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ANDERSON MESSIAS RODRIGUES
TAXONOMIA POLIFÁSICA E CARACTERÍSTICAS PROTEÔMICAS
DO COMPLEXO Sporothrix schenckii
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina como
requisito para a obtenção do título de Mestre em
Ciências. Área de concentração: Micologia.
São Paulo
2010
ANDERSON MESSIAS RODRIGUES
TAXONOMIA POLIFÁSICA E CARACTERÍSTICAS PROTEÔMICAS
DO COMPLEXO Sporothrix schenckii
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina como
requisito para a obtenção do título de Mestre em
Ciências. Área de concentração: Micologia.
Orientação: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo
São Paulo
2010
FICHA CATALOGRÁFICA
Rodrigues, Anderson Messias
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii. São
Paulo, 2010.
241 p. il. 30 cm.
Polyphasic taxonomy and proteomic features in the Sporothrix schenckii complex. São
Paulo, 2010.
Dissertação apresentada ao Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, da
Universidade Federal de São Paulo. Área de concentração: Micologia Médica.
Orientação: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo
1. Sporothrix schenckii, 2. Esporotricose, 3. Taxonomia polifásica, 4. Proteômica, 5.
Imunoproteômica, 6. Caracterização, 7. Micologia Médica
“Permitida a cópia parcial deste documento desde que citada a fonte – O autor”
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia Médica, Disciplina de Biologia
Celular, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia (DMIP) da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo. Recebeu apoio
financeiro da Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
processo 2008/55975-8 e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível
Superior (CAPES).
Chefe de Disciplina: Profa. Dra. Rosana Puccia
Chefe de Departamento: Profa. Dra. Clara Lúcia Barbiéri Mestriner
Coordenador de Pós-graduação: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara
Pró-reitor de Pós-graduação: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
Dedico
À minha mãe Lucilene e ao meu pai Reinaldo
As pessoas mais importantes da minha vida.
Aos meus irmãos Jaqueline e Alexander
Muito obrigado por tudo!
Agradecimentos
Este trabalho foi realizado com a contribuição conjunta de diversas pessoas,
sem as quais não teria sido possível a sua concretização. Neste sentido, gostaria de
expressar a minha gratidão a todos aqueles que direta ou indiretamente me
apoiaram tanto no âmbito científico como pessoal.
Agradeço ao Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo pela orientação e conselhos
durante o desenvolvimento desta dissertação. Agradeço pela amizade, pela
oportunidade de participar do grupo de pesquisa, pela confiança depositada e é
claro, pela paciência que não foi pouca, diga-se de passagem... Muito obrigado por
tudo professor!
Agradeço à Profa. Dra. Olga Fischman Gompertz pela generosidade em
colocar seu laboratório de pesquisa à disposição e pelos valiosos ensinamentos em
Micologia Médica.
Agradeço aos meus amigos de bancada durante o período de execução desta
dissertação pelo excelente convívio: Alexandre Sasaki, Cristiane Amaral (Cris),
Geisa Fernandes, Priscila Oliveira (Pri), Rodrigo Berzaghi, Agenor Júnior, Thiago
Roberto e Mayra Maciel. Agradeço também a Rosângela Pfister, por ter feito mais de
5.000 tubos de ensaios com meio de cultura!
Je remercie mes amis, Antoine Bahri et Nesma Zaid El Kilani, de la Faculté de
Pharmacie de Lyon - Université Claude Bernard Lyon (France).
Agradeço aos funcionários da Disciplina de Biologia Celular: Rose Pfister,
Maria, Claudeci, Cláudio, Luiz e Américo.
Agradeço aos secretários Márcia Martins, Marcelo Rodrigues, Mércia Maia e
Regiane Escobar pela colaboração, disponibilidade, eficiência e apoio.
Um agradecimento especial as amigas Priscila Oliveira dos Santos e Márcia
Martins pelo precioso auxílio e disponibilidade no momento da impressão deste
documento.
Agradeço aos meus queridos amigos de Guarulhos, a quem carinhosamente
menciono de “família”, pela ajuda e carinho: Claudete, Walas, Natália, Nayara,
Matheus e Nair. Vocês foram pessoas fundamentais para que eu concluísse mais
uma etapa da minha formação. Muito obrigado por tudo!
Agradeço aos meus familiares e amigos por entenderem a minha ausência no
convívio durante a maior parte do período de execução deste trabalho!
Agradeço ao Prof. Dr. Ricardo Bertolla do Centro de Pesquisa em Urologia do
Departamento de Cirurgia – UNIFESP, por disponibilizar o Scanner Image III e o
software Image Master 7 para a digitalização dos géis bidimensionais de proteínas e
análise de Bioinformática das imagens.
Agradecemos aos esforços das pesquisadoras Dra. Leila Maria Lopes
Bezerra (Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto
Alcantara Gomes, Departamento de Biologia Celular e Genética, Laboratório de
Micologia Celular e Proteômica - LMCProt) e Dra. Rosane Orofino Costa
(Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas, Chefe
do Laboratório de Micologia - HUPE) pela doação dos soros humanos de pacientes
com esporotricose (padrão-ouro) utilizados neste trabalho;
Agradecemos aos pacientes com esporotricose que permitiram utilização das
amostras biológicas (soros);
Agradeço aos amigos dos laboratórios de pesquisa da Disciplina de Biologia
Celular pelo apoio, pelo empréstimo dos equipamentos, pela disponibilidade e
amizade!
Agradeço a participação dos professores do DMIP durante a minha formação
neste programa de pós-graduação;
Agradecemos sinceramente aos esforços de diversos pesquisadores do Brasil
e da América Latina em enviar as culturas de Sporothrix spp. necessárias para a
confecção da micoteca utilizada neste trabalho: Dr. Carlos Pelleschi Taborda,
Instituto de Ciências Biomédicas (ICB), Universidade de São Paulo (USP); Dr.
Arnaldo Lopes Colombo, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Dr. Luiz
Carlos Severo, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS); Dra. Gilda
Maria Barbaro Del Negro, Instituto de Medicina Tropical, Universidade de São Paulo
(USP); Dra. Junia Hadam, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Dra.
Liline M. S. Martins, Universidade Federal do Piauí (UFPI); Dr. Flávio de Queiroz
Telles Filho, Universidade Federal do Paraná (UFPR); Dr. José Júlio Costa Sidrim,
Universidade Federal do Ceará (UFC); Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha,
Universidade Estadual do Ceará (UECE); Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva,
Universidade Federal de Goiás (UFG); Dra. Patrícia Fagundes da Costa,
Universidade Federal do Pará (UFPA); Dr. Mario Carlos Araujo Meireles,
Universidade Federal de Pelotas; Dr. Eduardo Bagagli, Universidade Estadual de
São Paulo (UNESP – Botucatu); Dra. Mariceli Araujo Ribeiro, Universidade Federal
do Espírito Santo (UFES); Dr. Marcio Nucci, Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ); Dr. Diltor Vladimir Araújo Opromolla (Instituto Lauro de Souza Lima); Dra.
Rosane Christine Hahn, Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT); Dr. Mario
Léon Silva-Vergara, Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (UFTM); Dra.
Cláudia Maria Leite Maffei, Dpto. Biologia Celular e Bioagentes Patogênicos,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP (FMRP-USP); Dra. Angélica Zaninelli
Schreiber, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP); Dra. Cristina Ma. de
Souza Motta, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE); Dr. Mário Augusto Ono,
Universidade Estadual de Londrina (UEL); Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima,
Universidade Federal da Paraíba (UFPB); Dra. Cintia de Moraes Borba, Fundação
Oswaldo Cruz (Fiocruz); Dra. Melissa Orzechowski Xavier, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul (UFRGS); Dra. Carmelia Matos Santiago Reis, Universidade de
Brasília (UnB); Dra. Beatriz Bustamante, Instituto de Medicina Tropical Alexander
Von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia (Lima, Peru); Dra.
Concepcíon Torielo Nájera, Departamento de Microbiología y Parasitologia
Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).
Agradeço imensamente ao Prof. Dr. Josep Guarro Artigas e a Profa. Dra.
Josepa Gené Díaz do Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques da Facultat de
Medicina i Ciències de la Salut, Universitat Rovira i Virgili, Reus, Espanha, por terem
gentilmente cedido as cepas tipo das novas espécies descritas do complexo
Sporothrix schenckii utilizadas neste trabalho.
Todas as parcerias estabelecidas e citadas acima foram imprescindíveis
para o bom andamento e realização deste trabalho, sem as quais nada
seria possível!
Agradeço sinceramente as agências de fomento CAPES, CNPq e FAPESP
pelas diversas formas de auxílios recebidos durante o desenvolvimento deste
trabalho.
Anderson Messias Rodrigues.
Taxonomia polifásica e características
proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
como requisito para a obtenção do título de
Mestre em Ciências. Área de concentração:
Micologia.
Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo (Orientador)
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – DMIP
Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia
Banca examinadora
Prof. Dr. Carlos Pelleschi Taborda
Universidade de São Paulo – USP Instituto de Ciências Biomédicas – ICB
Programa de Pós-graduação em Microbiologia
Prof. Dr. Sandro Rogério de Almeida
Universidade de São Paulo – USP Faculdade de Ciências Farmacêuticas – FCF
Departamento de Analises Clínicas e Toxicológicas
Profa. Dra. Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Universidade Federal do Ceará – UFC Centro Especializado em Micologia Médica – CEMM Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas
Profa. Dra. Olga Fischman Gompertz
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – DMIP
Programa de Pós-graduação em Microbiologia e Imunologia
“Com o conhecimento nossas dúvidas aumentam”
Johann Wolfgang von Goethe
Escritor alemão (1749–1832)
ÍNDICE
RESUMO.......................................................................................................................................... I
ABSTRACT...................................................................................................................................... II
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................................ III
LISTA DE TABELAS....................................................................................................................... VIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS.................................................................................... X
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................................. 01
1.1 Fungos de importância médica: Perspectiva geral......................................................... 01
1.2 Sporothrix schenckii Hektoen et Perkins 1900 e o complexo S. schenckii……………. 03
1.3 Conceitos de espécie em micologia.................................................................................. 12
1.4 Taxonomia polifásica de fungos patogênicos: Técnicas empregadas para a
classificação...................................................................................................................... 16
1.5 Esporotricose: uma micose reemergente......................................................................... 21
1.5.1 Esporotricose cutânea fixa............................................................................................ 23
1.5.2 Esporotricose linfocutânea........................................................................................... 24
1.5.3 Esporotricose disseminada.......................................................................................... 24
1.6 Diagnóstico da esporotricose: da sorologia à detecção molecular............................... 26
1.7 Epidemiologia da esporotricose: uma micose de espectro mundial............................. 28
1.8 Análise proteômica............................................................................................................. 32
1.8.1 Eletroforese bidimensional de proteínas....................................................................... 33
1.8.2 Primeira dimensão: Focalização Isoelétrica (IEF)........................................................ 34
1.8.3 Segunda dimensão: SDS-PAGE.................................................................................. 35
1.8.4 Detecção de proteínas.................................................................................................. 35
1.8.5 Aquisição de imagens................................................................................................... 36
1.8.6 Espectrometria de massas............................................................................................ 36
1.9 Importância da proteômica no estudo de patógenos humanos..................................... 37
1.10 Imunoproteômica: Importância dos marcadores sorológicos de doenças................. 39
1.11 Justificativa........................................................................................................................ 39
2. OBJETIVOS................................................................................................................................. 42
2.1 Delineamento experimental................................................................................................ 44
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 45
3.1 Cepas de Sporothrix spp. utilizadas e condições de cultivo.......................................... 45
3.2 Caracterização fenotípica................................................................................................... 45
3.2.1 Ensaios morfológicos.................................................................................................... 54
3.2.1.1 Microcultivo........................................................................................................... 54
3.2.1.2 Crescimento vegetativo em meio CMA (Corn Meal Agar).................................... 55
3.2.2 Ensaios fisiológicos....................................................................................................... 56
3.2.2.1 Crescimento vegetativo em função das temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C....... 56
3.2.2.2 Influência da temperatura na inibição do crescimento.......................................... 56
3.2.2.3 Análise de clusterização e análise estatística....................................................... 57
3.2.2.4 Efeito fungistático e fungicida da temperatura no crescimento fúngico................ 58
3.2.3 Ensaios bioquímicos..................................................................................................... 59
3.2.3.1 Assimilação de fontes de carbono, segundo protocolo de Marimon et al.
(2007)................................................................................................................... 59
3.2.3.1.1 Preparo das microplacas de assimilação..................................................... 59
3.2.3.1.2 Preparo do inóculo fúngico........................................................................... 59
3.2.3.1.3 Inoculação, incubação e leitura dos resultados............................................ 60
3.2.3.1.4 Avaliação dos resultados de assimilação..................................................... 61
3.3 Taxonomia Molecular.......................................................................................................... 62
3.3.1 Extração de DNA genômico de leveduras de Sporothrix spp....................................... 62
3.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)............................................................................... 64
3.3.2.1 Purificação e quantificação do produto de PCR............................................... 65
3.3.3 Sequenciamento dos produtos de PCR........................................................................ 65
3.3.4 BLAST........................................................................................................................... 66
3.4 Taxonomia polifásica do complexo Sporothrix schenckii.............................................. 66
3.5 Proteômica........................................................................................................................... 67
3.5.1 Isolado e condição de cultivo........................................................................................ 67
3.5.2 Extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii....................................... 68
3.5.2.1 Protocolos de extração (I) (Nitrogênio líquido)..................................................... 70
3.5.2.2 Protocolos de extração (II) (Fastprep® 1200)........................................................ 70
3.5.2.3 Quantificação protéica pelo método de Bradford (1976) e avaliação da
integridade da amostra........................................................................................ 71
3.5.3 Precipitação de proteínas............................................................................................. 72
3.5.3.1 TCA (ácido tricloroacético).................................................................................... 72
3.5.3.2 Acetona................................................................................................................. 73
3.5.3.3 TCA/Acetona......................................................................................................... 73
3.5.3.4 2D-Clean up kit (GE Healthcare, USA)…………………………...…...….………… 74
3.5.4 Análise dos resultados de extração e precipitação de proteínas.................................. 75
3.5.5 Eletroforese bidimensional............................................................................................ 75
3.5.5.1 Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão)........................................................ 76
3.5.5.2 Tratamento das tiras de pH imobilizado................................................................ 76
3.5.5.3 SDS-PAGE (Segunda dimensão)......................................................................... 76
3.5.6 Géis analíticos (Nitrato de prata).................................................................................. 77
3.5.7 Géis preparativos (Coomassie coloidal G-250)............................................................ 77
3.5.8 Aquisição e análise das imagens.................................................................................. 78
3.6 Imunoproteômica................................................................................................................ 79
3.6.1 Western Blot Bidimensional.......................................................................................... 79
4. RESULTADOS............................................................................................................................. 82
4.1 Características fenotípicas................................................................................................. 82
4.2 Influência da temperatura no crescimento fúngico......................................................... 83
4.2.1. Crescimento vegetativo................................................................................................ 83
4.2.2. Inibição do crescimento vegetativo.............................................................................. 101
4.3 Características microscópicas.......................................................................................... 118
4.4 Perfil bioquímico de assimilação de fontes de carbono................................................. 119
4.5 Taxonomia molecular......................................................................................................... 130
4.6 Taxonomia polifásica.......................................................................................................... 138
4.7 Epidemiologia do complexo Sporothrix schenckii no Brasil.......................................... 146
4.8 Análise Proteômica............................................................................................................. 149
4.8.1 Extração de proteínas de Sporothrix schenckii............................................................. 149
4.8.2. Análise proteômica das cepas de importância clínica e ambiental do complexo S.
schenckii...................................................................................................................... 153
4.8.3. Moléculas imunogênicas presentes no extrato precipitado de leveduras do
complexo S. schenckii................................................................................................ 160
5. DISCUSSÃO................................................................................................................................ 168
6. CONCLUSÕES............................................................................................................................ 199
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................ 201
8. APÊNDICE I................................................................................................................................. 231
– I –
RESUMO
RODRIGUES, A. M. Taxonomia polifásica e características proteômicas do
complexo Sporothrix schenckii. 2010. 241 f. Dissertação (Mestrado) –
Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, 2010.*
A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela
implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo.
Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem
sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo
termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No
entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade
genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta
informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de
espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161
cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do
Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento
vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em
meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as
características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia
molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus
calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem
uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição
na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano.
S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de
Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie.
Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados
de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína
entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar
o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as
proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram
transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas
principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram
que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com
um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no
perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas.
Palavras-chave: Sporothrix schenckii. Esporotricose. Taxonomia. Caracterização. Proteômica.
Imunoproteômica. Micologia.
* Orientador: Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo – UNIFESP.
– II –
ABSTRACT
RODRIGUES, A. M. Polyphasic taxonomy and proteomic features in the
Sporothrix schenckii complex. 2010. 241 p. Dissertation (Master) – Federal
University of São Paulo, São Paulo, 2010. *
Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic
implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since
1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been
attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus
that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as
S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic
species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic
taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161
strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse
regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth
on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the
assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic
features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the
sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S.
globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our
knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing
disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul
and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this
specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp.
isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the
cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major
antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular
proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then
incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and
linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens
from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies
reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile
differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here.
Key words: Sporothrix schenckii. Sporotrichosis. Taxonomy. Characterization. Proteomic.
Immunoproteomic. Mycology
* Advisor: Zoilo Pires de Camargo, PhD – UNIFESP.
– III –
Lista de Figuras
Figura 1: Triangulo da doença. As interações compatíveis entre um patógeno e o hospedeiro
apenas resultarão em doença quando forem atendidos os três fatores: patógeno, hospedeiro e
condições do ambiente (adaptado de van Baarlen et al., 2007 e Sullivan et al., 2005)................... 02
Figura 2: O complexo Sporothrix schenckii. As espécies crípticas do complexo S. schenckii são
indistinguíveis macroscopicamente, sendo empregadas as diferenças microscópicas,
características fisiológicas e metabólicas para a distinção clássica entre as espécies. A) S.
brasiliensis; B) S. schenckii; C) S. globosa; D) S. mexicana; E) S. albicans e F) S. luriei............... 08
Figura 3: Resolução taxonômica de algumas técnicas empregadas na taxonomia e sistemática
de fungos. As barras horizontais indicam o poder discriminatório de cada abordagem entre os
táxons (Adaptado de Bruns et al., 1991 & Vandamme et al., 1996)................................................ 20
Figura 4: Manifestações clínicas da esporotricose. Esporotricose linfocutânea (L); Esporotricose
cutânea fixa (F); Esporotricose disseminada (D)............................................................................. 25
Figura 5: Delineamento experimental. Caracterização proteômica do complexo Sporothrix
schenckii: Análise de proteínas diferencialmente expressas e proteínas imunogênicas de
isolados de S. schenckii, S. brasiliensis, S globosa e S. mexicana................................................. 44
Figura 6: Distribuição dos isolados depositados na coleção de cultura de Sporothrix spp. quanto
à forma clínica da doença provocada em humanos (A) ou a origem ambiental (B) e animal (C)... 52
Figura 7: Esquema do teste de assimilação utilizando microplacas de 96 orifícios. (A) Preparo
das placas contendo 150 µL do meio Yeast Nitrogen Base (Difco) complementado ou não com
os açúcares testes; (B) Preparo do inóculo de conídios em solução salina (0,85%) e
quantificação em espectrofotômetro a 520 nm. A suspensão é ajustada para uma absorbância
de 0,21–0,29 DO, a qual corresponde a um inóculo final de 2x105 a 2x10
6 UFC/mL; (C) Ensaio
de assimilação. São aplicados, em triplicata, 50 µL do inóculo da suspensão original de conídios
aos 150 µL do meio “C” complementado ou não com os diferentes açúcares testes (0,02 g/mL)
previamente distribuído. C -, controle negativo; C +, controle positivo; Raf, rafinose; Rib, ribitol;
Sac, sacarose................................................................................................................................... 61
Figura 8: Abordagem esquemática em proteômica diferencial. Mapas bidimensionais de
referência gerados a partir do antígeno celular total extraído de leveduras de Sporothrix
schenckii, S. brasiliensis, S. globosa e S. mexicana (n=3). As possíveis comparações entre as
imagens adquiridas dos géis provenientes das triplicatas experimentais são esquematizadas. As
análises comparativas de variações interespecíficas (→) são representadas pelas setas.
Abreviações: pI, ponto isoelétrico; mw, molecular weigth (massa molecular); Ss, Sporothrix
schenckii; Sb, Sporothrix brasiliensis; Sg, Sporothrix globosa; Sm, Sporothrix mexicana.............. 68
Figura 9: Protocolos de extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii (7 dias de
cultivo). Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de homogeneização das leveduras (em
suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45
segundos. Os protocolos 7 e 8 combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido
seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio e Uréia-Tiouréia
respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads
de vidro (0,5mm diâmetro). Após ruptura das células nos 8 protocolos, os lisados são
centrifugados a 15.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos. O sobrenadante (extrato bruto) é dosado
pelo método de Bradford, aliquotado e armazenados em freezer -80°C, até o momento do uso.
Aproximadamente 20 µg de amostra de cada protocolo são aplicados em um gel SDS-PAGE
69
– IV –
para verificação da integridade da amostra e do perfil de bandas gerados..................................... 69
Figura 10: Abordagem imunoproteômica. Comparação entre as formas clínicas da doença e as
espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii................................................................ 81
Figura 11: Detecção de proteínas imunogênicas com a técnica de Western-Blot. (A)
Transferência das proteínas fúngicas para uma membrana de nitrocelulose; (B) Incubação da
membrana com soro de paciente com esporotricose; (C) Incubação da membrana com um
anticorpo anti-IgG humana conjugado com peroxidase; (D) Incubação da membrana com
luminol; (E) e (F) Detecção dos spots imunogênicos com auxílio de filme fotográfico através da
impressão de pontos luminosos provenientes da reação de quimiluminescência entre a
peroxidase e o luminol..................................................................................................................... 81
Figura 12: Aspecto macroscópico de culturas do complexo S. schenckii em placas de Petri (9
cm diam.) em meio PDA (potato-dextrose-agar), após 21 dias de incubação à 30 °C. A) Ss 49 –
Cluster III (taxa de crescimento lento); B) Ss 139 – Cluster II (taxa de crescimento
intermediário); C) Ss 132 – Cluster I (taxa de crescimento rápido). Imagens reduzidas em 50%
do original......................................................................................................................................... 91
Figura 13: Análise de clusterização em função do crescimento vegetativo apresentado pelos
isolados do complexo Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas
temperaturas de 30, 35, 37 e 40ºC, em meio PDA, aos 21 dias de incubação, de acordo com o
coeficiente Euclidiano (método de ligação complete)...................................................................... 92
Figura 14: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado
pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,
agrupados de acordo com o estado de origem das cepas brasileiras de Sporothrix spp.
Distância Euclidiana (método de ligação complete)......................................................................... 96
Figura 15: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado
pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,
agrupados de acordo com a forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem
ambiental. Distância Euclidiana (método de ligação complete)...................................................... 99
Figura 16: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias (30, 35, 37 e 40
ºC) apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo S. schenckii de acordo com o
coeficiente Euclidiano (método de ligação complete)...................................................................... 101
Figura 17: Análise de clusterização baseado na inibição do crescimento vegetativo aos 21
dias de incubação em meio PDA, apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii
em função do diâmetro das colônias nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em relação à
temperatura de 30 ºC, de acordo com o coeficiente Euclidiano...................................................... 109
Figura 18: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo
apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e
40ºC em relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com o
estado de origem das cepas brasileiras. Distância Euclidiana (método de ligação complete)..... 112
Figura 19: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo
apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e
40ºC em relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com a
forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem ambiental. Distância Euclidiana
(método de ligação complete).......................................................................................................... 114
– V –
Figura 20: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo nas
temperaturas de 35, 37 e 40 ºC (em relação ao diâmetro obtido na temperatura de 30 ºC)
apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii, de acordo com o
coeficiente Euclidiano (método de ligação complete)...................................................................... 116
Figura 21: Inibição do crescimento dos isolados do complexo Sporothrix schenckii de acordo
com a origem geográfica dos isolados brasileiros (A e B), a origem humana (fixa e
linfocutânea), animal e ambiental (C e D) e a espécie filognética (E e F) a 35º e 37º C em
relação a temperatura de 30 ºC (21 dias de incubação). SE= Sudeste; S= Sul; CO= Centro-
Oeste; N= Norte; NE= Nordeste. (Barras: Valores máximos e mínimos)........................................ 117
Figura 22: Tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas brasileiras do complexo
Sporothrix schenckii. A) Conídios globosos de S. globosa (Ss06) diam.: 3,18 µm; B) Conídios
triangulares de S. schenckii (Ss 58) diam.: 3,2 µm; C) Conídios obovóides de S. mexicana (Ss
132) diam.: 3,13 µm; D) Conídios circulares de S. brasiliensis (Ss 10) diam.: 2,6 µm. Aumento
400X. Quadrantes em destaque 1000X........................................................................................... 118
Figura 23: Assimilação das fontes de carbono glicose (controle positivo), rafinose, ribitol e
sacarose após 10 dias de incubação a 25 ºC. O isolado Ss54 é capaz de assimilar apenas
glicose e fracamente ribitol, enquanto o isolado Ss131 é capaz de assimilar as quatro fontes de
carbono avaliadas. O controle negativo é representado apenas pelos conídios inoculados (2 x
105 a 2 x 10
6 UFC/mL) em meio YNB sem adição de fontes de carbono........................................ 120
Figura 24: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes
de carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii, após 05 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC. Coeficiente de
Jaccard (método de ligação average).............................................................................................. 126
Figura 25: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes
de carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii, após 10 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC. Coeficiente de
Jaccard (método de ligação average).............................................................................................. 129
Figura 26: Porcentagem de assimilação dos açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose pelas
cepas do complexo Sporothrix schenckii (n=170) após 5 e 10 dias de incubação.......................... 130
Figura 27: Extração de DNA de Sporothrix schenckii (1). Gel de agarose 0,8%, 100 v, 60
minutos. À esquerda, padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen, USA)............. 131
Figura 28: Amplicon do fragmento do gene da calmodulina (éxon 3-5), pela técnica de PCR, de
cepas representativas das espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii. (1) S.
schenckii (Ss 01); (2) S. brasiliensis (Ss 54); (3) S. globosa (Ss 06); (4) S. mexicana (Ss 131);
(5) controle negativo. Gel de agarose 1,2%, 80 v, 60 minutos. À esquerda padrão de peso
molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek, Canadá)............................................ 131
Figura 29: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento do gene da calmodulina
das espécies do complexo Sporothrix schenckii. Os sítios destacados em azul demonstram o
polimorfismo da sequência comparada entre as espécies S. schenckii (Ss01); S. brasiliensis
(Ss54); S. globosa (Ss06) e S. mexicana (Ss132) representadas no Brasil. CLC Sequence
Viewer 5, versão 5.1......................................................................................................................... 132
Figura 30: Distribuição dos isolados brasileiros do complexo Sporothrix schenckii após a
taxonomia polifásica de acordo com o estado de origem em que a cepa foi isolada. Os estados
em branco não possuem representantes estudados (A distribuição dos isolados dentro dos
148
– VI –
limites geográficos dos estados não representa a dispersão destes no território ou o ponto em
que foram isolados. No estado do Rio de Janeiro, por exemplo, todos os isolados estudados
são provenientes da região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro)........................................
148
Figura 31: Separação eletroforética por SDS-PAGE do extrato de proteínas de leveduras de
Sporothrix schenckii (Ss118), após 7 dias de cultivo em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um
inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida (10%) representativo da triplicata biológica
realizada para esta condição de cultivo. Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de
extração (2 µg de proteínas). Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein
Ladder (kDa).................................................................................................................................... 150
Figura 32: Perfis de bandas após a precipitação de proteínas. Aproximadamente 300 µg de
proteínas foram precipitadas utilizando Acetona, TCA, TCA/Acetona ou 2D Clean-up kit (GE
Healthcare) ressupensos em tampão de solubilização (uréia-tiouréia) e aplicados em gel de
SDS-PAGE (10%). Padrão de peso molecular Invitrogen – BenchMark Protein Ladder................ 151
Figura 33: Eletroforese bidimensional do extrato celular total do isolado Ss 118, resultante da
combinação do protocolo de extração através da maceração em nitrogênio líquido e
solubilização em tampão de extração tris-cálcio. Aproximadamente 300 µg de proteínas foram
precipitadas utilizando o 2D Clean-up kit (GE Healthcare), solubilizadas em tampão uréia-
tiouréia e aplicados em tiras de pH imobilizado (pH 4-7, 13 cm). Gel de poliacrilamida (10%)
representativo da triplicata biológica realizada. Padrão de peso molecular Invitrogen –
BenchMark Protein Ladder (kDa)..................................................................................................... 152
Figura 34: Perfil protéico de leveduras do complexo Sporothrix schenckii, após 7 dias de cultivo
em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida
(10%). Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de extração (2 µg de proteínas).
Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein Ladder. Coloração por nitrato de
prata................................................................................................................................................. 153
Figura 35: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix brasiliensis (Ss 54). Aproximadamente
300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16
cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein
Ladder.............................................................................................................................................. 156
Figura 36: Perfil proteômico de leveduras de S. globosa (Ss 06). Aproximadamente 300 µg de
proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).
Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein Ladder.... 156
Figura 37: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix mexicana (FMR 9108).
Aproximadamente 300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-
PAGE 10% (16 x 16 cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-
BenchMark Protein Ladder............................................................................................................... 157
Figura 38: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix schenckii (Ss 118). Aproximadamente
300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16
cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein
Ladder.............................................................................................................................................. 157
Figura 39: Imunoproteômica da cepa Ss 54 de S. brasiliensis. As proteínas do fungo S.
brasiliensis são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de
soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B)
forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana
162
– VII –
conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000) Revelação por
quimioluminescência........................................................................................................................
162
Figura 40: Imunoproteômica da cepa Ss 06 de S. globosa. As proteínas do fungo S. globosa
são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de soros de
pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma
linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana
conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência........................................................................................................................ 163
Figura 41: Imunoproteômica da cepa FMR 9108 de S. mexicana. As proteínas do fungo S.
mexicana são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de
soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B)
forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana
conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência........................................................................................................................ 164
Figura 42: Imunoproteômica da cepa Ss 118 de S. schenckii. As proteínas do fungo S.
schenckii são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em um pool de soros
de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma
linfocutânea. Soro diluído em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana
conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência........................................................................................................................ 165
– VIII –
Lista de Tabelas
Tabela 1: Classificação taxonômica do gênero Sporothrix.............................................................. 04
Tabela 2: Resumo das características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das espécies
filogenéticas do complexo S. schenckii............................................................................................ 11
Tabela 3: Representação dos principais gêneros de fungos de importância médica que
sofreram alterações na classificação nos últimos anos................................................................... 15
Tabela 4: Manifestações clínicas da esporotricose no hospedeiro humano (Lopes-Bezerra et al.,
2006)................................................................................................................................................ 23
Tabela 5: Código dos isolados, forma clínica da doença/ ou substrato ambiental e origem
geográfica das cepas de Sporothrix spp. depositados na micoteca do Laboratório de Mico-
Sorologia, Disciplina de Biologia Celular.......................................................................................... 46
Tabela 6: Isolados de referência do complexo Sporothrix schenckii, descritos em 2007 por
Marimon et al., depositados na coleção de culturas de fungos Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS), Utrecht, The Netherlands........................................................................ 51
Tabela 7: Resumo dos aspectos morfofisiológicos chaves para a diferenciação das espécies do
complexo S. schenckii. Adaptado de Marimon et al. (2007)............................................................ 51
Tabela 8: Marcador molecular utilizado para amplificação e sequenciamento do gene da
calmodulina, temperatura de anelamento e longitude do fragmento amplificado............................ 65
Tabela 9: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação
em diferentes temperaturas............................................................................................................. 84
Tabela 10: Diâmetro médio da colônia (mm) de isolados brasileiros cultivado em meio de
cultura PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas, de acordo com a origem
geográfica do isolado....................................................................................................................... 95
Tabela 11: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação
em diferentes temperaturas de acordo com a origem do isolado e a forma clínica da doença
desenvolvida no hospedeiro............................................................................................................. 97
Tabela 12: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação
em diferentes temperaturas de acordo com a espécie filogenética................................................. 100
Tabela 13: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo in vitro em meio PDA aos 21
dias de incubação nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em função de diferentes temperaturas..... 102
Tabela 14: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo em meio de cultura PDA aos 21
dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a origem geográfica do isolado.... 110
Tabela 15: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA aos 21
dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a origem do isolado e a forma
clínica da doença desenvolvida no hospedeiro................................................................................ 113
Tabela 16: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA aos 21
dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a espécie filogenética................... 115
Tabela 17: Resultados das provas fisiológicas de assimilação das fontes de carbono glicose,
rafinose, ribitol e sacarose para os conídios das cepas do complexo S. schenckii, após 05 e 10
dias de incubação a 25 ºC............................................................................................................... 120
– IX –
Tabela 18: Taxonomia molecular dos isolados do complexo Sporothrix schenckii baseados na
comparação da sequência de nucleotídeos entre o éxon 3-4 e 3-5 do gene da calmodulina......... 133
Tabela 19: Taxonomia polifásica das cepas do complexo Sporothrix schenckii utilizando
parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares....................................................................... 141
Tabela 20: Quantidade de proteínas extraídas de acordo com os protocolos de extração
avaliados.......................................................................................................................................... 150
Tabela 21: Resumo das características proteômicas das espécies do complexo S. schenckii...... 155
Tabela 22: Proteoma comparativo das espécies do complexo S. schenckii................................... 160
Tabela 23: Características moleculares experimentais das proteínas imunogênicas detectadas
na esporotricose humana................................................................................................................. 166
– X –
Lista de abreviaturas e símbolos
µg Micrograma M Molar
µl Microlitro mA Miliampere
ρmol Picomol MALDI-TOF
matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight
1D Unidimensional Mg Miligrama
2D Bidimensional mL Mililitro
BHI Brain Heart Infusion Mm Milímetro
BLAST Basic Local Alignment Search Tool mM Milimolar
BSA Bovine Serum Albumin MS Espectrometria de Massa
CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
MW Molecular weigth
CFU Colony Forming Unit NCBI National Centre for Biotechnology Information
cm Centímetros Ng Nanograma
CMA Corn Meal Agar OD Optical density
ConA Concanavalina A Pb Pares de bases
DNA Ácido desoxirribonucléico PBS phosphate buffered saline
dNTP Desoxirribonucleotídeo PCR Reação da polimerase em cadeia
DTT Ditiotreitol PDA Potato Dextrose Agar
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay pI Ponto isoelétrico
et al. “et allia” RNA Ácido ribonucléico
FMR Facultat de Medicina de Reus RPM Rotações por minuto
IEF Focalização isoelétrica SDA Sabouraud Dextrose Agar
Ig Imunoglobulina SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis
IPG Gradiente imobilizado de pH Ss Sporothrix schenckii
Kb Kilo base TCA Ácido tricloroacético
kDa kilo Dalton(s) Tm Temperatura de anelamento
Kg Quiilograma V Volts
µg Micrograma v/v Volume por volume
µl Microlitro YNB Yeast Nitrogen Base
® Marca registrada
1
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fungos de importância médica: Perspectiva geral
A vida na Terra é diversa e interativa: não foi descrito ainda nenhum
ecossistema contendo uma única espécie. As interações entre os organismos
podem ser de naturezas muito distintas, variando de benéficas, neutras a
prejudiciais. As doenças infecciosas são geralmente definidas como o resultado de
uma ou de um conjunto de interações prejudiciais, e comumente são restritas para
uma determinada combinação de hospedeiro (o doente) e patógeno (o agente
causador de doenças) (van Baarlen et al., 2007) (Figura 1). Estima-se que
aproximadamente 15 milhões, das 57 milhões de mortes mundiais estejam
relacionadas a doenças infecciosas (Morens et al., 2004).
Os primeiros fósseis de plantas terrestres e fungos apareceram entre 480 e
460 milhões de anos atrás (Heckman et al., 2001). Desde então as espécies
fúngicas evoluíram e adaptaram-se a viver em uma grande variedade de ambientes
e nichos ecológicos e, consequentemente, constituem atualmente, um grupo muito
diverso de organismos. Pouco mais do que 100.000 espécies foram identificadas até
o presente momento, todavia, isto significa apenas uma pequena parcela da
biodiversidade total das espécies fúngicas. De acordo com Sullivan et al. (2005)
estima-se que existam ao menos 1,5 milhões de espécies fúngicas habitando o
planeta Terra. Aproximadamente 150 a 200 espécies são capazes de provocar
doença em hospedeiro humano, as quais comumente são denominadas de micoses.
Robert & Casadevall (2009), consideram que a endotermia e a homeotermia
desenvolvidas por mamíferos e insetos respectivamente, são potentes defesas não-
específicas contra a maioria dos fungos. Tais adaptações fisiológicas de
manutenção da temperatura, embora dispendiosas para os hospedeiros, podem ter
2
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
favorecido a sobrevivência evolucionária destes contra o estabelecimento da
infecção.
Devido ao fato de poucos fungos serem essencialmente patógenos, o
mecanismo de patogênese tende a ser altamente complexo, resultando em grande
parte de adaptações pré-existentes de características de organismos com modo de
vida não parasitária (van Burik & Magee, 2001). Os fungos patogênicos têm
emergido como uma ameaça à saúde pública devido a expansão da população de
pacientes vulneráveis com algum déficit imunitário (Charlier et al., 2005) e a elevada
exposição a estes microrganismos em nosso ambiente, particularmente aos fungos
dimórficos sistêmicos que habitam amplamente o solo (Brandhorst et al., 2002).
Figura 1: Triangulo da doença. As interações compatíveis entre um patógeno e o hospedeiro apenas
resultarão em doença quando forem atendidos os três fatores: patógeno, hospedeiro e
condições do ambiente (adaptado de van Baarlen et al., 2007 e Sullivan et al., 2005).
No caso de algumas micoses em especial, observa-se com o passar do
tempo, o aumento do número de ocorrências, atingindo patamares epidêmicos assim
como o aumento da severidade com que essas doenças acometem o homem, em
pacientes não necessariamente imunocomprometidos. O tratamento é realizado por
3
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
longos períodos, com drogas muitas vezes agressivas, que produzem diversos
efeitos colaterais e resultados em grande parte insatisfatórios, acarretando em ônus
para a saúde pública.
Neste atual panorama, a micologia médica não pode valer-se apenas de
caracteres morfológicos, fisiológicos e bioquímicos isolados, para a classificação e
estudo da biologia dos fungos. Cada vez mais, torna-se necessário agregar novos
valores no âmbito da pesquisa. Neste contexto tem sido inestimável a contribuição
em conjunto de ciências como a ecologia, a epidemiologia, a imunologia, a genética
e a biologia molecular para o entendimento da complexidade que esta por trás das
interações destes microrganismos com o homem no século XXI.
A micologia médica, que há algumas décadas era considerada uma ciência
enigmática, caracterizada por infecções “exóticas” apresentada por pacientes na
rotina clínica, tem atualmente entrado na era genômica e proteômica.
1.2 Sporothrix schenckii Hektoen et Perkins 1900 e o complexo S.
schenckii
O patógeno mais importante da ordem Ophiostomatales é o fungo
dimórfico Sporothrix schenckii, o agente etiológico da esporotricose (Guarro et al.,
1999) (Tabela 1). O primeiro caso apresentado com o quadro clínico de
esporotricose foi relatado por Schenck em 1898 no Johns Hopkins Hospital em
Baltimore, EUA (Schenck, 1898, Rippon, 1982). O gênero Sporothrix foi proposto em
1900 por Hektoen & Perkins para o fungo isolado por Schenck dois anos antes.
Diversos sinônimos são descritos na literatura, dentre eles: Sporotrichum sp.
Smith 1898; Sporotrichum schenckii Matruchot 1910; Sporotrichum beurmanni
Matruchot & Ramond 1905; Sporotrichum asteroides Splendore 1909; Sporotrichum
equi Carougeau 1909; Sporotrichum jeanselmei Brumpt e Langeron 1910;
4
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Sporotrichum councilmani Wobach 1917; Sporotrichum grigsby Dodge 1935;
Sporotrichum fonsecai Filho 1930; Sporotrichum cracoviense Lipinski 1928;
Rhinocladium schencki Verdun e Mandoul 1924; Rhinotricum schenckii Ota 1928.
Tabela 1: Classificação taxonômica do gênero Sporothrix.
Reino Fungi
Divisão Ascomycota
Classe Sordariomycetes
Ordem Ophiostomatales
Família Ophiostomataceae
Gênero Sporothrix
Espécies S. schenckii; S. brasiliensis; S. globosa; S. mexicana; S. albicans; S. luriei
S. schenckii existe em todo o mundo, principalmente nas zonas temperadas
e tropicais (Esteves et al., 1990) e é um fungo termodimórfico, saprófito e geofílico,
comumente isolado de fontes ambientais como o solo e plantas. Este microrganismo
é responsável por causar uma infecção crônica na pele e tecido subcutâneo (Mehta
et al., 2007; Hay & Morris-Jones, 2008) a qual é adquirida principalmente por
implantação traumática deste patógeno (Hogan et al., 1996; Del Piero, 2003;
Benchekroun et al., 2008), sendo raros os casos de transmissão de pessoa para
pessoa (Carr et al., 1995).
O principal reservatório de fungos patogênicos para o homem é o solo
(Esteves et al., 1990) e este certamente não funciona como reservatório passivo de
esporos. Além do solo as plantas também são consideradas reservatórios naturais
de S. schenckii (Gumaa, 1989). O clima pode influenciar no desenvolvimento de S.
schenckii, o qual necessita de 95-100% de umidade relativa para seu
desenvolvimento (Mackinnon, 1949; Menges et al., 1952; Mackinnon, 1968).
5
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
A questão do estado teleomórfico de S. schenckii tem sido enfatizada em
estudos pela comparação de características fenotípicas e genotípicas de S.
schenckii e espécies ascígeras de Ceratocystis (Travassos, 1985). Certos
ascomicetos pertencentes ao gênero Ceratocystis são relacionados à S. schenckii
(Travassos & Lloyd, 1980).
Estudos realizados por Mariat (1969, 1971), Taylor (1970), Nicot & Mariat
(1973), Toriello & Mariat (1974), Bievre & Jourd’huy (1974), Bievre & Mariat (1975)
sugerem que o estado perfeito de S. schenckii se encontre no gênero Ceratocystis.
De acordo com Esteves et al. (1990) é conhecida a variante não sexuada de
Ceratocystis stenoceras, patogênica em modelo murino, muito semelhante à S.
schenckii. A divisão do gênero Ceratocystis tem sido proposta (Weijman & de Hoog,
1975), onde as espécies que apresentam conidiogênese endógena ou com estado
chalara são consideradas Ceratocystis sensu strictu, enquanto aquelas espécies
com conidiogênese exógena ou com estados Graphium-like foram classificadas
como Ophiostoma. As espécies ascígeras relacionadas à S. schenckii pertencem ao
gênero Ophiostoma (Travassos & Lloyd, 1980) embora algumas espécies do gênero
Ceratocystis produzam anamorfos indistinguíveis de S. schenckii (Travassos, 1985).
Estudos prévios de hibridização de DNA fornecem fortes evidências de que
O. stenoceras não é o teleomorfo de S. schenckii (Lopes-Bezerra et al., 2006).
Fundamentado na composição de bases do DNA e experimentos de hibridização,
Travassos & Lloyd (1980) sugerem que diferentes isolados de S. schenckii não
sejam os anamorfos de diferentes espécies do gênero Ceratocystis, mas que
possivelmente a espécie S. schenckii seja a forma homogênea imperfeita de uma
ainda não identificada espécie do gênero Ceratocystis (Travassos, 1985). De acordo
com Berbee & Taylor (1992) e de Meyer et al. (2008) a sequência de DNA do gene
ribossomal (18S) evidencia indiretamente que o teleomorfo de S. schenckii possa
6
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
pertencer ao gênero Ophiostoma (Ophiostomatales) e que provavelmente seja o
fungo não-patogênico O. stenoceras.
Os procedimentos habituais para a identificação de fungos baseiam-se no
exame da colônia (pigmentação superficial e inferior da colônia, topografia, textura e
taxa de crescimento) e morfologia microscópica (tamanho e forma dos macro e
microconídios, espiral, órgãos nodulares e ramificações), além de se valerem de
características como necessidades nutricionais e tolerância à temperatura.
Na natureza e/ou em cultura in vitro à temperatura ambiente S. schenckii é
um fungo filamentoso, enquanto que no tecido do hospedeiro e/ou em cultura in vitro
a 37 ºC existe como levedura.
Macroscopicamente, as colônias de S. schenckii são achatadas
apresentando crescimento lento, 4-15 mm em sete dias, em meio de ágar
Sabouraud à temperatura de 25° C (Summerbell, 2002). A colônia jovem exibe cor
variando de branca ao creme, de textura coriácea, com superfície sulcada. Algumas
amostras permanecem com a tonalidade creme, enquanto outras desenvolvem uma
coloração castanha escura a negra com o passar do tempo de cultivo. À temperatura
de 37 °C, o fungo semeado em ágar infusão de cérebro e coração (BHI), acrescido
ou não de sangue, transforma-se em colônia leveduriforme, de aspecto cremoso,
com coloração variando de branca a creme e com superfície irregular. A coloração
enegrecida apresentada por muitas culturas de S. schenckii tem sido atribuída à
presença do pigmento melanina (Romero-Martinez et al., 2000; Morris-Jones et al.,
2003; Madrid et al., 2010b) um reconhecido fator de virulência em fungos (Gómez &
Nosanchuk, 2003; Taborda et al., 2008). Fatores como diferentes concentrações de
pH e carboidratos podem ser responsáveis por afetar a produção de melanina in
vitro em S. schenckii (Almeida-Paes et al., 2009). A adição de tiamina e biotina aos
cultivos, bem como o fraco teor de CO2 facilitam a conversão da forma miceliana
para a leveduriforme (Lacaz et al., 2002).
7
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Microscopicamente, à temperatura de 25 °C verificam-se hifas delgadas,
hialinas, septadas e ramificadas, com conidióforos delgados em cujos ápices são
encontrados simpodulosporos hialinos, unicelulares, globosos a ovóides que nascem
em pequenos dentículos, ficando reunidos caracteristicamente em disposição floral
(lembrando margaridas) (Benade et al., 1997; Lacaz et al., 2002). As células
conidiogêneas surgem perpendicularmente à superfície das hifas. Elas são, por
vezes, terminais, cilíndricas, de 10-40 x 1-2 μm na maturidade, levemente
intumescidas, com ráquides simpodialmente compactas com fiálides semelhantes à
dentículos no ápice. Muitas vezes apresentam dentículos escassamente dispersos
ao longo da haste. Os conídios primários são formados em rosetas simpodiais sobre
o ápice dos conidióforos. Eles são obovóides (em forma de ovo, ligados por uma
terminação delgada), com dimensão de 3-6 x 1,5-3 μm (Summerbell, 2002). Os
conídios secundários são marrons escuros, geralmente subglobosos e medem cerca
de 3 μm de diâmetro. Em alguns isolados é comum a presença de conídios
triangulares ligados individualmente a dentículos nas hifas, especialmente em
cultivos em substrato sólido (ágar) (Summerbell, 2002). Os conídios desprendem-se
dos conidióforos, ficando por vezes dispostos um ao lado dos outros, enfileirados e
em ambos os lados da hifa.
Em esfregaço de cultura corado pelo método de Gram, o exame
microscópico de culturas leveduriformes revela a presença de células Gram-
positivas, globosas, ovais ou fusiformes (em forma de charutos) (Lacaz et al., 2002).
A transição para o estado dimórfico foi descrito por Howard (1961). A
conversão de fase pode ser obtida in vitro através do cultivo do fungo em meio
infusão de cérebro e coração (BHI). As colônias leveduriformes são brilhantes e
possuem coloração branca a creme. As leveduras medem de 3-10 x 1-3 μm com
brotos oboclavados (em forma de charuto). Brotos simpodiais formando pares são
tipicamente vistos (em forma de orelhas de coelho) (Summerbell, 2002).
8
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Figura 2: O complexo Sporothrix schenckii. As espécies crípticas do complexo S. schenckii são
indistinguíveis macroscopicamente, sendo empregadas as diferenças microscópicas,
características fisiológicas e metabólicas para a distinção clássica entre as espécies. A) S.
brasiliensis; B) S. schenckii; C) S. globosa; D) S. mexicana; E) S. albicans e F) S. luriei.
Estudos com diferentes isolados de S. schenckii relatam a existência de
variações fenotípicas entre as cepas. Estas diferenças incluem variações na
morfologia da colônia (Ghosh et al., 2002), no crescimento em diferentes meios de
cultura (Ghosh et al., 2002; Mendoza et al., 2005), na termotolerância (Marimon et
al., 2007; Fernandes et al., 2009b), na virulência em modelo murino (Nobre et al.,
2005; Kong et al., 2006; Brito et al., 2007; Arrillaga-Moncrieff et al., 2009), na
suscetibilidade às drogas antifúngicas (Marimon et al., 2008a), na secreção de
proteínas (Fernandes et al., 2009a) e na síntese de melanina (Romero-Martinez et
al., 2000; Almeida-Paes et al., 2009).
9
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
São diversos os relatos que comprovam a diversidade genética e
morfológica de isolados clínicos de S. schenckii. Smith & Batenburg-Van der Vegte
(1985) propuseram a heterogeneidade do gênero Sporothrix com base em estudos
de microscopia eletrônica evidenciado ao menos três padrões distintos de micro-
poros presente na membrana celular entre os septos.
A primeira indicação molecular de que a espécie S. schenckii aparenta ser
um complexo de espécies distintas foi proposto por Marimon et al. (2006) através da
análise filogenética combinada da sequência de DNA de três loci (Quitina sintase, β-
tubulina e Calmodulina) de sessenta isolados de S. schenckii de diversas regiões
geográficas. Os isolados foram agrupados em três “clusters” principais,
compreendendo um grupo de isolados europeus, um grupo apenas com isolados
brasileiros e um último grupo com isolados de países da América Latina e África.
Recentemente, Marimon et al. (2007) caracterizaram fenotipicamente e
genotipicamente 127 isolados previamente classificados como S. schenckii de
diversas regiões do mundo e propuseram além de S. schenckii, três novas espécies,
como agentes etiológicos da esporotricose com base nos perfis de assimilação de
açúcares (rafinose e ribitol), no diâmetro médio das colônias após crescimento nas
temperaturas de 20, 30, 35 e 37 °C, na morfologia dos conídios e nas sequências do
gene da calmodulina. As seguintes espécies foram propostas: S. brasiliensis, S.
globosa e S. mexicana. Em 2008, Marimon et al. propuseram que S. schenckii var.
luriei, uma variante morfológica de S. schenckii (patogênica ao homem e de
amplitude geográfica restrita) fosse elevado a espécie sendo denominado de S.
luriei.
Sporothrix stylites, S. humicola e S. lignivora foram descritos recentemente
como novos táxons dentro do gênero Sporothrix, baseados na sequência dos genes
LSU, ITS e -tubulina (de Meyer et al., 2008). Com base em sequências de LSU os
isolados de Sporothrix spp. de madeiras e de solo formam três distintos grupos
10
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
dentro do complexo O. stenoceras-S. schenckii. Estes grupos diferem quanto as
regiões geográficas e hospedeiros de que foram isolados. O fungo Sporothrix stylites
compreende o grupo de isolados provenientes de madeira de pinheiros em
Plettenberg Bay, e filogeneticamente relacionada com S. pallida. A espécie S.
humicola compreende os isolados provenientes do solo e que anteriormente eram
denominados por de Beer et al. (2003) como isolados ambientais de S. schenckii. S.
lignivora corresponde aos isolados de Eucaliptos de ambas localidades Saint Lucia e
Stellenbosch. Os isolados clínicos de S. schenckii formaram um grupo distinto dentro
da análise filogenética realizado por de Meyer et al. (2003) levando em consideração
o polimorfismo da sequência do gene LSU. As análises filogenéticas também
confirmaram a sinonímia de S. albicans e S. nivea com S. pallida.
Madrid e colaboradores (2010a) descreveram duas novas espécies
saprófitas dentro do gênero Sporothrix, a saber: S. brunneoviolacea e S.
dimorphospora. A espécie S. brunneoviolacea caracteriza-se fenotipicamente pela
produção de um pigmento violeta-marrom difuso na cultura in vitro.
Microscopicamente os conídios são globosos, pigmentados, com a presença de
blastoconídios laterais. S. dimorphospora, entretanto, não apresenta a produção do
pigmento característico em cultivos in vitro. Os conídios são basicamente
subglobosos a obovóides com a presença de blastoconídios laterais pigmentados.
Em contraste aos resultados obtidos para a cepa tipo de S. inflata, as espécies
descritas por Madrid et al. (2010a) são capazes de assimilar o açúcar rafinose como
única fonte de carbono. A tabela 2 resume as principais características fenotípicas e
genotípicas que possibilitam diferenciar as espécies filogenéticas de importância
clínica propostas por Marimon et al. (2007). Em virtude das recentes alterações que
ocorreram na taxonomia do agente etiológico da esporotricose é necessário rever a
concepção de espécie utilizada no estudo de fungos e como o emprego deste tem
sido alterado, aplicado e influenciado na prática clínica.
11
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Tabela 2: Resumo das características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas das espécies filogenéticas do complexo S. schenckii.
Características Espécies filogenéticas
S. brasiliensis S. schenckii S. globosa S. mexicana S. albicans S. luriei
Clado (genótipo) I II (IIa e IIb) III IV V –
Co
lôn
ia
(mm
)
30°C 15-38 23-34 18-40 66-69 62-71 51
35°C 10-22 14-30 6-16 10-11 27-29 35-36
37°C 5-10 3-9 0 1.5-2.5 2-5.5 21
40°C 0 0 0 0 0 0
Fo
nte
s
de
Ca
rbo
no
Rafinose Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo
Sacarose Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo
Ribitol Variável Variável Variável Variável Variável Positivo
Co
níd
io
Sim
po
dia
l Tamanho (µm) 2-6 x 1-4 3-6 x 1,5-3 2-5 x 1-3 3-5.5 x 2-2.5 - 4-10 x 1-2
Formato Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide Obovóide
Coloração Hialino a
subhialino Hialino a
subhialino Hialino a
subhialino Hialino a
Subhialino Hialino a
Subhialino Hialino
Sé
ss
il
Tamanho (µm) 2.5-5x2-3 3 2.5-4 x 2-3.5 3-4 x 2-2.5 - 4-10 x 1-2
Formato Globoso a subgloboso
Triangulares a cuneiformes
Globoso a subgloboso
Subgloboso, obovóides e elipsóide
Obovóides a elipsóide
Obovóide
Coloração Marrom a
Marrom escuro Marrom a
Marrom escuro Marrom a
Marrom escuro Marrom a
Marrom escuro Marrom a Marrom
escuro Hialino
MIC
- µ
g/m
l
(co
níd
io) Terbinafina 0.06–0.25 0.06–0.5 0.06–1 0.5 0.25–4 0.25
Itraconazol 0.5–2 1–32 1–32 32 32 1
Posaconazol 0.25–1 0.5–16 1–16 32 1–2 0.5
Anfotericina B 1–4 0.5–4 2–8 16–32 2–8 2
Virulência (modelo murino) OF-1 male mice
Alta Alta Intermediária Baixa Baixa Não testado
Informações baseadas nos trabalhos publicados na literatura por: Summerbell (2002); Marimon (2007); Marimon et al. (2007, 2008a,b); e Arrillaga-Moncrieff et al. (2009).
12
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.3 Conceitos de espécie em micologia
A natureza detesta categorias e de todas elas, uma das mais difíceis de
conciliar é a categoria de espécies biológicas (Lemke, 2001). Existem muitas
peculiaridades que são utilizadas na micologia tradicional e moderna que contribuem
para os estudos taxonômicos dos fungos. Estas incluem morfologia, anatomia,
bioquímica, sequenciamento de ácidos nucléicos, entre outras (Kurtzman, 1989;
Vinnere, 2004).
O conceito de espécie é a categoria fundamental utilizada em todas as
classificações biológicas (van Regenmortel, 1992) e a sua definição e aplicação é
sempre uma tarefa difícil (Valente et al., 1999). De um aspecto filosófico a questão
concentra-se na definição e delimitação do que é uma espécie em micologia,
enquanto que na perspectiva prática o problema esta centrado no reconhecimento
das espécies através das características morfológicas, fisiológicas e moleculares
apresentadas pelo grupo estudado.
A definição de espécie, seja para plantas superiores, animais, ou
microrganismos, tem sua base no princípio do isolamento genético. De acordo com
Mayr (1970), espécies são grupos de populações naturais intercruzantes, os quais
são isolados reprodutivamente de outros grupos. Basicamente, segundo
Dobzhansky (1976), membros de uma mesma espécie podem ser considerados
inférteis, enquanto que espécies geneticamente separadas podem não o ser.
Entretanto, até o final da década de 1960, a principal maneira pela qual era possível
definir espécie em leveduras baseava-se na avaliação subjetiva do mensuramento
de propriedades fenotípicas como a morfologia celular e resposta de crescimento em
várias fontes de açúcares entre outros compostos (Kurtzman, 1998).
O reino Fungi apresenta vários problemas na determinação das espécies,
pois pouco se sabe sobre a amplitude da variabilidade dentro das populações; os
13
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
ciclos de vida são diversos e complexos; e a reprodução (sexual e assexual) além de
extremamente complexa, pode afetar os padrões evolutivos de formas biológicas
que ainda não compreendemos (Petersen & Hughes, 1999).
Não existe um conceito de espécie único, universalmente reconhecido em
Biologia. De acordo com Nelson (1963) seria ingênuo insistir em uma definição de
espécie completamente exclusiva, porém dentro dos limites aceitáveis, um conceito
praticável é necessário. Tem feito pouca diferença se é teoricamente possível
determinar se duas populações compreendem espécies distintas, a menos que estas
espécies sejam delimitadas claramente o bastante para que outros pesquisadores
possam distingui-las com base nos caracteres definidos.
O que constitui uma espécie continua sendo o principal problema
taxonômico, independente da metodologia (Seifert et al., 1995). De acordo com de
Hoog et al. (2007) e Gräser et al. (2008), com o desenvolvimento recente de
ferramentas moleculares mais sensíveis para a identificação de espécies, tem-se
chegado sem dúvida à correta identidade do suposto agente infeccioso.
De acordo com Guarro et al. (1999) diferentes conceitos de espécie têm sido
utilizados pelos micologistas para definir as espécies fúngicas. Segundo Mayden
(1977), dentre os conceitos existentes os mais empregados são: conceito fenético ou
morfológico (morfológicos, fenotípicos), conceito biológico (cruzamentos) e conceito
cladístico (filogenética evolutiva).
Espécies microbianas podem ser definidas como um grupo ou táxon com
uma história evolucionária comum, e consequentemente, compartilham
características únicas (Simpson, 1951). O conceito morfológico de espécie
(fenético ou fenotípico) (MSC – morphological species concept) é um enfoque
clássico utilizado pelos micologistas. Neste conceito as unidades são definidas com
base nas características morfológicas idealizando as diferenças entre estas. O
conceito ecológico, que é baseado preferencialmente na adaptação a um habitat
14
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
particular do que o isolamento reprodutivo, tem sido geralmente adotado para a
classificação de fungos fitopatogênicos. O conceito biológico (BSC – biological
species concept), que foi desenvolvido antes do advento da análise filogenética
moderna, enfatiza a troca gênica (reprodução sexual e parasexual) entre as
espécies e a presença de barreiras que previnam o intercruzamento (cross-breeding)
de espécies. O conceito filogenético de espécie (PSC – phylogenetic species
concept) considera que os indivíduos que pertencem a uma espécie contêm todos
os descendentes de uma única população de ancestrais, ou seja, são monofiléticos.
Define-se espécie então como “o menor agrupamento diagnosticável de organismos
individuais dentro dos quais há um padrão de ancestralidade e descendência”
(Harrington & Rizzo, 1999). Assim, a premissa implícita no conceito filogenético é
que a classificação deve refletir a relação ramificada entre as espécies, a qual é
indicada por um cladograma.
O MSC é problemático porque pode ser de difícil aplicação para os
microrganismos crípticos que possuem diferenças fenotípicas indistinguíveis entre as
espécies relacionadas. O BSC baseado na incapacidade de intercruzamento exige o
entendimento dos requerimentos para a reprodução sexual, os quais são
desconhecidos para um grande número de fungos, incluindo Sporothrix. O PSC é
aplicável para todos os organismos e tem sido utilizado para caracterizar a
organização de espécies de diversos fungos de importância médica (Barker et al.,
2007) incluindo H. capsulatum (Kasuga et al., 2003), C. neoformans (Know-Chung &
Varma, 2006), P. brasiliensis (Matute et al., 2006; Teixeira et al., 2009), A. fumigatus
(Pringle et al., 2005), Coccidioides immitis (Koufopanou, 2001; Fischer et al., 2002),
Pseudallescheria boydii (Gilgado et al., 2005), Candida parapsilosis (Tavanti et al.,
2005), Fonsecaea nubica (Najafzadeh et al., 2010), Pneumocystis carinii (Beard et
al., 2000) entre outros. A tabela 3 resume algumas modificações taxonômicas que
ocorreram nos principais gêneros de fungos de importância médica.
15
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Tabela 3: Representação dos principais gêneros de fungos de importância médica que sofreram alterações na classificação nos
últimos anos.
Gênero Espécies
Evidências morfológicas e/ou moleculares Referência Representante do Gênero Espécies propostas
Coccidioides Coccidioides immitis Coccidioides immitis 9 Simple tandem repeats (STRs), 7 Single nucleotide
polymorphisms (SNPs); genômica comparativa. Fisher et al., 2002.
Coccidioides posadasii
Candida Candida albicans Candida albicans Cariótipo eletroforético, diferenças quanto à hibridização das
sondas 27A e Cd25, diferentes condições de crescimento. Sullivan et al., 1995.
Candida dubliniensis
Cryptococcus Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans Genômica comparativa (C. neoformans, H99 sorotipo A; C.
gattii, sorotipo B, isolado WM276 e R265)
Kwon-Chung et al., 2002.
Idnurm et al., 2005. Cryptococcus gattii
Paracoccidioides Paracoccidioides brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis Concordância genealógica para o reconhecimento de espécies
filogenéticas (GCPSR) utilizando 13 loci nucleares. Teixeira et al., 2009.
Paracoccidioides lutzii
Sporothrix Sporothrix schenckii
Sporothrix schenckii Análise multilócus de genes: calmodulina (CAL), quitina sintase
(CHS), β-tubulina (Bt2), ITS4, ITS5, 28S; diferentes padrões de
assimilação de fontes de carbono, diferentes padrões de
crescimento vegetativo em função da temperatura; morfologia
dos conídios e tipo de conidiogênese; diferentes padrões de
virulência em modelo murino, etc.
Marimon, 2007, Marimon
et al., 2006; 2007; 2008.
Arrillaga-Moncrieff et al.,
2009.
Sporothrix brasiliensis
Sporothrix globosa
Sporothrix mexicana
Sporothrix luriei
Fonsecaea Fonsecaea pedrosoi
Fonsecaea pedrosoi Perfil de AFLP, sequenciamento dos genes ITS e
sequenciamento parcial do gene de divisão do ciclo celular
(cdc42), β-tubulina (tub1) e actina (act1).
Najafzadeh et al., 2010. Fonsecaea monophora
Fonsecaea nubica
Trichosporon Trichosporon beigelli
Trichosporon cutaneum
Análise da ultra-estrutura dos poros entre os septos, % G-C,
hibridização de DNA, perfil nutricional, sequenciamento parcial
de DNA ribossomal (rDNA) da região 26S.
Guého et al., 1992; 1994.
Chagas-Neto et al., 2008.
Trichosporon asahii
Trichosporon asteroides
Trichosporon mucoides
Trichosporon inkin
Trichosporon ovoides
16
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Devido à biodiversidade do reino Fungi, a vasta abrangência de nichos e
habitats, assim como o desconhecimento do ciclo sexual do microrganismo na
natureza, torna-se necessário que sejam levados em consideração
concomitantemente os mais diversos aspectos da biologia do microrganismo quando
se tem interesse em propor novas espécies, tais como: diferenças morfológicas,
fisiológicas, virulência, manifestações clínicas, sensibilidade a antifúngicos, nicho,
polimorfismo gênico, entre outras, para que não sejam formados grupos ou táxons
artificiais.
1.4 Taxonomia polifásica de fungos patogênicos: Técnicas empregadas
para a classificação.
A sistemática é o estudo da diversidade biológica, mais especificamente, é a
ciência que descobre, descreve e classifica todos os organismos. A taxonomia, a
nomenclatura e a filogenia são todos ramos da sistemática. Estudos da sistemática
de fungos resultam na descoberta e descrição de novas espécies. Enquanto a
nomenclatura designa o nome do organismo, os estudos filogenéticos contribuem
para a classificação dos táxons em grupos geneticamente relacionados (Rossman &
Palm-Hernández, 2008). Todas as categorias taxonômicas devem ser monofiléticas
de um ponto de vista evolucionário (Valente et al., 1999). O sistema de taxonomia
fúngica atual é baseado no Código Internacional de Nomenclatura Botânica. Todas
as classificações fúngicas são designadas pelo homem e nenhuma está livre de
falhas (Wolf & Wolf, 1947a).
A taxonomia é uma ciência dinâmica que está associada com a síntese dos
dados obtidos da bioquímica, biologia celular, genética, morfologia e fisiologia em
um sistema de classificação útil e prático (McGinnis, 1980; Guarro et al., 1999).
Critérios taxonômicos tradicionais como a morfologia celular, o modo de brotamento,
17
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
a presença e o tipo de ciclo sexual e os esporos ainda são fundamentais para a
identificação do gênero. Outros testes utilizados para a classificação de espécie,
como os testes fisiológicos devem ser reconsiderados uma vez que muitas
limitações na taxonomia microbiana têm sido observadas nos últimos anos (Baleiras
Couto et al., 1994; Da Silva et al., 2007; Feau et al., 2009; Moriarty et al., 2009;
Žaloudíková et al., 2009; Alanio et al., 2010; Lu et al., 2010).
De fato, antes do uso rotineiro da taxonomia molecular, demonstrou-se que
mutações pontuais ocorrem em leveduras armazenadas por longos períodos de
tempo em coleções de culturas e que podem resultar em respostas
significantemente modificadas em testes fisiológicos. Sabe-se também que mesmo
quando métodos idênticos são empregados, os resultados podem variar de
laboratório para laboratório. Isto implica que diferentes conceitos têm sido aplicados
na taxonomia fúngica (Guarro et al., 1999).
A identificação de espécies crípticas fungos é ainda um desafio para os
micologistas. Dentro da micologia médica os testes laboratoriais são essenciais para
a identificação e o estabelecimento do diagnóstico das infecções fúngicas (Davey et
al., 1996). Os métodos utilizados são baseados em três enfoques: (1) detecção do
patógeno no tecido através do exame microscópico direto; (2) seu isolamento e
identificação em cultura; e (3) a detecção de uma resposta imunológica ao patógeno
(Davey et al., 1996; Yeo & Wong, 2002). A identificação e a classificação das
espécies de leveduras são muitas vezes difíceis quando baseadas apenas em
características fenotípicas (Meyer et al., 1997).
Variações fenotípicas das espécies fúngicas são comuns em níveis inter e
intra-específicos (Mitchell & Xu, 2003). A observação de caracteres fenotípicos
isolados em microrganismos pode levar a classificações errôneas, exigindo a
necessidade de métodos mais precisos de reconhecimento. O problema de
18
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
microrganismos assexuais leva à ampla aceitação dos métodos moleculares para a
delimitação de espécies.
As técnicas de biologia molecular fornecem muitas oportunidades para
determinar as relações de parentesco entre os organismos. A comparação de
macromoléculas, especialmente a reassociação de DNA nuclear (nDNA/nDNA) pode
ser utilizada para a discriminação de leveduras. Duas leveduras são consideradas
da mesma espécie se apresentarem uma taxa de reassociação superior a 80%
(Price et al., 1978). Porém, Vaughan-Martini & Martini (1996) demonstraram que
mesmo quando tudo é rigorosamente controlado experimentalmente, a semelhança
fenotípica não corresponde necessariamente à sinonímia (Vaughan-Martini &
Martini, 1996).
A atual revolução na biologia molecular tem fornecido subsídios e
refinamento às técnicas empregadas para identificar numerosos táxons de fungos de
importância médica, incluindo espécies patogênicas (Mitchell & Xu, 2003; Putignani
et al., 2010; Sidrim et al., 2010). Métodos baseados na técnica PCR oferecem novas
ferramentas que são diretamente aplicáveis à sistemática de fungos (Bridge & Arora,
1998). Muitos são os genes estudados até o presente momento, cujas sequências
são utilizadas como marcadores moleculares de fungos, como β-tubulina (Cabañes
et al., 2007; Balajee et al., 2009; Shinzato et al., 2009; Ferdman et al., 2009;
Peterson & Horn, 2009; Nalim et al., 2009; Huang et al., 2009), actina (Kawasaki et
al., 2008; Najafzadeh et al., 2009), quitina sintase (Kano et al., 2001; Cabañes et
al., 2007; Marimon et al., 2006; Kano et al., 2008; Ferdman et al., 2009; Horiuchi, et
al., 2009; Tintelnot et al., 2009), fator de elongação (EF-1a) (O'Donnell et al., 2008;
Liu et al., 2009a; Tintelnot et al., 2009), calmodulina (Hirata et al., 2007; Marimon et
al., 2007; O’Donnell et al., 2000; Balajee et al., 2009; Peterson & Horn, 2009), entre
outros.
19
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Técnicas como imunofluorescência (Camargo, 1974), eletroforese em campo
pulsado para análise do cariótipo (Tateishi et al., 1996) e RFLP mitocondrial (Takeda
et al., 1991; Ishizaki et al., 2009) têm sido utilizadas para identificação de isolados de
S. schenckii. Apesar do conhecimento de que nenhum método em particular é
suficiente para discernir entre duas espécies, muitos pesquisadores têm
desenvolvido uma tendência em superestimar os dados provenientes de análises
filogenéticas para classificar as espécies fúngicas.
Para superar esta premissa, uma abordagem polifásica foi proposta há
quatro décadas, visando a integração dos diferentes dados e informações sobre os
microrganismos e, essencialmente, indica um tipo de consenso na taxonomia.
O termo “taxonomia polifásica” possivelmente foi introduzido por Colwell
em 1970 para se referir a uma taxonomia que engloba diversos níveis de
informações, levando em consideração a síntese das características moleculares à
características ecológicas, incorporando porções de informações extraídas de um
sistema não homogêneo com o intuito de gerar sistema taxonômico
multidimensional. Este enfoque tem sido adotado em diversos estudos no campo da
micologia (Hong et al., 2005; Gräser et al., 2006; Samson et al., 2006; Balajee et al.,
2007; Samson & Varga, 2009).
De acordo com Samson & Varga (2009) o “padrão ouro” para a delimitação
de espécies deve levar em consideração o sequenciamento multilocus de genes
conservados (ITS, calmodulina, β-tubulina, actina, etc.), integrados à análise de
características morfológicas, fisiológicas e ecológicas. A figura 2 ilustra a resolução
de diversas técnicas comumente utilizadas no campo da micologia para a taxonomia
de fungos.
20
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Figura 3: Resolução taxonômica de algumas técnicas empregadas na taxonomia e sistemática de
fungos. As barras horizontais em azul indicam o poder discriminatório de cada técnica
entre os táxons (linhas verticais) (Adaptado de Bruns et al., 1991 e Vandamme et al.,
1996).
21
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.5 Esporotricose: uma micose reemergente
De uma perspectiva antropocêntrica, as doenças infecciosas podem ser
definidas como uma ação biológica que leva ao rompimento de um processo
fisiológico normal de um organismo multicelular na presença de um microrganismo
patogênico no corpo do hospedeiro. As doenças podem diferir quanto a sua
apresentação, porém são sempre precedidas pela infecção e colonização (van
Baarlen et al., 2007).
O desenvolvimento da civilização humana e o comércio global têm levado à
emergência e à circulação mundial de muitas doenças infecciosas (Keim & Wagner,
2009; Del Poeta, 2010). Atualmente, a ocorrência dos fungos termodimórficos que
há algumas décadas estava limitada a zonas temperadas e tropicais tem ampliado o
domínio biogeográfico, e observamos o aumento da frequência dos diagnósticos
destas micoses em países geograficamente distantes das áreas endêmicas. Este
evento é o resultado multifatorial de diversas mudanças biológicas e sociais, como o
avanço da medicina no século XXI e ao aumento das facilidades de rotas e do fluxo
migratório populacional entre áreas endêmicas e não endêmicas de micoses.
Poucos anos após a descrição do primeiro caso de esporotricose em 1898
por Schenck, um amplo espectro de doenças típicas foi apontado (Rippon, 1982). A
esporotricose é a micose subcutânea mais frequente em áreas urbanas, afetando
ambos os sexos, sem diferenças relacionadas à raça ou idade (Mendoza et al.,
2005). Esta doença tem distribuição mundial sendo principalmente encontrada em
regiões temperadas e tropicais (Ghosh et al., 2002) e comumente observada em
países da América Latina (Galhardo et al., 2008). Este patógeno é o único entre os
fungos dimórficos que não provoca tipicamente uma doença sistêmica (Hogan et al.,
1996). Esta micose é uma infecção crônica que algumas vezes assume proporções
epidêmicas (Alexopoulos & Mims, 1979).
22
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
A micose provocada por S. schenckii é também conhecida como doença de
Schenck ou doença de jardineiros de rosas (Devi et al., 2006). A esporotricose é
descrita como uma micose de risco ocupacional (Lima & Pereira Jr., 1981) para
floricultores (Avenel-Audran, 2009), pescadores (Haddad Jr. et al., 2002)
empacotadores, veterinários, cientistas (Thompson & Kaplan, 1977; Cooper et al.,
1992; Landell et al., 2010) entre outros profissionais que venham a ter contato com
musgos do gênero Sphagnum (Gastineau et al., 1941; González Benavides, 1952),
palha (González Benavides, 1952), objetos de madeira (Balabanoff et al., 1968)
espinhos (Del Piero, 2003) e solo, além de ser descrita como uma micose de risco
para pessoas que viajam à países tropicais (Zeegelaar & Faber, 2008). A maioria
das infecções ocorre devido a algum acidente cutâneo traumático no qual
propágulos de S. schenckii são introduzidos no tecido. A transmissão zoonótica
também é possível e diversos animais podem estar envolvidos (Del Piero, 2003).
Em algumas partes do Brasil estima-se que a esporotricose seja responsável
por 0,5% de todas as dermatoses (Sampaio et al., 1954). Esta doença é
especialmente comum no México (Lavalle, 1968) sendo considerada na cidade de
Guadalajara, a micose não cutânea mais prevalente.
A esporotricose humana pode ocorrer como diferentes formas clínicas,
dependendo da interação de dois fatores principais, como a integridade do sistema
imune do hospedeiro e as características biológicas do fungo. Devido às variadas
manifestações da doença em relação à topologia orgânica, a quantidade de lesões e
a severidade das mesmas, existem diversas classificações disponíveis na literatura.
Atualmente, a classificação mais adotada é baseada na revisão publicada por
Lopes-Bezerra et al. (2006) - Tabela 4.
23
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Tabela 4: Manifestações clínicas da esporotricose no hospedeiro humano (Lopes-
Bezerra et al., 2006).
1. Cutânea
Linfocutânea
Fixa
Disseminada ou múltipla
2. Mucosa
Ocular
Nasal
Outras
3. Extracutânea
Pulmonar
Osteoarticular
Meningite
Generalizada
4. Residual (Sequela)
5. Formas especiais
Regressão espontânea
Hipersensibilidade (eritema nodoso, eritema multiforme)
1.5.1 Esporotricose cutânea fixa
A esporotricose fixa é caracterizada pela presença de lesão única,
localizada, a qual pode aparecer na face, pescoço, tronco ou braços como uma
ferida ulcerativa, verrucosa ou papular (Gonzalez Ochoa, 1955) (Figura 3). De
acordo com Kwon-Chung (1975) esta forma clínica pode ocorrer como uma
reinfecção em pessoas que foram previamente sensibilizadas com o fungo, e o
agente etiológico é muitas vezes incapaz de crescer a temperaturas superiores a 35
°C. A esporotricose fixa pode ser um desafio para o diagnóstico clínico, mimetizando
uma série de outras doenças dermatológicas (Roldán-Marín et al., 2009).
24
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.5.2 Esporotricose linfocutânea
Após a implantação traumática do patógeno na derme e dependendo de
fatores como o tamanho do inóculo e a imunidade do hospedeiro, o período de
incubação é altamente variável, com uma média de aproximadamente 3 semanas
(Gumaa, 1989). A lesão inicial pode ter o aspecto de uma úlcera ou de um pequeno
nódulo subcutâneo, a pele varia de uma coloração enegrecida a avermelhada e,
posteriormente, adquire coloração negra (Gumaa, 1989) (Figura 3). As lesões
linfocutâneas são características da esporotricose (Pappas, 2003). Juntamente com
a forma cutânea fixa da doença constitui mais de 95% das ocorrências de
esporotricose (Campbell & Zaitz, 2004). Casos não tratados de esporotricose
linfocutânea podem tornar-se crônicos, mas algumas vezes a cura pode ocorrer
espontaneamente (Gumaa, 1989).
1.5.3 Esporotricose disseminada
A esporotricose pode acometer virtualmente qualquer órgão, manifestando-
se como uma doença disseminada (Pappas, 2003). A disseminação hematogênica
não é muito comum, mas algumas vezes pode ocorrer especialmente em pacientes
imunocomprometidos (Gumaa, 1989) ou com doenças associadas (Campbell &
Zaitz, 2004). Idade avançada, alcoolismo, diabetes, Cushing, corticoterapia
prolongada, AIDS, nefropatias entre outras são condições predisponentes ao
aparecimento desta forma clínica (Campbell & Zaitz, 2004). A esporotricose
disseminada é caracterizada por lesões múltiplas que inicialmente aparecem como
nódulos subcutâneos e então podem evoluir para pápulas, pústulas, úlceras ou
lesões úlcero-gomosas (Gumaa, 1989) (Figura 4).
25
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Figura 4: Manifestações clínicas da esporotricose. Esporotricose linfocutânea (L); Esporotricose
cutânea fixa (F); Esporotricose disseminada (D). Adaptado de: Mycology Online - The
University of Adelaide (www.mycology.adelaide.edu.au/); Montes et al. 2009
(www.dermato-santacasa.com.br); Carvalho et al. (2002).
26
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.6 Diagnóstico da esporotricose: da sorologia à detecção molecular
S. schenckii não é facilmente detectado por observação direta de espécimes
patológicos (Travassos & Lloyd, 1980), embora o diagnóstico laboratorial apóie-se
principalmente no estudo micológico das lesões (Esteves et al., 1990).
Nos exames histopatológicos podem ser observadas reações teciduais
granulomatosas mistas constituídas por células epitelióides, células gigantes,
linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e presença de microabscessos e granulomas. O
S. schenckii encontra-se sob a forma de corpúsculos redondos, ovais ou em
navetas, com 4 a 6 µm, e mais raramente na forma de “corpúsculos asteróides” que,
por sua vez, são estruturas fúngicas revestidas por imunoglobulinas (fenômeno de
Splendore-Hoeppli) (Sidrim & Moreira, 1999).
Diversos métodos sorológicos podem ser empregados como auxílio ao
diagnóstico da esporotricose, como por exemplo, a prova de aglutinação de Widal &
Abrami, reação de fixação do complemento, aglutinação em partículas de látex,
imunodifusão em gel, imunoeletroforese, ELISA e imunofluorescência (Nishikawa,
1975; Ripon, 1982; Sidrim & Moreira, 1999).
A esporotriquina é o antígeno para aplicação intradérmica, preparado com
filtrados de cultura da fase miceliana ou leveduriforme do S. schenckii (Campbell &
Zaits, 2004). A prova intradérmica com esporotriquina, quando positiva, constitui um
elemento adicional (Pappas, 2003), porém esta não pode fundamentar o diagnóstico
da micose (Esteves et al., 1990), uma vez que em áreas endêmicas um número
considerável de pessoas são reativas à esporotriquina sem apresentarem sinais
clínicos da doença (Pereira et al., 1962a,b; 1964; da Silva et al., 1963; Wernsdörfer
et al., 1963), devido provavelmente ao contato prévio do paciente com o patógeno
sem que se desenvolva a esporotricose.
27
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
A fração peptídeo-ramnomanana (CWPR) de S. schenckii tem sido utilizada
em testes intradérmicos (Lloyd & Bitton, 1971; Radentz & Elewski, 1992; Lima &
Lopes-Bezerra, 1997). Penha e Lopes-Bezerra (2000) aplicaram o teste de ELISA,
utilizando como antígeno o CWPR da parede celular do fungo. Os autores
observaram que a molécula fracionada (SsCBF – Sporothrix schenckii Con A Binding
Fraction), purificada por cromatografia de afinidade ligada a Con A, era altamente
específica para o diagnóstico da doença pelo teste de ELISA. O teste de ELISA,
utilizando exoantígeno bruto da fase micelial tem sido proposto por Almeida-Paes et
al. (2007).
A detecção molecular do patógeno é muito mais prática e rápida do que a
utilização de testes morfológicos, fisiológicos, bioquímicos ou sorológicos. Diversos
genes têm sido utilizados para a detecção molecular de S. schenckii. Kano et al.
(2001; 2003) desenharam as sequências de oligonucleotídeos iniciadoras
denominadas de S2 (5’-TGGGCGTCTACCAAGAGGGTATTGC-3’) e R2 (5’-
GCACATGGGCTCAAGATCAAAGGCC-3’) específicas para a o gene da quitina
sintase 1 de S. schenckii com o objetivo de realizar a detecção molecular do fungo
em biopsia de pacientes. Como resultado, a sensibilidade do teste de PCR foi
equivalente a detecção de até 10 pg de DNA genômico de S. schenckii.
Hu et al. (2003) empregaram a técnica de Nested-PCR utilizando como alvo
iniciadores específicos para a sequência do gene rRNA 18S, viabilizando a detecção
de DNA genômico de S. schenckii em amostras clínicas de pacientes. Este teste
permitiu o rápido diagnóstico de esporotricose assim como forneceu subsídios para
facilitar o diagnóstico de pacientes que tiveram o teste histoquímico ou a cultura
negativa do patógeno.
Kanbe et al. (2005), utilizaram as sequências de oligonucleotídeos
iniciadoras denominadas SSHF31 (5’-GCAGCCCACGTCCAACAAGACT-3’),
SSLF64 (5’-CATTAGATATTATCGGGGCCCAAGT-3’) e SSHR97 (5’-
28
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
GTCAGAGGTCTTATTGGACGTGA-3’) alvos para o gene da topoisomerase II. O
conjunto SSHF31/SSHR97 foi específico para S. schenckii, enquanto que o conjunto
SSLF64/SSHR97 foi específico para S. schenckii var. luriei. Os conjuntos de primers
utilizados por Kanbe et al. (2005) foram úteis para a rápida identificação de S.
schenckii em laboratório e distinção de espécies relacionadas.
1.7 Epidemiologia da esporotricose: uma micose de espectro mundial
Diversos fatores influenciam a epidemiologia das micoses, dentre eles: (i)
fatores biológicos como a virulência do fungo e a resistência do hospedeiro; (ii)
fatores ecológicos como a temperatura, a umidade relativa atmosférica, a radiação
ultravioleta, características geológicas, o bioma, a inter-relação com outros seres
vivos e (iii) fatores sócio-econômicos como o meio social, condições sanitárias, o
vestuário, a profissão, hábitos profiláticos, as migrações populacionais entre outros.
A incidência da esporotricose varia amplamente de país para país baseada
na observação de dados e relatos de casos (Pappas, 2003). A epidemia de
esporotricose que ocorreu nas minas de ouro do Transvaal, onde surgiram 2.825
casos de doença no homem, entre 1941 e 1944, contribuiu decisivamente para o
esclarecimento da ecologia do fungo. Foi possível isolar o fungo de vigas de
eucalipto das minas, do pavimento e mesmo dos pés dos trabalhadores sem
doença. Verificou-se que nas galerias a umidade atmosférica atingia valores de
100% ou muito próximos, que oferecia condições ótimas para o desenvolvimento do
fungo (Findlay, 1970). A fonte do surto foi atribuída à contaminação da mina por
madeiras que faziam o suporte das galerias subterrâneas (Gastineau et al., 1941).
Itoh et al. (1986) e Eisfelder et al. (1993) descreveram centenas de casos de
esporotricose humana diagnosticados no Departamento de Dermatologia do Hospital
da Universidade de Chiba no Japão durante os períodos de 1965 a 1983 e 1965 a
29
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1991, respectivamente. No estudo realizado até o ano de 1983 por Itoh et al. (1986)
haviam sido descritos aproximadamente 200 casos da doença, sendo que
aproximadamente metade dos indivíduos diagnosticados eram agricultores,
enquanto que no estudo realizado por Eisfelder et al. (1993) haviam 241 casos. A
diminuição do número de pacientes observados desde 1983 foi atribuída, segundo
Eisfelder et al. (1993), principalmente à queda no percentual da população local
envolvida na agricultura.
Kusuhara et al. (1988) relataram 150 casos de esporotricose atendidos no
Ambulatório de Dermatologia do Hospital Universitário de Kurume no Japão, durante
os anos de 1962 a 1986. A distribuição geográfica dos casos foi notável, estando
concentrados especialmente em torno dos rios Chikugo e Yabe, regiões de alta
umidade. A forma cutânea fixa da doença foi predominante, acometendo 85
pacientes, seguido da forma linfocutânea desenvolvida por 64 pacientes. Apenas um
paciente apresentou um caso atípico de esporotricose. As extremidades dos
membros superiores e a face foram as regiões mais afetadas pelas lesões.
Takenaka et al. (2009) relataram 155 casos de esporotricose, no período de
1951 a 2007 na província de Nagasaki, no Japão. As lesões foram frequentemente
observadas na face e membros superiores dos pacientes, sendo o tipo fixo da
doença a forma mais frequente, seguida da forma linfocutânea. Takenaka et al.
(2009) observaram ainda um aumento do número de pacientes de faixa etária
superior aos 50 anos com a doença.
Fukushiro (1984) resume os aspectos epidemiológicos e ecológicos da
esporotricose no Japão, atribuindo a algumas regiões do país as seguintes
características: i) incidência relativamente elevada; ii) aparecimento frequente de
infecções em estações frias; iii) predomínio da infecção no sexo feminino; iv)
predomínio da infecção em crianças e idosos; v) predileção de lesões no rosto das
crianças, assim como sobre a extremidade superior, no caso de pacientes
30
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
adolescentes e adultos; vi) ocorrência familiar e vii) alta frequência na demonstração
do parasita no tecido.
A incidência de micoses animais, especialmente a esporotricose, tem
aumentado recentemente no Japão e segundo Nakamura (2003) isto estaria
relacionado, em parte, a mudanças nos ambientes de vida humana e animal, para
uma relação mais próxima entre ambos. O número de micoses profundas tem
aumentado entre os animais velhos com o progresso da quimioterapia, imunoterapia
e prevenção na medicina veterinária (Nakamura, 2003).
Dixon et al. (1991) relatam uma grande epidemia de esporotricose em 1988
na América do Norte, envolvendo 84 casos em 15 estados, e atribui as condições
precárias de armazenamento do musgo do gênero Sphagnum como possível fonte
para dispersão do microrganismo. Cooper et al. (1992) demonstraram por meio de
técnicas de biologia molecular que existiam ao menos seis padrões distintos dentre
os isolados recuperados do evento epidemiológico descrito por Dixon et al. (1991).
Segundo Cooper et al. (1992) um padrão de DNA típico foi comum aos isolados
clínicos embora tenha sido diferente dos padrões exibidos pelos grupos II a VI. Os
últimos grupos (II a VI) descritos por Cooper et al. (1992) parecem formar um
conjunto heterogêneo, com alguns membros do mesmo grupo apresentando
diferentes padrões de DNA. Assim, os estudos de tipagem de DNA confirmaram que
o grupo I formado por isolados ambientais são indistinguíveis de isolados clínicos e
que os isolados pertencentes aos grupos II a VI representam um complexo de
fungos relacionados com anamorfo semelhantes à Sporothrix.
De acordo com Summerbell (2002), na América Central e do Sul, uma forma
não progressiva da doença, a esporotricose cutânea fixa, é especialmente vista em
pessoas que são repetidamente expostas ao patógeno, e que desta maneira
manifestam uma resposta imune que tende a prevenir a propagação linfocutânea.
31
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Devi et al. (2006) realizaram análise retrospectiva de casos de esporotricose
ocorridos no período de 1999 a 2005, em Manipur na Índia. No período de 6 anos
foram detectados 73 casos de esporotricose humana, dentre os quais 30 foram
confirmados por análise da cultura e 43 casos foram diagnosticados pela análise do
aspirado de lesão. A maioria dos pacientes pertencia à faixa etária de 21 a 40 anos,
com infecções acometendo predominantemente os membros superiores dos
indivíduos seguidos dos membros inferiores, sendo a esporotricose linfocutânea a
forma mais comum da doença seguida pela forma cutânea fixa. Este estudo revelou
o estado de Manipur como uma nova área endêmica para a esporotricose.
A esporotricose foi primeiramente relatada no Brasil em 1907 por Lutz &
Splendore. Desde então, outros casos têm sido descritos em diversos estados
brasileiros, como Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e São Paulo (Freitas et al.,
1965; Lopes et al., 1999, Fleury et al., 2001; Xavier et al., 2004; Lopes-Bezerra et al.,
2006; Madrid, 2007).
No Brasil, uma importante epidemia de esporotricose tem sido descrita na
região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro a partir de 1998, afetando seres
humanos, gatos e cães (em menor proporção) (Barros et al., 2001, 2004; Schubach
et al., 2004, 2006). A micose tem acometido principalmente indivíduos que habitam
áreas com condições sócio-econômicas desprivilegiadas e serviços de saúde
precários. No período de 1998 a 2004, um total de 759 pessoas, 1.503 gatos e 64
cães foram diagnosticados com esporotricose através do isolamento de S. schenckii
em diferentes tipos de amostras no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
(IPEC), Fiocruz-RJ (Lopes-Bezerra et al., 2006). Um levantamento recente
demonstra que o número de ocorrências duplicou na região (Barros et al., 2010).
Singer & Muncie (1952) relataram o primeiro caso de esporotricose felina
naturalmente adquirida em 1952. A primeira epidemia de esporotricose em
humanos, como resultado de transmissão zoonótica, foi identificada na cidade do
32
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Rio de Janeiro, em 1998 (Barros et al., 2008b). O período mais longo de
esporotricose infantil com transmissão zoonótica foi relatado por Barros et al.
(2008a) na cidade do Rio de Janeiro, entre 1998 e 2004, com o diagnóstico total de
81 casos de jovens com idade inferior a 15 anos.
Mais recentemente foi descrito na Austrália o aumento no número de casos
de esporotricose, que por métodos moleculares ficou demonstrado ser relacionado à
exposição ao fungo presente no feno (O’Reilly & Altman, 2006; Feeney et al., 2007).
S. schenckii é talvez, o agente de micoses humanas que se isola mais
frequentemente de plantas, detritos vegetais (Mackinnon et al., 1969) e solo (Criseo
& Romeo, 2010). As poeiras, o ar e a água são considerados meios de
disseminação (Esteves et al., 1990). São numerosas as observações que levam à
conclusão de que S. schenckii se associa no meio ambiente às plantas. Os dados
epidemiológicos e os estudos de distribuição na natureza são concordantes (Esteves
et al., 1990).
1.8 Análise proteômica
O transcriptoma, a proteômica, a metabolômica e seus aspectos
correlacionados formam uma fonte de dados integrados para o entendimento dos
sistemas biológicos (Panchaud et al., 2008). Análises proteômicas, podem ser
definidas como o estudo metódico das proteínas expressas por um genoma, célula,
tecido ou organismo (Bhadauria et al., 2007) em um estado biológico particular,
sendo uma poderosa ferramenta que pode proporcionar o entendimento sistemático
destes eventos molecularmente (Kim et al., 2007). A análise proteômica é
considerada segundo Cantú (2007) como uma área interdisciplinar da ciência, a qual
agrega principalmente química, biologia e informática.
Um fenótipo protéico é uma característica, segundo Thomas & VanBogelen
(2000) que pode ser observada através de métodos baseados na tecnologia
33
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
proteômica, tais como a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida e a
espectrometria de massa (MS). O fenótipo proteômico é determinado pelo estado do
sistema biológico em análise, sendo que o genótipo e o ambiente podem modificar
os fenótipos proteômicos. Utilizando metodologia proteômica, vários componentes
de fenótipos protéicos podem ser facilmente mensurados (Thomas & VanBogelen,
2000).
A análise detalhada do proteoma pode então levar à identificação de alvos
da doença, tratamento, ou desenvolvimento de vacinas (Rohrbough et al., 2007). A
análise proteômica provou ser extremamente importante para a micologia médica
(Murphy, 2007) fornecendo a rápida caracterização de proteínas envolvidas em
diversos processos biológicos como a interação parasita-hospedeiro, a resistência a
antifúngicos e no estudo da morfogênese de muitos fungos (Fernández-Arenas et
al., 2004; Asif et al., 2006; Ebanks et al., 2006; Thomas et al., 2006; Schmidt et al.,
2008; Martínez-Gomariz et al., 2009).
1.8.1 Eletroforese bidimensional de proteínas
A resolução de complexas amostras protéicas consiste basicamente na
eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (two-dimensional gel
electrophoresis, 2D-GE). Tradicionalmente, géis bidimensionais tem sido uma
ferramenta primária para a obtenção de um perfil de nível de expressão de um
proteoma sob várias condições (Zhu et al., 2003). Esta técnica foi desenvolvida
independentemente em 1975 por O’Farrell, a qual combina duas etapas de
fracionamento baseadas em um gel de poliacrilamida, composta por uma separação
inicial (primeira dimensão) com base em um gradiente de pH, onde as proteínas que
compõem a amostra migram horizontalmente até alcançarem o ponto isoelétrico (pI)
por meio de uma focalização isoelétrica (IEF). Uma segunda etapa de separação
(segunda dimensão) ocorre em função do estabelecimento de uma corrente elétrica
34
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
constante em um gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato sódio (SDS-PAGE),
onde as proteínas migram verticalmente em função de suas massas moleculares
(MM).
Muitas proteínas são modificadas pós-tranducionalmente e existem como
isoformas. Isso ocorre porque as proteínas podem existir em estados modificados e
não modificados, podendo conter diferentes números de um ou mais tipos de
modificações, e algumas modificações, como os carboidratos N e O-ligados, são
heterogêneos por natureza. Esta diferença no tipo e estequiometria das
modificações pode levar à presença de um grande número de produtos de proteína
para qualquer gene. Isto representa um enorme desafio para os pesquisadores que
desejem separar e visualizar isoformas distintas. A técnica que é mais útil para a
separação de isoformas de proteínas é o 2DE em gel de poliacrilamida (PAGE), que
separa as proteínas de acordo com a sua carga elétrica e massa molecular (Packer
et al., 2007).
1.8.2 Primeira Dimensão: Focalização Isoelétrica (IEF)
As proteínas são moléculas anfotéricas contendo grupos ácidos e básicos.
Estes se tornam protonados ou desprotonado dependendo do pH ambiente. No
ambiente básico, os grupos ácidos tornam-se negativamente carregados, em
ambiente ácido os grupos básicos tornam-se positivamente carregados. A carga
líquida de uma proteína é a soma de todas as cargas negativas ou positivas das
cadeias laterais dos aminoácidos. Quando um campo elétrico é aplicado, as
proteínas começarão a migrar para o eletrodo de sinal oposto da sua carga líquida.
No ponto isoelétrico (pI), a proteína tem carga líquida zero e deste modo encerra a
sua migração (López, 2007). A presença de ácidos nucléicos, particularmente DNA,
pode interferir com a focalização isoelétrica (IEF) na região ácida das tiras de IEF
(Berkelman, 2008).
35
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.8.3 Segunda Dimensão: SDS-PAGE
A segunda dimensão da 2DE separa as proteínas com base em sua massa
molecular aparente em um gel de poliacrilamida na presença de SDS. O
procedimento para a segunda dimensão não sofreu grandes alterações quanto à
metodologia para a IEF. Entretanto, para o SDS-PAGE alguns desenvolvimentos na
química e instrumentação tem contribuído para um melhor manuseio e
reprodutibilidade na posição dos spots (López, 2007).
Nesta etapa, grandes quantidades de SDS são incorporadas em um
complexo SDS-proteína na taxa de aproximadamente 1,4g de SDS/g de proteína.
Desta maneira, o SDS oculta a carga das proteínas e os complexos aniônicos
formados possuem carga elétrica líquida negativa por unidade de massa. Assim, a
mobilidade eletroforética das proteínas tratadas com SDS depende apenas do peso
molecular da proteína (López, 2007).
1.8.4 Detecção de proteínas
A detecção de proteínas em um gel de SDS-PAGE é um passo importante
para análise das proteínas (Kang et al., 2002). A visualização das proteínas ocorre
diretamente no gel após a coloração com corantes específicos como Coomassie
coloidal ou a prata. Cada ponto observado no gel (spot) corresponde a milhares de
cópias de uma proteína, as quais podem ser quantificadas de acordo com a
intensidade e área do respectivo spot. Existem diversos métodos para visualização
de spots de proteínas in gel. Protocolos utilizando Coomassie Brilliant Blue são
altamente compatíveis com a espectrometria de massas, porém são pouco sensíveis
quanto à detecção de proteínas. Existem diversas alternativas para aumentar a
sensibilidade de detecção empregando diferentes técnicas e diversos reagentes. As
36
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
colorações baseadas em nitrato de prata e Coomassie coloidal são as técnicas mais
utilizadas. O maior obstáculo encontrado para a utilização da técnica de detecção
pela prata é a incompatibilidade com os passos subsequentes de extração das
proteínas in gel para a espectrometria de massas. Como alternativa, destaca-se a
utilização do Coomassie coloidal, que embora seja menos sensível que a coloração
pela prata é mais sensível que o Coomassie Brilliant Blue e é compatível com os
passos subsequentes da espectrometria de massas.
1.8.5 Aquisição de imagens
O processo de fotodocumentação ocorre com a digitalização do gel em
scanner densitométrico e posterior análise por software específico como o Image
MasterTM 2D Platinum®. A comparação de diversos géis de diferentes proteomas
pode ser aplicada como uma importante ferramenta para detectar proteínas que são
expressas diferencialmente em função das distintas condições e estímulos testados.
1.8.6 Espectrometria de massas
A identificação de proteínas separadas em gel de poliacrilamida apresenta
inúmeras vantagens quando comparado às técnicas gel-free (Shevchenko et al.,
2006). Dentre as principais vantagens observadas pode ser citada a possibilidade de
observação de alterações quantitativas e qualitativas na expressão de proteínas,
assim como a observação de modificações pós-traducionais e a comparação de
inúmeras situações testes.
Nos últimos 20 anos ocorreram avanços extraordinários na tecnologia de
espectrometria de massas. Tais avanços fizeram com que a análise do proteoma de
uma amostra biológica qualquer transpusesse o efeito contemplativo criado até
37
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
então e as alterações observadas no proteoma pudessem ser analisadas. Isto tem
influenciado no estabelecimento da ciência proteômica.
Duas formas de ionização de proteínas e peptídeos são amplamente
utilizadas, o Electrospray Ionization (ESI) e a Ionização dessorção assistida por
matriz (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – MALDI), e estes estão
acoplados com uma variedade de detectores e analisadores de massas (Wilkins &
Appel, 2007).
1.9 Importância da proteômica no estudo de patógenos humanos
Os estudos de proteômica têm produzido detalhadas listas de proteínas
presentes nas células (Robinson et al., 2007) e na última década, tem sido notável
os avanços na tecnologia de proteômica (Cravatt et al., 2007). Segundo Oberg et al.
(2008), proteínas que possuem a expressão aumentada/diminuída entre dois ou
mais grupos de interesse são consideradas candidatas a biomarcadores.
Biomarcadores podem ser definidos como uma característica que é objetivamente
medida e avaliada como indicador de um processo biológico normal, um processo
patogênico ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica (Atkinson et
al., 2001).
Trichophyton rubrum é o dermatófito mais comum entre os agentes de
micose de pele humana. A esporulação assexual é um eficiente meio de propagação
do patógeno. Leng et al. (2008) em estudo do proteoma do conídio deste patógeno,
identificaram 1.026 proteínas, sugerindo que o proteoma do conídio de T. rubrum é
consideravelmente complexo. Algumas das proteínas identificadas estão
relacionadas à sobrevivência e dispersão enquanto outras estão relacionadas com a
germinação conidial e resposta a condições ambientais, sendo importantes para o
monitoramento e germinação do conídio em condições favoráveis.
38
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
Xi et al. (2007) estudaram a expressão diferencial de proteínas durante as
fases de micélio e levedura no fungo termodimórfico Penicillium marneffei e
relataram mais de 500 proteínas que demonstraram perfis de expressão diferencial
entre as duas fases. Chandler et al. (2008) demonstraram que durante a fase
parasítica de P. marneffei ocorre aumento na expressão de proteínas relacionadas
ao choque térmico (heat shock protein), ao metabolismo geral e à biossíntese da
parede celular ao estudarem o dimorfismo neste fungo.
Diversos estudos de proteômica têm sido realizados com fungos do gênero
Aspergillus e nos últimos anos foram publicados 10 trabalhos, os quais, de acordo
com Kim et al. (2008) realizaram a identificação de 28 proteínas de superfície, 102
proteínas secretadas e 139 proteínas intracelulares.
Com o objetivo de entender a patogênese fúngica em pacientes com
inflamação da córnea, “ceratites” e refinar o tratamento existente, Ananthi et al.
(2008) analisaram o perfil protéico da lágrima de pacientes infectados com fungos,
utilizando géis bidimensionais para separação e fracionamento de proteínas. Ao
comparar o perfil de pacientes infectados com controles não infectados foi possível
evidenciar 63 spots nos dois géis. A proteína Glutaredoxina, cuja expressão é
relacionada ao estresses oxidativo em Aspergillus, estava expressa apenas em
amostras de lágrimas de pacientes infectados, permanecendo ausente em amostras
controle. De modo interessante detectou-se níveis mais elevados da expressão da
Glutaredoxina em amostras de pacientes com ceratites provocada por Aspergillus do
que amostras de pacientes com ceratites provocada por Fusarium, podendo de
algum modo esta proteína estar relacionada ao processo patofisiológico de ceratites
micóticas.
Os estudos de proteômica diferencial têm levado de fato à melhor
compreensão da biologia de patógenos importantes como T. rubrum, P. marneffei,
Aspergillus, Fusarium entre outros.
39
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
1.10 Imunoproteômica: importância dos marcadores sorológicos de
doenças
A imunoproteômica pode ser definida como a combinação de qualquer
tecnologia proteômica com a presença de dados imunológicos (Falisse-Poirrier et al.,
2006). A imunoproteômica é uma forma rápida e prática de buscar moléculas
imunogênicas que possam servir como biomarcadores de doença ou fornecer
subsídios para o entendimento da patogênese.
A técnica de Western blot é geralmente empregada na pesquisa clínica
(Hayes et al., 1989). A proteômica combinada com Western blot (imunoproteômica)
e técnicas de espectrometria de massas tem sido reconhecida como uma ferramenta
proveitosa para a identificação de proteínas de interesse no desenvolvimento de
vacinas (Poobalane, 2007), no estudo de proteínas imunogênicas entre outros.
O imunoblot é amplamente utilizado para detectar e comparar os níveis
relativos de uma proteína de interesse particular em uma célula, soro e outros
materiais biológicos (Krajewski et al., 1996). Atualmente na micologia médica
diversos trabalhos têm empregado esta combinação de técnicas para compreender
a resposta imunológica do hospedeiro aos antígenos fúngicos, detectando
principalmente anticorpos circulantes produzidos na resposta imune humoral (da
Fonseca et al., 2001; Tarcha, 2006; Gautam et al., 2007; Jobbins et al., 2010).
1.11 Justificativa
Nas últimas duas décadas tem-se presenciado o retorno das doenças
infecciosas como uma das principais causas de mortes humanas e da diminuição da
qualidade de vida dos pacientes. Dentre os fatores que contribuem para este quadro
destacam-se a presença de organismos mais resistentes à drogas, o surgimento de
40
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
novos patógenos e/ou re-emergentes e o aumento no número de pacientes
imunocomprometidos como aqueles com AIDS, câncer ou ainda aqueles que
sofreram transplante de órgãos. Deste modo, torna-se crucial o entendimento da
biologia dos fungos patogênicos, como a fisiologia e aspectos moleculares assim
como o aprofundamento do conhecimento das interações patógeno-hospedeiro.
Durante muito tempo a esporotricose foi descrita como uma doença de baixa
incidência no Brasil, no entanto, relatos recentes mostram que não só o número de
casos descritos vem aumentando como a incidência de formas clínicas mais graves
ou atípicas da doença vem ocorrendo com maior frequência (Lopes-Bezerra et al.,
2006).
Com o advento e a diminuição dos custos de técnicas moleculares que estão
cada vez mais acessíveis à pesquisa, como a reação da polimerase em cadeia
(PCR) e o sequenciamento de genomas inteiros, um verdadeiro boom de espécies
novas tem sido propostas na literatura. Nesta era molecular, a análise multilocus de
polimorfismo gênico tem sido uma ferramenta importante para propor a divisão de
espécies de fungos. Marimon et al. (2007) propuseram três novas espécies de
interesse clínico na esporotricose. Esta, entre outras publicações recentes,
despertou nosso interesse em estudar a epidemiologia destas espécies no Brasil e
as moléculas imunogênicas destes novos patógenos. Diversas perguntas e
hipóteses foram formadas dentre elas: Qual a importância clínica da diferenciação
das espécies consideradas agentes etiológicos da esporotricose? Quais as
diferenças intra e interespecíficas dos proteomas destes fungos? Essas possíveis
diferenças refletem proteínas imunogênicas distintas? Alguma proteína poderia ser
utilizada como biomarcador da espécie? Os diferentes quadros clínicos
apresentados por pacientes refletem a infecção por diferentes espécies? Sporothrix
schenckii está relacionado com todas as manifestações clínicas da doença ou
estaria relacionado com uma forma em particular e o mesmo raciocínio se
41
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Introdução
empregaria as demais espécies do complexo e as diferentes manifestações clínicas
da doença?
Os estudos de caracterização bioquímica das proteínas imunogênicas
expressas por S. schenckii são escassos. Até o momento, a proteína melhor
caracterizada é uma glicoproteína de 70 kDa (gp70) com função de adesina. A
análise proteômica é uma forma global de identificar e caracterizar proteínas
envolvidas em processos biológicos. Informações sobre níveis de expressão,
organização estrutural, localização celular e modificações pós-traducionais
permitirão a ampla caracterização dos alvos funcionais envolvidos nos mecanismos
de colonização e patogenicidade. A utilização desta poderosa ferramenta de análise
diferencial de proteínas foi proposta neste trabalho com o intuito de identificar
proteínas diferencialmente expressas pelas quatro espécies do complexo S.
schenckii que possam servir como marcadores biológicos, sendo importantes para a
utilização em testes clínicos sorológicos de detecção do patógeno no hospedeiro
como Western blot ou ELISA. Aliado a isto, o conhecimento de proteínas
diferencialmente expressas nas formas clínicas da doença poderá levar ao
conhecimento de moléculas importantes como futuros alvos terapêuticos.
42
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Objetivos
2. OBJETIVOS
Tendo em vista a importância clínica do S. schenckii como patógeno
humano e animal, a necessidade do desenvolvimento de técnicas mais rápidas de
identificação e de uma maior compreensão dos aspectos de sua biologia,
patogênese, e epidemiologia, o presente trabalho tem como objetivo geral contribuir
para o a compreensão do complexo S. schenckii no Brasil buscando evidências
moleculares de variações intra e interespecíficas através de análise molecular e
proteômica comparativa entre as espécies S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e
S. schenckii. Com esta finalidade foram estabelecidos os seguintes objetivos
específicos:
Reclassificar os 161 isolados, inicialmente depositados em nossa
micoteca como pertencentes à espécie S. schenckii, de acordo com os
padrões morfológicos, fisiológicos e moleculares apresentados pelas
cepas em testes de assimilação de fontes de carbono, crescimento
vegetativo em meio PDA, microcultivo e sequenciamento parcial do gene
da calmodulina;
Descrever a distribuição das novas espécies filogenéticas do complexo S.
schenckii em território brasileiro;
Analisar a influência da temperatura no crescimento in vitro de cepas de
Sporothrix spp., buscando uma correlação entre a origem geográfica, a
forma clínica da doença e a espécie filogenética;
Analisar com auxílio de ferramentas de bioinformática o polimorfismo do
fragmento de 800 pb do gene da calmodulina de cepas de diferentes
origens geográficas;
Padronizar a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) para o extrato
celular total (levedura) e selecionar uma cepa representante de cada
43
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Objetivos
espécie do complexo S. schenckii (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis
e S. mexicana) para análise proteômica comparativa, com base no perfil
da doença e da origem geográfica do patógeno;
Buscar proteínas diferencialmente expressas pelas espécies do complexo
S. schenckii (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis e S. mexicana)
através da comparação entre os mapas de proteoma (pH 4-7) das
espécies estudadas;
Comparar o perfil de detecção de anticorpos da esporotricose humana,
utilizando soros de pacientes com a forma cutânea fixa e linfocutânea,
através da técnica de 2D- Western blot e analisar as possíveis diferenças
dos perfis das proteínas imunogênicas evidenciadas entre as diferentes
espécies.
44
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Objetivos
2.1 Delineamento experimental
Figura 5: Delineamento experimental. Caracterização proteômica do complexo Sporothrix schenckii:
Análise de proteínas diferencialmente expressas e proteínas imunogênicas de isolados de
S. schenckii, S. brasiliensis, S globosa e S. mexicana
45
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cepas de Sporothrix spp. utilizadas e condições de cultivo
Cento e sessenta e um (161) isolados de Sporothrix spp. provenientes de
amostras clínicas e ambientais (Figura 6) oriundas de diversas regiões do Brasil e de
outros países foram estudadas (Tabelas 5 e 6). Estes microrganismos encontram-se
depositados na Micoteca do laboratório de Micologia Médica do Prof. Dr. Zoilo Pires
de Camargo, na UNIFESP. As culturas dos isolados são mantidos em tubos de
ensaio inclinados com 10-15 mL de meio SDA (Sabouraud-dextrose-agar) (DIFCO) a
temperatura ambiente. A manutenção dos isolados é realizada trimestralmente
através de repiques para novos tubos.
3.2 Caracterização fenotípica
A taxonomia clássica em micologia médica tem por fundamento a análise de
características morfológicas e fisiológicas para a classificação dos fungos. Diferentes
testes laboratoriais morfológicos, fisiológicos e bioquímicos foram realizados para a
caracterização fenotípica dos 161 isolados de Sporothrix spp. Os resultados obtidos
foram comparados com as características consideradas peculiares de cada nova
espécie do complexo, resumidas na tabela 7 e/ou aplicados nos passos da chave
dicotômica descrita por Marimon et al. (2008).
46
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Tabela 5: Código dos isolados, forma clínica da doença/ ou substrato ambiental e
origem geográfica das cepas de Sporothrix spp. depositados na micoteca do
Laboratório de Micologia Médica, Disciplina de Biologia Celular.
Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País
Ss 01 Gato Linfocutânea São Paulo SP Brasil
Ss 02 Humano Fixa Porto Alegre RS Brasil
Ss 03 Humano Fixa Porto Alegre RS Brasil
Ss 04 Humano Fixa Porto Alegre RS Brasil
Ss 05 Gato Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 06 Humano Fixa Belo Horizonte MG Brasil
Ss 07 Humano Disseminada Belo Horizonte MG Brasil
Ss 08 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 09 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 10 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 11 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 12 Humano Fixa Belo Horizonte MG Brasil
Ss 13 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 14 Humano Disseminada Belo Horizonte MG Brasil
Ss 15 Humano Linfocutânea Belo Horizonte MG Brasil
Ss 16 Humano Linfocutânea Teresina PI Brasil
Ss 17 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 19 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil
Ss 20 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 21 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil
Ss 22 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 24 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 25 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 26 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 27 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil
Ss 28 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 30 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 31 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 32 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 33 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil
Continua...
47
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Continuação...
Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País
Ss 34 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 35 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 36 Humano Linfocutânea Curitiba PR Brasil
Ss 37 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 38 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 39 Humano Fixa Curitiba PR Brasil
Ss 40 Humano Fixa Fortaleza CE Brasil
Ss 41 Humano Fixa Fortaleza CE Brasil
Ss 42 Humano Fixa Fortaleza CE Brasil
Ss 43 Humano Fixa Fortaleza CE Brasil
Ss 44 Humano Linfocutânea Fortaleza CE Brasil
Ss 45 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 46 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 47 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 48 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 49 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 50 Humano Linfocutânea Goiânia GO Brasil
Ss 51 Humano Fixa Belém PA Brasil
Ss 52 Humano Fixa São Paulo SP Brasil
Ss 53 Gato Linfocutânea Rio Grande RS Brasil
Ss 54 Gato Linfocutânea Rio Grande RS Brasil
Ss 55 Humano Linfocutânea Rio Grande RS Brasil
Ss 56 Humano Linfocutânea Rio Grande RS Brasil
Ss 57 Humano Linfocutânea Rio Grande RS Brasil
Ss 58 Humano Fixa Botucatu SP Brasil
Ss 59 Humano Linfocutânea Botucatu SP Brasil
Ss 60 Humano Linfocutânea Botucatu SP Brasil
Ss 61 Solo Isolado ambiental Botucatu SP Brasil
Ss 62 Humano Linfocutânea Vila Velha ES Brasil
Ss 63 Humano Linfocutânea Vila Velha ES Brasil
Ss 64 Humano Linfocutânea Vila Velha ES Brasil
Ss 65 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
48
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Continuação...
Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País
Ss 66 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 67 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 68 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 69 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 70 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 71 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 72 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 73 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 74 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 75 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 76 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 77 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 78 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 79 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 80 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 81 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 82 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 83 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 84 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 85 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 86 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 87 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 88 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 89 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 90 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 91 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 92 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 93 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 94 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 95 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 96 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 97 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 98 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
49
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Continuação...
Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País
Ss 99 Humano Linfocutânea Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 100 Humano Fixa Rio de Janeiro RJ Brasil
Ss 101 Humano Linfocutânea Bauru SP Brasil
Ss 102 Humano Linfocutânea Bauru SP Brasil
Ss 103 Humano Linfocutânea Bauru SP Brasil
Ss 104 Humano Linfocutânea Cuiabá MT Brasil
Ss 105 Humano Linfocutânea Uberaba MG Brasil
Ss 106 Humano Linfocutânea Uberaba MG Brasil
Ss 107 Humano Linfocutânea Uberaba MG Brasil
Ss 109 Humano Fixa Uberaba MG Brasil
Ss 110 Humano Fixa Uberaba MG Brasil
Ss 111 Humano Fixa São Paulo SP Brasil
Ss 112 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil
Ss 113 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil
Ss 114 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil
Ss 115 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil
Ss 116 Humano Fixa Ribeirão Preto SP Brasil
Ss 117 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 118 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 119 Humano Extracutânea Campinas SP Brasil
Ss 120 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 121 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 122 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 123 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 124 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 125 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 126 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 127 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 128 Humano Fixa Campinas SP Brasil
Ss 129 Humano Linfocutânea - SP Brasil
Ss 130 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 131 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 132 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
50
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Conclusão...
Isolado Hospedeiro Forma Clínica Cidade Estado País
Ss 133 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 134 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 135 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 136 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 137 Humano Linfocutânea Recife PE Brasil
Ss 138 Humano Linfocutânea João Pessoa PB Brasil
Ss 139 Humano Linfocutânea João Pessoa PB Brasil
Ss 140 Humano Linfocutânea João Pessoa PB Brasil
Ss 141 Humano Linfocutânea Brasília DF Brasil
Ss 143 Humano Linfocutânea Belém PA Brasil
Ss 144 Humano Linfocutânea - RS Brasil
Ss 145 Humano Linfocutânea - RS Brasil
Ss 146 Humano Linfocutânea Manaus AM Brasil
Ss 147 Humano Linfocutânea Manaus AM Brasil
Ss 148 Humano Linfocutânea São Paulo SP Brasil
Ss 149 Humano Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 150 Humano Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 151 Cão Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 152 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 153 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 154 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 155 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 156 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 157 Gato Linfocutânea Pelotas RS Brasil
Ss 158 Humano Fixa Manaus AM Brasil
Ss 159 Humano Linfocutânea - - Japão
Ss 160 Humano Linfocutânea - - México
Ss 161 Humano Linfocutânea - - México
Ss 162 Vegetal Isolado ambiental - - México
Ss 163 Humano Fixa - - Peru
Ss 164 Humano Fixa - - Peru
Ss 167 Solo Isolado ambiental - - Peru
Ss 168 Humano Fixa - - Peru
51
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Tabela 6: Isolados de referência do complexo Sporothrix schenckii, descritos em
2007 por Marimon et al., depositados na coleção de culturas de fungos
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Utrecht, The Netherlands.
Isolados1 Espécie Hospedeiro País
Código FMR Outro Código
FMR 8309 CBS 120339 S. brasiliensis Humano Brasil
FMR 8314 IPEC 16919 S. brasiliensis Humano Brasil
FMR 8600 CBS 120340 S. globosa Humano Espanha
FMR 8595 FMR 8595 S. globosa Humano Espanha
FMR 9108 CBS 120341 S. mexicana Isolado ambiental México
FMR 9107 CBS 120342 S. mexicana Isolado ambiental México
FMR 8939 CBS 302.73 S. albicans Isolado ambiental Reino Unido
FMR 8803 KMU 4217 S. albicans Isolado ambiental China
FMR 6618 CBS 359.36 S. schenckii Humano EUA
FMR 9018 UTHSC 99-173 S. schenckii Humano EUA
FMR 9280 CBS 937.72 S. luriei Humano África
1Todos os isolados tipo descritos para o complexo Sporothrix schenckii foram gentilmente cedidos pelo Dr. Josep Guarro e pela
Dra. Josepa Gené, da Universitat Rovira i Virgili (URV), Facultat de Medicina i Ciències de la Salut de Reus, Unitat de Microbiologia, Reus, Espanha. FMR: Facultat de Medicina de Reus; CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands; IPEC: Instituto de Pesquisa Evandro Chagas, Rio de Janeiro, Brasil; KMU: Kanazawa Medical University, Ishikawa, Japan. UTHSC: Fungus Testing Laboratory, University of Texas Health Science Center.
Tabela 7: Resumo dos aspectos morfofisiológicos chaves para a diferenciação das
espécies do complexo S. schenckii. Adaptado de Marimon et al. (2007).
Espécie
Presença de conídios
pigmentados sésseis
Colônias em PDA a 30 °C excedem 50
mm em 21 dias
Crescimento a 37 °C
Teste de assimilação
Sacarose Rafinose
S. brasiliensis Sim Não Sim – –
S. luriei Não Não Sim – –
S. globosa Sim Não Não + –
S. mexicana Sim Sim Sim + +
S. schenckii Sim Não Sim + +
S. albicans Não Sim Sim + –
52
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Figura 6: Distribuição dos isolados depositados na coleção de cultura de Sporothrix spp. quanto à
forma clínica da doença provocada em humanos (A) ou a origem ambiental (B) e animal
(C).
53
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Chave taxonômica para a classificação das espécies do complexo Sporothrix
schenckii. (Adaptado de Marimon et al., 2007; 2008b).
1. Assimilação de sacarose negativa...............................................................2
Assimilação de sacarose positiva.................................................................3
2. Colônias em PDA a 35 °C não excedem 30 mm de diâmetro em 21 dias,
conídios sésseis e pigmentados presentes, conídios simpodiais de 2 a 6
µm de ....................................................................................S. brasiliensis
Colônias em PDA a 35 °C excedem 30 mm de diâmetro em 21 dias;
conídios sésseis pigmentados ausentes, conídios simpodiais de 4 a 10 µm
de longitude.......................................................................................S. luriei
3. Colônias em PDA a 30 °C excedem os 50 mm de diâmetro aos 21
dias...............................................................................................................4
Colônias em PDA a 30 °C não excedem os 50 mm de diâmetro aos 21
dias...............................................................................................................5
4. Assimilação de rafinose positiva; colônias em CMA a 30 °C apresentam
coloração marrom em duas semanas.......................................S. mexicana
Assimilação de rafinose negativa; colônias permanecem incolores em
CMA a 30 °C em duas semanas.................................................S. albicans
5. Assimilação de rafinose negativa; temperatura máxima para o crescimento
vegetativo é 35 °C; conídios sésseis pigmentados, globosos ou
subglobosos.................................................................................S. globosa
Assimilação de rafinose positiva; temperatura máxima para o crescimento
vegetativo é 37 °C; conídios sésseis pigmentados predominantemente de
outra forma................................................................................S. schenckii
54
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.2.1 Ensaios morfológicos
Diversos aspectos fenotípicos são utilizados em micologia como
características auxiliares para a caracterização macro e microscópica de fungos de
importância médica. Dentre estes, os mais importantes são: o formato, a coloração,
a ornamentação, a disposição e o arranjo dos conídios; a coloração, a textura e o
diâmetro da colônia; a coloração, o diâmetro e os septos apresentados pelas hifas,
etc. Deste modo, realizamos a caracterização morfológica de 161 cepas de
Sporothrix schenckii de origem humana, animal e ambiental, levando em
consideração os caracteres descritos na Tabela 7.
3.2.1.1 Microcultivo
A análise morfológica através da visualização das estruturas vegetativas do
fungo como hifas, conidióforos e conídios foi realizada através do microcultivo dos
isolados em lâmina pela técnica de Riddell (1950). A técnica consiste em semear
amostras do fungo em delgadas camadas de meio de cultura sobre lâminas estéreis,
posterior posicionamento de uma lamínula sobre o meio e o armazenamento em
câmara úmida. Após 10 dias de incubação a 30°C em meio de Agar batata (PDA,
DIFCO), as lamínulas foram removidas suavemente, a fim de não danificar as
estruturas vegetativas assim como a disposição das mesmas. O fungo aderido à
lamínula foi corado com lactofenol para facilitar a visualização das estruturas
fúngicas. As lâminas foram observadas em microscópio óptico (OLYMPUS BX50,
Japan) acoplado a uma câmera fotográfica digital (Sony DXC-107A, CCD-Iris Color
Video Camera, Japan). As principais características morfológicas como a presença
ou ausência de conídios sésseis, a pigmentação, a disposição, a forma e o tamanho
longitudinal dos conídios foram registradas. Para a estimativa do tamanho dos
55
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
conídios a partir das imagens capturadas foi utilizado o software Image-Pro® Express
versão 5.1 para Windows (Media Cybernetics, Inc., USA) mensurando-se
longitudinalmente ao menos 20 conídios em 5 campos distintos, perfazendo um total
de 100 amostras por isolado. Após mensurar os conídios, calculou-se o valor médio
do diâmetro. Algumas cepas mais representativas foram escolhidas para a
fotodocumentação em microscópio óptico.
3.2.1.2 Crescimento vegetativo em meio CMA (Corn Meal
Agar)
O crescimento em meio CMA é importante, de acordo com Marimon et al.
(2007; 2008) para a distinção entre as espécies S. mexicana e S. albicans. A
obtenção de culturas marrons ou incolores após a incubação do fungo a 30 °C
durante 14 dias pode ser utilizada como característica taxonômica.
Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados previamente em meio PDA,
a temperatura ambiente, durante 10 dias antes de serem realizados os ensaios de
crescimento vegetativo em meio CMA. Fragmentos de micélio de aproximadamente
1 mm de diâmetro foram inoculados assepticamente no centro de placas de Petri (5
cm de diâmetro) vertidas com o meio CMA. As placas foram identificadas e
incubadas em triplicata a 30 °C durante 14 dias. Após este período, a coloração
apresentada por cada isolado foi avaliada por dois examinadores, com a intenção de
evitar uma classificação individual.
56
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.2.2 Ensaios fisiológicos
3.2.2.1 Crescimento vegetativo em função das
temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C
De acordo com Marimon et al. (2007) as temperaturas de incubação
discriminatórias para a comparação durante o crescimento vegetativo destes
patógenos correspondem as faixas de 30, 35 e 37 °C.
Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados em meio PDA, a
temperatura ambiente, durante 10 dias, antes de serem realizados os ensaios de
crescimento em função da temperatura. Fragmentos de micélio aproximadamente 1
mm de diâmetro foram inoculados assepticamente no centro de placas de Petri de 9
cm de diâmetro vertidas com 20 mL de meio PDA. As placas foram identificadas,
vedadas com filme plástico pvc e incubadas em triplicata nas temperaturas de 30,
35, 37 e 40 °C. Após 21 dias de incubação foram escolhidas duas colônias mais
uniformes e o crescimento vegetativo foi avaliado mensurando-se o diâmetro da
colônia (mm) em dois sentidos ortogonais, com o auxílio de um paquímetro digital
(150 x 0.01mm, King Tools, Ltda), e calculando-se a média das duas medidas. Os
dados obtidos foram comparados com os dados da Tabela 7 e/ou aplicados nos
passos da chave dicotômica.
3.2.2.2 Influência da temperatura na inibição do
crescimento
Os dados obtidos para o diâmetro das colônias de Sporothrix spp, descritos
no item anterior (3.2.2.1) foram comparados entre as diferentes temperaturas de
incubação a fim de se verificar a influência da temperatura na inibição do
57
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
crescimento fúngico. A taxa de inibição foi calculada para as temperaturas de 35, 37
e 40 °C em relação ao diâmetro obtido para a temperatura de 30 °C utilizando-se a
seguinte equação (1) descrita por Mesa-Arango et al. (2002):
(1)
Em que:
% IC = porcentagem de inibição do crescimento;
DC = diâmetro da colônia em mm.
3.2.2.3 Análise de clusterização e análise estatística
Os valores de diâmetro médio das colônias em milímetros obtidos para os
ensaios de crescimento vegetativo nas temperaturas de 30, 35 e 37 °C foram
analisados conjuntamente através da análise de clusterização hierárquica dos casos
(cepas), utilizando a distância Euclidiana para o cálculo de similaridade entre os
perfis de crescimento vegetativos apresentados pelas cepas e o método de ligação
completo para a formação dos grupos. Este algoritmo permite o agrupamento de
todas as distâncias em pares de objetos em diferentes clusters para decidir quão
distantes eles são.
Os valores obtidos para a inibição do crescimento vegetativo, em
porcentagem, nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, foram utilizados
concomitantemente para a análise de clusterização hierárquica utilizando os
mesmos parâmetros descritos acima. Os cálculos, a construção e a visualização dos
dendogramas foram realizados utilizando-se o software SYSTAT 13, versão
13.00.05 (Chicago, IL, USA).
58
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Os dados obtidos dos isolados quanto ao crescimento vegetativo e inibição do
crescimento foram submetidos à análise estatística, com o intuito de verificar se
existiam diferenças entre os isolados relacionadas à origem geográfica. O mesmo foi
feito quando os isolados foram agrupados por espécie filogenética, origem clínica
humana ou animal. Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA / teste de
Tukey utilizando o software GraphPad (GraphPad Prism v. 5.00 para Windows, San
Diego California USA, www.graphpad.com), considerando estatisticamente
significante quando p < 0.05.
3.2.2.4 Efeito fungistático e fungicida da temperatura no
crescimento fúngico
Com o objetivo de avaliar se a temperatura atua sobre o crescimento fúngico
como um fator fungistático, capaz apenas de inibir o crescimento fúngico ou como
um fator fungicida capaz de inviabilizar as células fúngicas após a incubação in vitro,
o seguinte experimento foi realizado: as cepas de Sporothrix spp. foram inoculadas
centralmente em placas de Petri de 5 cm de diâmetro e incubadas durante 21 dias a
40 ºC. Decorrido o tempo de incubação avaliou-se o diâmetro médio das colônias
com auxílio de um paquímetro. As mesmas culturas foram então incubadas
novamente, porém à temperatura de 28 ºC, durante 14 dias. Após a incubação, o
diâmetro da colônia foi avaliado com auxílio de um paquímetro digital (150 x
0.01mm, King Tools, Ltda).
59
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.2.3 Ensaios bioquímicos
3.2.3.1 Assimilação de fontes de carbono, segundo
protocolo de Marimon et al. (2007)
Para a prova de assimilação de carboidratos foram utilizados conídios de
Sporothrix spp.
3.2.3.1.1 Preparo das microplacas de assimilação
Adicionou-se em tubos Falcon estéreis o meio de cultura Yeast Nitrogen Base
(Difco) e um dos açúcares testes (Glicose, Rafinose, Ribitol, Sacarose) na
concentração final de 2%. Os solutos foram suspensos em água MilliQ®. Como
controle negativo do teste, utilizou-se uma solução contendo apenas o meio Yeast
Nitrogen Base (Difco) sem a adição de qualquer fonte de carbono. Após a
dissolução completa dos solutos, a solução resultante foi esterilizada por filtração
utilizando-se filtros Millipore 0,22 µm de diâmetro. Optou-se por não autoclavar os
meios a fim de evitar a degradação dos açúcares.
Após a esterilização, foram distribuídos em triplicata 150 µL de cada um dos
meios de cultura individualmente em regiões distintas de microplacas de fundo chato
de 96 oríficios (Corning Costar Corporation) (Figura 7a).
3.2.3.1.2 Preparo do inóculo fúngico
Os isolados de Sporothrix spp. foram cultivados previamente à temperatura
ambiente, em tubos inclinados contendo meio PDA durante 10-14 dias. Os conídios
foram coletados adicionando-se à superfície das culturas 2-3 mL de solução salina
60
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
estéril (0,85%). Os tubos foram agitados suavemente a fim de promover a liberação
dos conídios na solução. A suspensão foi recuperada com auxílio de uma pipeta
Pasteur e filtrada em gaze estéril a fim de se obter uma preparação contendo
apenas conídios, removendo resquícios de meio de cultura e fragmentos de hifas.
Procedeu-se a quantificação dos conídios em espectrofotômetro (Tecan
Sunrise, Grödlg, Austria) utilizando-se o software Magellan CE v.1.3.5. Cinquenta
microlitros (50 µL) da suspensão foram adicionados, em duplicata, a uma microplaca
de fundo chato de 96 orifícios (Corning Costar Corporation). A leitura foi realizada
em um comprimento de onda de 520 nm (A520) e a suspensão ajustada para a
absorbância de 0,21 – 0,29 DO (Densidade Ótica) que corresponde a um inóculo
final de 2 x 105 a 2 x 106 UFC/mL (Figura 7b).
A viabilidade dos conídios foi verificada concomitantemente ao experimento,
semeando-se 100 µL da suspensão original dos conídios em placas de Petri (5 cm
de diâmetro) contendo o meio PDA e incubada a temperatura ambiente por 10 dias.
3.2.3.1.3 Inoculação, incubação e leitura dos resultados
Os ensaios de assimilação foram realizados inoculando-se, em triplicata, 50
µL da suspensão de conídios aos 150 µL de meio de cultura de cada tratamento
previamente descrito (Figura 7c). Após inocular os conídios procedeu-se a leitura
das microplacas em espectrofotômetro, no tempo zero, num comprimento de onda
ajustado em 520 nm (A520). As placas foram incubadas em estufa, a 25 °C, durante
10 dias, sendo realizadas leituras durante o quinto e o décimo dia de incubação sob
as mesmas condições de absorbância.
61
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Figura 7: Esquema do teste de assimilação utilizando microplacas de 96 orifícios. (A) Preparo das
placas contendo 150 µL do meio Yeast Nitrogen Base (Difco) complementado ou não com
os açúcares testes; (B) Preparo do inóculo de conídios em solução salina (0,85%) e
quantificação em espectrofotômetro a 520 nm. A suspensão é ajustada para uma
absorbância de 0,21–0,29 DO, a qual corresponde a um inóculo final de 2x105 a 2x10
6
UFC/mL; (C) Ensaio de assimilação. São aplicados, em triplicata, 50 µL do inóculo da
suspensão original de conídios aos 150 µL do meio “C” complementado ou não com os
diferentes açúcares testes (0,02 g/mL) previamente distribuído. C -, controle negativo; C +,
controle positivo; Raf, rafinose; Rib, ribitol; Sac, sacarose.
3.2.3.1.4 Avaliação dos resultados de assimilação
O valor médio das absorbâncias obtido para as triplicatas dos tratamentos
com glicose (controle positivo) e sem açúcar (controle negativo) foi calculado e
utilizado para a comparação com os demais tratamentos (rafinose, ribitol e
sacarose). Assim, consideramos assimilação positiva para determinado açúcar teste,
o tratamento que apresentasse absorbância média semelhante ao controle positivo
ou superior ao valor obtido para o controle negativo.
Os resultados obtidos no quinto e décimo dia de incubação para as variáveis
testadas foram transformados em dados binários, atribuindo-se o valor “0” para
ausência de crescimento (assimilação negativa) e o valor “1” para presença de
crescimento (assimilação positiva). Estes dados foram utilizados para a construção
de dendogramas distintos. As variáveis testadas foram avaliadas
62
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
concomitantemente, utilizando-se o coeficiente de Jaccard para a análise da
distância métrica entre os perfis de assimilação, e o método de ligação Average para
a formação dos clusters. Este algoritmo permite o agrupamento de todas as
distâncias em pares de objetos em diferentes clusters para decidir quão distantes
eles são. Os mesmos parâmetros foram adotados para avaliar os resultados
referentes a 10 dias de incubação. Os cálculos, a construção e a visualização dos
dendogramas foram realizados utilizando-se o software SYSTAT 13, versão
13.00.05 (Chicago, IL, USA).
3.3 Taxonomia Molecular
As quatro espécies do complexo Sporothrix (S. brasiliensis, S. globosa, S.
mexicana e S. schenckii), recentemente propostas por Marimon et al. (2007), tiveram
como principal base molecular para sua diferenciação o polimorfismo na sequência
de nucleotídeos de um fragmento do gene da calmodulina (CAL). As sequências de
nucleotídeos geradas pelo grupo espanhol no referido trabalho, estão depositadas e
disponíveis para o acesso no Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.
html). A partir desta informação, realizamos a taxonomia molecular das cepas de
Sporothrix spp. com base na comparação das sequências obtidas para nossos
isolados com as sequências depositadas no Genbank.
3.3.1 Extração de DNA genômico de leveduras de Sporothrix
spp.
Células leveduriformes dos isolados de Sporothrix spp. foram cultivadas em
meio BHI ágar (DIFCO) com o pH ajustado em 8,0, a 37 °C, durante o período de
10-14 dias. As células foram coletadas com auxílio de uma alça de platina e
transferidas para tubos plásticos Eppendorfs e suspensas em 1.000 µL de água
63
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
MilliQ®. A suspensão foi agitada por 10-20 segundos e então centrifugada a 14.500
rpm, 4°C, por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o procedimento de
lavagem das células foi repetido ao menos 3 vezes. O pellet formado foi suspenso
em 200 µL do tampão de protoplasto, incubado por 2 horas a 37 °C. A suspensão foi
homogeneizada por inversão, durante a incubação, em intervalos de 30 minutos.
Aos protoplastos foram adicionados 200 µL de solução de lise com proteinase K. A
suspensão foi homogeneizada por inversão e incubada a 65 °C, durante 20 minutos.
Após a lise celular, foram adicionados 200 µL de acetato de sódio, 5M, pH 5,4 e a
suspensão foi incubada a -20 °C durante 15 minutos. Os tubos Eppendorfs foram
centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo e foram acrescentados 600 µL de isopropanol. A
solução foi homogeneizada por inversão e incubada a - 20 °C por 16 horas. Após a
precipitação do DNA, os tubos foram centrifugados a 15.400 rpm, 4 °C, durante 15
minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet formado foi lavado com etanol a
70% (-20ºC), para a remoção dos sais. O processo de lavagem foi repetido ao
menos 2 vezes. Após descartar o etanol proveniente da última lavagem o pellet de
DNA foi seco durante 10 minutos a temperatura ambiente. O DNA foi então
ressuspenso em 98 µL de água ultra pura, 1µL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 e 1 µL de
RNAse (10 µg/mL), sendo incubado a 37 °C, durante 60 minutos. O DNA foi
aliquotado em tubos Eppendorfs e estocado em freezer a -20 °C até o momento do
uso nas reações de PCR.
A concentração de DNA foi determinada em espectrofotômetro NanoDrop
2000 (Thermo Fischer Scientific, USA) pela absorbância das preparações a 260 nm,
utilizando como valor padrão 1DO = 50 µg/mL de DNA dupla fita. O grau de pureza
foi avaliado pela relação DO 260/280 nm. Amostras de DNA consideradas de boa
qualidade, livre de proteínas e outros resíduos apresentam relação entre 1,7 e 2,0.
64
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
A integridade do DNA genômico extraído foi verificado através de corrida
eletroforética em gel de agarose 0,8%, adicionado de 1% de Brometo de etídeo (10
mg/mL). Ao gel foram aplicados 1 µL da amostra de extração concomitantemente
com 5 µL do padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen). A corrida
foi realizada em tampão TBE 1X, aplicando-se uma corrente eletroforética constante
de 100 V por 60 minutos. A visualização e a documentação foram realizadas em um
sistema de fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho
transiluminador UV (Loccus Biotecnologia) acoplado a uma câmera fotográfica digital
(Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.
3.3.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Para as reações de PCR foram adicionados em um microtubo Eppendorf
(200µL): 12,5 µl de PCR Master Mix 2X (Promega, USA) (contendo MgCl2, dATP,
dTTP, dCTP, dGTP e Taq polimerase), 1 µl do primer CL1 [10 ρmol/µl] e 1 µl do
primer CL2A [10 ρmol/µl] (Tabela 8), 9,5 µl de água MilliQ estéril e 1 µl de DNA de
Sporothrix spp. [100 ng/µl], perfazendo um volume final de 25 µL.
As reações de PCR foram incubadas em um termociclador (MyGene Series
Peltier Thermal Cycler, MG96G, LongGene Scientific), com um passo inicial de 94°C
por 5 minutos e então amplificadas por 35 ciclos utilizando-se o seguinte programa:
94 °C (desnaturação) por 1 minuto; 60 °C (anelamento) por 1 minuto e 72 °C
(extensão) por 3 minutos. Após a ciclagem realizou-se um passo a 72 °C por 7
minutos para a extensão final. Os amplicons resultantes da reação foram
homogeneizados em tampão de amostra (DNA), aplicados em gel de agarose 2%,
previamente acrescido brometo de etídeo (1mg/mL), concomitantemente com 5 µL
do padrão de peso molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek,
Canadá), e submetidos à corrente elétrica constante de 80 V por 60 minutos. Após a
65
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
corrida, procedeu-se a visualização dos amplicons em um sistema de
fotodocumentação (L-Pix Touch) composto de um aparelho transiluminador UV
(Loccus Biotecnologia, São Paulo) acoplado a uma câmera fotográfica digital
(Canon, USA) utilizando-se o software L-Pix Image.
Tabela 8: Marcador molecular utilizado para amplificação e sequenciamento do
gene da calmodulina, temperatura de anelamento e longitude do
fragmento amplificado.
Região Primers Sequência (5’ a 3’) Tm Amplicon Referência
CAL CL1 GA(AG)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC
60 °C ≈ 800 pb O’Donnell
(2000) CL2A TTTTTGCATCATGAGTTGGAC
3.3.2.1 Purificação e quantificação do produto de PCR
Os fragmentos visualizados foram recuperados do gel após a eletroforese e
purificados utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,
USA) seguindo-se as recomendações do fabricante. As amostras purificadas foram
quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fischer Scientific,
USA) e armazenadas em freezer a -20 °C até o momento do sequenciamento.
3.3.3 Sequenciamento dos produtos de PCR
O sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR foi realizado no
Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP),
utilizando-se o sistema de análise de DNA de 96 capilares MegaBACE 1000 (GE
Healthcare). As reações de sequenciamento foram realizadas de acordo com o
protocolo para o MegaBACE 1000, utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator Kit
66
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
(com Thermo Sequenase™ II DNA Polimerase). As sequencias foram analisadas
pelo software Sequence Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.12.
3.3.4 BLAST
Para buscar similaridades com sequencias depositadas no Genbank foi
utilizado o software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool –
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Altschul et al., 1997).
Sequencias consenso foram obtidas através do alinhamento das sequencias
foward e reverse utilizando-se o software DNA Baser (versão 2.91). Todas as
sequencias foram analisadas automaticamente por comparação no banco de dados
de sequências não redundantes (NR) do NCBI (Altschul et al., 1997). Utilizando o
algoritmo BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), as sequências consenso obtidas
para o amplicon do gene da Calmodulina foram avaliadas e os resultados obtidos
tiveram como parâmetro de aceitação, um e-value igual ou menor que 10-3, que
confirma segundo Maranhão (2008) a obtenção de alinhamento com similaridade
confiável por estar mais próximo de zero e diminui a probabilidade do alinhamento
ter ocorrido casualmente.
3.4 Taxonomia polifásica do complexo Sporothrix schenckii
A classificação final dos isolados de Sporothrix spp. foi realizada levando-se
em consideração os resultados obtidos da caracterização molecular e fenotípica das
161 cepas estudadas. Em casos isolados, em que houvesse discrepância dos
resultados entre o método molecular e fenotípico, optou-se por repetir os
experimentos. Persistindo a divergência, adotamos o resultado obtido para o método
molecular como padrão para a classificação final.
67
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5 Proteômica
A análise do proteoma da fase parasitária das principais espécies que
compõem o complexo Sporothrix schenckii foi proposta neste trabalho utilizando
como ferramenta a eletroforese bidimensional de proteínas em gel de poliacrilamida
(Figura 8).
Alguns fatores devem ser levados em consideração quando existe a
intenção de extrair e solubilizar proteínas, entre eles: tempo, temperatura, pH,
concentração de proteínas, sais, íons metálicos e cofatores (Leimgruber, 2005). Os
protocolos de extração, solubilização, precipitação, focalização isoelétrica (IEF),
SDS-PAGE foram adaptados e otimizados neste trabalho para nossas amostras.
3.5.1 Isolado e condição de cultivo
Utilizamos o isolado Ss 118 para os ensaios de padronização das
metodologias propostas. Um fragmento de micélio, de aproximadamente 20 mg foi
adicionado em frascos Erlenmeyers de 500 mL de capacidade, contendo 100 mL de
caldo BHI, pH 8,0. A cultura foi colocada para crescer sob agitação constante de 120
rpm, em agitador rotatório (Nova Ética, São Paulo) a 37 °C, durante 7 dias.
Alíquotas das culturas foram recuperadas após o crescimento e analisadas ao
microscópio óptico para confirmação do estágio de diferenciação celular (levedura) e
pureza das culturas quanto à presença de microrganismos contaminantes.
As células foram transferidas assepticamente para tubos Falcons de 50 mL e
lavadas em água MilliQ® 18MΩ, centrifugando a suspensão a 3.500 rpm, 4°C, por 10
minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi
novamente lavado em água MilliQ até que não houvesse mais resquícios visual de
meio de cultura entre as células. O pellet resultante foi incubado em gelo (4 ºC) e,
posteriormente, utilizado nos protocolos de extração de proteínas descritos a seguir.
68
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.2 Extração de proteínas de leveduras de Sporothrix
schenckii
O preparo de extrato protéico de leveduras é complicado pela presença de
uma parede celular rica em quitina e glucanas que necessitam ser rompidas durante
o processo de extração (Norbeck, 2005). Neste trabalho foram testados 9 protocolos
de extração de proteínas, que variaram em dois aspectos principais: a combinação
de métodos físicos e químicos de lise celular e a solubilização do extrato protéico.
Didaticamente estes protocolos foram divididos em dois blocos, variando a principal
forma de lise física, por (I) nitrogênio líquido ou (II) por ação de pérolas de vidro
(beads) no aparelho Fastprep 1200®. O esquema geral dos protocolos de extração
pode ser visualizado na Figura 9.
Figura 8: Abordagem esquemática em proteômica diferencial. Mapas bidimensionais de referência
gerados a partir do antígeno celular total extraído de leveduras de Sporothrix schenckii, S.
brasiliensis, S. globosa e S. mexicana (n=3). As possíveis comparações entre as imagens
adquiridas dos géis provenientes das triplicatas experimentais são esquematizadas. As
análises comparativas de variações interespecíficas (→) são representadas pelas setas.
Abreviações: pI, ponto isoelétrico; mw, molecular weigth (massa molecular); Ss, Sporothrix
schenckii; Sb, Sporothrix brasiliensis; Sg, Sporothrix globosa; Sm, Sporothrix mexicana.
69
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Figura 9: Protocolos de extração de proteínas de leveduras de Sporothrix schenckii (7 dias de cultivo). Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de
homogeneização das leveduras (em suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45 segundos. Os protocolos
7 e 8 combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio e Uréia-Tiouréia
respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads de vidro (0,5mm diâmetro). Após ruptura das células
nos 8 protocolos, os lisados são centrifugados a 15.000 rpm, 4°C, durante 10 minutos. O sobrenadante (extrato bruto) é dosado pelo método de
Bradford, aliquotado e armazenados em freezer -80°C, até o momento do uso. Aproximadamente 20 µg de amostra de cada protocolo são aplicados
em um gel SDS-PAGE para verificação da integridade da amostra e do perfil de bandas gerados.
70
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.2.1 Protocolos de extração (I) (Nitrogênio líquido)
Leveduras do isolado Ss 118 foram cultivadas e coletadas de acordo com a
metodologia descrita no item 2.5.1. Aproximadamente 5 mL de células
leveduriformes foram transferidas para um almofariz (previamente autoclavado, a
120 °C, 40 minutos). As células foram maceradas por aproximadamente 30 minutos,
com auxílio de um pistilo até a obtenção de um pó extremamente fino. O macerado
foi transferido com auxílio de uma espátula para um frasco Falcon estéril de 50 mL e
ressuspenso em 3 mL de tampão Tris-Cálcio (Apêndice I) ou Uréia-Tiouréia
(Apêndice I). Ao homogeneizado foram adicionadas pérolas de vidro de 0,5 mm de
diâmetro (Invitrogem, USA). A suspensão foi agitada vigorosamente em vórtex
durante 40 minutos, a 4 °C, com a finalidade de aumentar o índice de lise celular e
consequentemente aumentar a liberação de proteínas na suspensão.
O homogeneizado foi recuperado com auxílio de uma pipeta Pasteur e
transferido para tubos plásticos Eppendorf, 1,5 mL de capacidade e centrifugados a
15.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O pellet formado, contendo os restos
celulares, foi descartado e os sobrenadantes provenientes dos diversos Eppendorfs
foram homogeneizados em um Falcon de 15 mL e, em seguida, alíquotado em
novos Eppendorfs. Ditiotreitol (DTT) foi adicionado à amostra a uma concentração
final de 20 mM (Missall et al., 2006) no protocolo com o tampão Tris-Cálcio. O
extrato protéico bruto foi armazenado imediatamente em freezer a – 80 °C.
3.5.2.2 Protocolos de extração (II) (Fastprep® 1200)
Os protocolos que compõem este segundo grupo de extração variam a
composição do tampão de lise química das células e solubilização de proteínas.
Tubos Eppendorfs de 2 mL foram adicionados de uma esfera de cerâmica de ¼ de
71
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
diâmetro (MP Biomedicals, USA), 500 mg de esferas de vidro 0,5 mm de diâmetro
(Invitrogen, USA). Os Eppendorfs adicionados das esferas foram autoclavados a 120
°C, 1atm durante 30 minutos.
Aproximadamente 600 µL de células (2x1010 UFC/mL) foram adicionadas
aos tubos Eppendorfs por protocolo, em triplicata. Os tubos Eppendorfs foram
mantidos em gelo, até o momento da agitação. A seguir foram adicionados 600 µL
de cada tampão de extração. Os tubos Eppendorfs foram então posicionados em um
aparelho Fastprep® 1200 e as condições de agitação foram ajustadas para 1 ciclo de
45 segundos, a velocidade 5.0 X.
Após a agitação, os tubos Eppendorfs foram centrifugados a 15.000 rpm, 4
°C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e em
seguida armazenado a -80 °C.
3.5.2.3 Quantificação protéica pelo método de Bradford
(1976) e avaliação da integridade da amostra
Todos os extratos brutos provenientes dos protocolos de extração foram
quantificados pelo ensaio colorimétrico proposto por Bradford (1976) baseado em
uma curva com concentração conhecida da proteína soroalbumina bovina (BSA),
utilizando o reagente Coomassie® Plus Protein Assay Reagent Kit (Pierce
Biotechnology , USA). Após a quantificação, aproximadamente 2 µg do extrato
protéico bruto foi aplicado em um gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970) composto
por gel de empacotamento (3 %) e gel de separação linear (10 %) a fim de verificar a
integridade da amostra.
72
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.3 Precipitação de proteínas
A precipitação de proteínas é um passo opcional na preparação de amostra
para a eletroforese bidimensional. A precipitação, seguida pela ressuspensão da
amostra, é geralmente empregada para separar as proteínas presentes na amostra
bruta de moléculas contaminantes como sais, detergentes, ácidos nucléicos, lipídios,
etc., que podem interferir com os resultados finais dos géis bidimensionais, gerando
géis de baixa resolução com arrastes horizontais.
Diversos métodos e reagentes são empregados para a precipitação de
proteínas, dentre eles os mais comumente empregados são: precipitação em sulfato
de amônio, TCA, Acetona, TCA/Acetona e Acetato de amônio em metanol seguido
de extração fenólica.
3.5.3.1 TCA (ácido tricloroacético)
Aproximadamente 300 µg de proteínas foram precipitadas utilizando uma
solução a 15 % de ácido tricloroacético (TCA). Em um tubo Eppendorf estéril
contendo o extrato bruto de proteínas das leveduras de S. schenckii foi adicionado o
TCA na razão 1:1 (TCA: amostra). A amostra foi homogeneizada por inversão e
incubada a 4 °C durante 15 minutos. Os tubos foram então centrifugados a 14.000
rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e ao pellet resultante
foram adicionados 200 µL de acetona previamente refrigerada (-20 °C). Os tubos
foram incubados em gelo durante 15 minutos, e em seguida centrifugados a 14.000
rpm, 4 °C, durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o processo de
lavagem com acetona foi repetido. Os Eppendorfs foram abertos durante 5 minutos,
a temperatura ambiente, para a evaporação da acetona residual. As proteínas foram
ressuspensas em um tampão de solubilização e reidratação das tiras de pH
imobilizado (Apêndice I).
73
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.3.2 Acetona
Em um tubo Eppendorf estéril contendo o extrato bruto de proteínas das
leveduras de S. schenckii foi adicionado uma solução de acetona (-20 °C) na razão
4:1 (acetona: amostra). A solução foi homogeneizada em agitador de tubos durante
30-60 segundos e em seguida incubado a -20 °C, durante 2 horas. Os tubos foram
então centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi
removido e ao pellet resultante foram adicionados 500 µL de acetona a -20 °C e, em
seguida, centrifugado a 14.000 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. Os tubos Eppendorfs
foram abertos para a evaporação da acetona residual durante 5 minutos, a
temperatura ambiente. As proteínas foram ressuspensas em um tampão de
solubilização e reidratação das tiras de pH imobilizado (Apêndice I).
3.5.3.3 TCA/Acetona
Em um tubo Eppendorf estéril foram misturados o extrato bruto de leveduras
de S. schenckii, a acetona -20 °C e o ácido tricloroacético (TCA) na proporção de
1:8:1 respectivamente. A solução foi homogeneizada em agitador de tubos durante
30-60 segundos e, em seguida, incubado a -20 °C, durante 2 horas. Os tubos foram
então centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. O sobrenadante foi
removido e ao pellet resultante foram adicionados 1000 µL de acetona a -20 °C. Os
tubos foram novamente centrifugados a 14.000 rpm, 4 °C, durante 15 minutos. Os
Eppendorfs foram abertos para a evaporação da acetona residual durante 5 minutos,
a temperatura ambiente. As proteínas foram ressuspensas em um tampão de
solubilização e reidratação das tiras de pH imobilizado (Apêndice I).
74
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.3.4 2D-Clean up kit (GE Healthcare, USA)
O 2D-clean up é um kit comercial desenvolvido para utilização em
precipitação de amostras protéicas visando a aplicação em análises de géis
bidimensionais. O princípio deste protocolo é similar ao método de precipitação
desenvolvido por Damerval et al. (1986), porém, com o auxílio um detergente co-
precipitante as proteínas são eficientemente precipitadas e as moléculas
interferentes removidas da solução (Westermeier & Navem, 2002).
Aproximadamente 300 µg de proteínas foram precipitadas utilizando o 2D-
clean up kit, seguindo-se as recomendações do fabricante. Resumidamente, foram
adicionados a 1 volume de amostra do extrato bruto de leveduras de S. schenckii, 3
volumes da solução precipitante. A amostra foi homogeneizada em agitador de
tubos durante 30-60 segundos e incubada a 4 °C durante 15 minutos. Ao
homogeneizado foi adicionado 3 vezes o volume original da amostra de co-
precipitante. A amostra foi homogeneizada novamente e em seguida centrifugada a
11.500 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao tubo
Eppendorf foi adicionado novamente a solução co-precipitante em um volume de 3-4
vezes o tamanho do pellet resultante. Os tubos foram centrifugados a 11.500 rpm, 4
°C, durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e ao tubo Eppendorf foi
adicionado 50 µL de água MilliQ® 18MΩ. Os tubos foram agitados em vórtex
vigorosamente e, em seguida, foram adicionados 1.000 µL de wash buffer
refrigerado (-20 °C) e 5 µL da solução wash additive. Os tubos foram incubados a -
20 °C durante 30 minutos sendo novamente agitados em vórtex durante 30
segundos, a cada intervalo de 10 minutos de incubação. Os tubos foram novamente
centrifugados a 11.500 rpm, 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi
descartado e os tubos Eppendorfs foram abertos para a evaporação da solução
wash buffer residual durante 5 minutos, a temperatura ambiente. As proteínas foram
75
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
ressuspensas em um tampão de solubilização e reidratação das tiras de pH
imobilizado (Apêndice I).
3.5.4 Análise dos resultados de extração e precipitação de
proteínas
A relação quantidade de células/ tampão de lise/ quantificação protéica foi
estabelecida e o rendimento da extração foi determinado para cada protocolo.
Aproximadamente 10 µg de proteínas foram aplicadas em um gel de
poliacrilamida 10% e submetidas à eletroforese. Os géis resultantes foram corados
com nitrato de prata e/ou Coomassie coloidal. Após a coloração os géis foram secos
em papel celofane (BioRad, USA) e, em seguida, digitalizados com auxílio de um
scanner convencional (HP Photosmart C4480).
As imagens foram analisadas densitométricamente em relação à quantidade
de bandas e a intensidade apresentada por cada banda, utilizando o software
ImageLab 1D (Loccus Biotecnologia, São Paulo).
3.5.5 Eletroforese bidimensional
Durante a escolha do método de extração e precipitação optou-se por
combinar o passo de extração de proteínas que fornecesse o melhor rendimento de
extração/ padrão de bandas com a possibilidade de futura precipitação de proteínas,
sem perda de amostra e que apresentasse melhor solubilização protéica.
76
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.5.1 Focalização Isoelétrica (Primeira dimensão)
Após precipitadas, as proteínas foram ressuspensas diretamente em 250 µL
do tampão de reidratação das tiras de pH imobilizado e solubilização das proteínas
(Apêndice I). A suspensão foi aplicada por toda a extensão de um sarcófago de
cerâmica (strip holder). Uma tira de pH imobilizado de 13 cm (pH 3-10 ou 4-7) foi
posicionada sob a solução, com a face do gel voltada para baixo. Aproximadamente
2 mL de óleo mineral (GE Healthcare, USA) foram aplicados sob a tira e em seguida,
o aparato foi posicionado em um aparelho Ettan IPGphor III para realizar a
isoeletrofocalização à 20 ºC até completar 65.000 Vhrs totais.
3.5.5.2 Tratamento das tiras de pH imobilizado
Após a isoeletrofocalização as tiras foram congeladas em freezer a -80 ºC
ou aplicadas imediatamente na segunda dimensão. As tiras foram equilibradas
durante 20 minutos, a temperatura ambiente, sob agitação constante em 5 mL
tampão de equilíbrio para a redução e alquilação dos grupos tióis das proteínas,
respectivamente em DTT (0,1%) e Iodoacetamida (0,2%).
3.5.5.3 SDS-PAGE (Segunda dimensão)
Após o tratamento, as tiras foram aplicadas na parte superior de um gel de
poliacrilamida 10% (160 x 150 mm), juntamente com 8 µL do padrão de peso
molecular BenchMark Protein Ladder (Invitrogen, USA). Na parte superior foi
aplicado 1mL de agarose 0,5% com azul de bromophenol (0,001%). O gel foi
posicionado em uma cuba de eletroforese vertical, Hoefer SE 600 e a corrida foi
conduzida a 10 ºC, aplicando-se um corrente eletroforética constante de 15 mA/gel
77
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
durante 10 minutos e 23 mA/gel até que o corante alcançasse o final do gel. Após a
separação das proteínas em segunda dimensão os géis foram fixados e corados
com nitrato de prata ou coomassie coloidal de acordo com o objetivo desejado.
3.5.6 Géis analíticos (Nitrato de prata)
Após a eletroforese os géis foram submersos em tampão de fixação sob
agitação moderada por no mínimo 3 horas, sendo em seguida lavados três vezes em
água ultra-pura por 10 minutos. Em seguida o gel foi incubado por 30 minutos em
uma solução de etanol 50%, 10 minutos em uma solução de Tiossulfato e 10
minutos em uma solução de nitrato de prata, sendo lavados com água ultra-pura por
10 minutos entre as soluções citadas. Após a coloração os géis foram submersos
em uma solução de revelação até o aparecimento dos spots (por um período de 2 a
3 minutos). A reação de revelação foi finalizada adicionando ao gel uma solução de
parada (Apêndice I).
3.5.7 Géis preparativos (Coomassie coloidal G-250)
Os géis preparativos foram utilizados para a obtenção de proteínas para o
sequenciamento. Deste modo foram aplicados aproximadamente 500 µg de
proteínas para a eletroforese. Após a eletroforese, os géis foram submersos em
tampão de fixação II sob agitação constante por no mínimo 3 horas. Em seguida, os
géis foram lavados em água ultra-pura por 10 minutos e, em seguida, submersos em
150 mL de solução coloração (Coomassie coloidal G-250), por no mínimo 16 horas
(Apêndice I). A descoloração foi realizada utilizando água ultra pura.
78
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.5.8 Aquisição e análise das imagens
A aquisição das imagens dos géis bidimensionais foi realizada em um
digitalizador densitométrico Image Scanner III (GE Healthcare, USA). A
determinação dos spots foi realizada automaticamente no software Image Master 7.0
(GE Healthcare, USA) levando-se em consideração os critérios de área mínima,
suavização e saliência. Após a detecção automática procedeu-se a detecção manual
dos spots caso houvesse necessidade. Em seguida, foram adotados 5 spots de
referência (landmarks) para que o software pudesse comparar a posição das
proteínas nos diferentes géis e suprimisse deste modo possíveis variações
provocadas por diferenças no tamanho dos géis, migração das proteínas, entre
outros. As triplicatas biológicas foram comparadas entre si gerando um mapa
proteômico de referência. Os mapas de referências das espécies filogenéticas
estudadas foram comparados sendo evidenciadas as diferenças do mapa utilizando
como parâmetro a intensidade e a área dos spots para inferir os níveis de expressão
diferencial de proteínas.
79
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
3.6 Imunoproteômica
3.6.1 Western Blot bidimensional
Para os ensaios de imunoproteômica foram feitos géis bidimensionais com o
extrato protéico celular total dos isolados selecionados, seguindo a mesma
metodologia citada nos itens 2.5.1 (condições de cultivo) 2.5.2.1 (extração), 2.5.5.1
(IEF) e 2.5.5.3 (SDS-PAGE). As proteínas separadas no gel foram transferidas para
membranas Amersham Hybond™ (Amersham Bioscience, USA), 0,45 µm,
embebidas em uma solução de transferência contendo Trizma Base 25 mM, Glicina
192 mM, Metanol 20% em pH 8.3 (Towbin et al., 1979) utilizando-se o sistema
Trans-Blot® Semi-Dry (Bio-Rad, USA), aplicando-se uma corrente elétrica de 25 V,
durante 60 minutos. A confirmação da transferência foi realizada com o corante
Ponceau (Ponceau’S 0,15% e Ácido acético 1%).
Confirmada a transferência pela coloração das proteínas na membrana, esta
foi lavada com água MilliQ estéril para retirar o excesso do corante e os sítios livres
de proteínas foram bloqueados com 5% de leite em pó desnatado adicionado de 1%
de BSA fração V em solução de PBS Tween 20 por 2-3 horas. Em seguida, a
membrana foi lavada com PBS-Tween estéril (NaCl a 80%, KCl a 2%, Na2HPO a
11,5%, KH2PO4 a 2% e Tween 20 a 1%) e incubada com soro de pacientes com a
forma cutânea fixa ou a forma linfocutânea da doença, diluídos na proporção de
1:500, com agitação constante por 1 hora, a temperatura ambiente. A membrana foi
lavada com PBS-Tween 20 por 10 minutos, 3 vezes. Após os procedimentos de
lavagem, a membrana foi incubada por 1 hora, sob agitação constante com o
anticorpo secundário IgG de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase,
diluído 1:1000, a temperatura ambiente. Após este procedimento foi realizada uma
última lavagem com PBS-Tween 20 por 15 minutos, sob agitação leve.
80
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
O blotting foi revelado por quimioluminêscencia (Figura 11) utilizando-se o kit
SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology, USA)
diluído em tampão carbonato CO3- HCO3
- 50mM, pH 9,6 (Carbonato de sódio 0,5 M,
Carbonato ácido de sódio 0,5 M), de acordo com as informações do fabricante. O
luminol diluído foi incubado com a membrana durante 5 minutos. Após a exposição,
a membrana foi colocada em contato com filme High Performance
Chemiluminescence (GE Healthcare, USA) por até 5 minutos. O filme foi revelado
em solução de revelação, Revelador e Reforçador GBX (Kodak, USA), lavado em
água destilada, e solução de fixação, Fixador e Reforçador GBX (Kodak, USA).
As imagens impressas no filme de revelação foram fotodocumentadas em
scanner densitométrico (Image Scanner III – GE Healthcare) e os spots
imunogênicos foram analisados pelo software Image Master. O objetivo deste
ensaio é observar quais são as proteínas do fungo que reagem com o soro do
paciente com esporotricose e se existem diferentes moléculas imunogênicas entre
as espécies estudadas e entre as duas formas clínicas da doença escolhidas para
análise (Figura 10). Pretendemos deste modo, propor proteínas candidatas a
biomarcadores baseados nos perfis imunológicos observados nas reações das
proteínas quando incubadas com o soro de pacientes. Como controle negativo dos
ensaios as membranas serão incubadas com soro de indivíduos sadios.
81
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Material e Métodos
Figura 10: Abordagem imunoproteômica. Comparação entre as formas clínicas da doença e as
espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii.
Figura 11: Detecção de proteínas imunogênicas com a técnica de Western-Blot. (A) Transferência
das proteínas fúngicas para uma membrana de nitrocelulose; (B) Incubação da membrana
com soro de paciente com esporotricose; (C) Incubação da membrana com um anticorpo
anti-IgG humana conjugado com peroxidase; (D) Incubação da membrana com luminol;
(E) e (F) Detecção dos spots imunogênicos com auxílio de filme fotográfico através da
impressão de pontos luminosos provenientes da reação de quimiluminescência entre a
peroxidase e o luminol.
82
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
4. RESULTADOS
4.1 Características fenotípicas
As cepas de Sporothrix spp. foram isoladas diretamente de lesões de
pacientes com diferentes manifestações clínicas da doença, de felinos, assim como
de diferentes substratos na natureza como superfície vegetal e solo. Estas cepas
estão mantidas sob cultivo in vitro em tubos com meio SDA, à temperatura ambiente,
por tempos distintos que variam de poucos meses a sessenta anos.
A caracterização fenotípica foi realizada em meio de cultura PDA, a fim de
obtermos parâmetros de comparação com os dados publicados na literatura.
Quando incubados à temperatura de 30 ºC, o crescimento vegetativo foi
relativamente lento para a maioria das cepas (41,37 ± 8,25 mm em 21 dias).
Macroscopicamente, as colônias apresentam micélio densamente emaranhado,
fortemente compactado, gerando um aspecto coriáceo ou membranoso, de difícil
dissociação por ação mecânica. Durante os primeiros dias de incubação algumas
colônias apresentaram coloração branca, a qual foi adquirindo tonalidade marron em
diferentes intensidades dependendo do isolado e da região da colônia, enquanto
outros isolados apresentaram colônias que desenvolveram uma coloração vermelho-
esmaecida com o decorrer do tempo de cultivo.
À temperatura de 35 ºC (21 dias) as colônias apresentaram em média
diâmetro de 9,88 ± 3,86 mm com crescimento vegetativo protuberante com algumas
áreas de saliência pronunciada. A velocidade de expansão da colônia foi em parte
reduzida pela atuação da temperatura quando comparado ao diâmetro obtido para
30 ºC.
Quando incubadas em meio PDA à temperatura de 37 ºC o crescimento foi
extremamente lento, atingindo apenas 6,15 ± 2,53 mm, em 21 dias de incubação.
83
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Macroscopicamente, as cepas cultivadas não apresentaram o aspecto cremoso
característico das colônias leveduriformes, devido provavelmente ao meio de cultivo
utilizado. In vitro, a transição para a fase leveduriforme é induzida principalmente
pela ação da temperatura, porém os aspectos nutricionais do meio de cultura
também podem influenciar o dimorfismo. As colônias apresentaram um aspecto
cerebriforme, com sulcos acentuados, de coloração branca a creme. Para algumas
cepas esta temperatura foi capaz de inibir completamente o crescimento.
4.2 Influência da temperatura no crescimento fúngico
4.2.1. Crescimento vegetativo
A influência da temperatura sobre o crescimento vegetativo foi avaliada em
170 isolados do complexo S. schenckii. Os resultados obtidos foram utilizados como
dados taxonômicos para a classificação fenotípica dos isolados assim como dados
fisiológicos para o entendimento da biologia deste patógeno. O diâmetro das
colônias dos isolados após 21 dias de incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e
40 °C são descritos na Tabela 9.
84
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Tabela 9: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de
incubação em diferentes temperaturas.
Código do
Isolado
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ss 01SP 36,27 ± 0,77 7,28 ± 0,24 3,22 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 02RS 42,45 ± 2,95 10,13 ± 0,74 4,16 ± 1,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 03RS 47,55 ± 4,55 12,08 ± 0,53 4,72 ± 0,22 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 04RS 48,52 ± 2,52 10,30 ± 0,45 5,70 ± 0,60 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 05MG 47,15 ± 0,50 17,83 ± 1,18 5,96 ± 0,23 0,00 ± 0,00 II.b.1.1
Ss 06MG 36,67 ± 1,82 2,10 ± 0,12 1,82 ± 0,62 0,00 ± 0,00 III.a.2.2
Ss 07MG 40,55 ± 7,05 11,14 ± 0,08 5,03 ± 1,12 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 08MG 41,50 ± 1,20 13,18 ± 0,04 5,65 ± 2,45 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 09MG 41,97 ± 0,92 14,24 ± 0,51 1,16 ± 0,03 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 10MG 38,90 ± 0,25 13,60 ± 0,66 4,98 ± 0,96 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 11MG 40,32 ± 0,72 15,26 ± 1,61 5,02 ± 0,47 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 12MG 40,55 ± 0,95 10,21 ± 0,34 7,98 ± 0,93 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 13MG 30,42 ± 1,22 11,47 ± 0,12 1,90 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Ss 14MG 37,95 ± 2,35 13,37 ± 0,32 1,91 ± 0,06 0,00 ± 0,00 III.a.1.2
Ss 15MG 40,50 ± 0,40 5,04 ± 0,43 1,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.a.2.2
Ss 16PI 46,28 ± 1,43 16,80 ± 1,39 1,45 ± 0,10 0,00 ± 0,00 II.b.1.1
Ss 17PR 32,90 ± 5,90 13,44 ± 1,35 3,28 ± 0,68 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Ss 19PR 28,95 ± 0,70 4,80 ± 0,28 1,31 ± 0,06 0,00 ± 0,00 III.b.1.1
Ss 20PR 33,62 ± 6,37 16,49 ± 0,27 4,51 ± 1,36 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Ss 21PR 41,05 ± 2,55 13,52 ± 0,94 1,75 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 22PR 37,12 ± 0,07 14,84 ± 0,47 3,15 ± 1,95 0,00 ± 0,00 III.a.1.2
Ss 24PR 24,75 ± 0,20 7,05 ± 0,68 2,20 ± 1,05 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 25PR 43,70 ± 4,10 11,48 ± 0,11 1,47 ± 0,12 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 26PR 40,60 ± 2,15 12,10 ± 0,17 2,85 ± 0,15 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 27PR 39,37 ± 1,37 15,57 ± 0,01 4,17 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 28PR 40,32 ± 1,12 11,09 ± 0,41 1,67 ± 0,37 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 30PR 37,67 ± 1,67 14,13 ± 0,87 2,36 ± 0,63 0,00 ± 0,00 III.a.1.2
Ss 31PR 46,25 ± 1,85 16,35 ± 2,15 7,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 II.b.1.1
Ss 32PR 38,35 ± 2,60 8,29 ± 0,16 7,25 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 33PR 34,22 ± 5,67 11,01 ± 1,03 8,00 ± 2,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 34PR 52,75 ± 0,06 11,28 ± 0,41 11,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 35PR 34,10 ± 0,00 17,12 ± 0,20 7,75 ± 1,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Ss 36PR 50,57 ± 2,42 10,53 ± 0,08 7,50 ± 0,50 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 37PR 27,45 ± 0,00 19,70 ± 0,24 7,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Continua...
85
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Continuação…
Código do Isolado
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ss 38PR 39,35 ± 0,25 15,35 ± 1,06 9,75 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 39PR 44,35 ± 2,60 12,57 ± 0,21 6,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 40CE 42,75 ± 2,15 14,53 ± 0,49 7,25 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
Ss 41CE 41,00 ± 0,00 4,01 ± 0,04 4,00 ± 0,50 0,00 ± 0,00 III.a.2.2
Ss 42CE 35,20 ± 0,80 12,31 ± 1,33 7,75 ± 0,75 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 43CE 38,75 ± 3,75 15,76 ± 0,51 8,50 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 44CE 36,55 ± 2,05 13,09 ± 1,19 8,00 ± 1,50 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 45GO 41,57 ± 1,92 11,10 ± 1,79 6,50 ± 1,00 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 46GO 26,50 ± 0,00 13,78 ± 0,05 4,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.1
Ss 47GO 31,85 ± 0,25 9,01 ± 0,03 6,25 ± 1,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 48GO 44,10 ± 1,50 6,88 ± 0,01 5,50 ± 0,50 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 49GO 32,57 ± 0,67 4,43 ± 0,12 4,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.1.1
Ss 50GO 37,55 ± 1,95 6,1 ± 0,05 3,50 ± 0,00 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 51PA 37,70 ± 1,30 15,38 ± 1,82 9,82 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 52SP 28,92 ± 1,67 8,44 ± 0,46 8,22 ± 1,77 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 53RS 33,97 ± 4,02 10,71 ± 0,32 10,00 ± 1,00 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 54RS 38,00 ± 3,00 11,06 ± 0,53 11,25 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 55RS 33,90 ± 1,06 14,29 ± 0,33 9,75 ± 0,25 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 56RS 37,20 ± 0,64 14,56 ± 1,09 7,83 ± 0,22 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 57RS 37,75 ± 1,20 14,69 ± 1,30 9,63 ± 0,98 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 58SP 41,17 ± 1,06 9,23 ± 0,89 7,26 ± 0,03 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 59SP 48,79 ± 0,12 12,67 ± 0,88 9,93 ± 0,78 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 60SP 50,66 ± 0,49 10,57 ± 0,94 8,15 ± 0,22 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 61SP 49,31 ± 0,17 5,16 ± 0,02 5,43 ± 0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 62ES 40,40 ± 0,14 6,30 ± 0,17 6,58 ± 0,81 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 63ES 42,46 ± 1,69 6,31 ± 0,26 7,70 ± 0,09 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 64ES 44,79 ± 0,58 6,20 ± 0,67 8,29 ± 0,02 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 65RJ 40,19 ± 0,47 5,06 ± 0,18 7,86 ± 0,34 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 66RJ 37,31 ± 0,06 6,77 ± 0,07 5,02 ± 0,35 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 67RJ 32,89 ± 1,64 5,18 ± 0,01 4,66 ± 0,10 0,00 ± 0,00 III.b.1.1
Ss 68RJ 33,35 ± 0,26 8,87 ± 1,11 8,31 ± 0,24 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 69RJ 37,00 ± 0,17 10,66 ± 0,68 5,67 ± 0,24 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 70RJ 46,51 ± 1,41 9,51 ± 0,04 8,10 ± 0,16 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 71RJ 40,54 ± 1,11 5,90 ± 0,87 4,84 ± 0,14 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 72RJ 39,66 ± 0,70 6,98 ± 0,17 5,66 ± 0,81 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
86
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ss 73RJ 47,96 ± 0,48 10,13 ± 0,61 6,21 ±0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 74RJ 37,87 ± 0,25 5,06 ± 0,03 5,44 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 75RJ 49,99 ± 1,42 8,55 ± 0,30 5,45 ± 0,54 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 76RJ 39,17 ± 0,34 7,05 ± 0,18 7,20 ± 0,03 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 77RJ 32,21 ± 1,27 10,01 ± 0,98 8,74 ± 0,05 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 78RJ 38,01 ± 0,06 7,18 ± 0,17 5,01 ± 0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 79RJ 37,78 ± 0,31 4,42 ± 0,55 5,33 ± 0,48 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 80RJ 52,16 ± 0,24 6,42 ± 0,64 6,17 ± 0,49 0,00 ± 0,00 II.b.2.1
Ss 81RJ 39,10 ± 0,64 5,27 ± 0,18 4,81 ± 0,56 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 82RJ 38,95 ± 0,62 7,46 ± 0,45 6,49 ± 0,14 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 83RJ 34,33 ± 0,24 10,19 ± 0,81 6,24 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 84RJ 36,41 ± 0,14 6,25 ± 0,05 7,18 ± 0,38 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 85RJ 35,09 ± 0,57 8,61 ± 0,07 8,85 ± 0,09 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 86RJ 39,17 ± 0,50 7,39 ± 0,05 7,42 ± 0,72 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 87RJ 27,80 ± 0,11 10,82 ± 0,44 7,49 ± 1,40 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 88RJ 39,08 ± 0,12 5,51 ± 0,23 7,50 ± 0,21 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 89RJ 36,89 ± 0,81 3,82 ± 0,20 4,69 ± 0,12 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 90RJ 43,70 ± 0,65 8,87 ± 0,49 7,67 ± 0,53 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 91RJ 33,56 ± 0,79 8,60 ± 0,36 6,59 ±0,13 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 92RJ 42,33 ± 0,68 8,63 ± 2,58 5,82 ±0,85 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 93RJ 38,27 ± 0,48 3,54 ± 0,14 4,60 ±0,37 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 94RJ 46,94 ± 0,41 8,11 ± 0,81 8,67 ±0,51 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 95RJ 32,83 ± 0,95 5,78 ± 0,18 4,86 ±0,69 0,00 ± 0,00 III.b.1.1
Ss 96RJ 38,38 ± 0,78 8,17 ± 0,05 4,41 ±0,21 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 97RJ 38,00 ± 1,87 6,02 ± 0,24 4,09 ±0,35 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 98RJ 37,63 ± 1,27 6,85 ± 0,35 4,40 ±0,06 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 99RJ 38,77 ± 0,97 10,41 ± 0,18 4,59 ±0,53 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 100RJ 45,76 ± 0,86 8,27 ± 0,62 6,38 ±0,22 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 101SP 41,36 ± 1,25 10,84 ± 0,18 4,62 ±0,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 102SP 44,77 ± 0,09 5,72 ± 1,12 6,56 ±0,42 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 103SP 38,62 ± 1,34 9,30 ± 0,26 4,45 ±0,08 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 104MG 45,92 ± 1,19 13,06 ± 0,05 5,74 ±0,18 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 105MG 45,02 ± 0,34 12,16 ± 0,31 8,17 ±1,11 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 106MG 47,99 ± 1,35 5,60 ± 1,07 5,40 ±0,05 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 107MG 39,88 ± 0,78 12,70 ± 0,61 7,00 ±0,67 0,00 ± 0,00 III.a.1.1
87
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ss 109MG 48,39 ± 6,47 11,48 ± 1,17 7,17 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 110MG 54,39 ± 1,17 14,06 ± 0,46 7,41 ±0,44 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 111SP 45,76 ± 0,04 12,94 ± 1,13 6,50 ±0,79 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 112SP 46,72 ± 0,25 8,88 ± 1,00 6,70 ±0,23 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 113SP 44,99 ± 0,70 10,71 ± 1,51 3,57 ±0,33 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 114SP 53,12 ± 1,06 8,32 ± 0,77 8,15 ±0,97 0,00 ± 0,00 II.b.2.1
Ss 115SP 41,43 ± 0,59 10,37 ± 0,03 7,34 ±0,10 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 116SP 46,91 ± 0,26 4,32 ± 0,28 4,88 ±0,21 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 117SP 60,81 ± 0,47 9,59 ± 0,66 7,16 ±0,25 0,00 ± 0,00 I
Ss 118SP 43,63 ± 0,76 8,73 ± 0,06 8,54 ±0,17 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 119SP 43,76 ± 0,55 13,13 ± 0,31 6,45 ±0,34 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 120SP 51,49 ± 0,21 13,03 ± 0,68 7,20 ±0,15 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 121SP 54,43 ± 2,10 11,77 ± 1,05 8,87 ±0,26 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 122SP 24,10 ± 0,08 7,60 ± 0,01 4,74 ±0,16 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 123SP 53,66 ± 0,27 13,02 ± 0,02 8,29 ±0,23 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 124SP 51,70 ± 0,52 12,35 ± 0,49 5,65 ±0,09 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 125SP 43,89 ± 0,08 9,20 ± 0,13 9,44 ±1,14 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 126SP 45,62 ± 0,20 6,67 ± 1,18 5,11 ±0,78 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 127SP 53,47 ± 0,49 3,63 ± 0,04 5,59 ±0,59 0,00 ± 0,00 II.b.2.1
Ss 128SP 43,08 ± 0,56 10,73 ± 0,89 11,16 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 129SP 47,54 ± 0,88 6,52 ± 0,09 5,25 ±0,01 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 130PE 38,28 ± 0,48 9,63 ± 1,02 4,11 ±0,06 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 131PE 47,97 ± 1,53 7,50 ± 0,01 4,23 ±0,28 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 132SP 68,76 ± 0,32 4,89 ± 0,06 4,80 ±0,15 0,00 ± 0,00 I
Ss 133PE 68,11 ± 0,50 5,96 ± 0,76 3,48 ±0,64 0,00 ± 0,00 I
Ss 134PE 68,11 ± 2,38 2,00 ± 0,01 3,37 ±0,16 0,00 ± 0,00 I
Ss 135PE 43,84 ± 0,95 7,85 ± 0,36 6,61 ±0,35 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 136PE 47,74 ± 0,91 8,63 ± 0,10 8,89 ±0,31 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 137PE 48,42 ± 0,42 10,81 ± 0,11 8,36 ±0,18 0,00 ± 0,00 II.b.2.2
Ss 138PB 43,45 ± 0,25 6,96 ± 0,10 6,22 ±0,60 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 139PB 45,14 ± 0,31 8,94 ± 0,96 3,49 ±0,55 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 140PB 48,23 ± 1,74 7,07 ± 0,30 7,06 ±0,64 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 141DF 50,77 ± 0,35 6,89 ± 0,02 6,78 ±0,76 0,00 ± 0,00 II.b.2.1
Ss 143PA 38,08 ± 1,05 9,36 ± 0,31 7,07 ±0,26 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 144RS 53,83 ± 0,09 9,40 ± 0,03 8,99 ±0,91 0,00 ± 0,00 II.b.2.1
88
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Conclusão...
Código do Isolado
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão Cluster
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ss 145RS 29,12 ± 0,84 10,46 ± 0,01 5,33 ±0,00 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 146AM 36,28 ± 0,30 20,12 ± ,015 16,10 ±0,07 0,00 ± 0,00 –
Ss 147AM 35,86 ± 0,88 19,03 ± 0,59 16,59 ±0,83 0,00 ± 0,00 –
Ss 148SP 33,87 ± 1,79 8,96 ± 0,11 8,29 ±0,48 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 149RS 38,08 ± 0,52 10,01 ± 0,67 9,92 ±0,26 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 150RS 31,74 ± 0,34 9,41 ± 0,05 6,76 ±0,30 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 151RS 30,63 ± 0,50 9,35 ± 0,36 9,14 ± 0,70 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 152RS 30,92 ± 2,85 11,06 ± 0,29 8,80 ± 0,27 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 153RS 32,48 ± 0,28 8,85 ± 0,02 8,76 ±0,09 0,00 ± 0,00 III.b.2.2
Ss 154RS 28,29 ± 0,99 9,87 ± 0,40 9,67 ±0,51 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 155RS 24,97 ± 0,19 8,20 ± 0,09 7,58 ±0,75 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 156RS 42,88 ± 2,58 10,72 ± 0,42 7,69 ±0,25 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 157RS 29,64 ± 0,23 10,18 ± 0,34 6,34 ±0,48 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 158AM 25,62 ± 0,74 6,66 ± 0,07 7,54 ±0,15 0,00 ± 0,00 III.b.1.2
Ss 159JPO 38,42 ± 0,24 5,07 ± 0,65 5,08 ±0,19 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 160MEX 41,09 ± 0,22 9,32 ± 0,47 8,59 ±0,45 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 161MEX 38,86 ± 0,22 10,32 ± 0,46 4,89 ±0,02 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
Ss 162MEX 46,59 ± 0,45 6,47 ± 0,40 8,57 ±0,28 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 163PER 45,83 ± 0,26 7,40 ± 0,45 3,91 ±0,13 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 164PER 41,31 ± 0,02 8,71 ± 0,07 4,33 ±0,20 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 167PER 43,85 ± 0,75 7,95 ± 0,22 5,64 ±0,62 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
Ss 168PER 37,00 ± 0,59 7,16 ± 0,22 3,85 ±0,12 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
FMR 8309RJ 41,33 ± 0,10 8,58 ± 0,34 4,79 ±0,61 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
FMR 8314RJ 42,23 ± 0,01 10,46 ± 0,30 8,19 ±1,26 0,00 ± 0,00 II.b.1.2
FMR 8600ESP 37,78 ± 1,06 1,67 ± 0,07 1,66 ±0,17 0,00 ± 0,00 III.a.2.2
FMR 8595ESP 36,97 ± 0,28 3,02 ± 0,20 2,24 ±0,04 0,00 ± 0,00 III.a.2.2
FMR 9108MEX 65,89 ± 0,02 3,59 ± 0,17 3,92 ±0,67 0,00 ± 0,00 I
FMR 9107MEX 63,62 ± 0,20 3,65 ± 0,00 2,54 ±0,25 0,00 ± 0,00 I
FMR 8939UK 39,78 ± 0,40 7,43 ± 0,62 4,53 ±0,57 0,00 ± 0,00 III.a.2.1
FMR 8803CHI 64,17 ± 0,64 19,91 ± 0,45 5,18 ±0,06 0,00 ± 0,00 II.a
FMR 6618USA 34,70 ± 0,10 4,54 ± 0,25 3,41 ±0,22 0,00 ± 0,00 III.b.1.1
FMR 9018USA 36,29 ± 0,40 11,73 ± 0,15 2,76 ±0,16 0,00 ± 0,00 III.a.1.2
CBS937.72AFR 52,32 ± 1,21 27,75 ± 0,82 3,12 ±0,00 0,00 ± 0,00 II.a
Média (n=170) 41,43 ± 8,28 9,76 ± 3,73 6,03 ± 2,28 0,00 ± 0,00 –
89
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Os isolados de Sporothrix spp. (n=170) crescem em média 41,43 ± 8,28 mm;
9,76 ± 3,73 mm; 6,03 ± 2,28 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias de incubação nas
temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente. A análise de clusterização
utilizando a distância Euclidiana revelou dentre os cento e setenta isolados a
presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas de crescimento distintas.
O cluster I é formado por seis cepas (3,52%), sendo duas de Pernambuco
(Ss 133 e Ss 134), duas do México (FMR 9107 e FMR 9108) e duas cepas de São
Paulo (Ss 117, Ss 132) as quais apresentam taxa de crescimento rápido a 30 ºC
(Figura 12C). A taxa de crescimento do cluster I foi de 65,88 ± 2,85 mm; 5,40 ± 2,01
mm; 4,21 ± 1,48 mm e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,
respectivamente. Dentre as amostras que compõem o cluster I, quatro foram
isoladas de casos de esporotricose humana (Ss 117, Ss 132, Ss 133 e Ss134) e 2
isolados do meio ambiente (FMR 9107 e FMR 9108) (Figura 13).
O cluster II é formado por 70 cepas (41,17%) com representantes da África
(1,42%, n=1), China (1,42%, n=1), Peru (4,28%, n=3), México (2,85%, n=2) e dos
estados brasileiros do Espírito Santo (2,85%, n=2), Goiás (2,85%, n=2), Minas
Gerais (10%, n=7), Mato Grosso (1,42%, n=1), Paraíba (4,28%, n=3), Pernambuco
(5,71%, n=4), Piauí (1,42%, n=1), Paraná (5,71%,n=4), Rio de Janeiro (10%, n=10),
Rio Grande do Sul (7,14%, n=5), São Paulo (32,85%, n=23), além do Distrito Federal
(1,42%, n=1) com taxa de cresimento intermediário a 30 ºC (Figura 12B). Dentre
as amostras que compõem o cluster II, 35 cepas (50%) foram isoladas de casos de
esporotricose cutânea fixa, 24 (34,28%) de esporotricose humana linfocutânea, 1
(1,42%) de esporotricose humana extracutânea, 1 (1,42%) de esporotricose humana
disseminada, 3 (4,28%) de esporotricose humana (sem dados clínicos), 2 (2,85%) de
esporotricose felina linfocutânea e 4 (5,71%) isolados ambientais. A taxa de
crescimento do cluster II foi de 46,79 ± 4,34 mm; 10,32 ± 3,67 mm; 6,65 ± 1,86 mm e
0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente (Fig. 13).
90
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
O cluster III é formado por 94 cepas (55,29%) com representantes do Japão
(1,06%, n=1), México (1,06%, n=1), Peru (1,06%, n=1), Espanha (2,12%, n=2),
Estados Unidos (2,12%, n=2), Reino Unido (1,06%, n=1) e dos estados brasileiros
do Amazonas (1,06%, n=1), Ceará (5,31%, n=5), Espírito Santo (1,06%, n=1), Goiás
(4,25%, n=4), Minas Gerais (9,57%, n=9), Pará (2,12%,n=2), Pernambuco (1,06%,
n=1), Paraná (17,02%, n=16), Rio de Janeiro (29,78%, n=28), Rio Grande do Sul
(14,89%, n=14) e São Paulo (5,31%, n=5) que apresentam taxa de crescimento
lento a 30 ºC (Figura 12A). Dentre as amostras que compõem o cluster III, 44 cepas
(46,80%) foram isoladas de casos de esporotricose humana fixa, 35 (37,23%) de
esporotricose humana linfocutânea, 1 (1,06%) de esporotricose humana
disseminada, 4 (4,25%) de esporotricose humana (sem dados clínicos), 8 (8,51%) de
esporotrotricose felina linfocutânea, 1 (1,06%) de esporotricose canina e 1 (1,06%)
isolado ambiental. A taxa de crescimento do cluster III foi de 35,88 ± 4,37 mm; 9,62
± 3,67 mm; 5,68 ± 2,47 mm e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40
ºC, respectivamente (Figura 13).
A análise de variância para o crescimento vegetativo nas diferentes
temperaturas de incubação foi considerada extremamente significantiva (p <
0,0001). As comparações estatísticas entre os clusters I e II; I e III e II e III para o
crescimento vegetativo a 30 ºC foram consideradas signigicativas pelo teste de
Tukey (p<0,001). À 35 ºC, o cluster I e II diferem estatísticamente pelo teste de
Tukey (p<0,01), assim como os cluster I e III (p<0,05). Os clusters II e III não diferem
estatísticamente (p>0,05) nesta temperatura de incubação . À 37 ºC, os clusters I e II
e os cluster II e III diferem estatísticamente pelo teste de Tukey (p<0,05). Os
clusters I e III não apresentam diferenças estatísticas significativas pelo mesmo teste
a 37 ºC (p>0,05).
91
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Figura 12: Aspecto macroscópico de culturas do complexo S. schenckii em placas de Petri (9 cm diam.) em meio PDA (potato-dextrose-agar), após 21 dias de
incubação à 30 °C. A) Ss 49 – Cluster III (taxa de crescimento lento); B) Ss 139 – Cluster II (taxa de crescimento intermediário); C) Ss 132 – Cluster I
(taxa de crescimento rápido).
92
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Figura 13: Análise de clusterização baseado no crescimento vegetativo apresentado pelos isolados do complexo
Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40ºC, em meio PDA,
aos 21 dias de incubação, de acordo com o coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).
93
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Os isolados brasilieros (n=153) do complexo S. schenckii crescem em média
41,04 ± 7,96 mm; 9,85 ± 3,25 mm; 6,21 ± 2,25 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias de
incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente. Os dados
referentes ao diâmetro das colônias obtidas para os isolados brasileiros separados
por região geográfica estão descritos na Tabela 10.
Quando agrupados por estados de origem os isolados brasileiros são
divididos em três grupos principais (Figura 14). O cluster I é formado pelo estado do
Amazonas com uma cepa (Ss158). O cluster I apresenta taxa de crescimento de
25,62 ± 0,00 mm; 7,66 ± 0,00 mm; 7,54 ± 0,00 mm e 0,00 ± 0,00 mm, em 21 dias de
incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.
O cluster II é formado pelo subgrupo II.a contendo os estados do Espírito
Santo e Rio de Janeiro e o subgrupo II.b com os estados de Goiás, Rio Grande do
Sul, Pará, Ceará, Paraná e Minas Gerais. O cluster II apresenta taxa de crescimento
de 38,83 ± 6,15 mm; 10,13 ± 3,41 mm; 6,16 ± 2,33 mm e 0,00 ± 0,00 mm em 21 dias
de incubação nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.
O cluster III é formado pelo subgrupo III.a contendo o estado do Piauí
enquanto o subgrupo III.b é composto pelos clados III.b.1 contendo os estados de
Mato Grosso, São Paulo e Paraíba e pelo clado III.b.2, contendo o estado de
Pernambuco e o Distriro Federal. O cluster III apresenta taxa de crescimento de
47,94 ± 3,25; 10,24 ± 3,57; 5,30 ± 1,80 e 0,00 ± 0,00 mm nas temperaturas de 30,
35, 37 e 40 ºC, respectivamente.
A análise de clusterização hierárquica dos estados brasileiros amostrados,
cujas cepas foram incubadas em diferentes temperaturas, indica que o agrupamento
dos estados ocorre de maneira independente das condições climáticas e
características ambientais peculiares de cada região (Figura 14). A origem
geográfica não influenciou o fitness das cepas brasileiras do complexo S. schenckii.
Desta maneira, cepas provenientes de estados com clima mesotérmico brando (com
94
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
temperatura média entre 10 e 15 ºC) como o Rio Grande do Sul não apresentaram
diferenças significativas com relação ao desempenho fisiológico de cepas
provenientes de regiões de clima subquente (média entre 15 e 18 ºC) como o estado
de Goiás ou aquelas provenientes de clima predominantemente quente (temperatura
média maior que 18 ºC em todos os meses do ano) como o estado do Ceará.
95
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Tabela 10: Diâmetro médio da colônia (mm) de isolados brasileiros cultivado em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação em
diferentes temperaturas, de acordo com a origem geográfica do isolado.
Localização Geográfica Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão
País Região Estado (nº de espécimes) 30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Brasil
(n=153)
Sul
(n=39)
Rio Grande do Sul (19) 36,42 ± 7,50 10,81 ± 1,81 7,99 ± 1,93 0,00 ± 0,00
Paraná (20) 38,37 ± 7,01 12,86 ± 3,50 5,08 ± 3,03 0,00 ± 0,00
Sudeste
(n=87)
São Paulo (30) 45,95 ± 8,64 9,36 ± 2,48 6,72 ± 1,91 0,00 ± 0,00
Rio de Janeiro (38) 39,19 ± 5,03 7,87 ± 1,72 6,19 ± 1,42 0,00 ± 0,00
Minas Gerais (16) 42,01 ± 5,41 11,46 ± 3,93 4,86 ± 2,40 0,00 ± 0,00
Espírito Santo (3) 42,55 ± 1,79 7,85 ± 0,46 7,52 ± 0,70 0,00 ± 0,00
Centro-Oeste
(n=8)
Mato Grosso (1) 45,92 ± 0,00 13,06 ± 0,00 5,74 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Goiás (6) 35,69 ± 6,02 8,55 ± 3,15 5,00 ± 1,14 0,00 ± 0,00
Distrito Federal (1) 50,77 ± 0,00 6,89 ± 0,00 6,78 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Nordeste
(n=16)
Ceará (5) 38,85 ± 2,77 11,94 ± 4,13 7,10 ± 1,60 0,00 ± 0,00
Pernambuco (7) 51,78 ± 10,82 7,91 ± 2,18 5,58 ± 2,17 0,00 ± 0,00
Piauí (1) 46,28 ± 0,00 16,80 ± 0,00 1,45 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Paraíba (3) 45,60 ± 1,97 7,66 ± 0,90 5,59 ± 1,52 0,00 ± 0,00
Norte
(n=3)
Amazonas (1) 25,62 ± 0,00 7,66 ± 0,00 7,54 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Pará (2) 37,89 ± 0,19 12,37 ± 3,01 8,44 ± 1,37 0,00 ± 0,00
Média (n=153) 41,04 ± 7,96 9,85 ± 3,25 6,21 ± 2,25 0,00 ± 0,00
96
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Figura 14: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado pelos
isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,
agrupados de acordo com o estado de origem das cepas brasileiras de Sporothrix spp.
Distância Euclidiana (método de ligação complete).
Os isolados de Sporothrix spp. (n=163) foram agrupados de acordo com a
forma clínica provocada em hospedeiro humano e a origem animal ou ambiental. As
taxas de crescimento destes isolados estão descritos na Tabela 11.
97
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii.
Resultados
Tabela 11: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo
com a origem do isolado e a forma clínica da doença desenvolvida no hospedeiro.
Origem do isolado Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão
Hospedeiro Forma Clínica (nº de espécimes) 30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ori
gem
Clín
ica
Humana
(n=145)
Cutânea fixa (80) 41,26 ± 7,22 9,75 ± 3,35 6,17 ± 2,12 0,00 ± 0,00
Linfocutânea (62) 41,78 ± 8,53 9,67 ± 3,18 5,92 ± 2,28 0,00 ± 0,00
Disseminada (2) 39,25 ± 1,30 12,25 ± 1,11 3,47 ± 1,55 0,00 ± 0,00
Extracutânea (1) 43,76 ± 0,00 13,13 ± 0,00 6,45 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Animal
(n=11)
Esporotricose Felina (10) 34,46 ± 6,44 10,58 ± 2,70 7,90 ± 2,16 0,00 ± 0,00
Esporotricose Canina (1) 30,63 ± 0,00 9,35 ± 0,00 9,14 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Ambiental (n=7) Solo e Vegetal (7) 53,32 ± 10,11 8,27 ± 5,05 5,12 ± 1,71 0,00 ± 0,00
Média1 (163) 41,48 ± 8,37 9,75 ± 3,35 6,12 ± 2,24 0,00 ± 0,00
1Nesta análise não foram incluídos os isolados FMR 8309, FMR 8314, FMR 8600, FMR 8595, FMR 6618, FMR 9018 e CBS 937.72 porque não tínhamos em
mãos os dados referentes à forma clínica destas cepas.
98
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Quando calculamos a média de crescimento, agrupando as cepas de acordo
com a forma clínica apresentada pelo paciente, a origem animal ou ambiental
observou-se três grupos distintos (Figura 15). Os clusters I e II são formados por
cepas isoladas de hospedeiros mamíferos enquanto que o cluster III é formado por
cepas de origem ambiental. O cluster I compreende as cepas isoladas de casos
clínicos de esporotricose canina e felina. O cluster II corresponde a média dos
fungos isolados de lesões provocadas em hospedeiro humano.
Os agrupamentos detectados para a origem geográfica ocorrem
independentemente das características clímáticas ou dos biomas brasileiros. Não
observamos nenhuma correlação entre a área geográfica de isolamento do fungo e
e o comportamento in vitro em função da temperatura , evidenciando deste modo
que os aspectos morfológicos derivados da expansão da colônia independem da
origem geográfica do fungo e que a população de Sporothrix é altamente
heterogenea ao longo do território brasileiro, sendo isolado de uma mesma área
fungos com atributos biológicos diferentes.
Quando os isolados são agrupados por forma clínica ou origem ambiental
nota-se que as cepas de origem ambiental cresceram mais rapidamente e obtiveram
maior diâmetro da colônia (53,32 ± 10,11 mm) aos 21 dias de incubação a 30 ºC em
meio PDA. Os isolados provenientes da forma clínica cutânea fixa e linficutânea de
esporotricose humana apresentam o mesmo padrão de crescimento nas diferentes
temperturas avaliadas. Juntamente com os isolados provenientes de outras formas
clínicas humanas formam o cluster II. Não exite diferença no perfil de similaridade
entre estas cepas, o que nos leva a acreditar que a capacidade de provocar as
distintas formas clínicas da doença em hospedeiro humano poderia não estar
diretamente relacionado à sensibilidade térmica, mas possívelmente o curso da
doença decorra das condições de defesa do sistema imunitário do hospedeiro aliado
a outras caraterísticas biológicas e fisiológicas de virulência do patógeno.
99
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Por outro lado, os isolados obtidos de casos de esporotricose canina e felina
obtiveram as maiores médias de crescimento a 37 ºC. Possivelmente a temperatura
corporal destes mamíferos (aproximadamente 38 ºC) possa exercer uma pressão
seletiva sobre a população parasita, selecionando espécimes termotolerantes.
Figura 15: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias apresentado pelos
isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 ºC,
agrupados de acordo com a forma clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem
ambiental. Distância Euclidiana (método de ligação complete).
Após a taxonomia polifásica das cepas de Sporothrix spp., os isolados foram
agrupados de acordo com a espécie filogenética e, em seguida, calculou-se a média
de crescimento nas diferentes temperaturas de incubação (30, 35, 37 e 40 ºC),
seguindo-se o parâmetro taxonômico. Os dados referentes ao crescimento
vegetativo levando-se em consideração a espécie filogenética estão descritos na
Tabela 12.
100
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 12: Diâmetro médio da colônia (mm) em meio de cultura PDA aos 21 dias de
incubação em diferentes temperaturas de acordo com a espécie
filogenética.
Espécie
filogenética
Diâmetro da colônia (mm) ± Desvio padrão
30 ºC 35 ºC 37 ºC 40 ºC
S. brasiliensis (n=73) 37,71 ± 5,14 10,15 ± 3,18 6,86 ± 2,20 0,00 ± 0,00
S. schenckii (n=84) 43,27 ± 7,76 9,76 ± 3,03 5,69 ± 2,12 0,00 ± 0,00
S. globosa (n=5) 37,00 ± 2,69 3,04 ± 1,06 2,79 ± 1,10 0,00 ± 0,00
S. mexicana (n=5) 62,87 ± 7,66 5,27 ± 1,34 3,79 ± 0,76 0,00 ± 0,00
S. albicans (n=2) 51,97 ± 12,1 13,67 ± 6,23 4,86 ± 0,32 0,00 ± 0,00
S. luriei (n=1) 52,32 ± 0,00 29,75 ± 0,00 3,12 ± 0,00 0,00 ± 0,00
Média (n=170) 41,43 ± 8,28 9,76 ± 3,73 6,03 ± 2,28 0,00 ± 0,00
Quando os isolados (n=170) são agrupados levando-se em consideração a
variável espécie filogenéticas nota-se a presença de três clusters (Figura 16).
Sporothrix schenckii, S. brasiliensis e S. globosa formam o cluster I
contendo a maioria dos isolados estudados (95,29%, n=160). Com exceção de S.
globosa, as espécies S. brasiliensis e S. schenckii apresentaram desenvolvimento
satisfatório in vitro quando incubadas à 37 ºC.
O cluster II (4,11%, n=7) é formado por S. albicans (51,97 ± 12,1) e S.
mexicana (62,87 ± 7,66) os quais apresentam as maiores taxas de crescimento em
meio PDA, aos 21 dias de incubação a 30 ºC.
O cluster III (0,58%, n=1) é formado por S. luriei com um único
representante descrito na literatura, o qual é capaz de crescer por volta de 30 mm
aos 21 dias de incubação a 35 ºC.
101
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 16: Análise de clusterização em função do diâmetro médio das colônias (30, 35, 37 e 40 ºC)
apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo S. schenckii de acordo com o
coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).
4.2.2. Inibição do crescimento vegetativo
Em posse dos dados de diferentes variáveis de incubação foi possível
calcular a inibição do crescimento vegetativo nas diferentes temperaturas descritas
para cada isolado fúngico. Os dados referentes às porcentagens de inibição são
descritos na tabela 13. Em todos os experimentos de crescimento vegetativo
utilizamos as cepas tipo descritas por Marimon et al. (2007) e depositadas no
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) como parâmetros de comparação de
resultados. Os dados referentes a estas cepas encontram-se junto à referida tabela.
102
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 13: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo in vitro em meio PDA
aos 21 dias de incubação nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em função
de diferentes temperaturas.
Código do
Isolado
Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster
Ss 01SP 79,91 91,10 100 II.b.1.2
Ss 02RS 76,13 90,19 100 II.b.2.1
Ss 03RS 74,58 90,06 100 II.b.2.1
Ss 04RS 78,76 88,25 100 II.b.1.2
Ss 05MG 62,17 87,35 100 II.b.2.2
Ss 06MG 94,27 95,02 100 III.b.2
Ss 07MG 72,52 87,59 100 II.b.2.1
Ss 08MG 68,23 86,38 100 II.b.2.1
Ss 09MG 66,06 97,23 100 II.b.2.2
Ss 10MG 65,02 87,17 100 II.b.2.2
Ss 11MG 62,13 87,53 100 II.b.2.2
Ss 12MG 74,81 80,30 100 II.b.1.1
Ss 13MG 62,28 93,75 100 II.b.2.2
Ss 14MG 64,76 94,96 100 II.b.2.2
Ss 15MG 87,53 96,79 100 III.a.2
Ss 16PI 63,68 96,86 100 II.b.2.2
Ss 17PR 59,13 90,00 100 II.b.2.2
Ss 19PR 83,40 95,46 100 III.a.2
Ss 20PR 50,95 86,57 100 I
Ss 21PR 67,05 95,73 100 II.b.2.2
Ss 22PR 60,00 91,51 100 II.b.2.2
Ss 24PR 71,51 91,11 100 II.b.2.1
Ss 25PR 73,71 96,62 100 II.b.2.1
Ss 26PR 70,19 92,98 100 II.b.2.1
Ss 27PR 60,45 89,39 100 II.b.2.2
Ss 28PR 72,48 95,84 100 II.b.2.1
Ss 30PR 62,48 93,72 100 II.b.2.2
Ss 31PR 64,64 83,24 100 II.a.1.2
Ss 32PR 78,38 81,09 100 II.b.1.1
Ss 33PR 67,81 76,62 100 II.a.1.2
Ss 34PR 77,65 77,72 100 II.b.1.1
Ss 35PR 49,77 77,27 100 I
Ss 36PR 79,17 85,17 100 II.b.1.2
Continua...
103
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do
Isolado
Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster
Ss 37PR 28,20 73,58 100 I
Ss 38PR 60,97 75,22 100 II.a.1.1
Ss 39PR 71,65 86,47 100 II.b.2.1
Ss 40CE 66,01 83,04 100 II.a.1.2
Ss 41CE 90,21 90,24 100 III.a.1
Ss 42CE 65,02 77,98 100 II.a.1.2
Ss 43CE 59,30 78,06 100 II.a.1.1
Ss 44CE 64,17 78,11 100 II.a.1.2
Ss 45GO 73,28 84,36 100 II.b.2.1
Ss 46GO 48,00 84,90 100 I
Ss 47GO 71,71 80,37 100 II.b.1.1
Ss 48GO 84,38 87,52 100 II.b.1.2
Ss 49GO 86,38 86,95 100 II.b.1.2
Ss 50GO 83,75 90,67 100 II.b.1.2
Ss 51PA 59,18 73,93 100 II.a.1.1
Ss 52SP 70,82 71,56 100 II.a.2.1
Ss 53RS 68,46 70,56 100 II.a.2.1
Ss 54RS 70,87 71,05 100 II.a.2.1
Ss 55RS 57,83 71,23 100 II.a.1.1
Ss 56RS 60,84 78,93 100 II.a.1.1
Ss 57RS 61,08 74,47 100 II.a.1.1
Ss 58SP 77,56 82,35 100 II.b.1.1
Ss 59SP 74,02 79,63 100 II.b.1.1
Ss 60SP 79,12 83,91 100 II.b.1.2
Ss 61SP 88,00 88,97 100 III.a.1
Ss 62ES 81,91 83,70 100 II.b.1.1
Ss 63ES 81,60 81,86 100 II.b.1.1
Ss 64ES 81,12 81,48 100 II.b.1.1
Ss 65RJ 79,93 80,43 100 II.b.1.1
Ss 66RJ 81,85 86,52 100 II.b.1.2
Ss 67RJ 84,24 85,81 100 II.b.1.2
Ss 68RJ 73,39 75,08 100 II.a.2.1
Ss 69RJ 71,18 84,65 100 II.b.2.1
Ss 70RJ 79,55 82,57 100 II.b.1.1
Ss 71RJ 85,42 88,05 100 II.b.1.2
Ss 72RJ 82,38 85,71 100 II.b.1.2
104
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do
Isolado
Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster
Ss 73RJ 78,86 87,05 100 II.b.1.2
Ss 74RJ 85,30 85,63 100 II.b.1.2
Ss 75RJ 82,89 89,09 100 II.b.1.2
Ss 76RJ 79,44 81,59 100 II.b.1.1
Ss 77RJ 68,91 72,86 100 II.a.2.1
Ss 78RJ 81,09 86,80 100 II.b.1.2
Ss 79RJ 84,31 85,88 100 II.b.1.2
Ss 80RJ 86,25 88,16 100 II.b.1.2
Ss 81RJ 86,52 87,69 100 II.b.1.2
Ss 82RJ 80,83 83,32 100 II.b.1.1
Ss 83RJ 70,32 81,81 100 II.a.1.2
Ss 84RJ 80,06 80,25 100 II.b.1.1
Ss 85RJ 74,04 74,77 100 II.a.2.1
Ss 86RJ 80,49 81,04 100 II.b.1.1
Ss 87RJ 61,07 73,03 100 II.a.1.1
Ss 88RJ 80,77 80,80 100 II.b.1.1
Ss 89RJ 86,92 87,27 100 II.b.1.2
Ss 90RJ 79,69 82,43 100 II.b.1.1
Ss 91RJ 74,36 80,34 100 II.b.1.1
Ss 92RJ 79,60 86,23 100 II.b.1.2
Ss 93RJ 87,61 87,96 100 III.a.1
Ss 94RJ 80,59 81,52 100 II.b.1.1
Ss 95RJ 82,38 85,19 100 II.b.1.2
Ss 96RJ 78,71 88,49 100 II.b.1.2
Ss 97RJ 84,14 89,23 100 II.b.1.2
Ss 98RJ 81,79 88,30 100 II.b.1.2
Ss 99RJ 73,13 88,14 100 II.b.2.1
Ss 100RJ 81,91 86,05 100 II.b.1.2
Ss 101SP 73,79 88,81 100 II.b.2.1
Ss 102SP 84,98 85,33 100 II.b.1.2
Ss 103SP 75,90 88,46 100 II.b.2.1
Ss 104MG 71,55 87,48 100 II.b.2.1
Ss 105MG 72,98 81,85 100 II.b.1.1
Ss 106MG 88,33 88,74 100 III.a.1
Ss 107MG 68,14 82,44 100 II.a.1.2
Ss 109MG 76,26 85,16 100 II.b.2.1
105
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do
Isolado
Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster
Ss 110MG 74,13 86,37 100 II.b.2.1
Ss 111SP 71,70 85,79 100 II.b.2.1
Ss 112SP 80,98 85,65 100 II.b.1.2
Ss 113SP 76,17 92,05 100 II.b.1.2
Ss 114SP 84,33 84,64 100 II.b.1.2
Ss 115SP 74,96 82,27 100 II.b.1.1
Ss 116SP 89,17 89,59 100 III.a.1
Ss 117SP 84,21 88,21 100 II.b.1.2
Ss 118SP 79,98 80,42 100 II.b.1.1
Ss 119SP 69,98 85,24 100 II.b.2.1
Ss 120SP 74,69 86,00 100 II.b.2.1
Ss 121SP 78,36 83,69 100 II.b.1.2
Ss 122SP 68,45 80,33 100 II.a.1.2
Ss 123SP 75,72 84,54 100 II.b.2.1
Ss 124SP 76,11 89,07 100 II.b.2.1
Ss 125SP 76,76 78,48 100 II.b.1.1
Ss 126SP 85,36 88,78 100 II.b.1.2
Ss 127SP 88,98 89,53 100 III.a.1
Ss 128SP 73,93 74,07 100 II.a.2.1
Ss 129SP 86,27 88,95 100 II.b.1.2
Ss 130PE 74,84 89,25 100 II.b.2.1
Ss 131PE 84,35 91,16 100 II.b.1.2
Ss 132SP 92,88 93,01 100 III.b.1
Ss 133PE 91,23 94,89 100 III.b.1
Ss 134PE 94,11 95,04 100 III.b.2
Ss 135PE 82,09 84,90 100 II.b.1.2
Ss 136PE 79,81 81,36 100 II.b.1.1
Ss 137PE 77,67 82,73 100 II.b.1.1
Ss 138PB 83,97 85,66 100 II.b.1.2
Ss 139PB 80,19 92,25 100 II.b.1.2
Ss 140PB 85,33 85,34 100 II.b.1.2
Ss 141DF 86,42 86,63 100 II.b.1.2
Ss 143PA 75,42 81,43 100 II.b.1.1
Ss 144RS 82,53 83,29 100 II.b.1.1
Ss 145RS 64,05 81,69 100 II.a.1.2
106
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Conclusão...
Código do
Isolado
Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC Cluster
Ss 146AM 44,54 55,62 100 –
Ss 147AM 46,91 53,73 100 –
Ss 148SP 73,53 75,50 100 II.a.2.1
Ss 149RS 73,70 73,93 100 II.a.2.1
Ss 150RS 70,33 78,70 100 II.a.1.2
Ss 151RS 69,46 70,14 100 II.a.2.1
Ss 152RS 64,23 71,53 100 II.a.2.2
Ss 153RS 72,73 73,02 100 II.a.2.1
Ss 154RS 65,09 65,81 100 II.a.2.2
Ss 155RS 67,13 69,63 100 II.a.2.2
Ss 156RS 75,00 82,06 100 II.b.1.1
Ss 157RS 65,66 78,58 100 II.a.1.2
Ss 158AM 70,07 70,57 100 II.a.2.1
Ss 159JPO 85,49 86,77 100 II.b.1.2
Ss 160MEX 76,09 79,09 100 II.b.1.1
Ss 161MEX 73,43 87,40 100 II.b.2.1
Ss 162MEX 81,28 81,60 100 II.b.1.1
Ss 163PER 83,84 91,46 100 II.b.1.2
Ss 164PER 78,91 89,51 100 II.b.1.2
Ss 167PER 81,87 87,12 100 II.b.1.2
Ss 168PER 80,63 89,57 100 II.b.1.2
FMR 8309RJ 79,22 88,41 100 II.b.1.2
FMR 8314RJ 75,22 80,59 100 II.b.1.1
FMR 8600ESP 95,57 95,59 100 III.b.2
FMR 8595ESP 91,82 93,94 100 III.b.1
FMR 9108MEX 93,41 94,04 100 III.b.1
FMR 9107MEX 94,25 96,00 100 III.b.2
FMR 8939UK 81,31 88,60 100 II.b.1.2
FMR 8803CHI 68,97 91,91 100 II.b.2.1
FMR 6618USA 86,90 90,15 100 III.a.1
FMR 9018USA 67,67 92,39 100 II.b.2.1
CBS 937.72AFR 43,12 94,03 100 I
Média (n=172) 75,53 ± 10,24 84,88 ± 6,61 100 ± 0,00 –
107
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
A análise de clusterização utilizando a distância Euclidiana revelou a
presença de três grupos principais (cluster I, II e III) com taxas de inibição do
crescimento distintas (Figura 17).
O cluster I é formado por cinco cepas (2,94%), sendo três do estado do
Paraná (Ss 20, Ss 35 e Ss 37), uma cepa de Goiás (Ss 46) e uma cepa da África
(CBS 937.72), as quais são fracamente inibidas à temperatura de 35 ºC e
moderadamente inibidas à temperatura de 37 ºC. A porcentagem de inibição do
crescimento do cluster I em relação ao diâmetro obtido para a temperatura de 30 ºC
foi de 44,01 ± 8,34; 83,27 ± 7,19; e 100 ± 0,00 nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC
respectivamente.
O cluster II é formado por 148 cepas (87,05%), com representantes da
China (0,67%, n=1), Estados Unidos (0,67%, n=1), Japão (0,67%, n=1), México
(2,02%, n=3), Peru (2,70%, n=4), Reino Unido (0,67%, n=1) e os estados brasileiros
do Amazonas (0,67%, n=1), Ceará (2,70%, n=4), Espírito Santo (2,02%, n=3), Goiás
(3,37%, n=5), Minas Gerais (8,78%, n=13), Mato Grosso (0,67%, n=1), Pará (1,35%,
n=2), Paraíba (2,02%, n=3), Pernambuco (3,37%, n=5), Piauí (0,67%, n=1), Paraná
(10,81%, n=16), Rio de Janeiro (25%, n=37), Rio Grande do Sul (12,83%, n=19),
São Paulo (17,56%, n=26) além do Distrito Federal (0,67%, n=1) as quais são
moderadamente inibidas à temperatura de 35 e 37 ºC. Dentre as amostras que
compõem o cluster II, 73 cepas (49,32%) foram isoladas de casos de esporotricose
humana cutânea fixa, 54 (36,48%) foram isoladas de casos de esporotricose
humana linfocutânea, 1 (0,67%) de esporotricose humana extracutânea, 2 (1,35%)
de esporotricose humana disseminada, 3 (2,02%) de esporotricose humana (sem
dados clínicos), 10 (6,75%) de esporotricose felina, 1 (0,67%) de esporotricose
canina e 4 (2,70%) isolados ambientais. A porcentagem de inibição do crescimento
do cluster II em relação ao diâmetro (em mm) obtido para a temperatura de 30 ºC foi
108
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
de 74,88 ± 7,57; 84,04 ± 6,31 e 100 ± 0,00 nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC,
respectivamente.
O cluster III é formado por 17 cepas (10%), com representantes da Espanha
(11,76%, n=2), México (11,76%, n=2), Estados Unidos (5,88%, n=1) e os estados
brasileiros do Ceará (5,88%, n=1), Minas Gerais (17,64%, n=3), Pernambuco
(11,76%, n=3), Paraná (5,88%, n=1), Rio de Janeiro (5,88%, n=1) e São Paulo
(23,52%, n=3) as quais são fortemente inibidas à temperatura de 35 e 37 ºC.
Dentre as amostras que compõem o cluster III, 4 cepas (23,52%) foram isoladas de
casos de esporotricose humana cutânea fixa, 7 cepas (41,17%) foram isoladas de
casos de esporotricose humana linfocutânea, 3 (17,64%) de esporotricose humana
(sem dados clínicos) e 3 cepas (17,64%) de origem ambiental. A porcentagem de
inibição do crescimento do cluster III em relação ao diâmetro obtido para a
temperatura de 30 ºC foi de 90,45 ± 3,24; 92,64 ± 2,93 e 100 ± 0,00 mm nas
temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, respectivamente.
A análise de variância para a inibição do crescimento vegetativo nas
diferentes temperaturas de incubação foi considerada extremamente significante (p
< 0,0001). As comparações entre os clusters I, II e III para a inibição a 35ºC foi
considerada signigicativas pelo teste de Tukey (p<0,001). A 37 ºC, o cluster I e II
não diferem estatísticamente (p>0,05). O cluster I difere estatisticamente do cluster
III (p<0,01) e o cluster II apresenta diferença estatística significativa quando
comparado ao cluster III (p<0,001) pelo teste de Tukey.
109
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 17: Análise de clusterização baseado na inibição do crescimento vegetativo aos 21 dias de incubação em
meio PDA, apresentado pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii em função do diâmetro das colônias nas
temperaturas de 35, 37 e 40ºC em relação à temperatura de 30 ºC, de acordo com o coeficiente Euclidiano.
110
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Os isolados brasilieros (n=153) do complexo S. schenckii são inibidos em
média 75,00 ± 9,85%; 84,32 ± 6,57% e 100 ± 0,00% aos 21 dias de incubação nas
temperaturas de 35, 37 e 40 ºC, respectivamente, em relação ao diâmetro obtido
para a temperatura de incubação de 30 ºC. Os dados referentes à inibição do
crescimento vegetativo em função da temperatura de incubação dos isolados
separados por região geográfica estão descritos abaixo na Tabela 14.
Tabela 14: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo em meio de cultura
PDA aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo
com a origem geográfica do isolado.
Localização Geográfica Inibição do crescimento (%) em relação à
30ºC:
Região Estado (Espécimes) 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Sul
(n=39)
Rio Grande do Sul (19) 69,39 ± 6,35 77,01 ± 7,12 100 ± 0,00
Paraná (20) 65,48 ± 12,28 86,77 ± 7,45 100 ± 0,00
Sudeste
(n=87)
São Paulo (30) 78,89 ± 6,23 84,86 ± 5,21 100 ± 0,00
Rio de Janeiro (38) 79,59 ± 5,53 83,91 ± 4,44 100 ± 0,00
Minas Gerais (16) 72,48 ± 9,63 88,66 ± 5,18 100 ± 0,00
Espírito Santo (3) 81,54 ± 0,32 82,35 ± 0,96 100 ± 0,00
Centro-
Oeste
(n=8)
Mato Grosso (1) 71,55 ± 0,00 87,48 ± 0,00 100 ± 0,00
Goiás (6) 74,58 ± 13,14 85,80 ± 3,17 100 ± 0,00
Distrito Federal (1) 86,42 ± 0,00 86,63 ± 0,00 100 ± 0,00
Nordeste
(n=16)
Ceará (5) 68,94 ± 10,87 81,48 ± 4,78 100 ± 0,00
Pernambuco (7) 83,44 ± 6,52 88,47 ± 5,18 100 ± 0,00
Piauí (1) 63,68 ± 0,00 96,86 ± 0,00 100 ± 0,00
Paraíba (3) 83,16 ± 2,17 87,75 ± 3,18 100 ± 0,00
Norte
(n=3)
Amazonas (1) 70,07 ± 0,00 70,57 ± 0,00 100 ± 0,00
Pará (2) 67,30 ± 8,11 77,68 ± 3,74 100 ± 0,00
Média (n=153) 75,00 ± 9,85 84,32 ± 6,57 100 ± 0,00
111
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Quando os resultados de inibição do crescimento foram avaliados levendo-
se em consideração a similariade de inibição obtida de acordo com a origem
geográfica observou-se três clusters distintos (Figura 18). Os isolados do complexo
S. schenckii apresentam comportamento de termotolerância distintos, independente
da região de origem.
O cluster I é formado por dois subgrupos (I.a e I.b). O subgrupo I.a é
representado pelo estado do Amazonas. O subgrupo I.b é formado pelos estados do
Rio Grande do Sul, Pará e Ceará. O cluster II, compreende os subgrupos II.a e II.b.
O subgrupo II.a é composto pelos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito
Santo. O subgrupo II.b é formado pelos estados da Paraíba, Pernambuco e o Distrito
Federal. O cluster III é formado pelos subgrupos III.b e III.a. O subgrupo III.a é
formado pelos estados de Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais e Paraná. O subgrupo
III.b é representado pelo estado do Piauí.
112
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 18: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo apresentado
pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em
relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com o estado
de origem das cepas brasileiras. Distância Euclidiana (método de ligação complete).
A inibição do crescimento foi avaliada levando-se em consideração a forma
clínica apresentada pelo paciente, a origem animal ou ambiental. Os dados
referentes à inibição do crescimento vegetativo agrupados de acordo com a fonte
estão descritos na Tabela 15.
113
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 15: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA
aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a
origem do isolado e a forma clínica da doença desenvolvida no
hospedeiro.
Origem da amostra Inibição do crescimento (%) em relação
à 30ºC:
Hospedeiro Forma Clínica/Fonte 35 ºC 37 ºC 40 ºC
Ori
ge
m C
lín
ica
Humana
(n=145)
Cutânea fixa (80) 75,69 ± 10,04 84,73 ± 5,64 100 ± 0,00
Linfocutânea (62) 75,62 ± 9,83 85,31 ± 6,29 100 ± 0,00
Disseminada (2) 68,64 ± 3,87 91,27 ± 3,68 100 ± 0,00
Extracutânea (1) 69,98 ± 0,00 85,24 ± 0,00 100 ± 0,00
Animal
(n=11)
Esporotricose felina (10) 69,12 ± 5,21 76,07 ± 7,92 100 ± 0,00
Esporotricose canina (1) 69,46 ± 0,00 70,14 ± 0,00 100 ± 0,00
Ambiental (n=7) Solo e vegetal (7) 84,16 ± 8,05 89,75 ± 4,42 100 ± 0,00
Média1 (n=163) 75,46 ± 9,88 84,63 ± 6,57 100 ± 0,00
1Nesta análise não foram incluídos os isolados FMR 8309, FMR 8314, FMR 8600, FMR 8595, FMR 6618, FMR 9018 e CBS
937.72 porque não tínhamos em mãos os dados referentes à forma clínica destas cepas.
A análise de clusterização utilizando a distância Euclidiana revelou dentre os
173 isolados a presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas de inibição do
crescimento distintas (Figura 19) levando-se em consideração a variação obtida para
cada categoria.
O cluster I é formado pelos isolados ambientais (n=7; 4,29%), os quais são
inibidos em média 84,16% a 35 ºC e 89,75 % a 37 ºC. O cluster II é formado pelas
cepas de hospedeiro humano (n=145; 88,95%) as quais são inibidas em média
75,52% a 35 ºC e 85,07% a 37 ºC. O cluster III é representado pelas cepas isoladas
de casos de esporotricose animal (n=11; 6,74%), as quais são inibidas 69,16% em
média a 35 ºC e 75,53% a 37 ºC. As cepas de origem animal são mais
termotolerantes do que as cepas de orgiem humana e ambiental. As cepas de
origem ambiental foram mais sensíveis à ação da temperatura quando comparados
114
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
as cepas de esporotricose humana. Os isolados provenientes de esporotricose
animal foram mais resistentes ao aumento da temperatura in vitro quando
comparados com os isolados de origem ambiental e humana.
Figura 19: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo apresentado
pelos isolados do complexo Sporothrix schenckii nas temperaturas de 35, 37 e 40ºC em
relação ao diâmetro das colônias incubadas a 30 ºC, agrupados de acordo com a forma
clínica desenvolvida pelos hospedeiros ou origem ambiental. Distância Euclidiana
(método de ligação complete).
Após a taxonomia polifásica das cepas de Sporothrix spp., os isolados foram
agrupados de acordo com a espécie filogenética e, em seguida, calculou-se a
porcentagem de inibição do crescimento nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC em
relação ao diâmetro obtido para o crescimento das cepas quando incubadas a 30 ºC.
Os dados referentes à inibição do crescimento vegetativo levando-se em
consideração a espécie filogenética estão descritos na Tabela 16.
115
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 16: Porcentagem de inibição do crescimento vegetativo meio de cultura PDA
aos 21 dias de incubação em diferentes temperaturas de acordo com a
espécie filogenética.
Código do Isolado Inibição do crescimento (%) em relação à 30ºC:
35 ºC 37 ºC 40 ºC
S. brasiliensis (n=73) 72,60 ± 9,53 81,32 ± 6,78 100 ± 0,00
S. schenckii (n=84) 76,58 ± 8,93 86,76 ± 4,85 100 ± 0,00
S. globosa (n=5) 91,65 ± 3,22 92,35 ± 3,27 100 ± 0,00
S. mexicana (n=5) 91,23 ± 3,57 93,82 ± 1,65 100 ± 0,00
S. albicans (n=2) 75,14 ± 6,17 90,25 ± 1,65 100 ± 0,00
S. luriei (n=1) 43,12 ± 0,00 94,03 ± 0,00 100 ± 0,00
Média (n=170) 75,53 ± 10,24 84,88 ± 6,61 100 ± 0,00
A análise de clusterização das espécies filogenéticas com base nos
resultados de inibição de crescimento nas temperaturas de 35, 37 e 40 ºC utilizando
a distância Euclidiana revelou a presença de três grupos (cluster I, II e III) com taxas
de inibição do crescimento distintas (Figura 20).
O cluster I é formado pelas espécies S. globosa e S. mexicana as quais
apresentam o mesmo perfil de inibição nas temperaturas avaliadas. Estas espécies
apresentaram inibição no crescimento vegetativo superior a 90%.
O cluster II é formado pelas espécies S. brasiliensis, S. albicans e S.
schenckii, com comportamento mais heterogêneo nas temperaturas de incubação
avaliadas. A taxa de inibição do crescimento vegetativo variou entre 70 e 90%.
O cluster III compreende a espécie filognética S. luriei, a qual é pouco
inibida na temperatura de 35 ºC (43,12%), diferenciando-se fisiologicamente das
demais espécies filogenéticas estudadas.
116
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 20: Análise de clusterização em função da inibição do crescimento vegetativo nas
temperaturas de 35, 37 e 40 ºC (em relação ao diâmetro obtido na temperatura de 30
ºC) apresentado pelas espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii, de
acordo com o coeficiente Euclidiano (método de ligação complete).
A figura 21 sumariza os resultados referentes à inibição do crescimento dos
isolados estudados do complexo S. schenckii, levando-se em consideração três
variáveis para agrupamento: i) origem geográfica (Figura 21 A e B); ii) origem clínica
ou substrato (Figura 21 C e D) e; iii) espécie filogenética (Figura 21 E e F). A análise
estatística foi realizada com base no teste de ANOVA, seguida do teste de Tukey
para a comparação de médias (GraphPad Prism v. 5.00, San Diego California USA).
Foram consideradas estatisticamente significativas as comparações em que p <
0.05. As diferenças estatísticas significativas estão anotadas diretamente na Figura
21.
117
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 21: Inibição do crescimento dos isolados do complexo Sporothrix schenckii de acordo com a
origem geográfica dos isolados brasileiros (A e B), a origem humana (fixa e linfocutânea),
animal e ambiental (C e D) e a espécie filognética (E e F) a 35º e 37º C em relação a
temperatura de 30 ºC (21 dias de incubação). SE= Sudeste; S= Sul; CO= Centro-Oeste;
N= Norte; NE= Nordeste. (Barras: Valores máximos e mínimos).
118
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
4.3 Características microscópicas
Os tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas de Sporothrix
spp. foram avaliados através do microcultivo em meio de cultura PDA, incubados a
temperatura ambiente, durante 7-10 dias. Os caracteres morfológicos foram
empregados como dados taxonômicos para a classificação das cepas estudadas. A
figura 22 ilustra os principais tipos morfológicos encontrados para as cepas de
Sporothrix spp. Dentre estes se destacam os conídios globosos demácios (Figura
22A), triangulares demácios (Figura 22B), subglobosos hialinos (Figura 22C) e
circulares pigmentados (Figura 22D).
Figura 22: Tipos morfológicos dos conídios produzidos pelas cepas brasileiras do complexo
Sporothrix schenckii. A) Conídios globosos de S. globosa (Ss06) diam.: 3,18 µm; B)
Conídios tringulares de S. schenckii (Ss 58) diam.: 3,2 µm; C) Conídios obovóides de S.
mexicana (Ss 132) diam.: 3,13 µm; D) Conídios circulares de S. brasiliensis (Ss 10)
diam.: 2,6 µm. Aumento 400X. Quadrantes em destaque 1000X. Barra: 3 µm.
119
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
4.4 Perfil bioquímico de assimilação de fontes de carbono
Conídios de 170 cepas de Sporothrix spp., com 10 a 14 dias de cultivos,
foram utilizados em ensaios de assimilação de fontes de carbonos (glicose, rafinose,
ribitol e sacarose), sendo realizadas leituras no quinto e décimo dia de incubação
(Figura 23). Os resultados obtidos para os dois tempos de leitura estão descritos na
Tabela 17.
Após 5 dias de incubação, 100% das cepas utilizadas foram capazes de
assimilar glicose como única fonte de carbono. Os açúcares rafinose, ribitol e
sacarose foram assimilados de maneira distinta pelos isolados. O tempo de
incubação de 5 dias não permitiu detectar um perfil de assimilação eficiente cujas
características fossem capazes de discriminar bioquimicamente entre as espécies do
complexo S. schenckii. Os resultados satisfatórios de assimilação foram encontrados
no décimo dia de incubação.
Figura 23: Assimilação das fontes de carbono glicose (controle positivo), rafinose, ribitol e sacarose
após 10 dias de incubação a 25 ºC. O isolado Ss54 é capaz de assimilar apenas glicose e
fracamente ribitol, enquanto o isolado Ss131 é capaz de assimilar as quatro fontes de
carbono avaliadas. O controle negativo é representado apenas pelos conídios inoculados
(2 x 105 a 2 x 10
6 UFC/mL) em meio YNB sem adição de fontes de carbono.
120
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 17: Resultados das provas fisiológicas de assimilação das fontes de carbono
glicose, rafinose, ribitol e sacarose para os conídios das cepas do
complexo S. schenckii, após 05 e 10 dias de incubação a 25 ºC.
Código do Isolado
Tempo de incubação
05 dias 10 dias
Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster
Ss 01SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 02RS + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 03RS + - - + I.b + + + + II.b.1.1.2
Ss 04RS + - - + I.b + - + + II.b.2
Ss 05MG + - + - II.b + - + + II.b.2
Ss 06MG + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2
Ss 07MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 08MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 09MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 10MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 11MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 12MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 13MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 14MG + - - - II.a + - + - II.a
Ss 15MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 16PI + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 17PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 19PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 20PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 21PR + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2
Ss 22PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 24PR + - - + I.b + + + + II.b.1.1.2
Ss 25PR + - - - II.a + - + - II.a
Ss 26PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 27PR + - - - II.a + - + - II.a
Ss 28PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 30PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 31PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 32PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 33PR + - + - II.b + - + - II.a
Ss 34PR + - + - II.b + - + - II.a
Ss 35PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-) Continua...
121
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do
Isolado
Tempo de incubação
05 dias 10 dias
Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster
Ss 36PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 37PR + - - - II.a + - + - II.a
Ss 38PR + - - - II.a + - + - II.a
Ss 39PR + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 40CE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 41CE + - - + I.b + - + + II.b.2
Ss 42CE + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 43CE + - - - II.a + - + - II.a
Ss 44CE + - + - II.b + - + - II.a
Ss 45GO + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 46GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 47GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 48GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 49GO + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2
Ss 50GO + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 51PA + - + - II.b + - + - II.a
Ss 52SP + - - - II.a + - + - II.a
Ss 53RS + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 54RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 55RS + - - - II.a + - + - II.a
Ss 56RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 57RS + - - - II.a + - + - II.a
Ss 58SP + - - + I.b + + - + II.b.1.2
Ss 59SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 60SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 61SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 62ES + + + - I.a.2.1.1 + + + - II.b.1.1.1
Ss 63ES + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 64ES + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 65RJ + - - - II.a + - - - I
Ss 66RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 67RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 68RJ + - + - II.b + - + - II.a
Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-)
122
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Tempo de incubação
05 dias 10 dias
Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster
Ss 69RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 70RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 71RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 72RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 73RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 74RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 75RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 76RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 77RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 78RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 79RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 80RJ + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 81RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 82RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 83RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 84RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 85RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 86RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 87RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 88RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 89RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 90RJ + - + + I.a.2.2 + - + + II.b.2
Ss 91RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 92RJ + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 93RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 94RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 95RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 96RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 97RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 98RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 99RJ + - + - II.b + - + - II.a
Ss 100RJ + - - - II.a + - + - II.a
Ss 101SP + - - - II.a + - + - II.a
Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-)
123
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Tempo de incubação
05 dias 10 dias
Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster
Ss 102SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 103SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 104MT + - - - II.a + - + - II.a
Ss 105MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 106MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 107MG + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2
Ss 109MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 110MG + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 111SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 112SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 113SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 114SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 115SP + - - - II.a + + + + II.b.1.1.2
Ss 116SP + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 117SP + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 118SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 119SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 120SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 121SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 122SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 123SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 124SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 125SP + - + - II.b + + + - II.b.1.1.1
Ss 126SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 127SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 128SP + - - - II.a + - + - II.a
Ss 129SP + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 130PE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 131PE + - + + I.a.2.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 132SP + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 133PE + - + - II.b + - + + II.b.2
Ss 134PE + - - - II.a + - + + II.b.2
Ss 135PE + - - + I.b + + - + II.b.1.2
Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-)
124
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Conclusão...
Código do Isolado
Tempo de incubação
05 dias 10 dias
Gli Raf Rib Sac Cluster Gli Raf Rib Sac Cluster
Ss 136PE + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 137PE + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 138PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 139PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 140PB + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 141DF + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 143PA + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 144RS + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 145RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 146AM + + + + – + + + + –
Ss 147AM + + + + – + + + + –
Ss 148SP + - - - II.a + - + - II.a
Ss 149RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 150RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 151RS + - - - II.a + - + - II.a
Ss 152RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 153RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 154RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 155RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 156RS + - + - II.b + - + - II.a
Ss 157RS + - - - II.a + - + - II.a
Ss 158AM + + - + I.a.1 + + - + II.b.1.2
Ss 159JPO + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Ss 160MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 161MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 162MEX + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 163PER + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 164PER + + + + I.a.2.1.2 + + + + II.b.1.1.2
Ss 167PER + - - + I.b + + - + II.b.1.2
Ss 168PER + + - + I.a.1 + + + + II.b.1.1.2
Glicose (Gli), Rafinose (Raf), Ribitol (Rib), Sacarose (Sac), Assimilação posititiva (+) e negativa (-)
125
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Os resultados de assimilação, positivo e negativo, foram transformados em
dados binários e empregados para avaliar a similaridade entre os perfis de
assimilação entre as cepas de acordo com o coeficiente de Jaccard. Os
dendogramas baseados nos resultados de 5 e 10 dias de incubação estão descritos
nas figuras 24 e 25, respectivamente.
Aos 5 dias de incubação foi possível distinguir entre dois cluster, os quais
são separados principalmente pela capacidade de assimilar o açúcar sacarose
(Figura 24). Os conídios das cepas pertencentes ao cluster I (n=100, 58,82%,
subgrupos Ia e Ib) são capazes de assimilar tal açúcar após 5 dias de incubação
(com exceção da cepa Ss 62, subgrupo I.a.2.1.1). O subgrupo I.a é formado por 87
cepas (51,17%) as quais compreendem os subgrupos I.a.1 e I.a.2. O subgrupo I.a.1
possui 13 cepas (7,64%) as quais são capazes de assimilar glicose, rafinose e
sacarose aos 5 dias de incubação. O subgrupo I.a.2 é formados pelos grupos
menores I.a.2.1 (subgrupos I.a.2.1.1 e I.a.2.1.2) e I.a.2.2. O subgrupo I.a.2.1.1
compreende a cepa Ss 62 (0,58%), como perfil glicose, rafinose e ribitol positivo e
sacarose negativo, enquanto que o subgrupo I.a.2.1.2 é composto por 64 cepas
(37,64%) as quais são capazes de assimilar as quatro fontes de carbono avaliadas
após 5 dias de incubação. O subgrupo I.a.2.2 possui 9 representantes (5,29%), os
quais são capazes de assimilar glicose, ribitol e sacarose neste período de
incubação. Dentre as 11 cepas que compõem o subgrupo I.b (6,47%), apenas os
açúcares glicose e sacarose são assimilados até o 5 dia de incubação.
As cepas do cluster II (n=72, 48,82%) são incapazes de assimilar sacarose
até o quinto dia de incubação a 25 ºC. O cluster II compreende os subgrupos II.a
(n=38, 22,35%) e II.b (n=34, 20%). Os conídios das cepas que compõem o subgrupo
II.a foram capazes de assimilar apenas glicose como única fonte de carbono até o
quinto dia de incubação. As cepas do subgrupo II.b foram capazes de assimilar além
da glicose, o açúcar ribitol como única fonte de carbono (5 dias, 25ºC).
126
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 24: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes de
carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii, após 05 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC.
Coeficiente de Jaccard (método de ligação average).
127
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Os resultados de assimilação de fontes de carbono referentes a 10 dias de
incubação também foram utilizados para a construção de um dendograma de
similaridade baseado no coeficiente de Jaccard (Figura 25). Aos 10 dias de
incubação foi possível observar novamente a presença de dois clusters principais.
O cluster I é formado por duas cepas (1,17%), Ss 65 e FMR 8309 (cepa tipo
de Sporothrix brasiliensis), ambas provenientes da cidade do Rio de Janeiro. Os
conídios produzidos por estas cepas não foram capazes de assimilar nenhuma das
fontes de carbono testadas com exceção da glicose.
O cluster II é formado por 168 cepas (98,82%), divididas em subgrupos que
apresentaram os mais distintos perfis de assimilação de fontes de carbono. O
subgrupo II.a é formado por 64 cepas (37,64%). Dentre as cepas que compõem o
subgrupo II.a 45,31% e 21,87% são originárias dos estados do Rio de Janeiro (n=29)
e Rio Grande do Sul (n=14), respectivamente. As regiões sul (n=20, 31,25%) e
sudeste (n=41, 64,06%) respondem por 95,31% das cepas deste grupo. As cepas
deste subgrupo apresentam como perfil de assimilação os açúcares glicose e ribitol
apenas. A assimilação dos açúcares rafinose e sacarose foi considerada negativa
aos 10 dias de incubação. O subgrupo II.a contem as cepas tipo de Sporothrix
brasiliensis FMR 8314 e Sporothrix luriei FMR 9280 (CBS 937.72), ambas descritas
por Marimon et al. 2007 e 2008, respectivamente.
O subgrupo II.b é formado por 103 cepas (60,58%) com distribuição
geográfica mais heterogênea, abrangendo os representantes de todos os estados e
países amostrados neste trabalho. Compreendem o subgrupo II.b os subgrupos
II.b.1 (n=89, 52,35%) e II.b.2 (n=12, 7,05%).
Integram o subgrupo II.b.1, os clusters II.b.1.1 e II.b.1.2. O subgrupo II.b.1.1
(n=83, 48,82%) por sua vez é subdividido em dois subgrupos menores: II.b.1.1.1
com duas cepas (1,17%) capazes de assimilar glicose, rafinose e ribitol aos 10 dias
de incubação e II.b.1.1.2 (n=81, 47,64%), cujas cepas são capazes de assimilar
128
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
todas as fontes de carbono avaliadas neste período de incubação. As cepas tipo de
Sporothrix schenckii, FMR 9018 e FMR 6618, descritas por Marimon et al. (2007)
estão dentro do cluster II.b.1.1.2. O subgrupo II.b.1.2 (n=8, 4,70%) é formado por
cepas cujos conídios são capazes de assimilar glicose, rafinose e sacarose aos 10
dias de incubação. As cepas tipo de Sporothrix mexicana, FMR 9107 e FMR 9108,
descritas por Marimon et al. (2007) estão dentro deste subgrupo.
As cepas do subgrupo II.b.2 possuem o perfil de assimilação positivo dos
açúcares glicose, ribitol e sacarose aos 10 dias de incubação. As cepas tipo de
Sporothrix globosa FMR 8595 e FMR 8600 assim como as cepas tipo de S. albicans
FMR 8803 e FMR 8939 descritas por Marimon et al. (2007) estão inclusas neste
subgrupo.
Algumas cepas apresentaram mudanças nos perfis de assimilação entre o
quinto e o décimo dia de incubação. Alguns microrganismos foram mais fastidiosos
para assimilar tais fontes e devido a isto optou-se por empregar os resultados
referentes ao décimo dia de incubação, como já havia sido proposto por Marimon et
al. (2007), como dados taxonômicos para as cepas do complexo S. schenckii. A
figura 26 demonstra a dinâmica de assimilação apresentada pelas 170 cepas do
complexo Sporothrix schenckii utilizadas neste trabalho. Aos cinco dias de incubação
a porcentagem de assimilação positiva foi de 100%, 45,88%, 63,52% e 57,05% para
os açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose, respectivamente. A glicose (100%),
ribitol (94,11%), sacarose (59,41%) e rafinose (53,52%) foram nesta ordem as fontes
mais utilizadas aos 10 dias de incubação.
129
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 25: Análise de clusterização em função do perfil bioquímico de assimilação das fontes de
carbono glicose, rafinose, ribitol e sacarose apresentado por conídios dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii, após 10 dias de incubação em meio YNB, 25 ºC.
Coeficiente de Jaccard (método de ligação average).
130
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Positivo Negativo
Figura 26: Porcentagem de assimilação dos açúcares glicose, rafinose, ribitol e sacarose pelas cepas
do complexo Sporothrix schenckii (n=170) após 5 e 10 dias de incubação.
4.5 Taxonomia molecular
O DNA genômico foi extraído diretamente de 170 culturas puras do fungo
Sporothrix spp. (Figura 27) em meio sólido. Utilizando o par de iniciadores CL1 e
CL2A fomos capazes de amplificar um fragmento de aproximadamente 800 pb
referente ao éxon 3-4 ou 3-5 do gene da calmodulina (Figura 28).
As sequências de nucleotídeos senso e anti-senso geradas a partir do
amplicon da calmodulina para os isolados do complexo S. schenckii foram alinhadas
e as sequências consenso obtidas estão em fase de depósito no banco de dados de
sequência genética GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). As sequências
consenso foram utilizadas para a comparação com as sequências depositadas no
Genbank. A figura 29 ilustra o polimorfismo de nucleotídeos encontrados nas
sequências consensos entre os isolados brasileiros Ss 01, Ss 06, Ss 54 e Ss 132.
Os resultados referentes à taxonomia molecular estão descritos na Tabela 18.
131
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 27: Extração de DNA de Sporothrix schenckii (1). Gel de agarose 0,8%, 100 v, 60 minutos. À
esquerda, padrão de peso molecular Lambda DNA/HindIII (Invitrogen, USA).
Figura 28: Amplicon do fragmento do gene da calmodulina (éxon 3-4 ou 3-5), pela técnica de PCR,
de cepas representativas das espécies filogenéticas do complexo Sporothrix schenckii. (1)
S. schenckii (Ss 01); (2) S. brasiliensis (Ss 54); (3) S. globosa (Ss 06); (4) S. mexicana (Ss
131); (5) controle negativo. Gel de agarose 1,2%, 80 v, 60 minutos. À esquerda padrão de
peso molecular Low Ranger 100 bp DNA Ladder (Norgen Biotek, Canadá).
132
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 29: Alinhamento da sequência de nucleotídeos do fragmento do gene da calmodulina das espécies do complexo Sporothrix schenckii. Os sítios
destacados em azul demonstram o polimorfismo da sequência comparada entre as espécies S. schenckii (Ss01), S. brasiliensis (Ss54), S. globosa
(Ss06) e S. mexicana (Ss132) representadas no Brasil. Software CLC Sequence Viewer 5, versão 5.1.
133
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 18: Taxonomia molecular dos isolados do complexo Sporothrix schenckii
baseados na comparação da sequência de nucleotídeos entre o éxon
3-4 e 3-5 do gene da calmodulina.
Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)
Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade
Ss 01SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 99% 99%
Ss 02RS S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 03RS S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 04RS S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 05MG S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 06MG S. globosa FMR 8598 Espanha 98% 99%
Ss 07MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 99%
Ss 08MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 98%
Ss 09MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 97% 99%
Ss 10MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 98%
Ss 11MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 12MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 13MG S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%
Ss 14MG S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 15MG S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 16PI S. schenckii FMR 8677 Argentina 97% 95%
Ss 17PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 19PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 20PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 21PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 22PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 99% 99%
Ss 24PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 99% 99%
Ss 25PR S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 26PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 27PR S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 98% 99%
Ss 28PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%
Ss 30PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 31PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 32PR S. schenckii FMR 8678 Argentina 99% 99%
Ss 33PR S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 34PR S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 98% 98%
Ss 35PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Continua...
134
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)
Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade
Ss 36PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 37PR S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 38PR S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 39PR S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 98%
Ss 40CE S. schenckii FMR 8608 Peru 100% 99%
Ss 41CE S. globosa FMR 8598 Espanha 99% 100%
Ss 42CE S. schenckii FMR 8608 Peru 96% 99%
Ss 43CE S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 44CE S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 45GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 97%
Ss 46GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 98% 97%
Ss 47GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 98% 97%
Ss 48GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 100% 98%
Ss 49GO S. globosa FMR 8598 Espanha 99% 100%
Ss 50GO S. schenckii CBS 359.36 EUA 100% 97%
Ss 51PA S. brasiliensis IPEC 17920 Rio de Janeiro 98% 95%
Ss 52SP S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 53RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 100%
Ss 54RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 55RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 56RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 99%
Ss 57RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 99%
Ss 58SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%
Ss 59SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%
Ss 60SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%
Ss 61SP S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%
Ss 62ES S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 98% 99%
Ss 63ES S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 64ES S. schenckii FMR 8678 Argentina 98% 99%
Ss 65RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 66RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 67RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 68RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 69RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 70RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
135
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)
Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade
Ss 71RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 72RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 73RJ S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%
Ss 74RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 75RJ S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 99%
Ss 76RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 77RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 78RJ S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 79RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 80RJ S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 81RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 82RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 83RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 84RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 85RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 86RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 87RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 88RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 89RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 90RJ S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 100%
Ss 91RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 92RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 93RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 94RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 95RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 96RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 97RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 98RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 99RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 100RJ S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 101SP S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 102SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 103SP S. schenckii FMR 8677 Argentina 99% 99%
Ss 104MT S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 105MG S. schenckii FMR 8608 Peru 100% 98%
Ss 106MG S. schenckii FMR 8678 Argentina 99% 98%
136
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)
Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade
Ss 107MG S. brasiliensis IPEC 17920 Rio de Janeiro 96% 96%
Ss 109MG S. schenckii FMR 8678 Argentina 96% 99%
Ss 110MG S. schenckii FMR 8608 Peru 98% 98%
Ss 111SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 92% 99%
Ss 112SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 95% 99%
Ss 113SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 96% 99%
Ss 114SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 95% 99%
Ss 115SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 96% 99%
Ss 116SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 94% 99%
Ss 117SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 95% 99%
Ss 118SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 92% 99%
Ss 119SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 92% 99%
Ss 120SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 94% 99%
Ss 121SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 93% 99%
Ss 122SP S. schenckii FMR 8608 Peru 96% 99%
Ss 123SP S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 92% 98%
Ss 124SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 92% 99%
Ss 125SP S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 97% 99%
Ss 126SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 94% 99%
Ss 127SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 95% 99%
Ss 128SP S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 97% 99%
Ss 129SP S. schenckii FMR 8678 Argentina 97% 99%
Ss 130PE S. schenckii CBS 359.36 EUA 93% 99%
Ss 131PE S. mexicana FMR 9108 México 75% 100%
Ss 132PE S. mexicana FMR 9108 México 75% 100%
Ss 133PE S. mexicana FMR 9108 México 77% 100%
Ss 134PE S. schenckii CBS 359.36 EUA 100% 95%
Ss 135PE S. schenckii FMR 8678 Argentina 95% 99%
Ss 136PE S. schenckii FMR 8678 Argentina 96% 99%
Ss 137PE S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%
Ss 138PB S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 97%
Ss 139PB S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 98%
Ss 140PB S. schenckii FMR 8678 Argentina 100% 99%
Ss 141DF S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 92% 99%
Ss 143PA S. schenckii CBS 359.36 EUA 98% 99%
Ss 144RS S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
137
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Micoteca Isolado de Referência (Marimon et al. 2007)
Isolado Espécie Isolado Local Cobertura Identidade
Ss 145RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 99%
Ss 146AM B. proliferans – – – –
Ss 147AM B. proliferans – – – –
Ss 148SP S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 149RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 150RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 151RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 98% 100%
Ss 152RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 153RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 154RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 100% 100%
Ss 155RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 156RS S. brasiliensis IPEC 17786 Rio de Janeiro 99% 99%
Ss 157RS S. brasiliensis IPEC 16490 Rio de Janeiro 99% 100%
Ss 158AM S. schenckii FMR 8608 Peru 97% 98%
Ss 159JPO S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 100% 99%
Ss 160MEX S. schenckii CBS 359.36 EUA 99% 99%
Ss 161MEX S. schenckii CBS 359.36 EUA 93% 100%
Ss 162MEX S. schenckii FMR 8608 Peru 98% 99%
Ss 163PER S. schenckii IHEM 15499 Peru 96% 100%
Ss 164PER S. schenckii IHEM 15511 Peru 100% 99%
Ss 167PER S. schenckii IHEM 15499 Peru 97% 100%
Ss 168PER S. schenckii IHEM 3774 Colômbia 99% 99%
De acordo com os dados moleculares identificamos 82 S. schenckii, 71 S.
brasiliensis, 3 S. globosa e 3 S. mexicana. Dois isolados (Ss 146 e Ss 147),
recebidos como S. schenckii e morfologicamente semelhantes a S. schenckii foram
classificados como Blastobotrys proliferans Marvanová (1976), sinônimo B.
navarrensis Sesma & C. Ramirez (1978) de acordo com a sequência do gene ITS
(Internal Transcriber Spacer) utilizando o par de iniciadores ITS1 e ITS4. A
sequência de nucleotídeos do amplicon da calmodulina utilizando os iniciadores
CL1A e CL2 não apresentou homologia significativa (< 90%) com as sequências de
138
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Sporothrix spp. depositadas no GenBank. O gene ITS figura entre os mais utilizados
na taxonomia molecular de espécies fúngicas e deste modo escolhemos este
marcador para a taxonomia das espécies não pertencentes ao gênero Sporothrix.
Dentre os isolados de S. brasiliensis, 83,09% (n=59), apresentam entre 98-
100% de homologia com a sequência da calmodulina do isolado IPEC 16490. Estes
isolados foram obtidos de uma área epidêmica de esporotricose na cidade do Rio de
Janeiro, além dos estados de São Paulo e Rio Grande do Sul.
Dentre os 82 isolados molecularmente classificados como S. schenckii,
aproximadamente 86,58% (n=71) apresentam alta similaridade (98-100%) com
isolados provenientes de países da América do Sul como Argentina (cepas FMR
8677 e FMR 8678; n=36, 43,9%), Colômbia (cepa IHEM 3774; n=22, 26,82%) e Peru
(cepas FMR 8608, IHEM 15499 e IHEM 15511; n=13, 15,85%). Onze isolados
(13,41%) apresentam similaridade com a cepa CBS 359.36 proveniente dos Estados
Unidos.
Os três isolados de S. globosa apresentam entre 99 e100% de similaridade
com as cepas da Espanha FMR 8598, assim como os três isolados de S. mexicana
apresentam 100% de similaridade com os dois isolados mexicanos ambientais FMR
9107 e FMR 9108, descritos por Marimon e colaboradores (2007).
4.6 Taxonomia polifásica
A taxonomia polifásica do complexo S. schenckii foi realizada levando-se em
consideração os dados morfo-fisiológicos e moleculares obtidos nos ensaios de
microcultivo, morfometria, crescimento vegetativo e sequenciamento de ácidos
nucléicos.
Foram encontrados alguns resultados divergentes quando comparamos a
classificação baseada na taxonomia clássica e molecular. Os principais aspectos
139
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
que influenciaram esta divergência estão relacionados a três fatores: i) aos valores
de diâmetro da colônia após 21 dias de incubação a 30 ºC como característica chave
para a distinção entre as espécies S. schenckii e S. mexicana (Ss 36, Ss 60, Ss 61,
Ss 75, Ss 80, Ss 110, Ss 114, Ss 117, Ss 120, Ss 121, Ss 123, Ss 124, Ss 127 e Ss
141); ii) a assimilação positiva de sacarose para 5 isolados de Sporothrix spp.
classificados molecularmente como S. brasiliensis (Ss 05, Ss 53, Ss 67, Ss 92 e Ss
107); e iii) a ausência de assimilação de rafinose para o isolado Ss 133 de S.
mexicana.
Com exceção das cepas Ss 67 e Ss 92, os demais isolados classificados
molecularmente como S. brasiliensis e que foram capazes de assimilar o açúcar
sacarose foram coletados de regiões geograficamente distantes da área epidêmica
na cidade do Rio de Janeiro, como por exemplo os estados de Minas Gerais (Ss 05
e Ss 107) e Rio Grande do Sul (Ss 53).
As características fenotípicas observadas para a descrição da espécie
filogenética S. brasiliensis por Marimon et al. (2007) e proposição da chave
dicotômica (Marimon et al. 2008) é baseada na observação do desempenho em
testes morfo-fisiológicos de um grupo geograficamente restrito e de uma área
epidêmica no Brasil. As cepas utilizadas por Marimon et al. (2006, 2007) são
provenientes de casos clínicos de esporotricose de pacientes atendidos no Instituto
de Pesquisa Evandro Chagas (IPEC), na cidade do Rio de Janeiro. Possivelmente, o
número amostral avaliado não expresse a real diversidade da população de S.
brasiliensis ao longo do território brasileiro.
Até o presente momento, esta descrito na literatura a existência de apenas
duas cepas de S. mexicana. Nossos dados moleculares indicam que os isolados Ss
131, Ss132 e Ss 133 pertencem a espécie S. mexicana, porém nossos dados
fenotípicos são discordantes em dois aspectos: i) o isolado Ss 131 não foi capaz de
atingir um diâmetro superior a 50 mm após 21 dias de crescimento em meio PDA a
140
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
30 ºC, o que o classificaria de acordo com a chave dicotômica como S. schenckii; e
ii) o isolado Ss 133 não foi capaz de assimilar o açúcar rafinose após 10 dias de
incubação, fato este que impossibilitaria a sua classificação como S. mexicana.
Possivelmente o pequeno número de representantes amostrados e estudados possa
influenciar na discrepância de valores e respostas fisiológicas encontradas para as
cepas brasileiras de S. mexicana.
A medida que novos dados biológicos e epidemiológicos forem adicionados
a estudos do agente etiológico da esporotricose, maiores serão as chances do
conhecimento real de variações dentre estas características e a adequação do
sistema de classificação.
Este fato denota claramente a necessidade de atualizações constantes nas
variáveis morfo-fisiológicas empregadas para a classificação dos isolados que
compõem o complexo Sporothrix schenckii. Nos casos em que houve divergência
entre os métodos de classificação adotados optou-se por realizar a taxonomia das
cepas baseadas no polimorfismo do gene da calmodulina. Os resultados
comparativos, referentes à taxonomia polifásica dos isolados de Sporothrix spp.
estão resumidos na Tabela 19.
141
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 19: Taxonomia polifásica das cepas do complexo Sporothrix schenckii
utilizando parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares.
Código do Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação inicial
Taxonomia clássica
Taxonomia molecular
Ss 01SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 02RS S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 03RS S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 04RS S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii
Ss 05MG S. schenckii S. globosa S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 06MG S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa
Ss 07MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 08MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 09MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 10MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 11MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 12MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 13MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 14MG S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 15MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 16PI S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 17PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 19PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 20PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 21PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 22PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 24PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 25PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 26PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 27PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 28PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 30PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 31PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 32PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Continua...
142
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação inicial
Taxonomia clássica
Taxonomia molecular
Ss 33PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 34PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 35PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 36PR S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 37PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 38PR S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 39PR S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 40CE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 41CE S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa
Ss 42CE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 43CE S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 44CE S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 45GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 46GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 47GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 48GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 49GO S. schenckii S. globosa S. globosa S. globosa
Ss 50GO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 51PA S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 52SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 53RS S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 54RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 55RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 56RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 57RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 58SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 59SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 60SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 61SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 62ES S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 63ES S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
143
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação inicial
Taxonomia clássica
Taxonomia molecular
Ss 64ES S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 65RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 66RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 67RJ S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 68RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 69RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 70RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 71RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 72RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 73RJ S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 74RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 75RJ S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 76RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 77RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 78RJ S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 79RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 80RJ S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 81RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 82RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 83RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 84RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 85RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 86RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 87RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 88RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 89RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 90RJ S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii
Ss 91RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 92RJ S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 93RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 94RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
144
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação...
Código do Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação inicial
Taxonomia clássica
Taxonomia molecular
Ss 95RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 96RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 97RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 98RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 99RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 100RJ S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 101SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 102SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 103SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 104MT S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 105MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 106MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 107MG S. schenckii S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 109MG S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 110MG S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 111SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 112SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 113SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 114SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 115SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 116SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 117SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 118SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 119SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 120SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 121SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 122SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 123SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 124SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 125SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 126SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
145
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Continuação…
Código do Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação inicial
Taxonomia clássica
Taxonomia molecular
Ss 127SP S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 128SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 129SP S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 130PE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 131PE S. schenckii S. mexicana S. mexicana S. mexicana
Ss 132PE S. schenckii S. mexicana S. mexicana S. mexicana
Ss 133PE S. schenckii S. albicans S. mexicana S. mexicana
Ss 134PE S. schenckii S. globosa S. schenckii S. schenckii
Ss 135PE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 136PE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 137PE S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 138PB S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 139PB S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 140PB S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 141DF S. schenckii S. mexicana S. schenckii S. schenckii
Ss 143PA S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 144RS S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 145RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 146AM S. schenckii Blastobotrys sp B. proliferans B. proliferans
Ss 147AM S. schenckii Blastobotrys sp B. proliferans B. proliferans
Ss 148SP S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 149RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 150RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 151RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 152RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 153RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 154RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 155RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 156RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 157RS S. schenckii S. brasiliensis S. brasiliensis S. brasiliensis
Ss 158AM S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
146
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Conclusão...
Código do
Isolado
Método de classificação Classificação
final Classificação
inicial
Taxonomia
clássica
Taxonomia
molecular
Ss 159JPO S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 160MEX S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 161MEX S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 162MEX S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 163PER S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 164PER S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 167PER S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
Ss 168PER S. schenckii S. schenckii S. schenckii S. schenckii
4.7 Epidemiologia do complexo Sporothrix schenckii no Brasil
Após a taxonomia polifásica das cepas do complexo S. schenckii
depositadas em nossa micoteca apresentamos na Figura 30 a distribuição das
espécies filogenéticas descritas por Marimon et al. (2007) no Brasil, de acordo com o
estado de origem. Com exceção de S. luriei e S. albicans, as demais espécies foram
descritas em território brasileiro, no presente estudo.
Os dados geográficos indicam que S. brasiliensis ocorre com maior
frequência nas regiões Sul e Sudeste (94,36%). Detectamos a sua alta ocorrência
nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, Paraná e Rio Grande do Sul. Devido
principalmente, ao número amostral obtido, os estados do Ceará, Pará, Espírito
Santo, São Paulo e Mato Grosso do Sul, apresentam menor ocorrência desta
espécie.
Os fungos isolados na região Sul do país foram obtidos de casos clínicos de
esporotricose felina. A espécie filogenética S. brasiliensis ocorreu com maior
frequência em hospedeiro felino (90%) do que as demais espécies do complexo S.
schenckii.
147
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
A espécie filogenética S. schenckii esta amplamente distribuída em território
brasileiro sendo encontrada com alta frequência nos estados de São Paulo, Paraná,
Goiás, Minas Gerais, Rio Grande do Sul, e em menor quantidade nos estados do
Espírito Santo, Rio de Janeiro, Pernambuco, Paraíba, Ceará, Pará e Amazonas.
A espécie filogenética S. globosa foi registrada em três estados brasileiros, a
saber: Minas Gerais (Ss 06), Ceará (Ss 41) e Goiás (Ss 49). O fungo Ss 06 foi
isolado em 2002, de um paciente do sexo masculino de 76 anos, agricultor,
residente na cidade de Belo Horizonte - MG, com lesão de esporotricose cutânea
fixa no braço direito. O isolado Ss 41 foi obtido em 2002 de um caso humano onde o
paciente apresentava lesão fixa no braço. O isolado de S. globosa Ss 49, foi obtido
de um caso de esporotricose linfocutânea em 2004, na cidade de Goiânia-GO.
A espécie filognética S. mexicana foi encontrada nos estados de
Pernambuco (Ss 131 e Ss 133) e São Paulo (Ss 132). As duas cepas de S.
mexicana descritas por Marimon et al. (2007) foram isoladas de amostras de solo
(FMR 9108) e vegetal (FMR 9107). Nossos isolados de S. mexicana são
provenientes de casos clínicos de esporotricose humana. A caracterização destes
isolados neste trabalho destaca a descrição do primeiro caso de esporotricose
humana provocado por S. mexicana no mundo. Nosso dados indicam ainda que
embora a primeira descrição da espécie tenha ocorrido em 2007, esta espécie está
presente em território brasileiro desde a década de 50. Os isolados Ss 133 e Ss 131
foram isolados na cidade de Recife-PE em 1955 e 1958, respectivamente, enquanto
que o isolado Ss 132 foi obtido de um caso de esporotricose humana em 1977, em
São Paulo.
Os estados de Minas Gerais e Ceará foram considerados mais
heterogêneos devido a presença das espécies S. schenckii, S. brasiliensis e S.
globosa, assim como o estado de São Paulo onde foram detectadas as espécies S.
schenckii, S. brasiliensis e S. mexicana.
148
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 30: Distribuição dos isolados brasileiros do complexo Sporothrix schenckii após a taxonomia
polifásica de acordo com o estado de origem em que a cepa foi isolada. Os estados em
branco não possuem representantes estudados (A distribuição dos isolados dentro dos
limites geográficos dos estados não representa a dispersão destes no território ou o ponto
em que foram isolados. No estado do Rio de Janeiro, por exemplo, todos os isolados
estudados são provenientes da região metropolitana da cidade do Rio de Janeiro).
149
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
4.8 Análise Proteômica
4.8.1 Extração de proteínas de Sporothrix schenckii
Dentre os métodos físicos de lise avaliados para a extração de proteínas, a
maceração das células em nitrogênio líquido apresentou melhor perfil de extração
protéica quando comparado ao método utilizando agitação no aparelho Fast-prep
1200®. Levou-se em consideração a quantidade de proteínas extraídas, a
diversidade de bandas, a integridade das amostras, além da reprodutibilidade das
extrações. A quantificação dos extratos brutos de proteínas de acordo com o
protocolo de extração é apresentada na Tabela 20.
Quando avaliamos os tampões de lise e solubilização destas proteínas
(Apêndice I), os tampões tris-cálcio e uréia-tiouréia apresentaram os melhores perfis
de banda pela eletroforese unidimensional, levando-se em consideração os
parâmetros de avaliação citados acima. Devido ao fato do tampão tris-cálcio
apresentar maior reprodutibilidade durante a eletroforese bidimensional (dados não
mostrados) optou-se por adotar este tampão associado à maceração em nitrogênio
líquido para a extração de proteínas das demais amostras estudadas.
Quatro métodos de precipitação foram avaliados para purificação do extrato
bruto. A principal dificuldade encontrada foi a precipitação de proteínas de baixo
peso molecular (inferiores a 30 kDa) e a ressolubilização completa da amostra.
Dentre os métodos de precipitação avaliados, o 2D Clean-up kit foi mais reprodutível
e apresentou melhor perfil de proteínas pela eletroforese unidimensional e
bidimensional. A figura 31 ilustra os perfis de bandas gerados a partir dos 8
protocolos de extração avaliados utilizando leveduras com 7 dias de cultivo em meio
BHI caldo do isolado Ss 118. A figura 32 ilustra os protocolos de precipitação de
proteínas avaliados (acetona, TCA, TCA/Acetona e 2D Clean-up kit) utilizando o
extrato protéico do isolado Ss 118 (Protocolo de extração 7).
150
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 20: Quantidade de proteínas extraídas de acordo com os protocolos de
extração avaliados.
Protocolo Método de lise física Tampão Quantificação
(µg/mL)
C Fast-prep® Água MilliQ 65,09
P1 Fast-prep® Tampão de lise I 886,56
P2 Fast-prep® Tampão de lise II 265,19
P3 Fast-prep® Tampão de lise III 138,42
P4 Fast-prep® Tris-cálcio 450,75
P5 Fast-prep® Uréia 279,40
P6 Fast-prep® Uréia-Tiouréia 583,23
P7 Maceração em N2 Tris-cálcio 2.280,81
P8 Maceração em N2 Uréia-Tiouréia 2.497,33
C: controle com água MilliQ; P1: Protocolo 1; Os protocolos de 1-6 combinam uma etapa de homogeneização das leveduras
(em suspensão nos respectivos tampões) no aparelho Fast-prep®, velocidade 4.5, durante 45 segundos. Os protocolos 7 e 8
combinam um passo inicial de maceração em nitrogênio líquido seguido da ressuspensão do macerado em tampão Tris-Cálcio
e Uréia-Tiouréia respectivamente, além de um passo adicional de agitação da suspensão em vórtex com beads de vidro
(0,5mm diâmetro).
Figura 31: Separação eletroforética por SDS-PAGE do extrato de proteínas de leveduras de
Sporothrix schenckii (Ss118), após 7 dias de cultivo em meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir
de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida (10%) representativo da triplicata
biológica realizada para esta condição de cultivo. Extratos protéicos brutos referentes
aos protocolos de extração (20 µg de proteínas). PM: Padrão de peso molecular -
Invitrogen – BenchMark Protein Ladder (kDa). Coloração por nitrato de prata.
151
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 32: Perfis de bandas após a precipitação de proteínas. Aproximadamente 300 µg de proteínas
foram precipitadas utilizando Acetona, TCA, TCA/Acetona ou 2D Clean-up kit (GE
Healthcare) ressupensos em tampão de solubilização (uréia-tiouréia) e aproximadamente
2 µg foram aplicados em gel de SDS-PAGE (10%). Padrão de peso molecular Invitrogen –
BenchMark Protein Ladder.
Após a escolha do método de extração e de precipitação da amostra, as
proteínas foram fracionadas através da técnica de eletroforese bidimensional.
Inicialmente avaliamos as condições de focalização isoelétrica (IEF) utilizando tiras
de pH imobilizado (IPG) com amplitude de pH 3-10 (13 cm). Estas análises
evidenciaram uma grande concentração de proteínas com ponto isoelétrico variando
de 4 a 7 (dados não mostrados). O resultado final da padronização de eletroforese
bidimensional e a análise comparativa do proteoma dos isolados do complexo S.
schenckii será apresentado a seguir em IPG strips de pH 4-7 (13 cm).
Avaliou-se dois tampões de solubilização e reidratação das tiras de pH
imobilizado (Apêndice I). Diversos protocolos de focalização (primeira dimensão)
foram utilizados, alterando-se a voltagem aplicada em cada passo para separação
de proteínas (dados não mostrados). A figura 33 ilustra o mapa bidimensional
gerado para o tampão de escolha uréia-tiouréia (Figura 33).
152
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 33: Eletroforese bidimensional do extrato celular total do isolado Ss 118, resultante da
combinação do protocolo de extração através da maceração em nitrogênio líquido e
solubilização em tampão de extração tris-cálcio. Aproximadamente 300 µg de proteínas
foram precipitadas utilizando o 2D Clean-up kit (GE Healthcare), solubilizadas em tampão
uréia-tiouréia e aplicados em tiras de pH imobilizado (pH 4-7, 13 cm). Gel de
poliacrilamida (10%) representativo da triplicata biológica realizada. Padrão de peso
molecular Invitrogen – BenchMark Protein Ladder (kDa).
Definidas as condições de extração, solubilização, precipitação, focalização
isoelétrica e SDS-PAGE aplicou-se estes procedimentos para as demais amostras a
fim de compararmos o proteoma da fase parasítica nas diferentes espécies do
complexo S. schenckii.
153
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
4.8.2. Análise proteômica das cepas de importância clínica e
ambiental do complexo S. schenckii
A análise proteômica comparativa foi realizada em quatro isolados do
complexo S. schenckii, as quais foram escolhidas com base na origem geográfica,
hospedeiro ou substrato e espécie filogenética. Os isolados Ss 06 de S. globosa, Ss
54 de S. brasiliensis, Ss 118 de S. schenckii e FMR 9108 de S. mexicana foram
escolhidos para o estudo. O perfil protéico bruto dos isolados escolhidos é
representado na Figura 34.
Figura 34: Perfil protéico de antígenos do complexo Sporothrix schenckii, após 7 dias de cultivo em
meio BHI, 120 rpm, 37 ºC a partir de um inóculo de micélio (7 dias). Gel de poliacrilamida
(10%). Extratos protéicos brutos referentes aos protocolos de extração (2 µg de
proteínas). PM: Padrão de peso molecular - Invitrogen – BenchMark Protein Ladder.
Coloração por nitrato de prata. (S. schenckii: Ss 118; S. brasiliensis: Ss 54; S. globosa: Ss
06; S. mexicana: FMR 9108).
154
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Aproximadamente 300 µg de proteínas foram fracionadas por eletroforese
bidimensional. Os géis resultantes foram fixados e corados com nitrato de prata
(Apêndice I). As imagens dos géis de poliacrilamida foram obtidas com auxílio de um
scanner densitométrico (Image Scanner III, GE Healthcare). Os parâmetros
adotados para a obtenção das imagens foram constantes para todas as amostras.
Adotou-se uma resolução de 300 dpi para as imagens com filtro verde e
transparente. As imagens capturadas foram utilizadas no software Image Master v.
7.0 (GE Healthcare).
Após a detecção automática dos spots as imagens foram inspecionadas
visualmente para a adição de spots não detectados ou a remoção de falsos spots
gerados a partir de artefatos no gel.
O fungo Ss 54 é um isolado obtido de um caso de esporotricose felina na
cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. O proteoma deste isolado, classificado
como S. brasiliensis apresentou alta diversidade de proteínas, sendo visualizados
aproximadamente 549 spots. Com relação a massa molecular experimental, as
proteínas variaram de 14 a 236 kDa. Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos
uma variação na amplitude de pI de 4.07 a 6.7. A triplicata biológica apresentou
pareamento de 98% dos spots detectados, indicando boa reprodutibilidade (Tabela
21). A figura 35 representa o proteoma do isolado Ss 54 de S. brasiliensis.
A espécie filogenética S. globosa foi representada neste trabalho por um
isolado clínico (Ss 06), proveniente de um paciente do sexo masculino, lavrador,
com quadro de esporotricose cutânea fixa, residente na cidade de Belo Horizonte,
Minas Gerais. O proteoma das leveduras deste isolado apresentou grande
diversidade de proteínas, sendo visualizados aproximadamente 491 spots. Com
relação a massa molecular experimental, as proteínas variaram de 14 à 298 kDa.
Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos uma variação na amplitude de pI de
4.08 à 6.91. A triplicata biológica apresentou pareamento de 97% dos spots
155
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
detectados (Tabela 21). A figura 36 representa o proteoma do isolado Ss 06 de S.
globosa corado por nitrato de prata.
O isolado FMR 9108 foi utilizado como representante da espécie S.
mexicana. Este isolado é proveniente de uma amostra de solo coletada na cidade de
Puebla, no México. Esta cepa foi descrita e caracterizada por Marimon et. (2007) e
encontra-se depositada na CBS sob o código CBS 120341. O proteoma do isolado
FMR 9108 apresentou baixa diversidade de proteínas quando comparado aos
demais isolados estudados. Foram visualizados aproximadamente 298 spots, os
quais variaram de 10 à 231 kDa, com relação a massa molecular de 4,2 à 6,87 de
amplitude de pI. A triplicata biológica apresentou pareamento de 98% entre os spots
detectados (Tabela 21). A figura 37 representa o proteoma do isolado FMR 9108 de
S. mexicana corado por nitrato de prata.
O fungo Ss 118 é um isolado obtido de um caso de esporotricose humana
cutânea fixa, residente na cidade de São Paulo. O proteoma deste isolado,
classificado como S. schenckii, apresentou aproximadamente 450 spots. Com
relação a massa molecular experimental, as proteínas variaram de 13 a 267 kDa.
Utilizando IPG strips de pH 4-7 observamos uma variação na amplitude de pI de
4,00 à 6,74. A triplicata biológica apresentou pareamento de 99% dos spots
detectados (Tabela 21). A figura 38 representa o proteoma do isolado Ss 118 de S.
schenckii corado por nitrato de prata.
Tabela 21: Resumo das características proteômicas das espécies do complexo S.
schenckii.
Espécie Diversidade Características
Nº de spots Pareamento pI MM (kDa)
S. brasiliensis 549 98% 4.07 – 6.70 14 – 236
S. globosa 491 97% 4.08 – 6.91 14 – 298
S. mexicana 298 98% 4.20 – 6.87 10 – 231
S. schenckii 450 99% 4.00 – 6.70 13 – 267
156
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 35: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix brasiliensis (Ss 54). Aproximadamente 300
µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16
cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein
Ladder.
Figura 36: Perfil proteômico de leveduras de S. globosa (Ss 06). Aproximadamente 300 µg de
proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).
Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein
Ladder.
157
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 37: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix mexicana (FMR 9108). Aproximadamente
300 µg de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x
16 cm). Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark
Protein Ladder.
Figura 38: Perfil proteômico de leveduras de Sporothrix schenckii (Ss 118). Aproximadamente 300 µg
de proteínas foram aplicadas em fitas IPG pH 4-7 L, 13 cm. SDS-PAGE 10% (16 x 16 cm).
Coloração: Nitrato de prata. Padrão de peso molecular: Invitrogen-BenchMark Protein
Ladder.
158
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
A comparação dos spots diferencialmente expressos foi realizada aos pares
com base em um gel de referência de cada espécie filogenética. Uma proteína foi
considerada diferencialmente expressa nos casos em que houve variação entre as
classes comparadas, de pelo menos duas vezes o volume detectado para o spot
analisado.
A comparação global entre o perfil protéico apresentado pelas quatro
espécies do complexo S. schenckii revelou perfis claramente distintos com relação a
abundância, diversidade e organização nos mapas bidimensionais.
Aproximadamente 100 spots foram comuns às quatro espécies; 153 spots foram
comuns a pelo menos 3 espécies; 237 spots foram comuns a pelo menos 2
espécies. As proteínas que apareceram exclusivamente em algum representante
das espécies estudadas, somadas, atingiram o patamar de 475 spots.
As alterações estatisticamente significativas (p<0.01) de acordo com a
análise de variância (ANOVA) para a comparação entre S. schenckii e S. globosa
revelou 83 spots diferencialmente expressos. Dentre estas proteínas, 25 foram
encontradas nas duas classes avaliadas e 58 foram encontradas exclusivamente em
uma das classes (30 em S. schenckii e 28 em S. globosa). Dentre as proteínas
comuns, 10 spots obtiveram níveis de expressão superiores em S. schenckii e 15 em
S. globosa.
A comparação do perfil protéico de S. schenckii e S. brasiliensis demonstrou
234 spots diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre estes, 27 foram encontrados
nas duas classes avaliadas e 207 foram encontrados exclusivamente em uma das
classes (62 em S. schenckii e 145 em S. brasiliensis). Com relação às proteínas
comuns, 18 spots foram super-expressos em S. schenckii e 9 em S. brasiliensis.
Cento e trinta e três proteínas foram consideradas diferencialmente
expressas (p<0.01) quando comparamos o perfil protéico de S. schenckii e S.
mexicana. Dentre estas proteínas, 20 foram encontradas nas duas classes avaliadas
e 113 foram encontradas exclusivamente em uma das classes (82 em S. schenckii e
159
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
31 em S. mexicana). Dentre os spots protéicos comuns 4 foram super-expressos em
S. schenckii, enquanto que 16 apresentaram níveis de expressão superior em S.
mexicana.
A comparação entre S. globosa e S. brasiliensis revelou 232 spots
diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre os spots diferencialmente expressos 30
foram encontrados nas duas classes avaliadas e 202 foram encontrados
exclusivamente em uma das classes (48 em S. globosa e 154 em S. brasiliensis).
Dentre as proteínas comuns 18 spots foram super-expressos em S. globosa e 12 em
S. brasiliensis.
A comparação entre S. globosa e S. mexicana revelou 120 spots
diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre os spots diferencialmente expressos 22
foram encontrados nas duas classes avaliadas e 98 foram encontrados
exclusivamente em uma das classes (66 em S. globosa e 32 em S. mexicana).
Dentre as 22 proteínas comuns, 5 spots foram super-expressos em S. globosa e 17
em S. mexicana.
A comparação entre S. brasiliensis e S. mexicana revelou 209 spots
diferencialmente expressos (p<0.01). Dentre os spots diferencialmente expressos 24
foram encontrados nas duas classes avaliadas e 185 foram encontrados
exclusivamente em uma das classes (160 em S. brasiliensis e 25 em S. mexicana).
Dentre as proteínas comuns 10 spots foram super-expressos em S. brasiliensis e 14
em S. mexicana. A tabela 22 resume as comparações realizadas entre as espécies
crípticas do complexo S. schenckii.
Nossos géis bidimensionais de proteínas dos isolados do complexo
Sporothrix schenckii evidenciam a existência de diferenças significativas entre os
perfis de proteoma das espécies estudadas, reforçando nossa hipótese inicial.
Porém, fica claro que a evidência aqui apontada se refere a distribuição e
diversidade destes spots no gel de poliacrilamida. A confirmação desta hipótese
160
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
apenas poderá ocorrer com a caracterização detalhada destas moléculas utilizando
técnicas de espectrometria de massas para a identificação de proteínas.
A caracterização funcional destas proteínas diferencialmente expressas nos
levarão a explicar algumas perguntas importantes, como por exemplo, qual a função
destas proteínas na interação parasito-hospedeiro e quais são os possíveis fatores
de virulência provavelmente envolvidos na patogênese destas espécies nos
diferentes hospedeiros mamíferos.
Tabela 22: Proteoma comparativo das espécies do complexo S. schenckii.
Análise comparativa Expressão diferencial de proteínas
Spots ≠ expressos
Proteínas exclusivas
Proteínas comuns
S. schenckii x S. brasiliensis 234 207 62 (Ss)
27 18 ↑ (Ss)
145 (Sb) 9 ↑ (Sb)
S. schenckii x S. globosa 83 58 30 (Ss)
25 10 ↑ (Ss)
28 (Sg) 15 ↑ (Sg)
S. schenckii x S. mexicana 133 113 82 (Ss)
20 4 ↑ (Ss)
31(Sm) 16 ↑ (Sm)
S. globosa x S. brasiliensis 232 202 48 (Sg)
30 18 ↑ (Sg)
154 (Sb) 12 ↑ (Sb)
S. globosa x S. mexicana 120 98 66 (Sg)
22 5 ↑ (Sg)
32 (Sm) 17 ↑ (Sm)
S. brasiliensis x S. mexicana 209 185 160 (Sb)
24 10 ↑ (Sb)
25 (Sm) 14 ↑ (Sm) Spots ≠ expressos: Spots diferencialmente expressos; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii. ↑: Expressão superior na classe descrita.
4.8.3. Moléculas imunogênicas presentes no extrato precipitado
de leveduras do complexo S. schenckii.
A análise imunoproteômica comparativa foi realizada entre as quatro cepas
do complexo S. schenckii (Ss 06, Ss 54, Ss 118 e FMR 9108) descritas
anteriormente, avaliando-se o conjunto de proteínas expressas durante a fase
parasítica e que são reconhecidas por anticorpos IgG circulantes no soro de
161
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
pacientes que desenvolveram a forma cutânea fixa ou a forma linfocutânea da
doença.
O isolado Ss 54 de S. brasiliensis, apresentou 9 spots imunogênicos na
esporotricose cutânea fixa e 8 spots imunogênicos na esporotricose linfocutânea
(Figura 39). Três proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose
cutânea fixa (Identificação (ID): 7, 8 e 9), enquanto que duas proteínas foram
reconhecidas exclusivamente na esporotricose linfocutânea (ID: 10 e 11).
O isolado Ss 06 de S. globosa, apresentou 13 spots imunogênicos na
esporotricose cutânea fixa e 16 spots imunogênicos na esporotricose linfocutânea
(Figura 40). Três proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose
linfocutânea (ID: 9, 10 e 11).
O isolado FMR 9108 de S. mexicana, apresentou 6 spots imunogênicos em
cada forma clínica avaliada (Figura 41). O perfil de reconhecimento antigênico deste
isolado foi diferente das demais espécies avaliadas.
O isolado Ss 118 de S. schenckii, apresentou 14 spots imunogênicos na
esporotricose cutânea fixa e 6 spots imunogênicos na esporotricose linfocutânea
(Figura 42). Oito proteínas foram reconhecidas exclusivamente na esporotricose
cutânea fixa (ID: 7-14).
Os dados de ponto isoelétrico (pI) e massa molecular (MW) das proteínas
fúngicas reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G de pacientes com
esporotricose cutânea fixa e linfocutânea estão descritos na Tabela 23. O perfil
antigênico de cada isolado é útil para a seleção de candidatos a biomarcadores da
espécie em testes sorológicos para o diagnóstico diferencial da esporotricose
humana.
162
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 39: Imunoproteômica da cepa Ss 54 de S. brasiliensis. As proteínas do fungo S. brasiliensis são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG)
presentes em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído
em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência.
163
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 40: Imunoproteômica da cepa Ss 06 de S. globosa. As proteínas do fungo S. globosa são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes em
um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído em PBS tween
20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por quimioluminescência.
164
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 41: Imunoproteômica da cepa FMR 9108 de S. mexicana. As proteínas do fungo S. mexicana são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG)
presentes em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído
em PBS tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência.
165
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Figura 42: Imunoproteômica da cepa Ss 118 de S. schenckii. As proteínas do fungo S. schenckii são reconhecidas por imunoglobulinas do tipo G (IgG) presentes
em um pool de soros de pacientes (n=15) nas duas formas clínicas da doença: A) forma cutânea fixa e B) forma linfocutânea. Soro diluído em PBS
tween 20 (1:500); Anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase diluído em PBS tween 20 (1:1000). Revelação por
quimioluminescência.
166
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Tabela 23: Características moleculares experimentais das proteínas imunogênicas
detectadas na esporotricose humana.
Iso
lad
o
Proteínas imunogênicas
Características
experimentais
Soro
humano
Comum à:
Sb Sg Ss Sm
ID pI MM
(kDa) Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF
S. b
ras
ilie
ns
is
1 4.45 62 X X – – X X X X – –
2 4.50 61 X X – – X X X X – –
3 4.56 59 X X – – X X X X – –
4 4.62 58 X X – – X X X X – –
5 4.70 56 X X – – X X X X – –
6 4.80 55 X X – – X X X X – –
7 4.49 40 X – – – – – – – – –
8 4.56 39 X – – – – – – – – –
9 4.61 36 X – – – – – – – – –
10 4.45 91 – X – – – X – – – –
11 4.51 90 – X – – – X – – – –
S. g
lob
os
a
1 4.33 73 X X X X – – X X – –
2 4.38 73 X X X X – – X X – –
3 4.43 72 X X X X – – X X – –
4 4.51 73 X X X X – – X X – –
5 4.58 72 X X X X – – X X – –
6 4.68 69 X X X X – – X X – –
7 4.77 68 X X – – – – – – – –
8 4.85 64 X X – – – – – – – –
9 5.74 91 - X – – – – X – – –
10 4.77 107 - X – – – – X – – –
11 4.68 107 - X – – – – X – – –
12 4.58 107 X X – – – – X – – –
13 4.51 107 X X – – – – X – – –
14 4.43 107 X X – X – – X – – –
15 4.38 107 X X – X – – X – – –
16 4.33 107 X X – – – – X – – –
Continua...
As marcações “X” indicam detecção da proteína descrita, pelo respectivo soro de pacientes com a doença. As marcações em vermelho “X” indicam reconhecimento exclusivo para a espécie, e as marcações em verde “X” indicam reconhecimento comum para as espécies. Abreviações: ID: Identificação; pI: ponto isoelétrico; MM: Massa molecular em kDa; Fixa: Esporotricose cutânea fixa; LF: Esporotricose linfocutânea; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii.
167
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Resultados
Conclusão... Is
ola
do
Proteínas imunogênicas
Características
experimentais
Soro
humano
Comum à:
Sb Sg Ss Sm
ID pI MM
(kDa) Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF Fixa LF
S. m
ex
ica
na
1 4.80 52 X – – – – – – – – –
2 4.89 52 X – – – – – – – – –
3 4.86 42 X – – – – – – – – –
4 4.65 26 X – – – – – – – – –
5 4.71 26 X – – – – – – – – –
6 4.77 27 X – – – – – – – – –
7 5.84 72 – X – – – – – – – –
8 5.88 80 – X – – – – – – – –
9 5.97 80 – X – – – – – – – –
10 6.08 80 – X – – – – – – – –
11 6.20 82 – X – – – – – – – –
12 4.75 154 – X – – – – – – – –
S. s
ch
en
ck
ii
1 4.54 70 X X X X X X – – – –
2 4.60 69 X X X X X X – – – –
3 4.67 69 X X X X X X – – – –
4 4.73 69 X X X X X X – – – –
5 4.76 66 X X X X X X – – – –
6 4.82 68 X X X X X X – – – –
7 5.21 53 X – – – – – – – – –
8 4.31 91 X – – – X X – – – –
9 4.36 91 X – X X X – – – –
10 4.42 88 X – X X X – – – –
11 4.49 87 X – – X X – – – –
12 4.54 87 X – – X X – – – –
13 4.63 267 X – – – – – – – –
14 4.68 267 X – – – – – – – –
As marcações “X” indicam detecção da proteína descrita, pelo respectivo soro de pacientes com a doença. As marcações em vermelho “X” indicam reconhecimento exclusivo para a espécie, e as marcações em verde “X” indicam reconhecimento comum para as espécies. Abreviações: ID: Identificação; pI: ponto isoelétrico; MM: Massa molecular em kDa; Fixa: Esporotricose cutânea fixa; LF: Esporotricose linfocutânea; Sb: S. brasiliensis; Sg: S. globosa. Sm: S. mexicana; Ss: S. schenckii.
168
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
5. DISCUSSÃO
A descrição e caracterização do complexo S. schenckii foi realizada
recentemente por Marimon et al. (2007, 2008). Nosso trabalho teve como principal
objetivo descrever a distribuição deste complexo de espécies crípticas em território
brasileiro e contribuir para estudos da epidemiologia e biologia destes
microrganismos.
Com o propósito de estudar as diferenças fenotípicas, moleculares e
antigênicas entre as cepas do complexo S. schenckii utilizamos isolados de origem
clínica, que provocaram diferentes quadros de esporotricose no homem e em
animais, assim como isolados ambientais de diferentes regiões geográficas.
Dentre as características fenotípicas estudadas, o crescimento vegetativo é
um importante fator para a distinção das espécies que compõem o complexo S.
schenckii. O crescimento fúngico é um processo fisiológico complexo, coordenado e
que sofre influência de diversos fatores externos e internos. O crescimento tem sido
definido pelos biólogos nos últimos 50 anos como o aumento de tamanho
(Davenport et al., 1939) no número de células ou na massa (Lilly & Barnett, 1951).
No caso dos fungos o crescimento vegetativo ocorre através da expansão apical da
hifa.
Diversos fatores ambientais como diferentes regimes de nutrientes, a
presença de distintos indutores químicos e perturbações físicas como o pH externo e
a temperatura foram evidenciados como capazes de influenciar a taxa de
crescimento de leveduras e hifas (Gow, 1994). Dentre estes, a temperatura possui
um papel extremamente importante (Trinci, 1969, Wolf & Wolf, 1947b; Lilly & Barnett,
1951; Cochrane, 1958) determinando o nicho fundamental de todos os fungos
(Cooke & Whipps 1993).
169
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
Em muitos microrganismos tem-se demonstrado que o crescimento cessa à
temperatura levemente acima da temperatura ótima (Langridge, 1963). Por outro
lado, à baixa temperatura ocorre aumento no número de interações não covalentes
entre as moléculas; consequentemente, a membrana celular torna-se mais rígida
impedindo o crescimento (Jermy, 2010). A temperatura de incubação é um fator que
afeta notavelmente o crescimento vegetativo e a morfologia dos fungos e no caso de
S. schenckii este fator tem uma importância especial, pois altera a expressão gênica
do fungo e possibilita, junto a outros fatores, a transição de uma forma de vida
saprofítica para uma forma parasítica.
Em nosso estudo com S. schenckii o efeito da temperatura sobre o
crescimento fúngico foi mais evidente quando a temperatura de crescimento passou
de 30 para 35ºC, ocorrendo diminuição do crescimento e alterações morfológicas.
Estes dados estão de acordo com os esperados, quando consideramos a
diversidade de fatores ambientais com as quais estes isolados são desafiados no
ambiente. A temperatura do solo, principal reservatório de Sporothrix spp., varia
sazonalmente e diariamente, sendo afetada principalmente pelas variações na
temperatura do ar e radiação solar, além de variar espacialmente de acordo com a
profundidade amostrada. Quando o fungo encontra-se no solo, sob desenvolvimento
saprofítico, a temperatura em determinadas regiões do Brasil e em muitos outros
países de clima tropical a subtropical, onde a doença é endêmica, varia numa faixa
de 20-40 ºC, o que garante a preservação e viabilidade das estruturas fúngicas. Este
fato possivelmente restringe geograficamente a densidade populacional do fungo em
algumas regiões consideradas de temperaturas extremas, como as regiões
desérticas (temperaturas ocorrem acima de 40 ºC) e polares (abaixo de 0 ºC).
Devido à restrição térmica de alguns isolados de S. schenckii, a hipertermia
tem sido utilizada como terapia alternativa no tratamento da esporotricose
linfocutânea (Thomas et al., 1951; Galiana & Conti-Diaz, 1963; Laca, 1964; Trejos &
170
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
Ramirez, 1966; Lii et al., 1973; Sutherland et al., 1980; Takahashi et al., 1981;
Doherty et al., 2010). As espécies filogenéticas S. brasiliensis e S. schenckii
apresentaram as maiores taxas de crescimento a 37 ºC, o que nos leva a acreditar
que o emprego da hipertermia não seja satisfatório para o tratamento da
esporotricose que tenha como agente etiológico estas duas espécies. Destacamos
deste modo, a importância da correta identificação do agente patogênico para o
emprego da terapia mais adequada para o paciente.
Nossos resultados sobre a influência da temperatura no crescimento
vegetativo não estão de acordo com os encontrados por Kwon-Chung (1979). Os
isolados obtidos de pacientes que desenvolveram esporotricose linfocutânea não
foram mais termotolerantes do que os fungos isolados de pacientes com
esporotricose cutânea fixa. O isolado Ss 49 de S. globosa, por exemplo, não foi
capaz de crescer após 21 dias de incubação a 37 ºC embora tenha sido obtido de
um paciente com esporotricose linfocutânea. Este fato nos leva a acreditar que a
capacidade em provocar os mais diferentes quadros clínicos da doença esteja
intimamente relacionada e seja resultado da interação do patógeno com o sistema
imune do hospedeiro. Cabe ressaltar que o meio de cultura utilizado não reconstitui
os nutrientes disponíveis in vivo no hospedeiro. Estes nutrientes podem estimular
juntamente com a temperatura a expressão de diversos genes importantes para a
manutenção celular, virulência e patogenicidade in vivo. Estes fatores, aliados à
debilidade do sistema imune, podem culminar na capacidade deste isolado de S.
globosa provocar o quadro de esporotricose linfocutânea.
Vidal et al. (1997) demonstraram em Paecilomyces fumosoroseus que o
potencial de um isolado em tolerar altas ou baixas temperaturas está normalmente
relacionado com os dados climáticos da sua origem geográfica. Este fato não foi
observado com os isolados de Sporothrix spp. estudados. Os isolados apresentaram
perfis de similaridade distintos quando agrupados por origem geográfica e estes
171
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
perfis não foram congruentes com os dados climáticos das regiões brasileiras
estudadas. Nossa hipótese inicial teorizava que quando num estado saprofítico, a
pressão ambiental dos diferentes biomas do Brasil sobre a população natural de
Sporothrix spp. poderia selecionar fungos de uma mesma região com taxas de
crescimento similares. Embora existam grandes variações sazonais no clima
brasileiro, os fungos provenientes de estados com clima predominantemente quente
como acontece no nordeste brasileiro (temperatura média anual superior a 18 ºC),
não são mais termo resistentes do que os fungos isolados de regiões com clima
mesotérmico brando (com temperatura média entre 10 e 15 ºC) como acontece na
região sul do país.
O risco potencial quando são feitas correlações entre a origem geográfica e
a resposta térmica utilizando poucos ou apenas um espécime é a grande dificuldade
no conhecimento, a priori, de quão representativo da população natural um isolado
em particular pode ser, assim como a ausência de conhecimento sobre a presença e
fontes de variação na população natural de fungos (Cooke & Rayner, 1984).
A análise de clusterização baseada em dados de crescimento vegetativo e
inibição do crescimento vegetativo em diferentes temperaturas com 170 isolados de
Sporothrix revelou o comportamento fisiológico distinto pelos mesmos. Não
observamos uma correlação entre os perfis de crescimento e inibição do
crescimento vegetativo e a origem geográfica ou forma clínica da doença. Fungos
obtidos de uma mesma área geográfica demonstraram respostas fisiológicas
distintas, assim como fungos que provocaram diferentes quadros clínicos da doença
em hospedeiro humano demonstraram perfis de inibição semelhantes.
Para Angilletta et al. (2002) e McLean et al. (2005), a temperatura que
possibilita um crescimento rápido pode variar entre genótipos, e espera-se que a
seleção natural favoreça variantes particulares em função dos padrões espaciais e
temporais da temperatura ambiental. Um fator que pode explicar a diversidade de
172
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
fenótipos em relação à tolerância térmica pode estar relacionado à diversidade de
genótipos encontrados em Sporothrix spp. A questão da ploidia em S. schenckii
ainda não está totalmente esclarecida, sendo considerados estados diplóides,
haplóides e aneuplóides (Tateishi et al., 1996; Torres-Guerreiro, 1999). Segundo
Deacon (1997), fungos haplóides como Pandora blunckii e Zoophthora radicans
expressam todos os seus genes, além disso, todos são expostos a mutações. Como
resultado eles podem ter núcleos geneticamente diferentes no citoplasma da hifa
(heterocariose). A taxa de tipos nucleares pode variar de acordo com as condições
ambientais. Isto possibilita ao fungo acumular mutações e escondê-las da pressão
seletiva entre os núcleos selvagens, e eventualmente propicia a colônia alterar a
taxa nuclear em resposta às condições prevalentes. Este fenômeno é um atributo
importante, o qual proporciona aos fungos adaptarem-se às mudanças nas
condições ambientais pela alteração na taxa do tipo nuclear. Segundo Guzmán-
Franco et al. (2008) esta pode ser uma das razões pela qual, de uma mesma área
geográfica podem ser obtidos isolados com diferentes atributos biológicos.
O aspecto mais importante das populações naturais está geneticamente
baseado na existência de variação dentro delas. A variabilidade fenotípica
apresentada pelos isolados dessas espécies em reposta à temperatura sugere uma
grande adaptação aos ambientes em que estas espécies são encontradas, assim
como a diversidade de hospedeiros (vários gêneros de mamíferos e artrópodes) que
são parasitados pelos fungos do gênero Sporothrix.
De acordo com Mitchell & Xu (2003), a variação fenotípica das espécies
fúngicas são comuns em níveis inter e intra-específicos. As estirpes patogênicas
desenvolvem-se bem a 37°C, o que geralmente não acontece com as estirpes
saprofíticas (Esteves et al., 1990). De fato, os microrganismos que provocam doença
em hospedeiro humano apresentam um estilo de vida saprofítico e apenas aqueles
que conseguem adaptar-se à temperatura corporal sobreviverão (Ripon, 1982).
173
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
Robert & Casadevall (2009) consideram que a endotermia desenvolvida por
mamíferos seja um mecanismo de defesa não específico contra este tipo de
patógeno. Fungos que são capazes de provocar doenças em insetos e em
mamíferos possuem uma ótima termotolerância quando comparados aos fungos que
comumente habitam o solo e plantas. Nossos dados indicam que os isolados
provenientes de amostras clínicas (humana e animal) são mais termotolerantes do
que os isolados provenientes de fontes ambientais. Existe diferença estatística
significativa com relação a inibição do crescimento a 35 ºC entre os isolados
ambientais e de origem animal (p<0.01). À 37 ºC os isolados humanos (p<0.001) e
animais (p<0.001) diferem dos isolados ambientais.
Criseo e Romeo (2010) relatam a presença de dois clusters entre isolados
clínicos e ambientais de S. schenckii baseados nas informações da sequência do
gene ribossomal 28S (D1-D2). O primeiro cluster é formado apenas por isolados
ambientais, enquanto que o segundo grupo é formado por isolados clínicos de
origem humana e animal. Segundo Criseo e Romeo (2010), as cepas estudadas
apresentam uma translocação conservada entre todos os isolados de origem clínica
(T C e A G) e os ambientais (C T e G A). No estudo das cepas italianas
Criseo e Romeo (2010) apontam que as cepas ambientais estudadas apresentam
nível de diferença na região D1-D2 do rDNA 18S suficiente para justificar a
separação dos isolados examinados em dois grupos (ambientais e clínicos), embora
não esteja claro se o valor dessas diferenças genéticas é suficiente para definir
novas espécies ou se isto apenas demonstra uma variação genética entre isolados
de diferentes origens de S. schenckii.
Em ambientes naturais os fungos podem ser expostos a uma ampla faixa de
temperaturas, sujeitas a variações diárias e sazonais, de maneira que o crescimento
ativo nem sempre pode ser possível (Carlile et al., 2001).
174
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
A abundância e riqueza de fungos em um habitat são limitadas pela duração
das condições meteorológicas. Deste modo, segundo Talley et al. (2002), a
caracterização das condições climáticas favoráveis para os fungos patogênicos
podem ser utilizadas para prever a pressão seletiva imposta a estes em diferentes
habitats. Barrozo et al. (2009) demonstraram que a variação climática em uma
região hiper-endêmica de Paracoccidioides brasiliensis, no estado de São Paulo,
afeta o número de ocorrências da infecção na população. Acredita-se que este fator
abiótico seja importante para a ocorrência de outras micoses onde o reservatório
seja o solo. No caso da paracoccidioidomicose, a infecção se dá pela liberação dos
propágulos na natureza e inalação destes pelo hospedeiro mamífero. No caso da
esporotricose, uma micose geralmente subcutânea, ocorre a necessidade da
inoculação traumática do patógeno no tecido do hospedeiro.
Informações sobre o possível papel desempenhado pelos animais nas
infecções fúngicas em seres humanos apresentam consequências importantes na
saúde pública assim como no entendimento da ecologia fúngica (Restrepo et al.,
2000). Alguns mamíferos como gatos (Felis catus) e tatus (Dasypus novemcinctus)
são apontados como importantes reservatórios de fungos patogênicos e possuem
influência na transmissão destes para o homem. Na cidade do Rio de Janeiro, uma
área de grande incidência da esporotricose no Brasil, os gatos possuem um papel
de destaque na transmissão desta zoonose. No estado de São Paulo, alguns casos
estão ligados à caça de tatus na natureza. Os hospedeiros felinos podem adquirir o
fungo por meio do contato com outros animais infectados ou pelo contato direto com
solo e plantas, podendo assim transmitir o patógeno ao homem.
Em hipótese, o clima pode favorecer a expansão da população do
microrganismo na natureza, aumentando as chances de contaminação de algum
hospedeiro mamífero como gatos e tatus através do solo e deste modo ampliar as
possibilidades de transmissão da micose para humanos.
175
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
A região Sul do Brasil é considerada área endêmica da doença sendo
descritos 304 casos de esporotricose entre 1967 e 2002 (Rosa et al., 2005), assim
como o estado do Rio de Janeiro na região sudeste do país (Barros et al., 2008a;
Bernardes-Engemann, 2009) com a descrição de 759 casos humanos, 1.503 gatos e
64 cachorros entre 1998 e 2004 (Lopes-Bezerra et al., 2006). Possivelmente as
regiões sul e sudeste, onde são relatados mais casos da doença em humanos, as
condições climáticas de temperatura e umidade do ar favoreçam o desenvolvimento
e a expansão do número de focos do fungo na natureza. Isto pode aumentar as
possibilidades de aquisição da micose pelo gato através do contato direto com o
foco, favorecendo com que este seja posteriormente o principal agente de
transmissão da doença para o homem. Deste modo, acredita-se que o gato atue
mais do que um mero portador da doença, sendo, portanto um hospedeiro chave
para a ecoepidemiologia da doença nestes estados.
Nenhum isolado de Sporothrix spp. apresentou crescimento vegetativo aos
21 dias de incubação a 40 °C, e a temperatura atuou como fator fungistático e
fungicida, uma vez que após a incubação as placas foram armazenadas a
temperatura ambiente por 14 dias e o inóculo inicial permaneceu inerte.
A temperatura do micro-ambiente em que o fungo vive, seja ela a
temperatura do hospedeiro ou a temperatura ambiental (solo ou planta), representa
um fator abiótico de extrema importância sobre o crescimento, a reprodução, a
patogenicidade entre outros aspectos da fisiologia do microrganismo, podendo este
fator estabelecer a correlação entre a temperatura de crescimento in vitro, a
distribuição geográfica do patógeno e a época de ocorrência da enfermidade. O
aumento da temperatura global, poderá influenciar na eco-epidemiologia das
doenças fúngicas. Em sua grande maioria, as doenças fúngicas são restritas ou
ocorrem com maior intensidade em determinadas áreas geográficas. Muitas dessas
doenças são consideradas endêmicas de áreas tropicais, onde prevalecem
176
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
temperaturas e umidade relativa do ar elevadas durante a maior parte do tempo.
Este tipo de comportamento em função das condições climáticas pode ser associado
à maioria dos microrganismos, assim como às micoses provocadas por fungos
termodimórficos. De acordo com Garcia-Solache & Casadevall (2010) o aquecimento
global afetará a amplitude geográfica de ocorrência das espécies patogênicas e
selecionará fungos cada vez mais termo resistentes, favorecendo espécies
termotolerantes com potencial patogênico, mas que atualmente não acometem o
hospedeiro mamífero em virtude de serem restritas pela temperatura corpórea
desenvolvida por estes.
Outra característica morfológica avaliada como parâmetro taxonômico foram
os tipos de conídios produzidos por Sporothrix spp. Dados biométricos, como a
morfometria de micro-estruturas vegetativas como conídios e hifas têm sido
amplamente empregados na taxonomia de grupos fúngicos. A morfologia das micro-
estruturas vegetativas dos isolados de S. schenckii estudados são congruentes com
a diversidade encontrada por Marimon et al. (2007 e 2008). Embora o
mensuramento das microestruturas seja uma característica importante para
comparação dos nossos resultados com os resultados publicados por Marimon et al.
(2007 e 2008) este não foi um fator decisivo para a taxonomia do fungo utilizando
isolados brasileiros. De fato, dados publicados na literatura demonstram que em
outros fungos como ocorre em Cercospora sesani, de acordo com Carvalho e
Carvalho (1973), os conídios produzidos em temperaturas médias são maiores que
aqueles produzidos em temperaturas elevadas ou baixas. Segundo Cochrane
(1958), em Aspergillus janus, a temperatura pode ser um fator determinante para a
alteração da morfologia dos conídios. Deste modo, fica evidente que mesmo quando
os parâmetros experimentais estipulados são seguidos rigorosamente em condições
laboratoriais, poderá haver alterações morfológicas importantes dependendo da
composição do meio de cultura (os quais podem não ter a composição
177
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
quimicamente definida), do tamanho e do tempo de cultivo, do período e da
temperatura de incubação, da luminosidade fornecida durante a incubação, entre
outros fatores.
A população de Sporothrix spp. estudada demonstrou ser altamente
heterogênea quanto aos parâmetros morfológicos avaliados. A maioria dos estudos
sobre diversidade fúngica tem focado sua atenção na variabilidade entre indivíduos
isolados ao invés de focar as diferenças populacionais (Francis, 1976). Entretanto, a
existência de populações (unidades micro-evolucionárias) tem sido demonstrada
dentro de algumas espécies fúngicas. Lovelles (1971) distinguiu populações de
Claviceps purpurea baseado no tamanho do conídio, o qual tem sido relacionado à
origem do hospedeiro. Shepherd & Pratt (1973) encontraram isolados de
Phytophthora drechsleri de algumas origens geográficas as quais diferem com
relação à taxa de crescimento. O papel do isolamento geográfico como um
mecanismo seletivo, o qual contribui para o desenvolvimento de discretas
populações tem sido bem relatado na literatura.
A análise morfométrica do crescimento vegetativo dos 170 isolados de
Sporothrix spp. de diversas origens geográficas nos leva a acreditar que a taxa
crescimento vegetativo não está relacionado com a origem geográfica nem com as
diversas formas clínicas apresentada pelos pacientes. Entretanto, existe uma forte
correlação entre a taxa de crescimento nas temperaturas de 30, 35 e 37 ºC e a
termotolerância apresentada pelos isolados com as espécies filogenéticas
estudadas.
Sporothrix schenckii é descrito na literatura como uma espécie amplamente
distribuída na natureza. Os padrões de distribuição do agente etiológico da
esporotricose apresentam mudanças quando levamos em consideração a espécie
filogenética e a origem geográfica do fungo. A frequência de ocorrência desta
178
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
micose em determinada fonte ou vetor, afeta os padrões de distribuição da espécie
entre os hospedeiros.
Os dados geográficos indicam que S. brasiliensis ocorre com maior
frequência nas regiões Sul e Sudeste. Os fungos isolados na região Sul do país
foram obtidos de casos clínicos de esporotricose felina. A espécie filogenética S.
brasiliensis ocorreu com maior frequência em hospedeiro felino do que as demais
espécies do complexo S. schenckii. De modo concordante, a espécie filognética S.
brasiliensis predomina entre o hospedeiro humano nesta região. O contato direto do
homem com o animal contaminado pode estar relacionado com a disseminação
desta espécie entre seres humanos no Brasil e este fato pode ser uma das razões
que influenciam os aspectos epidemiológicos da doença cujo agente etiológico é o
fungo S. brasiliensis. No estado do Rio de Janeiro, esta espécie predomina em
casos de esporotricose humana. Uma importante epidemia de esporotricose felina é
descrita na região metropolitana do Rio de Janeiro sugerindo este animal como um
importante vetor. No estado de São Paulo, por exemplo, onde não ocorre a epidemia
de esporotricose felina, a espécie S. schenckii é predominante na esporotricose
humana, indicando possivelmente outra fonte de infecção no ambiente. Os dados de
crescimento vegetativo associados a outros caracteres morfológicos são importantes
para a caracterização populacional dos isolados fúngicos. A diversidade fenotípica
dentro da população de Sporothrix spp. ainda não está totalmente elucidada. À
medida que novos dados forem disponibilizados na literatura, os padrões de
classificação poderão ser alterados.
Os micróbios devem assimilar carbono para crescer (Barelle et al., 2006). O
desenvolvimento de microrganismos patogênicos em uma ampla gama de
hospedeiros depende, não apenas de certos fatores de virulência, mas também de
uma grande flexibilidade metabólica (Askew et al., 2009). Patógenos devem ser
capazes de assimilar fontes de carbono em seu ambiente para gerar metabólitos e
179
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
energia suficientes para sobreviver (Askew et al., 2009). De acordo com Kingsbury et
al. (2006), potenciais fontes de nitrogênio in vitro incluem amônia, uréia e
aminoácidos, enquanto que potenciais fontes de carbono incluem glicose, lactato,
piruvato e ácidos graxos. Saccharomyces cerevisiae e muitas outras leveduras
podem sobreviver utilizando uma grande variedade de fontes de carbono, entretanto,
os açúcares glicose e frutose constituem as fontes preferidas. Quando um destes
carboidratos está presente, as enzimas requeridas para a utilização de fontes de
carbono alternativas são sintetizadas a taxas basais ou totalmente reprimidas
(Gancedo, 1998).
A capacidade de um micróbio sobreviver in vivo é determinada por uma
complexa interação entre o microambiente do hospedeiro e o micróbio. O
metabolismo de fontes de carbono in vivo depende de diversos fatores como: i) a
concentração e a qualidade das fontes de carbono disponível; ii) fatores como o pH
e a temperatura influenciam a absorção de fontes de carbono; iii) A capacidade de o
microrganismo assimilar e metabolizar diferentes fontes de carbono in vivo é
determinado por genes e vias metabólicas específicos (Kingsburg et al., 2006).
A capacidade de assimilar carboidratos assim como substratos que
fornecem nitrogênio e a capacidade fermentativa constituem características muito
empregadas em testes fisiológicos para a definitiva identificação de leveduras de
interesse médico, pois permitem a diferenciação entre as espécies (Jones, 1990;
Sandven, 1990; Milan et al., 1997).
Os fungos são organismos quimio-organotróficos, obtendo sua energia a
partir da quebra de compostos orgânicos (Walker & White, 2005). Remetendo a um
modo de nutrição saprofítica, os fungos filamentosos demonstram naturalmente altos
níveis de secreção de hidrolases extracelulares (Wang et al., 2005; Barry et al.,
2009), o que lhes permitem a degradação extracelular de numerosas substâncias de
alto peso molecular e, consequentemente, a sua utilização (Esteves et al., 1990).
180
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
A identificação das espécies fúngicas, pelos procedimentos microbiológicos
padrões, é demorada e geralmente necessita de profissionais especializados de um
laboratório de referência (Schwarz et al., 2007).
Os resultados de testes de assimilação de diferentes fontes de carbono são
amplamente empregados em laboratórios para a identificação de microrganismos
(Wickerham & Burton, 1948). A metodologia clássica para a realização de testes de
assimilação é proposta por Beijerinck (1889). Marimon et al. (2007) utilizaram uma
metodologia distinta, que emprega a homogeneização de uma suspensão de
conídios do fungo em um meio líquido isento de fontes de carbono. Embora a
metodologia descrita por Beijerinck (1889) seja o método mais comumente utilizado
para a identificação de fungos leveduriformes, optou-se, por utilizar a mesma técnica
empregada e descrita pelo grupo espanhol para a realização dos testes de
assimilação de fontes de carbono, a fim de obtermos parâmetros comparativos de
nossos resultados.
Os isolados estudados neste trabalho apresentaram padrões de assimilação
distintos para as fontes de carbono testadas. Dentre as possibilidades de
combinações diferentes, todas foram apresentadas pelos isolados estudados.
Escolhemos aleatoriamente 70 isolados para repetir os ensaios e avaliar a
reprodutibilidade dos resultados. Satisfatoriamente, dentre os isolados escolhidos
obtivemos o mesmo perfil de assimilação quando comparados aos primeiros
resultados obtidos.
A fisiologia dos fungos determina os parâmetros de dispersão global das
espécies. A possibilidade de utilizar certos nutrientes aliados as condições
ambientais podem suportar a sua posição competitiva no seu ecossistema. Na
natureza, muitos fungos degradam fontes de carbono poliméricas com o intuito de
utilizar os componentes monoméricos como fonte de carbono. No entanto, a
disponibilidade e a diversidade destas fontes de carbono variam fortemente no
181
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
ambiente. O trissacarídeo rafinose (C18H32O16) (α-D-galactopiranosil-(16)-α-D-
glucopiranosil-(1↔2)-β-D-fructofuranosideo), assimilado por 53,52% dos isolados de
Sporothrix spp. avaliados, ocorre naturalmente em sementes de muitas plantas,
especialmente legumes (Côté et al., 2009). O fungo S. schenckii tem sido isolado da
superfície de vegetais. Os isolados que são capazes de assimilar a rafinose
disponível no micro-ambiente podem obter vantagem competitiva no
desenvolvimento sobre os isolados que não são capazes de realizar o metabolismo
de tal carboidrato. Os resultados de assimilação de rafinose, quando positivos,
podem ser indicadores do possível nicho fúngico, além de indicar forte associação
com a capacidade utilizar nutrientes derivados de vegetais. Enquanto alguns
microrganismos do gênero Sporothrix se tornaram especialistas em determinadas
fontes de carbono, outros são mais generalistas, sendo capazes de sobreviverem e
crescerem utilizando uma grande variedade de compostos orgânicos. Estas
diferenças na fisiologia podem, portanto, refletir importantes limites entre as
espécies, além da possibilidade da utilização destes dados como características
taxonômicas.
Os dados sobre a ecologia da maioria dos fungos de importância médica são
escassos. De fato, a capacidade de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio é
um importante determinante do nicho ecológico do microrganismo. De acordo com
Baumgardner (2009), o acúmulo de amônia em certos micro-ambientes pode ser
tóxico para a maioria dos microrganismos, incluindo a maioria dos fungos e
bactérias, porém Blastomyces dermatitidis, um fungo patogênico termodimórfico, é
capaz de sobreviver e crescer em condições de déficit de fontes de carbono
orgânica e altas concentrações de amônia. Para Baumgardner (2009) esta
habilidade pode resultar no sucesso competitivo do agente da blastomicose na
natureza, garantindo a sua sobrevivência em detrimento aos outros organismos
presentes no mesmo micro-ambiente.
182
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
As vias metabólicas assim como os genes que são expressos ou reprimidos
para que haja a assimilação destes açúcares ainda não foram bem descritos em S.
schenckii ou espécies relacionadas (com exceção da glicose). Em bactérias, como
Erwinia chrysanthemi, por exemplo, dois conjuntos de genes, scrKYABR e rafRBA
foram descritos por Hugouvieux-Cotte-Pattat & Charaoui-Boukerzaza (2009) como
necessários para o catabolismo dos carboidratos sacarose e rafinose como única
fonte de carbono disponível para o crescimento. Ambos os grupos gênicos são
controlados pelo ativador global do catabolismo de carboidratos, a proteína
receptora de AMP cíclico (CRP). O ribitol (adonitol) foi assimilado por 94,11% dos
isolados avaliados após 10 dias de incubação. Primrose & Ronson (1980)
descrevem em Rhizobium trifolii, uma bactéria de importância agronômica, uma
enzima denominada ribitol desidrogenase, com ação substrato-específico para o
ribitol.
Durante os últimos anos, a análise da sequência de DNA tornou-se um dos
principais meios de identificação taxonômica das espécies biológicas (Nilsson et al.,
2005; Nilsson et al., 2006), particularmente para microrganismos crípticos ou de
difícil distinção baseado em caracteres morfo-fisiológicos como ocorre no complexo
S. schenckii. Milhares de sequências estão disponíveis em bancos de dados on-line
para a consulta pública. A sequência nucleotídica de um fragmento de
aproximadamente 800 pb do gene da calmodulina foi empregada por Marimon et al.
(2007) para caracterizar e distinguir molecularmente entre os isolados que compõem
o complexo Sporothrix schenckii.
A calmodulina é uma proteína ubíqua, ancestral em organismos eucariotos
(Friedberg & Taliaferro, 2005) e pertence a uma grande família de proteínas ligantes
a íons cálcio Ca2+ (Kretsinger, 1980). Proteínas ligantes de cálcio têm sido
identificadas em muitos fungos filamentosos e leveduras (Ortega Perez et al., 1981;
Hoshino et al., 1992; Ortega Perez et al., 1994; Bindra et al., 1995) e existem cada
183
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
vez mais evidências para o seu envolvimento em inúmeros eventos dependentes de
íons cálcio. Uma mudança conformacional induzida pela interação com íons cálcio
capacita a Calmodulina a interagir com “proteínas alvo de cálcio” as quais incluem
proteínas do citoesqueleto (Bonafé & Sellers, 1998), quinases (Lukas et al., 1998),
fosfatases (Perrino & Soderling, 1998), adenilato ciclase, fosfodiésterases
(Sonnenburg et al., 1998), Ca2+-ATPases, entre outras. O cálcio ligado à calmodulina
possui uma afinidade muito superior, em torno de quatro ordens de magnitude, para
a enzima alvo, do que o cálcio livre da calmodulina. (Pietrobon et al., 1990).
A calmodulina é uma das proteínas mais conservadas conhecidas até hoje,
e é geneticamente representada por um único gene que varia de 1 a 15 Kb (de
Carvalho et al., 2003).
De acordo com Marimon et al. (2008) quando comparamos a sequência de
nucleotídeos do amplicon da calmodulina das espécies do complexo S. schenckii à
sequência correspondente de S. luriei são encontradas 121 alterações em S.
albicans; 62 em S. brasiliensis; 70 em S. globosa; 124 em S. mexicana e 63 em S.
schenckii.
Com relação à variabilidade da sequência da calmodulina em isolados do
complexo Sporothrix schenckii, Marimon et al. (2006) relatam que 12,8% dos
nucleotídeos que compõem a sequência gênica analisada são sítios variáveis,
correspondendo a aproximadamente 100 nucleotídeos. Dentre estes, 84
nucleotídeos são sítios parcimoniosos informativos. Nossos dados moleculares
estão de acordo com o polimorfismo encontrados por Marimon et al. (2006 e 2007).
Estas características moleculares referentes ao sequenciamento do gene da
calmodulina aliados a fatores morfo-fisiológicos, já citados anteriormente, foram
utilizados por Marimon et al. (2006, 2007 e 2008) como subsídio para a proposição
da diferenciação de S. schenckii em um complexo de espécies crípticas
filogeneticamente relacionadas.
184
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
Para Lemke (2001) os três principais aspectos que influenciam a especiação
em fungos são: (i) a grande maioria dos fungos são organismos haplóides; (ii) os
fungos empregam uma considerável quantidade de energia para controlar a
formação e a manutenção de heterocários específicos; e (iii) os fungos tidos como
um grupo são paradoxais, pois num contexto de extravagantes e variados ciclos
sexuais, estes têm uma tendência para restringir o fluxo de genes e a recombinação.
Para a o fungo patogênico S. schenckii assim como para as demais
espécies filogenéticas, recentemente descritas na literatura, ainda não são
conhecidas a forma perfeita ou teleomórfica, assim como o nicho ecológico de cada
espécie, desvendando a sua fonte no meio ambiente. Este fato dificulta o
entendimento das relações gênicas atribuídas a cada espécie e ainda poucas e
inconclusivas afirmações podem ser feitas sobre o processo de especiação para um
determinado grupo de isolados morfologicamente crípticos.
As técnicas de sequenciamento de genomas inteiros, como o
pirosequenciamento, estão cada vez mais sofisticadas e possivelmente possibilitarão
aos pesquisadores olharem de uma forma global para os processos de mutações,
recombinação e fluxo gênico dentro de organismos de uma mesma espécie. Deste
modo, estes futuros dados genômicos serão importantes e poderão ser utilizados
com maior acurácia e confiabilidade como estimativa de diversidade taxonômica
dentro do Reino Fungi.
A comparação entre as classificações adotadas na taxonomia fúngica
indicam que quanto mais informações forem integradas à biologia de um
determinado microrganismo e inseridas no contexto da micose, por exemplo,
influenciará positivamente o sistema de classificação, o qual tem sido proposto de
tempos em tempos, tornando este mais adequado e compreensivo para os
micologistas. Diversos dados publicados na literatura indicam a importância da
distinção entre as espécies do complexo S. schenckii. No âmbito da
185
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
ecoepidemiologia abrem-se novas perspectivas para a amplitude geográfica de
ocorrência destas espécies, assim como para o habitat e o nicho ambiental. Na área
terapêutica, os antifúngicos ganham um enfoque diferencial para as espécies
filogenéticas e reescrevem o tratamento da micose. No campo da biologia, a busca
pelo estado perfeito (teleomorfo) poderá encontrar novas respostas para uma
questão que não estava bem especificada há algumas décadas. Numa perspectiva
sorológica a preparação de antígenos e as moléculas purificadas utilizadas no
diagnóstico necessitam ser mais especificas, uma vez que distintas espécies
filogenéticas poderão influenciar de maneira singular o desenvolvimento da resposta
imune humoral. Na área clínica, a associação entre a forma da doença (cutânea fixa,
linfocutânea, disseminada, etc.) e a espécie filogenética poderão nos ajudar a
compreender melhor a interação fungo-hospedeiro e o desenvolvimento da doença.
Estudos recentes demonstram que algumas espécies definidas com base
em caracteres morfológicos consistem na verdade em entidades crípticas com
distribuição geográfica restrita. Até o momento, pouco são os estudos capazes de
decifrar a estrutura populacional e a distribuição fúngica na natureza. Para alguns
fungos de importância médica o verdadeiro nicho ambiental ainda é completamente
desconhecido ou existem dados escassos. Os estudos taxonômicos que identificam
e descrevem estas espécies crípticas são importantes neste contexto para que
possamos, em estudos futuros, testar hipóteses sobre entidades monofiléticas e
estabelecer com maior confiabilidade a distribuição biogeográfica das espécies
fúngicas.
O fungo S. schenckii, descrito há 112 anos por Schenck, está amplamente
distribuído de acordo com dados publicados na literatura desde a sua descrição,
porém estes dados refletem a distribuição de um grupo polifilético. Os dados
moleculares iniciais publicados na literatura e que discriminam as novas espécies
filogenéticas indicam que S. luriei esta restrito ao continente Africano, enquanto S.
186
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
brasiliensis é restrito ao continente Americano. As demais espécies que compõem
o complexo, como S. globosa e S. schenckii já foram descritas no continente
americano, asiático e europeu (Marimon et al., 2007; Madrid et al., 2009a). Uma
hipótese que explicaria estes achados seria que o processo evolutivo dentro do
complexo S. schenckii estaria relacionado ao fenômeno de vicariância.
Possivelmente, o evento de separação natural dos continentes nos primórdios da
pangéia explique a distribuição destas espécies na natureza. Com a divisão dos
continentes, a população fúngica ancestral teria sido fragmentada e as espécies
fúngicas passaram a adaptar-se a novos hospedeiros e/ou associar-se a novas
formas de vida no ambiente, evoluindo separadamente.
Atualmente, num contexto de mundo globalizado, o aumento das facilidades
de rotas e do fluxo migratório populacional entre áreas endêmicas e não endêmicas
de micoses, aliado ao fato que o homem é um importante hospedeiro deste fungo,
poderia explicar a ocorrência de determinadas espécies em áreas não endêmicas ou
de menor incidência.
Como não existem dados sobre a existência de ciclo parasexual em S.
schenckii, assim como não sabemos ao certo quais são os mecanismos que
governam a troca gênica e proporcionam a variabilidade genética entre as espécies
ou mesmo a adaptabilidade a determinados ambientes e possíveis interações
ecológicas, fica difícil prever a flutuação populacional destas espécies na natureza.
Embora intrigante, o fenômeno de especiação que deu origem ao complexo S.
schenckii é uma questão ainda sem respostas e de difícil comprovação.
Antes de 1960, a dispersão oceânica era uma possível explicação para a
distribuição das espécies fúngicas (Liu et al., 2009a). Posteriormente, e
crescentemente após a validação da teoria das placas tectônicas muitas
distribuições foram explicadas como eventos de vicariância. Entre os fungos, a
vicariância tem sido atribuída como um fenômeno capaz de explicar a distribuição
187
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
das espécies filogenéticas do complexo Gibberella fujikuroi (O’Donnell et al., 1998) e
Hyphoderma setigerum (Nilsson et al., 2003). Por outro lado, recentes avanços nas
técnicas que estimam a taxa de tempo de divergências pela substituição de
nucleotídeos sugerem que em muitos táxons irmãos, espalhados através do oceano,
divergiram mais recentemente do que possa ser explicado pelo evento de
fragmentação continental. Nestes casos, a dispersão oceânica é a explicação mais
racional para os padrões de separação e distribuição das espécies. De fato, muitos
fungos podem ser dispersos por uma variedade de propágulos os quais incluem
esporos, esclerócios e micélio aderido ao tecido de hospedeiros ou substratos. De
acordo com Liu et al. (2009a), não seria surpresa encontrar que dispersão oceânica
desempenhou e desempenha um importante papel nos padrões de separação.
Outro fator que pode influenciar a distribuição desta micose no ambiente
pode estar associado ao fato que este fungo possui o solo como reservatório. O
comércio industrial de solo para fins de jardinagem podem ter importado o fungo
para regiões onde a micose não ocorre. De fato, foi descrito recentemente por
Criseo & Romeo (2010) na Itália, o isolamento e identificação de S. schenckii em
amostras de solo natural e industrial. Como ressaltam os autores, as amostras de
solo comercial em que foram isolados S. schenckii foram adquiridas na Itália, porém
a procedência destas foi atribuída a outros países europeus como Alemanha,
Holanda, Espanha e Austria. Na Itália (e no continente europeu de uma maneira
geral) poucos casos de esporotricose são descritos. Neste exemplo, um dos fatores
que parece influenciar a distribuição e ocorrência da micose no ambiente deve-se
principalmente a introdução do fungo pelo homem através de amostras comerciais
de solo.
Um dos objetivos deste trabalho foi contribuir para a iniciativa da construção
de mapas proteômicos comparativos das espécies do complexo S. schenckii
utilizando inicialmente mapas bidimensionais. Como esperado, a padronização da
188
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
técnica para nossas amostras biológicas exigiu o uso de diferentes protocolos até
que obtivéssemos resultados satisfatórios representados por um amplo número de
“spots” individuais presentes nos géis. As condições foram testadas inicialmente
para o isolado de S. schenckii, Ss 118, e depois de estabelecidas foram aplicadas
para os demais isolados estudados. Em ordem cronológica foram avaliados fatores
como o preparo da amostra (tempo de cultivo, método de lise e solubilização das
proteínas), a focalização isoelétrica e a eletroforese em segunda dimensão.
Os tampões padrões de lise celular são compostos por uréia (9 M), CHAPS
(4%), DTT (1%), anfólitos (0,8%), azul de bromophenol (0,002%). Dentre os tampões
avaliados, os tampões de lise tris-cálcio e uréia-tiouréia associados à lise física por
maceração em nitrogênio líquido obtiveram o melhor perfil protéico quando avaliados
por eletroforese unidimensional. O perfil protéico foi avaliado seguindo os
parâmetros de diversidade, integridade e intensidade das bandas. Porém, quando
avaliamos os dois protocolos de extração frente à eletroforese bidimensional o
protocolo que empregou o tampão tris-cálcio apresentou melhor resolução na
separação das proteínas.
Algumas proteases continuam ativas na presença de uréia e detergentes.
Inibidores de proteases podem inativar a maior parte da atividade proteolítica da
mistura, entretanto, este efeito inibitório não ocorre em sua plenitude em alguns
lisados de células. O PMSF é frequentemente utilizado (8mmol/L), porém este é um
composto tóxico. Misturas (cocktails) comerciais de inibidores de protease são
amplamente utilizadas durante a extração de proteínas e promovem uma eficaz
preservação da integridade da amostra. Deste modo, utilizamos uma mistura de
inibidores de proteases no extrato bruto para a conservação da amostra.
O extrato bruto pode estar “contaminado” com sais, fosfolipídios e ácidos
nucléicos, comprometendo o resultado da focalização isoelétrica. Sobre condições
denaturantes, como as utilizadas nas preparações das amostras, os complexos de
189
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
DNA são dissociados e podem provocar aumento na viscosidade da solução,
inibindo a entrada das proteínas nas tiras de pH imobilizado (IPG strips), dificultando
a migração protéica. O DNA também é capaz de se ligar às proteínas e gerar uma
migração artefactual e arrastes horizontais, facilmente detectados na coloração pela
prata. A utilização de uma mistura comercial de nucleases, contendo DNAse e
RNAse, responsáveis pela degradação dos ácidos nucléicos, diminuiu
significativamente os arrastes observados nos géis.
Diversos protocolos têm sido utilizados para a precipitação de distintas
amostras protéicas. Basicamente a remoção de contaminantes e a inibição da
atividade de protease têm sido atribuídas como benefícios deste procedimento.
Ainda utilizando a eletroforese unidimensional avaliamos quatro protocolos de
precipitação.
O método utilizando a precipitação com TCA acetona foi proposto
inicialmente por Damerval et al. (1986). Este protocolo foi utilizado com algumas
modificações. Após a extração, as proteínas foram misturadas com TCA (10%) em
acetona gelada (–20 ºC). A amostra foi precipitada por centrifugação e o pellet foi
seguidamente lavado em acetona gelada. Após a centrifugação, as proteínas foram
solubilizadas em tampão de solubilização contendo uréia-tiouréia. A desvantagem,
entretanto, é que algumas proteínas ácidas são perdidas durante este processo,
porque elas não são precipitadas. A utilização de DTT (20 mM) foi preferida à
utilização de 2-mercaptoetanol, com o objetivo de aumentar o número de proteínas
básicas.
A utilização do 2D Clean-up kit é prática e reprodutível. A sua utilização não
implica em ganho ou perda de spots segundo o fabricante. O princípio é semelhante
ao método proposto por Damerval et al. (1986). Com a adição de um detergente co-
precipitante, as proteínas são mais eficientemente e completamente removidas do
extrato bruto. O “wash buffer” contém aditivos orgânicos que possibilitam a rápida e
190
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
completa ressuspensão das proteínas com o tampão de solubilização (Stasyky et al.,
2001).
Dentre os protocolos testados a utilização do 2D Clean up kit da GE
Healthcare apresentou melhor perfil de precipitação de proteínas, incluindo proteínas
de alto e baixo peso molecular, além de apresentar melhor reprodutibilidade durante
os ensaios. Este fato nos levou a adotar este método de precipitação para aplicação
nos ensaios de eletroforese bidimensional.
A solubilização das proteínas após a precipitação é um passo importante da
focalização isoelétrica. Altas concentrações de uréia são necessárias para converter
proteínas em conformações primárias pelo cancelamento das estruturas secundárias
e terciárias, para solubilizar proteínas hidrofóbicas na solução e evitar as interações
proteína-proteína. Em alguns casos, um segundo denaturante caotrópico, como a
tiouréia, tem sido adicionado à tampões contendo 7-9 M de uréia com a intenção de
aumentar a solubilidade de proteínas muito hidrofóbicas, como proteínas de
membrana.
O CHAPS é um detergente zwitteriônico, sendo seu uso preferível às
misturas poliol não iônicas como Triton X-100 e NP-40, devido a sua pureza ser
superior. A adição do CHAPS à solução aumenta a solubilidade de proteínas
hidrofóbicas. Outra característica importante é o fato de que a espectrometria de
massas é particularmente sensível a contaminantes derivados de detergentes como
o Triton X-100. Agentes redutores como o DTT previnem diferentes passos de
oxidação das proteínas. O DTT pode tornar-se ionizado acima do seu pK de 8 e
migrar através ânodo durante a IEF em gradiente de pH básico. Isto leva a streaks
horizontais derivadas de alguns spots na área básica. Anfólitos, os quais têm sido
designados para geração de gradientes de pH, aumentam consideravelmente a
solubilidade das proteínas pela substituição de tampões iônicos. A utilização do
191
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
tampão uréia-tiouréia apresentou melhores resultados durante os ensaios de
padronização.
Deste modo resolvemos empregar o método de extração física através da
maceração da amostra em nitrogênio líquido, associado à lise celular química,
utilizando o tampão tris-cálcio, seguido de precipitação das proteínas suspensas no
extrato bruto com auxílio do 2D Clean-up kit e solubilização das proteínas
precipitadas utilizando o tampão uréia-tiouréia. Este protocolo resultou na extração
de uma grande quantidade de proteínas, de forma reprodutível, revelando um
proteoma altamente complexo, composto de proteínas de baixa e alta massa
molecular, bem como de proteínas ácidas e básicas.
Barreira (2007) padronizou a técnica de eletroforese bidimensional para a
análise de proteínas de superfície do S. schenckii. A autora relata que variações nas
condições de cultivo (inóculo inicial) para a obtenção da fase leveduriforme levam a
significativas alterações na expressão de proteínas evidenciado pela alteração do
perfil proteômico bidimensional. Este trabalho ilustra a importância na determinação
rigorosa das condições experimentais a serem utilizadas na abordagem proteômica.
A comparação do perfil bidimensional de proteínas dos isolados do
complexo Sporothrix schenckii evidenciam a existência de diferenças significativas
entre as espécies estudadas.
Dentre todas as proteínas expressas in vitro pelas leveduras das diferentes
espécies de Sporothrix sp, 475 spots apareceram exclusivamente em pelo menos
uma das quatro classes (S. schenckii, S. globosa, S. brasiliensis e S. mexicana). O
sequenciamento destas proteínas fornecerá dados importantes sobre a biologia
destes microrganismos assim como será útil para a proposição de marcadores
biológicos nestas espécies.
Alguns resultados publicados recentemente por Fernandes (2009) e
Fernandes et al. (2009a,b) podem ajudar a esclarecer as diferenças nos níveis de
192
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
expressão encontrados para os isolados Ss 06, Ss 54 e Ss 118. Estes resultados
serão discutidos abaixo e co-relacionados com nossas hipóteses para as diferenças
nos níveis de expressão.
De acordo com Fernandes et al. (2009b) os isolados brasileiros de S.
schenckii apresentam grande variabilidade genética quando avaliados por RAPD
(primer OPD18) com a reunião de 7 grupos majoritários. Dentre os isolados
estudados, o isolado Ss 06 apresenta genótipo I.b.2.1, distinto de Ss 118
(I.b.2.2.1.1) e de Ss 54, o qual apresenta genótipo II.
Dentre as características genéticas dos isolados de S. schenckii
representativos do Brasil, analisado por Southern blot, observadas para a digestão
do DNA genômico com a enzima APA I e hibridização com a sonda ITS, Fernandes
(2009) relata a presença de três perfis distintos. O isolado Ss 54 pertence ao grupo I
(bandas 3.849,81 bp e 1.548,38 bp) enquanto o isolado Ss 06 pertence ao grupo III
(bandas 13.103,88 bp, 8.989,17 bp, 7.215,06 bp, 6.363,26 bp, 5.107,40 bp e
4.504,43 bp).
Outro fator avaliado por Fernandes (2009) leva em consideração a
capacidade de isolados de Sporothrix spp. na indução à morte. O isolado de
Sporothrix globosa (Ss 06) não é capaz de levar camundongos Balb/C à morte após
20 semanas de infecção. O isolado Ss 54 de S. brasiliensis foi capaz de induzir a
morte na segunda semana de infecção. Com relação à capacidade de colonização e
disseminação para os órgãos fígado, baço e pulmões em camundongos Balb/c, o
isolado Ss 54 foi capaz de colonizar todos os órgãos avaliados enquanto que o
isolado Ss 06 não foi capaz de disseminar no modelo experimental murino. Os
resultados obtidos por Fernandes (2009) são concordantes com os obtidos por
Arrillaga-Moncrieff et al. (2009) utilizando camundongos OF1. Os dados de ambos
os grupos confirmam que a espécie filogenética S. brasiliensis é altamente
patogênica em modelo murino experimental, enquanto que a espécie S. globosa
193
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
apresenta dificuldades para obter sucesso na infecção. No atual trabalho fomos
capazes de detectar 262 proteínas diferencialmente expressas entre estas duas
espécies, onde, 154 proteínas, aparecem exclusivamente no isolado Ss 54 além da
ocorrência de expressão superior em 12 proteínas em S. brasiliensis quando
comparado com S. globosa (Ss06).
Os isolados selecionados para os estudos proteômicos apresentam
diferenças fenotípicas, genotípica e de virulência já observadas por Fernandes
(2009) e Fernandes et al. (2009a,b). Os perfis bidimensionais de proteínas
observados deixam claro que existem diferenças significativas entre as espécies
filogenéticas estudadas, fornecendo subsídios que fortalecem a separação destes
microrganismos em espécies distintas.
O estudo das proteínas imunogênicas dos isolados do complexo Sporothrix
schenckii foi proposto neste trabalho. A caracterização bioquímica e imunológica
destas moléculas são importantes por fornecerem subsídios para a compreensão da
interação parasito-hospedeiro e da resposta imune humoral na esporotricose
humana. O conhecimento das proteínas imunodominantes de Sporothrix spp. pode
ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e para o
estabelecimento de testes para o diagnóstico diferencial entre os agentes etiológicos
e as diversas manifestações clínicas doença.
Almeida-Paes et al. (2007) relataram em pacientes a presença de anticorpos
da classe IgG, IgM e IgA contra antígenos brutos secretados in vitro durante a fase
micelial de Sporothrix schenckii. Anticorpos IgG possuem um papel importante na
patogênese da doença.
De acordo com as condições biológicas estabelecidas neste trabalho para a
aquisição e fracionamento do extrato protéico celular total de leveduras de
Sporothrix spp. observamos através da técnica de Western-Blot quais são as
proteínas que são reconhecidas por imunoglobulinas séricas do tipo G (IgG) na
194
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
esporotricose humana. Para tanto, estabeleceu-se um pool de soro de 15 pacientes
que apresentam o quadro clínico de esporotricose.
As imunoglobulinas presentes no soro de pacientes infectados com
Sporothrix sp e que desenvolveram a forma cutânea fixa da doença foram capazes
de reconhecer 14 proteínas de S. schenckii, 9 proteínas de S. brasiliensis 13
proteínas de S. globosa e 6 proteínas de S. mexicana. Os anticorpos gerados nos
pacientes que desenvolveram esporotricose linfocutânea foram capazes de
reconhecer 6 proteínas de S. schenckii, 8 proteínas de S. brasiliensis, 16 proteínas
de S. globosa e 6 proteínas de S. mexicana.
A resposta imune humoral na esporotricose murina foi avaliada por
Fernandes (2009) utilizando proteínas secretadas in vitro pela fase micelial de
culturas de Sporothrix. Houve diferenças significativas no perfil de secreção de
proteínas entre os isolados (Fernandes et al. 2009a) assim como no reconhecimento
por anticorpos IgG. As frações protéicas secretadas pelo isolado Ss 06 (160, 120,
87, 60, 45 e 40 kDa) não foram reconhecidas por Igs presentes no soro de
camundongos. O isolado Ss 54 secretou oito frações protéica/glicoprotéica (110, 87,
80, 60, 45, 40, 38 e 30 kDa) sendo reconhecidas as frações de 80, 60 e 30 kDa.
Em nosso estudo, 6 proteínas presentes no extrato protéico celular total de
ambos os isolados, Ss 06 e Ss 54, foram reconhecidos de maneira idêntica por
anticorpos IgG presentes na esporotricose humana em ambas as formas clínicas
(cutânea fixa e linfocutânea).
Dentre as proteínas celulares expressas pelas leveduras, uma molécula de
aproximadamente 70 kDa foi majoritariamente reconhecida por três (Ss 06, Ss 54 e
Ss 118) dos quatro isolados estudados em ambas as formas clínicas avaliadas
(esporotricose cutânea fixa e linfocutânea). O isolado de Sporothrix mexicana, FMR
9108, não apresentou a reatividade característica dos demais isolados do complexo.
195
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
As respostas do sistema imune inato são mediadas pelas células fagocíticas
como os macrófagos e neutrófilos, os quais fagocitam e matam os patógenos
invasores e, então, estimulam o sistema imune adaptativo através da secreção de
citocinas e quimiocinas (Dostert & Tschopp, 2007). Os mecanismos de defesa do
hospedeiro influenciam na manifestação e severidade das infecções fúngicas, de
modo que as formas clínicas da doença dependem da resposta imune do paciente
(Romani, 2004, 2007). Ambos, os fatores patogênicos de isolados de S. schenckii e
o estado imunológico do hospedeiro podem determinar as manifestações clínicas da
esporotricose, entretanto, os fatores envolvidos na patogênese de S. schenckii e os
mecanismos que determinam a sua virulência permanecem obscuros (Uenotsuchi et
al., 2006). Acredita-se que o tamanho inicial do inoculo, a integridade do sistema
imune do hospedeiro, a virulência do fungo, a profundidade em que este é inoculado
e a termotolerância possuam um papel importante no desenvolvimento da doença
no hospedeiro mamífero.
O escape das defesas do sistema imune é um fator crucial para a
sobrevivência e/ou multiplicação no hospedeiro para muitos microrganismos,
incluindo S. schenckii. De acordo com Uenotsuchi et al. (2006) os isolados
provenientes de esporotricose cutânea são mais eficazes para ativar as células
dendríticas e induzir subsequentemente uma reposta imune via Th1, do que isolados
de origem visceral como evidenciado pela: (i) forte expressão de HLA-DR e outras
moléculas co-estimulatórias e (ii) alta indução de citocinas Th1(IFN-γ e TNF-α).
Importantes vias de sinalização como JNK e p38 MAPK, podem estar envolvidas na
indução diferencial de resposta Th1 por isolados de S. schenckii de diferentes
origens (Uenotsuchi et al., 2006).
A resposta imune humoral na esporotricose é diversa. Fatores como o grupo
de antígeno utilizado, as características biológicas do agente etiológico, a
integridade do sistema imune do hospedeiro assim como o seu perfil genético
196
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
podem influenciar no perfil de moléculas reconhecidas por imunoglobulinas
presentes no soro de pacientes.
Scott & Muchmore (1989), por meio da técnica de Western blot
unidimensional, observaram que 100% dos soros de pacientes utilizados
reconhecem as moléculas de 40 kDa e 70 kDa. As moléculas de 22 e 36 kDa foram
reconhecidas pela maioria dos soros de pacientes com esta micose. Mendoza et al.
(2002) relataram que as bandas de 40 kDa, 55 kDa, 74 kDa, 90 kDa e 147 kDa são
reconhecidas por anticorpos presentes em soros de pacientes com esporotricose.
É importante ressaltar que fatores como o meio de cultura utilizado para a
produção do extrato protéico/glicoprotéico podem influenciar o perfil de proteínas
expressas e deste modo interferir na diversidade de reconhecimento,
consequentemente dificultando a comparação de resultados.
De acordo com Fernandes (2009), os anticorpos gerados na esporotricose
murina experimental reconhecem as moléculas de 90 kDa, 87 kDa, 80 kDa, 75kDa,
60 kDa, 45 kDa, 38 kDa e 30 kDa. A diversidade de combinações de
reconhecimento ocorreu em função do exoantígeno testado. A molécula que foi mais
reconhecida em diferentes exoantígenos foi a de 60 kDa, em 5 de 10 exoantígenos
avaliados. Por outro lado, de acordo com Carlos et al. (1999) na esporotricose
experimental murina, os anticorpos presentes no soro reconhecem a molécula de 67
kDa.
Nascimento & Almeida (2005) apontam como molécula imunodominante da
esporotricose experimental a fração de 70 kDa. Posteriormente, Nascimento (2008)
e Nascimento et al. (2008) demonstraram que esta molécula é uma glicoproteína
presente na superfície das células leveduriformes e é uma adesina putativa para
fibronectina e laminina.
De acordo com Fernandes (2009) as frações protéicas de 70 e 38 kDa
secretadas in vitro são majoritariamente reconhecidas na esporotricose humana,
197
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
independente da forma clínica avaliada (cutânea fixa ou linfocutânea). Nossos
resultados de reconhecimento antigênico são congruentes com os encontrados por
Nascimento & Almeida (2005) e Fernandes (2009).
O isolamento e a caracterização parcial do antígeno de 70 kDa de Sporothrix
schenckii foi realizada por Ruiz-Baca et al. (2009). No referido trabalho a molécula
de 70 kDa purificada foi fracionada por eletroforese bidimensional utilizando IPG
strips de pH3-10 (11 cm). A reação com anticorpos policlonais anti-gp70,
provenientes de soro hiperimune de coelho detectou a molécula na faixa de pH de
4.1.
Quando utilizamos IPG strips com resolução superior (13 cm, pH4-7)
identificamos a presença de pelo menos 8 moléculas, possivelmente isoformas, nas
espécies estudadas e que variam de pI de 4.3 à 4.8, todas sendo reconhecidas por
anticorpos gerados na resposta imune humoral humana.
De acordo com Ruiz-Baca et al. (2009) aproximadamente 5,7% da massa
molecular da proteína é influenciado por glucanos N-ligados. A glicosilação da
molécula de 70 kDa pode ser responsável pela alteração no peso molecular
observado para as possíveis isoformas desta proteínas. Observamos variações no
peso molecular e no ponto isoelétrico das proteínas imunogênicas expressas (com
exceção de FMR 9108) e entre as diferentes espécies analisadas. A reação
característica destas proteínas foi observada na altura de 62-55 kDa em S.
brasiliensis (ID: 1-6), 73-64 kDa em S. globosa (ID: 1-8) e 70-68 kDa em S. schenckii
(ID: 1-6).
A presença de anticorpos específicos contra as moléculas de 70 kDa pode
ser importante para a defesa do hospedeiro uma vez que Ruiz-Baca et al. (2009)
demonstram in vitro que as células leveduriformes de S. schenckii aderem à derme
de camundongos e que a presença de anticorpos anti-gp70 reduzem este processo
de maneira dose-dependente.
198
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Discussão
A identificação de espécies crípticas ainda é um desafio para os
micologistas. A habilidade de delimitação destes microrganismos influencia a
estimativa da diversidade fúngica. O monitoramento das micoses cutâneas,
subcutâneas e sistêmicas depende diretamente da precisão da identificação do
suposto agente infeccioso. Nosso estudo sobre o agente etiológico da esporotricose
humana e animal teve como foco abordar características eco-epidemiológicas,
fenotípicas, genotípicas, proteômicas e imunoproteômicas levando em consideração
as alterações na taxonomia deste fungo. O uso correto da taxonomia pode revelar
aspectos e características importantes de uma população heterogênea que
previamente era tratada de forma homogênea. À medida que mais dados biológicos
tornarem-se disponíveis para estas espécies, teremos uma compreensão mais
precisa da sua estrutura populacional, distribuição e flutuação geográfica, do seu
papel nas manifestações clínicas da doença, nos perfis de sensibilidade e
mecanismos de resistência a diferentes antifúngicos, em suma, das complexas
relações biológicas que estão por trás do complexo Sporothrix schenckii.
199
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Conclusões
6. CONCLUSÕES
A população de Sporothrix spp. é altamente heterogênea ao longo do território
brasileiro, levando-se em consideração os aspectos morfológicos, fisiológicos e
moleculares;
Os isolados de Sporothrix spp. apresentam padrões de crescimento vegetativo
rápido, intermediário e lento dependendo do isolado. A temperatura de
incubação in vitro afeta a taxa de crescimento vegetativo assim como a
morfologia (macroscópica) dos isolados do complexo S. schenckii;
Os isolados do complexo S. schenckii apresentam padrões diferenciados de
assimilação de fontes de carbono e os açúcares sacarose, rafinose e ribitol são
importantes marcadores fisiológicos para a classificação dos isolados
brasileiros;
A sequência nucleotídica de um fragmento de aproximadamente 800 pb do
gene da calmodulina foi suficiente para a correta classificação dos isolados
brasileiros inicialmente identificadas como S. schenckii. Assim sendo, os 161
isolados recebidos como S. schenckii foram redefinidos como: 82 S. schenckii,
71 S. brasiliensis, 3 S. mexicana e 3 S. globosa. Dois isolados, Ss 146 e Ss
147 não foram classificados como Sporothrix spp. e sim como Blastobotrys
proliferans.
A utilização de caracteres moleculares não exclui a utilização de caracteres
morfológicos e estes dados devem ser analisados de maneira integrada para a
correta identificação dos isolados do complexo S. schenckii.
Foi detectada a presença das espécies filogenéticas S. schenckii, S.
brasiliensis, S. globosa e S. mexicana em território brasileiro como agentes da
esporotricose humana e felina.
200
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Conclusões
Ocorre alta frequência da espécie filogenética S. brasiliensis em felinos e estes
podem ser responsáveis pela epidemiologia da doença e prevalência desta
espécie filognética em humanos nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande
do Sul, onde ocorrem epidemias de esporotricose felina; Nos demais estados
avaliados, onde não são relatados surtos de esporotricose felina, ocorre o
predomínio da espécie S. schenckii em humanos, indicando outras fontes de
aquisição da micose no ambiente;
Os perfis bidimensionais de proteínas observados deixam claro que existem
diferenças significativas entre as espécies filogenéticas estudadas, fornecendo
subsídios que fortalecem a separação destes microrganismos em espécies
distintas;
O padrão de reconhecimento antigênico de proteínas dos fungos por anticorpos
circulantes presentes no soro de pacientes com as formas cutânea fixa e
linfocutânea da esporotricose foi semelhante entre os isolados de S.
brasiliensis, S. globosa e S. schenckii estudados e as duas formas clínicas
escolhidas. A molécula de 70 kDa destas espécies foi majoritariamente
reconhecida por anticorpos IgG e pode ser considerada um bom marcador
sorológico para o diagnóstico da esporotricose provocada por estas espécies;
A espécie S. mexicana apresenta perfil protéico e perfil antigênico diferente das
demais espécies estudadas assim como entre as formas clínicas cutânea fixa e
linfocutânea da doença.
201
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
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231
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
8. APÊNDICE I
Meios de cultura
Meio Sabouraud (SDA - Sabouraud Dextrose Agar)
Peptona de caseína…..…………....................…………………...………........ 5 g
Peptona de carne…………………………………....................………….……. 5 g
Dextrose……………………………………………………………..................... 40 g
Ágar……………………………………………………….………........................ 15 g
Água destilada q.s.p. .................................................................................... 1.000 mL
pH 5.6 ± 0.2 (25 °C)
Foram dissolvidos 65 g do meio de cultura SDA (Acumédia, USA) em água destilada
suficiente para 1.000 mL até se obter uma suspensão homogênea. O meio de cultura foi autoclavado
a 1 atm e 120 ºC durante 20 min.
Meio PDA - Potato Dextrose Agar (Hawksworth et al., 1995)
Extrato de batata (infusão 200 g)................................................................. 4 g
Dextrose....................................................................................................... 20 g
Ágar.............................................................................................................. 15 g
Água destilada q.s.p. ................................................................................... 1.000 mL
Trinta e nove gramas do meio de cultura PDA (Acumédia, USA) foram dissolvidos em água
destilada suficiente para 1.000 mL. O meio de cultura foi autoclavado, 1 atm e 120 ºC durante 20 min.
Meio BHI (Brain-Heart-Infusion)
Infusão de cérebro e coração...................................................................... 17.5 g
Digestão enzimática de gelatina………………………...……...................… 10 g
Dextrose…………………………………………………………...................… 2 g
Cloreto de sódio……………………………………………….…..................... 5 g
Fosfato de disódio………………………………………………...................... 2.5 g
Água destilada q.s.p. .................................................................................. 1.000 mL
pH 7,5 ± 0,2 (25 °C)
Trinta e sete gramas do meio de cultura BHI (Acumédia, USA) foram adicionadas a 1.000 mL
de água destilada. Para a obtenção do meio sólido foram adicionados à suspensão 20 g de ágar. O
pH do meio de cultura quando necessário foi ajustado em 8,0 e, em seguida, autoclavado a 1 atm e
120 ºC durante 20 min.
232
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Meio CMA – Corn Meal Agar (Atlas & Snyder, 2006)
Farinha de milho (Fubá)………………………………....................…………. 30 g
Ágar………………………………………………….…………......................... 15 g
Água destilada q.s.p. .................................................................................. 1.000 mL
pH 5.6 ± 0.2 (25 °C)
Foram dissolvidos 30 g de fubá em 500 mL de água. A seguir, a solução foi aquecida a 100°C
e homogeneizada durante 1 hora. Após este procedimento a solução foi filtrada em gaze para
remoção do material particulado formado durante o preparo. Em outro recipiente foram dissolvidos 15
g de ágar em 500 mL de água destilada. As soluções resultantes foram reunidas em Becker e o
volume foi ajustado para 1.000 mL. O meio de cultura foi autoclavado a 1 atm e 120 ºC durante 20
min.
Soluções corantes utilizadas para a visualização das estruturas morfológicas, em microscópio
óptico, dos isolados de Sporothrix spp.
Solução de Lactofenol (Barnett et al., 1974)
Ácido lático.................................................................................................. 20 g
Fenol............................................................................................................ 20 mL
Glicerol........................................................................................................ 40 mL
Água destilada autoclavada........................................................................ 20 mL
Solução de Lactofenol azul de algodão (Barnett et al., 1974)
Ácido lático................................................................................................... 20 g
Fenol............................................................................................................. 20 mL
Glicerol.......................................................................................................... 40 mL
Azul de algodão............................................................................................ 0.05-0.10 g
Água destilada autoclavada.......................................................................... 20 mL
233
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Soluções para extração de DNA de leveduras de S. schenckii.
Tampão de protoplasto.
β-Mercaptoetanol.......................................................................................... 10 µL
Tris-HCl, 1M, pH 7,5..................................................................................... 100 µL
EDTA, 0,5 M................................................................................................. 20 µL
Zimoliase 0,2 mg/mL.................................................................................... 2 µL
18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 870 µL
As soluções de Tris-HCl (1 M, pH 7,5) e EDTA (0,5 M) foram preparadas separadamente e
autoclavadas a 1 atm e 120 °C durante 20 min. A enzima Zimoliase foi adicionada apenas no
momento do uso do tampão.
Tampão de lise do protoplasto.
NaOH 10N.................................................................................................... 20 µL
SDS 10%...................................................................................................... 100 µL
Proteinase K................................................................................................. 20 mg
18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 880 µL
As soluções de NaOH (10 N) e SDS a 10% foram preparadas separadamente e autoclavadas
a 1 atm e 120 °C durante 20 min. A proteinase K foi adicionada apenas no momento do uso do
tampão.
Solução Acetato de potássio, 5M, pH 5,4.
Acetato de potássio...................................................................................... 49,07 g
18MΩ Água MilliQ®....................................................................................... 100 mL
O pH da solução foi ajustado em 5,4 e autoclavada a 1 atm e 120 °C durante 20 min.
Tampão TBE (10X) (Sambrook et al., 2001)
Trizma base................................................................................................. 108 g
Ácido Bórico................................................................................................ 55 g
EDTA 0,5 M pH 8,0..................................................................................... 40 mL
18MΩ Água MilliQ®...................................................................................... 1.000 mL
O tampão TBE 10 X foi preparado e em seguida autoclavado a 1 atm e 120 °C durante 20
min.
234
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Tampão de amostra de DNA 6X (Sambrook et al., 2001)
Azul de bromofenol...................................................................................... 0,25 g
Xileno cianol FF........................................................................................... 0,25 g
Sucrose....................................................................................................... 40 g
18MΩ Água MilliQ® q.s.p ............................................................................ 100 mL
O tampão de amostra de DNA foi preparado assepticamente, esterilizado por filtração com
filtros Millipore 0,22 µm, sendo em seguida aliquotado em tubos tipo Eppendorf e armazenado a 4ºC.
Soluções utilizadas em técnicas Proteômicas
Tampão de lise celular I (Adaptado de Chandler et al., 2008)
Tris-HCl, 1M, pH 7,6..................................................................................... 20 mM
NaCl, 1M....................................................................................................... 10 mM
Deoxicolato de sódio 0,5 M.......................................................................... 0,5 mM
Cocktail de inibidor de protease (1X)............................................................ 40 µL/mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 1.000 µL
A solução de Deoxicolato de sódio (0,5 M) foi aquecida a 60 °C durante 15 min para a
completa dissolução do reagente, sendo em seguida esterilizada por filtração em filtro Millipore® 0,22
µm de diâmetro. As soluções de Tris-HCl (1M, pH 7,6) e NaCl (1M) foram autoclavadas a 1 atm e a
120 °C, durante 20 min. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado
apenas no momento do uso do tampão.
Tampão de lise celular II (Adaptado de Winters et al., 2008)
Uréia.......................................................................................................... 9M
CHAPS...................................................................................................... 2%
DTT............................................................................................................ 1%
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 10 mM
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 µL
Foram dissolvidos a uréia, o CHAPS e o DTT em água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A
solução foi homogeneizada e esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de
diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no
momento do uso do tampão.
235
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Tampão de lise celular III (Adaptado de Missall et al., 2008)
Tris HCl, 1M, pH 9,0.................................................................................. 40 mM
CHAPS...................................................................................................... 4%
EDTA 0,5 M............................................................................................... 1 mM
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 1 x
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 µL
O detergente aniônico CHAPS foi inicialmente dissolvido em 250 µL de água MilliQ®. A seguir
foram adicionadas as quantias correspondentes de Tris-HCl (1M, pH 9,0) e EDTA (0,5M)
(autoclavados separadamente a 1 atm e 120 °C durante 20 min). O volume da solução foi ajustado
para 1.000 µL e a solução resultante foi esterilizada por filtração, utilizando um filtro Millipore® 0,22
µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no
momento do uso do tampão.
Tampão de lise celular IV (Tris-Cálcio) (Silva et al., 1994; Salem et al., 1997; Da Fonseca et al.,
2001)
Tris-HCl, 2M, pH 8,8……………………………………………..................... 1 %
CaCl2, 1M……………………….………………………………...................... 0,5 %
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 10 mM
DTT*.......................................................................................................... 20 mM
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 µL
As quantias correspondentes das soluções de Tris-HCl (2M, pH 8,8) e CaCl2 (1M) foram
adicionadas ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução resultante foi esterilizada
por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de protease (GE
Healthcare, USA) foi adicionado apenas no momento do uso do tampão. *Após a extração, foi
adicionado 20 mM de DTT à suspensão de proteínas.
Tampão de lise celular V (Uréia)
Uréia………………….…………………………………………...................... 8 M
CHAPS…………………………….……………………………...................... 2 %
IPG Buffer pH 3-10..................................................................................... 2 %
DTT............................................................................................................ 20mM
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 10 mM
Cocktail de nuclease (1X).......................................................................... 10 mM
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1000 µL
236
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
A uréia, o CHAPS e o DTT foram dissolvidos em 500 µL de água MilliQ. A suspensão foi
homogeneizada com auxílio de uma micropipeta. Após a dissolução completa, adicionou-se o IPG
Buffer pH 3-10 ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução resultante foi
esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de inibidor de
protease e o cocktail de nuclease (GE Healthcare, USA) foram adicionados apenas no momento do
uso do tampão.
Tampão de lise celular VI (Uréia-Tiouréia)
Uréia………….……...................……………………………………………... 7 M
Tiouréia..…...…………………….....................……………………………… 2 M
CHAPS…...……………………………..………...................………………... 2 %
IPG Buffer pH 3-10..................................................................................... 2 %
DTT............................................................................................................ 20mM
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 10 mM
Cocktail de nuclease (1X).......................................................................... 10 mM
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1000 µL
A uréia, a tiouréia, o CHAPS e o DTT foram dissolvidos em 500 µL de água MilliQ. A
suspensão foi homogeneizada com auxílio de uma micropipeta. Após a dissolução completa,
adicionou-se o IPG Buffer pH 3-10 ao volume de água MilliQ® suficiente para 1.000 µL. A solução
resultante foi esterilizada por filtração utilizando um filtro Millipore® 0,22 µm de diâmetro. O cocktail de
inibidor de protease e o cocktail de nuclease (GE Healthcare, USA) foram adicionados apenas no
momento do uso do tampão.
Tampão de lise celular VII
Tris-HCl, 1M, pH 7,6.................................................................................. 20 mM
NaCl, 1M.................................................................................................... 10 mM
Triton X-100............................................................................................... 2%
Cocktail de inibidor de protease (1X)......................................................... 40 µL/mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 µL
As soluções de Tris-HCl (1M, pH 7,6) e NaCl (1M) foram autoclavadas a 1 atm e 120 °C
durante 20 min. O cocktail de inibidor de protease (GE Healthcare, USA) foi adicionado apenas no
momento do uso do tampão.
237
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Tampão (I) de solubilização de proteínas e reidratação para Immobiline™ DryStrip gels (GE
Healthcare).
Uréia……………...................……………………….………………………... 8 M
CHAPS…………………………....................………..………………………. 2 %
IPG Buffer*................................................................................................. 2 %
DeStreak®.................................................................................................. 1,2 %
Azul de bromophenol................................................................................. 0,8 %
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 µL
*Anfólitos (IPG Buffer) aplicados de acordo com a faixa de pH das strips utilizadas, pH 3-10
ou pH 4-7.
Tampão (II) de solubilização de proteínas e reidratação para Immobiline™ DryStrip gels (GE
Healthcare).
Uréia………....................…..………………………………………..………... 7 M
Tiouréia………….…………....................……………………..……………… 2 M
CHAPS……………………………………....................…..…..……………... 2 %
IPG Buffer*................................................................................................. 2 %
DeStreak®.................................................................................................. 1,2 %
Azul de bromophenol................................................................................. 0,8 %
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 µL
*Anfólitos (IPG Buffer) aplicados de acordo com a faixa de pH das strips utilizadas, pH 3-10
ou pH 4-7.
Tampão de equilíbrio para Immobiline™ DryStrip gels (GE Healthcare).
Uréia.......................................................................................................... 6 M
Tris-HCl pH 8,8.......................................................................................... 0,375 M
Glicerol....................................................................................................... 20 %
SDS........................................................................................................... 2 %
DTT1.......................................................................................................... 0,1 %
Iodoacetamida2.......................................................................................... 0,2 %
Azul de Bromophenol................................................................................ Traço
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
O DTT1 ou a Iodoacetamida
2 foram adicionados separadamente ao tampão para a redução
ou alquilação das proteínas respectivamente.
238
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
PBS 10X (1,5M, pH 7,4)
NaCl………...................……..…………………..…………….……………… 80 g
KCl………………….……...................……….….…………..……………...... 2 g
Na2PO4…………………..……….….…...................……….………………... 14,4 g
KH2PO4…………………….…………….……………...................………….. 2,4 g
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
O KH2PO4 foi dissolvido em 100 mL de água MilliQ e o pH foi ajustado para 7,2. Após a
dissolução completa, os demais reagentes foram adicionados e completou-se o volume de água
MilliQ® suficiente para 1.000 mL. O tampão foi preparado e em seguida autoclavado a 1 atm e 120 °C
durante 20 min.
Gel de poliacrilamida 10% (Segunda dimensão)
Acrilamida (30%), Bis-acrilamida (8%)...................………….……..……… 15 mL
Tris-HCl, pH 8,8…………………………………………....................….…… 16,8 mL
SDS 10%................................................................................................... 300 µL
Perssulfato de amônio (10%)….……………………..……..….................... 450 µL
TEMED...................................................................................................... 30 µL
Água MilliQ® 18MΩ.................................................................................... 14,7 mL
1D SDS-PAGE
Solução estoque Gel de
separação (10%)
Gel de
empacotamento (3%)
Acrilamida (30%), Bis-acrilamida (8%).............. 5 mL 0,65 mL
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 – SDS 0,2%................... 3,75 mL ---
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 – SDS 0,2%................... --- 1,25 mL
Água MilliQ® 18MΩ............................................ 6,25 mL 3,05 mL
Perssulfato de amônio (10%)………….............. 50 µL 25 µL
TEMED……………………………………............ 10 µL 5 µL
239
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Tampão de corrida para SDS-PAGE (10 X)
Trizma Base…………………………...................…………………………… 30,825 g
Glicina…………………………..……………………......................…………. 144,13 g
SDS………………………………....……………………………..................... 10 g
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
pH 8,0
O tampão de corrida eletroforética de proteínas 10 X foi preparado e estocado a 4 °C até o momento
do uso.
Tampão de amostra 4X para proteínas SDS-PAGE
Trizma HCl 0,5 M, pH 6,8….……......................…..……..………………… 6 mL
SDS…………………………….…..……………….....................……………. 1 g
Glicerol…………………………..….…………………………....................… 5 mL
Azul de bromofenol………………………….…………..…..…..................... 0,005 g
β-mercaptoetanol 1%................................................................................. 120 µL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
pH 8,0
Detecção de proteínas utilizando Nitrato de prata (géis analíticos)
As proteínas foram visualizadas pela coloração com nitrato de prata, de acordo com a
metodologia proposta por Blum et al. (1987).
Solução de fixação I (16 horas)
Metanol……………………….……....................……………………………..... 125 mL
Ácido Acético………………………….…………...................………………… 30 mL
Formaldeído 37%......................................................................................... 125 µL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 250 mL
Solução de lavagem (30 min)
Etanol……………………………...................…………………..……………… 125 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ............................................................................ 250 mL
Solução de sensibilização (10 min – 30 min)
Tiossulfato de sódio…………….………….…..….………...................……. 0,05 g
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 mL
240
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Solução de coloração (10 min – 30 min)
Nitrato de prata…………….………..………………………...................…... 0,5 g
Formaldeído (37%)……….…….………………………………..................... 175 µL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 mL
Solução de revelação
Carbonto de sódio………….…………………………………….................... 15 g
Tiossulfato de sódio………………………………………….…..................... 0,001 g
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 mL
Solução de parada
Metanol……………....................……………………………………………... 125 mL
Ácido acético……………………...................……………….………………. 30 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 250 mL
Solução de lavagem
Metanol…………..…………………………..…………………...................... 125 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p........................................................................... 250 mL
Detecção de proteínas utilizando Coomassie coloidal (géis preparativos)
Solução de fixação II (16 horas)
Metanol……..……….………...................………………………….………... 40 mL
Ácido acético………………………………...................………….…………. 10 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 100 mL
Solução de coloração Coomassie Coloidal G-250 (Candiano et al., 2004)
Ácido fosfórico........................................................................................... 140 mL
Sulfato de amônio...................................................................................... 200 g
Metanol...................................................................................................... 400 mL
Coomassie coloidal G-250......................................................................... 2,4 g
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 2.000 mL
O ácido fosfórico e o sulfato de amônio foram dissolvidos em 200 mL de água. Após a
dissolução, completou-se o volume com água MilliQ® suficiente para 600 mL. Em seguida, o
Coomassie coloidal foi adicionado e a solução permaneceu sob agitação constante durante 2-3
horas. O metanol foi adicionado à solução e esta foi agitada por 30 minutos. A solução resultante foi
armazenada em frasco âmbar.
241
Taxonomia polifásica e características proteômicas do complexo Sporothrix schenckii
Apêndice I
Tampão de transferência para Western Blot (Towbin et al., 1979)
Trizma Base............................................................................................... 3,62 g
Glicina........................................................................................................ 18 g
Metanol...................................................................................................... 250 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
pH 8,3
O tampão foi preparado, devidamente vedado para evitar a evaporação do metanol e em
seguida armazenado a 4 °C, até o momento do uso.
Ponceau’S (Confirmação de transferência de proteínas)
Ponceau’S................................................................................................. 0,15 g
Ácido acético............................................................................................. 1 mL
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 100 mL
A solução foi preparada e armazenada em frasco âmbar.
Tampão Carbonato CO3- HCO3
- 50mM, pH 9,6
Carbonato de sódio................................................................................... 0,5 M
Carbonato ácido de sódio.......................................................................... 0,5 M
Água MilliQ® 18MΩ q.s.p. ......................................................................... 1.000 mL
O tampão foi preparado e em seguida esterilizado por filtração utilizando um filtro Millipore®
0,22 µm de diâmetro e armazenado a 4 °C, até o momento do uso.