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Revista Electrónica Iberoamericana de Educación en Ciencias y Tecnología — Volumen 6, Número 2, Junio 2015. Página 51

Técnicas de obtención de cuerpos de moluscos lymneidos para

su identificación taxonómica

Tomassi CA.; Soria CC.; Fresco M.J.; Covarrubia E.; Valdez P.; Malandrini JB. Facultad de Ciencias de la Salud. UNCa.

[email protected]

RESUMEN

Fasciolosis es una zoonosis parasitaria con un ciclo de vida donde participa como hospedero intermedio un caracol de agua dulce. Los moluscos de la Familia Lymnaeidae, (Gasterópoda, Pulmonata) modelan la transmisión de Fasciola hepatica de acuerdo a la especie de caracol involucrado Limnea viatrix fue considerado durante años como el único hospedero involucrado en la epidemiología de la enfermedad en Argentina. Estudios recientes demuestran la presencia de otras especies, y que los caracoles intervinientes en los casos humanos y animales, inclusive de la misma zona, serían de distintas especies.

El objetivo del presente trabajo fue reportar los resultados comparativos obtenidos con distintas técnicas utilizadas para la observación morfológica de caracoles que permitan identificar los principales hospederos intermediarios que intervienen en la parasitosis.

Se colectaron a mano caracoles (n = 673) de una vega ubicada a la vera del río Abaucán (27°29´52” S - 67°35´53,5 O) a 1650 mnm y se trasladaron vivos al laboratorio. Los moluscos se separaron en lotes iguales y se enfrentaron para estudio con tres técnicas: una directa, la de Railliet y la propuesta por Pointier, para poder obtener la separación de su cuerpo, conchilla, aparato reproductor masculino y una porción de su pie, permitiendo una mejor observación de los órganos internos de los caracoles para su reconocimiento taxonómico e identificación por morfología. Paralelamente se sacó

Técnicas de obtención de cuerpos de moluscos lymneidos para su identificación taxonómica: Tomassi CA.; Soria CC.; Fresco M.J.; Covarrubia E.; Valdez P.; Malandrini JB.


la parte blanda de la Lymnea en busca de formas intermedias de Fh en el hepatopáncreas del molusco.

Los resultados permiten afirmar que la técnica recomendada por Pointier es la de más fácil aplicación, además de ser más económica. Los resultados obtenidos permiten acercar nuevos conocimientos sobre la enfermedad y los actores involucrados en el mantenimiento y difusión de la parasitosis.

Palabras clave: Técnicas; Lymneidos; Identificación; Taxonomía; Catamarca

Getting technical lymneidos mollusc bodies for taxonomic

identification

ABSTRACT

Fascioliasis is a zoonosis with a life cycle where it participates as a snail intermediate host of fresh water. Mollusks of the Family Lymnaeidae, (Gastropoda, Pulmonata) model Fasciola hepatica transmission according to the snail species involved. Limnea viatrix was considered for years as the only host involved in the epidemiology of the disease in Argentina. Recent studies show the presence of other species, and that the snails involved in human and animal cases, including in the same area, would be of different species.

The aim the present work was report the comparative results obtained with different techniques used for morphological observation of snails that allow identify the main hosts intermediaries that intervene in the parasitosis.

Snails were collected by hand (n = 673) of a plain located on the banks of the Abaucán river (27 ° 29'52 "S - 67 ° 35'53, 5 O) 1650 masl and moved to the laboratory alive. The mollusks were separated into equal lots and clashed for study with three techniques: a straightforward as that of Railliet and the proposal for Pointier, order to obtain the separation of his body, shells, male reproductive system and a portion of your foot, allowing better observation of the internal organs of the snails for taxonomic recognition and



identification by morphology. Parallel pulled the soft part of the Lymnaea in search of intermediate forms of Fh in the liver - pancreas of shellfish.

The results confirm that the technique recommended by Pointier is the easiest to implement, as well as being cheaper. The results allow us to bring new knowledge about the disease and the actors involved in the maintenance and dissemination of the parasite.

Keywords: Techniques; Lymneidos; Identification; Taxonomy; Catamarca

INTRODUCCIÓN

Fasciolosis es una zoonosis parasitaria con un ciclo de vida en el que

participa como hospedero intermedio un caracol de agua dulce. Los moluscos de

la Familia Lymnaeidae, (Gasterópoda, Pulmonata) modelan la transmisión de

Fasciola hepatica de acuerdo a la especie de caracol involucrado. Lymnaea viatrix

fue considerado durante años como el único hospedero en la epidemiología de

fasciolosis en Argentina (1). Estudios recientes demuestran la presencia de otras

especies involucradas y sostienen que los caracoles intervinientes en los casos

humanos y animales, inclusive de la misma zona, son de distintas especies (2).

Es necesario estudiar los diversos lymneidos encontrados en distintas

regiones de Catamarca debido a que se desconocen las especies que habitan en

un mismo nicho ecológico y que a su vez pudieran actuar de manera diferencial en

la dinámica de transmisión. Está posibilidad se presenta por parámetros de tipo

fisiográficos y factores climáticos.

La obtención de cuerpos de moluscos del género Lymnaedae permite

realizar observaciones microscópicas para observar la estructura y disposición de

sus órganos reproductores como también su hepatopáncreas. Para la



identificación molecular de especies, se retira una porción de su pie para posterior

análisis que permita investigarlos a fin de describir con mayor precisión la

enfermedad con un importante número de afectados por la misma (1).

Por las condiciones de altitud, así como de temperatura (con variaciones

extremas durante el día), humedad y presión se encontrarían distintos genotipos

de lymneidos en diferentes regiones o en distintos nichos de una misma región y

causes de agua, los que a su vez podrían también variar en el modo de transmisión

de la fasciolosis en animales y en humanos.

Es por ello que con el fin de identificar los principales hospederos

intermediarios que intervienen en la parasitosis se colectan manualmente

ejemplares para su caracterización taxonómica y molecular en los distintos

departamentos de la provincia. Los resultados permitirán obtener nuevos

conocimientos sobre la enfermedad y los actores involucrados en el

mantenimiento y difusión de la parasitosis (1).

El objetivo del presente trabajo fue reportar los resultados comparativos

obtenidos con distintas técnicas utilizadas para la observación morfológica de

caracoles que permiten identificar los principales hospederos intermediarios que

intervienen en el ciclo de fasciolosis.

REFERENTE TEÓRICO

Hay que tener en cuenta que la fasciolosis es una enfermedad presente

desde la antigüedad que fue hallada en poblaciones humanas prehistóricas,

considerada una patología secundaria hasta mediados de los años `90. Fue

recientemente incluida por la Organización Mundial de la Salud en la lista de

importantes enfermedades parasitarias humanas y se encuentra en el grupo de

las 17 enfermedades tropicales desatendidas (“neglected tropical diseases”). El

desarrollo del parásito es muy dependiente de las características ambientales de

acuerdo con la naturaleza de las fases del ciclo de vida libre que ocurren en el

entorno externo de agua dulce y la fase de vector, que se desarrolla



completamente dentro de un caracol del género Lymnaea. Estudios realizados

recientemente han demostrado que es un problema importante de salud pública,

y los casos humanos se han incrementando en 51 países de los cinco continentes

(3). Sin embargo, un análisis global de la distribución geográfica de casos humanos

muestra que la correlación esperada entre fasciolosis animal y humana sólo

aparece en un nivel básico. Altas prevalencias en los seres humanos no parecen

estar necesariamente relacionadas con áreas donde la fasciolosis es un gran

problema de los animales.

Fasciola hepatica muestra un gran potencial de adaptación a nuevas

condiciones ambientales, consecuencia de la propia capacidad parasitaria junto

con la adaptación y habilidad de colonización de los hospedadores intermediarios.

Conocidos patrones epidemiológicos de fasciolosis pueden no siempre explicar las

características de transmisión en una zona determinada. Cuando se trata de una

zona endémica no estudiada previamente, los patrones epidemiológicos

conocidos de fasciolosis siempre deben tenerse en cuenta simplemente como la

base de partida, la adaptación a las nuevas condiciones ambientales puede

cambiar las características de las especies intermedias.

La ecología de la fasciolosis está estrechamente relacionada con la de los

caracoles que sirven de hospedadores intermediarios. Los caracteres fisiográficos,

la composición del suelo y los factores climáticos determinan el ritmo de la

reproducción de las Lymnaea y, por consiguiente, la dinámica epidemiológica.

El ciclo de infección en la naturaleza se mantiene mediante animales y los

caracoles de la familia Lymnaeidae. Desde el punto de vista ecológico, los hábitats

de Lymnaea pueden dividirse en dos grandes clases: focos primarios o reservorios

y áreas de extensión o diseminación. Los focos primarios son parajes

permanentemente húmedos, como ríos de poco curso, lagos, lagunas y acequias,

donde los caracoles se reproducen de modo constante. Los campos húmedos de

suelo arcilloso constituyen otro tipo de reservorio. Las áreas donde se alternan

inundaciones y estados secos son de especial interés epidemiológico. Estos

lugares de extensión de los focos originales contienen grandes concentraciones

de Lymnaea.



Los hábitat temporales o de extensión en los campos de pastoreo

constituyen las áreas enzoóticas donde ocurren brotes graves de fasciolosis (4).

En Argentina se ha registrado la presencia de Lymnaea viatrix en la provincia de

Buenos Aires (5) y en provincias del Centro, Centro-Oeste y Sur (6, 7, 8), L.

diaphana en Patagonia (9), Galba truncatula al norte de la Patagonia (10) y

Pseudosuccinea columella en el noreste del país (6, 11).

Estudios previos han demostrado diferencias a nivel del parásito y de su

hospedador intermediario que se pueden interpretar como estrategias

relacionadas con la adaptación a las condiciones geográficas (12).

El uso de técnicas moleculares para identificar y diferenciar Lymneidos sp

ofrece ventajas considerables; en los últimos años, los métodos basados en PCR

han permitido la rápida caracterización del parásito (13, 14, 15). La disponibilidad

de una variedad de técnicas moleculares también provee un método de dilucidar

la biología, epidemiología, genética y evolución de Lymnaea sp. así como medidas

de control más efectivas (15).

Paraense utilizando la morfología clásica, ha reportado para la región de

América del Sur las siguientes especies: L. viatrix Orbigny, 1835, L. columella Say,

1817, L. diaphana King, 1830, L. cousini Jousseaume, 1887, L. rupestris Paraense,

1982, L. plicata Scott, 1953, la especial identificación de estos lymneidos está

basada en la comparación de caracteres morfológicos de la conchilla, rádula, riñón

y órganos reproductivos.

En efecto, Parense, nombró a L. peregrina Clessin, 1882 como un sinónimo

de L. columella. Se reportaron en el norte del Altiplano boliviano L. viatrix y L.

cubensis Peiffer, 1839 pero se sugirió que esas dos especies corresponden a dos

formas extremas de la especie europea L. truncatula. (16)

L. columella fue identificada por primera vez en Argentina en la provincia

de Misiones por Scott en 1953 (17). L. cubenisis fue encontrada en Venezuela y en

varios sitios de República Dominica. L. truncatula en Francia (18). L. plicata Hylton-

Scott, 1953 fue encontrada en la provincia de Chubut Argentina (19). En Perú L.



neotropica (es igual a L. viatrix var. B elongata) y fue diferenciada como las dos

especies presentes junto con L. viatrix (20).

METODOLOGÍA

En una vega del rio Abaucán (27° 29' 52 "S - 67° 35' 53,5 O) localizada

aproximadamente a1650 msnm, se colectaron manualmente los moluscos

presentes (n = 673) y fueron llevados vivos al laboratorio en donde iban a ser

sometidos a las diferentes técnicas.

Fueron separados (n=224) para realización con técnica de Paraense, para

técnica de Pointier (n=225) y los restantes para observación directa de la

morfología de su conchilla

La técnica de Railliet (21) consiste en un protocolo para la fijación y

conservación de moluscos de agua dulce que comprende tres etapas, una de

relajación, una de sacrificio y finalmente otra de fijación y conservación.

En la etapa de relajación se colocaron los caracoles recolectados en una

solución de agua declorinada a temperatura ambiente con tres a siete cristales de

mentol en cápsulas de Petri, durante aproximadamente 20 minutos luego durante

el proceso, se corroboró continuamente que los moluscos se encuentren

sumergidos, para que no pudieran realizar movimientos, perder el contacto con la

solución y de este modo no lograr una relajación completa, Se los tapó

parcialmente con las tapas de la capsula para permitir que entre aire. Luego de

realizar esto se observó claramente como los cuerpos de los moluscos empezaran

a salir en parte de las conchillas. Este procedimiento se continuó hasta corroborar

su relajación o inmovilidad completa.

El sacrificio se logró sumergiendo a los caracoles relajados en agua a 70ºC

durante 40-45 segundos (tiempo sugerido para ejemplares de entre 10 y 20 mm de

largo), inmediatamente después de hacer esto se colocan los caracoles muertos

en agua fría para evitar la cocción de los tejidos, y por último se desprende el

cuerpo de la conchilla tirando del pie con una pinza adecuada.



En la etapa de fijación y conservación del proceso se colocan los cuerpos

de cada caracol en líquido fijador Railliet-Henry que se prepara en una solución

con formol 4% neutralizado (50 ml), solución fisiológica (930 ml); y ácido acético

glacial (20 ml), teniendo en cuenta que el volumen del fijador debe ser veinte

veces mayor al volumen del cuerpo. Transcurridas 24 horas se renovó el líquido

fijador. Finalmente se pudo conservar el material en el fijador por tiempo

indefinido manteniéndolo en un recipiente hermético. Para evitar posibles

confusiones, como actividad final se rotuló con un mismo código el cuerpo y la

conchilla de cada espécimen para saber qué tipo de cuerpo estamos analizando

con su conchilla correspondiente

La técnica Pointier consiste en trasladar los caracoles al laboratorio,

lavándolos con agua para de este modo eliminar posibles suciedades arrastradas

en la recolección de las zonas de obtención. A posteriori se colocan los moluscos

en agua caliente (a 70°C) aproximadamente 30 segundos, consiguiendo la muerte

de los lymneidos. Inmediatamente se deben colocar en agua fría para evitar la

cocción de los mismos, se dispone de un colador con el que se sumergen los

moluscos y así retirarlos más fácil y rápidamente una vez transcurrido el tiempo

que deban estar en agua caliente.

Una vez realizado este procedimiento se colocan los ejemplares en una

solución de alcohol 70° durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, los cuerpos

de los lymneidos se desprenden con una pinza adecuada o una aguja, conseguido

esto se debe quitar una porción del pie de estos moluscos que posteriormente

será utilizada para identificación de su especie mediante análisis molecular. Tanto

el pie como el cuerpo de estos ejemplares debe ser conservado en alcohol 70° pero

no así las conchillas las que no requieren de ninguna solución conservante.

Se conservan conchilla, cuerpo y pie de cada molusco en un recipiente

hermético, se identifican cada uno con un mismo código para luego con la

obtención de los resultados de análisis molecular poder realizar especificaciones

de la conchilla y del los órganos reproductores que se pudieran observar a

microscopio con los cuerpos.



La tercera técnica consistió en una observación directa de los ejemplares

obtenidos a simple vista, tomando en cuenta los diferentes aspectos de los

moluscos.

RESULTADOS

Los resultados comparativos obtenidos con distintas técnicas utilizadas

para la observación morfológica de caracoles permitieron identificar los

principales hospederos intermediarios y reportar que la técnica de Pointier es la

más práctica y económica para ser utilizada en la rutina del laboratorio

malacológico (Véase Tabla 1, anexo 1).

De las técnicas utilizadas para la obtención de cuerpos de los distintos

ejemplares se concluye que estas presentan ventajas y desventajas

comparándolas entre sí.

En la técnica de Railliet se pueden obtener cuerpos que presenten mayor

relajación en sus órganos internos que presentan otras técnicas, los cuales

permitirán una observación con mayor detalle de los mismos al microscopio

pudiendo obtener de esta forma la realización de un boceto de estos. En contra

posición al conservar los cuerpos mediante este procedimiento no se pueden

obtener porciones de pie de estos caracoles para análisis molecular, además de

presentar mayores costos al emplear cristales de mentol.

Con la técnica de Pointier se permite una obtención con mayor rapidez y

menos costos de los cuerpos de los lymneidos al emplear para su uso agua y

alcohol. Como desventaja presenta que mediante esta técnica los órganos

internos que se observaran a microscopio no lograrán una relajación como la

obtenida en la técnica anterior, por lo que la identificación de las diferentes partes

será más dificultosa.

La tercera técnica de observación en forma directa a pesar de ser rápida y

no requerir de múltiples instrumentos, presenta resultados de baja confiabilidad



debido a que estos están condicionados a la subjetividad del observador al

momento de realizar la observación.

CONCLUSIONES

La técnica que brinda mejores resultados de trabajo es la propuesta por Pointier

debido a que permite con menores costos obtener importantes ventajas para la

identificación morfológica de moluscos y permitir un posterior empleo de los

mismos en análisis de técnicas enzimáticas.

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2009

AGRADECIMIENTOS

A los doctores, Carlos Ovejero; Roberto Córdoba y a la Agente Sanitario Agustina López

por su invalorable colaboración en la obtención de los ejemplares y a la Doctora Lucila

Prepelitchi por su desinteresada colaboración en la capacitación de la becaria.

Esta investigación fue realizada en el marco del proyecto de investigación “Estudio

epidemiológico y molecular de la transmisión de Fasciola hepatica en diferentes

ecosistemas: aplicaciones al diagnostico y prevención de la zoonosis”. Subsidiada por la

Secretaria de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Catamarca.

Tabla 1

Características de las técnicas de estudio de moluscos del género Lymnaea _______________________________________________________________

Técnicas Características Observación

Directa Técnica de Pointier Técnica de Railliet



Materiales Pinzas Microscopio (eventualmente)

Agua destilada Mechero Termómetro Pinzas Bisturí Alcohol Capsulas de Petri Tubos herméticos Pipetas.

Agua declorinada Agua destilada Cristales de Mentol Mechero Termómetro Pinzas Alcohol Capsulas de Petri Tubos herméticos Pipetas.

Tiempo Dependiente de la cantidad de moluscos a observar

Poco más de 24 hs Cerca de 30 hs

Ventajas Observación rápida en corto tiempo.

Menos Costos y mayor rapidez de trabajo, además del posible empleo de los moluscos trabajados para análisis con técnicas de reacción enzimática en la identificación de especies de los gasterópodos.

Relajación de los cuerpos de los lymneidos para observación de sus sistemas de identificación como el reproductor.

Desventajas Baja fiabilidad de los datos obtenidos debido a la subjetividad en la observación del operador.

Baja o nula relajación de los cuerpos de los lymneidos para observación de sus sistemas de identificación como el reproductor

Costos mayores en comparación con otras técnicas, mayores tiempos de trabajo y la imposibilidad de empleo de los moluscos trabajados para análisis con técnicas de reacción enzimáticas que brinden una identificación de las especies de gasterópodos.

Fuente propia

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