técnicas de biología molecular -...
TRANSCRIPT
![Page 1: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/1.jpg)
Técnicas de Biología Molecular
![Page 2: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/2.jpg)
![Page 3: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/3.jpg)
I. Enzimas de restricción
Análisis
DNA
![Page 4: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/4.jpg)
Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su función natural es proteger contra DNA extraño
![Page 5: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/5.jpg)
II. Separación electroforética de moléculas de DNA
(A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia)
(B) Electroforesis para RFLP (sepración entre 100 a 10000 nt)
(C) Electroforesis de campo pulsante (separación de DNA cromosomal)
+
– –
–
+
+
![Page 6: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/6.jpg)
III. Secuenciación de DNA por el método de Sanger
No acepta elongación de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa
• dsDNA molde (¿secuencia?) • 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)
• cebador de DNA
• DNA polimerasa
![Page 7: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/7.jpg)
![Page 8: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/8.jpg)
5’
5’
3’
3’
![Page 9: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/9.jpg)
Secuenciación automatizada de DNA
![Page 10: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/10.jpg)
Marcaje de un fragmento de DNA (obtención de una sonda)
dCTP[αP32]
α β γ
![Page 11: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/11.jpg)
Hibridación y reconocimiento de secuencias con alta homología
65oC 50oC
![Page 12: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/12.jpg)
IV. Southern Blot (detección de secuencias específicas de DNA)
1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricción 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o
nylon 6. Hibridar con sonda específica 7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de
fosforimager
![Page 13: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/13.jpg)
Bromuro de etidio
Sonda P32
![Page 14: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/14.jpg)
V. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Desnaturalizar Alineamiento Polimerización
cebador directo
cebador reverso
![Page 15: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/15.jpg)
La amplificación es exponencial
En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de interés
1
2
4 8
![Page 16: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/16.jpg)
Pruebas de identidad
![Page 17: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/17.jpg)
Mutagénesis sitio dirigida
La mutación se incluye en uno de los cebadores para el PCR
![Page 18: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/18.jpg)
Mutagénesis dirigida
Se pueden generar proteínas mutadas manipulando su DNA
Generalmente la mutagenesis se hace por PCR: - Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro) - Deleciones
![Page 19: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/19.jpg)
VI. DNA recombinante
DNA A
DNA B
DNA AB
ligasa
![Page 20: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/20.jpg)
Después del PCR los fragmentos se pueden clonar
Los cebadores son diseñados con extremos reconocidos por enzimas de restricción
![Page 21: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/21.jpg)
Vectores de clonación
1. Plásmidos
2. Fagos
3. Cósmidos
4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz)
![Page 22: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/22.jpg)
1. Plásmidos
Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucleótidos
DNA doble cadena, circular, origen propio de replicación
![Page 23: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/23.jpg)
Marcadores de resistencia a antibióticos Permiten la selección de bacterias transformadas con el plásmido o con el DNA recombinante
![Page 24: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/24.jpg)
Otras características de los plásmidos
Sitios de clonación múltiples: varias enzimas de restricción que solo cortan una vez en el plásmido
![Page 25: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/25.jpg)
2. Fagos
![Page 26: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/26.jpg)
4. Cromosomas artificiales de Bacteria (BAC’s) o de levadura (YAC´s)
Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos
![Page 27: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/27.jpg)
Múltiples copias de DNA recombinante
Obtención de múltiples copias de la molécula recombinante
![Page 28: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/28.jpg)
La transformación implica la introducción de DNA extraño a una célula hospedante
Plásmido de bajo número de copias Plásmido de alto número de copias
![Page 29: Técnicas de Biología Molecular - depa.fquim.unam.mxdepa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Clase22_23690.pdf · Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maíz) 1](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022042209/5ead031200f0844cc9721655/html5/thumbnails/29.jpg)