUsa um substrato: papel, agarose, poliacrilamidaSepara proteínas por cargas e peso molecularSepara ácido nucléicos por peso molecular

By Diamar

Eletroforese

+-

Horizontal

VerticalFonte de eletroforese

Visualização do gel de agarose

-

+By Diamar

Eletroforese

By Diamar

Vídeo de Eletroforese

By Diamar

Clonagem Molecular

Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas

Primeiro: inserto + vetor = rDNA

Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação

By Diamar

By Diamar

Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico, com uma característica desejada, e transfere este

gene para outro organismo vivo

Célula humana Bactéria

Plasmídeo

DNA

Enzima de restrição

Tesoura genética

Transformação

DigestãoDNA da bactéria

DNA da célula humana

rDNAClonagem

By Diamar

O DNA recombinante

Não se limita a organismos de uma mesma espécie

A compatibilidade sexual torna-se irrelevante

Permite modificações em uma única geração, o queantes levaria dezenas ou centenas de gerações

By Diamar

Vídeo de Clonagem Molecular

By Diamar

Vetor

São moléculas de transporteMoléculas de DNADiversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, YACs, etc.Diferenças de tamanho de insertoPodem ter comportar linear e/ou circular

By Diamar

Vetor(continuação)

Vetores de expressão procarióticos

Promotores fortesSítios de ligação a ribossomosSítios de clonagem

Vetores de expressão eucarióticos

Origem de replicação eucarióticaRegião de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mRNA, cappingSinais especiais para processamento e secreção

By Diamar


Características gerais

Região promotoraSítio Múltiplo de Clonagem - PolylinkerGene de resistência a antibióticosOrigem de replicaçãoGene repórter

By Diamar


PLASMÍDEOS:

Penetra naturalmente nas bactériasFita duplaCircularExtracromossômicoResistência a antibióticosVetores shuttleInsertos até 4000 pbpUC 18, pUC 19

By Diamar


FAGOS

Vírus de bactériasFago λ é o mais utilizadoFita dupla linearRecirculariza durante a infecção na bactériaAceita até 20 mil pb

By Diamar


COSMÍDEOS

Pequeno tamanho 4 a 6 KbEngenherado: empacota rDNA no capsídeo do fago para infectar bactériaPossuem seqüências cosAceitam insertos de até 50 mil pb

By Diamar

COSMÍDEOS

By Diamar


YACs (Yeast Artificial Chromosome)

Células hospedeiras as levedurasComportam-se como cromossomosAceitam 400 mil pbPossuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero, centrômero e origem de replicação

ARS: Seqüência de replicação autônoma

CEN: Seqüências centroméricas

By Diamar

Engenharia Genética – Produção em série

- Hormônio de crescimento

- Insulina humana

- Vacina da Hepatite B

- Hormônio sexuais By Diamar

Sequenciamento

Frederick Sanger (1977), InglaterraSegundo Prêmio NobelSíntese de DNA in vitro por término didesoxiMapa físico dos genes e dos cromossomos

By Diamar

Sequenciamento (continuação)

Hood: Semi-automatizado (1986)Venter: Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados, robóticas e PCR (1995)Perkins-Elmer Corp: Comercializado o Sequenciamento totalmente automatizado (1999)

By Diamar

ConsideraçõesP

P

BN

A

C

G

T

U

OH

P

OHOH

Ribose

C1

C2C3

C4

C5

P

P

BN

A

C

G

T

OH

P

OHOH

dNTP

Pentose

C1

C2C3

C4

C5

Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico

O - Necessário para ligação fosfodiéster

5’ 3’ Polimerização

ddNTP (Didesoxinucleotídeo)NTP

By Diamar

Estuda a integridade da sequência de um DNA molde. Analisa diferentes tamanhos de fragmentos formados a partir de um primer e da inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.Sequenciamento

ddNTP

ddNTP

ddNTP

Fragmento 1

Fragmento 2

Fragmento 3

Primer

DNA molde

dNTPdNTPdNTP

dNTP

dNTPdNTP

DNA polimerase

ACGT

AC

ACG

TGCA

By Diamar

Sequenciamento automatizado

Vídeo do Sequenciamento(Cycseqpc)

By Diamar

Southern Blotting

E. M. Southern (1975)Fragmentos de DNA são separados em gel de agaroseTransferidos para membranas por ação capilarDNA é desnaturado antes ou durante a transferênciaSonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membranaDetecta polimorfismo de DNA ou mutação

By Diamar

Southern blotDescrição:

- Digestão do DNA em teste com enzimas de restrição;

- Resolução dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose;

- Transferência do DNA para membrana de nylon;

- Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada com radioatividade ou quimioluminescentes

Aplicação: Alterações em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo.

Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado.

By Diamar

Southern blot

46, XY.Síndrome da insensibilidade androgênica. Vagina em fundo de saco, sem útero ou tubas uterinas. 1:20.000. Testículos no abdome ou canal inguinal (confundidos com hérnias, na infância). Defeito molecular: varia de deleção completa do gene a mutações de ponto nos domínios de ligação de andrógenos ou ligação ao DNA da proteína receptora de andrógeno.

Sonda de cDNA para o gene humano ligado ao X de receptor de andrógeno hibridando no genoma digerido do paciente.

Exemplo da especificidade das sondas.

By Diamar

Vídeo de Southern blot(DNA _DetectivePC)

Northern blotting

Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agaroseRNAs devem ser desnaturados (formaldeído)Sensibilidade a RNAsesTransferência para membrana por ação capilarSondas de RNA ou DNA para hibridar

By Diamar

Northern blotting(Continuação)

Úteis em estudo de expressão gênicaEstudo de diferentes tecidosEstuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo

By Diamar

Northern blotting

Marcadores rRNA

RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).

A – sonda de α-tubulina – hibrida todos

B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores

C - sonda de α3- tubulina – hibrida todosBy Diamar

Western blotting

Corrida de proteínas em gel de poliacrilamidaSeparação e caracterização de proteínasUso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturaçãoTransferência para membrana por força elétrica

By Diamar

Western blotting (continuação)

Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonalRevelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativoInforma o tamanho e a quantidade das proteínas

By Diamar

Western blotting

By Diamar

Western blottingAnálise de proteínas por anticorpos específicos após

eletroforese e transferência para membrana.

By Diamar

Vídeo Immunoblotting(3EIMMBLOT)

RFLPsPolimorfismo dos comprimentos dos

fragmentos de restrição

Uso de enzimas de restrição Produção de fragmentos de DNA de tamanho adequados para serem utilizadosAs Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de DNAAplicação: compara alelos normais e afetados para cada mutação estudada.

Mapa de Restrição

By Diamar

PCR - RFLP

By Diamar

RFLPsPolimorfismo dos comprimentos dos

fragmentos de restrição

Um caso de erro inato do metabolismo:

G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)By Diamar

RFLP de Planta

DNAs genômico de Arabidopis é digerido

com EcoRI.

Southern blotting com sonda azul e

verde.

F1 é heterogênio possui fragmentos de ambos os genitores.

F1 autopoliniza:

1:2:1 Ecotipo diferentes: C-Colombia, N-

Niederzenzes e H –Heterozigoto.

Oligonucleotídeo alelo-específico (ASO)

Descrição:

- Hibridação preferencial de sonda marcada para testar DNA com composição de bases complenmentar única.

Aplicação:- Alelos de composição conhecida.

Mutação é conhecida. Revela uma única alteração de base. Distingue hetero ou homozigotos para a sequência. A análise é restrita a mutação familiar conhecida ou para distúrbios genéticos com nº finito de mutações diferentes. Ex: beta-talassemia.

By Diamar

FISH Hibridação in situ com fluorescência

Detecta DNA localizados dentro de cromossomosUsa lâminas de microscopiaCromossomos estão em metáfase, anáfase e interfaseUsa sondas de DNA específicas

By Diamar

FISH(Hibridação in situ com fluorescência)

Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no cromossomo 15 paterno.

By Diamar

By DiamarFISH

(Hibridação in situ com fluorescência)

Relação evolutiva entre cromossomos.

DNA de gibão Hylobates lar

sondado com DNA Humano.

Setas indicam cromossomo 8 do

gibão.

Cromossomo humano 4 hibrida com cromossomo

(laranja) do macaco verde africano.

Evolução cromossômica em mamíferos

SSCPSingle-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

Método baseado na mobilidade eletroforética.

Gel não desnaturante.

Protocolo Básico

PCR do gene alvo.

DNA desnaturado.

(eletroforese)

Mobilidade diferente da normal indica mutação.

Sensível para tamanho e forma da fita simples.

Detecta a mudança de uma base.

By Diamar

SSCPSingle-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

Fragmentos até200 pb – 90% de sensibilidade.

Fragmentos maiores que 400 pb - 80% de sensibilidade.

(digestão )

Heterozigoto

Microarray – Chip de DNA –Microarranjos de DNA

Southern blotting em lâminaChips de genesPode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas

By Diamar


Microdisposição de oligo ou de sondas

- Microssíntese de oligos in situ (no chip)

- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré

fabricadas

- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA

Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes

Leitura por scanners

By Diamar

Microarray Microarranjos de DNA – Chips de DNA

É uma técnica que emprega arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro.

Pode comparar a expressão de um grande número de gene, simultaneamente.

Existem lâminas de 400.000 pontos.São feitas com ponteiras de titâneo.

By Diamar


Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos

Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais

Sequenciamento do DNA e genotipagem


Contras Utilização

Técnica cara - Mapear mutações

Sensibilidade é reduzida - Oncogenes

Lâminas não são reutilizadas - Expressão das viasmetabólicas

Repetir várias vezes - Regiões regulatórias de genes de levedura

Grande quantidade de - Expressão de genesmRNA (2 a 5 µg) anônimos

- Analisar 10.000 amostrasem 12 horas

Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA

Descrição:

- Hibridação do DNA em teste com disposições ordenadas de nucleotídeos em chip de silicone.

Aplicação:

- Detecção de DNA em teste com composição conhecida.

By Diamar

Referências Bibliográficas:

MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517.

By Diamar

Obrigada!

By Diamar

técnicas básicas de biologia molecular

Health & Medicine