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Tcnicas de Estudio de las clulas

Microscopia

Preparaciones permanentes:

Fijacin Deshidratacin Inclusin Corte

Fijacin: Acidos, solventes orgnicos como alcohol, aldehdos (Formaldehdo, glutaraldehdos)

Inclusin: Ceras o resinas (lquido a slido)Ej.: Parafina (xileno, benceno, tolueno)

Celoidina (etanol, eter)

Cortes: Micrtomo, vibrtomo, crostato.

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Colorantes utilizados para microscopia

Bsicos: Azul de metilenocidos: Eosinaneutros: Eosinato de azul de metileno.

Ej.: Hematoxilina: (-), revela ADN, ARN y protenas cidas

Para lpidos: OsO4, Sudn III

Otros mtodos de visualizacin

Asociacin con molculas grandes: Enzimas + sustrato adecuado anticuerpos marcados

Inmunofluorescencia

Difraccin de rayos X

Rayos X, son una forma de radiacin electromagntica, de una longitud de onda bastante pequea, de alrededor de 0.1nm (dimetro de un tomo de hidrogeno).

La posicin e intensidad de cada spot en el patrn de difraccin contiene informacin acerca de la localizacin de los tomos en el cristal, permitiendo deducir la estructura tridimensional de la molcula que conforma el cristal.

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Patrn de difraccin de una protena

Patrn de difraccin de la molcula de ADN

Como medir las condiciones internas de clulas vivas?

Microelectrodos:

Medicin de variables elctricas medicin de concentracin intracelular de iones inorgnicos

Microagujas:

Inyeccin de distintas sustancias

Micropipetas:

Diseccin Extraccin injertos

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Introduccin de sustancias

Microinyeccin Electroporacin Utilizacin de liposomas

Fraccionamiento celular

Ruptura celular

Shock osmtico Vibracin Ultrasonicacin Homogenizacin

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Fraccionamiento por centrifugacin

Centrifugacin diferencial

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Centrifugacin en gradiente

Estudio de protenas

Protenas poseen diferentes:Tamao Forma Carga Hidrofobicidad Afinidad por otras molculas

Separacin

Purificacin

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Cromatografas

Fase mvil: solvente

Fase inmvil: papelresina cargadasmatriz porosas inertes

Cromatografa en capa fina

Fase inmvil: Papel de cromatografaHoja de plsticovidrio con celulosa o silica.

Fase mvil: Agua Alcohol

Cromatografa en columnas

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Cromatografa de intercambio inico

Posee pequeas esferas cargadas negativa o positivamente

La separacin se produce segn carga

Cromatografa de filtracin en gel

Separacin segn tamao molecular

Matrices porosas de acuerdo al tamao

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Cromatografa de afinidad

Separacin de acuerdo a la afinidad de una molcula con otra.

La protena de inters puede ser retenida especficamente por la matriz

Electroforesis

Las protenas usualmente poseen carga neta positiva o negativa, dependiendo los aminocidos que contenga.

Cuando se aplica un campo elctrico a una solucin conteniendo molculas proteicas, las protenas migran a una razn dependiendo de su carga neta, y de su tamao y forma.

* A mayor carga y menor peso molecular, mayor movilidad electrofortica.

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Isoelectroenfoque

Cada protena tiene su punto isoelctrico; pH al cual tiene carga neta 0.

Una protena en su punto isoelctrico no migra en un campo elctrico.

* Gel con gradiente estable de pH La protena migra hasta el punto isoelctrico.

Electroforesis en gel

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Electroforesis en condiciones denaturantes (SDS-PAGE)

Las protenas se encuentran en una solucin que contiene un detergente con fuerte carga negativa (SDS).

Las molculas de detergente enmascaran la carga intrnseca de la protena y cuando se aplica voltaje migran hacia el electrodo positivo.

Electroforesis bidimensional

1.- Separacin en cuanto a carga (isoelectroenfoque).2.- Separacin en cuanto a peso molecular (con SDS).

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Tecnologa del ADN recombinante

* Largas molculas de ADN son cortadas en fragmentos por enzimas de restriccin

Nucleasas de restriccin (o enzimas de restriccin): Corta el ADN doble hebra en sitios especficos definidos por la secuencia nucleotdica local.

Extremos romos

Extremos cohesivos

El uso de enzimas de restriccin para realizar cortes especficos en el ADN, facilita el aislamiento y manipulacin de genes individuales.

Dos fragmentos de ADN cortados por la misma enzimas pueden unirse fcilmente (o con otra nucleasa que genere los mismos extremos cohesivos)

ADN recombinante

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Hibridacin utilizando sondas

- Localizacin de genes- Northern (RNA)- Southern (DNA)

Deteccin de DNA o RNA por hibridacin

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Clonar Genes

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Cultivos celulares

Fibroblastos Mioblastos

Lnea celulares

Cultivos primarios