tÉcnicas de intensificaciÓn de la crÍa de juveniles de

TÉCNICAS DE INTENSIFICACIÓN DE LA

CRÍA DE JUVENILES DE ASTÁCIDOS

(Pacifastacus leniusculus) DURANTE

LOS SEIS PRIMEROS MESES

UNIVERSIDAD DE LEÓN

Departamento de Producción Animal Universidad de León, España

León, 2010

ROCÍO GONZÁLEZ LÓPEZ

TÉCNICAS DE INTENSIFICACIÓN DE LA CRÍA DE JUVENILES DE ASTÁCIDOS (Pacifastacus leniusculus) DURANTE

LOS SEIS PRIMEROS MESES

Memoria de Tesis Doctoral presentada por Rocío González López dirigida por Jesús Domingo Celada Valladares y

José Manuel Carral Llamazares para acceder al grado de doctor con mención europea

León, mayo de 2010

Los Drs. D. Jesús Domingo Celada Valladares y José Manuel Carral Llamazares como Directores1 de la Tesis Doctoral titulada “Técnicas de intensificación de la cría de juveniles de astácidos (Pacifastacus leniusculus) durante los seis primeros meses” reali-zada por Dña. Rocío González López en el Departamento de Producción Animal, infor-man favorablemente el depósito de la misma, dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 11.3 del R.D. 56/2005, en León a _____ de________________de 2010.

Fdo.: Jesús D. Celada Fdo.: José M. Carral

1 Si la Tesis está dirigida por más de un Director tienen que constar los datos de cada uno y han de firmar todos ellos.

INFORME DEL DIRECTOR DE LA TESIS(Art. 11.3 del R.D. 56/2005)

El Departamento de _______________________________ en su reunión celebra-da el día ___ de _____________ de ________ ha acordado dar su conformidad a la ad-misión a trámite de lectura de la Tesis Doctoral titulada “Técnicas de intensificación de la cría de juveniles de astádos (Pacifastacus leniusculus) durante los seis primeros meses”, dirigida por el Dr. D. Jesús Domingo Celada Valladares y el Dr. D. José Manuel Carral Llamazares, elaborada por Dña. Rocío González López, y cuyo título en inglés es el si-guiente “Intensification techniques of astacid juvenile (Pacifastacus leniusculus) rearing for the first six months”.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 11.3 del R.D. 56/2005, en León a _____ de __________________ de ___________.

El Secretario,

Fdo.: ____________________ Vº Bº El Director del Departamento,

Fdo.: ____________________

ADMISIÓN A TRÁMITE DEL DEPARTAMENTO(Art. 11.3 del R.D. 56/2005 y

Norma 7ª de las Complementarias de la ULE)

“La felicidad no es hacer lo que uno quiere sino querer lo que uno hace”

Jean Paul Sartre

1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA DE LAS PUBLICACIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2. INTRODUCTION AND JUSTIFICATION OF THE THEMATIC UNIT OF THE PUBLICATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3. LISTA DE PUBLICACIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4.1. ESPECIES DE CANGREJOS DE RÍO DE INTERÉS EN ACUICULTURA . . . . . . . . . 18 4.2. CICLO VITAL Y CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE INTERÉS PRODUCTIVO . .19 4.3. HISTORIA Y SITUACIÓN ACTUAL DEL CULTIVO DE ASTÁCIDOS . . . . . . . . . . . . . 21 4.4. ESTADO ACTUAL DE LA INVESTIGACIÓN EN CULTIVO DE ASTÁCIDOS . . . . . . 22

4.4.1. Fase reproductiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.4.1.1. Incubación maternal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.4.1.2.Incubaciónartificial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4.4.1.3. Almacenamiento y transporte de huevos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

4.4.2. Cría de juveniles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.4.2.1. Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.4.2.2. Abastecimiento de agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.4.2.3. Alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.4.2.4. Origen de los juveniles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4.4.2.5. Densidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4.4.2.6. Frecuencia de aporte de alimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4.4.2.7. Sustrato y refugios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 4.4.2.8. Iluminación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 4.4.2.9. Perspectivas de futuro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5. OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

6. MATERIAL Y MÉTODOS GENERALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

6.1. CANGREJOS, INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTO BÁSICO DE EXPERIMENTACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

6.2. ALIMENTACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

6.3. RECOGIDA Y ANÁLISIS DE DATOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

7. SECUENCIA DE EXPERIMENTACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

7.1. ESTUDIO I: INCUBACIÓN ARTIFICIAL DE HUEVOS DE CANGREJO DE RÍO: REVISIÓN Y ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LOS EFECTOS DEL ORIGEN DE LOS JUVENILES (INCUBACIÓN MATERNAL O ARTIFICIAL) SOBRE SU POSTERIOR SUPERVIVENCIA Y CRECIMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 7.1.1. Planteamiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 7.1.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 7.1.3. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

11

ÍNDICE

7.2. ESTUDIO II: DENSIDAD PARA LA CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES, UTILIZANDO NAUPLIOS DE ARTEMIA COMO SUPLEMENTO DE UNA DIETA SECA DESDE EL INICIO DE LA ALIMENTACIÓN EXTERNA . . . . . . . . . . . . 42 7.2.1. Planteamiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 7.2.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 7.2.3. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

7.3. ESTUDIO III: QUISTES DECAPSULADOS DE ARTEMIA COMO SUPLEMENTO ALIMENTICIO PARA JUVENILES A DIFERENTES FRECUENCIAS DE ALIMENTACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 7.3.1. Planteamiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 7.3.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 7.3.3. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

7.4. ESTUDIO IV: REFUGIOS Y CONDICIONES DE ILUMINACIÓN PARA LA CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES DESDE EL COMIENZO DE LA ALIMENTACIÓN EXTERNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 7.4.1. Planteamiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 7.4.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 7.4.3. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

7.5. ESTUDIO V: CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES DURANTE LOS SEIS PRIMEROS MESES: EFECTOS DE LA CLASIFICACIÓN POR PESO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 7.5.1. Planteamiento experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 7.5.2. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 7.5.3. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

8. DISCUSIÓN GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

9. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

10. CONCLUSIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

11. RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

12. SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

13. BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

14. AGRADECIMIENTOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

15. ANEXO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

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Índice

Durante las últimas décadas, el con-sumo mundial de productos acuáticos de origen animal se ha incrementado en gran medida. La imposibilidad de cubrir esta creciente demanda mediante una actividad pesquera racional hace que la acuicultura adquiera cada vez más importancia, cons-tituyendo una alternativa real para disminuir la diferencia que existe entre la demanda y la oferta de estos productos, así como para resolver problemas de conservación de es-pecies mediante repoblación. Según las últi-mas estimaciones de la FAO, publicadas en 2008, se ha pasado de una producción infe-rior al millón de toneladas en los años 50 a 51,7 millones de toneladas en 2006. Dentro de ello, los crustáceos cultivados represen-taban el 9% en 2006, si bien el alto valor que alcanzan estas especies en el merca-do determina que, en términos económicos, aportaran un 23% del total. La mayor parte de la producción acuícola procede de aguas continentales. La acuicultura continental aporta un 58% en cantidad, lo que repre-senta un 48% del valor total de los animales cultivados (FAO, 2008).

Todos los crustáceos objeto de cría en la actualidad son decápodos macruros, prin-cipalmente varias especies de langostinos de los géneros Penaeus y Metapenaeus, el camarón de agua dulce (Macrobrachium ro-senbergii) y diversas especies de cangrejos de río, la mayoría pertenecientes a la fami-lia astácidos, y además algunos cambáridos y parastácidos.

A partir de los años 60, se ha venido desarrollando un creciente interés por el cultivo de astácidos en Europa, donde son considerados un alimento de lujo y alcan-zan elevados precios en el mercado. Las especies de mayor importancia ecológica, productiva y gastronómica son el cangrejo noble (Astacus astacus L.), el cangrejo de

patas blancas (Austropotamobius pallipes Lereboullet), el cangrejo de patas largas (Astacus leptodactylus Eschscholtz) y el cangrejo señal (Pacifastacus leniusculus Dana). Se han contabilizado más de 760 as-tacifactorías en la UE (entonces con solo 15 países), en su mayoría dedicadas al cultivo del cangrejo señal (Pérez et al. 1997a). Los sistemas son, generalmente, de tipo exten-sivo y, en el mejor de los casos, semiexten-sivo (Pérez et al. 1997b). En tales circuns-tancias, las diferentes etapas del proceso productivo están sujetas a factores ambien-tales de difícil control, con rendimientos ba-jos e impredecibles. Esto ha conducido en numerosos países al desarrollo de líneas de investigación para la intensificación y mejo-ra de las distintas fases del cultivo.

Respecto a la reproducción, en an-teriores investigaciones con P. leniuscu-lus y A. pallipes, este grupo ha llegado a la puesta a punto de técnicas de gran va-lor aplicativo en la fase reproductiva, que abarcan desarrollo gonadal, maduración, apareamiento, oviposición, embriogénesis en incubación maternal (Celada et al. 1985, 1987, 1988, 2001a, 2005, 2006, Carral et al. 2000), sistemas de incubación artificial (Carral et al. 1992, 2004, 2009, Pérez et al. 1998a, 1998b, 1999, Celada et al. 2004, Melendre et al. 2006, 2007, Sáez-Royuela et al. 2009, González et al. 2010a, 2010b), así como almacenamiento y transporte de huevos (Celada et al. 2000, 2001b, Pérez et al. 2003), todo ello orientado a la mejora de cada una de las etapas del largo proceso que finalmente culmina con la obtención del juvenil estado 2. Además, se ha comproba-do repetidamente que los resultados obteni-dos y las técnicas desarrolladas en una es-pecie son, en gran medida, aplicables a la otra y, por extensión, a otros astácidos eu-ropeos, con las modificaciones adaptativas oportunas en cada caso.

Introducción y justificación de la unidad temática de las publicaciones

1. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN DE LA UNIDAD TEMÁTICA DE LAS PUBLICACIONES

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Introducción y justificación de la unidad temática de las publicaciones

Una vez que se ha logrado una acepta-ble eficiencia en la producción de juveniles, el siguiente paso ha de abordar la mejora de las tasas de supervivencia y de crecimiento de los animales obtenidos en la fase reproducti-va. Para ello, el primer factor a considerar es la alimentación. En trabajos llevados a cabo con juveniles de astácidos desde el comien-zo de la alimentación externa (Mason 1979, D’Abramo et al. 1985, Gydemo y Westin 1989, Celada et al. 1989, 1993, Ackefors et al. 1989, 1992, 1995, Taugbøl y Skurdal 1992, Hentto-nen et al. 1993, Blake et al. 1994, Sáez-Ro-yuela et al. 1995, 1996, 2001, Savolainen et al. 2003, 2004), se ha probado una amplia gama de alimentos, tanto frescos como elabo-rados artificialmente. Sin embargo, dentro de una desconcertante variabilidad de resultados, ninguno de ellos permitió alcanzar aceptables tasas de supervivencia y de crecimiento. Re-cientemente, Sáez-Royuela et al. (2007) han señalado que las causas se encuentran vin-culadas a deficiencias nutritivas, relacionadas con factores esenciales desconocidos, que pueden ser aportados por alimento vivo (Arte-mia o Daphnia). Posteriormente, González et al. (2008) han cuantificado las cantidades óp-timas de nauplios vivos de Artemia como su-plemento de una dieta compuesta seca para salmónidos, alcanzando altas tasas de super-vivencia y un crecimiento mucho mayor que el obtenido hasta entonces durante el mismo período (100 días). Estos estudios establecen las bases para una alimentación adecuada, que ha permitido superar el bloqueo sufrido por los procesos de investigación durante 30 años, provocado por resultados que probable-mente han respondido más a una deficiente alimentación que a efectos de los tratamien-tos experimentales. A partir de aquí, otros fac-tores importantes en la cría de juveniles pue-den ser estudiados sin el riesgo de que los resultados se distorsionen, enmascarados por una alimentación inadecuada.

Sobre esta base, las investigaciones para la mejora de las técnicas de cría de ju-veniles de astácidos han de orientarse al es-tudio de aspectos relacionados con prácticas de manejo y condiciones ambientales, cen-trado no solo en el incremento de las tasas de supervivencia y de crecimiento sino tam-bién en las posibilidades de reducir trabajo y costes, así como en obtener información sobre la respuesta de los juveniles a perío-dos de cría desde el inicio de la alimenta-ción externa más largos que los alcanzados hasta el presente. Así, los factores de mayor importancia tanto para la mejora de los pro-cesos productivos como de sus resultados constituyen el objeto de esta Tesis, y son los siguientes:

- Efectos del origen de los juveniles: in-cubación maternal o incubación artifi-cial. Publicación I.

- Densidades adecuadas para la cría intensiva. Publicación II.

- Simplificación de las prácticas vincu-ladas a la alimentación. Publicación III.

- Condiciones adecuadas de disponibi-lidad de refugios y de iluminación. Pu-blicación IV.

- Cría intensiva durante los seis prime-ros meses, evaluando efectos de la clasificación por peso. Publicación V.

Estas investigaciones se han llevado a cabo dentro del proyecto del Plan Nacional de I+D+i “Técnicas de cría de juveniles de astácidos (P. leniusculus Dana) en condicio-nes controladas”, referencia AGL2005-01127. Las cinco publicaciones que sustentan esta Tesis se relacionan en el apartado 3.

14

Introduction and justification of the thematic unit of the publications

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Over the last decades, worldwide consumption of aquatic products of animal origin has grown dramatically. The impossi-bility of meeting this increasing demand by means of a reasonable fishing activity leads aquaculture to gain more and more impor-tance, reducing the difference between de-mand and supply of these products, as well as solving problems of species conservation through restocking. According to the FAO’s latest estimates published in 2008, produc-tion has increased from less than one million tonnes in the 1950s to 51.7 million tonnes in 2006. Cultured crustaceans accounted for 9% of the total production in 2006 and, in economic terms, those amounts (4.5 million tonnes) were worth US$ 17.95 billion (23% of the total value). Most aquaculture produc-tion comes from inland waters. Freshwater environment contributes 58% by quantity and 48% by value (FAO, 2008).

Currently, the crustaceans which are the object of culture belong to the order Decapoda, primarily species of the genera Penaeus and Metapenaeus, the freshwater shrimp (Macrobrachium rosenbergii) and several freshwater crayfish species, most of them belonging to family Astacidae, to-gether with some cambarid and parastacid crayfish.

Since the sixties, an increasing inter-est has been shown in astacid crayfish cul-ture in Europe, due to its gastromic quality as well as its high market Price. From the ecologic, productive and gastronomic point of view, the most important species are the noble crayfish (Astacus astacus L.), the white-clawed crayfish (Austropotamobius pallipes Lereboullet), the narrow-clawed crayfish (Astacus leptodactylus Eschscholtz) and the signal crayfish (Pacifastacus leni-usculus Dana). There are around 760 cray-fish farms in the EU (with only 15 countries

at that time), most of them devoted to the cultivation of signal crayfish (Pérez et al. 1997a). Culture systems are generally ex-tensive or semi-extensive at best. In such circumstances, the different phases of the productive process are subject to uncon-trolled factors, resulting in a low and unpre-dictable yield. This has led to the develop-ment of research lines investigating means to intensify and improve the culture phases in several countries.

As regards reproduction, in previous research with P. leniusculus and A. pal-lipes, this team developed techniques with a high application value in the reproductive phase, including gonadal development, mat-uration, mating, spawning, embriogenesis in maternal incubation (Celada et al. 1985, 1987, 1988, 2001a, 2005, 2006, Carral et al. 2000), artificial incubation systems (Carral et al. 1992, 2004, 2009, Pérez et al. 1998a, 1998b, 1999, Celada et al. 2004, Melendre et al. 2006, 2007, Sáez-Royuela et al. 2009, González et al. 2010a, 2010b), as well as egg transport and storage (Celada et al. 2000, 2001b, Pérez et al. 2003), aimed at improving each phase of the long process with ends with obtaining the stage 2 juve-nile. Moreover, it has been proved that the results obtained and techniques developed in one of the species can be, in large part, applied to the other, and by extension, to other European astacid crayfish, with appro-priate adaptative modifications as the case may require.

Having obtained acceptable efficiency in juvenile production, the next step is to in-crease animal survival and growth rates. The first factor to consider is feeding. In studies carried out under controlled conditions (Ma-son 1979, D’Abramo et al. 1985, Gydemo y Westin 1989, Celada et al. 1989, 1993, Ackefors et al. 1989, 1992, 1995, Taugbøl y

2. INTRODUCTION AND JUSTIFICATION OF THE THEMATIC UNIT OF THE PUBLICATIONS

Introduction and justification of the thematic unit of the publications

Skurdal 1992, Henttonen et al. 1993, Blake et al. 1994, Sáez-Royuela et al. 1995, 1996, 2001, Savolainen et al. 2003, 2004), a wide variety of foods have been tested in astac-id juveniles from the onset of exogenous feeding. However, results were usually un-satisfactory. Recently, Sáez-Royuela et al. (2007) reported that these poor results were mainly due to nutritional deficiencies, relat-ed to unknown essential elements that can be provided by live food (Artemia o Daph-nia). Later on, González et al. (2008) de-termined the optimum quantities of Artemia nauplii to supplement a dry diet for salmo-nids, which allowed high survival rates and a growth greater than that obtained so far for the same period (100 days). This knowl-edge constitutes an important advance in the research process and lays the founda-tions for an adequate feeding regime. Once the effects of the experimental treatments are no longer masked by deficient feeding, other important factors in juvenile rearing can be studied.

In this context, research on intensive juvenile astacid crayfish rearing has to aim at studying aspects related to management and environmental conditions, focused not only on increasing survival and growth rates but also on the possibilities of reducing la-bor and costs, in addition to obtaining infor-mation about the response of juveniles to rearing periods from the onset of exogenous

feeding which were longer than those test-ed so far. Thus, the more important factors involved in improving the productive proc-esses and the results constitute the aim of this thesis, whose specific objectives are as follows:

- Assessing possible influences of juve-nile origin: maternal incubation or arti-ficial incubation. Study I.

- Determining adequate densities for in-tensive rearing. Study II.

- Simplifying the practices linked with feeding. Study III.

- Determining adequate conditions of shelter and lighting. Study IV.

- Intensive rearing for the first six months, assessing effects of size grading. Study V.

This research was carried out in the aquaculture laboratories of the Animal Produc-tion Department at the University of León, over three consecutive years, within the framework of Research Project AGL2005-01127 “Rearing techniques of astacid juvenile (P. leniusculus Dana) under controlled conditions”, funded through the Plan Nacional de I+D+i. The five publications which support this thesis are as follows in the section 3.

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I. Autores: González R, Celada JD, García V, Carral JM, González A, Sáez-Royuela M (2009). Título: The artificial incubation of crayfish eggs: review and report from an experimental study concerning the effects of offspring origin (maternal or artificial incubation) on the survival and growth of juvenile signal crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae). Revista: Reviews in Fish Biology and Fisheries 19, 167-176.Factor de impacto (JCR 2008): 1.792Categoría: Fisheries 7/40

II. Autores: González R, Celada JD, González A, García V, Carral JM, Sáez-Royuela M (2010). Título: Stocking density for the intensive rearing of juvenile crayfish, Pacifastacus le-niusculus (Astacidae), using Artemia nauplii to supplement a dry diet from the onset of exogenous feeding.Revista: Aquaculture International 18, 371-378.Factor de impacto (JCR 2008): 0.608Categoría: Fisheries 31/40

III. Autores: González R, Celada JD, Carral JM, González A, Sáez-Royuela M, García V (2009).Título: Decapsulated Artemia cysts as dietary supplement for juvenile crayfish (Paci-fastacus leniusculus, Astacidae) at different food supply frequencies from the onset of exogenous feeding under controlled conditions.Revista: Aquaculture 295, 200-204.Factor de impacto (JCR 2008): 1.678Categoría: Fisheries 9/40

IV. Autores: González R, Celada JD, García V, González A, Carral JM, Sáez-Royuela M (2010). Título: Shelter and lighting in the intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus le-niusculus, Astacidae) from the onset of exogenous feeding. Revista: Aquaculture Research. En revisión.Factor de impacto (JCR 2008): 0.991Categoría: Fisheries 23/40

V. Autores: González R, Celada JD, Carral JM, García V, Sáez-Royuela M, González A (2010).Título: Intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) dur-ing the first six months: Effects of size grading. Revista: Aquaculture. En revisión.Factor de impacto (JCR 2008): 1.678Categoría: Fisheries 9/40

Lista de publicaciones

3. LISTA DE PUBLICACIONES

Revisión bibliográfica

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4.1. ESPECIES DE CANGREJOS DE RÍO DE INTERÉS EN ACUICULTURA

Existen más de 540 especies de can-grejos de río englobadas en el Suborden As-tacidea (Hogger 1988), que se encuentran distribuidas por todos los continentes, excepto en la Antártida (Holdich 2002). Dicho Subor-den se divide en dos Superfamilias: Astacoi-dea y Parastacoidea, según estén localizadas en el Hemisferio Norte o Sur, respectivamen-te. Aparte de su situación geográfica, existen importantes diferencias morfológicas y bio-lógicas entre ambos grupos al haber segui-do diferentes líneas evolutivas. En el primer caso, se pueden distinguir dos grandes fami-lias: Astacidae y Cambaridae. Los astácidos comprenden dos géneros de origen europeo (Astacus y Austropotamobius) y uno de pro-cedencia norteamericana (Pacifastacus). Los cambáridos, todos ellos originarios del conti-nente americano, engloban un gran número de géneros, entre los cuales tiene un interés preponderante el Procambarus por su ex-traordinaria capacidad adaptativa y su amplia expansión en las últimas décadas a través de buena parte de los ecosistemas dulceacuíco-las del continente europeo, así como del afri-cano y del asiático.

A nivel de especie, las de mayor im-portancia ecológica, productiva y gastronó-mica en los países europeos son: el cangrejo noble (Astacus astacus Linnaeus 1758), el cangrejo de patas blancas (Austropotamo-bius pallipes Lereboullet 1858), muy pareci-do al Austropotamobius torrentium Schrank 1803, el cangrejo de patas largas (Astacus leptodactylus Eschscholtz 1823), el cangrejo señal (Pacifastacus leniusculus Dana 1852) y el cangrejo rojo de los pantanos o de las marismas (Procambarus clarkii Girard 1852).

El cangrejo noble (A. astacus) tiene como área de origen el noroeste de Europa

(Rusia, países escandinavos, Polonia, Repú-blicas Checa y Eslovaca, Alemania, Hungría, Rumanía, antigua Yugoslavia y Holanda), habiéndose extendido a algunas zonas de Francia y Portugal.

Foto 1. Cangrejo noble.

El oeste europeo es la zona de distri-bución natural del cangrejo de patas blancas (A. pallipes), principalmente España, Inglate-rra, Gales, Irlanda, Francia, Italia y norte de Portugal. Existen también algunas poblacio-nes en Suiza y la antigua Yugoslavia.

Foto 2. Cangrejo de patas blancas.

La región centroeuropea constituye el área natural de A. torrentium (especialmente en Alemania y Francia).

El cangrejo de patas largas (A. lepto-dactylus) se distribuye de forma natural por el este de Europa (sur de la CEI, Turquía y Polonia), habiendo sido introducido reciente-mente en Francia y Alemania.

4. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA


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El cangrejo señal (P. leniusculus) procede de la zona noroeste de USA. A finales del siglo XIX fue introducido en estados del suroeste, ta-les como California. Su llegada al continente eu-ropeo tuvo lugar a lo largo de la década de los sesenta del siglo XX, comenzando por Suecia. Karlsson (1994) afirma que, desde entonces, se han desarrollado poblaciones de esta es-pecie en al menos 20 países europeos.

Foto 3. Cangrejo señal.

Según Hobbs (1972), las zonas panta-nosas del estado de Louisiana (localizado en el SE de Estados Unidos) y del NE de México son el área de origen del cangrejo rojo de los pantanos (P. clarkii). No obstante, Hobbs et al. (1989) señalan que gracias a las extraor-dinarias características biológicas y gran ca-pacidad de adaptación y propagación de esta especie, se ha producido su difusión por bue-na parte de América Central, América del Sur, África, Asia y Europa (fundamentalmente Es-paña, Francia y Portugal).

Por lo que se refiere a los cangrejos de río del Hemisferio Sur, éstos se encuentran dentro de la familia Parastacidae. A ella perte-necen catorce géneros distribuidos por Austra-lasia, Madagascar y la zona Sur del continente americano (Holdich 2002). Entre las especies de parastácidos de mayor interés por sus posi-bilidades de cultivo cabe destacar: el “yabbie” (Cherax destructor Clark 1936), cuya área ori-ginal se corresponde con el cuadrante sudeste de Australia; el “marron” (Cherax tenuimanus Smith 1912), originario de la zona suroeste de Australia, y el cangrejo de pinza roja (Cherax quadricarinatus Clark 1936) procedente del norte de Australia. Estos dos últimos parecen ser los de mayor proyección con vistas a su explotación, aunque la producción actual toda-

vía es insuficiente para satisfacer la demanda del mercado (Lawrence y Jones 2002).

4.2. CICLO VITAL Y CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE INTERÉS PRODUCTIVO

El ciclo biológico del cangrejo de río presenta importantes diferencias en el desa-rrollo cronológico de sus fases según las dis-tintas familias. De forma general y centrándo-nos básicamente en los astácidos, el proceso tiene lugar sólo una vez al año y se inicia con el desarrollo gonadal en machos y hembras durante la estación estival. De esta forma, co-incidiendo con el descenso de la temperatura y la reducción del fotoperíodo durante los me-ses de otoño, se desencadena un incremen-to de la actividad sexual de los reproductores que desemboca en el apareamiento (Foto 4). Este tiene lugar mediante cópula, cuando el macho realiza la deposición de los esperma-tóforos sobre la parte ventral media del ce-falotórax de la hembra, donde permanecen adheridos hasta que, unos días después, tie-ne lugar la oviposición, cuando se produce la fecundación. Los huevos quedan unidos a los pleópodos maternos hasta finalizar el desa-rrollo embrionario e incluso la primera muda.

Foto 4. Apareamiento.

Es de tener en cuenta que el cangrejo de río no presenta estados de metamorfosis tras la eclosión, con fases larvarias que se desplazan e ingieren alimento externo a su propio organismo, tal como sucede en otros crustáceos cultivados. La mayor cantidad de vitelo de los huevos permite un desarrollo completo, de manera que las fases larvarias tienen lugar en el interior del huevo y los juve-niles eclosionan directamente.

En comparación con otras especies de crustáceos, el cangrejo de río presenta valo-res de fecundidad francamente bajos. Así, en A. astacus se citan cifras medias de 80-200 huevos (Skurdal y Taugbøl 2002). El número de huevos en el cangrejo de patas largas (A. leptodactylus) oscila entre 100 y 300 (Skur-dal y Taugbøl 2002). Por su parte, A. palli-pes presenta puestas muy reducidas, con medias de 50-75 huevos/hembra (Brown y Bowler 1977, Arrignon 1981, Brewis y Bowler 1985, Woodlock y Reynolds 1988, Carral et al. 1994), cifras similares a las registradas en A. torrentium (Schellenberg 1928-cita Lau-rent 1988). Según Momot (1991), los valores medios de puesta en P. leniusculus varían entre 110 y 180 huevos por hembra, mien-tras que Reynolds (2002) considera valores hasta 270.

Los cambáridos y los parastácidos po-seen mayor fecundidad que los astácidos. En este sentido, las hembras de cangrejo rojo de los pantanos (P. clarkii) pueden presentar, como término medio, 400-450 huevos pleopo-dales (Lacaze 1970, Oluoch 1990), mientras que en los cangrejos del Hemisferio Sur se han registrado valores entre 200 y 1000 huevos por hembra (Morrissy 1974, Frost 1975, D.P.I. 1993, Jones 1995, Shipway 1951-cita Honan y Mitchell 1995, Lawrence y Jones 2002).

En todos los casos, el número de hue-vos de cada puesta se encuentra directamente relacionado con la talla de la hembra, al igual que sucede en otros animales acuáticos. Au-tores como Brewis y Bowler (1985), O’Keefe (1986), Carral et al. (1994) y Sáez-Royuela et al. (2006) han llegado en A. pallipes a fórmu-las de regresión lineal que relacionan la longi-tud del cefalotórax con el número de huevos pleopodales. Por otra parte, Lahti y Lindqvist (1983) y Sáez-Royuela et al. (2006) no han encontrado una relación directa entre la talla de la hembra y el diámetro de los huevos, si bien parece que las hembras más grandes suelen producir huevos mayores (Woodlock y Reynolds 1988). Finalmente, Sáez-Royuela et al. (2006) afirman que existe una correla-ción negativa, aunque débil, entre el número

de huevos de una puesta y el diámetro de los mismos.

Referente a la duración de la embriogé-nesis, existen importantes diferencias según la familia. Así, los astácidos en Europa presentan el período más largo con 6-8 meses en condi-ciones naturales (Hogger 1986a, 1986b, Cuker-zis 1988, Matthews 1992, Skurdal y Taugbøl 1994, 2002), frente a las 2-3 semanas registra-das a temperaturas de 22ºC por Suko (1956), Hill y Cancienne (1963) y Huner (2002) en el cangrejo rojo. En las especies del Hemisferio Sur, la embriogénesis dura entre 1 y 3 meses (Sammy 1988, Lawrence y Jones 2002).

Una vez que se ha producido la eclo-sión, los individuos resultantes son juveniles estado 1 que, tras un período de 7-10 días, en dependencia de la temperatura del agua, experimentan la primera muda pasando al segundo estado juvenil, que presenta aspec-to y morfología semejante al adulto. Durante los primeros meses de vida, las mudas son numerosas, espaciándose en el tiempo a me-dida que se aproxima la madurez sexual. La edad y la talla a las que alcanzan dicha ma-durez sexual son variables dependiendo de la especie, siendo factores ambientales como la temperatura y el oxígeno los que más influyen en el proceso (Reynolds 2002). En astácidos, A. astacus madura en torno a los 3-5 años de edad cuando alcanza entre 62 y 85 mm de longitud total (Skurdal y Taugbøl 2002). En el caso del cangrejo de patas blancas (A. pallipes), la madurez aparece a los 3-4 años con una longitud de cefalotórax de 22-26 mm, mientras que P. leniusculus normalmente ma-dura a los 2-3 años con 60-90 mm de longi-tud total en condiciones naturales, aunque en algunas regiones han sido encontrados ejem-plares maduros con un año de vida (Abra-hamsson y Goldman 1970, Abrahamsson 1971, Reynolds 2002). Una vez adquirida la capacidad reproductiva, los procesos de de-sarrollo gonadal, apareamiento, oviposición, desarrollo de los huevos y producción de ju-veniles tendrán lugar una vez al año duran-te aproximadamente una década (Skurdal y Taugbøl 2002).


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4.3. HISTORIA Y SITUACIÓN ACTUAL DEL CULTIVO DE ASTÁCIDOS

Las primeras actividades a pequeña escala de cría de cangrejos de río datan de la Edad Media en Europa y tuvieron lugar en estanques y pequeños cuerpos de agua si-tuados dentro de propiedades pertenecientes a diversas órdenes religiosas. Dichas activi-dades consistían, básicamente, en el mante-nimiento de animales y la producción de pe-queñas cantidades de cangrejos con vistas al consumo directo en los propios monasterios y núcleos de población circundantes.

Los primeros intentos serios de produc-ción en condiciones relativamente controladas se remontan a finales del siglo XIX y primera mitad del XX. De esta forma, Laurent (1988) y Arrignon (1989) hacen alusión al funciona-miento, durante el último tercio del siglo XIX, de la primera astacifactoría dedicada a la cría de cangrejo de río en Francia, mientras que Cukerzis (1984) cita a un industrial proce-dente de Alemania que, a partir de 1888, se dedicó en Lituania a la explotación de diver-sas poblaciones de cangrejos. En Alemania, Hofmann (1978) hace referencia a una explo-tación de cangrejo noble en funcionamiento durante la década de los 40 del siglo XX. En la década de los 90, se contabilizaban ya más de 760 astacifactorías en los 15 países de la UE (Pérez et al. 1997a).

Actualmente, según Pérez et al. (1997a) podría establecerse una clasificación de los métodos de cultivo, hasta la obtención de ju-

veniles destinados a la repoblación o de ejem-plares para alimento humano, en tres grupos: extensivo, semiextensivo e intensivo.

Extensivo. El abastecimiento de agua y condiciones de mantenimiento de los ani-males son naturales. La productividad es-pontánea sirve de base para la alimentación, aunque en algunos casos puede añadirse al-gún otro tipo de materias comestibles con el fin de facilitar un incremento de la densidad de población.

En ocasiones, puede existir un cier-to control por parte del hombre: mayor o menor aporte de alimento, regulación de la densidad de animales, fertilización del agua y limitación de la presencia de depredadores que, con frecuencia, constituyen un proble-ma. Todas las fases del cultivo tienen lugar en el mismo estanque, estableciéndose una verdadera estructura de población.

Semiextensivo. Se lleva a cabo en estanques diseñados específicamente para cangrejos. Normalmente, pueden vaciarse con el fin de facilitar el manejo y la recolec-ción de animales. Además del alimento na-tural generado en el estanque, los cangrejos pueden ver su dieta incrementada por apor-tes adicionales. Este sistema se diferencia del anterior por presentar un cierto grado de intensificación, definido fundamentalmen-te por la realización de prácticas de manejo que se efectúan en determinados momentos de la fase reproductiva.


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Foto 5. Estanques de reproductores en cultivo semiextensivo.

Así, al final del verano, los reproduc-tores se encuentran en estanques (Foto 5), donde se completa el desarrollo gonadal y tienen lugar el apareamiento y la oviposición. En todos los casos, las madres se mantie-nen, durante la casi totalidad del desarrollo embrionario, bajo condiciones naturales y a bajas densidades para limitar las pérdidas de huevos. Cuando la embriogénesis llega a fases terminales, las hembras con huevos se recogen de los estanques y se trasladan a lugares donde la eclosión tiene lugar bajo condiciones controladas, posibilitando así la recolección de juveniles. Estos pueden ser destinados directamente a repoblación (indi-viduos en estados 2 ó 3) o, cuando el cultivo se encuentra orientado a la obtención de ani-males para alimento humano, los juveniles son transferidos posteriormente a estanques al aire libre donde crecerán en condiciones seminaturales hasta la adquisición de la talla comercial.

Intensivo. Este sistema aún no ha sido aplicado en condiciones industriales, encontrándose en la actualidad en fases ex-perimentales. En un intento de alcanzar altos niveles productivos, todo el ciclo se llevaría a cabo ejerciendo un fuerte control de los fac-tores ambientales, la reproducción y la ali-mentación.

En definitiva, se puede concluir que los sistemas de cría extensivos y semiexten-sivos son los que se practican en el territo-rio europeo, si bien se contemplan diversas modificaciones encaminadas a la mejora de los procesos productivos. Frecuentemente, las actividades se orientan a la obtención de juveniles (bien en los estados 2 ó 3 o bien de un verano de vida) con destino a la re-población. Por lo que se refiere al cultivo de animales para alimentación humana, se está experimentando un cierto avance en algu-nos países, aunque la falta de conocimientos sobre aspectos tales como requerimientos nutritivos, patología y manejo durante estas etapas, obliga a trabajar en condiciones ex-tensivas y seminaturales.

4.4. ESTADO ACTUAL DE LA INVESTIGA-CIÓN EN CULTIVO DE ASTÁCIDOS

4.4.1. Fase reproductiva

Tiene como principal objetivo la obten-ción de juveniles estado 2, de vida indepen-diente. La baja fecundidad y el largo período de desarrollo embrionario son los principales inconvenientes de esta fase. La mayoría de los estudios sobre eficiencia reproductiva aportan resultados parciales, ya que se cen-tran en determinadas partes del ciclo, sin considerar el conjunto de pérdidas desde el desarrollo gonadal hasta la producción de juveniles estado 2. Son escasos los traba-jos que, mediante el mantenimiento de los reproductores bajo condiciones controladas durante todo este período, permiten el regis-tro de pérdidas en cada una de sus etapas y evaluaciones globales de eficiencia. Esto es necesario para determinar cuál sería la pro-ducción final de un stock de reproductores y, en consecuencia, para conocer el número de reproductores necesario para conseguir una producción concreta de juveniles estado 2.

4.4.1.1. Incubación maternal

Este término se refiere al proceso de de-sarrollo de los huevos, eclosión de los juveni-les estado 1 y muda al estado 2, que de forma natural tiene lugar en los pleópodos maternos.

Foto 6. Hembras de cangrejo señal con huevos (izquierda) y con juveniles (derecha).


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La densidad de reproductores es uno de los factores que más afecta a la eficiencia reproductiva en cultivo. En estanques de tie-rra, la densidad es normalmente baja, no más de 6 animales m-2 (Pursiainen et al. 1983, 1989, Ackefors 1996), e incluso inferior: 0,4 m-2 (Köksal 1988, Mackeviciené et al. 1997) ó 0,08 m-2 (De Luise y Sabbadini 1988). Celada et al. (2006) obtuvieron buenos resultados con 6,6 reproductores m-2. En tanques interiores de fibra de vidrio, Taugbøl y Skurdal (1990) recomendaron que, para A. astacus, la den-sidad no debería sobrepasar los 50 individuos m-2 en el apareamiento/puesta y 33 m-2 duran-te la incubación, señalando que cuanto más baja sea la densidad mayores serán las tasas de supervivencia de los huevos. En diferentes estudios llevados a cabo con A. pallipes bajo condiciones controladas (Carral et al. 1994, 2000, Celada et al. 2001a), concentraciones entre 7 y 24 reproductores m-2 no provoca-ron efectos negativos sobre la eficiencia re-productiva. Trabajando con P. leniusculus en condiciones controladas, los reproductores se han mantenido en tanques de fibra de vidrio a densidades entre 6 m-2 y 25 m-2 (Celada et al. 2005, 2006) con buenos resultados, a la vez que se ha conseguido reducir la proporción machos:hembras de 1:2 a 1:4.

En condiciones de cultivo, estudios lle-vados a cabo con A. astacus han aportado datos sobre el número inicial de reproduc-tores introducidos en estanques en verano/otoño, mortalidad, hembras con huevos en primavera y número medio de huevos por hembra en ese momento. Así, Pursiainen et al. (1983) registraron un 88% de hembras con huevos en primavera (respecto a las previamente introducidas en verano/otoño), mientras que Mackeviciené et al. (1997) ob-tuvieron un 62% con una media de 97 hue-vos pleopodales/hembra antes de la eclosión y Mackeviciené et al. (1999) un 76,9% con más de 100 huevos. Sin embargo, pocos autores han indicado el número de juveniles estado 2 obtenidos por hembra. Valores en-tre 60 y 80 juveniles de A. astacus fueron re-gistrados por Pursiainen et al. (1983, 1989), mientras que Mackeviciené et al. (1997) ob-

tuvieron medias de 22,4 y 70. En A. lepto-dactylus, Köksal (1988) registró una produc-ción de 105 juveniles estado 2 por hembra.

En condiciones controladas de expe-rimentación, la mayoría de los estudios han sido iniciados después la puesta (Mason 1974, 1977a, 1977b, Cukerzis et al. 1979, Celada et al. 1988) y pocos cubren todo el proceso reproductivo, desde la maduración hasta la obtención de juveniles estado 2. En A. pallipes, Matthews (1992) registró impor-tantes pérdidas, aproximadamente un 96%. Posteriormente, Carral et al. (2000) regis-traron valores medios de 49,5 juveniles es-tado 2/hembra con una eficiencia del 54% con respecto al número inicial de huevos por puesta, mientras que en el estudio publicado por Celada et al. (2001a), la tasa de eficien-cia fue del 33% (18,5 juveniles/hembra).

En P. leniusculus, los valores medios de huevos por hembra varían entre 110 y 180 (Momot 1991), mientras que Reynolds (2002) considera valores hasta 270. En el primer pe-ríodo tras la puesta, 234 huevos/hembra han sido contabilizados por Celada et al. (1987), y 207 por Arrignon y Laurent (1998). A partir de hembras con huevos trasladadas al labo-ratorio, Mason (1974) y Celada et al. (1988) obtuvieron medias de 104 y 74 juveniles por hembra, respectivamente. En estudios recien-tes, todo el ciclo reproductivo, desde el perío-do previo al apareamiento, fue llevado a cabo bajo condiciones controladas. Partiendo del número de huevos puestos por reproductora, Celada et al. (2005) obtuvieron una eficiencia al estado 2 del 51% (165 juveniles/hembra), por medio de una combinación de incubación maternal y artificial. Posteriormente, Celada et al. (2006) registraron valores medios de 135 juveniles estado 2/hembra con una eficiencia del 45% siempre en incubación maternal.

Desde el punto de vista práctico, el ren-dimiento de la fase reproductiva en su conjun-to ha de cuantificarse en términos del número medio de juveniles estado 2 producidos por hembra respecto al número inicial de repro-ductores utilizados, incluyendo todas las pér-


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didas posibles, como mortalidad, fracasos en el desarrollo gonadal, en el apareamiento, en la oviposición y en el largo desarrollo embrio-nario, hasta llegar a la liberación de juveniles.

4.4.1.2. Incubación artificial

El desarrollo de técnicas de incubación artificial en el cangrejo de río surge como in-tento de mejora de los procesos productivos y sanitarios, de forma que permita la obten-ción en condiciones controladas de grandes cantidades de juveniles, libres de posibles procesos patológicos y dispuestos para ser utilizados en programas de repoblación o bien en centros de producción.

La puesta en práctica de técnicas de incubación artificial resulta particularmente interesante en el caso de los astácidos, fun-damentalmente por tratarse de especies que se reproducen una sola vez al año (Celada et al. 2000, González et al. 1993), con un largo desarrollo embrionario, 6-8 meses en con-diciones naturales (Pérez et al. 1998a), y un reducido número de huevos en cada pues-ta, 20-250 huevos/hembra (Reynolds et al. 1992). Durante las últimas décadas, las téc-nicas de incubación artificial han sido desa-rrolladas a nivel de investigación para mejorar la fase reproductiva en cultivo. Numerosos autores han hecho referencia a las múltiples ventajas y posibilidades de esta práctica en el funcionamiento de los centros de cría. Así, se conseguiría un importante ahorro de es-pacio, agua, energía y mano de obra (Carral et al. 1992, Celada et al. 1994, González et al. 1993, Järvenpää 1995). Además, permiti-ría evitar pérdidas de huevos al desprender-se de las hembras (Rhodes 1981, Celada et al. 1994, Matthews y Reynolds 1995, Pérez et al. 1998b, 1999) o tras la muerte de algu-nas de ellas (Cukerzis 1969, Arrignon 1981, Celada et al. 1994). Igualmente, posibilitaría la obtención de animales libres de la temible afanomicosis (Nylund y Westman 1992) y de posibles enfermedades contagiosas que pue-da adquirir la progenie por el contacto directo con los padres (Pérez et al. 1998b, 2003, Ca-rral et al 2003). Además, se podría actuar so-

bre la duración de la embriogénesis mediante las oportunas manipulaciones térmicas (Brod-sky 1984, Carral et al. 1988, 1992, Celada et al. 1994, Pérez et al. 1998a). Finalmente, la incubación artificial ofrece la posibilidad de identificar el origen de los juveniles con más precisión, lo cual podría ser útil en programas de selección genética (Carral et al. 2003).

Los primeros intentos de incubar los huevos separados de las reproductoras fue-ron llevados a cabo con A. astacus en Ale-mania (Reichenbach 1886). Posteriormente, Paris (1911) en Francia usó incubadores de huevos de truchas para huevos de A. palli-pes. Además, sistemas de incubación para ciprínidos, como botellas invertidas, han sido probados con huevos de P. leniusculus en los Estados Unidos (Andrews 1904) y de A. asta-cus en Alemania (Hofer 1912 - cita Hofmann 1978, Strempel 1973), Ucrania (Brodsky 1962, 1984) y Lituania (Cukerzis 1964, 1984, 1988). Los resultados solamente indicaban las tasas de supervivencia a la eclosión. Desde un pun-to de vista práctico, es necesario conocer la producción final de juveniles estado 2, ya que esta representa el resultado final de todo el proceso reproductivo. Así, Mason (1977a) en Canadá, Rhodes (1981) en Gran Bretaña y Köksal (1988) en Turquía, con P. leniusculus, A. pallipes y A. leptodactylus, respectivamen-te, aportaron datos de eficiencia al estado 2 utilizando incubadores para huevos de salmó-nidos. También se han utilizado otros apara-tos especialmente diseñados para astácidos. Así, en Finlandia, Järvenpää (1995), trabajan-do con A. astacus, comparó la eficacia pro-ductiva de dos modelos de bandejas, unas dotadas con motor para proporcionar un mo-vimiento longitudinal de vaivén y otras estáti-cas. En Irlanda, Matthews y Reynolds (1995) probaron un método de incubación para hue-vos de A. pallipes basado en la recirculación de agua mediante inyección de aire. En am-bos casos, se aportaron datos de eficiencia tras la primera muda (juvenil estado 2).

Hasta hace pocos años, la idea gene-ral era que la incubación artificial sólo podía ser factible cuando los huevos se retiraban de


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la hembra en fases avanzadas del desarro-llo embrionario (Cukerzis 1984, 1988, Köksal 1988, Mason 1977b, Rhodes 1981, Strempel 1973), de forma que el éxito de la incubación artificial se encontraba condicionado por tal circunstancia. Esta situación condujo a Carral et al. (1988, 1990, 1992) en el cangrejo señal, y a Pérez et al. (1998a, 1998b, 1999) en el cangrejo de patas blancas, al planteamiento del estudio de posibles vías de solución que permitieran abarcar la mayor parte de la em-briogénesis en incubación artificial.

En un primer momento, se consideró que el conocimiento en profundidad del desa-rrollo embrionario permitiría una mejora de las técnicas de incubación artificial al proporcio-nar condiciones adecuadas en las diferentes fases, por lo que se aplicaron los estudios de Celada et al. (1985, 1987, 1991). También, se diseñó un modelo de incubador para huevos de astácidos (Carral et al. 1988), que resultó ser adecuado para llevar a cabo los procesos de experimentación posteriores. En un intento de acortar el período de incubación maternal al retirar los huevos de P. leniusculus en fases del desarrollo embrionario más tempranas que las recomendadas hasta entonces, Carral et al. (1992) incubaron con éxito huevos desde el día 18 tras la oviposición. Estos resultados han confirmado que el éxito de la incubación artificial depende más del modelo de aparato utilizado, de las condiciones de incubación y de la calidad del agua que de la fase de reti-rada de los huevos. Posteriormente, Pérez et al. (1998a, 1998b, 1999) probaron el mismo incubador, pero con huevos de A. pallipes, de-terminando la influencia del régimen térmico y del momento de la retirada de los huevos.

En el proceso de incubación artificial, los huevos muertos son muy susceptibles de ser colonizados por hongos y, una vez que ocurre, la infección se propaga rápidamen-te a los viables circundantes provocando la muerte embrionaria. Así, la proliferación fún-gica puede ser controlada mediante la ex-tracción periódica de huevos y juveniles es-tado 1 inviables (Carral et al. 2004, Policar et al. 2006), aunque se recomienda la ad-

ministración de tratamientos antifúngicos. El verde de malaquita ha sido el fungicida más efectivo de los usados en acuicultura. Sin embargo, en 1991 Estados Unidos prohibió su uso en los peces destinados a alimenta-ción humana y en sus huevos. En 1997 se prohibió en la Unión Europea (Schreier et al. 1996, Kitancharoen et al. 1997, Melendre et al. 2006). A raíz de esto, se probaron otros agentes químicos, y el formaldehído ha re-sultado ser el más efectivo para controlar el crecimiento fúngico en los huevos de cangre-jo, permitiendo un incremento de las tasas de eclosión (Celada et al. 2004, Melendre et al. 2006, 2007). En la actualidad, su uso en acuicultura está permitido tanto en Estados Unidos como en la Unión Europea. Tenien-do en cuenta la preocupación actual acerca de los posibles efectos que el uso del for-maldehído puede causar sobre la salud y el medio ambiente acuático, Carral et al. (2009) y González et al. (2010b) probaron la efecti-vidad antifúngica de otros agentes químicos en la incubación artificial de huevos de P. le-niusculus. Los resultados indican que tanto el hidróxido de cobre como el bronopol podrían considerarse alternativas al formaldehído.

Una vez que los conocimientos so-bre incubación artificial permitieron obtener aceptables tasas de eficiencia al estado 2, era conveniente desde el punto de vista pro-ductivo evaluar la posibilidad de incubar los huevos a altas densidades. Recientemente Sáez-Royuela et al. (2009), tras haber ob-tenido tasas de supervivencia al estado 2 próximas al 90%, afirmaron que el uso de tratamientos antifúngicos, concretamente for-maldehído, es un factor clave en la incuba-


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Foto 7. Huevos colonizados por hongos.

ción artificial de huevos de cangrejos a altas densidades, llegando a incubar con éxito 20 cm-2 (1 capa completa, Foto 8) e incluso 42 cm-2 (2 capas, Foto 9). También con formal-dehído, González et al. (2010a) alcanzaron tasas de supervivencia al estado 2 del 68,5% con una concentración de 60 huevos cm-2

(tres capas). Como una aportación más en la mejora de la incubación artificial, los tra-bajos de Melendre et al. (2007) evidenciaron que la eficiencia final puede ser incrementa-da hasta un 35% reduciendo los períodos de coexistencia de los juveniles estado 1 y esta-do 2 en las unidades de incubación.

Así, se puede concluir que la eficiencia final de la incubación artificial, entendida como el porcentaje de juveniles estado 2 producidos respecto al número inicial de huevos incubados, depende principalmente de la duración del pro-ceso, condiciones del agua, utilización de anti-fúngicos y frecuencia de extracción de juveniles de los incubadores. Habitualmente, dicha efi-ciencia se encuentra entre el 70 y 85%.

4.4.1.3. Almacenamiento y transporte de huevos

Una vez que se dispuso de técnicas efi-caces de incubación artificial, el siguiente paso para la intensificación de la fase reproductiva consistió en el estudio de las posibilidades de almacenamiento y transporte de huevos.

Tradicionalmente, el transporte de hue-vos de cangrejo de río se ha venido efectuando en las propias madres. No obstante, conviene reseñar que este método presenta múltiples desventajas, ya que requiere contenedores de gran tamaño y una elevada densidad de hem-bras para el envío de cantidades importantes de huevos, lo que conlleva elevados costes de facturación (Celada et al. 1994). Dado que la eficacia de este sistema es incierta, el tras-lado y almacenamiento de huevos separados de las madres ofrecería indudables ventajas y contribuiría a un incremento de los rendimientos productivos de las factorías. Este pensamiento condujo a este equipo a la realización de diver-sos estudios bajo un planteamiento orientado, en principio, a la superación de las limitaciones existentes en su momento.

Así, Celada et al. (2000) consiguieron almacenar con éxito huevos de cangrejo señal durante un período de 28 días. Tras la corres-pondiente incubación artificial, las tasas de efi-ciencia al estado 2 se encontraron en torno al 70%. Posteriormente, Celada et al. (2001b) rea-lizaron un experimento con A. pallipes, consta-tando que un almacenamiento de hasta 42 días influye escasamente sobre la viabilidad de los huevos. Finalmente, Pérez et al. (2003) consi-guieron alargar el período de almacenamiento hasta 126 días a una temperatura de refrigera-ción constante (4ºC) sin provocar una disminu-ción en las tasas de supervivencia. Estos estu-dios también demostraron que las condiciones utilizadas para el almacenamiento son adecua-das para el transporte.

En definitiva, considerando en conjunto la experiencia previa con el cangrejo señal y los estudios llevados a cabo con el cangrejo de pa-tas blancas, puede afirmarse que la integración de las prácticas de transporte y almacenamien-to de huevos embrionados vivos, combinadas necesariamente con la incubación artificial, per-mitiría la producción escalonada de juveniles durante largos períodos, así como la especiali-zación de las factorías en determinadas fases del ciclo productivo, haciendo posible la distri-bución y el comercio de huevos. Además, mien-tras los huevos permanecen almacenados, el


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Foto 8. Juveniles estado 1 y 2 pro-cedentes de la

incubación de 6,6 y 20 huevos cm-2.

Foto 9. Juveniles estado 1 y 2

procedentes de la incubación de 42 huevos cm-2.

desarrollo embrionario continúa, sin gastos de agua ni de mano de obra. En el aspecto sanita-rio, la incubación artificial posibilita la producción de juveniles libres de enfermedades conocidas. Por todo ello, la incorporación de estas técnicas al funcionamiento de astacifactorías supondría un paso importante en la intensificación de la astacicultura.

4.4.2. Cría de juveniles

Desde el punto de vista tanto científico y experimental como de una cría industrial, la su-pervivencia y el crecimiento de juveniles consti-tuyen un tema de difícil enfoque. De hecho, los elevados niveles de mortalidad de estos ani-males durante los 2-3 primeros meses de vida representan un fuerte inconveniente para la in-tensificación de la cría de astácidos (Gydemo y Westin 1989, Ackefors et al. 1995, Sáez-Ro-yuela et al. 1995, 1996, 2001). Durante los últi-mos 30 años, se han llevado a cabo numerosas investigaciones encaminadas a superar esta limitación, con resultados en general poco sa-tisfactorios. A continuación, se expone un breve resumen de los niveles actuales de conocimien-to en los aspectos estudiados.

4.4.2.1. Temperatura

En este aspecto hay coincidencia entre los distintos investigadores. El margen adecua-do se encuentra, al igual que en condiciones naturales, entre 15º y 25ºC. En general, todos los autores que han trabajado con juveniles a partir del estado 2 han llevado a cabo pruebas a temperaturas entre 20º y 24ºC.

4.4.2.2. Abastecimiento de agua

Como una de las medidas para unifor-mar la investigación en crustáceos a nivel mun-dial, D’Abramo y Castell (1997) recomiendan utilizar agua de óptima calidad y composición constante en circuito abierto con suficiente flujo. En las pruebas de Sáez-Royuela et al. (1995), el circuito abierto permitió mayor supervivencia y crecimiento que el parcialmente recirculado, a la vez que se demostró la conveniencia de no utilizar flujos excesivamente altos.

4.4.2.3. Alimentos

En hábitats naturales, estos animales consumen una amplia gama de alimentos, que incluye vegetales y animales vivos, microor-ganismos y detritus, en cantidades que osci-lan entre el 2% y el 16% del peso vivo por día (D’Abramo y Robinson 1989).

En condiciones controladas, se han probado alimentos de muy diversa naturaleza (principalmente animales frescos o congelados y vegetales) en juveniles desde el inicio de la alimentación externa (Mason 1979, D´Abramo et al. 1985, Ackefors et al. 1989, 1995, Celada et al. 1989, Gydemo y Westin 1989, Blake et al. 1994). También se han probado varias die-tas compuestas para peces y otras especies de crustáceos, así como alguna dieta seca expe-rimental para cría de astácidos en condiciones semiextensivas, como aporte adicional a la pro-ducción espontánea de los estanques (Ackefors et al. 1989, Taugbøl y Skurdal 1992, Celada et al. 1989, 1993, Henttonen et al. 1993, Sáez-Ro-yuela et al. 1995, 1996, 2001, Savolainen et al. 2003). Todas estas dietas han sido utilizadas en laboratorio solas o suplementadas con alimen-to natural, aunque no han permitido mejorar los resultados anteriores. Así, considerando en conjunto los trabajos publicados, presentan una amplia variabilidad y no han sido, en general, satisfactorios, con tasas de supervivencia en torno al 50% y valores de crecimiento de 15-20 mm de longitud rostrumtelson y 90-200 mg de peso. Como excepciones a esta tónica general, Nyström (1994) y Savolainen et al. (2004) ob-tuvieron mejores tasas tanto de supervivencia como de crecimiento, debido probablemente a una disponibilidad adicional de alimento vivo, que no fue cuantificada (Sáez-Royuela et al. 2007).

Recientemente, los trabajos de Sáez-Royuela et al. (2007) han demostrado que, ali-mentando a juveniles con una dieta compuesta para salmónidos, el suplemento con Daphnia o nauplios vivos de Artemia desde el inicio de la alimentación externa permite una mejora de los resultados, lo cual sugiere que el alimento vivo posee factores nutricionales desconoci-


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dos esenciales para los juveniles de astácidos. Posteriormente, González et al. (2008) cuanti-ficaron las cantidades óptimas de nauplios vi-vos de Artemia como suplemento de una dieta compuesta seca similar. De este modo, se re-gistraron tasas de supervivencia entre 75 y 90% a los 100 días y un crecimiento mucho mayor que el obtenido hasta entonces durante ese período (1,283 mg). Estos estudios establecen las bases para una alimentación adecuada, que ha permitido superar el bloqueo sufrido por los procesos de investigación durante 30 años, pro-vocado por resultados que han respondido más a una deficiente alimentación que a los efectos de los tratamientos experimentales. A partir de aquí, otros factores importantes para la inten-sificación de la cría de juveniles de astácidos pueden ser estudiados sin el riesgo de que los resultados puedan encontrarse enmascarados por una alimentación inadecuada.

4.4.2.4. Origen de los juveniles

Cara a la mejora de los procesos produc-tivos en astacifactoría, diversos autores han he-cho referencia a las ventajas y posibilidades que pueden ofrecer las técnicas de incubación artifi-cial respecto a la incubación maternal (Carral et al. 1992, 2003, González et al. 1993, Celada et al. 1994, Järvenpää 1995, Matthews y Reynolds 1995, Pérez et al. 1998b, 1999, 2003). Sin em-bargo, hace ya tres décadas que se planteó un interrogante acerca de la posterior viabilidad de los juveniles obtenidos mediante esta práctica (Mason 1977a), surgiendo la duda de si estos animales tendrían las mismas perspectivas de subsistencia que los procedentes de incubación maternal. La única comparación hasta la fecha entre juveniles procedentes de incubación ma-ternal y artificial (sin tratamientos antifúngicos) fue realizada por Sáez-Royuela et al. (1995), sin detectar diferencias significativas en la supervi-vencia ni en el crecimiento. Desde entonces, se han llevado a cabo varios estudios orientados a la intensificación de la cría utilizando juveniles de astácidos procedentes de huevos incubados artificialmente (Savolainen et al. 2003, 2004, Policar et al. 2006, Sáez-Royuela et al. 2007, González et al. 2008), con la diferencia de que, en estos casos, la proliferación fúngica durante

la incubación de los huevos fue controlada con la administración de diferentes tratamientos antifúngicos. Aunque se ha comprobado que, a dosis fungicidas, estos biocidas con fuerte efecto antimicrobiano, como el formaldehído (McDonnell y Russell 1999, Stephensona et al. 2003, McDonnell 2007), no afectan negativa-mente a los huevos (Celada et al. 2004, Me-lendre et al. 2006, Sáez-Royuela et al. 2009), los posteriores efectos sobre los juveniles son todavía desconocidos.

4.4.2.5. Densidad

Éste es un factor fuertemente condicio-nante en los procesos de intensificación de la cría de juveniles de astácidos. Para el mante-nimiento en grupos bajo condiciones controla-das, se ha recomendado una densidad inicial de juveniles estado 2 de 50 m-2 (Ackefors et al. 1989), que es la utilizada por Celada et al. (1989, 1993) y por Sáez-Royuela et al. (1995, 1996, 2001). Una densidad de 150 m-2 sería adecuada únicamente para los 30 primeros días (D’Abramo et al. 1985), mientras que la máxi-ma concentración inicial para llegar a 3,5 cm de longitud (unos 6 meses) sería 100 m-2, dispo-niendo de suficientes refugios (Gydemo y Wes-tin 1989). Según Nystrom (1994), la densidad inicial ha de ser menor de 100 m-2 para los tres primeros meses, mientras que Savolainen et al. (2004) afirman que una mejora de la alimenta-ción permitiría superar 200 m-2. Considerando en conjunto los resultados obtenidos, presentan una amplia variabilidad y no son concluyentes, por lo que es conveniente el desarrollo de nue-vos procesos de investigación para determinar las densidades adecuadas en función de los objetivos de producción, así como máximas densidades admisibles.

4.4.2.6. Frecuencia de aporte de alimento

En la mayoría de las investigaciones para la mejora de las tasas de supervivencia y de crecimiento a partir del inicio de la ingestión de alimento, este se ha aportado una vez al día, co-incidiendo con la retirada de residuos. Algunos investigadores han realizado esta práctica dos veces al día (D’Abramo et al. 1985, Henttonen


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et al. 1993, Sáez-Royuela et al. 2001), mientras que otros lo han hecho cada dos días (Nystrom 1994, Blake et al. 1994) o tres veces por semana (Savolainen et al. 2003, 2004, Taugbol y Skur-dal 1992). En el único estudio llevado a cabo en este sentido, Sáez-Royuela et al. (2001) no registraron diferencias en el crecimiento apor-tando alimento una o dos veces al día.

4.4.2.7. Sustrato y refugios

Para todos los investigadores, es evi-dente que los efectos perjudiciales del com-portamiento agresivo y del canibalismo pueden reducirse con los refugios adecuados. En P. leniusculus, Blake et al. (1994) y Savolainen et al. (2003) obtuvieron tasas de crecimiento más elevadas con el alga Elodea sp. o un sustrato de grava, respectivamente. En el caso de A. pa-llipes, Sáez-Royuela et al. (2001) señalaron que la supervivencia mejoró al utilizar piezas ondu-ladas de fibrocemento como refugio, aunque el crecimiento fue menor que con tubos de PVC. En último término, se ha probado a aislar indi-vidualmente a los animales en condiciones de experimentación (Celada et al. 1989, 1993, Ac-kefors et al. 1992, 1995, Henttonen et al. 1993, Nystrom 1994, Sáez-Royuela et al. 1995), cons-tatando una importante mejora de la superviven-cia, pero sería muy cuestionable su viabilidad a nivel productivo, donde se requiere otro tipo de soluciones. En este sentido, han de tenerse en cuenta aspectos higiénicos, de modo que los materiales a utilizar y su disposición deben pro-porcionar adecuado refugio a los animales sin dificultar el manejo o las labores de limpieza ni perjudicar la calidad del agua.

4.4.2.8. Iluminación

En la mayoría de los estudios bajo con-diciones controladas, no se ha manipulado la iluminación. La idea de que, tratándose de ani-males de hábitos mayormente nocturnos, la luz podría reducir su actividad y, por tanto, el com-portamiento agresivo, condujo a algunos inves-tigadores a experimentar modificando el fotope-ríodo y la intensidad lumínica. En 1992, Taugbøl y Skurdal señalaron que la iluminación continua mejoró la supervivencia y la longitud final, pero

no redujo la pérdida de pinzas. Posteriormente, Nystrom (1994) obtuvo mayor tasa de supervi-vencia con la más alta intensidad de luz. Por el contrario, Blake et al. (1994) no encontraron re-lación de diferentes niveles de iluminación con la supervivencia ni con el crecimiento. De igual modo, Sáez-Royuela et al. (1996) no registraron diferencias significativas en la supervivencia, ni en el ritmo de crecimiento ni en la pérdida de pinzas al incrementar la iluminación. En estas circunstancias, se requieren nuevos procesos de investigación para determinar los posibles efectos de la luz.

4.4.2.9. Perspectivas de futuro

Hoy sabemos que los pobres resultados obtenidos en general durante 30 años de inves-tigación para la intensificación de la cría de ju-veniles de astácidos, así como las dificultades para su interpretación, se han debido principal-mente a la interferencia de factores relaciona-dos con deficiencias nutricionales, capaces de enmascarar los tratamientos experimentales. Una vez que este bloqueo ha sido superado y que se han establecido las bases para una alimentación adecuada, procede el estudio de otros factores importantes para la intensificación y mejora de los procesos de cría de juveniles de astácidos. En principio, el grado de desarrollo alcanzado en técnicas de incubación artificial, que incluye la administración de tratamientos antifúngicos sobre altas densidades de huevos, hace conveniente el estudio de la posterior via-bilidad de los juveniles así obtenidos. Por otro lado, la aplicación de los recientes avances en alimentación permite alcanzar buenas tasas de supervivencia y de crecimiento, a la vez que, in-dudablemente, influye sobre el comportamiento ingestivo y agonístico de los cangrejos. Esto incide directamente sobre los efectos de aque-llos factores estrechamente relacionados con la agresividad y el canibalismo, que son princi-palmente la densidad de juveniles, la frecuen-cia de alimentación y forma de los alimentos, la disponibilidad de refugios y las condiciones de iluminación, así como las posibilidades de redu-cir la presión dominante de los juveniles de cre-cimiento más rápido sobre los más pequeños mediante la separación por clasificación.


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Objetivos

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La finalidad de esta Tesis Doctoral es la mejora de las técnicas de cría de juveniles de astácidos aplicando recientes avances en alimentación, y orientada al estudio de aspectos re-lacionados con prácticas de manejo y condiciones ambientales, así como a obtener informa-ción sobre la respuesta de los juveniles a períodos de cría desde el inicio de la alimentación externa más largos que los alcanzados hasta el presente. Los objetivos concretos son:

• Evaluarposiblesinfluenciasdelorigendelosjuveniles:incubaciónmaternaloincuba-ción artificial. Estudio I.

• Determinardensidadesadecuadasparalacríaintensiva.EstudioII.

• Simplificarlasprácticasvinculadasalaalimentación.EstudioIII.

• Determinarcondicionesadecuadasdedisponibilidadderefugiosydeiluminación.Estu-dio IV.

• Críaintensivadurantelosseisprimerosmeses,evaluandoefectosdelaclasificaciónpor peso. Estudio V.

Estos objetivos forman parte del proyecto del Plan Nacional de I+D+i “Técnicas de cría de juveniles de astácidos (Pacifastacus leniusculus Dana) en condiciones controladas”, refe-rencia AGL2005-01127, y constituyen el fundamento de una beca del Programa Nacional de Formación de Profesorado Universitario, con referencia AP2005-4860.

5. OBJETIVOS

Material y métodos generales

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6.1. CANGREJOS, INSTALACIONES Y PROCEDIMIENTO BÁSICO DE EXPERIMENTACIÓN

Estas investigaciones se han llevado a cabo en las instalaciones y laboratorios de acuicultura del Departamento de Producción Animal de la Universidad de León, radicado en la Facultad de Veterinaria.

La especie de astácido utilizada fue Pacifastacus leniusculus (Dana, 1852). La obtención de juveniles estado 2 se realizó a partir de hembras con huevos procedentes de una astacifactoría. Fueron trasladadas al la-boratorio a finales del mes de noviembre de cada año (aproximadamente 30 días después de la oviposición) y allí tuvo lugar el desarro-llo embrionario durante varios meses hasta la producción de juveniles estado 2 (Foto 10).

Foto 10. Juvenil estado 2 de cangrejo señal.

Según el tipo de incubación, los juveni-les procedieron de dos orígenes diferentes:

a) Incubación maternal. Este término se refie-re al proceso de desarrollo de los huevos, eclosión de los juveniles estado 1 y muda al estado 2, que de forma natural tiene lugar en los pleópodos maternos.

b) Incubación artificial. Los huevos se separa-ron de las madres deslizando suavemente unas pinzas finas desde la base del pleó-podo hasta su extremo (Foto 11). Posterior-

mente, el desarrollo tuvo lugar en un apa-rato de incubación (Foto 12) especialmente diseñado por nuestro equipo con fines expe-rimentales (Carral et al. 1988, 1992). Como antifúngico se utilizó formaldehído, admi-nistrado a una concentración de 3000 ppm cada segundo día hasta el comienzo de las eclosiones mediante bombas dosificadoras SEKO tipo DS que vertían la solución duran-te 15 minutos en el flujo de entrada al incu-bador, según Melendre et al. (2006).

6. MATERIAL Y MÉTODOS GENERALES

Foto 11. Separación de los huevos de los pleó-podos en una hembra de cangrejo señal.

Foto 12. Aparato de incubación para huevos de astácidos diseñado

por Carral et al. (1988, 1992).

Foto 13. Unidad de incubación con juveniles estado 1(abajo) y estado 2 (arriba).

Los ensayos se realizaron durante 3 años consecutivos. En total, se llevaron a cabo 7 experimentos: 3 de 80 días, 2 de 100, 1 de 120 y 1 de 180, iniciados con juveniles estado 2, cuando comienza la alimentación externa. En todos los casos, los animales procedían de al menos ocho hembras y fue-ron distribuidos al azar en los diferentes tra-tamientos. Al comienzo de las pruebas, se tomaban muestras de los juveniles estado 2, que eran medidos y pesados con calibre y ba-lanza de precisión respectivamente.

El abastecimiento de agua procedía de un pozo artesiano, cuyos parámetros de ca-lidad fueron analizados periódicamente en el laboratorio de la Oficina Municipal del Con-sumidor del Ayuntamiento de León, así como por mediciones efectuadas en nuestro labora-torio. Los valores medios de las característi-cas físico-químicas más relevantes del agua a la entrada de las instalaciones de experi-mentación fueron:

•pH=7,9

•Durezatotal=10°dH(calcio=72mgl-1)

•Sólidostotalesensuspensión=14,2mgl-1

•Sólidosdisueltostotales=207,6mgl-1

•Conductividad=145µscm-1

Semanalmente, se efectuaban medicio-nes de oxígeno disuelto, de amonio y de nitri-tos del agua donde se encontraban los anima-les. Las medidas de oxígeno se realizaron con un oxímetro Sension6 dissolved Oxygen Meter of Hatch Company (valores en torno a 7 mg l-1, mínimo 5,8 mg l-1, máximo 7,7 mg l-1). Amonio y nitritos fueron medidos con un Pocket-Photo-meter Lasa Aqua a partir de muestras de agua tomadas del interior de los tanques (amonio < 0,02 mg l-1 y nitritos < 0,05 mg l-1).

Las instalaciones de experimentación se encuentran ubicadas en tres recintos de la Facultad de Veterinaria. Se dispone de depó-sitos de fibrocemento para la recepción y el

tratamiento del agua, mientras que el mante-nimiento de los animales se llevó a cabo en tanques de fibra de vidrio aglomerada con resina poliéster. En función de las caracterís-ticas de las diferentes pruebas, se utilizaron 28 tanques de 100x100x30 cm, 24 tanques de 60x33x30 cm, 12 tanques de 53x26x20 cm y 9 tanques de 53x53x20 cm, provistos todos ellos de filtros de malla planctónica de 200 ó 250µmconlafinalidaddeimpedirlasalidade animales o de alimento.

El régimen de circulación del agua en todos los casos fue en sistema abierto y cada tanque recibía un aporte independiente.

La temperatura se mantuvo en el rango de 20º-23ºC en todos los casos. El agua fue calentada mediante resistencias de 3.200 W blindadas y conectadas a sus correspondien-tes termostatos. La temperatura de los dife-rentes circuitos se registró diariamente con termómetros de máxima-mínima.

La limpieza del fondo de los tanques se efectuó mediante sifonado 3 veces por sema-na, mientras que los filtros se limpiaron cada segundo día.

Tras la finalización de cada prueba, los tanques se limpiaban y se dejaban en seco. Previamente a la entrada de un nuevo grupo de juveniles, los depósitos se desinfectaban con lejía, que se eliminaba posteriormente.

Las fotografías fueron realizadas con una cámara SONY DSC-W35 de 7,2 mega-píxeles de resolución real. Para la obtención de las microfotografías se empleó un micros-copio estereoscópico NIKON SMZ-25, que lleva acoplado el sistema fotográfico Microflex HFX-DX Type 115.

6.2. ALIMENTACIÓN

Los cangrejos fueron alimentados ma-nualmente con un pienso compuesto formu-lado para salmónidos (T-NUTRA-0, Skretting, Trouw España SA. Cojobar, E-09620, Burgos, España, composición analítica proporcionada


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por el fabricante: proteína bruta 54%, grasa bruta 18%, celulosa 0,08%, cenizas 12%, fós-foro total 1,8%, Vitamina A 10000 UI kg-1, D3 1500 UI kg-1, E 150 mg kg-1, diámetro de grá-nulo 0,9-1,5 mm) en cantidad suficiente para que resultara ligeramente en exceso (2,5-4% del peso vivo). Esta dieta seca (Foto 14) fue suplementada con nauplios de Artemia re-cién eclosionados o con quistes decapsula-dos de Artemia (quistes de INVE Aquaculture Nutrition,HighHUFA430µm,Hoogveld91,B-9200 Dendermonde, Bélgica).

Foto 14. Pienso compuesto para salmónidos.

El proceso de decapsulación o elimi-nación del corion de los quistes de Artemia se realizó del modo descrito por Van Stappen (1996). Para la obtención de nauplios, los quis-tes decapsulados se incubaron durante 24 ho-ras en botellas invertidas de plástico de 1,5 l de capacidad. Las condiciones durante la incuba-ción fueron: iluminación continua, temperatura del agua 28 ºC, salinidad de 35‰ y aireación desde el fondo para proporcionar oxígeno y mantener los quistes en suspensión.

Foto 15. Nauplio de Artemia.

Después de verificar las tasas medias de eclosión, que coincidieron con los datos proporcionados por la casa comercial (núme-ro de nauplios/g quistes), la cuantificación del suplemento se realizó a partir de cantidades conocidas de nauplios eclosionados en de-terminados volúmenes de agua y distribuyén-dolos posteriormente en las correspondientes réplicas. Cuando se utilizaron los quistes di-rectamente como alimento, se decapsulaba una cierta cantidad cada tres días y se alma-cenaba a 4ºC. En este caso, la medida del suplemento se realizó a partir del número de quistes/g proporcionado por el fabricante.

6.3. RECOGIDA Y ANÁLISIS DE DATOS

En los distintos experimentos, los resul-tados se cuantificaron registrando los siguien-tes parámetros:

• Recuentosdesobrevivientesynúmerode animales con una sola pinza y sin pinzas cada 20 días.

• Coincidiendoconestosrecuentos,semidió la longitud del cefalotórax (LC) y el peso de los individuos de muestras representativas, previa eliminación del agua retenida con papel secante.

• Númerodesobrevivientesydecangre-jos con una sola pinza y sin pinzas al final del experimento. Longitud de cefa-lotórax y peso de todos los animales o de una muestra representativa.

• Pesovivofinaldelconjuntodecangre-jos de cada réplica.

Con los datos obtenidos se calcularon los índices siguientes:

• Porcentajedesupervivencia.

• Porcentajedesobrevivientesconunasola pinza y sin pinzas.

• Tasadecrecimientoespecífico(TCE).Es el incremento de peso diario expre-


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sado en porcentaje, según la fórmula: (LnPeso final en g-LnPeso inicial en g)100/días.

• Pesoganado(PG)=(Pesofinaleng-Peso inicial en g)100/Peso inicial en g.

• Índicedeconversióndelalimento(IC)=Dt/Wt -W0, siendo Dt la cantidad total de quistes (gramos de su forma comercial) y de dieta seca usada y Wt -W0 el peso ganado (g) en un determinado período de tiempo.

• Coeficientedevariación(CV)=SD/m, siendo SD la desviación estándar y m la media.

• Biomasafinal=Pesovivofinal/unidadde superficie.

La longitud del cefalotórax se midió con calibres MITUTOYO (±0.01 mm) (Foto 16). Para el registro del peso se empleó una ba-lanza de precisión COBOS M-150-SX (±0.001 g) (Foto 17).

Diariamente se inspeccionaban cuido-samente los tanques para verificar el correcto mantenimiento de las condiciones de experi-mentación, así como para retirar y anotar los animales muertos.

En los distintos ensayos, se establecie-ron 3 réplicas por tratamiento (un tanque por cada réplica). Para la realización de los co-rrespondientes estudios estadísticos, se uti-

lizó el programa SPSS (SPSS Inc. Chicago, III., USA). Las comparaciones entre los trata-mientos de los diferentes experimentos fueron realizadas sometiendo los datos a un análisis de varianza (ANOVA). En su caso, la compa-ración de medias se llevó a cabo por el mé-todo Duncan y el nivel de significación esta-blecido fue siempre P < 0.05. Los porcentajes fueron transformados al arcoseno previamen-te a los análisis estadísticos. El cálculo de las medias en cada tratamiento se acompaña de ± E.E.M. (error estándar de la media).

Foto 16. Calibre utilizado en la medición de la longitud del cefalotórax.

Foto 17. Balanza de precisión COBOS M-150-SX.


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Secuencia de experimentación: Estudio I

35

7.1.1. Planteamiento experimental

Hace ya tres décadas, se planteó un in-terrogante acerca de la posterior viabilidad de los juveniles obtenidos mediante incubación artificial (Mason 1977a), surgiendo la duda de si estos animales tendrían las mismas pers-pectivas de subsistencia que los procedentes de incubación maternal. Durante la incubación artificial, es aconsejable la utilización de bioci-das para evitar la proliferación fúngica sobre los huevos muertos. Aunque se ha compro-bado que, a dosis fungicidas, estos compues-tos con fuerte efecto antimicrobiano, como el formaldehído (McDonnell y Russell 1999, Stephensona et al. 2003, McDonnell 2007), no afectan negativamente a los huevos (Ce-lada et al. 2004, Melendre et al. 2006, Sáez-Royuela et al. 2009), los posteriores efectos sobre los juveniles son todavía desconocidos.

Para aclarar esta cuestión, se diseñaron dos experimentos de 80 días con la finalidad

7.1. ESTUDIO I: INCUBACIÓN ARTIFICIAL DE HUEVOS DE CANGREJO DE RÍO: REVISIÓN Y ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LOS EFECTOS DEL ORIGEN DE LOS JUVENILES (INCUBACIÓN MATERNAL O ARTIFICIAL) SOBRE SU POSTERIOR

SUPERVIVENCIA Y CRECIMIENTO

Artificial incubation of crayfish eggs: review and report from an experimental study on effects of offspring origin (maternal or artificial incubation) on survival

and growth of juvenile signal crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae)

R. González, J.D. Celada, V. García, A. González, J.M. Carral, M. Sáez-Royuela 2009

Reviews in Fish Biology and Fisheries 19, 167-176

Impact factor (JCR 2008) 1.792. Category: Fisheries 7/40

de comparar la supervivencia y el crecimiento de juveniles procedentes de dos orígenes: in-cubación maternal o incubación artificial con tratamientos de formaldehído, administrado a una concentración de 3000 ppm durante 15 minutos cada segundo día hasta el comienzo de las eclosiones (Melendre et al. 2006).

Los cangrejos se distribuyeron en tan-ques de fibra de vidrio provistos de refugios (un grupo de cuatro tubos unidos de PVC de 4 cm de longitud x 20 mm diámetro por cada tres animales) a la densidad de 100 m-2. El fotoperíodo fue natural (aproximadamente 14 h luz:10 h oscuridad).

Los cangrejos fueron alimentados con una dieta seca para salmónidos suplementada con nauplios de Artemia (González et al. 2008). Diariamente, se hacían eclosionar los quistes y se comenzó suministrando manualmente 500 nauplios por cangrejo y día, cantidad que fue incrementada un 20% cada 20 días.

7. SECUENCIA DE EXPERIMENTACIÓN

Experimento I.1. Se utilizaron 270 juveniles estado 2 distribuidos en 9 tanques de 0,3 m2 de superficie y 0,1 m de profundidad de agua (Foto 18), abastecidos con un flujo de 0,5 l min-1. La frecuencia de alimentación fue una vez al día y la temperatura del agua 20 ± 1ºC.

En función del origen de los animales, los tratamientos fueron tres:

- Juveniles procedentes de incubación artificial durante 70 días.

- Juveniles procedentes de incubación maternal.

- Mezcla de juveniles de ambos orígenes (50% de incubación artificial y 50% de incubación maternal).

En los muestreos periódicos, se toma-ban 20 cangrejos por réplica para pesarlos y medirlos individualmente. Al final del experi-mento (80 días), todos los cangrejos sobrevi-vientes fueron medidos y pesados individual-mente.

Experimento I.2. Se utilizaron 180 juveniles estado 2 distribuidos en 12 tanques de 0,15 m2 de superficie y 0,1 m de profundidad de agua (Foto 18), abastecidos con un flujo de 0,25 l min-1. La temperatura del agua fue 22 ± 1º C.

En función del origen y de la frecuencia de alimentación, se diseñó un experimento bifactorial con cuatro tratamientos: juveniles procedentes de incubación artificial o mater-nal alimentados una vez o dos veces al día.

En los muestreos periódicos se toma-ban 10 cangrejos por réplica para pesarlos y medirlos individualmente. Al final del experi-mento (80 días), todos los cangrejos sobrevi-vientes fueron medidos y pesados individual-mente.

7.1.2. Resultados

Experimento I.1. Los valores de superviven-cia y de crecimiento obtenidos tras los 80 días de prueba se recogen en la tabla 1. Las tasas de supervivencia se encontraron entre 87,8% y 93,3%, sin diferencias significativas entre tratamientos. No se encontraron tampoco di-ferencias significativas en los controles inter-medios, desde el día 20 hasta el final de la prueba (día 80).

Respecto al crecimiento, los valores finales más altos y significativamente supe-riores de longitud de cefalotórax (11,47 mm), peso individual (373,80 mg), tasa de creci-miento específico (3,05 %), peso ganado (1.129,61 %) y biomasa (332,27 mg dm-2) co-rrespondieron a los cangrejos procedentes de incubación artificial.


36

Foto 18. Instalaciones donde se realizaron los experimentos I.1 y I.2.

La longitud de cefalotórax en cada uno de los controles se representa en el gráfico 1 y el peso medio en el gráfico 2. Los ani-males procedentes de incubación artificial crecieron siempre significativamente más rápido que los de incubación maternal. En

la mezcla de ambos orígenes, los valores de crecimiento fueron significativamente supe-riores a los obtenidos en incubación mater-nal e inferiores a los de incubación artificial, mostrando diferencias significativas desde el día 60.


37

Tabla 1. Valores finales de supervivencia y de crecimiento (80 días) de juveniles procedentes de diferen-tes orígenes (experimento I.1).

Gráfico 1. Longitud de cefalotórax de juveniles procedentes de diferentes orígenes a lo largo del período experimental (experimento I.1).

Valores en las filas con distinto superíndice presentaron diferencias significativas (P < 0,05).

Experimento I.2. Los valores de superviven-cia y de crecimiento obtenidos tras los 80 días de prueba se recogen en la tabla 2. Las tasas de supervivencia se encontraron entre 68,9% y 77,8%, sin diferencias significativas entre tratamientos. Tampoco hubo diferencias signi-ficativas en los controles intermedios, desde el día 20 hasta el final de la prueba (día 80).

Respecto al crecimiento, los valores más altos y significativamente superiores de longi-tud de cefalotórax (14,54 mm), peso individual (780,13 mg), tasa de crecimiento específico (3,94 %), peso ganado (2.466,20 %) y bio-masa (545,42 mg dm-2) correspondieron a los cangrejos procedentes de incubación artificial y alimentados una vez al día, sin diferencias significativas con los juveniles procedentes del mismo origen y alimentados dos veces al día.

Si se tiene en cuenta solamente el ori-gen, los animales producidos mediante incu-bación artificial crecieron significativamente más rápido (medias de 14,27 mm de longi-tud de cefalotórax y 750,02 mg de peso) que los de incubación maternal (medias de 12,95 mm de longitud de cefalotórax y 520,57 mg de peso). Independientemente del origen, no se encontraron diferencias entre las dos frecuencias de alimentación (una o dos ve-ces al día).

La longitud de cefalotórax en cada uno de los controles se representa en el gráfico 3 y el peso medio en el gráfico 4. A lo largo del período experimental, los animales proceden-tes de incubación artificial crecieron siempre significativamente más rápido que los de in-cubación maternal.


38

Gráfico 2. Peso de juveniles procedentes de diferentes orígenes a lo largo del período experimental (experimento I.1).


39

Gráfico 3. Longitud de cefalotórax de juveniles procedentes de incubación maternal o artificial y alimenta-dos una o dos veces al día a lo largo del período experimental (experimento I.2).

Tabla 2. Valores finales de supervivencia y de crecimiento (80 días) de juveniles procedentes de incuba-ción artificial o maternal y alimentados una o dos veces al día (experimento I.2).


7.1.3. Discusión

Se sabe que la frecuencia de alimen-tación puede ser un factor importante, funda-mentalmente en los animales más jóvenes. Dado que en el experimento I.1 las tasas de crecimiento fueron mayores en el caso de los juveniles procedentes de incubación artificial, se planteó la hipótesis de que estos efectos beneficiosos podrían ser mejorados al incre-mentar la frecuencia de alimentación. En el experimento I.2, no se encontraron diferen-cias significativas entre las dos frecuencias (una o dos veces al día), lo cual coincide con los resultados publicados por Sáez-Royue-la et al. (2001) con juveniles de A. pallipes procedentes de incubación maternal. Esto puede ser debido a que los cangrejos no in-gieren el pienso inmediatamente, sino que lo llevan a los refugios donde el consumo fi-nal puede tener lugar cierto tiempo después. Además, los nauplios de Artemia son capa-ces de sobrevivir y nadar durante un perío-

do prolongado en agua dulce (Celada et al. 2008), permaneciendo disponibles para los cangrejos.

Hasta la fecha, hay pocos estudios que hagan referencia al posible efecto nega-tivo que podría ejercer sobre la descendencia el hecho de que los huevos sean incubados artificialmente y de que los primeros estados juveniles no tengan contacto directo con sus madres. En este sentido, Sáez-Royuela et al. (1995) no registraron diferencias en función de la procedencia de los juveniles aunque, en este caso, los huevos incubados artificialmen-te no habían recibido tratamientos antifúngi-cos. En el estudio de Policar et al. (2006), se utilizó un compuesto yodado como antifúngi-co en incubación artificial y los juveniles ob-tenidos no mostraron posteriormente efectos perjudiciales. De forma similar, en el presente estudio la incubación artificial con tratamien-tos de formaldehído no ha tenido efectos negativos sobre la supervivencia ni sobre el


40

Gráfico 4. Peso de juveniles procedentes de incubación maternal o artificial y alimentados una o dos veces al día a lo largo del período experimental (experimento I.2).

crecimiento de los juveniles. Además, ante-riormente se ha considerado la posibilidad de que estas técnicas puedan permitir obte-ner juveniles con un óptimo estado sanitario (Nylund y Westman 1992, Edgerton y Owens 1997, 1999), ya que se asume que los pro-

ducidos mediante incubación artificial con agentes biocidas y sin contacto con otros animales se encuentran libres de enferme-dades conocidas, lo que explicaría en parte el mejor crecimiento de los animales produ-cidos mediante incubación artificial.


41


La densidad es un factor decisivo con influencia directa sobre la productividad de los cultivos. Para mantener a los juveniles de astácidos a partir del estado 2 bajo condi-ciones controladas, algunos autores han re-comendado diversas densidades (D’Abramo et al. 1985, Ackefors et al. 1989, Gydemo y Westin 1989, Nystrom 1994, Savolainen et al. 2004). Sin embargo, los resultados ob-tenidos presentan una amplia variabilidad y ahora se sabe que no han respondido ple-namente a efectos de los tratamientos ex-perimentales, sino más bien a una deficien-te alimentación. Los conocimientos actuales permiten superar este obstáculo y plantean la necesidad del desarrollo de nuevos pro-cesos de investigación para determinar densidades adecuadas en función de los objetivos de producción, así como máximas densidades admisibles de cara a la intensi-ficación del cultivo. Para ello, se diseñó la prueba siguiente:

7.2. ESTUDIO II: DENSIDAD PARA LA CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES, UTILIZANDO NAUPLIOS DE ARTEMIA COMO SUPLEMENTO DE UNA DIETA SECA

DESDE EL INICIO DE LA ALIMENTACIÓN EXTERNA

Stocking density for the intensive rearing of juvenile crayfish, Pacifastacus leniusculus (Astacidae), using Artemia nauplii to supplement

a dry diet from the onset of exogenous feeding

R. González, J.D. Celada, A. González, V. García, J.M. Carral, M. Sáez-Royuela2010

Aquaculture International 18, 371-378


Experimento II.1. La finalidad fue comparar la supervivencia y el crecimiento de juveniles estado 2 a las densidades iniciales de 100, 300, 600 y 1000 m-2, alimentados una vez al día con una dieta seca para salmónidos suplementada con nauplios de Artemia, de acuerdo con los recientes avances aporta-dos por González et al. (2008). Diariamente, se hacían eclosionar los quistes y se comen-zó suministrando manualmente 500 nauplios por cangrejo y día, cantidad que fue incre-mentada un 20% cada 20 días.

Se emplearon 6.000 juveniles estado 2 procedentes de huevos incubados artifi-cialmente con tratamientos de formaldehído, según Melendre et al. (2006). Los cangrejos fueron distribuidos en 12 tanques de fibra de vidrio de 1 m2 de superficie con 200 l de agua (Foto 19) y abastecidos con un flujo de 1,5 l min-1. Como refugio, se utilizaron pie-zas onduladas de fibrocemento minionda de 54 x 20,5 cm, cuyo número en cada uno de los tanques varió en función de la densidad

Secuencia de experimentación: Estudio II

42


43

(cuatro piezas para 100 animales m-2, seis para 300 m-2, ocho para 600 m-2 y doce para 1000 m-2). La temperatura del agua fue 20 ± 1ºC y el fotoperíodo fue natural (aproximada-mente 14 h luz:10 h oscuridad).

En los muestreos periódicos, se to-maba una muestra de juveniles por réplica para pesarlos y medirlos individualmente. El tamaño de la muestra varió de acuerdo con la densidad: 10, 15, 20 y 30 cangrejos en los tratamientos de 100, 300, 600 y 1000 m-2, res-pectivamente. Al final del experimento, se re-gistraron la longitud de cefalotórax y el peso individual de una muestra que varió en fun-ción de la densidad: 20, 30, 40 y 60 juveniles en los tratamientos de 100, 300, 600 y 1000 m-2, respectivamente.

Tanto en los controles intermedios como al final del experimento, se registró el número de cangrejos con una sola pinza y sin pinzas.

La prueba duró 100 días.

7.2.2. Resultados

Tras los 100 días de prueba, los ani-males que se encontraron a la densidad ini-cial más baja (100 m-2) alcanzaron mayor supervivencia (86,33%), que se redujo signi-ficativamente en cada una de las densidades superiores, hasta un mínimo de 39,13%, que correspondió a 1000 m-2.

Referente al crecimiento, los valores finales medios más altos de longitud de cefa-lotórax (15,28 mm), peso individual (1,08 g), tasa de crecimiento específico (3,56%) y peso ganado (3.449,01%) correspondieron al trata-miento de 100 m-2 y fueron significativamen-te superiores al resto, sin que las diferencias entre las densidades de 300, 600 y 1000 m-2

fueran significativas, con un crecimiento final medio de 14 mm de cefalotórax y 0,72 g de peso. La biomasa más alta (271,03 g m-2) se obtuvo con la densidad inicial de 1000 m-2 y fue significativamente inferior a medida que las densidades iniciales fueron menores.

Foto 19. Instalaciones donde se realizó el experimento II.1.


44

El gráfico 5 muestra las tasas de su-pervivencia en los controles efectuados a lo largo del experimento. En cada uno de ellos, el porcentaje de sobrevivientes fue significativamente superior en el tratamien-

to de densidad inicial más baja (100 m-2) y significativamente inferior en el de densidad inicial más alta (1000 m-2). En las concen-traciones intermedias (300 m-2 y 600 m-2), diferencias significativas en el mismo sen-

Tabla 3. Valores finales de supervivencia y de crecimiento (100 días) de juveniles a diferentes densidades (experimento II.1).


Gráfico 5. Tasas de supervivencia de juveniles mantenidos a diferentes densidades durante 100 días (experimento II.1).


45

tido pudieron apreciarse a partir de los 60 días de prueba.

La longitud de cefalotórax en cada uno de los controles se representa en el gráfico 6 y el peso medio en el gráfico 7. Todos los controles periódicos mostraron que partiendo de 100 m-2 los animales crecieron significati-vamente más rápido que a densidades más altas. Entre éstas (300, 600 y 1000 m-2), nin-guno de los controles mostró diferencias sig-nificativas en la longitud de cefalotórax ni en el peso durante los 100 días de prueba.

La tabla 4 recoge el porcentaje de ju-veniles con pérdida de una o de ambas pin-zas en los diferentes controles. En todos los registros efectuados hasta 80 días, se eviden-ció que en el tratamiento de 100 m-2 la propor-ción de animales con falta de una o de ambas pinzas fue significativamente inferior a las re-gistradas a densidades más altas (300, 600 y 1000 m-2), entre las que no hubo diferencias significativas. Al final del experimento, dicho porcentaje fue más elevado cuanto mayor fue la densidad inicial, encontrándose entre 14,44% (100 m-2) y 41,45% (1000 m-2).

Gráfico 6. Longitud de cefalotórax de juveniles a diferentes densidades en cada uno de los controles a lo largo del período experimental (experimento II.1).


46

Gráfico 7. Peso de juveniles a diferentes densidades en cada uno de los controles a lo largo del período experimental (experimento II.1).

Tabla 4. Porcentaje de juveniles a diferentes densidades con pérdida de una o de ambas pinzas en cada uno de los controles a lo largo del período experimental (experimento II.1).



47

7.2.3. Discusión

Es un hecho conocido que, en general, los efectos de la agresividad y el canibalismo se intensifican con el incremento de la den-sidad, dando como resultado tanto reduccio-nes de la tasa de supervivencia y del ritmo de crecimiento como pérdida de pinzas. Aunque diversos autores han llevado a cabo experi-mentos con astácidos en condiciones contro-ladas partiendo de concentraciones entre 50 y 200 juveniles estado 2 por m2 (Mason 1979, D´Abramo et al. 1985, Gydemo y Westin 1989, Celada et al. 1989, 1993, Taugbøl y Skurdal 1992, Ackefors et al. 1992, 1995, Henttonen et al. 1993, Blake et al. 1994, Sáez-Royuela et al. 1995, 1996, 2001, Savolainen et al. 2003), solamente Ackefors et al. (1989), Nyström (1994) y Savolainen et al. (2004) se centraron específicamente en el estudio de efectos de la densidad. Savolainen et al. (2004) habían registrado los valores de crecimiento más al-tos hasta ese momento en astácidos. Sin em-bargo, estos resultados fueron inferiores a los alcanzados en nuestro experimento a la mis-ma densidad (100 m-2) e incluso inferiores a los obtenidos en el tratamiento de 1000 m-2, probablemente debido a que en este estudio

los animales dispusieron de mayores canti-dades de alimento vivo, tal como sugieren los resultados de Sáez-Royuela et al. (2007) y González et al. (2008), que obtuvieron mayor crecimiento cuando el suplemento vivo fue in-crementado.

La norma general en acuicultura de que a mayor densidad menor crecimiento no se cumplió en la presente prueba. Cierto es que con 100 m-2 se obtuvo un crecimiento significativamente mayor que con densida-des más altas, pero entre éstas (300, 600 y 1000 m-2) las diferencias en ningún momento fueron significativas y el ritmo de crecimiento mostró escasa dependencia de la densidad (Foto 20). Ante este hecho, cabría admitir la posibilidad de que el efecto negativo sobre el crecimiento causado por la intensificación del comportamiento agonístico y del estrés a altas densidades fuese compensado por dos efectos positivos. Por un lado, el de la buena calidad de la dieta y, por otro, el de la suple-mentación alimenticia que representa el cani-balismo, siendo mayor la ingestión de congé-neres cuanto más elevada es la densidad, tal como evidencian las significativas reduccio-nes del número de sobrevivientes.

Foto 20. Ejemplares correspondientes a cada una de las densidades al final del experimento II.1.


48

Cara a las posibilidades aplicativas en el cultivo, ha de tenerse en cuenta la baja fe-cundidad de los astácidos, que no deja am-plios márgenes para asumir excesiva mor-talidad durante la etapa juvenil. También, la disponibilidad de infraestructura y mano de obra para el mantenimiento de animales constituye un fuerte condicionante. Por tanto, las decisiones habrían de tomarse en función

de las circunstancias y de los objetivos priori-tarios en cada caso. Así, los datos generados por el presente estudio pueden servir de refe-rencia para establecer densidades adecuadas en función de los objetivos, tanto a nivel de experimentación como de cultivo, y demues-tran que la calidad de los alimentos constituye un factor decisivo para alcanzar con éxito al-tas densidades en condiciones controladas.

Secuencia de experimentación: Estudio III

49


El empleo de nauplios de Artemia es generalizado en las etapas iniciales de la cría de peces y crustáceos, pero su produc-ción diaria resulta laboriosa, cara y requie-re instalaciones accesorias. Por estos mo-tivos, el uso directo de quistes de Artemia puede ofrecer una interesante alternativa a los nauplios vivos. Una vez decapsulados, los quistes pueden ser manejados como una dieta inerte, están desinfectados y no pierden nutrientes en el agua (Vanhaecke et al. 1990). Esta condición de estabilidad de los quistes podría ser aprovechada a la hora de establecer la frecuencia de alimen-tación. Así, con el objetivo de reducir cos-tes y mano de obra, y tras haber compro-bado que el incremento de la frecuencia de alimentación de una a dos veces al día no mejoró la tasa de crecimiento (experimento I.2), se probó a distanciar más los aportes de alimento. De este modo, se diseñó la si-guiente prueba factorial:

Experimento III.1. En función del suple-mento y de la frecuencia de alimentación, los tratamientos fueron seis: dos dietas di-ferentes (pienso granulado de trucha su-plementado con quistes o con nauplios de

7.3. ESTUDIO III: QUISTES DECAPSULADOS DE ARTEMIA COMO SUPLEMENTO ALIMENTICIO PARA JUVENILES A DIFERENTES FRECUENCIAS DE ALIMENTACIÓN

Decapsulated Artemia cysts as dietary supplement for juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) at different food supply frequencies

from the onset of exogenous feeding under controlled conditions

R. González, J.D. Celada, J.M. Carral, A. González, M. Sáez-Royuela, V. García 2009

Aquaculture (2009) 295, 200-204


Artemia) aportadas con tres frecuencias de alimentación (una vez al día, una vez cada dos días y una vez cada tres días).

Se emplearon 360 juveniles estado 2 procedentes de huevos incubados artificial-mente. Los cangrejos fueron distribuidos en 18 tanques de fibra de vidrio de 0,20 m2 de superficie con 25 l de agua (Foto 21) pro-vistos de refugios (un grupo de cuatro tubos unidos de PVC de 4 cm de longitud x 20 mm diámetro por cada tres animales) a la densi-dad de 100 m-2. El flujo fue 0,25 l min-1. La temperatura del agua fue 21 ± 1ºC y el foto-período fue natural (aproximadamente 14 h luz:10 h oscuridad).

Foto 21. Tanques donde se realizó el experimento III.1.

Tabla 5. Valores finales de supervivencia y de crecimiento (100 días) de juveniles alimentados con una dieta seca suplementada con quistes o nauplios de Artemia a diferentes frecuencias de alimentación (experimento III.1).


50

En los muestreos periódicos, se tomaban 10 cangrejos por réplica (30 por tratamiento) para pesarlos y medirlos individualmente. Al final del experimento, todos los cangrejos sobrevivientes fueron medidos y pesados individualmente.


La prueba duró 100 días.

7.3.2. Resultados

Los valores de supervivencia y de creci-miento obtenidos tras los 100 días de prueba se recogen en la tabla 5. Las tasas de super-vivencia se encontraron entre 56,7% (frecuen-cia de alimentación una vez cada tres días y suplemento de nauplios) y 81,7% (frecuencia de alimentación una vez al día y suplemento de quistes), incrementándose significativa-mente con el aumento de la frecuencia de alimentación. No se encontraron diferencias significativas de supervivencia entre ambos suplementos (nauplios o quistes).

Referente al crecimiento, los valores fi-nales medios más altos y significativamente superiores de longitud de cefalotórax (12,94 mm), peso individual (539,08 mg), tasa de crecimiento específico (2,77%), peso gana-do (1.673,29%) y biomasa (440,25 mg dm-2) fueron alcanzados por los cangrejos que re-cibieron la dieta seca suplementada con quis-tes una vez al día.

Considerando solamente el suple-mento, los juveniles alimentados con quistes crecieron significativamente más rápido (me-dia: 12,40 mm de longitud de cefalotórax y 460,65 mg de peso) que los que recibieron nauplios (media: 11,19 mm de longitud de cefalotórax y 320,0 mg de peso).

En cuanto a la frecuencia de alimen-tación, el crecimiento fue significativamente más alto cuando el aporte de alimento se realizó una vez al día. No hubo diferencias significativas de crecimiento entre la frecuen-cia de una vez cada tres días con el suple-mento de quistes y la de una vez al día con el suplemento de nauplios.



51

El gráfico 8 muestra las tasas de su-pervivencia en los controles efectuados a lo largo del experimento. Hasta el día 40, el porcentaje de sobrevivientes fue signifi-cativamente más alto cuando la dieta seca fue suplementada con nauplios una vez al día y significativamente más bajo cuando los quistes fueron aportados una vez cada tres días. En los días 60 y 80, las tasas de supervivencia no mostraron diferencias sig-nificativas entre tratamientos.

La longitud de cefalotórax en cada uno de los controles se representa en el gráfico 9 y el peso medio en el gráfico 10. Los cangrejos que recibieron quistes de Artemia siempre cre-cieron más rápido que los que recibieron nau-plios, con diferencias significativas desde el día 40. En cuanto a la frecuencia de alimentación, el mayor crecimiento fue obtenido cuando el alimento fue aportado una vez al día, mostran-do siempre diferencias significativas con la fre-cuencia más baja (una vez cada tres días).

Gráfico 8. Tasas de supervivencia de juveniles alimentados con una dieta seca suplementada con quistes o nauplios de Artemia a diferentes frecuencias de alimentación durante 100 días (experimento III.1).


52

Gráfico 10. Peso de juveniles alimentados con una dieta seca suplementada con quistes o nauplios de Artemia a diferentes frecuencias de alimentación durante 100 días (experimento III.1).

Gráfico 9. Longitud de cefalotórax de juveniles alimentados con una dieta seca suplementada con quistes o nauplios de Artemia a diferentes frecuencias de alimentación durante 100 días (experimento III.1).


53

La tabla 6 muestra el porcentaje de ju-veniles con pérdida de una o de ambas pinzas en los diferentes controles. No se encontraron diferencias significativas relacionadas con el suplemento ni con la frecuencia de alimenta-ción entre los distintos grupos a lo largo del experimento. A los 100 días, los valores se encontraron entre 1,67% y 8,33%, mientras que en controles previos el rango estuvo en-tre 1,67% y 10%.

El mayor porcentaje de animales muer-tos (calculado a partir del número inicial de cangrejos) retirados de los tanques corres-pondió a los grupos que recibieron nauplios (11,67%), mostrando diferencias significativas con los que recibieron quistes (3,33%). No se encontraron diferencias significativas entre las tres frecuencias de alimentación.

7.3.3. Discusión

En el cultivo de crustáceos marinos, se ha desaconsejado el uso de quistes de Arte-mia desde el inicio de la alimentación externa debido a que su rápida sedimentación en el agua salada reduce la disponibilidad para lar-vas planctónicas (Sorgeloos et al. 1998). Los resultados de nuestro estudio con juveniles de cangrejo de río (P. leniusculus) muestran que los nauplios de Artemia como suplemento

de una dieta seca pueden ser sustituidos por quistes decapsulados de Artemia desde el ini-cio de la alimentación externa. Esto se debió probablemente a la inexistencia de fases lar-varias planctónicas en los astácidos. Además, el crecimiento fue más alto en los cangrejos que recibieron quistes. Teniendo en cuenta que no hay diferencias significativas entre la composición de los quistes decapsulados y la de los nauplios recién eclosionados (García-Ortega et al. 1998), ni entre la digestibilidad de ambos (García-Ortega et al. 2000), este resultado podría estar relacionado con un su-perior contenido de energía y materia seca (entre 30 y 40%) de los quistes decapsula-dos con respecto a los nauplios (Van Stappen 1996). Así, el mayor crecimiento de los can-grejos que recibieron quistes se debería a un mayor consumo de alimento (materia seca).

En cuanto a la frecuencia de alimenta-ción, su reducción afectó negativamente a la supervivencia y al crecimiento. Esto puede ser debido a la influencia tanto de factores de comportamiento como nutricionales. Por un lado, la búsqueda de nuevo alimento daría lu-gar a una mayor movilidad, lo que conduciría a un incremento de la probabilidad de encuen-tros y, por tanto, del comportamiento agre-sivo y del estrés. La proporción de animales desaparecidos (debido al canibalismo) apoya

Tabla 6. Porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en los controles a lo largo del período experimental (experimento III.1).

Las medias no son significativamente diferentes.


54

esta hipótesis, ya que el mayor porcentaje (35,83% del número inicial de cangrejos) fue registrado con la frecuencia de una vez cada tres días, disminuyendo con el incremento de la frecuencia hasta 11,67% con una vez al día. Por otro lado, la deficiente estabilidad en el agua de la dieta seca podría haber causado una pérdida de nutrientes (D´Abramo y Robin-son 1989), además de que la comida resulta menos atractiva tras haber permanecido en el agua algún tiempo (Løkkeborg 1990, Burns y Avault 1991, Sáez-Royuela et al. 2001).

Es destacable que no se hayan en-contrado diferencias de crecimiento entre la frecuencia de una vez cada tres días con el suplemento de quistes y la de una vez al día con el suplemento de nauplios. Por tanto, la suplementación con quistes permitió redu-cir la frecuencia de alimentación de una vez al día a una vez cada tres días sin afectar al crecimiento. Esto puede ser parcialmente explicado considerando el diferente compor-tamiento de los quistes y los nauplios en el agua. Los nauplios de Artemia recién eclosio-

nados permanecen vivos durante un período relativamente corto (en torno a 12 horas) en agua dulce (Celada et al. 2008) y van per-diendo progresivamente calidad nutricional. Por el contrario, los quistes decapsulados van al fondo rápidamente, donde permanecen disponibles para los cangrejos durante largos períodos, conservando su integridad nutritiva (Vanhaecke et al. 1990).

A partir de los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede deducir que la suplementación con quistes decapsulados de Artemia ofrece ventajas sobre la de nauplios vivos, ya que los quistes pueden ser mane-jados como una dieta inerte y permiten una mejora de los resultados, así como una re-ducción de mano de obra y costes. Aunque el mayor crecimiento se obtuvo con la frecuencia de una vez al día, las diferentes posibilidades en cultivo deberían ser evaluadas en términos de mano de obra, costes y posibilidades apli-cativas. El presente estudio proporciona dife-rentes opciones que pueden ser aplicadas en función de los objetivos de producción.

Foto 22. Quistes decapsulados de Artemia.

Secuencia de experimentación: Estudio IV

55


Uno de los principales problemas que afectan al cultivo intensivo de astácidos está relacionado con las pérdidas debidas al comportamiento agresivo y al canibalis-mo (Nyström 1994, Savolainen et al. 2004, González R. et al. 2009a). Es sabido que los efectos perjudiciales de las interacciones agresivas pueden reducirse con los refugios adecuados (Mason 1979, Celada et al. 1993, Sáez-Royuela et al. 2001, Streissl y Hödl 2002, Savolainen et al. 2003). Por otro lado, basándose en la idea de que la luz podría re-ducir la actividad de los cangrejos (animales nocturnos) y, por tanto, el comportamiento agresivo, algunos investigadores comen-zaron a experimentar modificando el foto-período y la intensidad lumínica (Taugbol y Skurdal 1992, Nystrom 1994, Sáez-Royuela et al. 1996). Considerando estos estudios en conjunto, los resultados presentan una am-plia variabilidad y no es posible extraer con-clusiones. Además, ha de tenerse en cuenta la influencia de la alimentación sobre los pro-cesos vinculados al comportamiento agresi-vo. En este sentido, si la escasa cantidad de alimento juega un papel esencial en el incre-mento del canibalismo, la calidad de la die-ta no es menos importante (Ackefors y Lin-dqvist 1994, Nyström 2002). De este modo,

7.4. ESTUDIO IV: REFUGIOS Y CONDICIONES DE ILUMINACIÓN PARA LA CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES DESDE EL COMIENZO DE LA ALIMENTACIÓN EXTERNA

Shelter and lighting in the intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) from the onset of exogenous feeding

R. González, J.D. Celada, V. García, J.M. Carral, A. González, M. Sáez-Royuela2010

Aquaculture Research. En revisión.


los conocimientos actuales sobre alimenta-ción plantean la necesidad del desarrollo de nuevos procesos de investigación sobre los efectos de la disponibilidad de refugios y las condiciones de iluminación durante los pri-meros meses.

Para ello, se diseñaron dos experimen-tos con la finalidad de determinar los efectos de diversas condiciones de disponibilidad de refugios y de iluminación sobre la superviven-cia y el crecimiento de juveniles alimentados una vez al día con una dieta seca para sal-mónidos combinada con quistes decapsula-dos de Artemia, de acuerdo con los recien-tes avances aportados por González et al. (2009a).

Los cangrejos, procedentes de huevos incubados artificialmente, se distribuyeron en tanques de fibra de vidrio a la densidad de 100 m-2. La temperatura del agua fue 22 ± 1ºC.

Tanto en los controles intermedios como al final de cada experimento, se regis-tró el número de cangrejos con una sola pin-za y sin pinzas.

Las curvas de supervivencia se com-pararon usando el método de Kaplan-Meier y el test de Log Rank.


56

Experimento IV.1. Se utilizaron 270 juveni-les estado 2 distribuidos en 9 tanques de 0,3 m2 de superficie y 0,1 m de profundidad de agua (Foto 23), abastecidos con un flujo de 0,5 l min-1. El fotoperíodo fue natural (aprox. 14 h luz:10 h oscuridad). El experimento duró 80 días.

Foto 23. Tanques donde se realizó el experimento IV.1.

Considerando la conveniencia del uso de materiales higiénicos en el interior de los tanques, se utilizaron tubos de PVC (4 cm longitud x 20 mm diámetro) como refugio (1 tubo=1refugio).

Los tratamientos fueron 3: cuatro, dos o un tubo (refugios) por cangrejo.

En los muestreos periódicos, se to-maban 20 cangrejos por réplica (66,7% del número inicial) para pesarlos y medirlos in-dividualmente. Al final del experimento (80 días), todos los cangrejos sobrevivientes fueron medidos y pesados de forma indivi-dual.

Experimento IV.2. Se utilizaron 180 juveni-les estado 2 distribuidos en 9 tanques de 0,2 m2 de superficie y 0,1 m de profundidad de agua (Foto 24), abastecidos con un flujo de 0,25 l min-1. Teniendo en cuenta los resulta-dos obtenidos en el experimento IV.1, sólo se proporcionó un tubo de PVC (4 cm longitud x 20 mm diámetro) por animal. El experimento duró 120 días.

En función de las condiciones de ilu-minación, los tratamientos fueron 3:

- Iluminación continua de 925 lux. Los tanques fueron aislados de los otros tratamientos y del exterior. La fuente de luz era una lámpara fluorescente.

- Oscuridad continua. Se cubrió cada tanque con plástico negro opaco, que impedía la entrada de luz exterior.

- Fotoperíodo natural (aprox. 14 h luz:10 h oscuridad).

En los muestreos periódicos, se to-maban 10 cangrejos por réplica (50% del número inicial) para pesarlos y medirlos in-dividualmente. Al final del experimento (120 días), todos los cangrejos sobrevivientes fueron medidos y pesados de forma indivi-dual.

7.4.2. Resultados

Experimento IV.1

Los valores finales de supervivencia y de crecimiento tras los 80 días de prueba se encuentran en la tabla 7. Las tasas de su-pervivencia se encontraron entre el 81,1% y el 91,1%, sin diferencias significativas entre

Foto 24. Instalaciones utilizadas en el experimento IV.2.


57

tratamientos. Referente al crecimiento, los valores finales medios más altos de longitud de cefalotórax (11,69 mm), peso individual (384,81 mg), tasa de crecimiento específico (3,07% día-1), peso ganado (1.165,82%) y biomasa (31.212,2 mg m-2) fueron obtenidos en los tanques provistos con 1 refugio por cangrejo, pero las diferencias con el resto no fueron significativas.

El gráfico 11 muestra las tasas de su-pervivencia en los controles efectuados a lo largo del experimento. Hasta el día 20, el porcentaje de sobrevivientes fue significati-vamente más bajo con 1 refugio por animal. Desde el día 40 hasta el final de la prueba, las tasas de supervivencia no mostraron dife-rencias significativas entre tratamientos (4, 2 ó 1 refugio por cangrejo).

Tabla 7. Valores finales de supervivencia y crecimiento de juveniles bajo diferentes condiciones de disponibilidad de refugios durante 80 días (experimento IV.1).


Gráfico 11. Tasas de supervivencia de juveniles bajo diferentes condiciones de disponibilidad de refugios durante 80 días (experimento IV.1).


58

Los gráficos 12 y 13 muestran los cambios de la longitud de cefalotórax y del peso, respectivamente, a lo largo del experi-mento. No se encontraron diferencias signifi-cativas durante los 80 días de prueba.

La tabla 8 muestra el porcentaje de

juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en los diferentes controles. A los 80 días, los valores se encontraron entre 4,4% y 5,6%, mientras que en controles previos el rango estuvo entre 2,2% y 10%. No se encontraron diferencias significativas a lo largo del experimento.

Gráfico 12. Longitud de cefalotórax de juveniles bajo diferentes condiciones de disponibilidad de refugios en cada uno de los controles durante 80 días (experimento IV.1).


59

Gráfico 13. Peso de juveniles bajo diferentes condiciones de disponibilidad de refugios en cada uno de los controles durante 80 días (experimento IV.1).

Tabla 8. Porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en cada uno de los controles a lo largo del experimento IV.1 (80 días).



60

Experimento IV.2 Los valores finales de supervivencia y

de crecimiento (120 días) se recogen en la tabla 9. Las tasas de supervivencia se en-contraron entre 76,7% y 88,3%, sin diferen-cias significativas entre tratamientos.

Respecto al crecimiento, los valores más altos de longitud de cefalotórax (12,70 mm), peso individual (543,08 mg), tasa de crecimiento específico (2,32 % día-1), peso ganado (1.686,44 %) y biomasa (46.161,7 mg m-2) correspondieron a los cangrejos so-

metidos a oscuridad continua, mostrando di-ferencias significativas con el resto en peso individual, tasa de crecimiento específico y peso ganado.

El gráfico 14 muestra las tasas de su-pervivencia en los controles efectuados a lo largo del experimento. A los 80 días, los va-lores se encontraron entre 83,3% y 91,7% (similares a los obtenidos en el experimento IV.1). No se encontraron diferencias signi-ficativas en los controles intermedios, des-de el día 20 hasta el final de la prueba (día 120).

Tabla 9. Valores finales de supervivencia y crecimiento de juveniles bajo tres condiciones diferentes de iluminación durante 120 días (experimento IV.2).



61

Los gráficos 15 y 16 muestran los cambios de la longitud de cefalotórax y del peso, respectivamente, a lo largo de los 120 días de prueba. Los cangrejos en oscuridad continua crecieron siempre significativamen-te más rápido que el resto, apreciándose diferencias significativas en el peso a partir del día 80.

La tabla 10 muestra el porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en los diferentes controles. A los 120 días, los valores se encontraron entre 1,7% y 8,3%, mientras que en controles previos el rango estuvo entre 1,7% y 13,3%. No se en-contraron diferencias significativas a lo largo del experimento.

Gráfico 14. Tasas de supervivencia de juveniles bajo tres condiciones diferentes de iluminación durante 120 días (experimento IV.2).


62

Gráfico 15. Longitud de cefalotórax de juveniles bajo tres condiciones diferentes de iluminación en cada uno de los controles durante 120 días (experimento IV.2).

Gráfico 16. Peso de juveniles bajo tres condiciones diferentes de iluminación en cada uno de los contro-les durante 120 días (experimento IV.2).


63

7.4.3. Discusión

Se ha demostrado que los efectos de la agresividad y el canibalismo se pueden re-ducir con el incremento de la disponibilidad de refugios, dando como resultado mayores tasas de supervivencia y crecimiento (Nys-tröm 1994, Sáez-Royuela et al. 1995, 2001, Streissl and Hödl 2002, Savolainen et al. 2003). En este sentido, debe considerarse que los materiales a utilizar no sólo tienen que proporcionar refugio a los animales, sino que también deberían ser atractivos para ellos y facilitar las operaciones a realizar du-rante esta fase del cultivo, todo ello sin dañar la calidad del agua. Se han probado diversos tipos de sustratos similares a los existentes en hábitats naturales, como grava (Mason 1979, Savolainen et al. 2003) o el alga Elo-dea sp. (Blake et al. 1994). Sin embargo, es-tos materiales no serían adecuados en siste-mas intensivos, ya que plantean problemas para el manejo de los animales y la limpieza de los tanques. Por otro lado, las piezas on-duladas de fibrocemento y los tubos de PVC cumplen en gran medida los requisitos men-cionados y permiten obtener mejores resulta-dos. Sáez-Royuela et al. (1995, 2001) obtu-vieron mayor crecimiento con tubos de PVC

y señalaron que la disponibilidad de grava adicional no afectó a la supervivencia ni al crecimiento. En nuestro estudio con tubos de PVC, se registraron tasas de supervivencia más altas que las obtenidas anteriormente. Además, los resultados mostraron que 1 re-fugio por animal puede ser suficiente, facili-tando las prácticas higiénicas y el manejo de animales. En P. leniusculus, es especialmen-te importante proporcionar condiciones de refugios adecuadas (al menos uno por can-grejo), ya que se trata de una especie terri-torial (Peeke et al. 1995, Edsman y Jonsson 1996) con tendencia a no compartir el mismo refugio (Ranta y Lindström 1992).

En cuanto a las condiciones de ilumi-nación, diversos autores (Mason 1979, Taug-bøl y Skurdal 1992, Nyström 1994, Sáez-Royuela et al. 1996) han obtenido mejores tasas de supervivencia y crecimiento con altas intensidades de luz o con iluminación continua. Sin embargo, no ocurrió lo mismo en el presente estudio, ya que no hubo di-ferencias significativas en la supervivencia ni en la pérdida de pinzas, y el crecimiento fue mayor en oscuridad continua. Esto pue-de deberse a que los cangrejos son anima-les nocturnos y la duración de su actividad

Tabla 10. Porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en cada uno de los controles a lo largo del experimento IV.2 (120 días).



64

está relacionada con las horas de oscuridad (Gherardi 2002), de tal forma que la búsque-da de alimento tiene lugar principalmente du-rante la noche. De este modo, las condicio-nes de oscuridad continua permitirían a los cangrejos alimentarse durante más tiempo con una dieta de mayor calidad que la utiliza-da en estudios anteriores.

Considerando en conjunto los dos ex-perimentos, los resultados muestran que, bajo las condiciones de alimentación de este estudio, se puede reducir el número de re-fugios al mínimo posible (1 por cangrejo), lo que facilita el manejo y las prácticas higiéni-cas, así como conseguir un mayor crecimien-to bajo condiciones de oscuridad continua.

Foto 25. Refugios utilizados en los experimentos IV.1 y IV.2.

Secuencia de experimentación: Estudio V

65


La clasificación por tamaño es una práctica habitual en el cultivo de la mayoría de las especies de peces de interés comer-cial debido a sus efectos beneficiosos sobre la supervivencia, el crecimiento y la eficien-cia de utilización del alimento. Además, esta práctica se recomienda especialmente en especies agresivas con tendencia al caniba-lismo y a competir por el alimento, como es el caso de los crustáceos. En el cultivo in-tensivo de astácidos, las bajas tasas de su-pervivencia y crecimiento obtenidas durante tres décadas (ver revisión de González et al. 2009a) no han permitido aceptables resulta-dos tras los primeros meses desde el inicio de la alimentación externa, lo que ha impedi-do el desarrollo de estudios de clasificación. Gracias a recientes avances en alimentación bajo condiciones controladas (Sáez-Royuela et al. 2007, González A. et al. 2008, Gonzá-lez R. et al. 2009b), este obstáculo ha sido superado. En consecuencia, se diseñó la prueba siguiente:

Experimento V.1. El objetivo fue la cría in-tensiva de juveniles de cangrejo señal du-rante los seis primeros meses de vida libre, evaluando los efectos de la clasificación por peso a 60 y 100 días sobre la supervivencia,

7.5. ESTUDIO V: CRÍA INTENSIVA DE JUVENILES DURANTE LOS SEIS PRIMEROS MESES: EFECTOS DE LA CLASIFICACIÓN POR PESO

Intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) during the first six months: Effects of size grading

R. González, J.D. Celada, J.M. Carral, V. García, M. Sáez-Royuela, A. González2010

Aquaculture. En revisión.


el crecimiento y la eficiencia de utilización del alimento.

Para ello, se emplearon 1500 juveniles estado 2 procedentes de huevos incubados artificialmente. Los cangrejos fueron distribui-dos a la densidad de 100 m-2 en 15 tanques de fibra de vidrio de 1 m2 de superficie con 200 l de agua (Foto 26). Se utilizaron 3 piezas onduladas de fibrocemento minionda de 54 x 20,5 cm y 6 grupos de cuatro tubos de PVC de 4 cm de longitud x 20 mm diámetro unidos como refugio en cada uno de los tanques. El flujo fue 1,5 l min-1 y la temperatura del agua se mantuvo a 22 ± 1 C. El fotoperíodo fue na-tural (aprox. 14 h luz:10 h oscuridad).

Foto 26. Instalaciones donde se realizó el experimento V.1.


66

Los cangrejos fueron alimentados una vez al día con una dieta seca para salmóni-dos suplementada con quistes decapsulados de Artemia (González et al. 2009b).

Los juveniles fueron alojados en 15 tanques bajo las mismas condiciones desde el inicio de la alimentación externa hasta el momento de la clasificación. A los 60 días, los cangrejos de seis tanques se mezclaron y se pesaron individualmente para clasificar-los en grandes (clase G) y pequeños (clase P). Cada clase fue distribuida aleatoriamente en tres réplicas (tanques), de tal forma que el número de cangrejos por tanque fue el mis-mo (±1 cangrejo). A los 100 días, se repitió el proceso con juveniles procedentes de otros seis tanques no clasificados previamente.

De este modo, los tratamientos fueron cinco:

• Sinclasificación.• Clasificaciónalos60días:grandes(>

405 mg).• Clasificaciónalos60días:pequeños

(< 405 mg).• Clasificaciónalos100días:grandes(>581mg).

• Clasificaciónalos100días:pequeños(< 581 mg).

En los muestreos periódicos, se toma-ban 20 cangrejos por réplica (60 por trata-

miento) para pesarlos y medirlos individual-mente. Al final del experimento (180 días), se pesaron y midieron todos los cangrejos sobrevivientes.


7.5.2. Resultados

Los valores de supervivencia, creci-miento e índices de conversión del alimento (180 días) de los animales no clasificados y de los clasificados (media de las clases G y P) se recogen en la tabla 11. Las tasas de supervivencia se encontraron entre 71,67% y 74,83%, sin diferencias significativas.

Referente al crecimiento, los valores finales medios más altos de longitud de ce-falotórax (17,39 mm), peso individual (1,43 g), tasa de crecimiento específico (2,06%) y peso ganado (4.575,84%) correspondie-ron a los cangrejos clasificados a 60 días, mostrando diferencias significativas con los no clasificados en longitud de cefalotórax, peso y tasa de crecimiento específico. No se detectaron diferencias significativas entre la clasificación a 100 días y el resto. La bioma-sa más alta (103,11 g m-2) fue alcanzada por los juveniles clasificados a 100 días, sin dife-rencias significativas con los otros grupos.

Tabla 11. Valores finales de supervivencia, crecimiento e índice de conversión del alimento (180 días) en los juveniles no clasificados y en los clasificados (media de las clases G y P).


67

El índice de conversión del alimento fue más bajo en los animales clasificados (media 2,64), mostrando diferencias signifi-cativas con los no clasificados (3,23).

La tabla 12 muestra los valores finales de supervivencia, crecimiento e índice de conver-sión del alimento en la clase G de ambas clasi-ficaciones. No se encontraron diferencias signifi-cativas en la supervivencia ni en el crecimiento, con valores medios de 74,5% de supervivencia, 19,11 mm de LC, 1,84 g de peso, 2,23 % día-1 de TCE, 5.948,29% de PG y 137,03 g m-2 de bio-masa. El índice de conversión del alimento no mostró diferencias significativas (media 2.36).

La tabla 13 muestra los valores fina-les de supervivencia, crecimiento e índice de conversión del alimento en la clase P de ambas clasificaciones. No se encontraron di-ferencias significativas en la supervivencia (media 72%). Los valores más altos de lon-gitud de cefalotórax (15,72 mm), peso (1,03 g), TCE (1,89% día-1), PG (3.255,42%) y bio-masa (72,76 g m-2) fueron alcanzados por los cangrejos clasificados a 60 días, mostrando diferencias significativas con los clasificados a 100 días. El índice de conversión del ali-mento no mostró diferencias significativas (media 2,93).

Tabla 12. Valores finales de supervivencia, crecimiento e índice de conversión del alimento (180 días) en los juveniles de la clase G de ambas clasificaciones (experimento V.1).

Tabla 13. Valores finales de supervivencia, crecimiento e índice de conversión del alimento (180 días) en los juveniles de la clase P de ambas clasificaciones (experimento V.1).

Valores en las filas con distinto superíndice presentaron diferencias significativas (P < 0,05). Losvaloresdecrecimientoderivandetodoslossobrevivientesde3réplicas(n=214enlosgruposclasificadosa60díasyn=218enlosgruposclasificadosa100días).


68

El gráfico 17 muestra las tasas de su-pervivencia en los controles efectuados a lo largo del experimento. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de sobrevivientes desde el día 20 hasta el final de la prueba (día 180). A los 60 días (prime-ra clasificación) la supervivencia media fue 84%, mientras que a los 100 días (segunda clasificación) fue 83%.

La longitud de cefalotórax en cada uno de los controles se representa en el gráfico

18 y el peso en el gráfico 19. En los juveniles no clasificados, los valores fueron siempre significativamente inferiores a los obtenidos en la clase G de ambas clasificaciones y sig-nificativamente superiores a los de la clase P. No se detectaron diferencias significativas entre ambas clases G desde el día 100 has-ta el día 180. Durante el mismo período, la longitud de cefalotórax y el peso de la clase P de la clasificación a 60 días fueron signifi-cativamente más altos que los de la clase P de la clasificación a 100 días.

Gráfico 17. Tasas de supervivencia de juveniles en los controles efectuados durante 180 días (experi-mento V.1).


69

Los valores de tasa de crecimiento es-pecífico, peso ganado e índice de conversión del alimento en diferentes períodos (0-60, 0-100, 60-180 y 100-180 días) se recogen en la tabla 14. La clasificación tanto a 60 como a 100 días ha permitido mejorar dichos valores, aunque las diferencias no resultaron significa-tivas. A medida que los animales avanzaron en su desarrollo, la tasa de crecimiento es-

pecífico fue disminuyendo desde una media de 4,37% día-1 durante los primeros 60 días hasta una media de 0,81% día-1 durante el último período (100-180 días). Por el contra-rio, el índice de conversión del alimento fue aumentando desde una media de 0,92 du-rante los primeros 60 días hasta una media de 3,19 durante el último período (100-180 días).

Gráfico 18. Longitud de cefalotórax de juveniles en los controles efectuados durante 180 días (experimen-to V.1).

Gráfico 19. Peso de juveniles en los controles efectuados durante 180 días (experimento V.1).


70

La tabla 15 muestra el porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas a lo largo del período experimental. A los 180 días, los valores se encontraron en-tre 5,33% y 9,33%, mientras que en los con-troles previos el rango estuvo entre 2,33% y 9,67%. No se encontraron diferencias signifi-cativas a lo largo del experimento.

La tabla 16 recoge los coeficientes

de variación de la longitud de cefalotórax (CVLC) y del peso (CVP) al final del experi-mento (180 días). Los valores obtenidos en el control (18,29% en longitud de cefalotórax, 62,75% en peso) fueron significativamente más altos que los obtenidos en la clasifica-ción a 60 días (en torno a 13% en longitud de cefalotórax y 46% en peso) y a 100 días (en torno a 13% en longitud de cefalotórax y 44% en peso).

Tabla 14. Tasa de Crecimiento Específico (% día-1), Peso Ganado (%) e Índice de Conversión del Alimen-to en los juveniles no clasificados y en los clasificados durante 180 días (experimento V.1).

Las medias no son significativamente diferentes.Losvaloresdecrecimientoderivandemuestrastomadasde3réplicasenelcontrol(n=60)yde6réplicasenlosgruposclasificados(n=120)enlosmuestreosintermediosydetodoslossobrevivienteseldía180.

1 Valores calculados antes de la clasificación (condiciones similares).2 Los valores de los no clasificados y de la clasificación a 100 días fueron calculados antes de la clasificación (condicio-nes similares).


71

7.5.3. Discusión

En astácidos, no se han llevado a cabo, hasta el momento, estudios de cla-sificación desde el inicio de la alimentación externa. Para ello, habría sido necesario su-perar previamente los inconvenientes de las bajas tasas de supervivencia y crecimiento durante los primeros meses de cría bajo con-diciones controladas. Sin embargo, un estu-dio (Ahvenharju et al. 2005) ha sido posible, pero comenzando con animales de 3,5 a 6 meses de edad. En parastácidos, Qin et al. (2001) iniciaron la prueba clasificando Che-rax tenuimanus con pesos comprendidos entre 10 y 160 g. Estos experimentos co-

menzaron en el momento de la clasificación, sin considerar el período previo, que implica criar a los animales desde el inicio de la ali-mentación externa hasta que sus diferencias de crecimiento puedan dar lugar a la forma-ción de distintos grupos. En este sentido, conviene señalar que un estudio completo de clasificación debería incluir datos tanto de crecimiento como de pérdidas a lo largo de todo el proceso, antes y después de la clasi-ficación.

Nuestro estudio se llevó a cabo desde el inicio de la alimentación externa, compa-rando los efectos de la clasificación a dife-rentes períodos. Los resultados obtenidos in-

Tabla 15. Porcentaje de juveniles con pérdida de una o de ambas pinzas en cada uno de los controles a lo largo del experimento V.1 (180 días).

Tabla 16. Coeficientes de variación (%) de la longitud de cefalotórax y del peso en los diferentes grupos al final del experimento V.1 (180 días).




72

dican que ambas clasificaciones, tanto a 60 como a 100 días, mejoraron los valores de crecimiento (tabla 11). Además, los cangre-jos pequeños clasificados a 60 días crecie-ron más que los clasificados a 100 días (ta-bla 13). Esto se debe probablemente a que los animales más pequeños se han benefi-ciado de la ausencia de los más grandes y dominantes durante más tiempo. Sin embar-go, la clasificación implica manejo de los ani-males que, según Farrell y Leonard (2000) y Ahvenharju et al. (2005), podría tener efec-tos perjudiciales sobre el crecimiento o la pérdida de pinzas. En nuestro estudio, la cla-sificación no incrementó la pérdida de pinzas ni afectó negativamente a la supervivencia o al crecimiento. Considerando que la densi-dad inicial fue de 100 m-2 y que los efectos perjudiciales del comportamiento agresivo y del canibalismo aumentan con la concentra-ción de animales (González et al. 2009a), se podría esperar que los beneficios de la clasi-ficación fuesen más evidentes a densidades más altas.

En cuanto al índice de conversión del alimento, la clasificación permitió mejoras significativas. Comparados con los animales no clasificados, los cangrejos clasificados fueron más eficientes para convertir el ali-mento en biomasa, al igual que se ha seña-lado en peces (Leitritz y Lewis 1976, Coche y Muir 1998) y en el crustáceo Macrobrachium rosenbergii (New 2002). La clasificación pue-de reducir, en los animales más pequeños, los niveles de estrés y dominación por par-te de los más grandes, lo que les permitiría alimentarse de forma óptima y expresar su máximo potencial de crecimiento (Ahvenhar-ju et al 2005, Martins et al. 2006, Strand et al. 2007) ya que, al emplear menos energía en luchas, pueden destinar una mayor pro-porción a los procesos de crecimiento (Davis 2006, Martínez-Porchas et al. 2009).

Considerando en conjunto los resulta-dos de este estudio, la cría intensiva de juve-niles de cangrejo durante los primeros seis meses se ha llevado a cabo con éxito y bue-nas tasas de crecimiento (Foto 27), lo que ha posibilitado la clasificación en cangrejos criados desde el inicio de la alimentación ex-terna, obteniéndose información a lo largo de todo el proceso, antes y después de la clasificación. Con vistas a las posibilidades de aplicación en cultivo, la clasificación pue-de ser recomendable una vez que aparecen marcadas diferencias de tamaño, ya que ha permitido mejorar tanto el crecimiento como el índice de conversión del alimento.

Foto 27. Individuos a los 20 días y al final del experimento V.1 (180 días).

Discusión general

73

El hecho de que la fecundidad de los astácidos sea muy inferior a la del langostino, bogavante y camarón de agua dulce determi-na que la obtención de unas tasas de super-vivencia elevadas durante las primeras eta-pas de la cría de juveniles resulte crítica para mantener un nivel de producción viable.

Una característica diferencial del cultivo de astácidos respecto al resto de crustáceos cultivados es la ausencia de fases larvarias tras la eclosión (nauplio, zoea, mysis). Sin embargo, puede establecerse cierta similitud entre las postlarvas de langostino, bogavante y camarón de agua dulce, una vez que pasan al estado bentónico, y los juveniles estado 2 de los astácidos. De este modo, el cultivo de las primeras etapas de vida libre se podría equiparar a la fase de pre-engorde o “nursery” de las postlarvas de los restantes crustáceos cultivados, de forma que algunos aspectos del ciclo productivo podrían ser comunes a ambos grupos.

La alimentación tras la fase de cría lar-varia constituye un problema aún no solven-tado de forma satisfactoria en la mayoría de las especies de crustáceos cultivados. En la investigación para el cultivo intensivo del bo-gavante, langostino y camarón de agua dulce, se sigue recurriendo a una gran variedad de dietas. Así, se han utilizado nauplios de Arte-mia recién eclosionados, diversos alimentos frescos como pescado, moluscos, otros crus-táceos y vegetales, y también piensos com-puestos granulados específicos o formula-dos para otras especies (Shleser y Gallagher 1974, Boghen y Castell 1981, Waddy 1988, D’Abramo y New 2000, Coyle et al. 2003, Ka-rani et al. 2005, Schmalenbach et al. 2009). En cuanto a la investigación para la cría de ju-veniles de astácidos en condiciones controla-das desde el inicio de la alimentación externa, la utilización de alimentos inertes, naturales o elaborados artificialmente, no ha permitido

resultados satisfactorios (ver revisión de Gon-zález et al. 2009a). Recientemente, Sáez-Royuela et al. (2007) han demostrado que, alimentando a los juveniles con una dieta compuesta para salmónidos, el suplemento con Daphnia o nauplios vivos de Artemia des-de el inicio de la alimentación externa permite una mejora de los resultados, lo cual sugiere que el alimento vivo posee factores nutricio-nales desconocidos esenciales para los juve-niles de astácidos. Posteriormente, Gonzá-lez et al. (2008) cuantificaron las cantidades óptimas de nauplios vivos de Artemia como suplemento de una dieta compuesta seca si-milar y alcanzaron un crecimiento mucho ma-yor que el obtenido hasta entonces durante el mismo período (100 días). Así, se ha demos-trado que el alimento vivo ejerce un efecto be-neficioso en la alimentación inicial de juveni-les de astácidos, tal como hace tiempo que se conoce en otros crustáceos cultivados.

Aunque el empleo de nauplios de Arte-mia es generalizado en las etapas iniciales de la cría de peces y crustáceos, su producción diaria resulta laboriosa, cara y requiere insta-laciones accesorias. Por estos motivos, el uso directo de quistes decapsulados de Artemia puede ofrecer una interesante alternativa a los nauplios vivos. En postlarvas de langos-tinos, Stael et al. (1995) y Ribeiro y Jones (1998) obtuvieron mejores tasas de supervi-vencia y crecimiento al reemplazar nauplios vivos de Artemia por quistes decapsulados. En nuestros experimentos con P. leniusculus, se comprobó que los nauplios vivos como su-plemento de una dieta seca pueden ser susti-tuidos por quistes decapsulados en la misma proporción desde el inicio de la alimentación externa, ya que el crecimiento fue mayor cuando los cangrejos recibieron quistes.

Las prácticas de incubación artificial no resultan especialmente interesantes en el caso del langostino o del camarón de agua

8. DISCUSIÓN GENERAL

Discusión general

74

dulce, fundamentalmente por tratarse de es-pecies con un corto desarrollo embrionario y un elevado número de huevos en cada pues-ta. Sin embargo, en astácidos se planteó la conveniencia de la incubación artificial ya en el siglo XIX y, hace tres décadas, surgió un interrogante acerca de la posterior viabilidad de los juveniles obtenidos mediante incuba-ción artificial, planteando la duda de si estos animales tendrían las mismas perspectivas de subsistencia que los procedentes de in-cubación maternal (Mason 1977b). Posterior-mente, Sáez-Royuela et al. (1995) señalaron que la procedencia de los juveniles no influye sobre la futura viabilidad de los mismos. Tam-poco se detectaron efectos negativos al usar un compuesto yodado como antifúngico en incubación artificial (Policar et al. 2006). De forma similar, en el presente estudio la incu-bación artificial con tratamientos de formalde-hído no ha tenido efectos perjudiciales sobre la posterior supervivencia de los juveniles, que además crecieron significativamente más rápido que los obtenidos mediante incubación maternal, lo que atribuimos principalmente al mejor estado sanitario de los animales que, en principio, puede asumirse que nacen libres de enfermedades.

El comportamiento agresivo y el cani-balismo representan un obstáculo importante para el cultivo de crustáceos en general, con excepción de los langostinos (Walne 1977, Barnabé 1991). La pérdida de apéndices, las heridas y la amplia diversidad de tamaños son las principales consecuencias y todas ellas afectan marcadamente a su valor en el mer-cado. Este comportamiento bajo condiciones de cultivo ha sido considerado por diversos in-vestigadores como un serio problema para la cría de postlarvas de M. rosenbergii (Wickins 1972, Sandifer y Smith 1976, 1985, Walne 1977) y Homarus sp. (Walne 1977, Van Olst y Carlberg 1978, Coll 1983, Lee y Wickins 1992), así como de juveniles de cangrejo de río (Mason 1979, Ackefors et al. 1989, Sáez-Royuela et al. 1995, 1996, 2001). El mante-ner a los animales a una densidad adecuada, fijar frecuencias de alimentación apropiadas, proporcionar suficientes refugios y condicio-

nes idóneas de iluminación podría mejorar los resultados de forma significativa (Aiken et al. 1981, Sáez-Royuela et al. 1995, 2001, 2007, Coyle et al. 2003, Whangchai et al. 2007).

En crustáceos juveniles, el incremento de la densidad ocasiona un mayor número de encuentros agonísticos, lo que determina una disminución del porcentaje de supervi-vencia y de las tasas de crecimiento (Lee y Wickins 1992, Gherardi 2002). En el camarón de agua dulce y el langostino, el cultivo a al-tas densidades parece ser factible. Así, Mar-ques et al. (2000) recomiendan densidades iniciales de 800 postlarvas de M. rosenbergii por m2, mientras que Arnold et al. (2006) ob-tuvieron resultados aceptables con 2000 Pe-naeus monodon por m3. Por el contrario, en el bogavante sólo se obtienen valores de su-pervivencia aceptables cuando se mantiene a los animales en compartimentos individua-les, donde el canibalismo y las heridas debi-das a las interacciones agresivas pueden ser evitadas (Lee y Wickins 1992, Prodöhl et al. 2006). En astácidos, se han utilizado siste-mas de aislamiento en investigación (Celada et al. 1989, 1993, Ackefors et al. 1992, 1995, Henttonen et al. 1993, Nystrom 1994, Sáez-Royuela et al. 1994, 1995), pero en cultivo no son aconsejables debido a su elevado coste y al reducido valor unitario de los animales en el mercado. Por tanto, es conveniente el desarrollo de sistemas de cría en grandes grupos. Algunos autores han aconsejado den-sidades para mantener a los juveniles desde el estado 2 en condiciones controladas. Así, D´Abramo et al. (1985), Ackefors et al. (1989), Gydemo y Westin (1989) y Nyström (1994) re-comendaron densidades iniciales entre 50 y 150 juveniles por m2 hasta los 4 meses, mien-tras que Savolainen et al. (2004), en un inten-to de equilibrar resultados de la cría y costes de producción, consideraron que la concen-tración inicial debería encontrarse entre 200 m-2 y 400 m-2 durante los 3 primeros meses. Teniendo en cuenta los recientes avances en alimentación, en este estudio se proba-ron densidades iniciales entre 100 y 1000 cangrejos m-2, obteniéndose unos resultados que superaron ampliamente a los obtenidos

Discusión general

75

en anteriores investigaciones. Las tasas más altas de supervivencia y crecimiento se alcan-zaron con 100 juveniles m-2, mientras que el crecimiento mostró escasa dependencia de la densidad entre 300 m-2 y 1000 m-2.

Referente a la frecuencia de alimenta-ción, tanto en postlarvas de bogavante como de langostino se han probado aportes de ali-mento desde varias veces al día hasta una vez cada cuatro días (Shleser 1974, Robert-son et al. 1993, Schmalenbach et al. 2009). Los resultados obtenidos en Homarus ameri-canus (Shleser 1974) indican que es conve-niente alimentar a las postlarvas al menos una vez al día. Sin embargo, Schmalenbach et al. (2009), con Homarus gammarus, obtuvieron altas tasas de supervivencia y crecimiento in-cluso con una frecuencia de alimentación de una vez cada cuatro días. En Penaeus van-namei, Robertson et al. (1993) recomiendan una frecuencia mínima de cuatro veces al día. En juveniles de astácidos bajo condicio-nes controladas, Sáez-Royuela et al. (2001) no encontraron diferencias significativas entre una y dos veces al día, lo cual coincide con los resultados de nuestro trabajo (experimen-to I.2). Pero esto supone una tarea laboriosa y las posibilidades de su reducción deberían ser estudiadas. Así, en el estudio III se pro-bó a distanciar los aportes de alimento de una vez al día a una vez cada tres días. En este caso, las tasas de supervivencia y crecimien-to fueron negativamente afectadas cuando la frecuencia se redujo de una vez al día a una vez cada dos o cada tres días. Sin embargo, la suplementación con quistes una vez cada tres días permitió un crecimiento similar al ob-tenido con el suplemento de nauplios una vez al día, lo que puede confirmar la mayor capa-cidad de los quistes para conservar su integri-dad nutritiva en el agua.

En crustáceos cultivados, la disponibi-lidad de refugios apropiados conduce a una disminución del número de encuentros entre animales y, por tanto, de los ataques y del canibalismo (Van Olst et al. 1975, Aiken y Wady 1977, Sáez-Royuela et al. 1995, 2001, Savolainen et al. 2003, Streissl y Hödl 2002).

Así, cuando postlarvas de M. rosenbergii y de Homarus sp. son mantenidas en tanques sin refugios adecuados, la tasa de mortalidad es muy elevada (Fujimura y Okamoto 1970). Según Spanier et al. (1998), Abgrall et al. (2000) y Whangchai et al. (2007), la adición de diversos tipos de sustratos artificiales a los tanques permite obtener mayores porcentajes de supervivencia y crecimiento, además de facilitar las operaciones de manejo y limpieza. En condiciones de laboratorio con juveniles de cangrejo, los sustratos utilizados como re-fugios han sido de diversa naturaleza (Mason 1979, Blake et al. 1994, Sáez-Royuela et al. 1995, 2001, Savolainen et al. 2003). Sin em-bargo, deben considerarse materiales que sir-van no sólo de refugio para los juveniles, sino también que sean atractivos para ellos y faci-liten tanto el manejo de los animales como la limpieza de los tanques, todo ello sin dañar la calidad del agua. Sáez-Royuela et al. (1995, 2001) registraron un mayor crecimiento usan-do tubos de PVC y comprobaron que la dis-ponibilidad adicional de grava no afecta a la supervivencia ni al crecimiento. Aplicando los conocimientos actuales sobre alimentación, en nuestros estudios con tubos de PVC, las tasas de supervivencia y crecimiento fueron superiores a las obtenidas en trabajos pre-vios, demostrando que 1 refugio por cangrejo puede ser suficiente, facilitando las prácticas higiénicas y el manejo de los animales. No obstante, la utilización de piezas onduladas de fibrocemento (estudio II) o la combinación de estas con tubos de PVC (estudio V) han mostrado una eficacia similar para proporcio-nar refugio a los juveniles.

En cuanto a condiciones de ilumina-ción para la cría de postlarvas de crustáceos, se han obtenido resultados diversos. En H. americanus, Carlberg et al. (1979) registraron mayores tasas de supervivencia en condicio-nes de luz constante. De forma similar, en los experimentos llevados a cabo por Aiken et al. (1981) con la misma especie, las mayores ta-sas de crecimiento se alcanzaron al incremen-tar el fotoperíodo. No obstante, los resultados obtenidos por Koshio et al. (1990) no mostra-ron influencia del fotoperíodo sobre el creci-

Discusión general

76

miento. Por el contrario, en Macrobrachium sp. se obtuvo un mayor crecimiento en con-diciones de oscuridad continua (Withyachum-narnkul et al. 1990, Subramanian et al. 2005). En el caso del cangrejo de río, el incremen-to del fotoperíodo y de la intensidad lumínica permitió obtener un mayor porcentaje de su-pervivencia en los trabajos de Mason (1979), Taugbøl y Skurdal (1992), Nyström (1994) y Sáez-Royuela et al. (1996). Sin embargo, en nuestra prueba no se encontraron diferencias en la supervivencia, mientras que el creci-miento fue mayor en los animales sometidos a oscuridad continua. Esto puede deberse a que los cangrejos son animales nocturnos y la búsqueda de alimento tiene lugar princi-palmente durante la noche (Gherardi 2002). De este modo, las condiciones de oscuridad continua habrían permitido a los cangrejos ali-mentarse durante más tiempo con una dieta de mayor calidad que la utilizada en los ante-riores estudios con astácidos.

Se han registrado amplias diferencias de crecimiento entre individuos de la mis-ma especie y edad, tanto en peces como en crustáceos (D’Abramo et al. 1985, D’Abramo y Robinson 1989, New 1990, Lee y Wickins, 1992, Sáez-Royuela et al. 1995, 1996, 2001, Coche y Muir 1998), debido posiblemente a la dominancia ejercida por los animales más agresivos (Walne 1977, Atencio-García y Za-niboni-Filho 2006, Ahvenharju y Ruohonen 2007). La separación de los ejemplares que han alcanzado mayores dimensiones permiti-ría un incremento del ritmo de crecimiento de los individuos más pequeños, cuyo desarrollo se habría encontrado inhibido por los gran-des. Así, la clasificación por tamaños es una práctica habitual en el cultivo de peces de-bido a sus efectos beneficiosos sobre la su-pervivencia, el crecimiento (Southgate 1993, Barki et al. 2000) y la eficiencia de utilización del alimento (Leitriz y Lewis 1976, Coche y Muir 1998). Esta práctica es especialmen-te recomendada en especies agresivas, con fuerte tendencia al canibalismo, aunque sus efectos sobre el cultivo de crustáceos no han sido suficientemente estudiados. En el cama-rón de agua dulce, hay referencias que indi-

can los beneficios de esta práctica (Daniels y D’Abramo 1994, Daniels et al. 1995, New 2002, Tidwell et al. 2003, 2004). En las inves-tigaciones con astácidos desde el comienzo de la alimentación externa, las bajas tasas de supervivencia y crecimiento obtenidas du-rante tres décadas han impedido el desarrollo de estudios de clasificación, ya que no han permitido que las circunstancias pudieran dar lugar a este planteamiento. La mayor disponi-bilidad de conocimientos actual ha conducido a la realización con éxito de nuestra prueba de cría durante los primeros seis meses, don-de la clasificación tanto a 60 como a 100 días permitió un incremento de los valores de cre-cimiento y una disminución de los índices de conversión del alimento.

Considerando en conjunto los porcenta-jes de supervivencia en nuestros experimen-tos, iniciados todos ellos desde el comienzo de la alimentación externa (juvenil estado 2), los valores fueron altos en las condiciones básicas de los diferentes estudios (densidad inicial de 100 cangrejos m-2 y aporte una vez al día de una dieta compuesta para salmónidos suple-mentada con nauplios o con quistes de Arte-mia), encontrándose en torno al 80% a los 100 días y al 73% a los 180 días. El origen de los juveniles (incubación maternal o incubación artificial), la disponibilidad de refugios, las con-diciones de iluminación o la clasificación por peso no causaron cambios en la superviven-cia. Sin embargo, la mortalidad aumentó sig-nificativamente cuando se redujo la frecuencia de alimentación de una vez al día a una vez cada dos o tres días y cuando se alojaron a densidades iniciales de 300 m-2 o superiores.

Respecto al crecimiento, fue afectado por los diferentes factores estudiados con ex-cepción de la disponibilidad de refugios. En primer lugar, los juveniles procedentes de in-cubación artificial alcanzaron en 80 días un peso 49% superior al de los procedentes de incubación maternal. Los juveniles a la den-sidad inicial de 100 m-2 llegaron a pesar des-pués de 100 días un 50% más que los alo-jados a densidades más altas. El suplemento de quistes decapsulados de Artemia permitió

Discusión general

77

aumentar un 44% el peso de los cangrejos frente al suplemento de nauplios. Con una frecuencia de alimentación de una vez al día durante 100 días, los juveniles alcanzaron un 40% más de peso que con las mismas can-tidades de alimento aportadas una vez cada tres días. La oscuridad permanente durante 120 días permitió incrementar el peso un 22% frente a condiciones de fotoperíodo natural o iluminación continua. Después de los seis primeros meses de cría, el peso medio de los animales clasificados a 60 días fue un 10% más alto que el de los no clasificados.

Por otra parte, los porcentajes de ani-males con una sola pinza o sin pinzas no se vieron afectados por los diferentes factores estudiados con excepción de la densidad. Con 100 m-2 se encontraron en torno al 5% a los 100 días y al 7% a los 180 días. Dichos porcentajes fueron más elevados cuanto ma-yor fue la densidad inicial.

Cara a las posibilidades de aplicación en los procesos productivos, nuestras inves-tigaciones aportan resultados de gran utilidad para la mejora de las técnicas de cultivo, que podrían resumirse en los siguientes aspectos:

a) En principio, la introducción progresi-va de la incubación artificial con tratamientos de formaldehído en las factorías de producción debería ser considerada, ya que se aprovecha-rían las ventajas de esta técnica, que permite obtener juveniles con un óptimo estado sani-tario, pues puede asumirse que los produci-dos mediante incubación artificial con agentes biocidas y sin contacto con otros animales se encuentran libres de enfermedades conocidas. Además, los juveniles procedentes de incuba-ción artificial no sólo han presentado una tasa de supervivencia similar a los nacidos de hue-vos incubados por las madres, sino que crecie-ron significativamente más rápido.

b) En cuanto a la densidad, aunque los valores más altos de supervivencia y cre-cimiento fueron obtenidos con 100 m-2, entre 300, 600 y 1000 m-2 las diferencias de creci-miento en ningún momento fueron significati-

vas. Sin embargo, la biomasa más alta se ob-tuvo con la densidad inicial de 1000 m-2 y fue inferior a medida que las densidades iniciales fueron menores. Cara a las posibilidades apli-cativas en cultivo, las decisiones habrían de tomarse en función de las circunstancias y de los objetivos prioritarios en cada caso. Si el propósito es obtener un elevado número de animales por m2 o una alta biomasa final, la densidad inicial habría de ser mayor que si, en el mismo período, lo que interesa es con-seguir individuos con rápido ritmo de creci-miento y menor mortalidad.

c) Respecto a la frecuencia de alimen-tación, como las diferentes opciones en cul-tivo deberían ser evaluadas en términos de mano de obra, costes y posibilidades aplica-tivas, ha de valorarse si el mayor crecimiento (correspondiente a una frecuencia de una o dos veces al día) es la opción óptima. El pre-sente estudio proporciona diferentes alterna-tivas que pueden ser aplicadas en función de los objetivos de producción.

d) El uso de quistes decapsulados de Artemia como suplemento de un pienso com-puesto seco ofrece una interesante alterna-tiva a los nauplios vivos desde el punto de vista del cultivo, ya que permiten un mayor crecimiento, se pueden manejar como una dieta inerte, están desinfectados y no pierden nutrientes en el agua, además de facilitar un ahorro de mano de obra y costes, ya que se puede prescindir de las instalaciones y del trabajo para la producción de alimento vivo.

e) Bajo las condiciones de alimentación de nuestro estudio, el número de refugios por cangrejo no influyó sobre los resultados, su-giriendo que 1 refugio por animal puede ser suficiente. Por este motivo, en condiciones de cultivo sería interesante reducir el material para refugios al mínimo posible, lo que facili-taría el manejo y las prácticas higiénicas.

f) En cuanto a las condiciones de ilumi-nación, no hubo diferencias significativas en la supervivencia, mientras que el crecimiento fue mayor en los animales sometidos a oscu-

Discusión general

78

ridad continua. De este modo, en condiciones intensivas puede contemplarse la posibilidad de mantener a los juveniles en condiciones de relativa ausencia de luz durante el primer período de cría.

g) La etapa más crítica en la cría de ju-veniles se encuentra en los primeros meses. En el presente estudio, se ha superado esta fase con buenos resultados, llegando incluso a seis meses. Dentro de ello, la clasificación parece ser recomendable en condiciones de cultivo, ya que permite un incremento de los valores de crecimiento, así como una mejo-ra de los índices de conversión del alimento. Además, comparando los efectos de la clasi-ficación a dos períodos diferentes, se ha de-mostrado la conveniencia de clasificar a los cangrejos después de 60 días desde el co-mienzo de la alimentación externa, debido al mayor crecimiento final de los animales más pequeños comparado con el de los clasifica-dos a 100 días. Por otro lado, nuestro trabajo aporta datos sobre la evolución de las tasas de crecimiento y del índice de conversión del alimento en condiciones intensivas durante 180 días. Así, la tasa de crecimiento espe-cífico fue disminuyendo desde una media de 4,37% día-1 durante los primeros 60 días

hasta una media de 0,81% día-1 durante el último período (100-180 días). Por el contra-rio, el índice de conversión del alimento se fue incrementando desde una media de 0,92 durante los primeros 60 días hasta una me-dia de 3,23 durante el último período (100-180 días).

Los conocimientos adquiridos durante el período experimental constituyen una sóli-da base para la continuidad en aquellas vías específicas encaminadas a la mejora de los procesos productivos que, a nuestro juicio, deberían orientarse en el futuro hacia los si-guientes aspectos:

– Estudiar efectos de la densidad y de las condiciones de iluminación a partir de los tres meses.

– Valorar los efectos de la clasificación por sexo.

– Adquirir conocimientos básicos de nu-trición, orientados a la cría en condi-ciones controladas.

– Elaboración de dietas compuestas se-cas específicas para cangrejos.

Conclusiones

79

1. En las condiciones básicas de expe-rimentación de los diferentes estudios (den-sidad inicial de 100 cangrejos m-2 y aporte una vez al día de una dieta compuesta para salmónidos suplementada con nauplios o con quistes de Artemia), se obtuvieron valores medios del 80% de supervivencia y 663 mg tras 100 días desde el comienzo de la alimen-tación externa y del 73% de supervivencia y 1370 mg tras 180 días. Los porcentajes me-dios de cangrejos con una sola pinza o sin pinzas fueron del 5% tras 100 días y del 7% tras 180 días.

2. El tratamiento antifúngico adminis-trado durante la incubación artificial de los huevos (3000 ppm de formaldehído 15 minu-tos en días alternos) no ha mostrado efectos perjudiciales sobre la posterior viabilidad de los juveniles producidos. Dentro de tasas de supervivencia en torno al 86% tras 80 días de cría, los animales obtenidos mediante incu-bación artificial pesaron un 49% más que los procedentes de incubación maternal.

3. Las densidades iniciales de juveniles influyeron marcadamente sobre las tasas de supervivencia a los 100 primeros días de cría, que se redujeron desde un 86% con 100 can-grejos m-2 hasta un 39% con 1000 m-2. El cre-cimiento fue superior con 100 m-2 y no hubo diferencias entre 300, 600 y 1000 m-2.

4. Frecuencias de alimentación de una o dos veces al día no dieron lugar a diferentes resultados. La reducción a una vez cada dos o tres días durante 100 días afectó negativamen-te tanto a la supervivencia como al crecimiento.

5. Los quistes decapsulados de Arte-mia en sustitución de los nauplios vivos como suplemento de una dieta compuesta seca desde el comienzo de la alimentación externa no ha afectado a las tasas de supervivencia a 100 días de cría y ha permitido alcanzar un 44% más de peso. No hubo diferencia de cre-

cimiento entre el aporte de alimento una vez cada tres días con el suplemento de quistes y una vez al día con el de nauplios.

6. En condiciones controladas, ha de procurarse que cada juvenil tenga posibilidad de encontrar al menos un refugio, que puede ser suficiente, ya que no hubo diferencia entre disponibilidades de 1 y 4 refugios por cangrejo.

7. Dentro de tasas de supervivencia en torno al 83% a 120 días, la oscuridad perma-nente permitió incrementar el peso un 22% frente a condiciones de fotoperíodo natural o iluminación continua.

8. Las clasificaciones efectuadas tanto a 60 como a 100 días desde el comienzo de la alimentación externa han posibilitado uniformar las dimensiones de los cangrejos dentro de cada clase después de 180 días de cría. Los coeficientes de variación del peso de los juve-niles clasificados han sido por término medio un 28% inferiores a los de los no clasificados.

9. La clasificación a los 60 días de cría permitió incrementar el peso medio final (180 días) un 10% respecto a los cangrejos no cla-sificados. El peso final de los juveniles clasi-ficados como pequeños a los 60 días fue un 18% más alto que el de los pequeños clasifi-cados a los 100 días.

10. Después de 180 días de cría, el índice de conversión del alimento de los can-grejos clasificados (media 2,6) fue más bajo que el de los no clasificados (3,2).

11. Desde el comienzo de la alimenta-ción externa, la tasa de crecimiento especí-fico fue disminuyendo desde una media de 4,4% día-1 durante los primeros 60 días hasta 0,8% día-1 en el último tramo (100-180 días) mientras que el índice de conversión durante los mismos períodos fue aumentando desde una media de 0,9 hasta 3,2.

9. CONCLUSIONES

Conclusions

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1. Under the basic experimental con-ditions of the different studies (stocking den-sity of 100 crayfish per m2 and provision of a dry diet for salmonids supplemented with Artemia nauplii or cysts once a day), mean values of 80% survival and 663 mg were ob-tained after 100 days from the onset of ex-ogenous feeding and 73% survival and 1370 mg after 180 days. The mean percentages of crayfish lacking one or two chelae were 5% after 100 days and 7% after 180 days.

2. The antifungal treatment admin-istered during artificial incubation of eggs (3000 ppm of formaldehyde for 15 min eve-ry other day) had no harmful effects on the subsequent survival of juveniles. Within the 86% survival rate recorded after 80 days of rearing, the animals derived from artificial in-cubation weighed 49% more than those from maternal incubation.

3. Juvenile stocking densities greatly influenced survival rates for the first 100 days of rearing, dropping from 86% with 100 cray-fish per m2 to 39% with 1000 m-2. The highest growth rate was obtained with 100 m-2 and no differences were found between 300, 600 and 1000 m-2.

4. Feeding frequencies of once or twice a day did not produce different results. The reduction of frequency to once every two or every three days for 100 days negatively affected both survival and growth.

5. Decapsulated Artemia cysts as a substitute for live Artemia nauplii to supple-ment a dry diet from the onset of exogenous feeding did not affect survival rates after 100 days of rearing, and allowed a 44% increase in weight. There were no differences in

growth between the frequency of once every three days with cyst supplement and that of once a day with nauplii supplement.

6. Under controlled conditions, each juvenile should have the opportunity to find at least one shelter, which can be enough, since there were no differences between 1 and 4 shelters per crayfish.

7. Within the 83% survival rate re-corded after 120 days of rearing, continuous darkness allowed a 22% increase in weight compared to the natural photoperiod or con-tinuous light conditions.

8. Gradings at either 60 or 100 days from the onset of exogenous feeding allowed uniform crayfish size within each class af-ter 180 days of rearing. The coefficients of weight variation in the graded juveniles were 18% lower than in the ungraded crayfish.

9. Grading at 60 days allowed a 10% increase in final mean weight with regard to ungraded crayfish. The final weight of the lower-class juveniles graded at 60 days was 18% higher than that of lower-class juveniles graded at 100 days.

10. After 180 days of rearing, the food conversion ratio of the graded crayfish (av-erage 2.6) was lower than that of ungraded crayfish (3.2).

11. From the onset of exogenous feed-ing, specific growth rate decreased from a mean of 4.4% day-1 over the first 60 days to a mean of 0.8% day-1 during the final period (100-180 days), whereas the food conversion ratio for the same periods increased from a mean of 0.9 to 3.2.

10. CONCLUSIONS

Resumen

81

A partir de los años 60, se ha venido desarrollando un creciente interés por el cul-tivo de astácidos en Europa, donde son con-siderados un alimento de lujo y alcanzan ele-vados precios en el mercado. Los sistemas son, generalmente, de tipo extensivo y, en el mejor de los casos, semiextensivo. En tales circunstancias, las diferentes etapas del pro-ceso productivo están sujetas a factores am-bientales de difícil control, con rendimientos bajos e impredecibles. Esto ha conducido en numerosos países al desarrollo de líneas de investigación para la intensificación y mejora de las distintas fases del cultivo.

En anteriores investigaciones con P. le-niusculus y A. pallipes, este grupo ha llegado a la puesta a punto de técnicas de gran valor aplicativo en la fase reproductiva, que abarcan desarrollo gonadal, maduración, apareamien-to, oviposición, embriogénesis en incubación maternal, sistemas de incubación artificial, así como almacenamiento y transporte de huevos, todo ello orientado a la mejora de cada una de las etapas del largo proceso que finalmente culmina con la obtención del juvenil estado 2.

Una vez que se ha logrado una acep-table eficiencia en la producción de juveniles, el siguiente paso ha de abordar el incremento de las tasas de supervivencia y de crecimien-to de los animales obtenidos en la fase repro-ductiva. Ahora sabemos que las causas de los pobres resultados obtenidos durante 30 años se encuentran vinculadas a deficiencias nu-tritivas, relacionadas con factores esenciales desconocidos que pueden ser aportados por alimento vivo, lo cual ha permitido superar el bloqueo sufrido por los procesos de investiga-ción y establece las bases para una alimenta-ción adecuada. A partir de aquí, otros factores importantes en la cría de juveniles pueden ser estudiados sin el riesgo de que los resultados se distorsionen, enmascarados por una defi-ciente alimentación. En principio, el grado de desarrollo alcanzado en técnicas de incubación

artificial, que incluye la administración de tra-tamientos antifúngicos sobre altas densidades de huevos, hace conveniente el estudio de la posterior viabilidad de los juveniles así obteni-dos. Por otro lado, la aplicación de los recien-tes avances en alimentación permite alcanzar buenas tasas de supervivencia y de crecimien-to, a la vez que, indudablemente, influye sobre el comportamiento ingestivo y agonístico de los cangrejos. Esto incide directamente sobre los efectos de aquellos factores estrechamente relacionados con la agresividad y el canibalis-mo, que son principalmente la densidad de ju-veniles, la frecuencia de alimentación y forma de los alimentos, la disponibilidad de refugios y las condiciones de iluminación, así como las posibilidades de reducir la presión dominante de los cangrejos de crecimiento más rápido so-bre los más pequeños mediante la separación por clasificación.

Sobre esta base, la finalidad de esta Tesis Doctoral es la mejora de las técnicas de cría de juveniles de astácidos aplicando re-cientes avances en alimentación, orientada al estudio de aspectos relacionados con prácti-cas de manejo y condiciones ambientales, así como a obtener información sobre la respues-ta de los juveniles a períodos de cría desde el inicio de la alimentación externa más largos que los alcanzados hasta el presente. Los ob-jetivos concretos son:

• Evaluarposiblesinfluenciasdelorigende los juveniles: incubación maternal o incubación artificial. Estudio I.

• Determinardensidadesadecuadaspara la cría intensiva. Estudio II.

• Simplificarlasprácticasvinculadasalaalimentación. Estudio III.

• Determinarcondicionesadecuadasdedisponibilidad de refugios y de ilumina-ción. Estudio IV.

11. RESUMEN

Resumen

82

• Críaintensivadurantelosseisprime-ros meses, evaluando efectos de la clasificación por peso. Estudio V.

Estas investigaciones se desarrollaron en los laboratorios de acuicultura del Depar-tamento de Producción Animal de la Univer-sidad de León a lo largo de tres años con-secutivos, en el marco del proyecto del Plan Nacional de I+D+i “Técnicas de cría de juve-niles de astácidos (Pacifastacus leniusculus Dana) en condiciones controladas”, referencia AGL2005-01127, y de una beca del Programa Nacional de Formación de Profesorado Uni-versitario, con referencia AP2005-4860.

Se llevaron a cabo 7 experimentos en-tre 80 y 180 días de duración, iniciados todos ellos con juveniles estado 2 de la especie Pacifastacus leniusculus (Dana, 1852). Se utilizaron en total 8760 juveniles, obtenidos a partir de hembras con huevos procedentes de una astacifactoría que cada año se traslada-ban a nuestras instalaciones de experimenta-ción, aproximadamente un mes después de la oviposición, para la aplicación de técnicas de control de la reproducción durante varios meses hasta la conclusión del proceso con la producción del juvenil estado 2.

En los distintos experimentos, los can-grejos fueron alimentados manualmente con un pienso compuesto formulado para salmó-nidos suplementado con nauplios de Artemia recién eclosionados (estudios I, II y III) o con quistes decapsulados de Artemia (estudios III, IV y V).

Estudio I (Publicación I: Reviews in Fish Biology and Fisheries 19, 2009).– Durante la incubación artificial, es aconsejable la utiliza-ción de biocidas para evitar la proliferación fúngica sobre los huevos muertos. Aunque se ha comprobado que estos compuestos no afectan negativamente a los huevos, los pos-teriores efectos sobre los juveniles son toda-vía desconocidos. Para aclarar esta cuestión, se diseñaron dos experimentos de 80 días con la finalidad de comparar la supervivencia y el crecimiento de juveniles procedentes de

dos orígenes: incubación maternal o incuba-ción artificial con tratamientos de formaldehí-do (3000 ppm de formaldehído 15 minutos en días alternos hasta la eclosión).

En el experimento I.1, los tratamientos fueron tres: juveniles procedentes de incu-bación artificial, juveniles procedentes de in-cubación maternal y mezcla de juveniles de ambos orígenes. Los porcentajes finales de supervivencia se encontraron entre 87,78% y 93,33%, sin diferencias entre tratamientos, mientras que los cangrejos procedentes de incubación artificial crecieron significativa-mente más rápido (11,47 mm de longitud de cefalotórax y 373,80 mg de peso) que los ob-tenidos mediante incubación maternal (9,88 mm y 236,62 mg).

Dado que en el experimento I.1, las ta-sas de crecimiento obtenidas fueron mayores en el caso de los juveniles procedentes de in-cubación artificial, se planteó la hipótesis de que estos efectos beneficiosos podrían ser mejorados al incrementar la frecuencia de alimentación. Así, se diseñó un experimento bifactorial (I.2) con cuatro tratamientos: ju-veniles procedentes de incubación artificial o maternal alimentados una o dos veces al día. Sin diferencias entre las dos frecuen-cias, los porcentajes de supervivencia finales se encontraron entre 68,89% y 77,78%, y los cangrejos procedentes de incubación artifi-cial crecieron significativamente más rápido (media: 14,27 mm de longitud de cefalotórax y 750,02 mg de peso) que los de incubación maternal (media: 12,95 mm y 520,57 mg). Los resultados muestran que la incubación artificial con tratamientos de formaldehído no ha provocado posteriores efectos perjudi-ciales, permitiendo además un mayor creci-miento de los juveniles producidos.

Estudio II (Publicación II: Aquaculture International 18, 2010).– La determinación de densidades adecuadas, así como máximas cargas admisibles, es indispensable de cara a la intensificación del cultivo. En una prueba de 100 días (experimento II.1), se probó el efecto de cuatro densidades iniciales (100,

Resumen

83

300, 600 y 1000 m-2) de juveniles estado 2. Las tasas de supervivencia se redujeron des-de un 86,33% con 100 cangrejos m-2 hasta un 39% con 1000 m-2. La proporción de anima-les con falta de una o ambas pinzas al final del experimento fue más elevada cuanto ma-yor fue la densidad inicial, encontrándose en-tre 14,44% (100 m-2) y 41,45% (1000 m-2). El crecimiento fue superior con 100 m-2 (15,28 mm de longitud de cefalotórax y 1,08 g de peso) y no hubo diferencias entre 300, 600 y 1000 m-2 (media: 13,94 mm y 0,72 g). Este estudio demuestra que la dieta es un factor decisivo para alcanzar con éxito altas densi-dades en condiciones controladas y aporta información que puede servir de referencia para establecer densidades adecuadas en función de los objetivos de producción.

Estudio III (Publicación III: Aquacul-ture 295, 2009).– Se valoró la utilización de quistes decapsulados de Artemia como al-ternativa a los nauplios recién eclosionados, lo que supondría una simplificación de las prácticas de alimentación y prescindir de las instalaciones y del trabajo necesarios para el proceso de producción de nauplios. Además, los quistes, una vez decapsulados, pueden ser manejados como una dieta inerte, están desinfectados y no pierden nutrientes en el agua. Esta condición de estabilidad de los quistes podría ser aprovechada a la hora de establecer la frecuencia de alimentación. Así, tras haber comprobado que el incremento de la frecuencia de una a dos veces al día no mejoró la tasa de crecimiento (experimento I.2), también se probó a distanciar más los aportes de alimento.

Para ello, se diseñó una prueba de 100 días (experimento III.1) en la que dos dietas diferentes (pienso de trucha suple-mentado con quistes o con nauplios de Ar-temia) se aportaron con tres frecuencias de alimentación (una vez al día, una vez cada dos días y una vez cada tres días). Las ta-sas de supervivencia se encontraron entre 56,7% (frecuencia de alimentación una vez cada tres días y suplemento de nauplios) y 81,7% (frecuencia de alimentación una vez

al día y suplemento de quistes), incremen-tándose significativamente con el aumento de la frecuencia de alimentación. Conside-rando sólo el suplemento, los juveniles ali-mentados con quistes crecieron significati-vamente más rápido que los que recibieron nauplios (media: 460,65 mg frente a 320 mg). En cuanto a la frecuencia de alimen-tación, el crecimiento fue significativamente más alto cuando el aporte de alimento se realizó una vez al día. Sin embargo, la su-plementación con quistes una vez cada tres días permitió un crecimiento similar al obte-nido con el suplemento de nauplios una vez al día, lo que puede confirmar la mayor ca-pacidad de los quistes para conservar su in-tegridad nutritiva en el agua. De este modo, se puede deducir que la suplementación con quistes decapsulados ofrece ventajas sobre la de nauplios vivos. En cultivo de crustá-ceos, esta es la primera vez que los quistes decapsulados de Artemia son utilizados des-de el inicio de la alimentación externa alcan-zando buenos resultados.

Estudio IV (Publicación IV: Aquacul-ture Research, en revisión, 2010).– Uno de los principales problemas que afectan a las posibilidades de intensificación del cultivo de astácidos está relacionado con las pérdidas debidas al comportamiento agresivo y al cani-balismo, cuyos efectos perjudiciales podrían reducirse con las condiciones adecuadas de refugios y de iluminación. Así, se dedicó una prueba de 80 días (experimento IV.1) a evaluar efectos de diversas condiciones de disponibilidad de refugios (4, 2 y 1 refugio por animal) sobre la supervivencia y el cre-cimiento de los juveniles. No se encontraron diferencias entre los diferentes tratamientos (media: 86,67% de supervivencia, 11,41 mm de longitud de cefalotórax y 355,45 mg de peso tras 80 días). En el experimento IV.2, se estudiaron los efectos de tres condiciones de iluminación (iluminación continua de 925 lux, oscuridad permanente y fotoperíodo natural) durante 120 días. Los cangrejos sometidos a oscuridad continua crecieron significativa-mente más rápido que los criados bajo las otras dos condiciones de iluminación (media:

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543,08 mg frente a 445,44 mg). Este estudio muestra que se puede reducir el número de refugios al mínimo posible (1 por cangrejo), lo que facilita las prácticas higiénicas y el manejo de animales, así como conseguir un mayor crecimiento bajo condiciones de oscu-ridad permanente.

Estudio V (Publicación V: Aquacultu-re, en revisión, 2010).– La clasificación es una práctica especialmente recomendada en especies agresivas, con fuerte tendencia al canibalismo y a competir por el alimento, debido a sus efectos beneficiosos sobre la supervivencia, el crecimiento y la eficiencia de utilización del alimento. Sin embargo, sus posibilidades en el cultivo de crustáceos no han sido suficientemente estudiadas. En las investigaciones con astácidos, los recientes avances en alimentación nos han permitido evaluar los efectos de la clasificación por peso a diversos períodos en una prueba de seis meses desde el inicio de la alimen-tación externa (experimento V.1). Según el momento de la clasificación, los tratamientos fueron cinco: sin clasificación, clasificación a60días(grandes>405mgypequeños<405 mg) y clasificación a 100 días (grandes >581mgypequeños<581mg).Lastasasde supervivencia a 180 días de cría se en-contraron entre 71,67% y 74,83% sin dife-rencias significativas entre grupos. Los valo-res finales medios más altos (17,39 mm de longitud de cefalotórax y 1,43 g de peso) co-rrespondieron a los cangrejos clasificados a 60 días, mostrando diferencias significativas con los no clasificados (16,78 mm y 1,30 g). Los cangrejos clasificados como pequeños a los 60 días crecieron significativamente más rápido que los pequeños clasificados a 100 días. El índice de conversión del alimento fue más bajo en los animales clasificados (me-dia: 2,64), mostrando diferencias significati-vas con los no clasificados (3,23). A medida que los animales avanzaron en su desarro-llo, la tasa de crecimiento específico fue dis-minuyendo desde una media de 4,37% día-1

durante los primeros 60 días hasta una me-dia de 0,81% día-1 durante el último período (100-180 días). Por el contrario, el índice de

conversión del alimento fue aumentando des-de una media de 0,92 durante los primeros 60 días hasta una media de 3,19 durante el último período (100-180 días). Así, este estu-dio aporta información sobre la respuesta de los juveniles durante los seis primeros meses de cría intensiva desde el inicio de la alimen-tación externa y muestra que la clasificación por peso permite mejorar el crecimiento y la eficiencia de utilización del alimento.

Considerando en conjunto los porcen-tajes de supervivencia en nuestros experi-mentos, los valores fueron altos en las con-diciones básicas de los diferentes estudios (aporte de alimento una vez al día con una densidad inicial de 100 cangrejos m-2), en-contrándose en torno al 80% a los 100 días y al 73% a los 180 días. Sin embargo, la mor-talidad aumentó significativamente cuando se redujo la frecuencia de alimentación a una vez cada dos o cada tres días o cuando los juveniles se alojaron a densidades iniciales de 300 m-2 o superiores.

Respecto al crecimiento, fue afectado por los diferentes factores estudiados con excepción de la disponibilidad de refugios. En primer lugar, los juveniles procedentes de incubación artificial alcanzaron en 80 días un peso 49% superior al de los procedentes de incubación maternal. Los juveniles a la den-sidad inicial de 100 m-2 llegaron a pesar des-pués de 100 días un 50% más que los aloja-dos a densidades más altas. El suplemento de quistes decapsulados de Artemia permitió aumentar un 44% el peso de los cangrejos frente al suplemento de nauplios. Con una frecuencia de alimentación de una vez al día durante 100 días, los juveniles alcanzaron un 40% más de peso que con las mismas can-tidades de alimento aportadas una vez cada tres días. La oscuridad permanente duran-te 120 días permitió incrementar el peso un 22% respecto a condiciones de fotoperíodo natural o de iluminación continua. Después de los seis primeros meses de cría, el peso medio de los animales clasificados a 60 días fue un 10% más alto que el de los no clasifi-cados.

Resumen

85

Por otra parte, los porcentajes de ani-males con una sola pinza o sin pinzas no fueron afectados por los diferentes factores estudiados con excepción de la densidad. Con 100 m-2 se encontraron en torno al 5% a los 100 días y al 7% a los 180 días. Dichos porcentajes fueron más elevados cuanto ma-yor fue la densidad inicial.

Cara a las posibilidades de aplicación en los procesos productivos, nuestras inves-tigaciones aportan resultados de gran utili-dad para la mejora de las técnicas de cultivo. En principio, la introducción de la incubación artificial con tratamientos de formaldehído en las factorías de producción debería ser con-siderada, ya que se aprovecharían las venta-jas de esta técnica, que facilita la obtención de juveniles con un óptimo estado sanitario y, además, mejora el crecimiento posterior-mente. Referente a la densidad, los mejores resultados de supervivencia y crecimiento in-dividual se obtuvieron con 100 cangrejos m-2, pero la biomasa por unidad de superficie ha sido superior con densidades más altas. A nivel de cultivo, las decisiones habrán de to-marse en función de las circunstancias y de los objetivos productivos. El uso de quistes decapsulados de Artemia como suplemento de un pienso compuesto seco ofrece una in-teresante alternativa a los nauplios vivos, ya

que se alcanza un mayor crecimiento, ade-más de facilitar un ahorro de mano de obra y costes. En cuanto a la frecuencia, el aporte de alimento una vez al día ha mostrado ser adecuado para obtener altos valores de su-pervivencia y crecimiento. Bajo las mencio-nadas condiciones de alimentación, ha de procurarse que cada juvenil tenga posibilidad de encontrar al menos un refugio, que puede ser suficiente, lo que facilita la higiene y el manejo de animales. Además, el mayor cre-cimiento en condiciones de oscuridad per-manente abre la posibilidad de mantener a los juveniles en una relativa ausencia de luz. Finalmente, el proceso de cría durante 180 días aporta valiosa información sobre la res-puesta de los animales y muestra que la cla-sificación puede ser recomendable en cultivo una vez que aparecen marcadas diferencias de tamaño, ya que permite un incremento de los valores de crecimiento y una mejora de los índices de conversión del alimento.

Cabe concluir que los conocimientos adquiridos a lo largo del período experimen-tal contribuyen en gran medida a mejorar las técnicas de cultivo de juveniles de astácidos desde el inicio de la alimentación externa hasta los seis meses de edad, y constituyen una sólida base para el desarrollo de futuras líneas de investigación.

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Since the sixties, an increasing interest has been shown in astacid crayfish culture in Europe, due to its gastronomic quality as well as its high market price. Culture systems are generally extensive or semiextensive at best. In such circumstances, the different phases of the productive process are subject to un-controlled factors, resulting in a low and un-predictable yield. This has led to the develop-ment of research lines investigating means to intensify and improve the culture phases in several countries.

In previous research with P. lenius-culus and A. pallipes, this team developed techniques with a high application value in the reproductive phase, including gonadal development, maturation, mating, spawning, embriogenesis in maternal incubation, artifi-cial incubation systems, as well as egg trans-port and storage, aimed at improving each phase of the long process which ends with obtaining the stage 2 juvenile.

Having obtained acceptable efficiency in juvenile production, the next step was to increase animal survival and growth rates. It is known that the poor results obtained for 30 years were mainly due to nutritional deficien-cies, related to unknown essential elements that can be provided by live food; this knowl-edge constituted an advance in the research process and laid the foundations for an ad-equate feeding regime. Once the effects of the experimental treatments were no longer masked by deficient feeding, other important factors in juvenile rearing could be studied. Firstly, the development achieved in artifi-cial incubation, including the administration of antifungal treatments on high egg densi-ties, makes the study of viability of juveniles obtained advisable. In addition, recent ad-vances in feeding, which allow high survival and growth rates, also influence the inges-tive and agonistic behaviour of crayfish. This has a direct effect on those factors related to

aggressiveness and cannibalism, which are mainly density, feeding frequency and shape of food, shelter availability and lighting con-ditions, as well as introducing the possibility of reducing domination by the faster growing crayfish through size grading.

In this context, the aim of this the-sis was to improve astacid juvenile rearing techniques through the application of recent advances in feeding and to study aspects re-lated to management and environmental con-ditions, in addition to obtaining information about the response of juveniles to rearing periods from the onset of exogenous feeding which were longer than those tested so far. The specific objectives are as follows:

• Assessingpossibleinfluencesofjuve-nile origin: maternal incubation or arti-ficial incubation. Study I.

• Determiningadequatedensitiesforin-tensive rearing. Study II.

• Simplifyingthepracticeslinkedwithfeeding. Study III.

• Determiningadequateconditionsofshelter and lighting. Study IV.

• Intensive rearing for the f i rst s ixmonths, assessing effects of size grad-ing. Study V.

This research was carried out in the aquaculture laboratories of the Animal Pro-duction Department at the University of León, over three consecutive years, within the framework of Research Project AGL2005-01127 “Rearing techniques of astacid juvenile (Pacifastacus leniusculus Dana) under con-trolled conditions” funded through the Plan Nacional de I+D+i, and a grant from the Pro-grama Nacional de Formación de Profesora-do Universitario, reference AP2005-4860.

12. SUMMARY

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Seven experiments initiated with stage 2 juveniles Pacifastacus leniusculus (Dana, 1852) were conducted for 80-180 days. A to-tal of 8,760 juveniles were used. Every year, females with eggs were brought to our facili-ties from a farm, to control the reproduction process for several months until production of the stage 2 juvenile.

In all experiments, crayfish were fed a dry diet for salmonids supplemented with live freshlyhatched Artemia nauplii (studies I, II and III) or with decapsulated Artemia cysts (studies III, IV and V).

Study I (Publication I: Reviews in Fish Biology and Fisheries 19, 2009).– In artifi-cial incubation, it is advisable to use biocide treatments in order to avoid fungal prolifera-tion on dead eggs. Although eggs are not negatively affected by the antifungal treat-ment, the longterm effects of biocides with a strong antimicrobial effect, such as formal-dehyde, on juveniles are still unknown. To clarify this question, two experiments lasting 80 days were designed with the aim of com-paring survival and growth of juveniles from two sources: maternal incubation or artificial incubation with repeated treatments of for-maldehyde (3000 ppm 15 min every other day until eclosion).

In the experiment I.1, three conditions were analyzed: juveniles derived from artifi-cial incubation, juveniles derived from mater-nal incubation and mixed juveniles from the two different sources. Survival rates ranged from 87.78% and 93.33%, with no significant differences between treatments, whereas crayfish from artificial incubation grew signifi-cantly faster (11.47 mm carapace length and 373.80 mg weight) than crayfish from mater-nal incubation (9.88 mm and 236.62 mg).

Since juveniles produced through arti-ficial incubation grew faster in experiment I.1, it was hypothesized that the possible benefi-cial effect of this origin on growth could be enhanced by increasing feeding frequency. Thus, on the basis of the origin of offspring

and feeding frequency, a bifactorial trial (ex-periment I.2) was conducted which included four conditions: juveniles derived from artifi-cial or maternal incubation and fed once or twice a day. With no differences between ei-ther frequencies, the final percentages of sur-vival ranged from 68.89% and 77.78%, and crayfish from artificial incubation grew signifi-cantly faster (average: 14.27 mm carapace length and 750.02 mg weight) than crayfish from maternal incubation (average: 12.95 mm and 520.57 mg). Results showed that artificial incubation with formaldehyde treat-ments had no harmful effects and made it feasible to obtain a better performance from the juveniles thus produced.

Study II (Publication II: Aquaculture International 18, 2010).– The determination of adequate densities, as well as maximum acceptable densities, is essential for culture intensification. In a 100-day trial (experiment II.1), effects of four stage 2 juvenile stocking densities (100, 300, 600 and 1000 m-2) were tested. Mean survival rates were reduced significantly as stocking density increased, ranging from 86.33% at 100 m-2 to 39.13% at 1,000 m-2. The final proportion of animals with chelae autotomy rose significantly with increasing stocking density, ranging from 14.44% (100 m-2) to 41.45% (1,000 m-2). All checks showed that at the lowest initial den-sity (100 m-2) animals grew significantly fast-er than those kept at higher densities (15.28 mm and weight of 1.08 g), and there were no differences between 300, 600 and 1,000 m-2

(average: 13.94 mm and 0.72 g). This study shows that diet is a decisive factor for suc-cessfully stocking high densities under con-trolled conditions and provides useful infor-mation for establishing adequate densities in accordance with production objectives.

Study III (Publication III: Aquaculture 295, 2009).– The use of decapsulated Ar-temia cysts as direct food for juvenile crayfish could be an alternative to live nauplii, lead-ing to simplification of feeding practices and a reduction in the facilities and labor needed for the process of nauplii production. More-

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over, after the nondigestible shell has been chemically removed, decapsulated cysts can be handled as an inert diet, are sterile and do not leach nutrients. This stable condition could be considered to establish feeding fre-quency. Once it has been demonstrated than an increase in frequency from once to twice a day did not improve growth figures (experi-ment I.2), longer food supply intervals were tested.

To this end, a 100-day factorial trial (experiment III.1) was designed. It included six conditions, differing in the supplement provided and feeding frequency: the dry diet supplemented with Artemia nauplii or decap-sulated cysts was supplied once a day, once every two days and once every three days. Survival rates ranged from 56.7% (feeding frequency once every three days and nau-plii supplement) to 81.7% (feeding frequency once a day and cyst supplement), rising sig-nificantly as feeding frequency increased. As regards the supplement, the cysts supported significantly higher growth than the nauplii (average: 460.65 mg against 320 mg). Re-garding the feeding frequency, growth was higher when the food was supplied once a day, showing significant differences from the other two frequencies (once every two days and once every three days). However, the growth obtained from supplying the dry diet supplemented with cysts once every three days showed no significant differences from the growth obtained from supplying the dry diet supplemented with nauplii once a day, which confirms the higher capacity of cysts for manteining nutritional integrity in water. This study shows that decapsulated cysts constitute better dietary supplement than live nauplii. In crustacean culture, this is the first report of successful use of Artemia cysts from the onset of exogenous feeding.

Study IV (Publication IV: Aquaculture Research, under review, 2010).– One of the main problems affecting possibilities of in-tensifying astacid culture is related to losses due to agonistic behaviour and cannibalism, the harmful effects of which could be greatly

reduced by provision of adequate shelter and lighting conditions. Thus, an 80-day trial (ex-periment IV.1) was conducted to assess ef-fects of different shelter availability conditions (4, 2 and 1 shelters per animal) on survival and growth of juveniles. No significant differ-ences were found between groups (final av-erage: 86.67% survival, 11.41 mm carapace length and 355.45 mg weight). In experiment IV.2, three lighting conditions were tested for 120 days: continuous lighting of 925 lux, con-tinuous darkness and natural photoperiod. The crayfish kept under continuous darkness consistently grew faster than those reared under the other two lighting conditions (av-erage: 543.08 mg against 445.44 mg). This study shows that, under improved feeding conditions, a minimum number of shelters can be provided, making management and hygienic practices easier, and faster growth can be obtained in continuous darkness.

Study V (Publication V: Aquaculture, under review, 2010).– Size grading is a prac-tice which is especially recommended in ag-gressive species where competition for food and even cannibalism are common, due to the benefits for survival, growth and im-proved feeding efficiency. However, effects on crustacean culture are not wellknown. In the research on intensive juvenile astacid crayfish rearing, recent advances in feed-ing under controlled conditions enabled us to evaluate the effects of size grading at two different periods by means of a 6-month trial from the onset of exogenous feeding (ex-periment V.1). Five conditions were studied, related to the time of size grading: no grad-ing,sizegradingat60days(largesize>405 mg and small size < 405 mg) and size gradingat100days(largesize>581mgand small size < 581 mg). After six months, survival ranged from 71.67% to 74.83% with no significant differences between groups. The highest final growth (average of up-per and lower classes: 17.39 mm carapace length, 1.43 g weight) was attained by cray-fish sorted at 60 days, showing significant differences from the ungraded group (16.78 mm and 1.30 g). Smaller crayfish graded at

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60 days grew significantly faster than smaller crayfish graded at 100 days. The food con-version ratio was lower in the grading groups (mean 2.64), showing significant differences from the ungraded group (3.23). On the con-trary, food conversion ratio increased from a mean of 0.92 during the first 60 days to a mean of 3.19 during the final period (100-180 days). This study provides valuable informa-tion about the response of juvenile crayfish over six months of intensive rearing from the onset of exogenous feeding and shows that size grading allows better performance and improved feeding efficiency.

Considering all survival rates, high val-ues were recorded for the basic conditions of the different studies (feeding frequency of once a day at a stocking density of 100 cray-fish per m2), ranging around 80% at day 100 and 73% at day 180. However, mortality in-creased significantly when feeding frequency was reduced to once every two days or every three days and when juveniles were stocked at densities of 300 m-2 or higher.

With regard to growth, this was affect-ed by all the different factors studied except for shelter availability. Firstly, juveniles com-ing from artificial incubation weighed 49% more than those from maternal incubation after 80 days. Juveniles stocked at a densi-ty of 100 m-2 weighed 50% more than those stocked at higher densities after 100 days. The cyst supplement allowed a 44% increase in weight compared with the nauplii supple-ment. When food was supplied once a day for 100 days, the weight achieved by the ju-veniles was 40% higher than supplying the same amount of food once every three days. Continuous darkness for 120 days allowed a 22% increase in weight compared to natural photoperiod or continuous lighting conditions. After six months of rearing, mean weight of crayfish graded at 60 days was 10% higher than that of ungraded animals.

On the other hand, the percentages of animals lacking one or two chelae were not

affected by any of the different factors, ex-cept for density. At a density of 100 m-2, val-ues were around 5% at day 100 and around 7% at day 180. Such percentages rose sig-nificantly as stocking density increased.

With a view to application possibili-ties in productive processes, our research provides results which are highly pertinent to improving culture techniques. Firstly, the introduction of artificial incubation with for-maldehyde treatment in production factories makes improved growth rates feasible, since this technique provides health protection for the crayfish thus obtained. Regarding densi-ty, the highest survival and individual growth rates were obtained with 100 crayfish per m2, but biomass per unit of surface area rose sig-nificantly with increasing stocking densities. In culture, decisions would have to be taken according to circumstances and priority ob-jectives in each case. The use of decapsu-lated cysts as a supplement to a dry diet pro-vides an interesting alternative to live nauplii, as cysts improve crayfish performance and reduce labor and costs. As for frequency, food supply once a day proved to be effec-tive in obtaining high survival and growth values. Under the aforementioned feeding conditions, each juvenile should have the chance to find at least one shelter, which can be enough, since there were no differences between 1 and 4 shelters per crayfish. Fur-thermore, the higher growth obtained under continuous darkness offers the possibility of keeping juveniles in relative light absence. Finally, the rearing process for 180 days pro-vides valuable information on response of ju-veniles and shows that size grading may be advisable once differences in growth appear, as it allows better performance and improved feeding efficiency.

To conclude, the information acquired throughout the experimental period contrib-utes greatly to improving astacid juvenile cul-ture techniques from the onset of exogenous feeding to six months, and establishes solid grounds for developing future research lines.

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Agradecimientos

102

Después de todos estos años de arduo trabajo, de buenos y malos momentos y de experiencias inolvidables con personas que de otra manera no hubiese podido conocer, final-mente aquí está. Esta Tesis Doctoral tiene para mí un significado especial. Además de haber-me aportado conocimientos relacionados con el área de Producción Animal, me ha permitido crecer como persona y sentirme orgullosa de mi trabajo. Confío en la aplicación práctica de este estudio y en que haya gente que lo sepa valorar debidamente.

A continuación quiero hacer referencia a todas aquellas personas que, de manera di-recta o indirecta, han sido fundamentales en el desarrollo de esta Tesis y sin las cuales todo hubiese sido mucho más difícil.

Al Dr. Jesús Domingo Celada Valladares, director de esta Tesis Doctoral, por su es-fuerzo y dedicación a lo largo de estos cuatro años. Sus conocimientos y sus orientaciones han sido clave en mi formación pero, en particular, valoro su persistencia y rigor académico. Le agradezco sinceramente la confianza que ha depositado en mí al brindarme esta oportuni-dad, que tantas cosas positivas me ha aportado.

Al Dr. José Manuel Carral Llamazares, codirector de esta Tesis Doctoral, y a la Dra. María Sáez-Royuela Gonzalo, Profesora Titular del Departamento de Producción Animal, por sus consejos, ayuda y apoyo no sólo en el ámbito académico sino también en el personal, que para mí es igual o más importante. Les agradezco su actitud receptiva ante las opiniones, ideas o cambios planteados, pero lo que valoro especialmente es su cercanía que ha hecho de la palabra “jefe” algo agradable al oído.

Al Ministerio de Educación y Ciencia por el soporte económico prestado a lo largo de estos cuatro años a través del proyecto del Plan Nacional de I+D+i AGL2005-01127 “Técnicas de cría de juveniles de astácidos (Pacifastacus leniusculus Dana) en condiciones controladas” y de una beca del Programa Nacional de Formación de Profesorado Universitario, con refe-rencia AP2005-4860.

A la astacifactoría Quiñón S.A. (San Esteban de Gormaz, Soria) por su ayuda y cola-boración, especialmente en el abastecimiento de efectivos animales.

14. AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos

103

A la Lda. Jessica Martín Hernán por sus consejos, su apoyo y su buena acogida a mi llegada al departamento. Su ayuda en el desarrollo de parte de los procesos experimentales ha sido fundamental, pero lo que más aprecio y recuerdo de ese primer año es su compañe-rismo y el buen ambiente de trabajo creado.

Al Ldo. Álvaro González Martín por su directa colaboración en el desarrollo de los pro-cesos experimentales a lo largo de estos cuatro años.

A los técnicos de laboratorio Pedro De Vega Álvarez y Faustino García Olmos por su ayuda en las labores de mantenimiento de los juveniles.

Al Dr. Lennart Edsman, investigador principal en el Institute of Freshwater Research (Swedish Board of Fisheries) en Drottningholm (Suecia), al Dr. Ravi Fotedar, Profesor Aso-ciado en Curtin University of Technology, Perth (Australia) y a la Dra. Paula Henttonen, Pro-fesora Titular del Departament of Biosciences, University of Kuopio (Finlandia) por haberme permitido formar parte de sus equipos de investigación durante unos meses. Su hospitalidad, acogida a mi llegada, paciencia y constante preocupación por mi bienestar hicieron que me sintiese como en casa, por lo que les estoy muy agradecida. La posibilidad de intervenir en otros estudios y de intercambiar experiencias con gente tan diversa ha sido muy positivo, ya que no sólo ha contribuido a mi formación en el ámbito científico sino que me ha permiti-do también crecer como persona. Gracias a todos mis compañeros de trabajo: Anna, Jenny, Patrik, Roseana, Teresa, Julieta… que tantas cosas nuevas me han enseñado y con los que tanto me he reído.

A mis amigas Lucía Peteira Fernández, María Rey Insua y María Álvarez Sáez, por haberme soportado todos estos años. Su paciencia, sinceridad y transparencia son dignas de admiración. Han sido unas de las pocas personas a las que he recurrido en los momentos difíciles y las que siempre han estado cuando más lo he necesitado, por todo eso merecen mi más sincero agradecimiento. Por vuestro apoyo constante y, sobre todo, por haber confiado en mí, gracias.

A Laura Chova Martí, Rosa María Gregori Escrivá y Roberto Riaño Suárez por tan-tas cosas… Por encontrar siempre una sonrisa al final del día, por su apoyo y sus consejos, por su paciencia, por su tolerancia y, en general, por la convivencia. Gracias por haberme hecho la vida más fácil durante este último año y medio, por escucharme cuando lo necesité y por hacerme ver las cosas siempre desde el lado positivo. Laura, gracias por tus abrazos.

A Laura González Garrido, Eva Santolaya Meca, Alejandra Morán Ordóñez y Cyn-thia Cenzano por los buenos momentos. Su alegría y su forma particular de ver la vida me han permitido evadirme del trabajo y darme el empujón necesario para seguir adelante. Gra-cias a todas por vuestro apoyo y por haber estado ahí.

Agradecimientos

104

Debido a la importancia que han tenido en el día a día a lo largo de estos cuatro años, las tres personas que menciono a continuación merecen mi agradecimiento más especial.

A la Lda. y futura doctora Vanesa García Moreno, porque sin ella esta Tesis no habría generado tantos buenos recuerdos. Por las largas jornadas de trabajo, por los intensos días de muestreo a temperaturas bajo cero, por su manera de trabajar, por el buen ambiente de trabajo y, especialmente, por todo lo que he aprendido de ella. Su colaboración ha sido funda-mental en el desarrollo de todos y cada uno de los experimentos que componen este estudio, pero su apoyo y sus palabras de aliento en los momentos difíciles son los que merecen mi más profunda admiración y agradecimiento. Me considero una persona realmente afortunada por haberla tenido como compañera de trabajo y estoy muy orgullosa de poder contar con ella como amiga.

A mis padres Justo González Rego e Isabel López Ferro, a los que va dedicada esta Tesis por su amor incondicional, sus consejos y su espíritu de lucha que tan bien han sabi-do inculcarme. Por haberme soportado y escuchado cuando más lo he necesitado, por su bondad, humildad y sinceridad aunque duela son mi mejor ejemplo a seguir. Les agradezco de corazón su apoyo a lo largo de estos cuatro años y la confianza que siempre han tenido en mí. Isabel, gracias polas longas conversas que tan ben me fixeron sentir, pola túa forza a pesar de todo e porque ninguén me entende mellor ca ti. Sólo decir que espero os sintáis or-gullosos de mí y que tengo mucha suerte de teneros como padres.

Finalmente, a todos aquellos que me habéis dado ánimos para continuar, por los mo-mentos buenos y malos que he pasado con vosotros: Álvaro, Bautista, Bea, Carlos, Elkin, Eva, David, Heike, Herminia, Iker, Ito, Javi, Jorge, Katta, Lucía, Manolo, María, Maricar-men, Miriam, Paco, Roberto, Sabela, Teresa… También a los que no habéis podido llegar al final, pero que no por ello dejaréis de estar en mi recuerdo.

A todos,

Gracias.

105

ANEXO

Publicaciones

I. González R, Celada JD, García V, Carral JM, González A, Sáez-Royuela M (2009). The artificial incubation of crayfish eggs: review and report from an experimental study con-cerning the effects of offspring origin (maternal or artificial incubation) on the survival and growth of juvenile signal crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae). Reviews in Fish Biology and Fisheries 19, 167-176.

II. González R, Celada JD, González A, García V, Carral JM, Sáez-Royuela M (2009). Stocking density for the intensive rearing of juvenile crayfish, Pacifastacus leniusculus (Astacidae), using Artemia nauplii to supplement a dry diet from the onset of exogenous feeding. Aquaculture International 18, 371-378.

III. González R, Celada JD, Carral JM, González A, Sáez-Royuela M, García V (2009). Decapsulated Artemia cysts as dietary supplement for juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) at different food supply frequencies from the onset of exogenous feeding under controlled conditions. Aquaculture 295, 200-204.

IV. González R, Celada JD, García V, González A, Carral JM, Sáez-Royuela M (2009). Shelter and lighting in the intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniuscu-lus, Astacidae), from the onset of exogenous feeding. Aquaculture Research. En revi-sión.

V. González R, Celada JD, Carral JM, García V, Sáez-Royuela M, González A. (2010). In-tensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) during the first six months: Effects of size grading. Aquaculture. En revision.

RESEARCH PAPER

The artificial incubation of crayfish eggs: review and reportfrom an experimental study concerning the effectsof offspring origin (maternal or artificial incubation)on the survival and growth of juvenile signal crayfish(Pacifastacus leniusculus, Astacidae)

Rocıo Gonzalez Æ Jesus D. Celada ÆVanesa Garcıa Æ Alvaro Gonzalez ÆJose M. Carral Æ Marıa Saez-Royuela

Received: 28 April 2008 / Accepted: 4 August 2008 / Published online: 7 September 2008

� Springer Science+Business Media B.V. 2008

Abstract The development of artificial incubation

techniques in astacid crayfish has attracted attention

from scientists in many countries ever since the

nineteenth century. It is only in the last few years that

these techniques, along with studies on egg storage

and transport, have provided reliable options for

improving the reproductive phase in farming. The

juveniles produced need to be reared until they reach a

sufficient size both for restocking and for growing

purposes. In view of the current level of knowledge of

rearing juvenile astacids, two 80-day experiments

were carried out under controlled conditions to

compare the survival and growth of Stage 2 juvenile

signal crayfish (Pacifastacus leniusculus) from two

origins: maternal or artificial incubation. In the first

experiment, three treatments were tested: juveniles

from artificially incubated eggs with formaldehyde

treatments, juveniles from maternal incubation and a

mixture from both origins (50% each). Survival rates

ranged from 87.8% to 93.3% with no significant

differences among treatments. Crayfish from artificial

incubation grew significantly faster (11.47 mm cara-

pace length (CL), 373.80 mg weight) than crayfish

from maternal incubation. In the second experiment, a

bifactorial design included four treatments: the cray-

fish was derived from artificial or from maternal

incubation and was fed once a day or twice a day.

Final survival rates ranged from 68.89% to 77.78%,

with no significant differences among treatments.

Crayfish from artificial incubation grew significantly

faster than crayfish from maternal incubation. The

highest CL (14.54 mm) and weight (780.13 mg) were

reached by the juveniles from artificial incubation that

were fed once a day. No significant differences were

found between the two feeding frequencies. Results

showed that artificial incubation with formaldehyde

treatments had no harmful effects and made it feasible

to get a better performance from the juveniles

obtained.

Keywords Astacid crayfish �Pacifastacus leniusculus � Artificial incubation �Juvenile rearing � Offspring origin

Introduction

There There are more than 540 recognised species of

crayfish, which exhibit a circum-temperate distribu-

tion and are native to every continent except Africa

and Antarctica (Hobbs 1988). Currently crayfish fauna

comprise three families, Astacidae, Cambaridae and

Parastacidae, and 29 genera. The family Astacidae

occurs in Europe, western Asia (to the west of the Ural

R. Gonzalez (&) � J. D. Celada � V. Garcıa �A. Gonzalez � J. M. Carral � M. Saez-Royuela

Departamento de Produccion Animal, Universidad de

Leon, Campus de Vegazana s/n, 24071 Leon, Spain

e-mail: [email protected]

123

Rev Fish Biol Fisheries (2009) 19:167–176

DOI 10.1007/s11160-008-9095-9

Anexo I-1

Mountains) and in western North America (Taylor

2002). The family Cambaridae occurs in North

America (except for the Pacific slope of the western

United States and Canada), in the far East of Asia and

in Japan (Hobbs 1988). The family Parastacidae, also

known as Southern Hemisphere crayfish, occurs in

Australia, New Guinea, New Zealand, Madagascar

and in southern South America (Hobbs 1988).

The family Astacidae comprises three genera with

three species of Astacus and two species of Austro-

potamobius in Europe or western Asia (Gherardi and

Holdich 1999), whereas the other genus (Pacifasta-

cus), with four extant species, is endemic to western

North America. The signal crayfish, Pacifastacus

leniusculus, has been introduced into new habitats in

North America, Europe and Japan (Lewis 2002) for

both restocking and aquaculture purposes. The

reproductive activity of astacid crayfish is subject to

an annual cyclic chronology. The drop in water

temperature and photoperiod at the end of summer

determines the beginning of sexual activity in

September–October. In the wild, after mating and

spawning, eggs remain attached to the maternal

pleopods for 4–10 months (Reynolds 2002), depend-

ing on the mean water temperature and the species.

After hatching, the juvenile Stage 1 still remains

attached to the mother until its first moult, whereupon

juvenile Stage 2 appears and its independent life

begins. This is known as maternal incubation.

The development of artificial incubation tech-

niques in astacid crayfish has attracted attention

from scientists and aquaculturists in many countries

for a long time. The first attempts were carried out

with Astacus astacus in Germany (Reichenbach

1886). Subsequently, Paris (1911) in France used

trout incubators to incubate the eggs of Austropot-

amobius pallipes. Moreover, cyprinid incubation

systems, such as inverted bottles, have been tried for

eggs of P. leniusculus in the U.S.A. (Andrews 1904)

and A. astacus in Germany (Hofer 1912—cited by

Hofmann 1978; Strempel 1973), the Ukraine (Brod-

sky 1962, 1984) and Lithuania (Cukerzis 1964, 1984,

1988). The results reported only indicated survival

rates after hatching. From a practical point of view,

the total production of Stage-2 juveniles needs to be

known as it represents the final result of the

reproductive process. Data of this were provided by

Mason (1977) from Canada, Rhodes (1981) from

Great Britain and Koksal (1988) from Turkey, for

P. leniusculus, A. pallipes and Astacus leptodactylus,

respectively, a device for salmonid egg incubation

having been used. Other devices have been used for

astacid crayfish. In Finland, Jarvenpaa (1995) reported

a system of moving trays for the artificial incubation

of A. astacus eggs. In Ireland, Matthews and Rey-

nolds (1995) developed a re-circulating airlift

incubator for eggs of A. pallipes. In both cases,

efficiency data after the first moult were also reported.

It has been generally accepted that artificial

incubation of astacid crayfish eggs can be performed

successfully only by removing eggs at later stages of

embryonic development. That limitation on the use of

this technique led Carral et al. (1988, 1992) and

Perez et al. (1998a, 1998b, 1999) in Spain to seek

possible solutions that would allow egg artificial

incubation from earlier stages. Since an in-depth

knowledge of embryonic development would allow

the improvement of artificial incubation techniques

by providing adequate conditions for the different

phases, studies of Celada et al. (1985, 1987, 1991)

were undertaken. Firstly, Carral et al. (1988)

designed an incubator model for astacid eggs, which

proved to be appropriate for carrying out later trials.

In an attempt to shorten the period of maternal

incubation by removing the eggs of P. leniusculus at

earlier embryonic stages than those hitherto recom-

mended, Carral et al. (1992) successfully incubated

eggs from 18 days after spawning. These results

proved that the success of artificial incubation does

not depend solely on the stage reached in embryonic

development, but rather on this and other factors such

as the model of incubator used, incubation conditions

and water quality. Later, Perez et al. (1998a, 1998b,

1999) tested the same incubator with A. pallipes,

reporting on the effects of thermal regime and the

time at which eggs were stripped.

Apart from the Astacidae family, experiments in

artificial incubation have also been carried out with

species belonging to the other two families of fresh-

water crayfish: Parastacidae and Cambaridae. In

Australia, Evans et al. (1993) and Henryon and Purvis

(2000) incubated eggs of Cherax tenuimanus King

(1993); Edgerton and Owens (1997) worked with

Cherax quadricarinatus and Leonard et al. (2001)

with Cherax destructor. In Japan, Nakata et al. (2004)

carried out a study with Cambaroides japonicus.

Over the past few decades, artificial incubation

techniques have been developed to improve the

168 Rev Fish Biol Fisheries (2009) 19:167–176

123

Anexo I-2

reproductive phase in culture. Several authors refer to

the advantages of this practice. This makes consid-

erable savings of space, water and energy (Carral

et al. 1992; Celada et al. 1994; Evans et al. 1993;

Gonzalez et al. 1993; Jarvenpaa 1995) feasible and

may also avoid the loss of eggs due to their

detachment from the maternal pleopods or to the

mother’s death (Arrignon 1981; Carral et al. 2003;

Celada et al. 1994; Cukerzis 1969; Matthews and

Reynolds 1995; Nakata et al. 2004; Perez et al.

1998b, 1999; Rhodes 1981). This practice can also

control the length of embryogenesis by means of

appropriate temperature adjustments (Brodsky 1984;

Carral et al. 1988, 1992; Celada et al. 1994; Perez

et al. 1998a). Moreover, artificial incubation can

produce juveniles free of aphanomycosis from

infected (Nylund and Westman 1992), as well as

virus-free C. quadricarinatus (Edgerton and Owens

1997), while the use of biocide treatments may assist

in obtaining disease-free offspring (Carral et al.

2003). Finally, artificial incubation offers a possibil-

ity of identifying the origin of offspring more

accurately, which could be useful for genetic selec-

tion programmes (Carral et al. 2003).

Once efficient techniques for artificial incubation

had been developed, the next step for an intensifica-

tion of the reproductive processes was the study of

the potential for storing and transporting live embry-

onated eggs. Such practices would allow the

development of egg marketing, as well as staggered

production of juveniles at hatchery centres over long

periods of time. In this way, artificial incubation

facilities would be more efficiently used. Further-

more, embryonic development continues while eggs

are stored, without any expenditure of water or

labour. Over the last few years, studies into tech-

niques of egg storage and transport have been

conducted. Celada et al. (2000) achieved successful

storage for up to 28 days with eggs of P. leniusculus.

In later investigations, Celada et al. (2001) achieved

storage over a 42-day period with A. pallipes.

Finally, Perez et al. (2003) stated that the storage of

signal crayfish eggs for up to 126 days at a constant

refrigeration temperature is not detrimental to sur-

vival rates. In general, the combined use of artificial

incubation, storage and transport techniques have

important applications to the production of juvenile

crayfish for both restocking and growing purposes

(Carral et al. 2003).

During artificial incubation, dead eggs are usually

invaded by fungi with an ability to spread to the

surrounding healthy eggs. Although fungal prolifer-

ation can be controlled by means of the periodic

removal of non-viable eggs (Carral et al. 2004;

Policar et al. 2006), the administration of antifungal

treatments is advisable. Malachite green has been the

most effective fungicide used for many years in

aquaculture. However, in 1991 the use of this

chemical agent on food fishes and their eggs was

forbidden in the U.S.A. and in 1997 it was banned in

the European Union (Melendre et al. 2006). For this

reason, other chemicals have been tested, and form-

aldehyde has proved to be the most effective in

controlling fungal growth on crayfish eggs (Celada

et al. 2004; Melendre et al. 2006, 2007). At present,

this fungicide is approved for use in fish farming in

the U.S.A. and the E.U. Although eggs are not

negatively affected by the antifungal treatment, the

long-term effects of biocides with a strong antimi-

crobial effect, such as formaldehyde (McDonnell and

Russell 1999; McDonnell 2007; Stephensona et al.

2003), on juveniles are still unknown.

To date, the only comparison between juveniles

derived from maternal or artificial incubation (with-

out antifungal treatments) was performed by Saez-

Royuela et al. (1995) and no significant differences in

survival and growth were found. Since then, several

studies have been performed with astacid juveniles

produced by artificial incubation (Policar et al. 2006;

Saez-Royuela et al. 2007; Savolainen et al. 2003,

2004). Regardless of origin, survival and growth after

2–3 months of independent life under controlled

conditions showed great variability and, in general,

high mortality (Ackefors et al. 1989; Celada et al.

1989, 1993; D’Abramo et al. 1985; Gydemo and

Westin 1989; Nystrom 1994; Saez-Royuela et al.

1995, 1996, 2001; Savolainen et al. 2003). From

recent results (Saez-Royuela et al. 2007), it can be

deduced that live feed supplementation from the

onset of external feeding guarantees viability during

the first few months of life.

Usually, diets tested with astacid juveniles have

been supplied once a day or less frequently (Ackefors

et al. 1989, 1992; Blake et al. 1994; Celada et al.

1989, 1993; Mason 1979; Nystrom 1994; Saez-

Royuela et al. 1995, 1996; Savolainen et al. 2003,

2004; Taugbøl and Skurdal 1992). In a study carried

out on this topic, Saez-Royuela et al. (2001) reported

Rev Fish Biol Fisheries (2009) 19:167–176 169

123

Anexo I-3

that an increase in the frequency of supplying food

from once to twice a day allowed a slight improve-

ment in growth figures.

The main problem in rearing juvenile astacid

crayfish is the high mortality and slow growth during

the first few months of independent life. Nowadays,

research aims at getting past this phase while

obtaining good survival and growth rates, which

would allow the animals produced to be used for

growing purposes or the enhancement of wild stocks

with a greater likelihood of success. Furthermore, the

information obtained during these early months can

be applied to make feasible a grow-out phase under

intensive conditions. Currently, artificial incubation

techniques are able to produce Stage-2 juvenile

crayfish, but it would be interesting to know if these

animals perform like those derived from maternal

incubation. Hence, the aim of this present work was

to compare the survival and growth of juveniles from

two origins: eggs attached to the females throughout

the whole embryonic development (maternal incuba-

tion) or eggs stripped and artificially incubated under

repeated treatments of formaldehyde. In addition, the

frequency of food supply, either once or twice a day,

was tested for offspring of both origins.

Materials and methods

Two 80-day experiments were carried out in indoor

facilities with Stage-2 juveniles of P. leniusculus

(mean carapace length (CL) 5.58 ± 0.03 mm and

weight 30.4 ± 0.3 mg) hatched in the laboratory.

Juveniles were placed in fibreglass tanks providedwith

shelters (one group of four jointed sections of P.V.C.

pipe 4 cm long and 20 mm in diameter for every three

animals) at a density of 100 crayfish/m2. To avoid any

escape of live feed, each tankwas fittedwith a 250 lm-

mesh filter outlet. Aerated artesian well water was

supplied as an open system, and each tank had its own

water inlet and outlet. The quality parameters for the

incoming water were: pH 7.9, hardness 188f (calcium72 mg/l), total dissolved solids 207.6 mg/l and total

suspended solids 14.2 mg/l. Throughout the trial,

oxygen content was measured in the tanks by means

of a Sension6 dissolved Oxygen Meter produced by

the Hatch Company (values approximately 7 mg/l,

minimum 5.8 mg/l, maximum 7.7 mg/l). Ammonia

and nitrites were measured with a Pocket-Photometer

Lasa Aqua from water samples taken inside the tanks

(values were always \0.02 mg/l for ammonia and

\0.05 mg/l for nitrites). The photoperiod was set by

natural daylight (approximately 14 h light and 10 h

dark). Tanks were cleaned twice a week.

Crayfish were fed a dry diet for salmonids

(T-NUTRA-0, Skretting & Trouw Espana S.A.,

Cojobar, 09620, Burgos, Spain, with the composition

data provided by the manufacturer being: crude

protein 54%, crude fat 18%, crude cellulose 0.08%,

ash 12%, total phosphorus 1.8%, vitamin A 10,000

international units (IU) per kilogram, D3 1500 IU/kg,

vitamin E 150 mg/kg, pellet diameter 0.9–1.5 mm)

supplied by hand moderately in excess (around 4%

body weight) in such a manner that a small remainder

of uneaten food could be always seen in the bottom.

Live freshly-hatched Artemia nauplii (cysts of INVE

Aquaculture Nutrition, High HUFA 430 lm, Hoog-

veld 91, B-9200 Dendermonde, Belgium) were

obtained daily to supplement the dry diet, starting

at 500 nauplii per crayfish per day (later increased by

20% every 20 days). Cysts were decapsulated accord-

ing to the method described by Van Stappen (1996).

After verifying mean hatching rates, which coincided

with the data provided by the supplier (250,000 nau-

plii per gram of cysts), supplement assessment was

performed using known amounts of nauplii hatched

in determinate water volumes and distributing them

into the corresponding replicates.

Every 20 days, survivors were counted, excess

water was removed with tissue paper and juveniles

were weighed and measured individually. The ani-

mals were thereafter gently returned to their

respective tanks. CL was measured with a digimatic

calliper (to the nearest 0.01 mm) and individual wet

weight (BW) was determined by means of a precision

balance (to the nearest 0.1 mg). Specific growth rate

(SGR) and weight gain (WG) were expressed as (ln

Wt - ln Wi) 9 100/T and (Wt - Wi) 9 100/Wi,

respectively, where Wt is the mean final weight

(mg), Wi is the mean initial weight, and T is the

duration of the experiment (in days). At the end of the

experiments, survival percentages were calculated,

samples of surviving crayfish were weighed and

measured individually, total weight in each tank was

recorded and final biomass (milligram per square

decimetre) was calculated.

All experimental groups were in triplicate (three

tanks per treatment). Results were examined by


123

Anexo I-4

analysis of variance (ANOVA) using the computer

package SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, U.S.A).

A Duncan test was applied to compare means at

P\ 0.05 level of significance. Percentages were

arcsine-transformed prior to statistical analysis.

Experiment 1

About 270 Stage-2 juveniles were placed in nine

tanks (0.3 m2 bottom and 0.1 m water depth). The

flow rate was 0.5 l/min and feeding frequency was

once a day. Water temperature was 20 ± 1�C.In accordance with the different origins of off-

spring, three treatments were tested:

– Juveniles from eggs are artificially incubated for

70 days. In accordance with Melendre et al.

(2006, 2007), formaldehyde was administered at

3,000 ppm for 15 min every other day up to the

beginning of hatching.

– Juveniles maternally incubated under labora-

tory conditions. Eggs remained attached to the

females throughout the whole period of embry-

onic development and no chemical treatment was

performed.

– Mixed juveniles of the two origins (50% artificial

incubation and 50% maternal incubation).

Every 20 days, 20 crayfish per replicate were

sampled in order to record CL and weight. At the end

of the experiment, all surviving crayfish were mea-

sured and weighed.

Experiment 2

About 180 Stage-2 juveniles were placed in twelve

tanks (0.15 m2 bottom and 0.1 m water depth). The

flow rate was 0.25 l/min. Water temperature was

22 ± 1�C.On the basis of the origin of offspring and feeding

frequency, a bifactorial design included four treat-

ments: juveniles derived from artificial or maternal

incubation and fed once or twice a day. Every

20 days, 10 animals per replicate were sampled to

record CL and weight. At the end of the experiment,

all surviving crayfish were measured and weighted.

Results

Experiment 1

Final survival and growth values are presented in

Table 1. Survival rates ranged from 87.8% to 93.3%,

with no significant differences among treatments. All

checks from day 20 up to the end of the trial (day 80)

showed no significant differences in the survival

rates.

Regarding growth, the highest final CL

(11.47 mm), weight (373.80 mg), SGR (3.05%),

WG (1129.61%) and biomass (332.27 mg/dm2) were

reached by the crayfish produced by artificial incu-

bation, with significant differences from the others.

Figures 1 and 2 show the evolution of CL and

weight over the 80 days of the experiment. All

checks showed that animals derived from artificial

incubation grew significantly faster than crayfish

from maternal incubation. When both origins were

mixed, growth figures were always higher than those

for animals originating from maternal incubation and

lower than those for animals derived from artificial

incubation, significant differences being visible from

day 60 onwards.

Table 1 Final survival and growth performance (80 days) of juvenile crayfish coming from different origins (experiment 1)

Origin Maternal incubation Mixing Artificial incubation

Survival (%) 93.3 ± 1.9a 87.8 ± 4.8a 88.9 ± 2.9a

CL (mm) 9.88 ± 0.13a 10.82 ± 0.13b 11.47 ± 0.16c

BW (mg) 236.62 ± 9.52a 295.54 ± 11.19b 373.80 ± 17.14c

SGR (%) 2.48 ± 0.05a 2.77 ± 0.05b 3.05 ± 0.05c

WG (%) 678.35 ± 31.30a 872.19 ± 36.82b 1129.61 ± 56.40c

Biomass (mg/dm2) 220.84 ± 13.97a 259.42 ± 6.99b 332.27 ± 9.25c

* Values are mean ± SEM

* Values followed by the same superscript are not significantly different (P\ 0.05) from other in the same line


123

Anexo I-5

Experiment 2

Final survival and growth values are presented in

Table 2. Survival rates ranged from 68.9% to 77.8%,

with no significant differences among treatments. All

checks from day 20 up to the end of the trial (day 80)

showed no significant differences in survival rates.

With respect to growth, crayfish derived from

artificial incubation and fed once a day reached the

highest final CL (14.54 mm), weight (780.13 mg),

SGR (3.94%), WG (2466.20%) and biomass (545.42

mg/dm2). There were no significant differences when

they were compared to juveniles of the same origin

fed twice a day.

If origin alone is taken into account, animals

derived from artificial incubation grew significantly

faster, with averages of 14.27 mm for CL and

750.02 mg for weight), than animals from maternal

incubation, whose averages were 12.95 mm for CL

and 520.57 mg for weight. Independent of origin of

offspring, no differences were found between the two

feeding frequencies (once or twice a day).

Figures 3 and 4 show the evolution of CL and

weight over the 80 days of the experiment. All checks

showed that crayfish artificially incubated grew sig-

nificantly faster than crayfish maternally incubated.

Discussion

In most tests carried out with astacid crayfish during

the first 2–3 months of independent life under

controlled conditions, high mortalities have been

recorded. Only three studies (Nystrom 1994; Saez-

Royuela et al. 2007; Savolainen et al. 2004) reported

high survival rates (around 80% after 100 days). The

survival percentages in the study being reported here

were in the same range, but in this case growth

improved. The weight reached by crayfish derived

from either maternal or artificial incubation

(535.70 mg and 780.13 mg after 80 days, respec-

tively) was higher than figures reported hitherto

(Ackefors et al. 1992, 1995; Celada et al. 1993;

D’Abramo et al. 1985; Gydemo and Westin 1989;

Henttonen et al. 1993; Mason 1979; Nystrom 1994;

Saez-Royuela et al. 1995, 2001, 2007; Savolainen

et al. 2003, 2004; Taugbøl and Skurdal 1992). This is

probably due to the improved feeding achieved by

adding a supplement of Artemia nauplii to the dry

diet used. According to Saez-Royuela et al. (2007),

live feed seems to be the source of some unknown

nutritional factors required by juvenile astacid cray-

fish from the onset of external feeding.

It is known that feeding frequency can be an

important factor, especially in younger animals.

Since juveniles produced through artificial incubation

grew faster in the first experiment, when the second

experiment was being designed it was hypothesized

806040200

Days

12

10

8

6

4

2

0

CL

(m

m)

Maternal incubationMixingArtificial incubation

Fig. 1 Mean carapace length of juvenile crayfish coming from

different origins at the 20 day checks from Experiment 1

806040200

Days

400

350

300

250

200

150

100

50

0

Wei

gh

t (m

g)

Maternal incubationMixingArtificial incubation

Fig. 2 Mean weight of juvenile crayfish coming from

different origins at the 20 day checks from Experiment 1


123

Anexo I-6

that the possible beneficial effect of this origin on

growth could be enhanced by increasing feeding

frequency. In previous work using A. pallipes juve-

niles maternally incubated (Saez-Royuela et al.

2001), a slight improvement in growth values was

seen when the food supply frequency was increased

from once a day to twice a day, although the

difference was not significant. This coincides with

the present results, in which no differences were

found between the two feeding frequencies. Hence,

splitting the ration into two meals during the day did

not improve growth. The feed consumption behav-

iour of juvenile crayfish may partially explain this

fact. Dry pellets are not consumed immediately, but

rather are collected by crayfish and carried to shelters

where final consumption may take a long time.

Furthermore, Artemia nauplii are able to survive and

swim for a prolonged period in artesian well water

(Celada et al. 2008), remaining available for crayfish.

Little information on comparisons between cray-

fish whose origin is maternal versus artificial

incubation is available. Saez-Royuela et al. (1995)

found similar survival and growth in signal crayfish

(P. leniusculus) artificially or maternally incubated,

but in this case artificially incubated eggs did not

receive any antifungal treatment. Using iodine deter-

gent, no negative effects of artificial incubation on the

growth and survival of juveniles were detected

Table 2 Final survival and growth performance (80 days) of juvenile crayfish coming from maternal or artificial incubation fed once

or twice a day (experiment 2)

Origin Maternal incubation Artificial incubation

Feeding frequency Once a day Twice a day Once a day Twice a day

Survival (%) 73.3 ± 0.0a 68.9 ± 2.2a 77.8 ± 2.2a 73.33 ± 3.8a

CL (mm) 12.89 ± 0.18a 13.01 ± 0.11a 14.54 ± 0.33b 13.99 ± 0.35b

BW (mg) 535.70 ± 41.70a 505.43 ± 18.49a 780.13 ± 53.11b 719.91 ± 45.77b

SGR (%) 3.48 ± 0.09a 3.49 ± 0.04a 3.94 ± 0.09b 3.85 ± 0.10b

WG (%) 1662.16 ± 137.18a 1562.59 ± 60.81a 2466.20 ± 174.69b 2268.13 ± 150.56b

Biomass (mg/dm2) 332.98 ± 32.52a 372.46 ± 43.41a,b 545.42 ± 40.41c 495.53 ± 49.14b,c

* Values are mean ± SEM

* Values followed by the same superscript are not significantly different (P\ 0.05) from other in the same line

806040200Days

16

14

12

10

8

6

4

2

0

CL

(m

m)

Artificial incubation (twice a day)Artificial incubation (once a day)Maternal incubation (twice a day)Maternal incubation (once a day)

Fig. 3 Mean carapace length of juvenile crayfish coming from

maternal or artificial incubation fed once or twice a day at the

20 day checks from Experiment 2

806040200Days

800

700

600

500

400

300

200

100

0

Wei

gh

t (m

g)

Artificial incubation (twice a day)Artificial incubation (once a day)Maternal incubation (twice a day)Maternal incubation (once a day)

Fig. 4 Mean weight of juvenile crayfish coming from

maternal or artificial incubation fed once or twice a day at

the 20 day checks from Experiment 2


123

Anexo I-7

(Policar et al. 2006). Similarly, this present study

showed that artificial incubation with formaldehyde

treatments has no harmful effects on the further

survival and growth of the juveniles obtained.

Moreover, the possibility that artificial incubation

techniques may improve the health of the hatched

crayfish has been considered by several authors

previously. Thus, Nylund and Westman (1992)

reported that artificial incubation can produce pest-

free juveniles and it may also be feasible to reduce

the spread of other crayfish diseases. Edgerton and

Owens (1997) noticed specific virus-free C. quadric-

arinatus can be produced by removing eggs from

females, disinfecting the surface of eggs with forma-

lin, and hatching the eggs in uncontaminated water.

This practice might improve the general state of

health of the hatched crayfish which, under aquacul-

ture conditions, might then perform better than those

obtained by maternal incubation (Edgerton and

Owens 1999). In the experiments reported here, the

crayfish derived from artificial incubation always

grew significantly faster than those maternally incu-

bated. These results support the views of the authors

mentioned, as it is possible that the use of formal-

dehyde throughout artificial incubation provides

health protection for the crayfish obtained, making

an improvement in their growth feasible.

To sum up, the current state of knowledge of

storage, transport and artificial incubation of crayfish

eggs provides reliable options for improving the

reproductive phase in aquaculture and would also

facilitate the development of an embryonated egg

market. Eggs can be detached early from the berried

females and artificially incubated or stored previous to

incubation for periods up to 4 months, with or without

transport. In artificial incubation, the use of formal-

dehyde greatly increases juvenile production. In

addition, crayfish derived from this origin grow faster

than those maternally incubated. Juvenile rearing can

be successfully performed under controlled conditions

by supplying dry diets supplemented with Artemia

nauplii once a day.

Acknowledgements Funding of this study was the Plan

Nacional de I ? D?i, Ministerio de Educacion y Ciencia,

Spain, Research Project AGL2005-01127. We thank the

financing of a grant for Programa Nacional de Formacion de

Profesorado Universitario, Ministerio de Educacion y Ciencia,

Spain, reference AP2005-4860. We should also like to thank

the Quinon S.A. crayfish farm for their collaboration.

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123

Anexo I-10

II

Stocking density for the intensive rearing of juvenilecrayfish, Pacifastacus leniusculus (Astacidae),using Artemia nauplii to supplement a dry dietfrom the onset of exogenous feeding

R. Gonzalez Æ J. D. Celada Æ A. Gonzalez Æ V. Garcıa Æ J. M. Carral ÆM. Saez-Royuela

Received: 1 August 2008 /Accepted: 16 February 2009 / Published online: 28 February 2009� Springer Science+Business Media B.V. 2009

Abstract Recent advances in intensive rearing of astacid juvenile crayfish have greatly

improved the results. This challenges the current application possibilities of the studies

performed previously, and new research on density is required. A 100-day experiment was

carried out under controlled conditions to evaluate density effects on survival and growth

rates of juvenile crayfish in optimal conditions of feeding. Juvenile stage 2 Pacifastacusleniusculus were stocked in fibreglass tanks (1 m2, 200 l water) at 20 ± 1�C and fed a dry

diet for salmonids supplemented with restricted amounts of Artemia nauplii. Stocking

densities were 100, 300, 600 and 1,000 crayfish m-2. Mean survival rate was reduced

significantly with increased stocking density, ranging from 86.33% (100 m-2) to 39.13%

(1,000 m-2). All checks showed that at the lowest initial density (100 m-2) animals grew

significantly faster those at higher densities, recording a final carapace length of 15.28 mm

and weight of 1.08 g. Among the treatments of 300, 600 and 1,000 m-2 no differences

were found either in carapace length or in weight throughout the experimental period, with

a final mean growth of 14 mm carapace length and 0.72 g weight. The final proportion of

animals with chelae autotomy rose significantly with increasing stocking density, ranging

from 14.44% (100 m-2) to 41.45% (1,000 m-2). This study shows that diet is a decisive

factor for stocking successfully high densities under controlled conditions and provides

useful information to set adequate densities in accordance with the production objectives.

Keywords Artemia nauplii � Astacid crayfish � Density � Intensive breeding �Pacifastacus leniusculus

Introduction

Up to now, intensification of astacid culture had posed serious problems as low survival

and growth rates during the first months of independent life. In studies carried out under

controlled conditions, a wide variety of foods have been tested in juveniles from the onset

R. Gonzalez (&) � J. D. Celada � A. Gonzalez � V. Garcıa � J. M. Carral � M. Saez-RoyuelaDpto. Produccion Animal, Universidad de Leon, Campus de Vegazana s/n, 24071 Leon, Spaine-mail: [email protected]

123

Aquacult Int (2010) 18:371–378DOI 10.1007/s10499-009-9250-x

Anexo II-1

of exogenous feeding. Fresh Daphnia, earthworms, chironomid larvae, Chlorella, freshfish, vegetables and experimental dry pellets for crayfish and for fish species have been

tried by Mason (1979), D’Abramo et al. (1985), Celada et al. (1989, 1993), Blake et al.

(1994), Saez-Royuela et al. (1995, 1996) and Savolainen et al. (2003, 2004) with

Pacifastacus leniusculus. Gydemo and Westin (1989), Ackefors et al. (1989, 1992, 1995),

Taugbøl and Skurdal (1992) and Henttonen et al. (1993) used different combinations of

frozen fish and vegetables, oat flakes, Chara, frozen insect larvae and Neomysis, freshMysis and formulated feedstuffs for other crustaceans with Astacus astacus, whereas

Saez-Royuela et al. (2001) tested fresh Daphnia and a feed formulated for rainbow trout

with Austropotamobius pallipes. In all of these cases, after exceeding the critical period of

the first 2–3 months and leaving aside the high mortalities sometimes recorded, survival

rates were about 50% with growth values of 8–12 mm carapace length and 90–200 mg in a

temperature range of 18–22�C. Currently, we know that these poor results were mainly due

to a nutritional deficiency, which was also able to mask the effects of the experimental

treatments. According to Saez-Royuela et al. (2007) and Gonzalez et al. (2008), this

deficiency is related to unknown essential factors that can be provided by zooplanktonic

live feed. Thus, exceptional and high survival (around 80% after 100 days) has been

reported (Nystrom 1994; Saez-Royuela et al. 2007; Gonzalez et al. 2008) with

P. leniusculus under conditions of live feed availability (Artemia or Daphnia). In addition,

the growth reported by Gonzalez et al. (2008) is much higher than that achieved so far.

These improvements give rise to new considerations on intensive rearing of juveniles

during the first months of life. The most important factor involved is the density, as the

optimum stocking density is closely dependent on further survival and growth rates. In

consequence, the aim of this study was to evaluate density effects in improved condi-

tions of feeding, according to the advances reported by Gonzalez et al. (2008), and to

obtain information about suitable densities with a view to intensification of this culture

phase.

Materials and methods

Crayfish, facilities and experimental procedure

A 100-day experiment was carried out in indoor facilities with 6,000 stage 2 P. leniusculus(Dana, 1852) (mean carapace length 5.58 ± 0.03 mm and weight 30.4 ± 0.3 mg) hatched

in the laboratory by means of the experimental artificial incubation devices described by

Carral et al. (1992). During the incubation, formaldehyde at 3,000 ppm was administered

every other day by peristaltic pump until the beginning of hatchings, discharging anti-

fungical solution for 15 min to the incoming water flow, according to Melendre et al.

(2006). Juveniles were placed in 12 fiberglass tanks (1 m2 bottom area, 200 l water)

provided with a 250 lm mesh filter outlet to avoid escape of live feed. Stocking densities

were 100, 300, 600 and 1,000 crayfish m-2. Corrugated fibre-cement sheets

(54 9 20.5 cm) were provided as shelter according to density (4 pieces for 100 ani-

mals m-2, 6 for 300 m-2, 8 for 600 m-2 and 12 for 1,000 m-2). Aerated artesian well

water was supplied in an open system, and each tank had its own water inlet (flow rate

1.5 l min-1) and outlet. Quality parameters of the incoming water were pH 7.9, hardness

10�dH (calcium 72 mg l-1), total dissolved solids 207.6 mg l-1 and total suspended solids

14.2 mg l-1. Throughout the trial, oxygen content was measured in the tanks with a

Sension6 dissolved Oxygen Meter (Hach Company, Loveland, CO, USA) with values

372 Aquacult Int (2010) 18:371–378

123

Anexo II-2

around 7 mg l-1 (minimum 5.8 mg l-1, maximum 7.7 mg l-1). Ammonia and nitrites

were measured with a Pocket-Photometer Lasa Aqua from water samples taken inside the

tanks (values were always ammonia \0.02 mg l-1 and nitrites \0.05 mg l-1). Water

temperature was maintained at 20 ± 1�C, and the photoperiod was natural (ca. 14 h light

and 10 h dark). Tanks were cleaned every other day.

Diet and feeding

Crayfish were fed a dry diet for salmonids (T-NUTRA-0, Skretting, Trouw Espana SA;

Cojobar, Burgos, Spain) with composition data provided by the manufacturer of crude

protein 54%, crude lipid 18%, crude cellulose 0.08%, crude ashes 12%, total phos-

phorus 1.8%, Vitamin A 10,000 UI kg-1, D3 1,500 UI kg-1, E 150 mg kg-1 and a

pellet diameter 0.9–1.5 mm. This feed was supplied by hand moderately in excess

(around 4% body weight) in such a manner that a small remainder of uneaten food

could always be seen at the bottom. Live freshly-hatched Artemia nauplii (cysts of

High HUFA 430 lm; INVE Aquaculture Nutrition, Dendermonde, Belgium) were

obtained daily to supplement the dry diet, starting on 500 nauplii per crayfish and day

(later increasing by 20% every 20 days). Cysts were decapsulated according to the

method described by Van Stappen (1996). After verifying mean hatching rates, which

coincided with data provided by the supplier (250,000 nauplii g-1 cysts), supplement

assessment was performed using known amounts of nauplii hatched in determinate

water volumes, and distributing them into the corresponding replicates. Food was

supplied once a day at around 8 PM.

Data collection and analysis

Every 20 days survival percentages were calculated. A sample of juveniles from each

replicate was collected for recording carapace length (CL) and wet body weight (BW)

individually. The sample size varied according to density, i.e. 10, 15, 20 and 30

juveniles in the treatments of 100, 300, 600 and 1,000 m-2, respectively. Subsequently,

animals were gently returned to their respective tanks. At the end of the experiment,

survivors were counted and total crayfish biomass (g m-2) in each tank (replicate) was

recorded. Carapace length and individual weight of a sample, which varied according to

density (20, 30, 40 and 60 juveniles in the treatments of 100, 300, 600 and 1,000 m-2,

respectively), were recorded. Carapace length was measured with digimatic calliper (to

the nearest 0.01 mm). To obtain individual weight, excess water was removed with

tissue paper and a precision balance (to the nearest 0.001 g) was used. Specific growth

rate (SGR) and weight gain (WG) were determined with (ln Wt - ln Wi) 9 100/T and

(Wt - Wi)100/Wi, respectively, where Wt is the mean final weight (g), Wi is the mean

initial weight, and T is the duration of the experiment (days).

In all checks and at the end of the experiment, percentages of crayfish lacking one or

two chelae were determined.

All experimental groups were in triplicate (three tanks per treatment). Growth data were

derived from pooled samples of three replicates, and all results were examined by analysis

of variance (ANOVA) using the computer programme SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, III.,

USA). The Duncan test was applied to compare means at P\ 0.05 level of significance.

Percentages were arcsine-transformed prior to statistical analysis.

Aquacult Int (2010) 18:371–378 373

123

Anexo II-3

Results

Final survival and growth values (100 days) are presented in Table 1. Mean survival rate

was reduced significantly the higher the stocking density, ranging from 86.33% (100 m-2)

to 39.13% (1,000 m-2).

Regarding growth, the highest final carapace length (15.28 mm), weight (1.08 g),

specific growth rate (3.56%) and weight gain (3,449.01%) were reached by the juveniles

stocked at the density of 100 m-2, showing significant differences from the others. No

differences were found among 300, 600 and 1,000 m-2, with a final mean growth of

14 mm carapace length and 0.72 g weight. Biomass increased significantly with increasing

stocking density, ranging from 90.67 g m-2 (100 m-2) to 271.03 g m-2 (1,000 m-2).

Table 1 Final survival and growth values of juvenile signal crayfish reared at different densities over100 days

Survival and growthvalues

Density (crayfish m-2)

100 300 600 1,000

Survival (%) 86.33 ± 3.38 64.89 ± 1.98 50.50 ± 2.34 39.13 ± 0.98

CL (mm) 15.28 ± 0.71 14.10 ± 0.14* 13.79 ± 0.04* 13.92 ± 0.31*

BW (g) 1.08 ± 0.12 0.73 ± 0.01* 0.70 ± 0.02* 0.73 ± 0.04*

SGR (%) 3.56 ± 0.12 3.18 ± 0.02* 3.13 ± 0.03* 3.17 ± 0.06*

WG (%) 3,449.01 ± 414.60 2,296.14 ± 42.37* 2,196.02 ± 59.59* 2,288.79 ± 147.72*

Biomass (g m-2) 90.67 ± 7.04 133.47 ± 4.26 194.25 ± 17.45 271.03 ± 9.59

CL carapace length, BW body weight, SGR specific growth rate, WG weight gain

Values are given as mean ± standard error

* Values within each row marked with an asterisk are not significantly different (P\ 0.05)

100806040200

Days

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Su

rviv

al (

%)

1000 m ¯²

600 m¯²

300 m¯²

100 m¯²

Fig. 1 Survival rates of juvenilesignal crayfish reared at differentdensities over 100 days

374 Aquacult Int (2010) 18:371–378

123

Anexo II-4

Figure 1 shows the survival rates in the checks throughout the experimental period. In

each check from day 20 up to the end of the trial (day 100), percentage of survivors was

significantly higher at the lowest initial density (100 m-2) and thus significantly lower at

the highest initial density (1,000 m-2). In intermediate treatments (300 and 600 m-2),

similar significant differences were detected from day 60.

100806040200

Days

16

14

12

10

8

6

4

CL

(m

m)

1000 m¯²

600 m¯²

300 m¯²

100 m¯²

Fig. 2 Mean carapace length ofjuvenile signal crayfish in thechecks throughout theexperimental period

100806040200

Days

1,20

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

Wei

gh

t (g

)

1000 m¯²

600 m¯²

300 m¯²

100 m¯²

Fig. 3 Mean weight of juvenilesignal crayfish in the checksthroughout the experimentalperiod

Aquacult Int (2010) 18:371–378 375

123

Anexo II-5

Figures 2 and 3 show mean carapace length and weight, respectively, throughout the

100 days. All checks showed that at the lowest initial density (100 m-2) crayfish grew

significantly faster than crayfish at higher densities. Among the treatments of 300, 600 and

1,000 m-2 no differences were found either in carapace length or in weight throughout the

experimental period.

Table 2 summarizes the percentages of juveniles lacking one or two chelae in each

check. The proportion of animals with chelae autotomy in the treatment of 100 m-2 was

always significantly lower than that of higher densities. No significant differences were

found among 300, 600 and 1,000 m-2 over 80 days. At the end of the experiment, this

percentage rose with increasing stocking density, ranging from 14.44% (100 m-2) to

41.45% (1,000 m-2).

Discussion

In crayfish, it is known that effects of aggressiveness and cannibalism rise with increasing

stocking density, resulting in reductions in survival and growth rates, as well as lack of

chelae. Several authors have carried out experiments with astacid crayfish at initial con-

centrations between 50 and 200 stage 2 juveniles per m2 under controlled conditions but

focussed on productive factors other than density (Mason 1979; D’Abramo et al. 1985;

Ackefors et al. 1989; Gydemo and Westin 1989; Celada et al. 1989, 1993; Taugbøl and

Skurdal 1992; Ackefors et al. 1992, 1995; Henttonen et al. 1993; Blake et al. 1994; Saez-

Royuela et al. 1995, 1996, 2001; Savolainen et al. 2003). The studies of Ackefors et al.

(1989), Nystrom (1994) and Savolainen et al. (2004) have focussed on density effects. In A.astacus, Ackefors et al. (1989) tested densities up to 1,000 per m2, with low survival rates.

In P. leniusculus, Nystrom (1994) and Savolainen et al. (2004) obtained 75% and 86%

survival, respectively, after 3 months at a density of 100 m-2. In our study with the same

species, that density allowed 86.33% survival after 100 days. Regarding growth, Savo-

lainen et al. (2004) recorded average values of 13.80 mm carapace length and 0.580 g

weight (maximum of 14.62 mm and 0.690 g in one replicate) which are higher than those

obtained previously by other authors. This can be due to the possible presence of natural

food in the incoming lake water used which, as the authors pointed out, was not quantified.

However, these results are lower than those obtained in our experiment (15.28 mm and

1.08 g) after 100 days at the same density (100 m-2) and even lower than those of the

treatment of 1,000 m-2. The higher live feed availability in these studies is the cause of

Table 2 Percentages of juvenile signal crayfish lacking chelae in the checks throughout the experiment

Days Density (crayfish m-2)

100 300 600 1,000

20 19.75 ± 3.68 40.73 ± 6.40* 42.20 ± 1.67* 53.36 ± 4.24*

40 21.95 ± 2.70 42.22 ± 6.71* 42.56 ± 2.35* 50.88 ± 6.88*

60 16.50 ± 3.08 33.92 ± 4.53* 37.05 ± 1.21* 40.10 ± 2.89*

80 17.49 ± 4.36 31.57 ± 4.73* 36.67 ± 1.64* 41.73 ± 6.73*

100 14.44 ± 2.18 27.31 ± 4.56 37.68 ± 0.61* 41.45 ± 5.10*

Values are mean ± standard error

* Values within each row marked with an asterisk are not significantly different (P\ 0.05)

376 Aquacult Int (2010) 18:371–378

123

Anexo II-6

this improvement in growth rate, which is supported by Saez-Royuela et al. (2007) and

Gonzalez et al. (2008).

As a general rule in aquaculture, growth rate is reduced with higher stocking density

(Morrissy 1992; Savolainen et al. 2004), but this did not happen in this trial. At the density

of 100 m-2 growth values were significantly higher than those obtained at the other

densities, but among these (300, 600 and 1,000 m-2), no differences were found and

growth rate was scarcely affected by density. The negative effect on growth caused by

magnification of agonistic behaviour and stress at high densities could have been com-

pensated by two positive effects: good quality of the diet and food supplementation due to

cannibalism, which increased with increasing stocking density, as the number of animals

which disappeared became evident.

With a view to a possible intensification of astacid juvenile rearing, some authors have

advised densities for keeping juveniles from stage 2 under controlled conditions. Ackefors

et al. (1989) recommended 50 m-2, whereas Gydemo and Westin (1989) suggested that

100 m-2 may be an adequate stocking density with enough shelters. The appropriate

density for D’Abramo et al. (1985) would be higher (150 m-2), but only for the first

30 days. If juveniles are kept in groups for a period of 3 or 4 months, Nystrom (1994)

assessed the initial concentration has to be\100 m-2. From the economic point of view in

culture conditions, Savolainen et al. (2004) advise an initial density of 400 m-2 which

resulted in 260 individuals m-2 with 0.43 g. In our study, higher growth values were

obtained even at the density of 1,000 m-2 (0.80 g), although the final number of animals

was slightly lower (194 crayfish m-2). Regarding the final biomass, in our study the values

obtained by stocking 300 crayfish m-2 (133 g m-2) were similar to those achieved by

Savolainen et al. (2004) at the density of 800 crayfish m-2 (146 g m-2). Considering these

results as a whole, recommendations about the appropriate stocking density could not have

general application and decisions would have to be taken according to circumstances and

priority objectives in each case. The low fecundity of astacid crayfish should be taken into

account, which does not allow excessive mortality for the first months of life. Infrastructure

and labour for animal maintenance also are a strong limiting factor. Thus, the information

provided by this study is useful to set appropriate densities in accordance with the pro-

duction objectives, showing that the diet seems to be a decisive factor for stocking high

densities successfully under controlled conditions.

Acknowledgments Funding for this study was provided by the Plan Nacional de I?D?i, Ministerio deEducacion y Ciencia, Spain, Research Project AGL2005-01127. We thank the financing of a grant for thePrograma Nacional de Formacion de Profesorado Universitario, Ministerio de Educacion y Ciencia, Spain,reference AP2005-4860.

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123

Anexo II-8

III

Decapsulated Artemia cysts as dietary supplement for juvenile crayfish (Pacifastacusleniusculus, Astacidae) at different food supply frequencies from the onset ofexogenous feeding under controlled conditions

R. González ⁎, J.D. Celada, J.M. Carral, Á. González, M. Sáez-Royuela, V. GarcíaDpto. Producción Animal, Universidad de León, Campus de Vegazana s/n, 24071 León, Spain

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:Received 11 February 2009Received revised form 8 July 2009Accepted 9 July 2009

Keywords:Astacid crayfishPacifastacus leniusculusJuvenile rearingArtemia cystsFeeding frequency

Considering that the use of decapsulated Artemia cysts as direct food for juvenile crayfish could be analternative to live nauplii, a 100-day experiment was carried out under controlled conditions to evaluate theeffects of cysts, comparing with nauplii, as supplement to a dry diet for salmonids on the survival and growthof juvenile signal crayfish (Pacifastacus leniusculus) from the onset of exogenous feeding (stage 2). Thereduction of feeding frequency was also tested. According to a bifactorial design, six treatments, differing inthe supplement and feeding frequency, were tested: the dry diet supplemented with Artemia nauplii ordecapsulated cysts was supplied once a day, once every two days and once every three days. Survival ratesranged from 56.7% to 81.7%, rising significantly with increasing the feeding frequency. The highest growth(12.94 mm carapace length and 593.08 mg weight) was reached by the crayfish that received the dry dietsupplemented with cysts once a day, with significant differences from the rest of the treatments. Consideringthe supplement, the cysts supported significantly higher growth than the nauplii. Regarding the feedingfrequency, growth was higher when the food was supplied once a day, showing significant differences fromthe other two frequencies (once every two days and once every three days). This study shows thatdecapsulated cysts are better dietary supplement than live nauplii. In crustacean culture, this is the firstreport of successful use of Artemia cysts from the onset of exogenous feeding.

© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction

The process for the intensification of astacid crayfish culture hadposed serious problems as low survival and growth during the firstmonths of independent life. As feeding is a key factor for successfuljuvenile farming, during three decades awide varietyof foods have beentested (see review by González et al., 2008) but results were usuallyunsatisfactory. Recently, Sáez-Royuela et al. (2007) reported that whenjuveniles were fed with a dry diet for salmonids, the supplementationwith live feed (Artemia nauplii or Daphnia) improved the survival andgrowth rates. Later, González et al. (2008) determined the optimumquantities of supplementationwithArtemianauplii, allowing to enhancethe growth rates obtained so far.

The daily production of nauplii is laborious, expensive and itrequires additional facilities. For these reasons, the use of Artemiacysts may offer an interesting alternative to live nauplii. After thenondigestible shell has been chemically removed, decapsulated cystscan be handled as an inert diet, they are disinfected and do not leachnutrients (Vanhaecke et al., 1990). Decapsulated cysts have been

tried instead of live nauplii as starter food for several freshwater fishspecies (Bardócz et al., 1999; Celada et al., 2008a; Hung et al., 2002;Kaiser et al., 2003; Lim et al., 2002; Shiri Harzevili et al., 2003;Vanhaecke et al., 1990). In crustaceans, Sorgeloos et al. (1998) statedthat the rapid settling of the decapsulated cysts in water can makethem unavailable for planktonic larvae. In later stages (post-larvae),decapsulated Artemia cysts have been used for feeding Penaeusmonodon (Stael et al., 1995) and Penaeus indicus (Ribeiro and Jones,1998) as complete replacement of live nauplii.

It is known that feeding frequency can be an important factor,especially in young animals. Astacid crayfish maintained undercontrolled conditions from the onset of external feeding have beenfed from twice a day to three times a week (Blake et al., 1994; Celadaet al., 1989, 1993; González et al., 2008; Henttonen et al., 1993; Mason,1979; Nyström, 1994; Sáez-Royuela et al., 1995, 1996, 2007; Savolai-nen et al., 2003, 2004; Taugbøl and Skurdal, 1992). Specific studies onthis topic (González et al., 2009; Sáez-Royuela et al., 2001) haveshown that an increase in food supply frequency from once to twice aday do not improve growth figures.

At present, live Artemia nauplii are an appropriate supplementwhen dry diets, originally formulated for other species, are used forfeeding juvenile crayfish under intensive conditions (González et al.,2008; González et al., 2009). Taking in mind that decapsulated

Aquaculture 295 (2009) 200–204

⁎ Corresponding author. Fax: +34 987 291187.E-mail address: [email protected] (R. González).

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Anexo III-1

Artemia cysts could be an advantageous alternative to live nauplii,since their use could save labour and costs, the present research aimsto establish basic feeding conditions for crayfish rearing from theonset of exogenous feeding, focusing on the use of Artemia cystscomparing with nauplii as supplement to a dry diet. In the same way,as food supply requires a lot of labour, the reduction of feedingfrequency was also tested.

2. Materials and methods

2.1. Crayfish, facilities and experimental procedure

A 100-day experiment was carried out in indoor facilities with 360stage 2 juvenile Pacifastacus leniusculus (5.58±0.03 mm carapacelength and 30.4±0.3 mg weight) hatched in the laboratory by meansof artificial incubation, controlling fungal growth with formaldehyde,according toMelendre et al. (2006). Crayfishwereplaced in 18fiberglasstanks (0.20 m2 bottom area, 25 l water) provided with shelters (onegroup of four jointed sections of PVC pipe 4 cm long × 20 mmdiameterper three animals) at a density of 100 crayfish m−2. Aerated artesianwell water was supplied in open system, and each tank had its ownwater inlet (flow rate 250 ml min−1) and outlet. To avoid the escape offeed, each tank was provided with a filter outlet (200 µm). Qualityparameters of the incoming water were pH 7.9, hardness 18 °dH(calcium 72 mg l−1), total dissolved solids 207.6 mg l−1 and totalsuspended solids 14.2 mg l−1. Throughout the trial, oxygen content wasmeasured in the tankswith a Sension6 dissolved OxygenMeter of Hatch

Company (values around 7mg l−1, minimum 5.8 mg l−1, maximum7.7mg l−1). Ammonia and nitrites were measured with a Pocket-Photometer Lasa Aqua from water samples taken inside the tanks(values were always ammonia b0.02mg l−1 and nitrites b0.05mg l−1).Water temperature was maintained at 21±1 °C and photoperiod wasnatural (ca. 14 h light:10 h dark). Tanks were cleaned every other day.Thewater quality parametersweremeasured once aweek, after thefirstcleaning.

2.2. Diets and feeding

Crayfish were manually fed to excess (approximately 4% bodyweight per day) a dry diet for salmonids (T-NUTRA-0, Skretting,Trouw España SA. Cojobar, E-09620, Burgos, Spain, composition dataprovided by the manufacturer: crude protein 54%, crude lipid 18%,crude cellulose 0.08%, crude ashes 12%, total phosphorus 1.8%, VitaminA 10,000 UI kg−1, D3 1500 UI kg−1, E 150 mg kg−1, pellet diameter0.9–1.5 mm) supplemented with live freshly hatched Artemia naupliior decapsulated Artemia cysts (cysts of INVE Aquaculture Nutrition,High HUFA 430 µm, Hoogveld 91, B-9200 Dendermonde, Belgium).The initial amount of Artemia supplement was 500 nauplii or cysts percrayfish and day, being each supply of 500, 1000 and 1500 for once aday, once every two days and once every three days, respectively.These amounts were later increased by 15% every 20 days. Cysts weredecapsulated according to the method described by Van Stappen(1996). After verifying mean hatching rates, which coincided with the

Table 1Final survival and growth performance (100 days) of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus) fed with a dry diet supplemented with Artemia cysts or nauplii at different feedingfrequencies.

Supplement Cysts Nauplii

Feeding frequency Once/day Once/2 days Once/3 days Once/day Once/2 days Once/3 days

Survival (%) 81.67±6.01a 75.00±5.00a,b,c 61.67±4.41c,d 80.00±2.89a,b 65.00±5.77b,c,d 56.67±3.33d

CL (mm) 12.94±0.28a 12.11±0.23b 12.02±0.24b 11.90±0.18b 11.37±0.21b 10.07±0.32c

BW (mg) 539.08±37.77ª 421.29±23.64b 404.65±23.65b,c 368.65±17.28b,c 334.51±19.69c 241.79±22.74d

SGR (%) 2.77±0.07a 2.56±0.06b 2.52±0.06b,c 2.45±0.05b,c 2.34±0.06c 1.92±0.10d

WG (%) 1673.29±124.24a 1285.82±77.78b 1231.08±77.79b,c 1112.67±56.83b,c 1000.37±64.79c 695.38±74.79d

Biomass (mg dm−2) 440.25±76.20a 315.97±32.67a,b 249.53±26.07b,c 293.47±28.04b 217.43±52.19b,c 137.02±9.90c

Values are mean ± standard error.Values followed by the same superscript are not significantly different (Pb0.05) from the others in the same line.

Fig. 1. Survival rates of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus) fed with a dry dietsupplemented with Artemia cysts or nauplii at different feeding frequencies during100 days.

Fig. 2.Mean carapace length of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus) fed with a drydiet supplemented with Artemia cysts or nauplii at different feeding frequencies during100 days.

201R. González et al. / Aquaculture 295 (2009) 200–204

Anexo III-2

data provided by the supplier (250,000 nauplii g−1 cysts), supple-ment assessment was performed from known amounts of naupliihatched in determinate water volumes and distributing them into thecorresponding replicates. When decapsulated cysts were directly usedas food, fresh stocks were prepared every three days and stored at4 °C. Supplement assessment was performed from the number ofcysts g−1 provided by the manufacturer.

According to a bifactorial design, six treatments, differing in thesupplement and feeding frequency, were tested: the dry diet sup-plemented with Artemia nauplii or decapsulated cysts was suppliedonce a day, once every two days and once every three days.

2.3. Data collection and analysis

Every twenty days, the percentage of survivors was calculated anda sample of 10 juveniles from each replicate (30 per treatment) wascollected to register carapace length (CL) and wet weight (BW)individually. Subsequently, animals were gently returned to theirrespective tanks. At the end of the experiment, surviving crayfishwerecounted, measured and individually weighted. Carapace length wasmeasured with digimatic calliper (to the nearest 0.01 mm). Excesswater was removed with tissue paper and crayfish were weighedusing a precision balance (to the nearest 0.001 g). Specific growth rate(SGR) and weight gain (WG) were expressed as (ln Wt− ln Wi)×100/T and (Wt−Wi)100/Wi, respectively, where Wt is the mean finalweight (mg),Wi is the mean initial weight, and T is the duration of theexperiment (days). Total weight in each tank (replicate) was recordedand final biomass (mg dm−2) was calculated.

In all checks and at the end of the experiment, percentages ofcrayfish lacking one or two chelaewere determined. In order to recordand remove dead animals, every tank was carefully inspected daily.

All experimental groups were in triplicate (three tanks per treat-ment). Results were examined by analysis of variance (ANOVA) usingthe computer programme SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, III., USA).Kolmogorov–Smirnov and Levene's tests were used to assess normal-ity and homogeneity of variances of data, respectively. Duncan testwas applied to compare differences between treatments. The sig-nificant level was Pb0.05. Percentages were arcsine-transformedprior to statistical analysis.

3. Results

Final survival and growth values are presented in Table 1. Survivalranged from 56.7% (feeding frequency once every three days andsupplement of nauplii) to 81.7% (feeding frequency once a day andsupplement of cysts), rising significantly with increasing the feedingfrequency. No significant differences in survival were detectedbetween both supplements (nauplii or cysts).

Fig. 1 shows the survival rates in the checks throughout the ex-perimental period. Up to day 40, the percentage of survivors wassignificantly higher when the dry diet was supplemented with naupliionce a day and significantly lower when cysts were supplied onceevery three days. From day 60 up to day 80 survival rates did not differsignificantly among groups.

Regarding growth, the highest final carapace length (12.94 mm),weight (539.08 mg), specific growth rate (2.77%), weight gain(1673.29%) and biomass (440.25 mg dm−2) were reached by thecrayfish that received the dry diet supplemented with cysts once aday, with significant differences from the rest of the treatment groups.

Considering only the supplement, Artemia cysts supported sig-nificantly faster growth (average: 12.40 mm carapace length and460.65 mg weight) than that achieved by co-feeding with Artemianauplii (average: 11.19 mm carapace length and 320.0 mg weight).

Regarding the feeding frequency, growth was higher when foodwas supplied once a day, showing significant differences from theother two frequencies (once every two days and once every threedays). There were no significant differences in growth between thefrequency of once every three days with cysts supplement and that ofonce a day with nauplii supplement.

Figs. 2 and 3 show the evolving of carapace length and weight,respectively, throughout the 100 days. Crayfish that received Artemiacysts always showed higher growth than those that received livenauplii, with significant differences from day 40. Regarding feedingfrequency, the highest growth was obtained by feeding once a day,showing always significant differences from the lowest frequency(once every three days).

Table 2 summarizes the percentages of crayfish lacking one or twochelae in each check throughout the 100 days of trial. No significantdifferences were found related to supplement or feeding frequencyamong groups along the experiment. At day 100, values were from1.67% to 8.33%, whereas in previous controls the range was between

Fig. 3. Mean weight of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus) fed with a dry dietsupplemented with Artemia cysts or nauplii at different feeding frequencies during100 days.

Table 2Percentages (%) of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus) lacking chelae in each treatment (the dry diet supplemented with Artemia cysts or nauplii at different feedingfrequencies) and in the checks throughout the experiment.

Days Cysts Nauplii

Once/day Once/2 days Once/3 days Once/day Once/2 days Once/3 days

20 3.33±1.67 8.33±6.01 6.67±4.41 1.67±1.67 3.33±1.67 3.33±1.6740 1.67±1.67 5.00±5.00 10.00±5.77 6.67±1.67 1.67±1.67 5.00±0.0060 1.67±1.67 5.00±2.89 5.00±2.89 5.00±2.89 1.67±1.67 5.00±2.8980 3.33±3.33 10.00±2.89 5.00±2.89 3.33±1.67 3.33±1.67 1.67±1.67100 5.00±5.00 6.67±1.67 5.00±2.89 3.33±1.67 1.67±1.67 8.33±3.33

Values are mean ± standard error.Means are not significantly different.

202 R. González et al. / Aquaculture 295 (2009) 200–204

Anexo III-3

1.67% and 10%. These percentages did not vary significantly withineach treatment among the different counts.

The highest percentage of dead animals (calculated from the initialnumber of crayfish) removed from the tanks was recorded in thegroups that received nauplii (11.67%), showing significant differencesfrom the groups that received cysts (3.33%). There were no significantdifferences among the three feeding frequencies.

4. Discussion

In marine crustacean culture, the use of decapsulated Artemia cystsfrom the onset of exogenous feeding has been unadvised because therapid settling of the cysts in seawater can make them unavailable forplanktonic larvae (Sorgeloos et al., 1998). In the post-larvae rearing,decapsulated Artemia cysts showed to be an adequate substitute for liveArtemia nauplii in P. monodon (Stael et al., 1995) and P. indicus (Ribeiroand Jones,1998). In our studywith juvenile crayfish (P. leniusculus), cystsor nauplii were tried as supplement to a dry diet from the onset ofexogenous feeding, and the results showed that live nauplii can besuccessfully substitutedbydecapsulated cysts in the sameamounts, sincehighergrowthwasachievedwhencrayfish received cysts. Probably, theseresults have been possible because astacid crayfish have no free-livinglarval stages. Thus, this is the first report of a crustacean species inwhichdecapsulated cysts can be used successfully from the onset of exogenousfeeding. Cysts have also showed to be avaluable alternative to live naupliifor the larval rearing of several freshwater fish species, and evendecapsulated cysts resulted in significantly higher growth than freshlyhatched nauplii in the guppy, Poecilia reticulata (Lim et al., 2002), thegoldfish, Carassius auratus (Kaiser et al., 2003) and the tench, Tinca tinca(Celada et al., 2008a). From the assertion that, on an individual basis,there is no significant difference in the proximate composition betweendecapsulated Artemia cysts and freshly hatched nauplii (García-Ortegaet al., 1998), this better performance can be related to the energy contentand dry weight of decapsulated cysts, which are 30–40% higher than forinstar 1 nauplii (Van Stappen, 1996).

It is known that high feeding frequencies involve big labour and,therefore, possibilities of their reduction should be studied. Asprevious studies on this topic in juvenile crayfish (González et al.,2009; Sáez-Royuela et al., 2001) showed no significant differencesbetween supplying food once or twice a day, in the present trial longerfood supply intervals were tested. Survival and growth rates werenegatively affected by the reduction of feeding frequency. This may bedue to the influence of both behavioural and nutritional factors. Onone hand, the search for new food would cause a higher motilitywhich would led to an increase of encounter probability and,therefore, of aggressive behaviour and stress. The proportion ofdisappeared animals (due to cannibalism) supports this hypothesis,since the highest percentages (average: 35.83% initial number ofstocked crayfish) were recorded in the longest interval of food supply(once every three days), decreasing with increasing feeding frequency(average: 11.67% when supplying once a day). On the other hand, theinsufficient water stability of the dry diet would lead to a nutrient loss(D'Abramo and Robinson, 1989). In addition, the food becomes lessattractive after remaining in water for some time (Burns and Avault,1991; Løkkeborg, 1990; Sáez-Royuela et al., 2001).

It is noticeable that the growth recorded by supplying the dry dietsupplemented with cysts once every three days showed no significantdifferences from the growth obtained by supplying the dry dietsupplemented with nauplii once a day. Thus, the supplementationwith cysts allowed reducing the feeding frequency from once a day toonce every three days without decreasing in growth. This fact could bepartly explained considering the different behaviour of nauplii andcysts in the water. Freshly hatched Artemia nauplii can remain livingand swimming for a short period (around 12 h) in artesian well water(Celada et al., 2008b) and later they die. Nauplii are progressivelylosing nutritional quality, both alive as well as after dying. On the

contrary, fresh decapsulated cysts quickly sink to the bottom, wherethey remain available for crayfish during long periods conserving theirnutritional quality, since cysts do not leach (Vanhaecke et al., 1990).

From the results of this study, it can be deduced that freshdecapsulated Artemia cysts are better supplement to a dry diet thanlive nauplii, since cysts can be handled as an inert diet, improve theperformance of crayfish and allow to reduce labour and costs.Although the highest growth during the first 100 days of juvenilerearing was obtained supplying both dry diet and cysts once a day, thedifferent options in culture must be evaluated in terms of labour, costand application possibilities. For this reason, it should be consideredthat the highest growth could not be the optimum, and this studyprovides different choices, which can be applied according to theproduction objectives.

Acknowledgements

Funding of this studywas provided by the Plan Nacional de I+D+i,Ministerio de Educación y Ciencia, Spain, Research Project AGL2005-01127. We thank the financing of a grant for Programa Nacional deFormación de Profesorado Universitario, Ministerio de Educación yCiencia, Spain, reference AP2005-4860. We should also like to thankthe Quiñón S.A. crayfish farm for their collaboration.

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Anexo III-5

1

Shelter and lighting in the intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) from the onset of exogenous feeding

R. González*, J. D. Celada, V. García, J. M. Carral, A. González, M. Sáez-Royuela

Dpto. Producción Animal, Universidad de León, Campus de Vegazana s/n, 24071 León, Spain.

*Corresponding author. Tel.: +34-987-291110 ext.: 5191; fax: +34-987-291187, e-mail address: [email protected]

Keywords: Astacid crayfish; feeding; intensive rearing; lighting; Pacifastacus leniusculus; shelter

1. Abstract Recent advances on feeding in intensive rearing of juvenile astacids enable research of other factors influencing growth and survival without the confounding effect of inadequate feeding. Two experiments were conducted to evaluate effects of the number of shelters per crayfish and to test different lighting conditions. Juvenile stage 2 Pacifastacus leniusculus were stocked in fibreglass tanks and fed a dry diet for salmonids combined with restricted amounts of decapsulated Artemia cysts. In the experiment 1, four, two or one shelters per crayfish were tested for 80 days. No signifi-cant differences were found among groups either in survival (final mean: 86.67%) or in growth (final mean: 11.41 mm mean carapace length, 355.45 mg mean weight). In the experiment 2, three lighting conditions were tested for 120 days: continuous lighting of 925 lux, continuous darkness, and natural photoperiod. Survival rates ranged from 76.7% to 88.3% with no significant differences among groups. The crayfish kept under continuous darkness grew faster (final mean: 12.70 mm carapace length, 543.08 mg weight) than those reared under the other two light conditions. This study shows that, under improved feeding conditions, one shelter per crayfish can be enough and faster growth can be obtained in continuous darkness.

2. Introduction

During three decades, the research for the intensification of astacid culture had posed serious problems with low survival and growth rates during the first months of independent life (see review by González R., Celada, González A., García, Carral and Sáez-Royuela 2010). This situation was overcome when Sáez-Royuela, Carral, Celada, Pérez and González A. (2007) reported that live feed (Artemia nauplii or Daphnia) from the onset of exogen-ous feeding can be the source of unknown nutritional factors needed by astacid juveniles. Later, González A., Celada, González R.,

García, Carral and Sáez-Royuela (2008) deter-mined the optimum quantities of Artemia nauplii supplementation to a dry diet for salmonids, al-lowing to enhance the growth rates obtained so far. Recently, González R., Celada, Carral, González A. and Sáez-Royuela (2009) proved that decapsulated Artemia cysts can be better supplement than live nauplii, since cysts im-proved the performance of crayfish, allowing to reduce labour and costs. These studies laid the foundations for an adequate feeding, providing an advance in the investigation processes, which have been at a standstill possibly because the effects of the experimental treatments could have been masked by a deficient feeding.

Anexo IV-1

2

Once these drawbacks can be over-come, a major problem is related to the losses due to agonistic behavior and cannibalism (Nyström 1994; Savolainen, Ruohonen and Railo 2004; González R. et al. 2010). In this sense, density, shelter availability and lighting conditions are the most important factors in-volved. Regarding density, the studies carried out by Savolainen et al. (2004) and González R. et al. (2010) have improved the previous results and provide valuable information on the effects of this factor. On the contrary, the avail-able information on shelter and lighting is con-fused, and provides scarce knowledge on ade-quate conditions for intensive rearing.

It is known that intraspecific competi-tion and cannibalism may be reduced by in-creasing the availability of effective shelter in communal systems (Mason 1979; Celada, Car-ral, Gaudioso, González and López-Baissón 1993; Sáez-Royuela, Carral, Celada and Pérez 2001; Streissl and Hödl 2002; Savolainen, Ru-ohonen and Tulonen 2003). Pebbles (gravel) or plants have been used as shelter (Mason 1979; Blake, Nyström and Hart 1994; Savolainen et al. 2003), although Sáez-Royuela, Carral, Ce-lada and Muñoz (1995) and Sáez-Royuela et al. (2001) recommended the use of other mate-rials, such as fiber-cement sheets or PVC pipes, which facilitate cleaning, hygienic condi-tions and handling of crayfish. On the other hand, changes in lighting conditions have been tried in order to decrease crayfish activity and, therefore, aggressive behavior. Taugbøl and Skurdal (1992) and Nyström (1994) obtained better results with continuous or extended light-ing, whereas no significant differences in sur-vival or growth rate were found by Sáez-Royuela, Carral, Celada, Muñoz and Pérez (1996) with increased lighting. Considering these studies as a whole, results show wide variability and no conclusions can be drawn from their comparison. In addition, it should be taken into account that although low amount of food is an essential factor favouring cannibal-ism in freshwater crayfish, food quality is not less important. Deficiency of necessary nutri-ents in diet causes an increase in aggressive

interactions (Ackefors and Lindqvist 1994) and agonistic behaviour can be kept to a minimum by improving the food quality (Nyström 2002). Thus, the recent advances on feeding give rise to new considerations on the effects of shelter and light-ing during the first months. This study was aimed to evaluate effects of the number of shelters per crayfish as well as to test different lighting re-gimes under conditions of improved feeding.

3. Material and Methods

Two experiments were carried out in in-door facilities with stage 2 juvenile Pacifastacus leniusculus (Dana) (mean carapace length 5.58 ± 0.03 mm and weight 30.4 ± 0.3 mg) hatched in the laboratory by means of artificial incubation, controlling fungal growth with formaldehyde (Me-lendre, Celada, Carral, Sáez-Royuela and Aguile-ra 2006). Crayfish were placed in opaque fibre-glass tanks at a density of 100 m-2. To avoid the escape of feed, each tank was provided with a 200 µm mesh filter outlet. Aerated artesian well water was supplied in open system, and each tank had its own water inlet and outlet. Quality parameters of the incoming water were pH 7.9, hardness 18 ºf (French grades, calcium 72 mg l-1), total dissolved solids 207.6 mg l-1 and total sus-pended solids 14.2 mg l-1. Throughout the trial, oxygen content was measured in the tanks, rang-ing from 5.8 mg l-1 to 7.7 mg l-1 (average values around 7 mg l-1). Ammonia and nitrites were measured once a week from water samples taken inside the tanks (values were always ammonia < 0.02 mg l-1 and nitrites < 0.05 mg l-1). Water tem-perature was maintained at 22 ± 1 ºC. Tanks were cleaned twice a week.

Crayfish were manually fed to excess (ca. 3% body weight per day) a dry diet for salmonids (T-NUTRA-0, Skretting, Trouw España SA. Cojo-bar, E-09620, Burgos, Spain, composition data provided by the manufacturer: crude protein 54%, crude lipid 18%, crude cellulose 0.08%, ashes 12%, total phosphorus 1.8%, Vitamin A 10000 UI kg-1, D3 1500 UI kg-1, E 150 mg kg-1, pellet diame-ter 0.9-1.5 mm) combined with decapsulated Ar-temia cysts (cysts of INVE Aquaculture Nutrition, High HUFA 430 µm, Hoogveld 91, B-9200

Anexo IV-2

3

Dendermonde, Belgium). The initial amount was 500 cysts per crayfish per day (later in-creasing by 15% every 20 days), according to González et al. (2009). Cysts were decapsu-lated according to the method described by Van Stappen (1996) and fresh stocks were prepared every three days and stored at 4 ºC. Artemia cysts assessment was performed from the number of cysts g-1 provided by the manu-facturer. Feeding frequency was once a day.

Every twenty days, survivors were counted and crayfish lacking one or two chelae recorded. After removing excess water with tissue paper, a sample of juveniles were weighed and measured individually. Subse-quently, animals were gently returned to their respective tanks. Carapace length (CL) was measured with a digimatic calliper (to the near-est 0.01 mm) and wet individual weight (BW) was determined by means of a precision bal-ance (to the nearest 0.1 mg). Specific Growth Rate (SGR) and Weight Gain (WG) were ex-pressed as (ln Wt-ln Wi) x 100/T and (Wt- Wi)100/Wi, respectively, where Wt is the mean final weight (mg), Wi is the mean initial weight, and T is the period (days). At the end of the experiments, survival percentages were calcu-lated and all surviving crayfish were weighed and measured individually. Total weight in each tank was recorded and final biomass (mg m-2) was calculated.

All experimental groups were in tripli-cate (three tanks per treatment). Data were examined by analysis of variance (ANOVA) using the computer programme SPSS 16 (SPSS Inc. Chicago, Ill., USA) and Duncan test was applied to compare differences among treatments. Percentages were arcsine-transformed prior to statistical analysis. Moreo-ver, the Kaplan-Meier method and Log Rank test were used to compare survival curves. In all cases, the significant level was P < 0.05.

3.1. Experiment 1

A total of 270 stage 2 juveniles were placed in nine tanks of 0.3 m2 bottom and 0.1 m

water depth (30 crayfish per tank). The flow rate was 0.5 l min-1. The experiment was conducted for 80 days.

Taking into account the convenience of the use of hygienic material inside the tanks, PVC pipes (4 cm long x 20 mm diameter) were used as shelter (one pipe=one shelter). Moreover, consid-ering that shelters hinder both cleaning and han-dling of animals, this experiment was aimed to decrease their number to a minimum. However, it is reasonable to assume that at least one shelter per crayfish is essential; especially in P. leniuscu-lus since this species shows clear shelter-related territoriality (Edsman and Jonsson 1996; Peeke, Sippel and Figler 1995) and tend not to share the same shelter (Ranta and Lindström 1992). Thus, three treatments were tested: four, two or one pipes (shelters) per crayfish.

Every 20 days, 20 crayfish per replicate (66.7% of the initial number) were sampled for recording carapace length and weight individually.

3.2. Experiment 2

A total of 180 stage 2 juveniles were placed in nine tanks of 0.20 m2 bottom and 0.1 m water depth (20 crayfish per tank). Considering the results obtained in experiment 1, only one PVC pipe (4 cm long x 20 mm diameter) per ani-mal was provided as shelter. The flow rate was 0.25 l min-1. The experiment was conduced for 120 days.

Three lighting conditions were tested:

- Continuous lighting of 925 lux. Tanks were iso-lated from the other treatments and from room lights, being the only light source a fluorescent providing 925 lux for 24 hours a day.

- Continuous darkness. Each tank was covered with matt-surface, opaque black plastic, so that it was isolated from the other treatments and from room lights.

- Natural photoperiod (ca. 14 h light:10 h dark).

Anexo IV-3

4

Every 20 days, 10 crayfish per replicate (50% of the initial number) were sampled for recording carapace length and weight individu-ally.

4. Results

4.1. Experiment 1

Final survival and growth values (80 days) are presented in Table 1. Survival rates ranged from 81.1% to 91.1% with no significant differences among groups. Figure 1 shows the survival rates at various periods throughout the experiment. Up to day 20, the percentage of survivors was significantly lower with 1 shelter per crayfish. From day 40 up to the end of the trial, survival rates did not differ significantly among groups (4, 2 or 1 shelters per crayfish).

Regarding growth, the highest final ca-rapace length (11.69 mm), weight (384.81 mg), specific growth rate (3.07% day-1), weight gain (1165.82%) and biomass (31212.22 mg m-2) were obtained in the tanks provided with 1 shel-ter per crayfish, with no significant differences from the other groups.

Figures 2 and 3 show the changes in carapace length and weight, respectively, throughout the 80 days. No significant differ-ences were found among groups during the experiment.

Table 2 summarizes the percentages of crayfish lacking one or two chelae at various periods throughout the 80 days of trial. The range was between 2.22% and 10%. No sig-nificant differences were found among groups for the experimental period.

4.2. Experiment 2

Final survival and growth values (120 days) are presented in Table 3. Survival rates ranged from 76.7% to 88.3% with no significant differences among groups. Figure 4 shows the survival rates at various periods during the experiment. At day 80, the range was between

83.3% and 91.7% (similar to the one obtained in the experiment 1). In all checks from day 20 up to the end of the trial (day 120), no significant differ-ences were detected.

Regarding growth, the highest final cara-pace length (12.70 mm), weight (543.08 mg), specific growth rate (2.32% day-1), weight gain (1686.44%) and biomass (46161.67 mg m-2) were achieved by the crayfish reared under continuous darkness, showing significant differences from the others in body weight, specific growth rate and weight gain.

Figures 5 and 6 show the changes in ca-rapace length and weight, respectively, through-out the 120 days. The crayfish kept under conti-nuous darkness grew always faster than those reared under the other two light conditions, show-ing significant differences in weight from day 80.

Table 4 summarizes the percentages of crayfish lacking one or two chelae at various peri-ods during the 120 days of trial. The range was between 1.67% and 13.33%. No significant differ-ences were found among groups throughout the experimental period.

5. Discussion

It is generally accepted that providing shelters is necessary in the intensive rearing of juvenile crayfish. Studies carried out with stocking densities between 50 and 200 juveniles m-2 have showed that aggressiveness and cannibalism can be greatly reduced with increasing in availability of shelters, allowing an increase in survival and growth rates (Nyström 1994; Sáez-Royuela et al. 1995, 2001; Streissle and Hödl 2002; Savolainen et al. 2003). It should be taken into account that refuges not only have to provide defence against aggressive behavior, but also should be hygienic, allowing easy access for cleaning and manage-ment without damaging water quality. Thus, al-though gravel bottom (Mason 1979; Savolainen et al. 2003) or the weed Elodea sp. (Blake et al. 1994) have been tested as shelter, these mate-rials would not be appropriate for intensive sys-tems. On the other hand, fibre-cement sheets are

Anexo IV-4

5

commonly used in crayfish farms and provide a wide area for groups to hide and avoid attack, whereas PVC pipes offer a more individualized refuge. Sáez-Royuela et al. (1995, 2001) ob-tained a better growth using PVC pipes at a density of 50 juvenile crayfish m-2 and pointed out that additional gravel availability had no effect either on survival or on growth. In the present study PVC pipes were used at a stock-ing density of 100 m-2, suitable for intensive rearing according to Savolainen et al. (2004) and González et al. (2010). Considering that P. leniusculus shows clear shelter-related territori-ality (Edsman and Jonsson 1996; Peeke, Sip-pel and Figler 1995) and tend not to share the same shelter (Ranta and Lindström 1992), each juvenile should have the possibility to find at least one shelter, which may be enough as there were no significant differences between one and four shelters per crayfish.

Regarding lighting conditions, it has been reported that continuous or extended lighting had a positive effect on crayfish juvenile survival and decreased chelae lacking (Mason 1979; Taugbøl and Skurdal 1992; Nyström 1994; Sáez-Royuela et al. 1996). However, our present results are in disagreement with those reports. While no significant differences were found in survival or lack of chelae among the lighting conditions tested, the crayfish reared under continuous darkness grew significantly faster than those reared under continuous light-ing. This could be because crayfish are noctur-nal animals and the duration of their activity is related to the length of the dark period (Gher-ardi 2002), in such a way that food finding takes place mainly during the night. Thus, con-tinuous darkness can have made animals keep eating for longer a better-quality diet than those used in the mentioned studies.

From the present results, it can be con-cluded that under the improved feeding condi-tions of this study, a minimum number of shel-ters can be provided (one per crayfish), making management and hygienic practices easier, and faster growth can be obtained in continu-ous darkness.

6. Acknowledgements

Funding of this study was the Plan Na-cional de I+D+i, Ministerio de Educación y Cien-cia, Spain, Research Project AGL2005-01127. We thank the financing of a grant for Programa Nacional de Formación de Profesorado Universi-tario, Ministerio de Educación y Ciencia, Spain, reference AP2005-4860. We should also like to thank the Quiñón S.A. crayfish farm for their col-laboration.

Anexo IV-5

6

7. References

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Anexo IV-6

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Anexo IV-7

8

Table 1 Final survival and growth values of juvenile crayfish reared under different shelter availability during 80 days (experiment 1)

4 shelters/crayfish 2 shelters/crayfish 1 shelter/crayfish

Survival (%) 91.1 ± 4.0 87.8 ± 2.5 81.1 ± 2.5

CL1 (mm) 11.28 ± 0.15 11.26 ± 0.15 11.69 ± 0.18

BW2 (mg) 341.60 ± 15.81 339.95 ± 13.94 384.81 ± 19.69

SGR3 (% day-1) 2.94 ± 0.05 2.92 ± 0.05 3.07 ± 0.06

WG4 (%) 1023.68 ± 52.00 1018.25 ± 45.87 1165.82 ± 64.78

Biomass (mg m-2) 31123.3 ± 2798.3 29265.6 ± 1660.9 31212.2 ± 2485.6

Values are mean ± standard error Means are not significantly different (P < 0.05) 1 Carapace length 2 Wet individual weight 3 Specific growth rate 4 Weight gain Table 2 Crayfish (%) lacking chelae at various periods under different shelter availability during 80 days

Days Shelters

4/crayfish 2/crayfish 1/crayfish

20 10.0 ± 5.1 5.6 ± 2.9 10.0 ± 3.3

40 2.2 ± 1.1 5.6 ± 1.1 4.5 ± 2.2

60 3.3 ± 1.9 5.6 ± 1.1 4.4 ± 1.1

80 4.4 ± 2.9 5.6 ± 2.2 4.5 ± 2.2

Values are mean ± standard error Means are not significantly different (P < 0.05)

Anexo IV-8

9

Table 3 Final survival and growth values of juvenile crayfish reared under three lighting conditions during 120 days (experiment 2)

Continuous lighting Continuous darkness Natural photoperiod

Survival (%) 88.3 ± 4.4a 85.0 ± 5.0a 76.7 ± 8.3a

CL1 (mm) 12.09 ± 0.20a 12.70 ± 0.25a 12.50 ± 0.23a

BW2 (mg) 442.21 ± 22.96ª 543.08 ± 39.50b 448.66 ± 25.23ª

SGR3 (% day-1) 2.17 ± 0.04a 2.32 ± 0.05b 2.19 ± 0.05a

WG4 (%) 1354.63 ± 75.52a 1686.44 ± 129.95b 1375.85 ± 83.00a

Biomass (mg m-2) 39061.7 ± 3595.1a 46161.7 ± 8628.2a 34261.7 ± 2344.8a

Values are mean ± standard error Values in the same row having the same superscript are not significantly different (P < 0.05)

1 Carapace length 2 Wet individual weight 3 Specific growth rate 4 Weight gain Table 4 Crayfish (%) lacking chelae at various periods under three lighting conditions during 120 days

Days Lighting conditions

Continuous lighting Continuous darkness Natural photoperiod

20 8.3 ± 3.3 3.3 ± 1.7 1.7 ± 1.7

40 6.7 ± 4.4 13.3 ± 3.3 6.7 ± 1.7

60 5.0 ± 2.9 11.7 ± 4.4 5.0 ± 2.9

80 5.0 ± 5.0 6.7 ± 6.7 3.3 ± 1.7

100 3.3 ± 3.3 5.0 ± 0.0 3.3 ± 1.7

120 1.7 ± 1.7 8.3 ± 3.3 1.7 ± 1.7


Anexo IV-9

10

Figure 1. Survival rates at various periods of juvenile crayfish breeding under different shelter avail-ability during 80 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-10

11

Figure 2. Average carapace length at various periods of juvenile crayfish breeding under different shelter availability during 80 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-11

12

Figure 3. Average weight at various periods of juvenile crayfish breeding under different shelter availability during 80 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-12

13

Figure 4. Survival rates at various periods of juvenile crayfish breeding under three lighting conditions during 120 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-13

14

Figure 5. Average carapace length at various periods of juvenile crayfish breeding under three light-ing conditions during 120 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-14

15

Figure 6. Average weight at various periods of juvenile crayfish breeding under three lighting condi-tions during 120 days. Error bars represent standard errors of the means

Anexo IV-15

1

Intensive rearing of juvenile crayfish (Pacifastacus leniusculus, Astacidae) during the first six months: Effects of size grading

R. González*, J.D. Celada, J.M. Carral, V. García, M. Sáez-Royuela, Á. González

Dpto. Producción Animal, Universidad de León, Campus de Vegazana s/n, 24071 León, Spain.

*Corresponding author. Fax: +34-987-291187, e-mail address: [email protected]

Abstract Recent advances on feeding in intensive rearing of juvenile astacid crayfish have made possible a good performance during the first months, which enables the development of studies searching for adequate periods of size grading from the start of first-feeding. A 180-day experiment aimed to the intensive rearing of Pacifastacus leniusculus in improved conditions of feeding was car-ried out under controlled conditions, evaluating effects of size grading at two different periods from the onset of exogenous feeding on survival, growth and feeding efficiency. Juvenile stage 2 were stocked in fiberglass tanks at a density of 100 m2, and fed a dry diet for salmonids combined with restricted amounts of Artemia cysts. According to the time of size grading, five groups were tested: no grading, grading at 60 days (large and small size) and grading at 100 days (large and small size). After six months, survival ranged from 71.67% to 74.83% with no significant differences among groups. The highest final growth (average of upper and lower classes: 17.39 mm carapace length, 1.43 g weight) was reached by the crayfish sorted at 60 days, showing significant differences from the no grading group. Smaller crayfish graded at 60 days grew significantly faster than smaller crayfish graded at 100 days. Food conversion ratio was lower in the grading groups (mean 2.64), showing significant differences from the no grading group (3.23). As crayfish grew, specific growth rate was decreasing from a mean of 4.37 % day-1 during the first 60 days up to a mean of 0.81% day-1 during the last period (100-180 days). On the contrary, food conversion ratio was increasing from a mean of 0.92 during the first 60 days up to a mean of 3.23 during the last period (100-180 days). This study provides valuable information about the response of juvenile crayfish during six months of intensive rearing from the onset of exogenous feeding and shows that size grading allows a better performance and an improved feeding efficiency. Keywords: Astacid crayfish; Pacifastacus leniusculus; juvenile; intensive rearing; size grading

1. Introduction

Size grading is a general practice in the culture of commercial fish species because of its benefits on survival, growth and improvement of feeding efficiency. Positive effects of grading on survival and growth are related to the absence of resource competition because of larger animals, which allows smaller individuals to avoid the negative effects of a dominance hierarchy (Barki et al., 2000; Southgate, 1993). Also when fish are of a nearly even size, the amount of food can be more accurately computed and feeding effi-

ciency improved (Coche and Muir, 1998; Leitriz and Lewis, 1976). In the overall, size grading seems to be especially recommended in aggres-sive species in which competition for food and even cannibalism are common, such as in the case of crustaceans, but effects on their culture are not well-known. Possible benefits of grading in the freshwater prawn (Macrobrachium rosen-bergii) have been reported by Daniels and D’Abramo (1994), Daniels et al. (1995), New (2002) and Tidwell et al. (2003, 2004). According to these authors, size grading results in in-creased average harvest size and total pond

Anexo V-1

2

production as well as improved food conversion ratios, although it is not generalized in culture. In the research for the intensive rearing of juvenile astacid crayfish, the low survival and growth rates obtained during three decades (see review by González et al., 2009a) have not allowed acceptable results after the first months from the onset of exogenous feeding, which hindered the development of size grading studies. Recent advances on feeding under controlled conditions (González et al., 2008; González et al., 2009a, 2009b; Sáez-Royuela et al., 2007) have made possible a good performance of crayfish from the start of first-feeding. Thus, the aim of this study was to evaluate effects of size grading at two different periods from the onset of exogenous feeding on survival, growth and feeding effi-ciency under conditions of improved feeding in the intensive rearing of juvenile crayfish during the first six months.

2. Material and Methods

2.1. Crayfish, facilities and experimental proce-dure

A 180-day experiment was carried out in indoor facilities with 1500 stage 2 juveniles P. leniusculus (mean: 5.58 ± 0.03 mm carapace length and 30.4 ± 0.3 mg weight) hatched in the laboratory by means of artificial incubation ac-cording to Melendre et al. (2006). Juveniles were placed in 15 fiberglass tanks (1 m2 bottom area, 200 l water) provided with a 200 µm mesh filter outlet to avoid escape of feed. The stocking den-sity was 100 crayfish m-2. Three corrugated fibre-cement sheets (54 x 20.5 cm) and six groups of four jointed sections of PVC pipes (4 cm long x 20 mm diameter) were provided as shelters in each tank. Aerated artesian well water was sup-plied in open system, and each tank had its own water inlet (flow rate 1.5 l min-1) and outlet. Qual-ity parameters of the incoming water were pH 7.7, hardness 10 ºdH (calcium 72 mg l-1), total dissolved solids 208.2 mg l-1 and total sus-pended solids 14.4 mg l-1. Throughout the trial, oxygen content was measured in the tanks with a Sension6 dissolved Oxygen Meter of Hatch Company (values around 7 mg l-1, minimum 5.7

mg l-1, maximum 7.8 mg l-1). Ammonia and ni-trites were measured with a Pocket-Photometer Lasa Aqua from water samples taken inside the tanks (values were always ammonia <0.02 mg l-1 and nitrites <0.05 mg l-1). Water temperature was maintained at 22 ± 1 ºC and photoperiod was natural (ca. 14 h light:10 h dark). Tanks were cleaned twice a week.

2.2. Diet and feeding

Crayfish were fed a dry diet for salmonids (T-NUTRA-0, Skretting, Trouw España SA. Cojo-bar, E-09620, Burgos, Spain, composition data provided by the manufacturer: crude protein 54%, crude lipid 18%, crude cellulose 0.08%, crude ashes 12%, total phosphorus 1.8%, Vitamin A 10000 UI kg-1, D3 1500 UI kg-1, E 150 mg kg-1, pellet diameter 0.9-1.5 mm) supplied by hand moderately in excess (2.5% body weight per day) in such a manner that a small remainder of un-eaten food could be always seen in the bottom. This dry diet was combined with decapsulated Artemia cysts (cysts of INVE Aquaculture Nutri-tion, High HUFA 430 µm, Hoogveld 91, B-9200 Dendermonde, Belgium), according to González et al. (2009b). The initial amount was 500 cysts per crayfish per day (later increasing 15% every 20 days). Cysts were decapsulated according to the method described by Van Stappen (1996) and fresh stocks were prepared every three days and stored at 4 ºC. Artemia cyst assessment was performed from the number of cysts g-1 provided by the manufacturer. Food was supplied once a day, an adequate frequency for the diet used (González et al., 2009b).

2.3. Size grading

Crayfish were reared under the same condi-tions in 15 tanks from the onset of exogenous feeding until the time of size grading. At day 60, the crayfish from six tanks were mixed, weighed individually and selectively separated into two groups: large and small size. Each group was distributed randomly into three replicates (tanks) in such a way that the number of crayfish per tank was the same (± 1 crayfish). At day 100, the process was repeated using crayfish from other

Anexo V-2

3

six tanks no graded previously. Thus, five groups (three tanks per group) were compared:

No grading.

Size grading at 60 days: large size (>405 mg).

Size grading at 60 days: small size (<405 mg).

Size grading at 100 days: large size (>581 mg).

Size grading at 100 days: small size (<581 mg).

2.4. Data collection and analysis

Every twenty days the percentage of sur-vivors was calculated and a sample of 20 juve-niles from each replicate (60 per treatment) was collected for recording carapace length (CL) and wet body weight (BW) individually. Carapace length was measured with digimatic calliper (to the nearest 0.01 mm). Excess water was re-moved with tissue paper and crayfish were weighed using a precision balance (to the nearest 0.001 g). Subsequently, animals were gently re-turned to their respective tanks. At the end of the experiment (180 days), survival rates were calcu-lated and all surviving crayfish were measured and individually weighed. Specific growth rate (SGR) and weight gain (WG) were expressed as (ln Wt-ln Wi)100/T and (Wt-Wi)100/Wi, respec-tively, where Wt is the mean final weight (g), Wi is the mean initial weight (g), and T is the period in days. Food conversion ratio (FCR) was calculated as Dt/Wt -W0, where Dt is the total amount of cysts (g of their commercial form) and dry diet used, and Wt -W0 is the weight gain (g) over a specified period of time. Coefficient of variation of carapace length and body weight were expressed as (σ/µ)100, where σ is the standard deviation and µ is the mean of carapace length or body weight values. Final biomass (g m-2) in each tank was also recorded.

In all checks and at the end of the expe-

riment, percentages of crayfish lacking one or two chelae were determined.

All data were examined by analysis of variance (ANOVA) using the computer pro-gramme SPSS 16.0 (SPSS Inc. Chicago, III., USA). Duncan test was applied to compare means at P < 0.05 level of significance. Percent-ages were arcsine-transformed prior to statistical analysis.

3. Results

Final survival, growth values and food conversion ratio (180 days) in the no grading and grading groups (average of upper and lower classes) are presented in Table 1. Survival ranged from 71.67% to 74.83% with no signifi-cant differences among groups. Figure 1 shows the survival rates in the checks throughout the experimental period. All checks from day 20 up to the end of the trial (day 180) showed no sig-nificant differences in the percentage of survi-vors. At day 60 (first grading), mean survival was 84%, whereas it was 83% at the time of the second grading (100 days).

Regarding growth, the highest final ca-rapace length (17.39 mm), weight (1.43 g), spe-cific growth rate (2.06%) and weight gain (4575.84%) were reached by the crayfish sorted at 60 days, showing significant differences from the ungraded group in carapace length, body weight and specific growth rate. No significant differences were found among grading at 100 days and the rest. The highest biomass (103.11 g m-2) was achieved by the crayfish graded at 100 days, with no significant differences from the other groups. Food conversion ratio (FCR) was lower in the grading groups (mean 2.64), show-ing significant differences from the no grading group (3.23).

Table 2 shows final survival, growth val-ues and food conversion ratio (180 days) in the upper class of both grading groups. No signifi-cant differences were found in survival or growth values, averaging 74.5% survival, 19.11 mm CL, 1.84 g BW, 2.23 % day-1 SGR, 5948.29% WG

Anexo V-3

4

and 137.03 g m-2 biomass. Food conversion ratio did not differ significantly between groups (mean 2.36.).

Table 3 shows final survival, growth val-ues and food conversion ratio (180 days) in the lower class of both grading groups. No significant differences were found in survival, averaging 72%. The highest carapace length (15.72 mm), weight (1.03 g), SGR (1.89 % day-1), WG (3255.42%) and biomass (72.76 g m-2) were achieved by the crayfish graded at 60 days, showing significant differences from those graded at 100 days. Food conversion ratio did not differ significantly between groups (mean 2.93).

Figures 2 and 3 show mean carapace length and weight, respectively, in the checks throughout 180 days. In the no grading group, the values were always significantly lower than those obtained in the upper classes and signifi-cantly higher than those of the lower classes. No significant differences were found between both upper classes from day 100 up to day 180. For the same period, carapace length and weight in the lower class of grading at 60 days were signif-icantly higher than those of the lower class of grading at 100 days.

Specific growth rate, weight gain and food conversion ratio in the no grading and grad-ing groups at different periods (0-60, 0-100, 60-180 and 100-180 days) are presented in Table 4. Improved values were found in both grading groups, although differences were not significant. As crayfish grew, specific growth rate was de-creasing from a mean of 4.37% day-1 during the first 60 days up to a mean of 0.81% day-1 during the last period (100-180 days). On the contrary, food conversion ratio was increasing from a mean of 0.92 during the first 60 days up to a mean of 3.19 during the last period (100-180 days).

Table 5 summarizes percentages of ju-veniles lacking one or two chelae throughout the 180 days. At the end of the trial, values were from 5.33% to 9.33%, whereas in previous con-

trols the range was between 2.33% and 9.67%. No significant differences were found among groups for the experimental period.

Table 6 presents final coefficients of var-iation of carapace length (CVCL) and weight (CVBW). Values in the no grading group (18.29% in carapace length, 62.75% in weight) were significantly higher than those recorded in grading at 60 days (around 13% in carapace length and 46% in weight) and at 100 days (around 13% in carapace length and 44% in weight).

4. Discussion

In astacid crayfish, grading studies start-ing from the onset of exogenous feeding have not been conducted so far. Previously, it was necessary to overcome the drawbacks of low survival and growth rates during the first months of rearing under controlled conditions. However, a study (Ahvenharju et al., 2005) was possible by using older animals (3.5 to 6 months) surviv-ing to the initial phase. In parastacid crayfish, Qin et al. (2001) began the trial with Cherax tenui-manus whose weights ranged between 10 and 160 g. These experiments started at the time of grading, without considering the previous period, which involves breeding the animals from the start of first-feeding until their different growth allows a size grading. Therefore, a complete study on grading should include growth and loss data throughout the whole process, prior to and after grading.

The present study was conducted from the onset of exogenous feeding, comparing the effects of grading at different periods. Results showed that both gradings at 60 or 100 days improved growth values (Table 1). Moreover, the higher final growth of the smaller crayfish graded at 60 days compared with that of the smaller crayfish graded at 100 days (Table 3) proves the convenience of separating the bigger crayfish from the smaller individuals after the shortest period. This was probably because the smaller animals have benefited from the absence of the more dominant larger crayfish for longer. How-

Anexo V-4

5

ever, grading involves handling of animals that, according to Farrell and Leonard (2000) and Ahvenharju et al. (2005), could have harmful effects on growth and cheliped losses. In our study, grading management neither increased cheliped injuries nor affected negatively the cray-fish performance. Considering that the initial density was 100 m-2 and that the harmful effects of aggressive behaviour and cannibalism rise with increasing stocking density (González et al., 2009a), it could be expected that the higher the density the more evident the beneficial effects of grading.

As regards food conversion ratio, grad-ing resulted in significant improvements in feed-ing efficiency. Compared with the ungraded group, graded crayfish converted feed more efficiently to body mass, as it has been reported in fish (Coche and Muir, 1998; Leitritz and Lewis, 1976) and in the crustacean M. rosenbergii (New, 2002). Separation of smaller individuals from the larger crayfish could have led to a re-duction in levels of stress and dominance, which would allow them to feed optimally and use the maximum scope for growth (Ahvenharju et al., 2005; Martins et al., 2006; Strand et al., 2007), because when reducing energy needed for fight-ing, animals can utilize a higher proportion of consumed energy toward growth process (Davis, 2006; Martínez-Porchas et al., 2009).

The upper classes included the crayfish whose growth rate was higher during the period before grading. Later on, those crayfish kept growing faster than those of the lower classes. These facts suggest an intrinsic capacity for faster growth. Thus, grading could be useful with a view to the possibilities of development of pro-grams in order to obtain a growth improvement within the shortest space of time, since this prac-tice would allow the selection of the fastest grow-ing animals to be used as breeders.

Considering as a whole the results of this study under improved feeding conditions, intensive rearing of juvenile crayfish for the first six months has been successfully carried out. This has made possible size grading with cray-

fish reared from the start of first-feeding, obtain-ing information throughout the whole process, prior to and after grading. With view to applica-tion possibilities in culture, grading may be rec-ommendable once differences in growth appear, since it allowed an improved feeding efficiency and a better crayfish performance.

5. Acknowledgements

Funding of this study was the Plan Na-cional de I+D+i, Ministerio de Educación y Cien-cia, Spain, Research Project AGL2005-01127. We thank the financing of a grant for Programa Nacional de Formación de Profesorado Universi-tario, Ministerio de Educación y Ciencia, Spain, reference AP2005-4860. We should also like to thank the Quiñón S.A. crayfish farm for their collaboration.

Anexo V-5

6

6. References

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Anexo V-6

7

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Anexo V-7

8

Table 1 Final survival, growth values and food conversion ratio (180 days) of juvenile crayfish in the no grading and grading groups (average of upper and lower classes)

Values are mean ± standard error. Data derived from all survivors of 3 replicates in the no grading group (n= 218) and of 6 replicates in the groups graded at 60 days (n= 430) and at 100 days (n= 449) Values in the same row having the same superscript are not significantly different (P < 0.05)

No grading Grading at 60 d Grading at 100 d

Survival (%) 72.67 ± 2.19a 71.67 ± 1.09a 74.83 ± 1.70a

CL (mm) 16.78 ± 0.21a 17.39 ± 0.15b 17.18 ± 0.14a,b

BW (g) 1.30 ± 0.06a 1.43 ± 0.03b 1.38 ± 0.02a,b

SGR (% day-1) 1.99 ± 0.02a 2.06 ± 0.01b 2.03 ± 0.01a,b

WG (%) 4182.71 ± 184.00a 4575.84 ± 130.05a 4432.51 ± 126.88 a

Biomass (g m-2) 94.61 ± 6.19a 101.87 ± 13.72a 103.11 ± 17.97a

FCR 3.23 ± 0.13a 2.67 ± 0.06b 2.61 ± 0.06b

Anexo V-8

9

Table 2 Final survival, growth values and food conversion ratio (180 days) of juvenile crayfish in the upper class of both grading groups

Values are mean ± standard error. Data derived from all survivors of 3 replicates (n= 216 in grading at 60 days and n= 231 in grading at 100 days) Means are not significantly different (P < 0.05) Table 3 Final survival, growth values and food conversion ratio (180 days) of juvenile crayfish in the lower class of both grading groups Values are mean ± standard error. Data derived from all survivors of 3 replicates (n= 214 in grading at 60 days and n= 218 in grading at 100 days) Values in the same row having the same superscript are not significantly different (P < 0.05)

Grading at 60 d Grading at 100 d

Survival (%) 72.00 ± 1.58 77.00 ± 2.53

CL (mm) 19.04 ± 0.19 19.17 ± 0.16

BW (g) 1.82 ± 0.06 1.86 ± 0.05

SGR (% day-1) 2.22 ± 0.02 2.24 ± 0.01

WG (%) 5884.04 ± 197.85 6012.54 ± 180.34

Biomass (g m-2) 130.98 ± 6.92 143.08 ± 1.20

FCR 2.40 ± 0.08 2.31 ± 0.06

Grading at 60 d Grading at 100 d

Survival (%) 71.33 ± 2.33a 72.67 ± 2.73a

CL (mm) 15.72 ± 0.15a 15.06 ± 0.14b

BW (g) 1.03 ± 0.03a 0.87 ± 0.03b

SGR (% day-1) 1.89 ± 0.02a 1.81 ± 0.02b

WG (%) 3255.42 ± 110.74a 2758.25 ± 82.59b

Biomass (g m-2) 72.76 ± 6.81a 63.14 ± 4.04a

FCR 2.93 ± 0.09a 2.92 ± 0.09a

Anexo V-9

10

Tabl

e 4

Spec

ific

Gro

wth

Rat

e (%

day

-1),

Wei

ght G

ain

(%) a

nd F

ood

Con

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Rat

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the

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th

roug

hout

the

180

days

Day

s

No

grad

ing

Gra

ding

at 6

0 d

Gra

ding

at 1

00 d

0-60

i

SGR

(% d

ay-1

) 4.

29 ±

0.0

9 4.

40 ±

0.0

8 4.

41 ±

0.0

4

WG

(%)

1215

.13

± 76

.27

1310

.99

± 63

.76

1310

.39

± 32

.43

FCR

0.

96 ±

0.0

6 0.

91 ±

0.0

4 0.

89 ±

0.0

2

0-10

0ii

SGR

(% d

ay-1

) 3.

13 ±

0.0

6 3.

14 ±

0.1

5 3.

16 ±

0.0

7

WG

(%)

2198

.85

± 13

5.44

23

51.7

5 ±

361.

61

2258

.11

± 69

.44

FCR

1.

44 ±

0.0

9 1.

53 ±

0.2

3 1.

51 ±

0.0

5

60-1

80

SGR

(% d

ay-1

) 0.

98 ±

0.0

3 0.

99 ±

0.0

4 0.

98 ±

0.1

4

WG

(%)

226.

09 ±

13.

54

228.

41 ±

17.

71

227.

42 ±

51.

63

FCR

2.

82 ±

0.1

9 3.

03 ±

0.4

2 3.

01 ±

0.8

2

100-

180

SGR

(% d

ay-1

) 0.

78 ±

0.0

1 0.

82 ±

0.0

4 0.

83 ±

0.0

2

WG

(%)

86.3

1 ±

1.51

92

.90

± 6.

56

94.3

2 ±

3.86

FCR

3.

20 ±

0.1

8 3.

19 ±

0.4

9 3.

17 ±

0.5

1

V

alue

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0) a

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M

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< 0

.05)

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calc

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e gr

adin

g (s

imila

r con

ditio

ns)

Anexo V-10

11

Table 5 Percentages (%) of juvenile crayfish lacking chelae in the checks throughout the experimen-tal period

Days No grading Grading at 60 d

(>405 mg) Grading at 60 d

(<405 mg) Grading at 100 d

(>581 mg) Grading at 100 d

(<581 mg)

20 3.33 ± 0.67 6.33 ± 2.33 5.00 ± 1.00 5.67 ± 1.67 6.33 ± 1.20

40 8.33 ± 1.86 7.33 ± 2.33 7.33 ± 0.88 7.67 ± 1.67 9.00 ± 2.65

60 8.00 ± 3.06 3.33 ± 2.33 6.33 ± 0.33 6.33 ± 0.67 4.33 ± 1.45

80 5.00 ± 2.08 6.67 ± 1.45 3.00 ± 0.58 3.00 ± 0.58 6.00 ± 1.53

100 4.33 ± 0.67 4.67 ± 0.67 2.33 ± 0.88 3.00 ± 0.58 4.00 ± 1.00

120 4.67 ± 1.45 7.33 ± 0.19 3.67 ± 0.88 4.00 ± 0.58 5.33 ± 0.33

140 3.33 ± 1.45 5.67 ± 1.67 5.33 ± 1.20a 5.00 ± 1.53 3.67 ± 1.76

160 9.67 ± 1.20 7.01 ± 1.00 7.00 ± 1.15 8.33 ± 1.45 7.67 ± 0.33

180 9.33 ± 2.33 6.67 ± 1.86 5.33 ± 0.33 6.00 ± 2.31 6.67 ± 2.03


Table 6 Final coefficients of variation (%) of carapace length and weight in the no grading and grad-ing groups

No grading Size grading at 60 days (> 405

mg)

Size grading at 60 days (< 405

mg)

Size grading at 100 days (> 581

mg)

Size grading at 100

days (< 581 mg)

CVCL (%) 18.29 ± 0.98a 14.25 ± 0.43b 13.62 ± 0.36b 12.86 ± 0.69b 13.24 ± 0.61b

CVBW (%) 62.75 ± 4.36a 47.41 ± 2.34b 46.12 ± 2.46b 44.40 ± 3.09b 42.46 ± 2.51b

Values are mean ± standard error Values in the same row having the same superscript are not significantly different (P < 0.05)

Anexo V-11

12

Figu

re 1

Sur

viva

l rat

es o

f juv

enile

cra

yfis

h in

the

no g

radi

ng a

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radi

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180

day

s

Anexo V-12

13

Figu

re 2

Cha

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f juv

enile

cra

yfis

h in

the

no g

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radi

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roug

hout

180

day

s

Anexo V-13

14

Fi

gure

3 C

hang

es in

wei

ght o

f juv

enile

cra

yfis

h in

the

no g

radi

ng a

nd g

radi

ng g

roup

s th

roug

hout

180

day

s

Anexo V-14

González R, Celada JD, García V, Carral JM, González A, Sáez-Royuela M (2009). The artificial incubation

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