tecnicas bacteriologias

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Health & Medicine


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Tema 1.1 Esterilizacion y medios de cultivo.

Tema 1.2 APLICAR TÉCNICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS PARA EL CONTROL BACTERIOLÓGICO.

Tema 1.3 Preparar los diferentes medios de cultivo para el aislamiento de bacterias.

Tema 1.4 Características morfológicas y taxonómicas de las bacterias

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Tema 1.1 Esterilizacion y medios de cultivo. Es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporos, y virus. Metodos de esterilizacio Fisicos, Son aquellos que no involucran el empleo de sustancias letales para los microorganismos, si no procedimientos fisicos qu

Metodos de esterilizacion

Calor Humedo Metodo termico de esterilización, mata microorganismos , por la coagulación de proteinas, causada por rutura de los puentes de hidrogeno.

Tindalazion Consiste en someter una sustancia a esterilizar a un proceso seriado de elevación y disminución de la temperatura, de tal modo que en cada una de esas etapas se eliminen paulatinamente las forma vegetativas y esporas

Pasteurizacion §Es el proceso térmico realizado a líquidos (generalmente alimentos) con el objeto de reducir los agentes patógenos que pueden contener: bacterias, protozoos, mohos y levaduras.

Ebullicion La ebullición es el proceso físico en el que un liquido pasa a estado gaseoso. Elimina la mayoria de microorganismos en el medio liquido.

Metodos de esterilización Quimicos: Los métodos químicos de esterilización son aquellos que involucran el empleo de sustancias letales para los microorganismos. El uso de este método es muy limitado para la industria alimentaria pero muy utilizado en otras industrias como la farmacéutica por ejemplo. OXIDO DE ETILENO ALDEHIDOS GLUTARALDEHIDO FORMALDEHIDO Medios de cultivo.

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Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado ( es decir, se le añaden organismos) y a continuacion incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano.

Condiciones para el Desarrollo de los Microrganismos: El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores que en algunos casos son ajenos al medio ambiente. 1.Disponibilidad de nutrientes adecuados. 2.Consistencia adecuada del medio 3.Presencia o ausencia del oxigeno y otros gases. 4.Condiciones adecuadas de humedad. 5.Luz ambiental. 6.Ph. 7.Temperatura. 8.Esterilidad del medio. Un medio de cultivo adecuado debe de contar como minimo carbono, nitrogeno,azufre,fosforo,sales inorganicas y ciertas vitaminas inductoras de crecimiento.

Tipos de medios para su desarrollo: Partiendo de un medio liquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albumina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o solido. Los medios solidificados tienen el gran inconveniente de que muchos no desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión y otros pueden licuarlo.

Clasificación de los medios de cultivo

De acuerdo a su consistencia, los medios pueden clasificarse en: 1. Liquidos: se utilizan para el crecimiento de cultivos

puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulacion.

2. Semisolido: contiene 0.5% de agar en su formulacion. Se utilizan para estudiar la mo vilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelos)

3. Solido: contiene de 1.5% a 2% agar en su formulacion. Estos medios inmovilizan a las celulas, permitiendoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias.

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De acuerdo a su funcion se clasifican en :

1. Medios selectivos: son aquellos que poseen uno o mas componentes añadidos, los cuales prevendan el crecimiento de cierto tipos de especie de bacterias deseada ajustando las condiciones fisicas tales como temperatura, ph, etc.

2. Medios diferenciales: permiten al investigador distinguir las diferencias entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna caracteristica observable en su patron de crecimiento en el medio.

3. Medios de enriquecimiento: contiene algun componente que permite el crecimiento de cierto tipo especifico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras.

4. Medios enriquecidos: se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran numero de factores de crecimiento. Generalmente contiene extractos biologicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, etc.

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Tema 1.2 APLICAR TÉCNICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS PARA EL CONTROL BACTERIOLÓGICO.

Aportaciones más importantes de científicos en la microbiología de interés médico Anthony Van L.

Conocido por introducir a la fabricación de los microscopios y descubrimientos pioneros sobre los protozoos,los globulos rojos, el sist. De capilares y ciclo vital de los insectos.

Lazzaro Spallanzani

investigo el origen de la vida la regeneración tisular la respiración y otras funciones del ser humano. también trabajo en la inseminación artificial

Agostino Bassi Realizó la 1era prueba experimental de un agente biológico como causa de una enfermedad epidémica señaló en obras que las enfermedades como el sarampión, peste bubónica, sífilis, cólera, rabia y gonorrea también son producidas por parásitos.

Luis Pasteur La pasteurización proceso de la destrucción de las bacterias patógenas en un liquido mediante calor. demostró que todo proceso de fermentación y descomposición orgánica se debe a la acción de organismos vivos. También vacunas contra enfermedades entre ellas la rabia.

Walter Reed Realizo importantes investigaciones sobre la etiología, control y transmisión de enfermedades epidémicas, la examinación de la fiebre tifoidea y demostró que la fiebre amarilla solo se propaga por medio de la picaduradel m osquito Aede

Paul Ehrlich Descubrió elsalvarsán, derivado de arsénico activo frente a la sífilis estableció concepto quimioterapico un fármaco que mataba bacterias respetando las células del huésped y la teoría de la inmunidad de cadena lateral.

David Bruce Descubrió las causas y vías de transmisión de varias enfermedades brucelosis y tripanosomiasis africana. Descubrió el fenómeno fiebre de malta.

Theobald Smith

Descubrió el parasito de la llamada "fiebre de Texas" el cual era transmitido por una garrapata. también hizo un trabajo que describía la presencia de la brucella en el protoplasma de las células del epitelio corial.

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Medios de esterilización. Métodos Químicos Estos métodos provocan la pérdida de viabilidad de los microorganismos. Hipoclorito de Sodio: Es el más utilizado por su fácil adquisición y por su efectividad en la desinfección. Oxido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus. Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. Estos compuestos destruyen las esporas Glutaraldehído: Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío Formaldehído: Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gas-plasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de esterilización a baja temperatura la cual consta en la transmisión de peróxido de hidrógeno en fase plasma. Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fácilmente.

Métodos Físicos Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Autoclave. Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estufas –Hornos: Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.

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Tema 1.3 Preparar los diferentes medios de cultivo para el aislamiento de bacterias.

Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproducción in vitro de las bacterias, para observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioquímico e inmunológico, al contar con material en cantidad suficiente. Por ello consta de algunas propiedades (pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de Aero-anaerobiosis, etc.), que son las más idóneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en particular, en la bacteriología sistemática. Se entiende por medio de cultivo la mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite mantener su variabilidad. Un microrganismo se siembra en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar . Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Condiciones requeridas.

Los medios de cultivo para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables deben cumplir con los siguientes requisitos:

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados:

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Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. 2- Consistencia adecuada del medio:

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al

punto de fusión de este solidifícate y de que otros tienen la capacidad de licuarla. 3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microrganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. En un punto intermedio, los microrganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. •4- Condiciones Adecuadas De Humedad: • Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. 5- Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos

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6- pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 7- Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios. 8- Esterilidad del medio:

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

Clasificación de los medios de cultivo. Para Usos Generales.

No Selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias.

Selectivos.

pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad.

Enriquecidos.

Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales. Los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos.

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Para Aislamientos Especializados.

Formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación(Lowenstein).

AGAR SANGRE Medio enriquecido, estándar. El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, así como los del género Candida.

AGAR POLIVITEX (chocolate) Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en medios habituales. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes.

MACCONKEY Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración desales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. SCHAEDLER Medio básico enriquecido con sangre. Este medio reductor está particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios.

KANA-VANCO Con Kanamicina y Vancomicina. Contiene 75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos Gram Positivos.

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Tema 1.4 Características morfológicas y taxonómicas de las bacterias

BACTERIAS Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas (c ocos), barras (bacilos) y hélices (espirilos). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las células eucariotas (de animales, plantas, hongos, etc.). MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS En biología, la morfología es la disciplina encargada del estudio de la reproducción y estructura de un organismo o sistema. La morfología es una ciencia biológica que trata de la forma y reproducciones de los seres orgánicos. MORFOLOGÍA BACTERIANA La morfología bacteriana debe considerarse desde dos puntos de vista: 1) como células individuales observables sólo al microscopio. 2) como colonias bacterianas apreciables a simple vista después de desarrollarse en la superficie de medios de cultivo sólidos. Las diferencias en el tamaño, forma y ciertos detalles estructurales son característicos de los principales grupos de bacterias, y proporcionan las bases fundamentales para su estudio sistemático e identificación. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS BACTERIAS

Presentan una forma en cocos o bacilos. Su tamaño es aproximadamente 10 micras 1x10-6m. Generalmente se reproducen por bipartición. Son unicelulares.

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LA FORMA DE LAS BACTERIAS ADOPTA DISTINTOS TIPOS MORFOLOGICOS LO QUE SE CONOCE COMO PLEOMORFISMO LOS CUALES SON:

1. Coco : de forma esférica. 2. Diplococo: cocos en grupos de dos. 3. Tetracoco: cocos en grupos de cuatro. 4. Estreptococo: cocos en cadenas. 5. Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo. 6. Bacilo: en forma de bastoncillo. 7. Formas helicoidales: 8. Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, judía o cacahuete. 9. Espirilo: en forma helicoidal rígida o en forma de tirabuzón. 10. Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible).

TAXONOMÍA DE LAS BACTERIAS La taxonomía es, en su sentido más general, la ciencia de la clasificación. Habitualmente, se emplea el término para designar a la taxonomía biológica, la ciencia de ordenar a los organismos en un sistema de clasificación compuesto por una jerarquía de taxones anidados.

Objetivo de la Taxonomia Es dar un ordenamiento de las unidades taxonómicas básicas (especie). Especie bacteriana: es un conjunto de poblaciones clonales que presenta un elevado grado de similitud fenotípica entre si y que a su ves difiere de otros conjuntos de poblaciones clonales. Carac terización

Ideal: Caracterización completa de genotipo (es decir de su constitución genética)

Real: Caracterización parcial del fenotipo (apariencia) LOS PRINCIPALES TAXONOMÍAS BACTERIANAS

Dominio Bacteria (Eubacteria) Reino Proteobacteria Sección g-Proteobacteria

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Clase Zymobacteria Orden Enterobacteriales Familia Enterobacteriaceae Género Escherichia Especie E. coli Morfovar propiedades morfológicas Biovar propiedades bioquímicas Serovar propiedades antigénicas Fagovar sensibilidad a fagos Patovar propiedades patogénicas

Coloración de Gram Negativo: se observan bacilos aislados de

color rosado (coloración dada por la safranina).

Positivo: se observan cocos agrupados en estafilos (estafilococos) de color violeta, típico de una coloración de Gram (+).